DE69934953T2

DE69934953T2 - Impstoffe gegen Coccidiosis

Info

Publication number: DE69934953T2
Application number: DE69934953T
Authority: DE
Inventors: Theodorus Cornelis Schaap; Catharina Maria Kuijper; Arnoldus Nicolaas Vermeulen
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1998-10-07
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: EP0995799A2; BR9904488A; JP2000219635A; CY1106433T1; CA2285136C; US6203801B1; NZ500033A; TWI231300B; CA2285136A1; EP0995799B1; AU753959B2; PT995799E; DE69934953D1; HU9903398D0; EP1731611A3; AU5348099A; EP0995799A3; ES2279599T3; EP1731611A2; HUP9903398A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide von Eimeria, DNS-Fragmente, die diese Peptide kodieren, rekombinante DNS-Moleküle, die solche Fragmente umfassen, lebende rekombinante Träger, die solche Fragmente oder Moleküle umfassen, Wirtszellen die solche Fragmente umfassen, Moleküle oder Träger, Antikörper gegen dieses Polypeptid und Impfstoffe gegen Coccidiosis. Die Erfindung betrifft auch Verfahren für die Herstellung von solchen Antikörpern und Impfstoffen und Verfahren zur Erfassung von Eimeria-Parasiten und Antikörpern gegen Eimeria-Parasiten.
Parasitäre Protozoen, die zur Art Eimeria gehören, sind die auslösenden Agenzien von intestinaler Coccidiosis, einer Enteritis, die Vögel betrifft. Dies bewirkt signifikante wirtschaftliche Verluste, insbesondere für die Geflügel-Industrie. (Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung sind mit dem Begriff „Geflügel" alle Vögel gemeint, die als Quelle von Eiern oder Fleisch dienen. Sie umfassen unter anderem Hühner, Truthähne, Enten, Gänse, Perlhühner, Fasane, Tauben und Pfaue). Heutzutage wird Coccidiosis hauptsächlich durch den Einsatz von antibiotischen Medikamenten im Futter kontrolliert. Das rasche Auftreten von Medikament-resistenten Stämmen (Chapman H.D. Parasitology Today 9, 159–162 (1993)) und die prohibitiven Kosten der Entwicklung und Zulassung eines neuen Medikamentes haben zu einem erhöhten Interesse an der Entwicklung von einem alternativen Verfahren der Kontrolle geführt. Die Entwicklung von wirksamen Impfstoffen ist daher seit vielen Jahren wünschenswert. Es ist jedoch nur ein teilweiser Erfolg erhalten worden.
Derzeitig verfügbare Impf-Strategien bestehen aus kontrollierten Infektionen mit entweder virulenten oder lebendem gedämpften Parasiten (Shirley M.W. in: Proceedings of the Vlth. International Coccidiosis Conference (Herausgeber: J.R. Barta und M.A. Fernando) Moffitt Print Craft ltd., Guelph. Seiten 61–72 (1993)). Aus Gründen der Sicherheit und Kosten ist das wünschenswerteste Verfahren der Immuno-Prophylaxe Coccidiosis der Einsatz eines sogenannten Subunit-Impfstoffes. Obwohl viele Versuche gemacht worden sind, Hühner gegen Coccidiosis mit Anteilen von parasitärem Material zu immunisieren (Murray P.K., Ghogal B.S., Crane M.S.J. & MacDonald T.T. in: Research in Avian Coccidiosis. Proceedings of the Georgia Coccidiosis Conference (Herausgeber: L.R. McDougald, Joyner L.P. and P.L. Long) Athens, University of Georgia, Seiten 564–573 (1986), McKenzie M.E. & Long P.L. Poultry Science 65, 892–897 (1986)) oder rekombinante Eimeria Polypeptide (Danforth H.D., Augustine P.C., Ruff M.D., McCandliss R., Strausberg R.L. & Likel M. Poultry Science 68, 1643–1652 (1989), Jenkins M.C., Augustine P.C., Danforth H.. & Barta J.R. Infection and Immunity 59, 4042–4048 (1991)) ist nur ein begrenzter Schutz gegen eine Challenge-Infektion erreicht worden. Die parasitären Stufen, die für die Induktion von Schutzimmunität verantwortlich sind, sind allgemein als frühe asexuelle Entwicklungsstufen betrachtet worden (Jenkins et al. 1991). Ursprünglich sind Auswahlen von antigenen Kandidaten unter Einsatz von Antikörpern von immunen Hühnern durchgeführt worden, aber angesichts der fundamentalen Rolle der Zellenvermittelten Antworten in der Schutzimmunität (Übersicht in Lillehoj H.S. & Trout J.M. Avian Pathology 22, 3–31 (1993), Rose M. E. in: Poultry Immunology (Herausgeber: T.F. Davison, T.R. Morris und L.N. Payne), Carfax Publishing Company, Oxfordshire, U.K. Seiten 265–299 (1996)), ist die Aufmerksamkeit, neben B-Zellen induzierende Antigene, auf Screening Antigene für ihre Fähigkeit der Stimulierung von spezifischen T-Zellen Antworten fokussiert worden (Dunn P.P-J., Billington K., Bumstead J.M. & Tomley F.M. Molecular and Biochemical Parasitology 70, 211–215 (1995)).
