DE69008521T2

DE69008521T2 - Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.

Info

Publication number: DE69008521T2
Application number: DE69008521T
Authority: DE
Inventors: Norbert Bischofberger; Regan Shea
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1989-03-07
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2010-02-24
Also published as: WO1990010448A3; EP0462145B1; DE69008521D1; CA2049028A1; JPH04503957A; WO1990010448A2; ES2055907T3; EP0462145A1; DK0462145T3; ATE104857T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft kovalente Konjugate von Lipiden und Oligonukleotiden und ihre Anwendung in pharmazeutischen, Reinigungs- und Diagnoseverfahren.
Die Verwendung von "antisense"-RNA oder DNA erwies sich zum Manipulieren von eukaryotischer Genexpression als nützlich. Dieses Verfahren beruht auf dem Blockieren des Informationsflusses von DNA zum Protein über RNA durch Einfügung einer Komplementärsequenz in einen Abschnitt der Ziel-mRNA in der Zelle. Wenn das Oligomer von Zellen aufgenommen wird, kann es entweder durch Blockieren der Translation des Zielboten im Zytoplasma funktionieren oder nach Eindringen in den Kern durch Binden an DNA die nukleare Verarbeitung oder Transkription stören. Im Falle von Vireninfektion können antisense-Oligomere auch durch Blockieren der Virenreplikation funktionieren, wobei dies von der Zielstelle des Oligomers auf dem Virengenom abhängt. Komplementäre Nukleinsäuren, welche die Genexpression inaktivieren, wurden als antisense-Nukleinsäuren bezeichnet.
Ein wirkungsvoller Transport von Nukleinsäuren durch Zellmembranen hindurch ist ftir die antisense-Nukleinsäurentechnologie ebenso wie fiir einfache Transfektionsexperimente von großer Bedeutung. Kürzlich verdffentlichte Besprechungen von antisense-Oligonukleotiden finden sich in van der Krol et al., BioTechniques, 6: 958 (1988) und Zon, Pharmaceutical Res., 5: 539 (1988).
Die Aufnahme von Nukleotiden durch Zellen und Liposome ist aufgrund der hohen Ladungsdichte des Nukleotids normalerweise ein ineffizienter Prozeß. Eine Anzahl an Schemata wurden verwendet, um die Einbaueffizienz zu erhöhen, nämlich die durch Kalziumphosphat vermittelte Genübertragung (Chen, C.A. und Okayama, H. BioTechniques, 6: 632 (1988)), die Verwendung von retroviralen Vektoren (Eglitis, M.A. et al., BioTechniques, 6: 608 (1988)), Mikroinjektion (DePamphilis, M.L. et al., BioTechniques, 6: 662 (1988)), die Verwendung von Adenovirus-Vektoren (Berkner, K.L., BioTechniques, 6: 616 (1988)), Elektroporation (Andreason, G.L. und Evans, G.A. BioTechniques, 6: 650 (1988)), die rasche Beschleunigung von DNA-beschichteten Goldpartikeln (Christou P. et al., Plant Physiol., 87: 671-674 (1988)) und die durch Liposomen vermittelte Genübertragung (Mannino, R.J. und Gould-Fogerite, S., BioTechniques, 6: 682 (1988)). Alle diese Verfahren weisen ein oder mehrere Probleme auf, die mit der Zelltoxizität, der Einführung potentiell pathogener Virenfaktoren, der schlechten Reproduzierbarkeit und Schwierigkeit der Durchführung oder der Ineffizienz der DNA-Zufuhr in Zusammenhang stehen.
In jüngster Zeit wurde DNA, die kovalent an Zellrezeptor-Ligandenproteinen befestigt ist, wie z.B. an jenes für den epidermalen Wachstumsfaktor, als Mittel untersucht, eine zellspezifische DNA-Zufuhr durchzuführen. Siehe EP 273.085, veröffentlicht am 6.Juli 1988. Außerdem wurde gezeigt, daß DNAs, die mit Zucker-Lysinkonjugaten (Wu, G.Y. und Wu, C.H., J.Biol.Chem., 263: 14621 (1988)) und mit einem positiv geladenen Lipid, d.h. N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, das in einem Liposom eingeschlossen war (Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987)) zu einem Komplex verbunden waren, die Transfektionseffizienz steigern.
Protein-DNA-Konjugate kommen in der Natur vor und sind bei der Virenreplikation von Bedeutung. Siehe Vartapetian und Bogdanov, A.A. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 34: 210 (1987). Nicht in der Natur vorkommende Hybride wurden hergestellt, in denen DNA mit Ziel-, Spaltungs- oder Reportergruppen verbunden ist, einschließlich Peptiden, Biotin, fluoreszierenden Farbstoffen und EDTA-Fe. Siehe Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 6592 (1988); Haralambidis et al., Tetrahedron Lett., 28: 5199 (1987); Connolly, Nucl. Acids Res., 15: 3131 (1987); Agrawal et al., Nucl. Acids Res., 14: 6227 (1986); Smith et al., Nucl. Acids Res., 13: 2399 (1985); Moser und Dervan, Science, 238: 645 (1987).
Phosphatidylnukleoside sind biosynthetische Zwischenprodukte im Lipidmetabolismus, und eine Anzahl an Derivaten davon zeigte interessante biologische Aktivitäten. Shuto, S. et al., Chem. Pharm. Bull., 36: 209 (1988) (5'-(3-sn-Phosphatidyl)nukleoside für antileukämische Aktivität); US PS Nr. 4.797.479, herausgegeben am 10. Januar 1989 an Shuto et al (Phospholipidnukleosid-Komplex, der durch das Umsetzen von L-Glycerophospholipid mit Nukleosid in Gegenwart von Phospholipase D zur Tumorbehandlung hergestellt wird); Matsushita, T. et al., Cancer Res., 41: 2707 (1981) (Nukleosid 5'-diphosphat-L-1, 2-dipalmitin-Derivate von 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin, 9-β-D-Arabinofuranosyladenin und Tubercidin für verbesserte katabolische Stabilität); Turcotte, J. G. et al., Biochem. Biophys. Acta, 619: 604 (1980) und 619: 619 (1980) (Analoge von Cytidindiphosphatdiacylglycerin, das die 1-β-D-Arabinofuranosyl-Gruppe für krebsbekämpfende Aktivität enthält). Es wurde in letzter Zeit von einem Cholesterin-Nukleosidkonjugat zur Anwendung in Liposomen berichtet. Hashida et al., Chem. Pharm. Bull., 36: 3186 (1988).
Es stellte sich heraus, daß Kombinationen von Ätherlipidanalogen und DNA-interaktiven Agentien, d.h. Adriamycin, 4-Hydroperoxycyclophosphamid und Cisplatin, die krebsbekämpfende Aktivität in additiver Weise steigern. Noseda et al., Cancer Res., 48: 1788-1791 (1988).
Transfektionsverfahren, die sich für therapeutische in vivo-Anwendungen eignen, z.B. bei denen fremde Sequenzen aktiver Nukleinsäuren einem lebenden Organismus zugeführt werden können, um einige Defizienzen des Zellmetabolismus zu heilen, sind entwickelt wurden. Beispielsweise berichtet Cheng et al., Nucl. Acids. Res., 11: 654-669 (1983), daß das Konstrukt des an α2-Makroglobulin gebundenen Chloramphenicol-Acetyltransferasegens in 3T3-4-Zellen internalisiert war. Es wurde jedoch kein Beweis erbracht, daß die internalisierte DNA eine Funktion in den Wirtszellen zu erfüllen imstande war. EP 273.085, veröffentlicht am 6.Juli 1988, offenbart das Verbinden einer Nukleinsäure mit einem Zellansteuerungs- oder Zielfaktor, der das Eindringen der fremden Nukleotide durch die Zellmembran hindurch fördert, jedoch wenig Spezifitat hinsichtlich der Zellerkennung aufweist. Zu solchen Zielfaktoren gehören Lipoproteine mit niedriger Dichte, Wachstumsfaktoren, virale Antigene und die B-Kette von Toxinen.
Die Verwendung von hydrophoben 5'-Schutzgruppen für die HPLC-Reinigung von chemisch synthetisierten Oligodesoxynukleotiden durch Festträger-Verfahren wurde in letzter Zeit untersucht. Seliger und Schmidt, J.Chromatography, 397: 141-151 (1987); Schmidt et al., Nucleosides and Nucleotides, 7: 795-799 (1988).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein hochwirksames Vehikel zur Einführung von DNA durch Zellmembranen hindurch bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Transfektionsverfahren zur Internalisierung aktiver Oligo- und Polynukleotide, z.B. antisense-DNA bereitzustellen, die in der Zelle mit mRNA hybridisieren und somit zellulare oder virale Funktionen hemmen kann.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Agens bereitzustellen, das stabiler als DNA-Lipidkomplexe ist und ein Substrat für zellulare Lipasen ist, sodaß das Molekül abgespalten wird, wenn es mit membrangebundenen intrazellularen cytoplasmischen Enzymen in Kontakt kommt, um das Arzneimittel zur Verwendung durch die Zelle freizusetzen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Liposom bereitzustellen, das ein solches Agens einkapselt.
Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Assay für Nukleinsäuren und Antikörper bereitzustellen, die das Agens einbauen.
Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein kovalentes Konjugat aus einem Lipid und einem Oligonukleotid, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon bereitgestellt, worin das Lipid über Phosphat kovalent mit dem 5'-Ende des Oligonukleotids verbunden und aus Steroiden, Glyceriden und Glyceryläthern ausgewählt ist; mit der Maßgabe, daß das Konjugat nicht am 5'-Phosphat mit Cholesterin modifiziertes Nonathymidyluridin ist. Vorzugsweise hat das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz, die zu einer pathogenen Nukleinsäure oder einem Onkogen ausreichend komplementär ist, um damit zu hybridisieren.
Das Konjugat kann markiert oder auf einem festen Träger immobilisiert sein.
Das obige Konjugat kann durch Transfizieren der Wirtszelle mit dem Konjugat in die Wirtszelle eingeführt werden.
Das Konjugat kann als Zusammensetzung formuliert werden, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und das Konjugat umfaßt, wobei der Träger vorzugsweise ein Liposom ist. Dieses kann in einem Verfahren verwendet werden, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge der obigen Zusammensetzung an eine Pflanze, ein Tier oder einen Menschen umfaßt, die an einer pathogenen Erkrankung leiden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für einen Assay einer Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Nukleotidsequenz in einer Probe bereit, umfassend:
(a) das Schaffen des Konjugats gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung als markiertes Konjugat, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Sequenz fähig ist;
(b) das Immobilisieren des markierten Konjugats auf einem Träger;
(c) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem immobilisierten Konjugat unter Bedingungen, die Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats verursachen würden, wenn die Nukleinsäure in der Probe vorhanden ist; und
(d) das Nachweisen der Gegenwart von markierten Oligomeren.
In einem zusätzlichen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen eines Oligonukleotids aus einer Mischung bereit, welches Verfahren umfaßt:
a) das Schaffen des Konjugats mit einer Nukleotidsequenz, die zur Hybridisierung mit einer innerhalb des abzutrennenden Oligonukleotids enthaltenen Sequenz fähig ist;
b) das Immobilisieren des Konjugats auf einem Träger;
c) das In-Kontakt-Bringen der Mischung mit dem immobilisierten Konjugat unter Bedingungen, die das Hybridisieren des Oligonukleotids der Mischung mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats verursachen; und
