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DE69332304T2 - Antivirale 2',5'-oligoadenylatderivate mit doppelter wirkung und ihre verwendungen - Google Patents

Antivirale 2',5'-oligoadenylatderivate mit doppelter wirkung und ihre verwendungen

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Publication number
DE69332304T2
DE69332304T2 DE69332304T DE69332304T DE69332304T2 DE 69332304 T2 DE69332304 T2 DE 69332304T2 DE 69332304 T DE69332304 T DE 69332304T DE 69332304 T DE69332304 T DE 69332304T DE 69332304 T2 DE69332304 T2 DE 69332304T2
Authority
DE
Germany
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conjugate
compound
adduct
deoxyadenylyl
hydroxyl
Prior art date
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DE69332304T
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DE69332304D1 (de
Inventor
Wolfgang Pfleiderer
Robert J. Suhadolnik
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Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Original Assignee
Temple University of Commonwealth System of Higher Education
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Publication date
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Description

  • Die Erfindung betrifft bestimmte 2',5'-Oligoadenylatanaloga, pharmazeutischen Konjugate und Zusammensetzungen mit solchen Analoga und ihre Verwendungen.
  • Die vollständige Nomenklatur des Gegenstands der vorliegenden Erfindung umfasst extrem lange Fachausdrücke. Es ist für den Fachmann üblich, diese Ausdrücke in einer ihm wohlbekannten Art abzukürzen. Diese allgemeinen und üblichen Abkürzungen sind im Folgenden dargelegt und können im Text dieser Beschreibung benutzt werden.
    • Abkürzungen:
  • RT, reverse Transkriptase
  • A, Adenosin oder Adenylat oder Adenylylcordycepin oder C oder 3k-dA, 3'-Desoxyadenosin-(3'-desoxyadenylat)
  • ara-A, 9-β-D-Arabinofuranosyladenin
  • EHNA, erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)adenin
  • A-3' -amino, 3-Amino-3-desoxyadenosin
  • Tubercidin, 4-Amino-7-(β-D-ribofuranosyl)-pyrrolo-[2,3-d]- pyrimidin
  • 3'-dATP, 3'-Desoxyadenosintriphosphat
  • ATP, Adenosintriphosphat
  • I, Inosin oder Inosinat oder Inosinylyl
  • Xylo-A oder Xyloadenosin, 9-β-D-Xylofuranosyladenin
  • dCF oder 2'-Desoxycoformycin, (R)-3-(2-Desoxy-β-Derythropentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5- d] [1,3] diazepin-8-ol
  • 2-5A oder 2',5'-oligo(A) oder 2',5'-Oligoadenylat, Oligomer der Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen und einem Triphosphat am 5'-Ende
  • C, Cordycepin
  • 2',5'-Cordycepinanalog oder 2',5'-Oligocordycepin, Oligomer der 3'-Desoxyadenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen und einem Triphosphat am 5'-Ende
  • 2',5'-An oder Kernoligomer, Oligomer der Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen
  • 2',5'-A&sub3; oder 2',5'-Adenylattrimerkern, Adenylyl (2',5') adenylyl (2',5') adenosin
  • 2',5'-A&sub4; oder 2',5'-Adenylattetramerkern, Adenylyl(2',5')- adenylyl (2',5') adenylyl (2',5') adenosin
  • 2',5'-3'dA&sub3; oder 2',5'-C-C-C oder 275'-Cordycepintrimerkern, 3'-Desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl(2',5')- 3'desoxyadenosin
  • 2',5'-C-C-C-C oder 2',5'-Cordycepintetramerkern, 3'- Desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl(2',5')3'- desoxyadenylyl-(2',5')3'-desoxyadenosin
  • 3',5'-A&sub3;, Adenylyl (3',5') adenylyl (3',5') adenosin
  • 2',5'-I&sub3; oder 2',5'-Inosintrimerkern, Inosinylyl(2',5')- inosinylyl-(2',5')inosin
  • dd benz, Benzimidazolyl(2',5')5, 6-dichlorbenzimidazolribosid
  • EBV, Epstein-Barr-Virus
  • EBNA, zum Epstein-Barr-Virus gehörendes frühes Kernantigen
  • HBV, Hepatitis-B-Virus
  • HIV, humanes Immunschwächevirus, einschließlich HIV-1, HIV-2 und aller anderen HIV-Subtypen
  • HBLV, humanes lymphotropes B-Zellvirus
  • HTLV, humanes T-Zell-Leukämievirus, einschließlich HTLV-I, HTLV-II und HTLV-III und aller anderen HTLV-Subtypen
  • IFNα: α-Interferon
  • rIFN-αA: rekombinantes α-Interferon
  • dsRNA: doppelsträngige Ribonukleinsäure
  • 2',5'-A-A-Tu, Adenylyl (2',5') adenylyl (2, 5') -tubercidin
  • 2',5'-Tu-Tu-Tu, 2',5'- Tubercidylyl(2',5')tubercidylyl(2', 5')tubercidin
  • 2',5'-A-A-ara-A, Adenylyl(2',5')adenylyl(2',5')ara-A 2',5'-C-C-A, 3'-Desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl- (2',5') adenosin
  • 2',5'-A-C-C, Adenylyl(2',5')3'desoxyadenylyl(2',5')3'- desoxyadenosin
  • 2',5'-A-A-C, Adenylyl(2',5')adenylyl(2',5')3'-desoxyadenosin 2',5'-C-A-C, 3'-Desoxyadenylyl(2',5')adenylyl(2',5')3'- desoxyadenosin
  • 2',5'-C-C-A, 3'-Desoxyadenylyl(2',5')3'- desoxyadenylyl(2',5')adenosin
  • 2',5'-A-C-A, Adenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl(2',5')adenosin
  • 2',5'-xylo-A&sub3;, Xyloadenylyl(2',5')xyloadenylyl- (2',5')xyloadenylyl(2',5')xyloadenosin
  • 2',5'-xylo-A&sub4;, Xyloadenylyl(2',5')xyloadenylyl- (2',5')xyloadenosin
  • Ac, Acetyl
  • Bz, Benzyl
  • MMTr, 5'-O-p-methoxytrityl
  • 2',5'-trityl-C&sub3;, 5'-O-p-Methoxytrityl-3'- desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl(2',5')3'- desoxyadenosin
  • 2',5'-trityl-A&sub3;, 5'-O-p-Methoxytrityladenylyl(2',5')adenylyl- (2',5') adenosin
  • 2',5'-C-C-dCF, 3'-Desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenylyl- (2',5')2'-desoxycoformycin
  • 2',5'-A-A-A-3'-amino, Adenylyl(3',5')adenylyl(3',5')3'- amino-3'-desoxyadenosin
  • SiTBD, t-Butyldimethylsilyl oder -Si(CH&sub3;)&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;
  • 2',5'-A(Si)-A(Si)-A, 3'-O-t Butyldimethylsilyladenylyl(2',5')3'-O-t- butyldimethylsilyladenylyl(2',5')adenosin 2',5'-A-A-A-3'-O-methyl, Adenylyl (2',5') adenylyl (2',5')3'-Omethyladenosin
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-pentyl, Adenylyl(2',5')adenylyl(2',5')3'-O- pentyladenosin
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-hexyl, Adenylyl(2',5')adenylyl(2',5')3'-O- hexyladenosin
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-heptyl, Adenylyl(2',5')adenylyl(2',5')3'-O- heptyladenosin
  • 2',5'-EHNA-A-A, erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)adenylyl- (2',5')adenylyl (2',5') adenosin
  • Die Abkürzung für die "tetrameren" Verbindungen mit den Bestandteilen Adenylyl (A) und 3'-Desoxyadenylyl (C) wird wie folgt erläutert:
  • 2',5'-A-A-C-C, Adenylyl (2',5') adenylyl (2',5')3'- desoxyadenylyl(2',5')3'-desoxyadenosin
  • Die oben genannten Verbindungen werden auch ohne den Vorsatz 2',5', ohne Bindestriche und ohne den Anhang 3' abgekürzt; daher wird 2',5'-C-C-C-3' auch als CCC abgekürzt.
  • Mit dem Anwachsen der Kenntnis über den durch Interferon induzierten antiviralen Status wurde die Aufmerksamkeit auf die chemische und enzymatische Synthese und die biologischen Eigenschaften der 2',5'-Oligoadenylate als Mediatoren der antiretroviralen Reaktion konzentriert. 2',5'-Oligo(A) ist ein Bestandteil des natürlichen Breitspektrum-Antivirus- Abwehrmechanismus bei Pflanzen und Tieren. Die Beteiligung des 2-5A-Mechanismus, auch als 2-5/Rnase-L-Mechanismus bekannt, bei der antiviralen Wirkung des Interferons ist weithin anerkannt. Er ist auch bei der Regulierung des Wachstums und der Differenzierung der Zellen beteiligt.
  • Der Reaktionsmechanismus umfaßt die Aktivierung der latenten Endo-Ribonuklease, RNAse L (EC 3.1.27), durch 2-5A. Nach diesem in Fig. 1 gezeigten Mechanismus wird 2-5A aus ATP durch 2',5'-Oligoadenylatsynthetase [ATP: (2',5')Oligo(A)- adenyltransferase (EC 2.7.7.19)], im weiteren "2-5A- Synthetase", synthetisiert. Nach Aktivierung durch dsRNA wandelt die 2-5A-Synthetase ATP in 2-5A um, d. h. in eine Reihe von 275-verknüpften Oligoadenylaten, die durch ein 5'-terminales Triphosphat gekennzeichnet sind. 2-5A- Synthetase existiert in verschiedenen isoenzymatischen Formen, wird von Interferon induziert, ist aber auch in kleineren Mengen bei Abwesenheit von Interferon nachweisbar. 2-5A übt seine biologische Wirkung durch Bindung an sein einziges bekanntes Zielenzym, die einzigartige 2-5Aabhängige Endo-Ribonuklease RNAse L, und dessen Aktivierung aus. Die letztere spaltet virale und zelluläre mRNA oder rmA und inhibiert dadurch die Proteinsynthese (Hovanessian et al., Eur. J. Biochem. 93, 515-526 (1979), Kerr et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 256-260 (1978)). Die kurze Halbwertszeit des authentischen 2-5A-Moleküls in biologischen Systemen ist ein bekannter Nachteil für die Beherrschung der viralen Replikation. Darüber hinaus wird bioaktives 2-5A durch drei Enzyme inaktiviert: eine relativ unspezifische 2'-Phosphodiesterase, eine 5'-Phosphatase und eine relativ spezifische 2',3'-Exo-Nuklease. Einige Cytokine, z. B. IL-6, aktivieren 2-5A-Synthetase so, daß sie das Enzym oder dessen besondere Formen zur Erzeugung bioinaktiver Formen des 2-5A veranlassen (Bickel, M., Dveksler, G., Dieffenbach, C. W., Ruhl, S., Midura, S. B. und Pluznik, D. H., Cytokine 2, 238-246 (1990) und Cohen, B., Gothelf, Y., Vaiman, D., Revel, M. und Chebath, J., Cytokine 3, 83-91 (1991)).