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Polypeptide zu liefern, die fähig sind, einen Schutz gegen die pathogene Wirkung von einer Eimeria-Infektion in Geflügel zu induzieren.
Es ist erstaunlicherweise gefunden worden, dass 6 verschiedene Polypeptide spezifisch identifiziert und isoliert werden konnten, insbesondere frei von anderen Eimeria-Polypeptiden, aus einer hydrophilen Fraktion von Eimeria-Polypeptiden, wobei jedes dieser verschiedenen Polypeptide fähig ist, eine Immun-Antwort gegen Eimeria-Parasiten zu induzieren. Die Erfinder haben dabei gefunden, dass diese Polypeptide eingesetzt werden können, entweder alleine oder in Kombination mit jeweils einem anderen, um einen Impfstoff zu liefern, der einen signifikanten Schutzgrad für Vögel (insbesondere Geflügel) hat. Beispielsweise konnte ein Schutz gegen die Ausbildung von zäkalen Läsionen bei Vögeln erreicht werden, die mit solch einem Impfstoff immunisiert worden sind, wenn sie einem nachfolgenden Challenge mit Eimeria-Parasiten ausgesetzt worden sind.
Ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf ein hydrophiles Polypeptid von Eimeria, welches in seiner vollen Länge ein Molekulargewicht von 25 kD hat und eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% Homologie mit der Aminosäure-Sequenz.
MPFELPPLPYPMDALEPYISKETLEYHYGKHHAAYVNNLNRLVEGKPEASKSLEEIIKT SSGSVLNNAGQAWNHTFYWKSMRPASAGGPPGAPGGGPPGAPGAPLREELESAFG GVEKFREAFAAAAAAHFGSGWAWLCFCKKSRSLFLLQTHDGATPFRDNPNCAPLLTC DLWEHAYYIDRRNDRKSYLDAWWSWNWDFANENLKKAMQGSD
teilt, (welche nachfolgend als SEQ. ID. Nr. 1 bezeichnet wird) und immunogene Fragmente dieses Polypeptides, welche fähig sind, eine Immunantwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren. Das Polypeptid ist in funktioneller Weise auf eine Superoxid-Dismutase (SOD) bezogen, welche in Nicht-Eimeria-Parasiten gefunden worden ist, und ist daher als SOD-ähnlich charakterisiert worden.
Auch bezieht sich dieses Ausführungsbeispiel auf ein hydrophiles Polypeptid von Eimeria, welches ein Peroxidoxin-ähnliches Polypeptid ist, welches in seiner vollen Länge ein Molekulargewicht von 22 kD hat und eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die mindestens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz LGPLALPLLADVR aufweist (welche weiter als SEQ ID Nr. 2 bezeichnet wird) und immunogene Fragmente dieses Polypeptides, die fähig sind, eine Immunantwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren.