d) das Abtrennen der hybridisierten Oligonukleotide.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen eines Oligonukleotids aus einer Mischung bereit, welches Verfahren umfaßt:
(a) das Schaffen des Konjugats gemäß dem ersten Aspekt mit einer Nukleotidsequenz, die zum Hybridisieren mit einer im abzutrennenden Oligonukleotid enthaltenen Sequenz fähig ist, in einer hydrophoben Phase;
(b) das Schaffen der Mischung in einer hydrophilen Phase;
(c) das In-Kontakt-Bringen der die Mischung enthaltenden Phase mit der das Konjugat enthaltenden Phase unter Bedingungen, welche die Hybridisierung des Oligonukleotids der Mischung mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats bewirken; und
(d) das Extrahieren der hybridisierten Oligonukleotide aus der die Mischung enthaltenden Phase und ihren Transport zu einer getrennten hydrophilen Phase.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von Lupus erythematosus bei einem Menschen bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Serumprobe aus dem Menschen mit einem Liposom, welches das Konjugat und einen Marker umfaßt, wobei genanntes In-Kontakt-Bringen so erfolgt, daß Antikörper im Serum sich an das Oligonukleotid am Liposom binden, um die Stabilität des Liposoms zu verändern; und das Messen in Hinblick auf die Gegenwart oder Abwesenheit des Markers.
Die Erfindung dreht sich hiebei um kovalente Konjugate von Lipiden und Oligonukleotiden, die interessierende Nukleotidsequenzen enthalten oder ausreichend komplementär sind, um mit interessierenden Sequenzen zu hybridisieren. Das Lipid kann wirken, um die Nukleinsäuresequenz zu internalisieren, die typischerweise durch Endocytosis chemisch dazu in Wirtszellen gekoppelt und durch eine Kopplung an das Oligonukleotid gebunden ist, die ausreichend labil ist, daß sie das nachfolgende biochemische Wirken des Oligonukleotids in der Zelle nach der Internalisierung nicht unterdrückt. Vorzugsweise ist das Konjugat ein Substrat für ein zellulares Enzym, welches das Konjugat spaltet, um die Oligonukleotide freizusetzen. Das Lipid ist geeigneterweise an eine beliebige Gruppe auf dem Oligonukleotid kovalent gebunden, wie z.B. eine Aminogruppe auf der Base, die Hydroxylgruppe des Phosphats oder eine Hydroxylgruppe am 5'- oder 3'-Terminus des Oligonukleotids. Vorzugsweise ist es jedoch an die 5'-Hydroxylgruppe davon gebunden.
Von besonderem Interesse sind hierin Konjugate, die eine Spaltungsstelle innerhalb des Lipids enthalten oder die kovalente Bindung zwischen dem Lipid und dem Oligonukleotid darstellen, die spezifisch durch ein zu einer Wirtszelle endogenes Enzym erkannt wird, auf die das Konjugat gezielt ist. Somit bricht die Spaltung an dieser Stelle die Bindung auf oder hydrolysiert das Lipid, um das Konjugat mehr wasserlöslich zu machen. Vorzugsweise ist die Spaltungsstelle Enzymhydrolyse-empfindlich. Es ist auch vorzuziehen, daß sich das Enzym an der zellularen oder nuklearen Membran oder im Cytoplasma einer Zelle befindet.
Hierin sind die am meisten bevorzugten Lipide Phospholipide, worin das Enzym, das die Spaltungsstelle erkennt, eine Lipase, vorzugsweise eine Phospholipase ist. Weiters ist die Spaltungsstelle vorzugsweise die Bindung zwischen dem 5'-Hydroxylsauerstoffatom des Oligonukleotids und dem Phosphoratom (im Falle von Phospholipase D) oder die Bindung zwischen dem Sauerstoffatom auf der Glycerinseite und dem Phosphoratom (im Falle von Phospholipase C). Phospholipase C und D sind ubiquitäre membrangebundene cytoplasmische Enzyme, welche die Hydrolyse bestimmter Phosphoesterbindungen katalysieren, wodurch das Konjugat gespalten und das Oligonukleotid in das Zytoplasma freigesetzt wird. Dennis, E.A. bespricht Phospholipasen in "The Enzymes", Band XVI (New York: Academic Press, Inc., 1983) S. 307-353). Es ist vorzuziehen, die Spaltung durch Phospholipase C oder D anstelle anderer Lipasen zu maximieren, die Fettsäuren spalten, um so auf dem Oligonukleotid einen Lipidrest zu belassen.
Geeignete Phospholipide sind hierin z.B. Phosphoglyceride, Plasmalogene und andere Phosphatidinsäuren, Sphingomyelin und 3'-O-Aminoacylphosphatidylglycerin.
Der "Oligonukleotid"-Abschnitt des Konjugats bezieht sich auf ein Molekül, das aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden gebildet ist und eine Nukleotidsequenz aufweist, die entweder von Interesse oder ausreichend komplementär ist, um mit einer interessierenden Nukleotidsequenz zu hybridisieren. Das Oligonukleotid ist typischerweise eines, das eine biochemische Funktion in Rezeptor-Wirtszellen erfüllen und/oder das Wirken der Zellmaschinerie verändern kann. Seine genaue Größe hängt von zahlreichen Faktoren ab, die ihrerseits von der Endfunktion oder -verwendung des Oligonukleotids abhängen. Wenn das Oligonukleotid z.B. als ein antisense-Oligomer verwendet werden soll, um dessen Spezifität sicherzustellen, muß die Sequenz in der mRNA-Population einzigartig und zur Ziel-RNA komplementär sein.
Es wurde errechnet, daß eine Kettenlänge von 14 Nukleotiden ausreichen kann, um die Sequenzspezifität von Oligonukleotiden zu definieren. Siehe Ts'0 et al., "Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs", Band 507, Ann. N.Y. Acad. Sciences, 1987. Eine Vergrößerung der Länge des Oligonukleotids steigert die Stabilität des gebildeten Duplexes und somit seiner Hemmwirkung. Auf der anderen Seite können sehr lange Oligomere mit zwei oder mehreren mRNAs durch Basenpaarung zusammenwirken, wobei nur 5-10 angrenzende Basen innerhalb der Sequenz des Oligonukleotids beteiligt sind, wodurch die Spezifität des Oligonukleotids gesenkt wird. Zur allgemeinen Verwendung enthält das Oligonukleotid zumindest fünf Basen, noch bevorzugter von etwa fünf bis etwa 30 Basen und am meisten bevorzugt von etwa 14 bis etwa 25 Basen.
Hierin sind die Oligonukleotide ausgewählt, um entweder die interessierende Nukleotidsequenz zu enthalten oder zu dieser ausreichend komplementär zu sein, um mit ihr zu hybridisieren Daher muß die Oligonukleotidsequenz die genaue Sequenz der interessierenden Nukleotidsequenz nicht widerspiegeln. Beispielsweise kann ein nichtkomplementares Nukleotidfragment am 5'-Ende des Oligonukleotids befestigt sein, wobei der Rest der Sequenz zum interessierenden Nukleotidstrang komplementär ist. Alternativ dazu kann das Oligonukleotid mit nichtkomplementären Basen oder längeren Sequenzen durchsetzt sein, mit der Maßgabe, daß seine Sequenz fähig ist, mit der Zielnukleinsäure zu hybridisieren.
Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Ausdruck "Oligonukleotid" auch Oligonukleotide, die Modifikationen des Zucker-Phosphodiester-Rückgrats aufweisen, um ihre Empfindlichkeit gegenüber zellularen Nukleasen zu verringern und die Absorption bzw. Aufnahme durch die Zelle je nach Bedarf zu erhöhen. Ein Beispiel sind Methylphosphonate, worin eines der Sauerstoffatome durch eine Methylgruppe substituiert ist, was zu vier verschiedenen Substituenten am Phosphoratom führt, wie dies durch van der Krol et al., siehe oben in Tabelle 1 geoffenbart ist. Es stellte sich heraus, daß Oligomermethylphosphonate, die gegen HSV-1 unmittelbare Früh-mRNA-4 und -5 gerichtet waren, die Expression von herpetischen Läsionen verhindern, wenn sie in Cremeform auf das HSV-infizierte Ohr einer Maus aufgetragen wurden und daß sie für Mäuse nicht toxisch sind, wenn sie in Konzentrationen von bis zu 40 mg/kg Körpergewicht intravenös injiziert wurden. Miller et al., Anti-Cancer Drug Design, 2: 117-128 (1987); Ts'O et al, siehe oben. Weiters stellte sich heraus, daß Phosphorthioate hochwirksame Inhibitoren von viraler Proliferation, insbesondere von HIV sind. Matsukura et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 7706-7710 (1987); Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7079-7083 (1988).
Die Definition von "Oligonukleotiden" umfaßt auch jene mit einem kovalent gebundenen Reagens neben dem Lipid, das die Affinität für die Komplementärsequenz erhöht. Beispielsweise kann das Koppeln von Poly-(L-lysin) an das 3'-Ende eines antisense-VSV-Oligonukleotids angewendet werden, um seine antivirale Aktivität zu steigern. Weiters kann ein Phosphorthioatoligomer an ein Poly-(L-lysin) gekoppelt werden, um die wirksame Dosis zu senken. Außerdem ist ein Phosphorthioatoligonukleotid hierin nützlich, da es gegenüber Spaltung durch Nukleasen stabil ist, in Wasser sehr löslich ist und wirkungsvoller mit einer komplementären DNA-Sequenz hybridisiert als die entsprechenden Methylphosphonatanaloge. Siehe z.B. Marcus-Sekura et al., Nucl. Acids Res., 15: 5749-5763 (1987). Ein eingelagertes Agens wie z.B. Acridin kann am 3'-Ende des Oligonukleotids hinzugefügt werden, um seine Affinität für das Ziel zu steigern. Andere Verfahren umfassen das Befestigen eines reaktionsfähigen Agens am antisense-Oligomer, um die Zielnukleinsäure irreversibel zu modifizieren, einschließlich alkylierender Reagentien, Metallkomplexe wie z.B. EDTA-Fe(II), o-Phenanthrolin-Cu(I) oder Porphyrin-Fe(II). Solche Verbindungen erzeugen Hydroxylradikale in Gegenwart von molekularem Sauerstoff und eines reduzierenden Agens und spalten den Komplementärstrang nach dem Angriff auf das Zielnukleinsäure-Rückgrat. Weiters kann ein Photovernetzungsagens am Oligomer befestigt werden, wie z.B. ein Psoralenderivat, Azidophenacyl und Proflavin.
Vorzugsweise ist das Lipid ein Glycerid oder Glyceryläther der Formel
worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; voneinander unabhängig aus H, C&sub1;-C&sub3;&sub0; Alkyl, C&sub2;-C&sub3;&sub0; mono-, di-, oder polyungesättigtem Alkyl, C&sub3;-C&sub8; Cycloalkyl oder C&sub4;-C&sub8; mono-, di- oder polyungesättigter Cycloalkylgruppe ausgewählt sind und X O oder -O.CO- ist.
Vorzugsweise ist die Oligonukleotidgruppe ausgewählt aus (ab dem 5'-Ende), (ab dem 3'-Ende), (ab dem 3'-enol-6-gliedrigen Ring, Agrawal et al., Nucl. Acids Res., 14: 6227-6245 (1986), (ab dem internukleotidischen Phosphat), (ab der N-Base), oder (ab der N-Base),
worin B eine von der Schutzgruppe befreite Base ist, p eine ganze Zahl von etwa 5 bis 30 ist, q und r ganze Zahlen von etwa 1 bis 28 sind, mit der Maßgabe, daß r + q von etwa 4 bis 29 ausmacht, s und t ganze Zahlen von 0 bis etwa 29 sind, mit der Maßgabe, daß s + t von etwa 4 bis 29 ausmacht, E X oder ZX ist und D aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (wobei die Bindung von den Ringstickstoffen an der Zuckergruppe des Oligonukleotids befestigt ist):