  • Der 2-5A-Synthetase/RNAse-L-Mechanismus wird nach viraler Infektion durch viele Viren aktiviert, darunter HIV-1 (Schröder, H. C., Wenger, R., Kuchino, Y. und Müller, W. E. G., J. Biol. Chem. 264, 5669 (1989); Schröder, H. C., Wenger, R., Rottmann, M. und Müller, W. E. G., Biolog. Chem. Hoppe-Seyler 369, 985 (1988)). Die Aktivierung dieses Mechanismus verzögert den HIV-Infektionsvorgang. Um die RNAse L zu aktivieren, benötigt das natürlich vorkommende 2- 5A-Molekül ein 5'-Triphosphat, welches instabil ist. 2-5A- Moleküle mit 5'-Monophospaten oder ohne 5'-Phosphate (Kern) aktivieren in physiologischen Konzentrationen die RNAse L nicht.
  • Das "humane B-lymphotropische Virus", auch bekannt als "humanes B-Zell-lymphotropes Virus" (HBLV), jetzt HHV-6 genannt, gekennzeichnet durch ein doppelsträngiges DNA-Genom mit hohem Molekulargewicht, ist morphologisch den Viren der Herpes-Virusfamilie ähnlich, jedoch von den bekannten humanen und nichthumanen Primaten-Herpesviren leicht unterscheidbar durch seinen Wirtsbereich, seine biologischen Wirkungen in vitro, durch seine Antigenmerkmale und sein Genom (Salahuddin et al., Science 234, 596-601 (1986), Josephs et al., Science 234, 601-602 (1986)). Es wurde beobachtete, daß das Virus frisch isolierte humane B-Zellen selektiv infiziert, die in große refraktile ein- oder zweikernige Zellen mit Einschlußkörperchen in Kern und Zytoplasma umgewandelt werden. HBLV steht im Verdacht, ein chronisches mononukleotisches Syndrom hervorzurufen, das durch chronische Müdigkeit gekennzeichnet ist, die über ein Jahr andauert.
  • Das humane Immundefizienzvirus ("HIV"), auch als humanes T- Zellen-Leukämievirus II1 ("HTLV-III") bekannt, das ätiologische Agens des erworbenen Immundefizienzsyndroms, ist ein Retrovirus vom Typ D. Wie in allen Retroviren ist ein notwendiges Merkmal der HIV-Replikation die reverse Transkription des Plus-Strang-RNA-Genoms in DNA, ein Vorgang, der eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die reverse Transkriptase, erfordert. Dieses Enzym ist viralkodiert und mit der Genom-RNA in reifen HIV-Virionen verbunden. Durch die Exklusivität der reversen Transkriptase für Retroviren und solche Viren, die einen kurzen reversen Transkriptionsschritt benötigen, wird die reverse Transkriptase zu einem Hauptziel für das antivirale und insbesondere das antiretrovirale therapeutische Eingreifen.
  • Das 2-5A-Synthetase/RNAse-L-System als ein antiviraler zellulärer Abwehrmechanismus hat sich als vielversprechendes Ziel für eine antivirale Chemotherapie erwiesen, insbesondere wegen seiner Wechselwirkung mit doppelsträngigen Segmenten in viralen Genomen oder Transkripten wie dem HIV-1 RNA-Genom (Lengyel, P., Annu. Rev. Biochem. 51, 251 (1982); Pestka, S., Hrsg., Methods Enzymol. 118, 119 (1986); Lengyel, P., J. Interferon Res. 7, 511 (1987); Sen, G. C., Proc. Nucleic Acid Res. Molec. Biol. 27, 105 (1982)). Es werden jedoch Derivate des 2-5A benötigt, welche dem Abbau durch Enzyme, die authentisches 2-5A inaktivieren, widerstehen. Notwendig ist ein Verfahren zur Beherrschung des HIV, der durch HBLV verursachten chronischen Müdigkeit und anderer viral oder durch Cytokine induzierter Krankheitszustände, die durch einen Defekt im 2- 5A-Mechanismus gekennzeichnet sind, unter Verwendung von Verbindungen, die metabolisch stabiler und aktiver sind als authentisches 2-5A. Notwendig ist ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen unter Verwendung von Verbindungen, die ein breites Wirkungsspektrum und eine Doppelwirkung haben, d. h. Verbindungen, die sowohl den 2- 5A-Mechanismus aktivieren als auch die Aktivität der viralen DNA-Polymerase inhibieren.
  • In einer Ausführungsform umfaßt die Erfindung eine neue Verbindung der Formel I
  • n eine positive ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
  • m 0, 1, 2 oder 3 ist,
  • R Wasserstoff ist,
  • X aus C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub6;-Akylenoxy ausgewählt ist, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
  • Bevorzugt ist n 1 bis 3, meist bevorzugt 1 oder 2. X ist bevorzugt aus C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylenoxy ausgewählt.
  • Beansprucht werden auch entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen und erste und zweite medizinische Verwendungen, wobei die zweite medizinische Verwendung die Verhinderung einer Virusinfektion bei Säugetieren ist.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Konjugat mit einer Verbindung der Formel II bereit:
  • X NH&sub2; oder CH&sub2; ist,
  • m 0, 1, 2 oder 3 ist,
  • n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
  • jeder Rest R&sub1; unabhängig ausgewählt ist aus O&supmin;, S&supmin; Sulfat, Se&supmin; C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyl und C&sub1;- bis C&sub8; Alkoxy, jeder Rest R&sub2; unabhängig ausgewählt ist aus O&supmin;, S&supmin;, Sulfat,
  • Se&supmin;, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyl und C&sub1;- bis C&sub8;-Alkoxy, jeder Rest R&sub3; unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amino und -OSi(CH&sub3;)&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;,
  • R&sub4; und R&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amino, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyl, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyloxy, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkylamino, Alkylcarbonyl, Alkylcarboxyl und Haloalkyl und C&sub1;- bis C&sub8;-Alkoxyamino, Alkoxycarbonyl, Alkoxycarboxyl und Haloalkoxy oder deren pharmazeutisch geeigneten Salzen, ausgenommen authentisches 2',5'-Oligoadenylat und dessen Salze,
  • wobei diese Verbindung über einen Hydroxylsauerstoff in 2'- oder 3'-Stellung ihres 2'-terminalen Nukleotids kovalent an ein Addukt gebunden ist, welches ausgewählt ist aus (1) Vitaminen, die entsprechende Rezeptoren an der Zelloberfläche zur rezeptorvermittelten Endozytose haben, (ii) Addukten mit der Cholesterylgruppe und (iii) Acylgruppen der Formel -CO(CH&sub2;)xCH&sub3;, worin x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist und wobei das Addukt zu einem verstärkten Eindringen der Verbindung in intakte Zellen führt.
  • Solche Konjugate verursachen bei der Verabreichung gleichzeitig eine Aktivierung des antiviralen 2-5A- Synthetase/RNAse-L-Mechanismus des Säugetiers und die Inhibierung der viralen DNA-Polymerase.
  • Bevorzugt ist n 1 bis 3, meist bevorzugt 1 oder 2. Nach einer anderen bevorzugten Ausführung können die Alkyl-, Alkoxy-, substituierten Alkyl- oder Alkoxygruppen 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten und haben bevorzugt 1 bis 4, meist bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Bei den halogensubstituierten Alkyl- und Alkoxygruppen ist das Halogen bevorzugt Chlor, Brom, oder Fluor, wobei Chlor meist bevorzugt ist.
  • Nach einer bevorzugten Untermenge der Erfindung ist die Gruppe A
  • worin m wie oben definiert ist, und mehr bevorzugt mindestens ein R&sub1; S&supmin; ist, wobei jedes andere R&sub1;&supmin; O&supmin; ist. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eines aus R3 und R4 Wasserstoff, das andere Hydroxyl.
  • Das Addukt wird höchst vorteilhaft über einen Hydroxylsauerstoff an der 2'-Stellung des 2'-terminalen Nukleotids an das Oligomer gebunden.
  • Zu den als Addukte erfindungsgemäß brauchbaren Vitaminen (i) gehören beispielsweise Vitamin B&sub1;&sub2;, Biotin, Riboflavin und Folsäure.
  • Wenn das Addtukt ein lipophiles Molekül oder ein solches Radikal aufweist, wie eine Acylgruppe (iii) der Formel -CO(CH&sub2;)xCH&sub3;, enthält es bevorzugt eine Cholesterylgruppe.
  • Nach einer bevorzugten Untermenge der Konjugate hat die Verbindung, an die das Addukt konjugiert ist, die Struktur der Formel II, worin
  • m 0, 1, 2 oder 3 ist,
  • n eine ganze Zahl von 1 bis 8, bevorzugt 1, 2 oder 3, ist, jeder der Reste R&sub3; und R&sub4; unabhängig aus Wasserstoff und Hydroxyl ausgewählt ist,
  • jeder der Reste R&sub2; unabhängig aus S&supmin; und O&supmin; ausgewählt ist, R&sub5; Hydroxyl ist,
  • oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon, wobei die Verbindung über die 2'-Stellung ihres 2'-terminalen Nukleotids kovalent an das Addukt gebunden ist.
  • In einer weiteren Ausbildung stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem pharmazeutischen Träger und einer Verbindung nach Formel I bereit, wobei zusätzlich zu den oben für die Formel I angegebenen Substitutionsmöglichkeiten R Hydroxyl sein kann.
  • Die Erfindung stellt auch erste und zweite medizinische Verwendungen solcher Verbindungen (außer jenen, bei denen R Wasserstoff ist) bereit, wobei die zweite Verwendung die Verhinderung der viralen Infektion bei Säugetieren ist.
  • Fig. 1 ist ein Diagramm, das den intrazellulären 2-5A- Synthetase/RNAse-L-Enzymmechanismus darstellt.
  • Fig. 2A ist eine mikroskopische Phasenkontrastaufnahme von H9-Zellen, die 5 Stunden mit an Folat kovalent konjugiertem Fluoreszein-Rinderserumalbumin (BSA) (25 ug/ml) in einem Medium mit Folatmangel inkubiert wurden.
  • Fig. 2B ist eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme der in Fig. 2A gezeigten H9-Zellen.
  • Fig. 2C ist eine mikroskopische Phasenkontrastaufnahme von H9-Zellen, die 5 Stunden mit Fluoreszein-BSA inkubiert wurden, das nicht an Folat konjugiert war.
  • Fig. 2D ist eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme der in Fig. 2C gezeigten H9-Zellen.