Ein hydrophiles Polypeptid von Eimeria, welches ein Peroxidoxinähnliches Polypeptid ist, welches in seiner vollen Länge ein Molekulargewicht von 25 kD hat und eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz
MPLNLGDSFPDFQAEALGAEHFRLHEYLGDSWGVMFSHPNDFTPVCTTELAEAVKLQ DSFTKKNCKLVGFSCNDLQSHREWAKDIMAYAGRSGNLPFPLVCDPNRELAASLGIM DPAEKDKKGLPLTCRCVFFISPEKKLAASILYPATTGRNFAEILRVLDSLQLTAKFPVAT PVDWTAGAKCCWPNLAAEEAQRLLPKGHEALQLPSGKPYLRLTPDPRG
teilt (welche nachfolgend als SEQ ID Nr. 3 bezeichnet wird), sowohl als auch immunogene Fragmente des Polypeptides, welche fähig sind, eine Immun-Antwort gegen dieses Polypeptid zu induzieren, sind auch Teil dieses Ausführungsbeispiels.
Ebenfalls Teil dieses Ausführungsbeispiels ist ein hydrophiles Polypeptid von Eimeria, welches in seiner vollen Länge ein Molekulargewicht von 22 kD aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens eine 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz MSPSPAGVAEYLASL teilt (welche nachfolgend als SEQ ID Nr. 4 bezeichnet wird), oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptides, welches fähig ist, eine Immun-Antwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren.
Dieses Ausführungsbeispiel umfasst auch ein Triosephosphat Isomerase-ähnliches Polypeptid von Eimeria, welches in seiner vollen Länge ein Molekulargewicht von 28 kD hat und eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine mindestens 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz NHAEFDPSQTEVWFP teilt (welche nachfolgend als SEQ ID Nr. 5 bezeichnet wird) oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptides, welches fähig ist, eine Immun-Antwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren.
Schliesslich bezieht sich dieses Ausführungsbeispiel auf ein hydrophiles Polypeptid von Eimeria, welches in seiner vollen Länge ein Molekular-Gewicht von 28 kD aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine mindestens 70% Homologie mit der Aminosäuresequenz VSAFTPSVGCVFAGMPADFR teilt (welche nachfolgend als SEQ ID Nr. 6 bezeichnet wird) oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptides, welches fähig ist, eine Immun-Antwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren.
Obwohl verschiedene Gruppen von Eimeria abgeleitete Proteine offenbart haben, die, zufälligerweise, Molekularmassen innerhalb des 26–30 kDa ± 5kDa Bereiches haben, sind diese Proteine zu den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung ziemlich unterschiedlich.
Beispielsweise ist in EP-A-0 231 537 (Newman et al) ein 25 kDa Oberflächen-Protein offenbart. Unter den reduzierenden Bedingun gen teilt sich dies auf, um zwei Bänder auf SDS-PAGE von ungefähr 17 und ungefähr 8 kDa zu bilden, wohingegen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung relative Molekularmassen von mindesents 21 kDa haben, wenn sie unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt werden.
Bouvier et al (J. Biol. Chem. (1985) 260(29); Seiten 15504-15509) lehrt, dass der Einsatz von Triton X114 extraktionsamphiphilen Proteinen (Membran-assoziiert) nur in der detergenten Phase und nicht in der hydrophilen Phase erfasst werden können.
In der US-A-4,710,377 (Schenkel et al) sind Antigene mit Molekular-Massen von ungefähr 28 und 26 kDa offenbart. Jedoch sind diese amphiphilen Aussen-Membran Komponenten und können daher nicht in der hydrophilen Phase eines Triton X-114 Extraktes vorliegen, welcher eingesetzt werden könnte, um die Polypeptide der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Eimeria-Proteine, die amphiphil sind, sind auch in WO92/04461 (Jacobson et al), EP-A-0 324 648 (Lieberator et al), AU-A-28542/49 (Turner et al), EP-A-0 344 808 (Alternburger et al) und EP-A-0 167 443 (Murray et al) offenbart.