Die hierin verwendeten Ausdrücke "Alkyl" und "Cycloalkyl" beziehen sich sowohl auf geradkettige und verzweigte Alkylgruppen als auch auf Cycloalkylgruppen mit geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen, die am Ring hängen. "Mono-, di- und polyungesättigte" Alkyl-, Cycloalkyl- oder Alkylen- (zweiwertige Alkyl)-Gruppen beziehen sich auf Kohlenwasserstoffe, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppel- oder Dreifachbindungen irgendwo entlang ihrer Kette enthalten. Beispiele von Verbindungen, die ungesättigte cyclische oder acyclische Gruppen bereitstellen können, sind Terpene, wie z.B. Phytol, Geraniol, Limonen, Farnesol und Squalen, Vitamine, wie z.B. Vitamin A, D und K, und β-Carotin, und Prostaglandine.
Wenn das Lipid eine Steroidgruppe ist, ist es vorzugsweise ein Sterin und noch bevorzugter ein Sterin, das über die Hydroxylgruppe (entweder als Äther oder Ester) an das Oligonukleotid an seiner C&sub3;-Position gebunden ist. Beispiele geeigneter Steroide sind Cholesterin, Lanosterin, ein Phytosterin oder ein Mycosterin, z.B. Ergosterin.
Wenn das Oligonukleotid ab der N-Base verbunden ist, ist es vorzugsweise ab der N6 eines Adeninrests oder N4 eines Cytosinrests.
Es ist wünschenswert, Oligonukleotide bereitzustellen, die eingefügte Basen enthalten, die sterisch begrenzt sind, sodaß der Zielstrang translational inaktiviert ist, wobei zumindest eine der Basen eine im wesentlichen planare Base ist. Die solcherart derivatisierten Oligonukleotide hybridisieren mit ihrem komplementären RNA- oder DNA-Strang, wobei das modifizierte Nukleosid ungepaart, doch zwischen den angrenzenden Basenpaaren im Duplex in einer stereochemisch genau definierten Weise eingefügt bleibt. Angesichts des genauen sterischen Zielens, das durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, kann die eingefügte Gruppe mit einer reaktionsfähigen Gruppe substituiert werden, die eine vorbestimmte Stelle im Komplementärbereich kovalent modifizieren kann. Zu solchen reaktionsfähigen Gruppen gehören Vernetzungsmittel und Phosphatbindungen spaltende Mittel. Diese reaktionsfähigen Gruppen sind sterisch begrenzt und treten weniger wahrscheinlich mit zellularen Komponenten oder Nukleinsäuren an anderen Stellen als der Zielkomplementärsequenz in Wechselwirkung.
Der Ausdruck "im wesentlichen planar" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die sterische voluminöse Masse der Gruppe im wesentlichen innerhalb einer Hülle nahe des sterischen Spalts liegt, der durch das Zuckerrückgrat und flankierende Basen begrenzt ist, die in einem komplementären Nukleinsäurestrang vorhanden sind. Im allgemeinen hat diese Hülle Äbmessungen von etwa 30-50 Ängström in der Breite und Tiefe und etwa 3-7 Angström in der Dicke. Ein Beispiel ist ein Nukleosid mit der Struktur:
worin R&sub3; ein aromatischer Polyzyklus ist, Y C oder N ist, R&sub7; N oder =C(R&sub1;)- ist, R&sub1; und R&sub6; H oder eine Halogen-, Nitro-, Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkyläthergruppe sind, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 C-Atome aufweist, und R&sub2; ein Ribose- oder Desoxyribosezucker ist.
Die interessierenden Nukleinsäuresequenzen umfassen mRNA und DNA und können in Restriktionsenzymdigesten oder anderen Fragmenten von Nukleinsäuren vorhanden sein, z.B. Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs). Die Nukleinsäure oder -säuren können aus jeder beliebigen Quelle, z.B. aus Plasmiden wie z.B. pBR322, aus geklonter DNA oder RNA oder äüs natürlicher DNA oder RNA aus jeder beliebigen Quelle, z.B. Bakterien, Hefe, Viren und höheren Organismen wie z.B. Pflanzen oder Tieren gewonnen werden. Für therapeutische Zwecke sollten die antisense-Oligonukleotide so ausgewählt sein, daß eine wirkungsvolle und spezifische Wechselwirkung mit der Ziel-mRNA, eine wirkungsvolle Aufnahme durch die Zelle und Aufteilung des Oligonukleotids und ausreichende Stabilität in den verschiedenen Zellabteilungen erzielt wird.
Zur diagnostischen Verwendung kann das Oligonukleotid eine Sequenz enthalten, die für ein diagnostisch nützliches Protein kodiert, z.B. für pathogene Proteine, wie z.B. jene, die für virale Infektionen, einschließlich AIDS, verantwortlich sind, Onkogene, Wachstumsfaktoren, β-Globin u.ä. Außerdem können andere Nukleinsäuren, die für kein Protein kodieren, von Interesse sein, z.B. Transkriptions- oder Translationssteuerbereiche oder -sequenzen, die sich für die Gerichtsmedizin eignen.
Am bevorzugtesten eignen sich die hierin angeführten Konjugate als Agentien für die antisense-Hemmung der Translation von Zielnukleinsäuren. Solche Anwendungsmöglichkeiten wurden bereits hinsichtlich anderer antisense-Oligonukleotide ausführlich untersucht (siehe van der Krol et al., oben, und WO 83/01451, veröffentlicht am 28.April 1983), und die hierin angeführten Oligonukleotide werden im wesentlichen in der gleichen Weise verwendet, nämlich unter Verwendung einer rationalen, spezifischen Konstruktion, die auf der Sequenz und der Sekundärstruktur-Information der Ziel-RNA oder -DNA beruht, wobei zu berücksichtigen ist, daß die Sekundär- oder Tertiärstruktur in der antisense-RNA das Ausmaß oder die Rate der Hybridisierung beeinflussen kann. Für diese Verwendung weist das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz auf, die mit einer pathogenen Nukleinsäure oder einem Onkogen, noch bevorzugter mit einer viralen oder parasitären Nukleinsäure hybridisieren kann, die eine Pflanze, wie z.B. eine Gemüsepflanze, ein Tier wie z.B. ein Haus-, Sport- oder Zuchttier, z.B. Hunde, Katzen, Kühe und Schweine, oder einen Menschen infiziert. Z.B. können antisense-Oligonukleotide entweder in modifizierter oder unmodifizierter Form verwendet werden, um virale Infektionen des Rous- Sarkomvirus, des vesikularen Stomatitis-Virus, des Typ A Influenza-Virus, des Herpes simplex-Virus, des HIV-Virus zu hemmen und Pflanzenviren wie z.B. das Kartoffelvirus X Hüllproteingen und das Gurkenmosaik-Virus-Hüllproteingen verwendet werden, um parasitäre, z.B. Malaria-Infektionen zu hemmen und die Expression des Proto-Onkogens c mvc (für die Leukämiebehandlung), des Affen-Sarkomvirus, β-Globins und der β-Tubulingene zu verringern. Beispiele veröffentlichter Virensequenzen, die eine hemmende Wirkung aufweisen, umfassen jene gegen das Rous-Sarkomvirus (Zamecnik und Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 280-284 (1978); Stephenson und Zamecnik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 285-288 (1978)), jene gegen das menschliche T-Zellen-Lymphotropenvirus Typ III (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4143-4146 (1986); WO 87/07300, veröffentlicht am 3. Dezember 1987) und jene gegen das Herpes simplex-Virus Typ I (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2787-2791 (1986)).
In die Definition nützlicher Oligonukleotide zum Inaktivieren von pathogenen Nukleinsäuren sind Oligonukleosid-Alkyl- oder Arylphosphonatanaloge eingeschlossen, die zur pathogenen Zielsequenz komplementär sind und eine funktionale Gruppe umfassen, die mit der Ziel-Nukleinsäure reagiert, um sie inaktiv oder nichtfunktional zu machen. Diese Derivate sind in EP 266.099, veröffentlicht am 4.Mai 1988, beschrieben.
In anderen Ausführungsformen weist das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz auf, die eine Spaltungsstelle darstellt oder fähig ist, mit einer Spaltungsstelle zu hybridisieren, die spezifisch durch ein Enzym erkannt wird, das zu einer Wirtszelle endogen ist, auf die das Konjugat gezielt ist. Das Oligonukleotid kann z.B. eine durch das RNase-H-Enzym erkannte Sequenz umfassen. Dieses Enzym spaltet den RNA-Teil eines RNA/DNA-Hybrids in vivo, was zu einem nachfolgenden Abbau der mRNA führt. Somit kann die Wirkung des antisense-Oligomers katalytisch durch RNase-H-Aktivität verbessert werden.
Da die Spleißverbindungsstellen von prä-mRNAs mit den RNAs kleiner Ribonukleoprotein-Teilchen in Wechselwirkung treten, die den Spleißprozeß vermitteln, sind diese Bereiche des Boten ideale Ziele für komplementäre Oligomere. Demnach umfaßt die Erfindung antisense-DNA oder ihre gegen Analoge gerichteten Spleißverbindungsstellen, insbesondere wenn sich herausstellt, daß eine solche antisense-DNA beim Hemmen der Ausbreitung von HIV (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7079-7083 (1988)), HSV (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2787-2791 (1986)) oder der Synthese des SV40 großen T-Antigens (Verspieren et al., Gene, 61: 307-315 (1987) wirksam ist. Weiters betrifft die Erfindung komplementäre Oligomere, die konstruiert sind, um mit der Kappenstelle oder dem Einleitungscodonbereich auf der mRNA in Wechselwirkung zu treten. Es wurde außerdem gezeigt, daß die antisense-Oligomeren, welche die Ribosomenbefestigungsstelle blockieren, für diesen Zweck sehr wirksam sind.
Die hierin angeführten Oligonukleotide werden geeigneterweise unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie z.B. durch das Phosphotriester- oder Phosphodiester-Verfahren, die durch Narang, S.A. et al., Meth. Enzymol., 68: 90 (1970) und Brown, E.L. et al., Meth. Enzymol., 68: 109 (1979) beschrieben sind, oder durch automatisierte Ausführungsformen davon hergestellt. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Phosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können synthetisiert werden, wie dies durch Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862 (1981) beschrieben wird. Ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden auf einem modifizierten festen Träger ist in der US PS 4.458.066 (herausgegeben am 3.Juli 1984) beschrieben. Es ist auch möglich, ein Oligonukleotid zu verwenden, das aus einer biologischen Quelle, wie z.B. einem Restriktionsendonukleasedigest isoliert wurde.
Die Konjugate werden durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt. Beispielsweise können H-Phosphonatverfahren zur Synthetisierung von Phospholipidkonjugaten verwendet werden, wie dies durch Lindh und Stawinki, J. Nucleic Acids Res., Symp. Ser.Nr. 18, 189 (1987) beschrieben ist. Die Synthese der gleichen Verbindungen wird auch unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie erreicht, wie dies durch Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett., 1859 (1981) und McBride und Caruthers, Tetrahedron Lett., 245 (1983) beschrieben ist. Der Hauptvorteil der Anwendung der H-Phosphonat-Verfahrensweise ist die Flexibilität des Oxidationsvorgangs. Wenn die Oxidation mit Kohlenstofftetrachlorid in Gegenwart von Aminen durchgeführt wird, sind Phosphoramidate verfügbar, wohingegen Oxidation mit Schwefel zu Phosphorthioatanalogen führt und Kohlenstofftetrachlorid in Gegenwart von Alkohol Phosphattriester erzeugt. Froehler, Tetrahedron Lett., 27: 5575 (1986).