  • Für die Behandlung von viralen Krankheitszuständen werden therapeutische Wirkstoffe verwendet, die den antiviralen 2- 5A-Synthetase/RNAse-L-Abwehrmechanismus aktivieren und auch die Aktivität der sich vom Virus ableitenden DNA-Polymere (insbesondere reverse Transkriptase) inhibieren. "Behandlung" soll hier auch Prophylaxe einschließen. Solche doppeltwirksame therapeutische Agenzien sind selektive Breitspektrum-Inhibitoren für die viralen DNA-Polymerasen, die während der viralen Infektion erzeugt werden. Die Polymerasen sind entscheidend für die virale Replikation. Die bei der Ausführung der Erfindung benutzten Verbindungen können gekennzeichnet werden als Derivate der authentischen 2-5A mit Modifikationen in der 5'-terminalen Phophatgruppe, dem Ribosylteil und/oder den Bindungen zwischen den Nukleotiden. Diese Derivate sind metabolisch stabil, nicht toxisch und wirken doppelt antiviral, z. B. aktivieren sie den antiviralen 2-5A-Synthetase/RNAse-L-Mecahnismus und inhibieren auch die vom Virus abgeleitete DNA-Polymerase. Wir haben also eine antivirale Therapie erreicht, indem wir sowohl die inhärenten in den Säugetierzellen vorhandenen Mechanismen aktivieren als auch die für die virale Informationsübertragung entscheidenden Enzyme inhibieren.
  • In einer Klasse der für die Ausführung der Erfindung brauchbaren Verbindungen wurden eine oder mehrere der 3'- Hydroxylgruppen unter Bildung der Derivate mit 2',5'- Cordycepinkern durch Wasserstoffatome ersetzt. Diese Modifikation führte zu Derivaten mit erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen den Abbau durch Phosphodiesterase. Die Herstellung solcher Verbindungen ist offenbart in den Patenten US-4,464,359 (2',5'- Oligocordycepin) und US-4,859,768 (2',5'-Oligocordycepin und gemischtes 2',5'-Oligo(cordycepin/adenosin)). Die Derivate mit 2',5'-Cordycepinkern sind auch nicht toxisch und haben eine antiretrovirale Breitspektrumaktivität in infizierten Zellen (Montefiori, D. C., Sobol, R. W., Li, S. W., Reichenbach, N. L., Suhadolnik, R. J., Charubala, R., Pfleiderer, W., Modliszewski, A., Robinson, W. E., Jr. und Mitchell, W. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7191 (1989); Suhadolnik, R. J., Lebleu, B., Pfleiderer, W., Charubala, R., Montefiori, D. C., Mitchell, W. M., Sobol, R. W., Li, S. W., Kariko, K. und Reichenbach, N. L., Nucleosides & Nucleotides 8, 987 (1989); Müller, W. E. G., Weiler, B. E., Charubala, R., Pfleiderer, W., Leserman, L., Sobol, R. W., Suhadolnik, R. J. und Schröder, H. C., Biochemistry 30, 2027 (1991)). Wie in US-4,859,768 beschrieben wurden andere 2',5'- Derivate mit anderen Modifikationen der 3'-Hydroxylgruppe, wie Substitution mit Amino und OSi(OH&sub3;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub3; hergestellt. Andere 2-5A-Derivate enthalten, zusätzlich oder anstelle der Modifikation des 3'-Hydroxyls an einem oder an mehreren Nukleotiden, Modifikationen in der 5'-terminalen Phosphatgruppe. Diese 2-5A-Derivate behalten die Fähigkeit, virale DNA-Polymerase zu inhibieren und behalten auch die metabolische Stabilität, können aber zusätzlich RNAse L aktivieren. Eine Vielfalt von 2',5'-Oligoadenylaten außer den bereits hergestellten wird eine verstärkte antivirale Aktivität zeigen.
  • Nach noch einer anderen Ausführungsform wird die Phosphodiesterbindung zwischen den Nukleotiden modifiziert. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird Schwefel anstelle eines Sauerstoffs unter Bildung der 2%5- Phosphorothioat-Oligoadenylate substituiert. Die Herstellung solcher Verbindungen einschließlich der optischen Isomeren ist in US-4, 924, 624 beschrieben. Die Substitution von Schwefel für Sauerstoff in das 2',5'-Phosphodiesterskelett erzeugt in den Molekülen Chiralität und führt eine neue Chemie des Skeletts ein. Der 2',5'-Phosphorothioatkern zeigt eine größere Beständigkeit gegenüber Phosphodiesterase und Phosphatasen und im Vergleich mit authentischen 2',5'-Kernen neue biologische Aktivitäten. Diese stereochemisch modifizierten Moleküle sind die ersten 2',5'-verknüpften Kernmoleküle, die RNAse L aktivieren können. Die 2',5'- Phosphorothioate wirken sowohl durch Aktivierung des antiviralen 2-5A-Synthetase/RNAse-L-Systems als auch durch Inhibierung der viralen DNA-Polymerase. Die 5'-Monophosphate des trimeren 2',5'-Phosphorothioats aktivieren RNAse bei nanomolaren Konzentrationen, ähnlich wie natürlich vorkommendes p&sub3;A&sub3;. Andere hier bereitgestellte Modifikationen im Molekül an der Bindung zwischen den Nukleotiden umfassen die Substitution eines Sauerstoffatoms durch Sulfat, Selen, C&sub1;-C&sub8;-Alkyl und C&sub1;-C&sub8;-Alkoxy.
  • In noch einer anderen Ausführungsform werden durch Konjugation des Oligomers mit einem Addukt doppeltwirkende antivirale 2-5A-Derivate hergestellt, die besser in intakte Zellen eindringen. Eine bevorzugte Gruppe von Addukten umfaßt die wasserlöslichen Vitamine (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Biotin, Folsäure, Vitamin B&sub1;&sub2; oder Riboflavin). Zu anderen bevorzugten Addukten gehören lipophile Molekülgruppen und chemische Gruppen wie beispielsweise Acyl oder Cholesterylgruppen. Solche Konjugate werden von intakten Zellen durch Ausnutzung einer rezeptorvermittelten Endozytose aufgenommen.
  • Die Verabreichung von exogenen, metabolisch stabilen, doppelt wirksamen 2-5A-Analoga wird zu einer erhöhten Schutzwirkung gegen Krankheiten, die durch einen 2-5A-Defekt gekennzeichnet sind, führen, insbesondere zu einem Schutz gegen virale Infektionen bei Tieren und Menschen. Mit "2-5A- Defekt" ist hier jegliche Manifestation, jeder Zustand oder jede Unterbrechung des 2-5A-Mechanismus gemeint, die physiologisch eine Veränderung der Erzeugung von authentischem 2-5A und/oder die Unterbrechung der 2-SAabhängigen Aktivierung der RNAse L zur Folge hat. Durch einen 2-5A-Defekt gekennzeichnete Leiden umfassen beispielsweise Virusinfektionen, insbesondere die HTLV- Infektion, hauptsächlich die HIV-Infektion, chronische Müdigkeit, und andere mit HHV-6 zusammenhängende Krankheiten, Hepatitis B und andere Infektionen mit Viren aus der Hepatitisfamilie, kutane T-Zell-Lymphome und andere mit HTLV-1 zusammenhängende Krankheiten usw. Andere einschlägige Erkrankungen sind chronisch-myeloische Leukämie, akute Leukämie, Krebs, T-Zell-Leukämie, Alzheimersche Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, multiple Sklerose, Autoimmunkrankheiten und chirurgisch oder durch andere Traumen hervorgerufene Immunfunktionsstörungen. Defekte des 2-5A-Mechanismus manifestieren sich insbesondere in Krankheiten, die sowohl durch Virusinfektion als auch durch Immunzellendefekte gekennzeichnet sind.
  • Die strukturelle Modifikation des 2-5A-Moleküls an den 3- Hydroxylgruppen und an anderen Stellen ergibt 2-5A-Analoga mit merklich erhöhter metabolischer Stabilität gegenüber 2'- Phosphodiesterasen und Zellkernen, während die Fähigkeit, RNAse L zu aktivieren und die retrovirale reverse Transkriptase zu inhibieren, erhalten bleibt. Ebenso führt die Modifikation des nativen 2-5A durch Substitution des 3'- terminalen Nukleotids zu einem stabileren Molekül. Eine Folge der erhöhten Stabilität ist eine andauernde hohe Konzentration der metabolisch stabilen 2-5A-Analoga in der Zelle. Zusätzlich steigert die Modifikation des 5'-Endes die Fähigkeit des 2-5A-Moleküls zur Aktivierung der RNAse L.
  • Die länger anhaltende pharmakologische Aktivität der 2-5A- Analoga ermöglicht ein günstigeres therapeutisches Verhältnis. Dies erlaubt eine verminderte Verabreichungshäufigkeit im Vergleich zu 2-5A, das metabolisch instabil ist. Die verminderte Verabreichungsfrequenz ist wegen der chronischen Natur vieler durch Defekte im 2-5A-Mechanismus gekennzeichneter Leiden wichtig. Zusätzlich vergrößern gewisse Modifikationen der 2-5A-Derivate, die das Eindringen in die Zelle erleichtern, das therapeutische Verhältnis weiter, weil die für einen therapeutischen Effekt zu verabreichende Menge vermindert wird.
  • Die 2-5A-Analoga sind besonders nützlich bei der Behandlung von Virusinfektionen. Der mit der Virusinfektion verbundene Defekt des 2-5A-Mechanismus umfaßt die Inaktivierung des Mechanismus durch die Störung der dsRNA-Aktivierung der 2- 5A-Synthetase durch das Virus. Ohne Aktivierung der 2-5A- Synthetase ist die 2-5A-Erzeugung und daher auch die Aktivierung der RNAse L vermindert. Erfindungsgemäß wird exogenes, metabolisch stabiles 2-5A-Analog verabreicht, um dem vom Virus erzeugten Defekt im 2-5A-Mechanismus entgegenzuwirken. Die 2-5A-Analoga können wie das authentische 2-5A RNAse L aktivieren, die die virale RNA spaltet.
  • Die 2-5A-Analoga sind besonders nützlich zum Schutz gegen Infektion durch die verschiedenen humanen T-Zell- Leukämieviren (Sammelbezeichnung "HTLV"), wie HTLV-1, welches das kutane T-Zell-Lymphom hervorruft, HTLV-II, das Sezary-Lymphom verursacht, HTLV-II1 und HTLV-IV, das zur Zeit als das ätiologische Agens für multiple Sklerose angesehen wird. Jedes HTLV-Virus ist ein Retrovirus. HTLV- II1, auch als "HIV-1" bekannt, ist für die Entstehung des erworbenen Immunschwächesyndroms ("AIDS") verantwortlich. Die Verbindungen werden auch als nützlich zur Behandlung von HIV-2, einem zweiten, serologisch unterschiedlichen HIV- Subtyp, angesehen. Im Folgenden soll (HIV) sowohl HIV-1 als auch HIV-2 und jegliche weitere Subtypen, die jetzt bekannt sind oder später bekannt werden, bedeuten.