Es ist wohlverstanden, dass für die besonderen hydrophilen Polypeptide, die hier umfasst sind, natürliche Variationen zwischen einzelnen Eimeria-Parasiten oder Stämmen existieren können. Diese Änderungen können in einem Aminosäure-Unterschied oder in mehreren Aminosäure-Unterschieden in der Gesamt-Sequenz durch Löschungen, Substitutionen, Einfügungen, Inversionen und Zufügungen von einer oder mehreren Aminosäuren in der besagten Sequenz existieren. Aminosäure-Ersetzungen, die nicht notwendigerweise biologische und immunologische Aktivitäten ändern, sind beispielsweise durch Neurath et al in „The Proteins", Academic Press New York (1979), beschrieben. Aminosäure-Ersetzungen zwischen zueinander gehörenden Aminosäuren oder Ersetzungen, die in der Evolution häufig aufgetreten sind, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, lie/Val (siehe Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Andere Aminosäure-Substitutionen umfassen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val und Ala/Glu. Basierend auf dieser Information haben Lipman und Pearson ein Verfahren zum schnellen und sensitiven Protein-Vergleich (Science, 227, 1435–1441, 1985) entwickelt und zum Bestimmen der funktionalen Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen. Solche Aminosäure-Ersetzungen der beispielhaften Ausführungsbeispiele dieser Erfindung sind innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, so lange die sich ergebenden Polypeptide ihre Immuno-Reaktivität behalten. Daher sind natürliche Variationen, die nicht wesentlich die Immunogenizität des Polypeptides im Vergleich zum Wildtyp-Polypeptid beeinflussen, als immunologisch äquivalente Varianten der Polypeptide gemäss der Erfindung anzusehen.
Daher wird ein Polypeptid, das eine Variante der Aminosäure-Sequenz hat, welches mindestens eine 70% Homologie zu jeweils der Aminosäuresequenz

hat, wie in SEQ ID Nr. 1–6 dargestellt, wird auch als unter den Schutz der Erfindung fallend angesehen.
Der Grad der Homologie wird durch die folgende Formel definiert: H = m/n × 100%, wobei H der Prozentsatz der Homologie ist, m die Anzahl der gleichen Aminosäuren in der Sequenz und n die Gesamtzahl der Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz ABCDEEGHIJK, im Vergleich zu ABCDEFGHIJK, würde daher eine 10/11 × 100% = 90.9% Homologie aufweisen. Die Aminosäure-Sequenz ABCDEGHIJK würde auch eine 10/11 × 100% = 90.9 % Homologie aufweisen: es würde gerade eine Lücke an dem Ort bestehen, wo eine Sequenz das F und das andere dies nicht hat.
Wenn ein Polypeptid für Impfzwecke oder zum Aufziehen von Antikörpern benutzt wird, ist es jedoch nicht notwendig, das ganze Polypeptid zu nutzen. Es ist auch möglich, ein Fragment dieses Polypeptides einzusetzen, welches fähig ist, eine Immun-Antwort gegen das Polypeptid zu induzieren, ein so genanntes immunogenes Fragment.
Ein „immunogenes Fragment" wird als ein Fragment des Voll-Längen Proteins angesehen, welches immer noch seine Fähigkeit beibehalten hat, eine Immun-Antwort in dem Wirt zu induzieren. Zu diesem Zeitpunkt bestehen eine Vielzahl von Techniken, um in einfacher Weise antigene Fragmente (Determinanten) zu bestimmen. Das Verfahren, welches von Geysen et al (Patentanmeldung WO 84/03564, Patentanmeldung WO 86/06487, US-Patent Nr. 4,833,092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998–4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259–274 (1987)) beschrieben worden ist, ist das so genannte PEPSCAN-Verfahren, eine einfach durchzuführende, schnelle und wohl etablierte Vorgehensweise für die Erfassung von Epitopen; die immunologisch wesentlichen Bereiche des Proteins, wird weltweit eingesetzt und ist somit dem Fachmann wohl bekannt. Dieses (empirische) Verfahren ist im Wesentlichen geeignet für die Erfassung von B-Zellen Epitopen. Auch sind, wenn die Sequenz des Gens, welches jegliches Protein kodiert, gegeben ist, Computer-Algorithmen fähig, spezifische Polypeptid-Fragmente als die immunologisch wesentlichen Epitopen auf der Basis ihrer sequenziellen und/oder strukturellen Homologie mit bereits bekannten Epitopen zu benennen. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination der Hydrophilizitäts-Kriterien gemäss Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Si. 78: 3824–3828 (1981), und den sekundären Struktur-Aspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymology 47: 45–148 (1987) und US-Patent 4,554,101).