Die chemische Befestigung von Lipiden an Oligodesoxynukleotiden durch die herkömmliche Festträger-DNA Synthesevorschrift kann für Lipide verwendet werden, die normalerweise den Entblockungsbedingungen gegenüber, d.h. konzentriertem Ammoniak, stabil sind. Solche Lipide umfassen Atherlipide oder Amidlipide, einschließlich Triglyceriden und Sterinen, die Amidfunktionalitäten in ihrem Rückgrat enthalten. Von Fettsäure abgeleitete Lipide, die Esterbindungen enthalten, würden normalerweise solchen Bedingungen gegenüber stabil sein. Die letzteren Lipide können mittels des Verfahrens von Chu et al., Nucl. Acids Res., 11: 6513-6529 (1983) konjugiert werden. Dieses Verfahren erfordert es, daß das Lipid eine freie primäre oder sekundäre Aminogruppe enthält. Das Lipid kann eine solche Aminogruppe bereits in einer Seitenkette enthalten, wie Z.B. im Falle von Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidyl- 3'-O-aminoacylglycerin und Phosphatidylserin, oder es kann derivatisiert sein, um eine solche Aminogruppe zu enthalten. Mittels des Verfahrens nach Chu et al. wird das Aminolipid an ein Oligomer-5'-Phosphat gekoppelt, um Lipidoligonukleotidkonjugate zu erzeugen. Phospholipide können weiters geeigneterweise unter Verwendung von Phospholipase D enzymatisch an Oligonukleotide gebunden werden, wie dies bezüglich der Synthese von Nukleosidlipidkonjugaten berichtet wurde. Siehe Shuto et al., oben.
Eine Verwendung des Koniugats ist hier die Verwendung für die Transfektion von Wirtszellen, sodaß DNA darin stabil eingearbeitet ist. Die Transfektion umfaßt lediglich das In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Konjugat, z.B. durch Rühren bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von zumindest etwa 15 Stunden, vorzugsweise etwa 20-30 Stunden.
Ein anderer Verwendungszweck ist die Behandlung eines Säugetiers mit einer pathogenen Erkrankung, die durch die Verwendung eines Oligonukleotids mit einer Nukleotidsequenz gelindert öder geheilt wird, welche eine für die Erkrankung verantwortliche Nukleinsäure blockt. Beispiele solcher Erkrankungen sind jene, die durch Onkogene und durch Viren verursachte Infektionen wie z.B. AIDS, Herpes, Hepatitis usw. bewirkt werden.
Das zu behandelnde Säugetier kann jede beliebige Säugetierspezies sein, wie z.B. Haus- und Zuchttiere, einschließlich Primaten, und Sport- bzw. Kuscheltiere, sowie Menschen. Vorzugsweise ist die bevorzugte behandelte Spezies jedoch der Mensch.
Das Konjugat wird dem Patienten durch jedes beliebige geeignete Verfahren verabreicht, z.B. durch parenterale, sublinguale, lokale, intrapulmonare und intranasale Verabreichung. Die spezielle Verabreichungsart hängt z.B. vom Typ der erforderlichen Therapie ab. Beispiele parenteraler Verabreichung sind intramuskuläre, subkutane, intravenöse, intraarterielle und intraperitoneale Verabreichung.
Die bei der Therapie zu verwendenden Konjugate werden in Einklang mit den Geboten der guten medizinischen Praxis formuliert und dosiert, wobei der klinische Zustand des jeweiligen Patienten, die Ursache der therapiebedürftigen Erkrankung, die Zuführungsstelle des Konjugats, das Verabreichungsverfahren, das zeitliche Ansetzen der Verabreichungen und andere dem Praktiker bekannte Verfahren berücksichtigt werden. Die "wirksame Menge" wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung somit durch solche Überlegungen bestimmt.
Als ein allgemeiner Grundsatz liegt die gesamte, pharmazeutisch wirksame Menge des parenteral verabreichten Konjugats pro Dosis im Bereich von etwa 1 ug/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag des Körpergewichts des Patienten, obwohl dies, wie bereits erwähnt, in hohem Maße Ermessenssache des Therapeuten ist. Der entscheidende Faktor bei der Auswahl einer geeigneten Dosis ist das erzielte Ergebnis, das durch die Beseitigung der Infektion oder die Abschwächung bzw. Verkleinerung des Tumors oder durch andere, vom Praktiker als geeignet betrachtete Kriterien gemessen wird.
Zur parenteralen Verabreichung wird das Konjugät im allgemeinen durch Vermischen in einem erwünschten Reinheitsgrad in einer als Dosierungseinheit injizierbaren Form (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Exzipienten oder Stabilisator formuliert, d.h. mit einem, der den Rezipienten gegenüber und bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch und mit anderen Ingredientien der Formulierung kompatibel ist. Zu solchen Materialien gehören hydrophobe Polymere, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate, einschließlich Zellulose oder ihre Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine, Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; und/oder nichtionische oberflächenaktive Stoffe wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG.
Im allgemeinen werden Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges In-Kontakt-Bringen der Konjugate mit flüssigen Trägern, homogenen Phospholipid-Mischungen (zur Liposom-Einkapselung) oder feinteiligen festen Trägern und anschließend (falls erforderlich) durch Formen des Produkts zur gewünschten Formulierung hergestellt.
Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Formulierung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Das Konjugat wird zur Lagerung oder Verabreichung durch Vermischen mit physiologisch verträglichen Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vorbereitet, wenn es den gewünschten Reinheitsgrad aufweist. Solche Materialien sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für Rezipienten nichttoxisch und hängen von der Wasserlöslichkeit des Konjugats ab. Wenn das Konjugat wasserlöslich ist, kann es in einem Puffer wie z.B. Phosphat oder einem anderen organischen Säuresalz vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 formuliert werden. Wenn das Konjugat in Wasser nicht sehr löslich ist, kann es durch Formulieren mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Stoff wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG, z.B. Tween 80, in einer Menge von 0,04-0,05% (G/v) als Mikroemulsion hergestellt werden, um seine Löslichkeit zu verbessern.
Wahlweise können andere Ingredientien wie z.B. Antioxydantien, z.B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate einschließlich Zellulose oder ihre Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; und Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit hinzugefügt werden.
Das zur therapeutischen Verabreichung zu verwendende Konjugat muß steril sein. Sterilität wird problemlos durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2 Mikron-Membranen) erreicht. Das Konjugat wird üblicherweise in lyophilisierter Form oder als wässerige Lösung oder Emulsion gelagert.
Jeder Bezug auf Konjugate umfaßt hierin auch pharmazeutisch verträgliche Salze solcher Verbindungen, und man beachte, daß die Verwendung bestimmter der oben erwähnten Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung solcher Salze führt. Beispiele pharmazeutisch verträglicher Salze umfassen jene alkalischer Erden (z.B. Natrium oder Magnesium), Ammonium oder NX&sub4;&spplus; (worin X C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist). Andere pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen organische Carbonsäuren wie z.B. Essig-, Milch-, Wein-, Apfel-, Isäthion-, Lactobion- und Bernsteinsäure; organische Sulfonsäuren wie z.B. Methansulfon-, Äthansulfon-, Benzolsulfon- und p-Toluolsulfonsäure; und anorganische Säuren wie z.B. Salz-, Schwefel-, Phosphor- und Sulfaminsäure. Physiologisch verträgliche Salze einer Verbindung mit einer Hydroxygruppe umfassen das Anion genannter Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Kation wie z.B. Na&spplus;, NH&sub4;&spplus; und NX&sub4;&spplus; (worin X eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe ist). Therapeutische Konjugatzusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, z.B. in einen Intravenöslösungsbeutel oder ein Fläschchen mit einem Stöpsel, der durch eine subkutane Injektionsnadel durchstechbar ist.
Die hierin angeführten Konjugate werden geeigneterweise auch über Systeme mit Langzeitwirkung verabreicht. Geeignete Beispiele von Zusammensetzungen mit Langzeitwirkung umfassen halbdurchlässige Polymermatrizes in Form geformter Gegenstände, z.B. Filme oder
Mikrokapseln. Matrizes mit Langzeitwirkung sind z.B. Polylactide (US PS 3.773.919, EP 58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Äthyl-L-glutamat (U.Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), Poly(2-hydroxyäthylmethacrylat) (R.Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) und R.Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), Äthylenvinylacetat (R.Langer et al., ebda.) oder Poly-D-(-)-hydroxybuttersäure (EP 133.988).
Konjugatformulierungen mit Langzeitwirkung umfassen auch liposomal eingeschlossene Konjugate. Solche Systeme haben den Vorteil, daß biologisch aktives Material durch Phagocytose in Gewebe eingeführt werden kann, insbesondere in Gewebe des Reticuloendothelialsystems. Konjugate enthaltende Liposomen werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt, einschließlich: DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); G. Gregoriadis, Liposome Technology, Band II Incorporation of Drugs, Proteins, and Genetic Material, CRC Press, 1984; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; japanische Patentanmeldung 83-118008; US PSen 4.485.045; 4.774.085 und 4.544.545; und EP 102.324. Zusätzlich kann das Liposom zur Steigerung der Aufnahme durch die Zellen antikörper-beschichtet sein, wie dies durch Wang und Huang, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84: 7851-7855 (1987) besprochen wird. Die erhaltenen Liposome können bis zu mehreren Wochen oder Monaten nach Zugabe von Stabilisatoren, z.B. Lactose, gelagert werden.
Die Größe der gebildeten Liposome hängt z.B. von der Struktur des aktiven Ingrediens und der Lipidkomponente, dem Mischverhältnis der Lipidkomponenten und der Konzentration dieser Komponenten in der wässerigen Dispersion ab. Durch Erhöhen oder Verringern der Konzentration der Lipidkomponente z.B. ist es somit möglich, wässerige Phasen mit einem hohen Gehalt kleiner oder großer Liposomen zu erzeugen. Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) Einlamellentyp, in dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil zur optimalen Therapie eingestellt wird.
Zur parenteralen Verabreichung wird die liposomenhältige wässerige Dispersion geeigneterweise mit herkömmlichen Verdickern, z.B. Hydroxypropylzellulose, geeigneten Konservierungsstoffen und Antioxydantien vermischt, und sie kann in der Form einer Lotion oder eines Gels zum Auftragen auf die Haut oder Schleimhaut verwendet werden. Zur parenteralen Verwendung kann die wässerige Dispersion der angereicherten Liposomen in einer geeigneten Trägerflüssigkeit suspendiert werden, z.B. in einer sterilen, kalziumfreien, isotonischen Natriumchlorid- oder Glucoselösung, die wahlweise auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 gepuffert ist.