  • Die 2-5A-Analoga sind auch besonders nützlich zum Schutz gegen Infektion durch die verschiedenen Hepatitisviren, welche Virushepatitis hervorrufen. Insbesondere das Hepatitis-B-Virus wird als ein Komposit aus einem Retrovirus und einem Virus, das die Replikation eines DNA-Genoms durch DNA-abhängige DNA-Polymerase einsetzt, angesehen. Die 2-5A- Analoga sind auch besonders nützlich zum Schutz gegen Infektion durch Viren mit einem DNA-Genom, wie Herpesviren.
  • Es wurde gezeigt, daß HTLV-infizierte, insbesondere HIV-1- infizierte Patienten ungewöhnlich niedrige Werte der 2-5A- und/oder RNAse-L-Aktivität in einkernigen Blutzellen aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigen einkernige Blutzellen von gesunden Individuen im Mittel höhere 2-5A-Werte und die RNAse-L-Aktivität ist leicht nachweisbar. Ebenso weisen mononukleäre Blutzellen von Individuen, die von chronischer Müdigkeit befallen sind, niedrige 2-5A-Werte auf und belegen das Auftreten von neuartigen RNA-Spaltprodukten, die von den spezifischen Spaltprodukten, wie sie in einkernigen Blutzellen normaler Individuen beobachtet werden, verschieden sind.
  • Während die Ausführung der Erfindung hier mit Bezug auf die Behandlung der Infektion durch HIV-1, der allgemein als Prototyp eines Retrovirus angesehen wird, und HBV, der Eigenschaften sowohl eines Retrovirus als auch eines DNA- Genom-Virus hat, veranschaulicht wird, findet das erfindungsgemäße Verfahren bei der Behandlung jeglicher Erkrankung Anwendung, bei das ätiologische Agens ein Virus umfaßt.
  • Außerdem werden chronische Virusinfektionen allgemein mit einem Ungleichgewicht der Cytokine in Verbindung gebracht, das weitere pathogene Wirkungen, einschließlich der Ansammlung bioinaktiven 2-5A, erzeugt. Die vorliegende Erfindung wirkt korrigierend auf die Wirkungen dieses Ungleichgewichts, indem sie bioaktives 2-5A liefert.
  • Die Herstellung gewisser bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung genutzter Verbindungen ist beschrieben in den Patentschriften US-4,859,768 und US-4,924,624. Die anderen bei der Ausführung der Erfindung verwendeten Verbindungen können nach den in diesen Patenten beschriebenen allgemeinen Synthesetechniken hergestellt werden.
  • Zu den Beispielen für Verbindungen für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren gehören die folgenden Kernverbindungen, ihre entsprechenden 5'-Mono-, Di- und Triphosphate und die pharmazeutisch geeigneten Salze von allen diesen:
    • Gemischte Cordycepin/Adenosinoligomere
  • 2',5'-C-C-C,
  • 2',5'-A-A-C,
  • 2',5'-A-C-C,
  • 2',5'-C-C-A,
  • 2',5'-C-A-C,
  • 2',5'-C-C-A und
  • 2',5'-A-C-A, zusätzlich zu den verschiedenen "tetrameren" Kombinationen von A und C, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
  • 2',5'-C-C-C-C,
  • 2',5'-A-A-A-C,
  • 2',5'-A-A-C-C,
  • 2',5'-A-A-C-A und dergleichen.
    • Alkoxyverbindungen
  • 2', 5'-A-A-A-3'-O-methyl,
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-pentyl,
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-hexyl,
  • 2',5'-A-A-A-3'-O-heptyl.
    • Aminoverbindungen
  • 2',5'-A-A-A-3'-amino.
    • Verschiedene Verbindungen
  • 2',5'-A(Si)A(Si)A,
  • 2',5'-A-A-ara-A,
  • 2',5'-A-A-Tu,
  • 2',5'-Tu-Tu-Tu,
  • 2',5'-I&sub3;,
  • 2',5'-xylo-A&sub3;,
  • 2',5'-xylo-A&sub4;,
  • 2',5'-C-C-dCF,
  • 2',5'-EHNA-A-A und
  • 5,6-Dichlorbenzimidazylyl-(2',5')-5, 6-dichlorbenzimidazylyl- (2',5')-5, 6-dichlorbenzimidazolribosid,
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2',5')-3'-desoxyadenylyl-(2',4')-9-(4'- hydroxybutyl)adenin und
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2',5')-3'-desoxyadenylyl-(2',4')-9-(4'- hydroxyethoxy)adenin.
  • Die beiden zuletzt genannten Verbindungen, gekennzeichnet durch eine Etherbindung zwischen einem Cordycepinnukleotid und Adenin, gehören zu einer Gruppe, die gemeinsam als "C-C- Ether-A" bezeichnet werden. Werden die Cordycepinreste durch Adenosin ersetzt, bezeichnet man die Verbindungen dementsprechend mit "A-A-Ether-A".
    • Inhibierung der HBV-Replikation durch 2-5A-Derivate
  • Die antivirale Aktivität einiger 2-5A-Derivate gegenüber Hepatitis-B-Viren wurde geprüft. Humane Leberzellen, die chronisch HBV erzeugten (Acs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4641-4645, (1987)) wurden auf 24 Gewebekulturplatten (well tissue culture plates) geimpft und bis zum Zusammenfließen wachsen gelassen. Dann wurden 2-5A-Derivate (20 umol/l) über einen zusammenhängenden Zeitraum von 9 Tagen zugesetzt. Das Kulturmedium wurde täglich ausgetauscht. Nach 0, 3, 6 und 9 Tagen wurde im verbrauchten Kulturmedium die HBV-DNA analytisch bestimmt. Die behandelten Zellen wurden nach den 9 Tagen 24 Stunden lang lysiert und auf intrazelluläre genomische DNA-Formen analysiert. Das Protokoll wurde von Korba und Milman (Antiviral Research 217, 217 (1991)) veröffentlicht. Die Parameter der Bestimmung sind weiter unten näher beschrieben.
  • Sowohl die intrazelluläre als auch die extrazelluläre HBV- DNA wurden nach bekannten Routineverfahren analysiert, um (1) die Verifizierung der Wirksamkeit der Verbindungen zu ermöglichen und (2) mögliche Daten über den Zielort der Verbindung im HBV-Replikationsmechanismus aus der Untersuchung des Musters der viralen Replikationsformen zu erhalten. Das Kulturmedium wurde während der Behandlung täglich ausgetauscht, um (1) die Ansammlung von potentiell toxischen Metaboliten der Versuchsverbindungen zu vermeiden und (2) eine Analyse der HBV-Virionenerzeugung während einzelner 24-Stunden-Intervalle zu erhalten, die einen quantitativen Vergleich etwaiger Wirkungen auf die Virionenerzeugung gestattet.
  • Die Analyse der HBV-DNA wurde unter Anwendung von Blot- Hybridisierungsverfahren (Southern und Slot Blot) und [³²p] markierten HBV-spezifischen Sonden durchgeführt. Die HBV- DNA-Mengen wurden durch Vergleich mit bekannten Mengen von HBV-DNA-Standards gemessen, die auf jede Nitrozellulosemembran (Gel oder Slot Blot) aufgebracht wurden. Zur quantitativen Analyse wurde ein AMBIS- Betascanner benutzt, der den radioaktiven Zerfall der hybridisierten Proben direkt auf der Nitrozellulosemembran mißt. Um die vom Betascanner gemessenen Zerfälle je Minute (cpm) mit den relativen Mengen der Ziel-DNA korrelieren zu können, wurden durch mehrfache Analyse Eichkurven erstellt. Die Menge der in das Kulturmedium abgegebenen HBV-Virionen- DNA wurde mit einem Slot-Blot-Hybridisierungsverfahren bestimmt. Dann wurden die HBV-DNA-Mengen mit jenen bei 0 Tagen verglichen, um die Wirkung der Behandlung mit dem Medikament zu bestimmen.
  • Die Mengen an Replikatzwischenprodukt und episomalen Monomeren wurden als Indikator der relativen Höhe der HBV- Replikation benutzt. Die integrierte HBV-DNA wurde zur Normalisierung der relativen DNA-Mengen in jeder Spur benutzt, weil die Mengen dieser Klasse von HBV-DNA je Zelle konstant bleibt. Die Inhibierung der HBV-DNA-Replikation wird durch Abnahme der Replikatzwischenprodukte ohne Änderung der Menge der integrierten HBV-DNA angezeigt. Bei dieser Bestimmung zeigten folgende 2-5A-Derivate anti-HBV- Aktivität: Xylo-A&sub3;, A-A-Ether-A, EHNA-A-A, CAC, ACCA und dd benz.
  • Um diese Inhibierungen weiter zu untersuchen, wurden 5 dieser 2-5A-Derivate verdünnt und zusätzlich zu 20 umol/l auch bei 2 und 6 umol/l getestet. Die 5 2-5A-Derivate zeigten ausgeprägte anti-HBV-Inhibierungskraft bei 20 umol/l und 3 von ihnen (A-A-Ether-A, dd benz und CAC) waren auch bei 2 umol/l sehr aktiv. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Vielfalt von 2-5A-Derivaten aktiv gegen HBV ist. Erfindungsgemäß kann man schließen, daß die anti-HBV- Aktivität von diesen und anderen 2-5A-Derivaten verstärkt wird durch Einführen von 5'-terminalen Modifizierungen, welche die Fähigkeit der 2-5A-Derivate zur Aktivierung der RNAse L steigern. Erfindungsgemäß kann auch geschlossen werden, daß die anti-HBV-Aktivität weiter gesteigert wird durch Konjugation von diesen 5-modifizierten und 5'- unmodifizierten 2-5A-Derivaten mit lipophilen Addukten wie Cholesterin, Palmitat, Folat usw.
  • Um das therapeutische Verhältnis der 5 2-5A-Derivate, deren anti-HBV-Aktivität gemessen worden war, zu bestimmen, wurde ihre Toxizität mit einer herkömmlichen Neutralrotmethode gemessen. Die Arbeitsvorschrift für die Bestimmung der Toxizität dieser Verbindungen in Kulturen ist bekannte Routine und kann wie folgt zusammengefaßt werden: Man läßt 2.2.15 Zellen in Flachboden-Gewebekulturplatten mit 96 Näpfchen bis zum Zusammenfließen wachsen und behandelt sie mit den Verbindungen in 0,2 ml Kulturmedium pro Näpfchen. Von jeder Verbindung wurden 4 Konzentrationen untersucht, jede in 3 Kulturen. Auf jeder Platte mit 96 Näpfchen ließ man Vergleichsnäpfchen unbehandelt. Näpfchen ohne Zellen wurden auf jeder Platte zur Korrektur der Lichtstreuung verwendet. Die Toxizität wurde anhand der Inhibierung der Aufnahme des Neutralrotfarbstoffs durch Bestimmung der optischen Dichte bei 510 nm im Vergleich mit unbehandelten Zellen bestimmt (Finter et al., J. Med. Chem. 5, 419 (1969)), und zwar über 24 Stunden nach dem neunten Tag der Behandlung.