T-Zellen Epitopen können in gleicher Weise aus der Sequenz durch Computer mit Hilfe von Berzofsky's Amphiphilizitäts-Kriterium vorhergesagt werden (Science 235, 1059–1062 (1987) und US-Patentanmeldung NTIS US 07/005,885). Ein zusammengefasster Überblick kann gefunden werden in: Shan Lu zu allgemeinen Prinzipien: Tibtech 9: 238–242 (1991), Good et al zu Malaria Epitopen; Science 235: 1059–1062 (1987), Lu für eine Übersicht; Vaccine 10: 3–7 (1992), Berzofsky für HIV-Eptiopen; The FASEB Journal 5: 2412–2418 (1991).
Daher bezieht sich das Ausführungsbeispiel der Erfindung nicht nur auf Polypeptide gemäss der Erfindung, sondern auch auf Fragmente von solchen Polypeptiden, die immer noch fähig sind, eine Immun-Antwort gegen Polypeptide (so genannte immunogene Fragmente) zu erzeugen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein hydrophiles Polypeptid vorgelegt, welches eine Aminosäure-Sequenz umfasst, welche mindestens 80% homolog zu der in einer der SEQ ID Nr. 1–6 gegebenen Sequenzen ist.
Bei einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel weist die Aminosäure-Sequenz mindestens eine 90% Homologie zu der Sequenz auf, die in einer der SEQ ID Nr. 1–6 gegeben ist.
In einer nochmals bevorzugteren Form dieses Ausführungsbeispiels ist die Aminosäuresequenz die Sequenz, die in einer der SEQ ID Nr. 1–6 angegeben ist.
Vorzugsweise ist das Polypeptid gemäss der Erfindung aus Eimeria tenella isoliert.
Ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf DNS-Fragmente, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon kodieren. Da für das erste Mal die teilweise Aminosäure-Sequenz der Polypeptide gemäss der Erfindung nun vorgelegt wird, kann der Fachmann in einfacher Weise (unter Einsatz der genetischen Code-Tabelle, die in Biochemie-Textbüchern wie beispielsweise in Lubert Stryer's Biochemistry, Herausgeber Freeman und Company, New York) eine gemischte DNS-Sonde herstellen und das Gen, welches das Polypeptid gemäss der Erfindung kodiert, aus Eimeria auswählen.
Es können kleinere Variationen in der Gesamt-Nukleotid-Sequenz der DNS bestehen, die die Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung in den jeweiligen Eimeria-Stämmen kodieren. Diese Variationen können auch keinen Effekt auf die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids aufweisen, im Falle dass die Modifikation dergestalt ist, dass die Varianten-Tripletcodes für dieselbe Aminosäure kodieren. Dieser Veränderungsgrund basiert auf dem Phänomen der Degenerierung des genetischen Codes. Es geschieht beispielsweise, dass aufgrund natürlicher Mutation das G im Triplet CTG, welches für die Aminosäure Leucin kodiert, durch ein C ersetzt wird, welches auch für Leucin kodiert, oder dass das A in GAA, welches für Glutaminsäure kodiert, durch ein G ersetzt wird, welches Triplet immer noch Glutaminsäure kodiert. Solch eine Mutation ist eine stille Mutation, d.h. sie zeigt sich nicht auf dem Anminosäure-Niveau. Solche stille Modifikationen treten in der Natur sehr häufig auf, wenn beispielsweise zwei unterschiedliche Feld-Isolate von Eimeria verglichen werden. Dieses Phänomen findet sich für alle Aminosäuren, ausser für Met und Trp. Somit ist es klar, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch eine Vielzahl von anderen Sequenzen kodiert werden können, die alle das gleiche identische Polypeptid kodieren. Es ist daher eigentlich nicht notwendig, auszusagen, dass jegliche Nukleinsäure-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens zu 70% homolog zu der Aminosäuresequenz aus der Darstellung einer der SEQ ID Nrn. 1–6 gemäss der vorliegenden Erfindung ist, oder ein immunogenes Fragment davon, auch als unter den Schutzbereich der Erfindung fallend angesehen wird.