Man schätzt, daß die für einen etwa 70 kg schweren Menschen anzuwendende Dosis im Bereich von etwa 200 mg bis 1 g Liposome liegt, die jeweils etwa 0,1 bis 500 mg eingeschlossenes Konjugat enthalten. Die höchste und niedrigste Dosis des eingekapselten Materials, die Konzentration des Phospholipds in der wässerigen Phase sowie die Anteile der eingekapselten Phospholipide können je nach den in klinischen Versuchen experimentell zu erzielenden Ergebnissen variieren, wobei die "wirksame Menge" dabei von den solcherart erzielten Ergebnissen abhängt.
Das liposomale pharmazeutische Verabreichungssystem, von dem die vorliegende Erfindung Gebrauch macht, besteht aus einem Satz von Bestandeilen, welche die Phospholipide und Konjugate enthaltenden Fläschchen oder Flaschen umfassen.
Wenn das antisense-Oligomer zur Krebsbehandlung verwendet werden soll, kann es hilfreich sein, die Konjugattherapie in Verbindung mit herkömmlichen chemotherapeutischen Agentien, wie z.B. einem 5-Fluoruracil durchzuführen. Wenn das antisense-Oligomer zur AIDS-Behandlung verwendet werden soll, kann es nützlich sein, die Therapie in Verbindung mit AZT, CD-4 und anderen experimentellen AIDS-Behandlungsmitteln durchzuführen.
Wenn das hierin angeführte Konjugat zu diagnostischen Zwecken verwendet werden soll, wird es mit einer geeigneten Markergruppe markiert, wobei typischerweise das Oligonukleotid markiert wird. Geeignete Marker umfassen radioaktive Marker wie z.B. ³²P, ¹²&sup5;J, ³&sup5;S u.ä. und nicht-radioaktive Marker wie z.B. Biotin, Thyroxin, Enzyme wie z.B. Hydrolasen oder Peroxidasen oder Phosphatasen, und verschiedene Chemolumineszenzmittel wie z.B. Luciferin, oder fluoreszierende Verbindungen wie z.B. Fluorescein und seine Derivate.
Ein diagnostisches Verfahren, bei dem sich markierte Konjugate eignen, erfolgt bei Assays auf Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Nukleotidsequenz in einer Probe, die auf der Immobilisierung der Oligomersonde auf einem festen Träger beruhen. Das Immobilisieren der Sonde auf einer hydrophoben Oberfläche durch die Lipidgruppe ermöglicht es dem Oligonukleotid, für die Hybridisierung zugänglicher zu sein als z.B. unter Verwendung von Southern Blots oder Dot Blots. Weiters muß beim vorliegenden Verfahren der Filter lediglich mit einer Lösung des Konjugats ausgewaschen werden und zum Immobilisieren der Nukleotide nicht erhitzt werden, wie dies für Southern Blots erforderlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt das Immobilisieren des Konjugats in markierter Form auf einem Träger, vorzugsweise einer festen Matrix wie z.B. einem Agarosegel oder einer Filtermembran und das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem immobilisierten Konjugat, sodaß die Nukleinsäure mit dem Oligonukleotidanteil des Konjugats hybridisiert, wenn die Nukleinsäure in der Probe vorhanden ist. Hybridisierungsbedingungen sind wohlbekannt und umfassen jene, die bei Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben sind. Typischerweise wird der Träger nach einer derartigen Hybridisierung gewaschen, um nicht-hybridisierende Materialien zu entfernen, bevor das Vorhandensein von markierten Oligomeren ermittelt wird.
In diesem Zusammenhang bezieht sich das Wort "Probe" auf jede beliebige Flüssigkeit oder biologische Probe, welche die zu bestimmende Nukleinsäure enthält oder möglicherweise enthält. Dieser Ausdruck umfaßt somit Fluids wie z.B. menschliche oder tierische Körperfluids, z.B. Blut, Serum, Harn, Amnionflüssigkeit, Gewebeextrakte, Zerebrospinal-Fluid u.ä.
Das obige diagnostische Verfahren eignet sich rum Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die mit Infektionserkrankungen, genetischen Störungen oder Zellstörungen wie z.B. Krebs in Zusammenhang stehen, z.B. Onkogenen. Zu genetischen Erkrankungen gehören spezifische Löschungen und/oder Mutationen von genomischer DNA aus jedem beliebigen Organismus, wie z.B. Sichelzellenanämie, cystische Fibrose, α-Thalassämie, β-Thalassämie u.ä. Infektionserkrankungen können durch das Vorhandensein spezifischer, für den verursachenden Mikroorganismus charakteristischer DNA-Sequenzen in klinischen Proben diagnostiziert werden. Dazu gehören Bakterien, wie z.B. Salmonella, Chlamydia und Neisseria; Viren wie z.B. die Hepatitisviren und Parasiten wie z.B. das für die Malaria verantwortliche Plasmodium.
Wenn eine Erkrankung durch die Gegenwart oder das Nichtvorhandensein zumindest einer spezifischen Restriktionsstelle in einer spezifischen Nukleinsäuresequenz charakterisiert ist, wie z.B. Sichelzellenanämie und β-Thalassämie, kann sie durch Verwendung von Restriktionsenzymen nachgewiesen werden. Im obigen Verfahren wird somit nach dem Waschen des Trägers das immobilisierte Konjugat mit einer Restriktionsendonuklease behandelt, um eine Restriktionsstelle innerhalb des Oligonukleotidabschnitts des Konjugats zu spalten, wodurch markierte und unmarkierte Oligomerfragmente entstehen, wie dies in der US PS 4.725.537 am 16.Februar 1988 herausgegeben beschrieben ist. Die markierten Oligomerfragmente werden dann nachgewiesen. Somit kann DdeI [Geever et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 5081-5085 (1981)) oder MstII (Orkin et al., N. Engl. J. Med., 307: 32-36 (1982)] verwendet werden, wenn die Erkrankung Sichelzellenanämie ist.
In einer weiteren Diagnoseausführungsform werden ein das Konjugat eingearbeitet enthaltendes Liposom, das wie oben hergestellt wird, und ein Marker (z.B. durch Einkapselung) zum Nachweis von Lupus erythematosus bei Menschen verwendet. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen von Serum von einem Humanpatienten mit dem Liposom (wo das Konjugat als Lupus-spezifisches Antigen wirkt) unter solchen Bedingungen, daß bei Vorhandensein von Lupus-Autoantikörpern (die bei Patienten mit aktivem Lupus vorhanden sind) diese sich an das Oligonukleotid auf dem Liposom binden, wodurch das Liposom entweder stabilisiert oder destabilisiert wird; und das Messen in Hinblick auf Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Markers. Wenn das Binden des Oligonukleotids das Liposom destabilisiert, wird der Marker freigesetzt und die Menge des freigesetzten Markers gemessen. Wenn das Binden das Liposom stabilisiert, ist der Marker nicht vorhanden und wird nicht nachgewiesen. Der Assay umfaßt im allgemeinen einminütiges Inkubieren des Serums bei Raumtemperatur und kann mit herkömmlichen Mikrotiterplatten durchgeführt werden, wodurch eine große Anzahl an Seren innerhalb kurzer Zeit gescreent werden können. Die Inkubationsbedingungen sind geeigneterweise jene, die für den Kolorimetrie-Test für Lupus gelten, der durch Janoff et al., Clin. Chem., 29: 1587-1592 (1983) und EP 90.735, veröffentlicht am 5. Oktober 1983, beschrieben ist. In diesen Veröffentlichungen ist die Liposomenstabilisierungs-Ausführungsform beschrieben.
Zum Nachweis von Lupus ist das Oligonukleotid des Konjugats vorzugsweise doppelstrangig, da es sich besser an die Antikörper bindet. Dies kann durch Synthetisieren einer Haarnadel-Doppelstrang-Nukleinsäure erreicht werden, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet wohlbekannt ist.
Ein weiterer Verwendungszweck der hierin angeführten Konjugate ist beim Abtrennen, Isolieren oder Reinigen einer Nukleinsäure (z.B. Oligonukleotiden oder Polynukleotiden) aus einer Komponentenmischung. Diese Verfahrensweise macht sich die geänderten physikalischen Eigenschaften des Oligonukleotids auf dem Konjugat aufgrund der Gegenwart des Lipids zunutze. Das verwendete Konjugat ist eines, das eine Nukleotidsequenz auf dem Oligonukleotid aufweist, die im wesentlichen zu einer Sequenz komplementär ist, die innerhalb der in Reinigung befindlichen Nukleinsäure enthalten ist.
Bei einer solchen Verwendung wird das Lipid des Konjugats verwendet, um das Oligonukleotid auf einem festen Träger zu immobilisieren, der eine hydrophobe Oberfläche enthält, wie z.B. einem Kunststoff-, Silanglas-, Alkylsepharose oder einem anderen hydrophoben Wechselwirkungschromatographieträger oder einer RP-HPLC-Matrix (z.B. Alkylsilikagels wie z.B. C8 Vydec). Für diesen Verwendungszweck muß man lediglich das Konjugat in einem Puffer wie z.B. einem Phosphatpuffer auflösen und die resultierende Lösung durch die Säule waschen. Das Lipid haftet unter solchen wässerigen Bedingungen an der Säule. Dann wird der feste Träger mit der Probe behandelt, welche die komplementäre Zielnukleinsäure enthält, die unter Bedingungen mit dem Träger hybridisiert, die eine solche Hybridisierung ermöglichen, wie sie für Fachleute auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Nach der Hybridisierung wird der Träger unter anderen Temperatur- oder Salzbedingungen gewaschen als sie zum Aufbringen der Mischung herrschten, um die erwünschte Nukleinsäure zu denaturieren und zu isolieren. Das Konjugat kann dann durch Waschen mit Acetonitril oder einem anderen organischen Lösungsmittel aus der Säule gewonnen werden.
Bei einer weiteren Anwendung des vorliegenden Verfahrens zum Trennen der Nukleinsäuren wird der Lipidanteil des Konjugats zum Transport der komplementären Zielnukleinsäure durch eine mit Wasser nicht-mischbare Phase verwendet. Demnach wird das Konjugat, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die mit einer Sequenz hybridisieren kann, die innerhalb des zu trennenden Oligonukleotids enthalten ist, in einer hydrophoben Phase, wie z.B. Octanol, in einem geeigneten Gefäß zur Extraktion und Übertragung aus einer organischen Phase in eine wässerige Phase, wie z.B. eine U-Röhre, bereitgestellt. Ebenso wird die die Zielnukleinsäure enthaltende Mischung in einer hydrophilen Phase wie z.B. Wasser im Gefäß bereitgestellt. Das Gefäß enthält auch eine wässerige Phase ohne jegliche Nukleinsäuren, vorzugsweise reines Wasser, in das die gewünschte Nukleinsäure übertragen wird. Das Konjugat ist teilweise sowohl in der wässerigen als auch der hydrophoben Phase löslich, und sein Oligonukleotidanteil würde mit dem Zielstrang unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und würde anschließend den Strang durch die hydrophobe Phase in die reine hydrophile Phase transportieren. Diese Verfahrensweise stellt tatsächlich ein spezifisches selektives DNA-Extraktionsverfahren dar.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben, die jedoch den erfindungsgemäßen Schutzbereich nicht einschränken.