  • Bei der höchsten Konzentration aus dem Test auf antivirale Aktivität (20 umol/l) wurde keine Toxizität der genannten 2- 5A-Derivate beobachtet. Bei der neunfachen antiviral wirksamen Konzentration (180 umol/l) zeigten vier der fünf getesteten 2-5A-Derivate keine Toxizität. Die fünfte, dd benz, zeigte bei 180 umol/l geringe Toxizität.
  • Um des weiteren die Spezifität der HBV-Inhibierung durch die genannten 2-5A-Derivate zu untersuchen, wurden ihre Abbauprodukte auf mögliche anti-HBV-Aktivität getestet. Bei Benzimidazol, Dibenzimidazol, Adenosin, Cordycepin und 9-β- D-Xylofuranosyladenin wurde keine anti-HBV-Aktivität festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die 2-5A-Derivate die Replikation des HBV bei Konzentrationen, die für nicht infizierte Zellen nicht toxisch sind, spezifisch inhibieren und daß die Inhibierung durch die 2-5A-Derivate und nicht durch ihre Metaboliten bedingt ist.
    • Virusinhibierung durch Phophorothioatoligomere
  • RNAse L ist ein Enzym mit Schlüsselfunktion im antiviralen 2-5A-Synthetase/RNAse-L-Abwehrmechanismus. Die Aktivierung dieser einzigartigen 2-5A-abhängigen endo-Ribonuklease durch 2-5A-Derivate und die nachfolgende Hydrolyse der viralen RNA ist entscheidend für die Inhibierung der Virusreplikation und für die Regulierung des Zellwachstums. Einige antiretrovirale Eigenschaften des Interferons werden durch die Aktivierung des 2-5A-Synthetase/RNAse-L-Mechanismus vermittelt. Eine direkte Aktivierung der RNAse L durch 2-5A- Derivate umgeht dieses Erfordernis nach Interferon zum Erreichen eines antiretroviralen Zustands. Modifikation des 2-5A-Moleküls an den 3'-Hydroxylgruppen und an den 2',5'- Bindungen zwischen den Nukleotiden führte zu 2-5A-Derivaten, die metabolisch stabil (und daher beständig gegenüber Abbau durch Phosphodiesterasen und Phosphatasen) und biologisch aktiv (fähig zur Aktivierung der RNAse L) sind. Die Anpassung der Syntheseverfahren erlaubt das Entwerfen und die Synthese von 2-5A-Derivaten, die (i) erhöhte metabolische Stabilität gegen nukleolytischen Abbau zeigen, (ii) gegen Phosphatase beständig sind, (iii) zur Aktivierung der RNAse L keine 5'-Phosphorylierung benötigen und (iv) in intakte Zellen transportiert werden können. Um eine Differenzierung zwischen Aktivierung der RNAse L und der Inhibierung auf Molekülebene zu erreichen, wurde in die 2',5'-Phoosphodiesterbindung des 2-5A-Moleküls Chiralität eingeführt. Die reinen Dimere und Trimere der diastereomeren Phosphorothioatderivate des 2-5A wurden zunächst enzymatisch synthetisiert. Neuerdings wurden chemische Synthese, Reinigung und Identifikation der beiden dimeren, vier trimeren und acht tetrameren Diastereomeren über den Phosphotriester- und Phosphoamidit-Syntheseweg erreicht. Diese chiralen Moleküle zeigen beeindruckende biologische Aktivitäten, welche das Dogma, zur Aktivierung der RNAse L seien drei Adenylatreste und zwei 5'-terminale Phosphate notwendig, widerlegten. Im Gegensatz zu authentischen 2-5A- Kernmolekülen, die RNAse L nicht aktivieren können, binden an und aktivieren RNAse L drei der vier 2',5'- Phosphorothioattrimerkerne (bei 10&supmin;&sup5; mol/l), ebenso wie die 2',5'-Phosphorothioat-5'-monophosphate (pRpRp, pRp5p und pSpRp) (bei 10&supmin;&sup8; mol/l).
  • Um festzustellen, ob diese in vitro-Untersuchungen auf ein in vivo-Modell mit virusinfizierten Zellen ausgedehnt werden können, wurden die 5'-Monophosphate des 2',5- Phosphorothioattetramers in das Zytoplasma von HeLa-Zellen mikroinjiziert und die Zellen dann mit VSV provoziert. Alle 5'-Monophosphate des 2',5'-Phophorothioattetramers (pRpRpRp, pSpRpRp und pRpSpSp) aktivierten RNAse L, jedoch das pSpSpSp-Isomer (bei hohen Konzentrationen bis zu 10&supmin;&sup6; mol/l) nicht. Die Mikroinjektion von pSpSpSp-Inhibitor gleichzeitig mit 2-5A beseitigte den Schutz gegen VSV-Replikation. Die Rp- und Sp-2',5'-Phosphorothioate inhibieren die HIV-1- Replikation in Kulturen von intakten Zellen. Die 2',5'- Phosphorothioate schützen Zielzellen vor HIV-1-Infektion durch Inhibierung der HIV-1 RT (gemessen in mit Triton X-100 aktivierten Lysaten von HIV-1-Virionen aus der überstehenden Flüssigkeit von H9/HTLV-IIIB-Kulturen). HIV-1 RT wurde durch A&sub3; oder p&sub3;A&sub3; bei 0,25-256 umol/l nicht inhibiert. Im Gegensatz zu 2-5A sind die 5'-Monophosphatderivate der 2',5'-Phosphorothioattetramere sehr wirksame Inhibitoren der Aktivität der HIV-1 RT. Der wirksamste Inhibitor für HIV-1 RT in Lysaten von HIV-1-infizierten Zellen ist p&sub3;A&sub3;αS mit 50 % Inhibierung bei 0,5 umol/l. AMPS inhibierte HIV-1 RT bis hinauf zu 200 umol/l nicht, was darauf hinweist, daß Abbauprodukte für die bei 2',5'-Phosphorothioaten beobachtete Inhibierung nicht verantwortlich sind.
  • Wie in Untersuchungen der UV-Vernetzung gezeigt wurde, binden d(T)16 und tRNALYS.3 spezifisch an die kinetisch signifikanten Primerbindestellen von homogen reiner rekombinater p66 HIV-1 RT. Die Bindung von oligo-d(T)n an p66 RT wird durch dNTPs nicht beeinträchtigt; in Vergleichsbestimmungen inhibieren die Primeranaloga Sd(C)&sub2;&sub8; und d(C)&sub1;&sub9;&submin;&sub2;&sub4;, der natürliche Primer tRNALYS.3 und p&sub3;A&sub3;αS die Bildung des oligo-d(T)n-p66/RT-Komplexes auf exponentielle Art erster Ordnung. Die Inhibierung von HIV-1 RT durch 2-5A und 2-5A-Derivate erfolgt and der Primerbindestelle. Im Bindungsgleichgewicht zeigt 2',5'-p&sub3;AY eine Bindungskinetik erster Ordnung mit halber Konkurrenz bei 55 umol/l (KP = 31 · 10&supmin;&sup6; mol/l). 2',5'-p&sub3;A&sub3;αS zeigt Bindungskinetik erster Ordnung mit halber Konkurrenz bei 5,1 · 10&supmin;&sup6; mol/l (Kp = 2,9 · 10&supmin; &sup6;mol/l). 2',5'-A&sub3;-Kern, 2',5'-pA&sub3;, 3',5'-A&sub3;-Kern, 3',5'-pA&sub3;, 3',5'-p&sub3;A&sub3; und ATP inhibieren die Bindung von HIV-1 RT an d(T)&sub1;&sub6; nicht.
  • Der 2',5'-Cordycepintrimerkern und das 5'-Monophosphat (1 umol/l) (bei Inkorporierung in spezifisch für das T-Zell- Rezeptormolekül CD&sub3; antikörperempfängliche Liposomen) inhibierte 90% der HIV-1-Replikation. Siehe Tabelle 1 in Müller, W. E. G., Weiler, B. E., Charubala, R., Pfleiderer, W., Leserman, L., Sobol, R. W., Suhadolnik, R. J. und Schröder, H. C., Biochemistry 30, 2027 (1991). Bestimmungen mit dot-blot und Gelretardation zeigten, daß 2',5'- Cordycepintrimerkern und 5'-Monophosphat die Bindung der tRNALYS.3 an HIV-1 RT stören. Siehe Fig. 3 in Müller et al. pC&sub3; regte die Aktivität der RNAse L nicht an und hatte keinen Einfluß auf die Menge der zellulären RNA oder des Proteins. Bei einer Konzentration von 10 umol/l waren die zellulären DNA-Polymerasen α, β und y nahezu unempfindlich gegen C&sub3; oder pC&sub3; (C = Cordycepin).
  • Uns stehen erstmalig antiretrovirale Moleküle (2-5A-- Derivate) zur Verfügung, die eine doppelte Wirkung auf mit HIV-1 infizierte Zellen besitzen: (i) Sie aktivieren das antiretrovirale 2-5A-Synthetase/RNAse-L-System und (ii) inhibieren HIV-1 RT. Mit den 2',5'-Phosphorothiotekernen und ihren 5'-Monophosphaten ist es möglich, (durch Inhibierung der HIV-1 RT) eine akute Infektion zu verhindern und gleichzeitig durch Aktivierung der RNAse L die HIV-1-mRNA abzubauen.
    • Konjugate von 2',5'-Oligoadenylatderivaten mit erhöhter Aufnahme durch die Zelle
  • Um das Eindringen der 2-5A-Derivate in die intakten Zellen zu erleichtern, wurden bioaktive 2-5A-Derivate an wasserlösliche Vitamine (Folsäure, Biotin, Riboflavin oder Vitamin B12) oder an lipophile chemische Gruppen konjugiert. Durch Ausnutzung dieser Technik können 2-5A-Derivate ohne Beschädigung der Membran in die intakten Zellen eingebracht werden. Dieser Weg umfaßt (i) die Synthese von bioaktiven, metabolisch stabilen Derivaten, beispielsweise 2,5'-Cn, 2',5'-Phosphorothioate (hergestellt nach US-4,924, 624) und andere metabolisch stabile Derivate wie die in US-4,859,768 offenbarten. 2-5A-Derivate nach der Offenbarung in den oben genannten Dokumenten wurden entworfen, synthetisiert und auf ihren antiretroviralen Einfluß auf die Menge der RNAse L und auf Inhibierung von RT getestet. 2,5'-Oligonukleotide können enzymatisch und in mehrstufiger chemischer Synthese über Phosphotriester und Phosphoramidite in Mengen von Milligramm bzw. Gramm hergestellt werden. Die richtige Auswahl der geeigneten Schutzgruppen für Zucker, Base und Phosphat bestimmt Ausbeuten, einfache Reinigung und chromatographisches Verhalten.
  • Das erfolgreich erleichterte Einbringen von biologisch aktiveren und metabolisch stabilen 2-5A-Derivaten ist der Schlüssel für die Fortsetzung der mechanistischen Untersuchungen der Inhibierung der HIV-1-Replikation und wirksames Einbringen der Medikamente. Für die Unterstützung des Einbringens der 2-5A-Derivate in die intakten Zellen können mehrere Strategien angewendet werden.