Nur zu dem Zweck, um ein Beispiel anzugeben, werden alle möglichen Sonden zur Erfassung des Gens, welches das 25kD SODähnliche hydrophile Eimeria-Polypeptid kodiert, die Aminosäure-Sequenzen YLDAWWSVVNWDFANENLK (Teil der SEQ ID Nr. 1) umfassend, in den SEQ ID Nrn. 7–38 angegeben. In diesen SEQ ID's sind alle möglichen Nukleinsäure-Sequenzen aufgelistet, die für die Aminosäure-Sequenz VNWDFA der SEQ ID Nr. 1 kodieren. Von den 32 Sonden hat eine per Definition eine vollständige Übereinstimmung mit dem DNS-Fragment, welches eine Nukleinsäure-Sequenz umfasst, welche ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Wie beispielsweise in Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6) beschrieben, wird eine Hybridisierung der Sonden zu DNS bei 12°C unter Tm durchgeführt, wobei Tm = 69.3 + 0.41 × (G + C)% – 650/L ist (L = Länge der Sonde). Dies bedeutet, dass unter strengen Bedingungen (eine Hybridisierungs-Temperatur zwischen 38 und 48°C), die Gene, die ein Polypeptid kodieren, welches eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, immer selektiv und frei von falschen Hybridisierungs-Signalen unter Einsatz der Sonden von SEQ ID Nrn. 7–38 ausgewählt werden kann. Solche gemischten Sonden können in sehr einfacher Weise unter Einsatz von Standard-Prozeduren hergestellt werden, beispielsweise durch eine der vielen kommerziell erhältlichen automatischen DNS-Synthesizern.
Aus den oben angegebenen Gründen kann insbesondere eine gemischte DNS-Sonde, die die gesamte Aminosäuresequenz von einer der Aminosäuresequenzen kodiert, die in den SEQ ID Nrn. 1–6 angegeben sind, eingesetzt werden, um die Gene zu erfassen, welche die Polypeptide gemäss der Erfindung in Eimeria kodieren.
Die Identifizierung und das Klonen der Gene, die die Polypeptide gemäss der Erfindung in Eimeria kodieren, nicht nur für Tenella, aber auch für andere Arten, kann in einfacher Weise wie folgt durchgeführt werden: Erststrang cDNS kann mit sowohl einer gemischten Sonde für eines der Polypeptide gemäss der Erfindung und einer Oligo-dT-Sonde hybridisiert werden. Das DNS-Fragment zwischen beiden Sonden kann dann in einer Standard-PCR-Reaktion vervielfacht werden (PCR-Techniken sind beispielsweise in Maniatios/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-087969-309-6)) beschrieben worden. Das PCR-Fragment kann dann in ein Plasmid geklont werden und beispielsweise eingesetzt werden zur Sequenzierung oder zur Erfassung des Voll-Längen-Gens in dem Genom von jeglicher Eimeria-Art.
Dieses Verfahren gestattet eine einfache und geradlinige Auswahl und Sequenzierung der Gene, die die Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung kodieren, nicht nur von Eimeria Tenella, sondern auch von Eimeria-Arten wie Necatrix, Brunetti, Mitis oder Acervulina.
So bezieht sich in einem anderen Ausführungsbeispiel die Erfindung auf ein DNS-Fragment, welches eine Nukleotid-Sequenz umfasst, die ein Polypeptid gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon kodiert.
Das Gemischtsondenverfahren, welches oben für die Feststellung der DNS beschrieben worden ist, welche die verschiedenen Polypeptide gemäss der Erfindung kodieren, ist beispielsweise eingesetzt worden um DNS zu erhalten, die 25 kD SOD-ähnliche Polypeptide gemäss der Erfindung in Eimeria Tenella kodieren. Unter Einsatz des in den Beispielen beschriebenen Verfahrens konnte ein DNS-Fragment, welches praktisch das gesamte 25 kD SOD-ähnliche Polypeptid von Eimeria Tenella kodiert, isoliert, geklont und sequenziert werden. Die Sequenz dieses DNS-Fragmentes ist festgestellt worden als
und wird nachfolgend als SEQ ID Nr. 39 bezeichnet werden.