BEISPIEL I

Herstellung und Reinigung des Konjugats

A. Herstellung des Lipidsalzes

1,2-di-O-Hexadecyl-rac-glycerin (Sigma) in einer Menge von 342 mg (0,63 mmol) wurde zweimal aus Pyridin verdampft und dann in 6 ml Pyridin und Methylenchlorid (1:1) aufgelöst. Nach dem Füllen des Kolbens mit Argon wurde die Lösung, während sie bei Raumtemperatur gerührt wurde, mit van Boom's Reagens behandelt (1,25 M Lösung in Dioxan, 0,52 ml) (Marugg et al., Tetrahedron Lett., 27: 2661 (1986)). Nach Abschluß der Reaktion (wurde durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von EM Silikagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4; vorbeschichteten Platten bestimmt, die mit einem sauren Molybdänfärbemittel sichtbar gemacht wurden, worin das Ausgangsmaterial einen Rf von 0,53 und das Produkt einen Rf von 0,24 aufweist), wurde die Lösung mit Methylenchlorid (10 ml) verdünnt und dann mit mehreren Teilmengen von wässerigem Triäthylammoniumbikarbonat (TEAB; 1 M) geschüttelt. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und in Vakuum verdampft. Säulenchromatographie mit EM Silikagel-60 (70-230 mesh) unter Verwendung von SiO&sub2;, 5-20% Methanol/Methylenchlorid mit 1% hinzugefügtem Triäthylamin gefolgt von 1% Essigsäure anstelle von Triäthylamin) und anschließende zusätzliche Extraktionen der reinsten Fraktionen mit 1 M TEAB lieferte 1,2-di-O-Hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat als ein nicht reinweißes Triäthylammoniumsalz (76% Ausbeute).
¹H NMR-Spektren wurden unter Verwendung eines Varian VXR-300S-Spektrometers erhalten und als ppm (d) unter Verwendung von TMS als innerer Standard aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind ¹H NMR (d): 6,86 (d, J = 616 Hz, H-P); 3,90 (dd, J = 4,2 und 7,7 Hz, H&sub2;C-OP); 3,60-3,40 (m, 7H, H&sub2;C-O-HC-H&sub2;C-O-H&sub2;C); 2,82 (qua, J = 7,2 Hz 6H, (H&sub2;C)&sub3;-N); 1,54 (m, 4H, 2(C-H&sub2;C-C-o); 1,25 (bs, 26H); 1,19 (t, J = 7,2 Hz, 9H, (H&sub3;C-C)&sub3;-N); 0,87 (bt, J = 6,3 Hz, 6H, 2(H&sub3;C-C&sub1;&sub5;).