    • Lipophile Konjugate der 275-Oliogoadenylate
  • Ein erstes Verfahren zur Unterstützung des Einbringens schließt die kovalente Konjugation von lipophilen Gruppen (beispielsweise Acyl- oder Cholesterylgruppen) an das 2',3'- Ende des Moleküls ein. Zum Beispiel kann der 2',5'- Cordycepintrimerkern mit Palmitoyl- (Formel III) oder Cholesterylformyl- (Formel IV) Esterbindungen an der 2'- terminalen Hydroxylgruppe synthetisiert und gereinigt werden:
  • Für diese veresterten Verbindungen wurde gefunden, daß sie die HIV-1-Replikation in Kulturen von mit HIV-1 infizierten H9-Zellen inhibieren.
  • 2-5A-analoge Cholesterinkonjugate können durch Reaktion einer konjugierenden Verbindung der Formel V mit Cholesterylchloroformat in Gegenwart von Dimethylaminopyridin (DMAP) und Dichlormethan synthetisiert werden: NH&sub2;
  • wobei
  • m Null, 1, 2 oder 3 ist,
  • n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
  • R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist,
  • R&sub1; COOH oder NH&sub2; ist,
  • R&sub2; unabhängig Schwefel oder Sauerstoff ist,
  • R&sub3; unabhängig Schwefel oder Sauerstoff ist und
  • x eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist. Die Reinigung erfolgt durch Säulenchromatographie.
  • Bevorzugt sind nicht alle R Hydroxyl, d. h. mindestens eines ist Wasserstoff. Bevorzugt ist n 1 bis 3, meist bevorzugt 1 bis 2. Das R&sub2; der 5'-terminalen Phosphonylgruppe ist bevorzugt Schwefel. Schließlich ist der Wert von x bevorzugt von 1 bis 8, meist bevorzugt 1 bis 4. Das konjugierende 2- 5A-Derivat nach Formel V kann durch Brauchbarmachung eines geeigneten 5'-phosphorylierten 2',5'-Oligoadenylats, 2%5- Oligocordycepins oder gemischten 2',5'- Oligo(adenylat/cordycepin)-Oligomers hergestellt werden, das entweder nach US-4,464,359 oder US-4,859,768 hergestellt werden kann. Das Oligomer wird brauchbar gemacht durch Kupplung seines 2'-terminalen Nukleotids an eine Alkylbindungsgruppe -(CH&sub2;)x-R&sub1;, wobei x und R&sub1; oben definiert sind.
  • Es sollte gewürdigt werden, daß zusätzlich zu den Oligomeren mit Phosphodiesterbindungen zwischen den Nukleotiden die konjugierenden 2-5A-Derivate der Formel V auch durch Anheften der Alkylbindungsgruppe an das 2'-terminale Nukleotid eine 2',5'-Phosphorothioatoligonukleotids hergestellt werden können. Die Herstellung der 2',5'- Phosphorothioate, einschließlich der vollständigen Trennung ihrer Enantiomere (die Phophorothioate sind optisch aktiv), ist in US-4,924,624 offenbart. Es sollte zu erkennen sein, daß man ein gemischtes 2',5'- (Phophodiester/phosphorothioat)-oligoadenylat herstellen kann, wenn man nach der kombinierten Synthesetechnik der Patente US-4,924, 624 und US-4,859,768 arbeitet.
  • Wenn die R&sub2;-Gruppen aller Bindungen zwischen den Nukleotiden des Moleküls Sauerstoff enthalten, d. h. wenn die Bindungen Phosphodiesterbindungen enthalten, können die 5'- Monophosphate leicht durch Reaktion der entsprechenden nicht phosphorylierten Kernverbindungen mit POCl&sub3; hergestellt werden. Wenn mindestens eine Bindung zwischen den Nukleotiden eine Phophorothioatbindung aufweist, d. h. R&sub2; = Schwefel, würde eine solche Reaktion zur Eliminierung des Schwefels aus der Phosphorothioatbindung zwischen den Nukleotiden und zur Bildung eines 2',5'-Oligoadenylats führen. Daher müssen die 5'-Monophosphate der Kernoligomere mit Phosphorothioatbindung aus den entsprechenden vollständig geschützten Kernoligomeren hergestellt werden, aus denen die Monomethoxytrityl-Schutzgruppe am 5'- terminalen Nukleotid entfernt wurde. Das Verfahren ist im Einzelnen in US-4,924,624, Spalte 26 bis 31, beschrieben.
  • 2-5-Derivat/Acyl-Konjugate können durch Reaktion der konjugierenden Verbindung mit Acylchlorid nach Standardverfahren synthetisiert werden. Alternativ kann das 2',5-Oligomer direkt mit einer mit der 2'-terminalen Hydroxylgruppe veresterten Acyl- oder Cholesterylformylgruppe synthetisiert werden. Ein solches Verfahren ist erläutert, aber nicht auf die Herstellung von der mit Cholesterin konjugierten und acylierten Cordycepintrimerverbindungen, zu denen die Verbindungen 12 und 13 in der Übersicht 1 gehören, beschränkt. Übersicht 1 Übersicht 1, Fortsetzung Übersicht 1, Fortsetzung Übersicht 1, Fortsetzung
  • Nach der Übersicht 1 beginnt eine mehrstufige chemische Synthese mit 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-p- nitrophenylethoxycarbonylcordycepin (1) und dem entsprechenden 2'-O-Succinatderivat (2). Die Verbindung 1 wird mit Cholesterylchloroformat zum Carbonat 3 umgesetzt, welches nach Detritylierung zu 4 als 2-terminaler Baustein benutzt wird. Das Succinat 2 wird mit Cholesterin zum Ester 5 kondensiert und Detritylierung führt zur Verbindung 6.
  • Der Syntheseweg zu den trimeren Konjugaten ist in der Übersicht 2 anhand eines von der Verbindung 6 ausgehenden Beispiels dargestellt. Dieses Cordycepinderivat wird zunächst mit dem vollständig geschützten Phosphoramidit 7 umgesetzt und ergibt in ausgezeichneter Ausbeute das Dimer 8. Detritylierung am 5'-Ende bildet 9 und nachfolgende Kondensation mit einem zweiten Molekül 7 ergibt das vollständig geschützte Trimer 10. Letzteres wird danach mit Säure behandelt, um die Dimethoxytritylgruppe abzuspalten, und mit DBU, um gleichzeitig die p-Nitrophenylethoxycarbonylgruppe abzuspalten, und liefert das freie Cordycepintrimerkonjugat 11. Der Vorteil dieses Vorgehens ist aus der Tatsache ersichtlich, daß die Esterfunktion zwischen Cholesterin und Succinat-Abstandshalter alle chemischen Manipulationen überlebt.
  • Auf völlig analoge Weise wird das Cholesterylcarbonat 4 nach der gleichen Schrittfolge umgesetzt, wobei das Cordycepintrimerkonjugat 12 hergestellt wird.
  • Ebenfalls auf völlig analoge Weise wird das Cordycepintrimerkonjugat 13, das einen Acylrest am 2'-terminalen Ende des Oligonukleotids trägt, hergestellt.
  • Erfindungsgemäße lipophile Konjugate haben aufgrund ihrer lipophilen Natur das Potential, durch Diffusion in die Zelle einzutreten. Sie können in die intakten Zellen mit im wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie authentisches 2-5A eingeführt werden. Nach dem Eintreten in die Zelle werden die Konjugate hydrolysiert und setzen die 2-5A-Derivate frei.
    • Konjugate der 2',5'-Oligoadenylate mit Vitamin
  • Ein zweites Verfahren zum unterstützten Einbringen der Oligonukleotide schließt die kovalente Konjugation der 2-5A- Derivate an wasserlösliche Vitamine, wie Biotin, Folsäure, Riboflavin oder Vitamin B&sub1;&sub2;, ein. Die kovalente Konjugation von 2-5A-Derivaten an wasserlösliche Vitamine ermöglicht ein Verfahren zum gemeinsamen Einbringen aktiver Moleküle in intakte Zellen durch Ausnutzung der rezeptorvermittelten Endozytose, wobei die biologische Aktivität im wesentlichen vollständig aufrechterhalten wird.
  • Um dieses Prinzip zu demonstrieren, haben wir kovalent an Fluoreszein-Rinderserumalbumin (BSA) konjugiertes Folat in kultivierte H9-Zellen eingebracht (Fig. 2A und 2B). In Vergleichsversuchen wurde nicht an Folat konjugiertes Fluoreszein-BSA nach 5 Stunden Inkubation von H9-Zellen nicht aufgenommen (Fig. 2C und 2D). Diese Versuche zeigen, daß an H9-Zellen Folatrezeptoren vorhanden sind, die zum gezielten Einbringen von 2-5A-Derivaten verwendet werden können. Die Folatrezeptoren können das folatkonjugierte Molekül binden, das innerhalb von 5 Stunden von 80% der Zellen aufgenommen wird.
  • 2-5A-Derivate können kovalent an wasserlösliche Vitamine konjugiert werden, wobei das Einbringen des polaren 2-5A- Moleküls in die intakte Zelle ohne Beschädigung der Membran erleichtert wird. Die wasserlöslichen Vitamine sind kovalent an den 2',3'-Terminus des 2-5A-Moleküls konjugiert und nutzen die rezeptorvermittelte Endozytose zur Aufnahme in die intakten Zellen aus. Das zerstörungsfreie Einbringen von an Biotin, Folsäure, Riboflavin und Vitamin B&sub1;&sub2; kovalent konjugierten polaren Molekülen in das Zytoplasma und die nachfolgende wirksame Aufnahme durch rezeptorvermittelte Endozytose wurde gut demonstriert. Auf diese Weise kann die durch andere Verfahren (wie Mikroinjektion, Elektroporation, Sonikation, Detergenzpermeation) verursachte Beschädigung der Membran durch Ausnutzung des natürlichen Endozytosemechanismus der Vitamine bei der Aufnahme vermieden werden. Die Aufnahme von Vitaminen erfolgt bei allen sich teilenden Zellen mit annehmbarer Geschwindigkeit. Auf der Grundlage der bekannten Effizienz der Aufnahme von Vitaminkonjugaten wird angenommen, daß eine intrazelluläre Konzentration eines 2-5A/Folsäure-Konjugats von etwa 10&supmin;&sup6; mol/l erreicht werden kann; diese Konzentrationen reichen zur Aktivierung der RNAse L und zur Inhibierung der HIV-1 RT aus. Wegen der ähnlichen Anzahl von Rezeptoren für Folat, Biotin und Vitamin B&sub1;&sub2; werden ähnliche Konzentrationen für die Konjugate 2-5A/Biotin und 2-5A/Vitamin B12 erwartet.