B. Herstellung des Konjugats

Die Synthese von polymergebundenen Nukleotid H-Phosphonaten erfolgte auf einem Biosearch Modell 4000 DNA-Synthetisiergerät unter Verwendung eines derivatisierten Glases mit regulierter Porengröße als Träger in dem Verfahren, das bei Froehler, B.C. und Matteucci, M.D., Tetrahedron Lett., 27: 469 (1986); Froehler, B.C. et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399 (1986); Froehler, B.C. und Matteucci, M.D. & Nucleotides, 6: 287 (1987); Garegg, P.J. et al., Tetrahedron Lett., 27: 4051 (1986) beschrieben ist. Die Detritylierung des Oligodesoxynukleotids ergab eine freie 5'-Hydroxylgruppe, die sich zur Konjugierung mit dem Lipidwasserstoffphosphonat-Produkt von Abschnitt A eignete. Dieses Produkt wurde in Pyridin/Acetonitril (1:1) aufgelöst (25 mg/ml) und mit dem polymergebundenen Oligodesoxynukleotid unter Verwendung von Pivaloylchlorid als Aktivierungsmittel unter den in den obigen Verweisen beschriebenen Kopplungsbedingungen konjugiert. Das Verdoppeln der Endkopplungszeit und/oder Wiederholen der Kopplungszyklen hatte eine geringe offensichtliche Wirkung auf die Ausbeute oder die Reinheit der Produkte. Die hergestellten Verbindungen waren: EL-T&sub1;&sub0;; EL-AGCTAGCT; EL-AGCTAGCTTTTTAGCTAGCT; EL-CAGTGATGTGT; EL-ACACATCACTG, worin EL 1,2-di-O-Hexadecyl-3-glycerylphosphat darstellt, das an die 5'-Hydroxylgruppe der DNA gebunden ist.
Nach dem Spalten und Entfernen der Schutzgruppe unter Verwendung der Verfahren der obigen Verweise wurden die Produkte unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese, RP-HPLC und enzymatischem Abbau analysiert.

C. Polyacrylamidgelelektrophorese

EL-DNA-Proben wurden in einem Formamid-hältigen Puffer aufgelöst, eine Minute lang auf 90ºC erhitzt und auf 15% Acrylamid, 7 M Harnstoffgels geladen. Nach 2,5 Stunden langem Laufen bei 50 mA (etwa 400 V) wurden die Gels unter UV-Beleuchtung photographiert Die lipidhältigen EL-DNAs (durch UV-Schattenbildung sichtbar gemacht) waren weniger mobil als die entsprechenden lipidfreien DNAs und traten als breite, ein großes Band umgebende Streifen auf. In jedem Fall war dieses große Band etwa so mobil wie ein normales Oligomer, das zweimal so lang wie die DNA der EL-DNA war.
Polyacrylamidgelelektrophorese erwies sich als eher wenig wertvoll, da die lipidhältigen Produkte als nicht klar begrenzte Flecke niedrigerer Mobilität auftraten als die entsprechenden lipidfreien DNAs. Ein Vergleich der relativen Menge der in Streifenform auftretender EL-DNA zum normalen Muster von DNA-Bändern erbrachte nur ein sehr ungenaues Maß an Lipideinbau.

D. Dünnschichtchromatographie

Die Proben wurden auf analytischen TLC-Platten (SiO&sub2;, nPrOH:conc.aq. NH&sub4;OH:H&sub2;O 55:10:35) laufen gelassen und sowohl durch UV als auch durch Fleckbildung analysiert (alkoholischer p-Anisaldehyd mit anschließender Erwärmung).
Unter Verwendung des Propanol/Ammoniak/Wassereluats wurden verschiedene Spezien als deutliche, einzelne Flecke erhalten. Die synthetischen Rohprodukte zeigten typischerweise zwei oder drei Flecke, die EL-DNA, DNA und manchmal einer Spur eines nichtidentifizierten Materials bei niedrigerem Rf entsprachen. Das Hauptmaterial (UV und Fleck) war in allen Fällen EL-DNA mit hohem Rf (0,55-0,70). Die entsprechenden normalen Oligomeren liefen knapp über oder knapp unter den EL-DNAs. Die relativen Anordnungen der Verbindungen waren konstant, doch ihre Rf-Werte waren variabel. Zusätzlich zu den Rf-Differenzen unterschied sich die Farbe der Flecke (durch Reaktion mit dem Molybdänfärbemittel entstanden). EL-DNA schien purpurrot, während DNA dunkelblau war (so wie der nichtidentifizierte kleine Fleck).

E. Umkehrphasen-HPLC

RP-HPLC erfolgte unter Verwendung eines Waters Modell 510 Systems und einer 10 um C8 Partisil-10, 4,6 x 250 mm analytischen Säule. RP-HPLC-Proben wurden in 100 % "A" Puffer geladen (25 mM wässeriges Triäthylammoniumphosphat (TEAP), pH-Wert 7,0, 5% CH&sub3;CN). Zunehmende Mengen an "B" Puffer (25 mM wässeriges TEAP, pH-Wert 7,0, 75% CH&sub3;CN) wurden verwendet, um die Proben aus der Säule mit einer Fließrate von 2,0 ml/min zu eluieren. Peaks wurden bei 254 nm nachgewiesen und unter Verwendung eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt.
Die Eluierung mit dem wässerigen TEAP-Puffer mit einem Acetonitril-Gradienten ergab eine gute Trennung von EL-DNA von der kleinen Menge verunreinigender normaler DNA, die in jeder Reaktionsmischung vorhanden war. Unter diesen Bedingungen eluierte die lipidfreie DNA bei 10-20% "B" je nach ihrer Länge. Im Gegensatz zu normaler DNA wurden längere Lipooligonukleotide vor den kürzeren eluiert. Es folgen Eluierungsdaten für die fünf EL-DNAs (% "B"): EL-AGCTAGCTTTTTAGCTAGCT (57%); EL-CAGTGATGTGT (62%); EL-ACACATCACTG (64%); EL-T&sub1;&sub0; (65%); EL-AGCTAGCT (68%).
Dieses Verfahren lieferte die ausführlichsten Produktinformationen. Unter Verwendung eines TEAP-Puffers mit einem Acetonitril-Gradienten war die Gegenwart oder das Nichtvorhandensein von Lipid im synthetischen Material sofort offensichtlich. In jedem Fall gab es eine kleine Menge an DNA (und die übliche Verteilung kürzerer Oligomere), die bei niedrigen Acetonitril-Prozentsätzen eluierte und eine größere Menge an spät eluierender EL-DNA. Eine kleine analytische HPLC-Säule erzeugte im allgemeinen einen einzelnen, breiten, geschwänzten Peak von Lipid-DNA-Material. Nach dem Isolieren der HPLC-Materialien wurden weitere Dünnschicht-Chromatographie-Versuche durchgeführt, die bestätigten, daß die spät eluierenden HPLC-Peaks und die purpurgefärbten TLC-Flecke mit hohem Rf identisch waren.

F. Enzymatische Digestion

Eine weitere Charakterisierung einer EL-DNA (EL-CAGTGATGTGT) erfolgte durch enzymatische Digestion. Schlangengift-Phosphodiesterase (Boehringer Mannheim GmbH) katalysierte die nahezu vollständige Hydrolyse des DNA-Rückgrats (36ºC, 30 Minuten, 50 mM Tris, pH-Wert 8, 10 mM MgCl&sub2;). Rindermilz-Phosphodiesterase (Sigma), jedoch ließ die Lipid-DNA intakt (37ºC, 1,5 Stunden, 50 mM Tris, pH-Wert 8, 10 mM MgCl&sub2;). Diese Ergebnisse konnte man für eine DNA erwarten, die eine freie Hydroxylgruppe am 3'-Terminus trägt, doch am 5'-Ende blockiert ist. Es stellte sich heraus, daß EL-CAGTGATGTGT als Substrat sowohl für Phospholipase C (Sigma, aus Bacillus cereus) als auch für Phospholipase D (Sigma, aus Kohl) unter Standardbedingungen (100 mM Tris, pH-Wert 8, 10 mM CaCl&sub2;, 36ºC) ungeeignet ist. RP-HPLC-Analyse der Digestionsprodukte zeigte bei jedem der Enzyme nur intakte EL-DNA.

G. Wärmedenaturierungsprofil

Proben, die normale DNA (CAGTGATGTGT/ACACATCACTG), EL-DNA (EL-CAGTGATGTGT/EL-ACACATCACTG) oder eine Mischung von DNA/EL-DNA (EL-CAGTGATGTGT/ACACATCACTG und CAGTGATGTGT/EL-ACACATCACTG) in 1 ml Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,2; jeder Strang 2 uM) enthielten, wurden in eine maskierte 1-cm Küvette gefüllt. Alle Proben waren entsalztes (SEP-PAK C-18, Minisäule) HPLC-gereinigtes Material. Die isolierten Zellabteilungen wurden in Zuwachsschritten von 1ºC mit einer einminütigen Äquilibrierung nach Erreichen jeder Temperatur von 10 auf 80ºC erwärmt. UV-dekad. Extinktion bei 260 nm wurde als Funktion der Temperatur automatisch aufgezeichnet.
TmS für EL-CAGTGATGTGT/ACACATCACTG (38ºC) und CAGTGATGTGT/EL-ACACATCACTG (33ºC) wurden im Verhältnis zu jener des normalen Duplexes CAGTGATGTGT/ACACATCACTG (41ºC) reduziert. Über die Abnahme der Tm für DNA-Ligandenkonjugate wurde mehrere Male berichtet. Siehe z.B. Kempe et al., Nucl. Acids Res., 13: 45 (1985). Der variierende Grad der Tm-Abnahme spiegelt möglicherweise nur die Unterschiede im GC :: AT-Gehalt am lipidtragenden Ende jedes Duplexes wider. Interessanter ist es, daß mit Lipid an beiden DNA-Strängen (EL-CAGTGATGTGT/EL-ACACATCACTG; Tm 50ºC) die Tm deutlich höher als bei lipidfreier DNA ist. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung von Lipidstrukturen etwas höherer Ordnung hin, wenn Lipid an jedem Ende des Duplexes vorhanden ist, die für nur ein Lipid aufweisende Duplexe nicht zugänglich sind.

BEISPIEL II

Transfektionsassay für das Konjugat

Es ist bekannt, daß NIH/3T3-Mausfibroblasten durch ras-Onkogene unter Verwendung von Kalziumchloridtransfektion transformiert werden können (siehe Graham und Van der Eb, Virology, 52: 456-467 (1973) und Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1373-1376 (1979)). Die transformierten Zellen bilden Herde lichtbrechender/strahlungsbrechender Zellen, die Kontakthemmung verloren haben und in athymischen Mäusen wachsen können.
In diesem prophetischen Beispiel wird das menschliche ras-Onkogen (isoliert z.B. aus einem Plasmid) durch jedes beliebige der oben beschriebenen Verfahren an ein Phospholipid gekoppelt, enthaltend Stickstoffbindung, oder vorzugsweise an ein Lipid-Oligonukleotidkonjugat ligiert. Im letzteren Fall wird ein Linker konstruiert, der zum 3'-Ende des Oligonukleotids des Konjugats zum 5'-Ende des menschlichen ras-Onkogens (das in einem linearisierten Plasmid enthalten ist) komplementär ist und es überspannt. Dieser Oligonukleotidabschnitt des Konjugats, der Linker und das linearisierte Plasmid werden durch herkömmliche Kinase-Verfahren phosphoryliert und miteinander unter Verwendung von T4-Ligase ligiert.
Konfluente Einzelschichten von NIH/3T3-Zellen werden zweimal mit dem Modified Eagle's Medium von Dulbecco (DMEM) ohne Serum gewaschen und in diesem DMEM-Medium vier Stunden lang inkubiert. Danach wird eines der Lipid-ras-Konjugate dem Medium hinzugefügt und drei Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Vollständiges DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum wird danach in eine Petrischale in einer Menge von 10:1 (v/v) gegeben und bei 37ºC über Nacht stehengelassen. Am nächsten Tag werden die Zellen in 1/20, 1/40 und 1/80-Verdünnungen geteilt und 17 Tage lang gezüchtet; danach wurden die Herde gezählt.
Das ras-Onkogen kann in die Zelle internalisiert, an den Kern gebracht und exprimiert werden, um das ras-Onkogenprodukt zu ergeben, wodurch gezeigt wird, daß die Konjugate NIH/3T3-Zellen in stabiler Weise transformieren können.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung Konjugate von Oligonukleotiden und Lipiden zum Transport, Zielen und Internalisieren der Oligonukleotide zu und innerhalb der geeigneten Zellen im allgemeinen durch Endozytose. Nach dem Internalisieren wird das Konjugat Z.B. durch zellulare Lipasen gespalten, die eine geeignete Spaltungsstelle auf dem Konjugat erkennen. Somit wirkt das hierin angeführte Konjugat geeigneterweise als zytospezifisches Arzneimittel, das zur spezifischen Zufuhr eines Oligomers zu einer Zelle fähig ist, das ein Polypeptid mit verschiedenen Arten von Aktivitäten, z.B. therapeutischen, prophylaktischen, antiviralen, zytotoxischen, usw., exprimiert. Außerdem kann das Oligomer den regulatorischen Mechanismus der Zelle beeinflussen, einen genetischen Fehler ausgleichen oder als Marker dienen.

Claims

1. Kovalentes Konjugat aus einem Lipid und einem Oligonukleotid, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, worin das Lipid über Phosphat kovalent mit dem 5'-Ende des Oligonukleotids verbunden und aus Steroiden, Glyceriden und Glyceryläthern ausgewählt ist; mit der Maßgabe, daß das Konjugat nicht am 5'-Phosphat mit Cholesterin modifiziertes Nonathymidyluridin ist.

2. Konjugat oder Salz nach Anspruch 1, worin das Lipid ein Glycerid oder Glyceryläther der Formel

ist, worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander aus H, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, mono-, di- oder polyungesättigtem C&sub2;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub3;-C&sub8;-Zykloalkyl oder mono-, di- oder polyungesättigten C&sub4;-C&sub8;-Zykloalkylgruppen ausgewählt sind und X O oder -O.CO- ist.

3. Konjugat oder Salz nach Anspruch 1 oder 2, worin das Konjugat so ausgebildet ist, daß es durch eine Lipase gespalten wird.

4. Konjugat oder Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oligonukleotidgruppe aus (ab dem 5'-Ende) (ab dem 3'-Ende) (ab dem 3'-enol 6-gliedrigen Ring), (ab dem internukleotidischen Phosphat), (ab der N-Base) oder

ausgewählt ist, worin B eine Base ist, von der die Schutzgruppe entfernt wurde, p eine ganze Zahl von etwa 5 bis 30 ist, q und r ganze Zahl von etwa 1 bis 28 sind, mit der Maßgabe, daß r + q von etwa 4 bis 29 ausmacht, s und t ganze Zahlen von 0 bis etwa 29 sind, mit der Maßgabe, daß s + t von etwa 4 bis 29 ausmacht, E X oder ZX ist und D aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (wobei die Bindung von den Ringstickstoffen an der Zuckergruppe des Oligonukleotids befestigt ist):

5. Konjugat oder Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oligonukleotidgruppe über den N6 eines Adeninrestes oder den N4 eines Zytosinrestes verbunden ist.

6. Konjugat oder Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin zumindest eine Base eine im wesentlichen planare Pyrimidinonbase ist.

7. Konjugat oder Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz enthält, die zu einer pathogenen Nukleinsäure oder einem Onkogen ausreichend komplementär ist, um damit zu hybridisieren und/oder das eine Spaltungsstelle darstellt oder zur Hybridisierung damit fähig ist, die von einem Enzym spezifisch erkannt wird, das für eine Wirtszelle endogen ist, auf die das Konjugat abzielt, und/oder eine mRNA-Spleißstelle darstellt oder zur Hybridisierung damit fähig ist.

8. Konjugat oder Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung als ein Medikament.

9. Verfahren für ein Assay einer Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Nukleotidsequenz in einer Probe, umfassend:

(a) das Schaffen eines markierten Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum Hybridisieren mit der vorbestimmten Sequenz fähig ist;

(b) das Immobilisieren des markierten Konjugats auf einem Träger;

(c) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem immobilisierten Konjugat unter Bedingungen, die Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats verursachen würden, wenn die Nukleinsäure in der Probe vorhanden ist; und

(d) das Nachweisen der Gegenwart von markierten Oligomeren.

10. Verfahren nach Anspruch 9, das nach Schritt (c) weiters einen Schritt umfaßt, bei dem das immobilisierte Konjugat unter Bedingungen der Digestion mit einer Restriktionsendonuklease in Kontakt gebracht wird, die fähig ist, den Oligonukleotidabschnitt des Konjugats zu spalten, um markierte und unmarkierte Oligomerfragmente zu erzeugen; und worin die Oligomeren in Schritt (d) Oligomerfragmente sind.

11. Verfahren zum Abtrennen eines Oligonukleotids aus einer Mischung, welches Verfahren umfaßt:

(a) das Schaffen des Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Nukleotidsequenz, die zur Hybridisierung mit einer innerhalb des abzutrennenden Oligonukleotids enthaltenen Sequenz fähig ist;

(b) das Immobilisieren des Konjugats auf einem Träger;

(c) das In-Kontakt-Bringen der Mischung mit dem immobilisierten Konjugat unter Bedingungen, die das Hybridisieren des Oligonukleotids der Mischung mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats verursachen; und

(d) das Abtrennen der hybridisierten Oligonukleotide.

12. Verfahren zum Abtrennen eines Oligonukleotids aus einer Mischung, welches Verfahren umfaßt:

(a) das Schaffen des Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Nukleotidsequenz, die zum Hybridisieren mit einer im abzutrennenden Oligonukleotid enthaltenen Sequenz fähig ist, in einer hydrophoben Phase;

(b) das Schaffen der Mischung in einer hydrophilen Phase;

(c) das In-Kontakt-Bringen der die Mischung enthaltenden Phase mit der das Konjugat enthaltenden Phase unter Bedingungen, welche die Hybridisierung des Oligonukleotids der Mischung mit dem Oligonukleotidabschnitt des Konjugats bewirken; und

(d) das Extrahieren der hybridisierten Oligonukleotide aus der die Mischung enthaltenden Phase und ihren Transport zu einer getrennten hydrophilen Phase.

13. Liposom, welches das Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und eine Markergruppe enthält.

14. Verfahren zum Nachweisen von Lupus erythematosus bei einem Menschen, welches das In-Kontakt-Bringen einer Serumprobe aus dem menschen mit dem Liposom nach Anspruch 13 umfaßt, wobei das genannte In-Kontakt-Bringen so erfolgt, daß Antikörper im Serum sich an das Oligonukleotid am Liposom binden, um die Stabilität des Liposoms zu verändern; und das Messen in Hinblick auf die Gegenwart oder Abwesenheit des Markers.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Antikörper sich an das Oligonukleotid auf dem Liposom binden, um den Marker freizusetzen, und worin die Menge an freigesetztem Marker gemessen wird.

16. Verwendung eines kovalenten Konjugats aus einem Lipid und einem Oligonukleotid bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, die mit einer/einem pathogenen Nukleinsäure oder Onkogen innerhalb der Zellen eines Patienten assoziiert ist.

17. Kovalentes Konjugat aus einem Lipid und einem Oligonukleotid, oder ein Salz davon, zur Verwendung als Medikament zur Behandlung einer Erkrankung, die mit einer/einem pathogenen Nukleinsäure oder Onkogen innerhalb der Zellen eines Patienten assoziiert ist, worin das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die mit der/dem genannten pathogenen Nukleinsäure oder Onkogen ausreichend komplementär ist, um damit hybridisieren.

18. Konjugat oder Salz nach Anspruch 17, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.