    • 2-5A/Vitamin B&sub1;&sub2;-Konjugat
  • Zur kovalenten Konjugation von 2-5A oder 2-5A-Derivaten an Vitamin B&sub1;&sub2; wird dieses zunächst durch milde saure Hydrolyse (0,4 mol/l HCl, 72 Stunden bei Zimmertemperatur) in sein Mono-Säurederivat umgewandelt. Man läßt eine konjugierende 2-5A-Verbindung, beispielsweise nach Formel V (R&sub1; = NH&sub2;), mit der Carboxylgruppe des Vitamins B&sub1;&sub2; unter Verwendung eines geeigneten Kupplungsreagenzes wie 1-Ethyl-3- (dimethylaminopropyl)-carbodiimid HCl (EDAC) reagieren. Das 2-5A/Vitamin B&sub1;&sub2;-Konjugat wird entweder chromatographisch an Sephadex G-25 oder durch Phasenumkehr-HPLC gereinigt. Die Charakterisierung erfolgt aufgrund der bekannten molaren Extinktionskoeffizeinten für 2-5A und Vitamin B&sub1;&sub2;.
    • 2-5A/Folsäure-Konjugat
  • Das 2-5A/Folsäure-Konjugat wird durch Reaktion einer konjugierenden Verbindung, beispielsweise nach Formel V (R&sub1; = NH&sub2;), mit einem geeigneten Kupplungsreagenz wie EDAC und nachfolgende Reinigung durch Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder HPLC synthetisiert.
    • 2-5A/Biotin-Konjugat
  • Das 2-5A/Biotin-Konjugat kann durch Reaktion von im Handel erhältlichen H-Hydroxysuccidimidylbiotin mit einer Verbindung nach Formel V (R&sub1; = NH&sub2;) und nachfolgende Reinigung wie für das 2-5A/Folsäure-Konjugat beschrieben synthetisiert werden.
    • Herstellung von 2',5'-Cordycepinanaloga mit 3'-terminalem azyklischem Nucleosid
  • Trimere Analoga des Cordycepin-"Kerns" nach Formel I, d. h. Verbindungen, bei denen m Null und n Eins ist, können nach Übersicht 2 hergestellt werden, wobei "bz" Benzoyl, "MeOTr" Monomethoxytrityl, "npe" 2-(4-Nitrophenyl)ethyl und "npeoc" [2-(4-Nitrophenyl)-ethoxy]carbonyl ist. Zur Veranschaulichung sind die Verbindungen als Ammoniumsalze hergestellt, was aber nicht als Beschränkung der Erfindung darauf zu verstehen ist. Die Übersicht gibt Beispiele für die Herstellung von vier Verbindungen 18, 19, 20 und 21. Übersicht 2
  • Der Dinukleotid-monophosphodiester 9 wurde aus 3'-Desoxy-5'- O- (monomethoxytrityl) -N&sup6;- [2- (4- nitrophenyl)ethoxycarbonyl]adenosin (4) nach dem Verfahren von Charubala et al., Helv. Chim. Acta 70, 2028 (1987) hergestellt. Die nach Charubala et al. herstellbare Verbindung 4 wurde genommen und nach dem Verfahren dieser Veröffentlichung von Charubala et al. in den 2'- Phosphotriester 5 mit einer 2,5-Dichlorphenyl- und einer 2- (4-Nitrophenyl)ethylgruppe an der Phosphatfunktion (Übersicht 1) umgewandelt. Die 2,5-Dichlorphenylgruppe wurde von 5 mit 4-Nitrobenzaldehydoxim abgespalten und man erhielt den Diester 6. Andererseits wurde die 5'-O- Monomethoxytritylgruppe mittels Säure abgespalten und man erhielt den 5'-Hydroxytriester 7. Diese beiden Bausteine 6 und 7 wurden in Gegenwart von 2,4,6- Triisopropylbenzolsulfonylchlorid und 1-Methyl-1H-imidazol mit einer Ausbeute des dimeren Phosphotriesters 8 von 88% nach Reinigung und Trocknung kondensiert. Wieder wurde nach dem Oximatverfahren die 2,5-Dichlorphenylgruppe von diesem Dimer abgespalten und man erhielt den entsprechenden Monophosphodiester 9 des Dinukleotids.
  • Zur Synthese der Trimeren 14-17 wurde der oben genannte Phosphodiester 9 in Gegenwart von 2,4,6-Triisobutylbenzolsulfonylchlorid und 1-Methyl-1H-imidazol mit den geeignet geschützten passenden azyklischen Nukleosiden 10 - 13 zu Ausbeuten von 70-75% kondensiert. Die azyklischen Nukleoside 10-13 können nach der Vorschrift von Tychinskaya et al., Bioorg. Khim. (USSR) 5, 1059 (1979) und Mikhalilov et al., Izv. Akad. Nauk Ser. Khim. 2582 (1974) hergestellt werden. Der dimere Diester 9 (1 mmol) und das passende azyklische Nukleosidanalogon 10-13 (0,75 mmol) wurden mit trockenem Pyridin (5 · 10 ml) gemeinsam eingedampft und schließlich in Pyridin (10 ml) gelöst. Dann wurden nacheinander 0,46 ml (6 mmol) 1-Methyl-1H-imidazol und 0,606 g (2 mmol) 2,4,6-Triisobutylbenzolsulfonylchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, dann mit CHCl&sub3; (100 ml) verdünnt und mit Wasser (2 · 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft und nach gemeinsamem Eindampfen mit Toluol (3 · 20 ml) wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie (Silicagel, 10 · 2,5 cm, CHCl&sub3;/MeOH 100 : 1) gereinigt: 14-17 als farblose Schäume mit 85-90% Ausbeute. Entsprechend wurde einer Lösung geschützten Trimers 15-18 (0,028 g, 15 umol) 0,5 mol/l DBU in trockenem Pyridin (5 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 20 Stunden gerührt, mit 1 mol/l AcOH in Pyridin (2,5 ml) neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wurde mit konzentriertem NH&sub3; (15 ml) gerührt. Nach 48 Stunden Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Behandlung mit 80 % AcOH/H&sub2;O (4 ml) über 24 Stunden bei Zimmertemperatur detrityliert. Nach Eindampfen wurde der Rückstand einige Male mit Wasser eingedampft, in Wasser aufgenommen, auf eine DEAE A-25-Sephadex-Säule (60 · 1 cm) aufgebracht und mit einem linearen Gradientenpuffer (pH 7,5) mit 0,001-0,3 mol/l Et3NH und HCO&sub3; (TBK) eluiert. Die Fraktionen des Produkts wurden eingedampft, einige Male mit Wasser eingedampft und durch Papierchromatographie (i-PrOH/konz. NH&sub3;/H&sub2;O 6 : 1 : 3) weiter gereinigt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, mit H&sub2;O eluiert und lyophilisiert und man erhielt
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-2')-9-(2'- hydroxyethyl)adenin-diammoniumsalz; 18;
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2'-5t-3'-desoxyadenylyl-(2'-3')-9-(3'- hydroxypropyl)adenin-diammoniumsalz; 19;
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-4')-9-(4'- hydroxybutyl)adenin-diammoniumsalz; 20 bzw.
  • 3'-Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-2")-9- [(2'-hydroxyethoxy)methyl]adenin-diammoniumsalz; 21
  • als farblose Pulver mit 75-85% Ausbeute. Die Reinheit aller Produkte wurde durch Dünnschichtchromatographie, UV und ¹H-NMR-Spektren geprüft.
  • Von allen Trimeren wurden nacheinander die Schutzgruppen entfernt, wobei 0,5 mol/l DBU (1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undecen-7) in trockenem Pyridin über 20 Stunden bei Zimmertemperatur zur Abspaltung der 2-(4- Nitrophenyl)ethylgruppen, NH&sub3; in Dioxan zur Entfernung der Benzoylgruppen und schließlich eine Säurebehandlung zur Entfernung der 5'-0-Monomethoxytritylgruppe verwendet wurden. Man erhielt die entsprechenden völlig von Schutzgruppen befreiten Trimere 18-21, die durch Säulenchromatographie mit DEAE Sephadex und Papierchromatographie gereinigt wurden. Die Trimere wurden charakterisiert durch Dünnschichtchromatographie, UV, HPLC und ¹H-NMR-Spektren (Daten nicht aufgeführt).
  • Tetramere (C-C-C-Ether-A) können hergestellt werden, indem man den Dinukleotid-Monophosphodiester 9 in Übersicht 2 durch das entsprechende geschützte Trinukleotid 9a ersetzt, welches, wie oben, mit dem geeignet blockierten passenden azyklischen Nukleosid kondensiert wird. Ebenso sollte klar sein, daß höhere Oligomere zu den vorliegenden 3'- azyklischen Cordycepinoligomeren hergestellt werden können, indem man für die Kondensation mit dem azyklischen Nukleosid passende höhere Oligonukleotide auswählt.
  • Die 5'-Monophosphate der nicht phosphorylierten Kernmoleküle können aus den völlig blockierten Trimeren, z. B. 14-17, durch Tritylabspaltung mittels Säurebehandlung und nachfolgende Reaktion mit Di-p-nitrophenylethylphosphorylchlorid hergestellt werden. Weitere Abspaltung von Schutzgruppen und Chromatographie führt zu Isolierung der 5'-Monophosphatoligomere. Das Verfahren zur 5'- Monophorylierung kann nach Beispiel 6 des US-4,859,768 ausgeführt werden.
  • Die 5'-Diphosphate und 5'-Triphosphate der Kernmoleküle können nach der Vorschrift des vorgenannten Patents hergestellt werden. Kurz gesagt können sie hergestellt werden durch Zusatz von 0,5 mmol/l Tributylammoniumpyrophosphat, gelöst in 5 ml Dimethylformamid, zu 0,1 mmol/l monophosphoryliertem Kern als wasserfreies Tributylammoniumsalz in 1 ml Dimethylformamid und 0,5 mmol/l 1-1'-Carbonyldiimidazol. Nach 20 Stunden bei Zimmertemperatur werden die Reaktanten mit 5 ml Methanol behandelt, zur Trockne eingedampft und auf einer 2 · 20 cm DEAE Cellulosesäule chromatographiert. Die 5'-Di- und triphosphate werden nach einem linearen Gradienten (0-0,4 mol/l in 3 l bei pH 7,5) von Triethylammoniumbicarbonat isoliert, entsprechend dem Verfahren von Hoard et al., J. Amer. Chem. Soc. 87, 1785- 178 (1965). Die 5'-Diphosphate und 5-Triphosphate können dann mit DEAE-Sephadex® A25 und Sephadex® gereinigt werden.
  • Die 2-5A-Analoga und Konjugate können nach den Verfahren, die in den Patenten US-4, 924, 624 und US-4,859,768 und in der Internationalen Anmeldung PCT/US85/03634 (Internationale Veröffentlichung WO 89/03683) beschrieben sind, in den dort empfohlenen Dosierungen verabreicht werden. So können für die pharmazeutische Verwendung die 2,5'- Oligoadenylatanaloga von pharmazeutisch geeigneten Trägern aufgenommen werden. Solche Träger für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen könne entweder organisch oder anorganisch und von flüssiger oder fester Art sein. Zu den geeigneten flüssigen Trägern gehören Wasser und Alkohole wie Ethanol, Benzylalkohol und Polyethylenglykole. Zu den bevorzugten Trägern für injizierbare Präparate gehören Wasser, Salzlösung, Dextroselösung und Glykollösungen wie wäßriges Propylenglykol oder Polyethylenglykol. Die Eigenschaften der Rezepturen können durch Zusatz eines oder mehrerer Adjuvantien verbessert werden, die Eigenschaften als Viskositätssteigerer, Netzmittel, pH-Modifizierer, Konservierungsmittel, Süßstoffe, Stabilisatoren, Farbmittel, Dispersionsmittel, Granulierhilfsmittel, Beschichtungshilfsmittel, Zerfallbeeinflusser, Treibmittel, Emulgatoren und Feuchthaltemittel besitzen. Die resultierenden Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Salben, Tropfen, injizierbaren Zusammensetzungen und dergleichen haben.
  • Die verabreichte Dosis hängt von der Schwere der Infektion oder des Leidens und von Größe und Gewicht des Subjekts ab. Abhängig von der Art des Leidens sowie von Größe und Gewicht des Subjekts kann die Dosis in einem weiten Bereich variieren. Nach einer Ausführungsform werden die Verbindungen als Lösung mit 0,1-100 mg/ml in Wasser, phosphatgepufferter Salzlösung oder einer anderen passenden Flüssigkeit oder als Tablette mit 0,01-1 g aktiver Verbindung hergestellt.
  • Die Verbindungen können in Form von wasserlöslichen Salzen verabreicht werden. Zu den pharmazeutisch geeigneten wasserlöslichen Salzen gehören beispielsweise die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze der aktiven Verbindungen. Sie lösen sich leicht in Wasser oder Salzlösung. Die Rezeptur kann zur Erhaltung des osmotischen Gleichgewichts weitere Agentien wie einen Zucker oder ein Protein enthalten.
  • Die 2',5'-Oligoadenylatanaloga können in Dosen von etwa 0,1 mg bis etwa 1 g Tieren oder Menschen verabreicht werden, die an einem der verschiedenen Zustände, die durch einen Defekt im 2-5A-Mechanismus gekennzeichnet sind, leiden oder im Verdacht oder in der Gefahr eines solchen Leidens stehen. Die tägliche Gesamtdosis kann beispielsweise zwischen 0,001 und 1 g schwanken, jedoch können auch höhere oder niedrigere Dosen verabreicht werden. Eine bevorzugte tägliche Dosis liegt zwischen etwa 0,01 g und 0,1 g des aktiven Bestandteils. Die Verbindungen können auf einem beliebigen von mehreren Wegen verabreicht werden, darunter, aber nicht beschränkt auf, intravenöse Injektion, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion und orale Gabe. Techniken zur Ausführung solcher Verabreichung sind Routine und in der Medizin bekannt. Die Verabreichung kann häufig wie mehrmals täglich oder selten wie wöchentlich sein. Zur intravenösen Injektion, vorzugsweise zur Behandlung von HIV, wird eine Lösung mit etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/ml des aktiven Bestandteils bevorzugt.
  • In Betracht kommt auch die topische Darreichung der 2',5- Oligoadenylatanaloga zur Behandlung von Hautschäden, die mit einem der durch einen Defekt im 2-5A-Mechanismus gekennzeichneten Krankheitszustand zusammenhängen. Man kann eine zur Bedeckung des Schadens oder des betroffenen Bereichs ausreichende Menge einer Zubereitung mit einer oder mehrerer der 2',5'-Oligoadenylatanaloga anwenden. Eine wirksame Konzentration des aktiven Agens liegt zwischen etwa 10&supmin;³ mol/l und etwa 10&supmin;&sup5; mol/l, wobei etwa 10&supmin;&sup4; mol/l bevorzugt ist.
  • Für Konjugate aus 2-5A-Analoga und Addukten, die das Eindringen in die Zelle fördern, geschieht die Dosierung aufgrund des Gewichts des Anteils des 2-5A-Analogons. Zusätzlich zur Verabreichung mit herkömmlichen Trägern können die 2-5A-Analoga auch durch eine Vielfalt von speziellen Verabreichungstechniken für Oligonukleotide oder Nukleinsäuren zugeführt werden, wie durch Einkapseln in unilamellare Liposomen oder in wiederhergestellte Sendaivirus-Hüllen oder durch Konjugation an Trägermoleküle wie Poly-L-lysin. Solche Verfahren sind in der Internationalen Anmeldung PCT/US85/03634 offenbart.
  • Außerdem können 2-5A-Derivate und Konjugate über mikroskopische Polystyrolträger von Nanometergröße verabreicht werden, die sich im Blutstrom lösen und den aktiven Wirkstoff freisetzen. Andere geeignete Träger sind in den Vorerwähnten Patentdokumenten besprochen.

Claims (35)

1. Verbindung der Formel
worin
n eine positive ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
m 0, 1, 2 oder 3 ist,
R Wasserstoff ist,
X aus C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylenoxy ausgewählt ist, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin X aus C&sub1;- bis C3- Alkylen und C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylenoxy ausgewählt ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus 3'- Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-2')-9-(2'- hydroxyethyl)adenin, dessen 5'-Mono-, Di- und Triphosphaten und deren pharmazeutisch geeigneten Salzen.
4. Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus 3'- Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-3')-9-(3'- hydroxypropyl)adenin, dessen 5'-Mono-, Di- und Triphosphaten und deren pharmazeutisch geeigneten Salzen.
5. Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus 3'- Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-4')-9-(4'- hydroxybutyl)adenin, dessen 5'-Mono-, Di- und Triphosphaten und deren pharmazeutisch geeigneten Salzen.
6. Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus 3'- Desoxyadenylyl-(2'-5')-3'-desoxyadenylyl-(2'-2')-9- [(2' -hydroxyethoxy)methyl]adenin, dessen 5'-Mono-, Di- und Triphosphaten und deren pharmazeutisch geeigneten Salzen.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 6 und einem pharmazeutischen Träger.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Medizin.
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Virusinfektion bei einem Säugetier.
10. Konjugat mit einer Verbindung der Formel
X NH&sub2; oder CH&sub2; ist,
m 0, 1, 2 oder 3 ist,
n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
jeder Rest R&sub1; unabhängig ausgewählt ist aus O&supmin;, S&supmin; Sulfat, Set C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyl und C&sub1;- bis C&sub8;-Alkoxy, jeder Rest R&sub2; unabhängig ausgewählt ist aus O&supmin;, S&supmin;, Sulfat, S&sub8;-, C&sub1;- bis C&sub5;-Alkyl und C&sub1;- bis C&sub8;-Alkoxy, jeder Rest R&sub3; unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amino und -OSi(CH&sub3;)&sub2;C(CH&sub3;)&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amino, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyl, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkyloxy, C&sub1;- bis C&sub8;-Alkylamino, Alkylcarbonyl, Alkylcarboxyl und Haloalkyl und C&sub1;- bis C&sub8;-Alkoxyamino, Alkoxycarbonyl, Alkoxycarboxyl und Haloalkoxy oder deren pharmazeutisch geeigneten Salzen,
ausgenommen authentisches 2',5'-Oligoadenylat und dessen Salze,
wobei diese Verbindung über einen Hydroxylsauerstoff in 2'- oder 3'-Stellung ihres 2'-terminalen Nucleotids kovalent an ein Addukt gebunden ist, welches ausgewählt ist aus (i) Vitaminen, die entsprechende Rezeptoren an der Zelloberfläche zur rezeptorvermittelten Endozytose haben, (ii) Addukten mit der Cholesterylgruppe und (iii) Acylgruppen der Formel -CO(CH&sub2;)XCH&sub3;, worin x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist
und wobei das Addukt zu einem verstärkten Eindringen der Verbindung in intakte Zellen führt.
11. Konjugat nach Anspruch 10, worin das Addukt Vitamin B&sub1;&sub2; ist.
12. Konjugat nach Anspruch 10, worin das Addukt Biotin ist.
13. Konjugat nach Anspruch 10, worin das Addukt Folsäure ist.
14. Konjugat nach Anspruch 10, worin das Addukt lipophil ist.
15. Konjugat nach Anspruch 10, worin
m 0, 1, 2 oder 3 ist,
n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
jeder der Reste R&sub3; und R&sub4; unabhängig aus Wasserstoff und Hydroxyl ausgewählt ist,
jeder der Reste R&sub2; unabhängig aus S und 0 ausgewählt ist,
R&sub5; Hydroxyl ist,
oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon, wobei die Verbindung über die 2'-Stellung ihres 2-terminalen Nucleotids kovalent an das Addukt gebunden ist.
16. Konjugat nach Anspruch 15, worin das Addukt ein Vitamin ist.
17. Konjugat nach Anspruch 16, worin das Vitamin aus der aus B&sub1;&sub2;, Folsäure und Biotin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
18. Konjugat nach Anspruch 15, worin das Addukt lipophil ist.
19. Konjugat nach Anspruch 15, worin das Addukt eine Cholesterylgruppe enthält.
20. Konjugat nach Anspruch 18, worin das Addukt eine Acylgruppe der Formel -CO(CH&sub2;)XCH&sub3; ist, wobei x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist.
21. Konjugat nach Anspruch 20, worin das Addukt Palmitoyl ist.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung der Formel
worin
n eine positive ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
m 0, 1, 2 oder 3 ist,
R unabhängig Wasserstoff oder Hydroxyl ist,
X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub6;- Alkylenoxy,
oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon, und einen pharmazeutischen Träger.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylenoxy und n 1 bis 3 ist.
24. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin X Ethylenoxy ist.
25. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, worin R Wasserstoff ist.
26. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, worin R Hydroxyl ist.
27. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, worin m Null ist.
28. Verbindung der Formel
worin
n eine positive ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
m 0, 1, 2, oder 3 ist,
R Hydroxyl ist,
X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylen und C&sub1;- ist C&sub6;- Alkylenoxy zur Verwendung in der Medizin.
29. Verbindung nach Anspruch 28, worin X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylenoxy und n 1 bis 3 ist.
30. Verbindung nach Anspruch 29, worin X Ethylenoxy ist.
31. Verbindung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, worin m Null ist.
32. Verwendung einer Verbindung der Formel
worin
n eine positive ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
m 0, 1, 2, oder 3 ist,
R Hydroxyl ist,
X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub6;-Alkylen und C&sub1;- ist C&sub6;- Alkylenoxy,
bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Virusinfektion bei einem Säugetier.
33. Verwendung nach Anspruch 32, worin X ausgewählt ist aus C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen und C&sub1;- bis C&sub3;-Alkenyloxy und n 1 bis 3 ist.
34. Verwendung nach Anspruch 33, worin X Alkyneloxy ist.
35. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 34, worin m Null ist.
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