Daher bezieht sich eine bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels auf ein DNS-Fragment, welches eine Nukleotid-Sequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 39 dargestellt ist.
Das Gemischt-Sonden-Verfahren ist auch eingesetzt worden, um die DNS zu erhalten, die das 25 kD Peroxidoxin-ähnliche Polypeptid gemäss der Erfindung in Eimeria Tenella codiert. Unter Einsatz des in den Beispielen beschriebenen Verfahrens konnte ein DNS-Fragment, welches einen grossen Teil des gesamten 25 kD Peroxidoxin-ähnlichen Polypeptids von Eimeria Tenella kodiert, isoliert, geklont und sequenziert werden. Zusätzlich ist die Genom-Sequenz, d.h. die Sequenz des Teils des Gens, wie es in dem Eimeria Tenella Genom gefunden worden ist, als
TTCCCGGATTTTCAGGCGGAGGCGCTGGGCGCCGAGCACTTCCGCTTGCACGAG TACTTGGGGGACAGCTGGGGAGTGATGTTCAGgtaagattggcgtaaaaaagccccatttaatcg catttttaattctgtagactctgtgtcgactgctgagcacgaggggggggcctgctgcacgggagagccttgtctcgcgctc aactctgggtttctggcgttgcttgcagCCACCCGAACGACTTCACCCCCGTCTGCACCACCGA.
Gefunden worden. Diese Sequenz wird nachfolgend als SEQ ID Nr. 40 bezeichnet werden.
Grossbuchstaben weisen darauf hin, dass die Sequenz auch in mRNS gefunden wird, Kleinbuchstaben weisen auf das Intron in dem Gen hin.
Daher bezieht sich eine weitere bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels auf ein DNS-Fragment, welches eine Nukleotid-Sequenz umfasst, wie sie in der SEQ Nr. 40 dargestellt ist.
Die cDNS, die die mRNS für dieses Polypeptid kodiert, ist auch unter Einsatz des Gemischtsondenverfahrens festgestellt worden. Diese cDNS ist sequenziert worden und dabei ist die folgende Sequenz festgestellt worden:
Diese Sequenz wird nachfolgend als SEQ ID Nr. 41 bezeichnet.
Somit bezieht sich eine weitere nochmals bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels auf ein DNS-Fragment, welches eine Nukleotid-Sequenz umfasst, wie sie in der SEQ ID Nr. 41 dargestellt ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus Eimeria-Parasiten unter Einsatz jeglicher Standard-Isolationsverfahren isoliert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, um Eimeria-Polypeptide zu isolieren. Die Polypeptide sind beispielsweise wie in den Beispielen beschrieben erhältlich. Diese können nachfolgend eingesetzt werden beispielsweise zur Herstellung eines Impfstoffes oder zur Aufzucht von Antikörpern.
Alternativ kann ein DNS-Fragment gemäss der Erfindung in einem in vitro Exprimierungs-System exprimiert werden und das Exprimierungs-Produkt, das Polypeptid gemäss der Erfindung, kann beispielsweise für einen Impfstoff oder Antikörper-Präparationen eingesetzt werden.
Ein wesentliches Erfordernis für die Exprimierung des DNS-Fragmentes ist ein adäquater Promoter, der in wirksamer Weise an das Fragment angekoppelt ist. Es ist für den Fachmann klar ersichtlich, dass die Wahl eines Promoters sich auf jeglichen eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promoter erstrecken kann, der fähig ist, die Gen-Transkription in Zellen zu steuern, die als Wirtszellen für die Protein-Exprimierung eingesetzt werden.
Daher bezieht sich eine bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels auf rekombinante DNS-Fragmente, d.h. DNS-Fragmente gemäss der Erfindung, an welche regulierende Sequenzen, welche die Exprimierung dieser Nukleinsäure-Sequenz ermöglichen, durch das Mittel von beispielsweise standardisierten molekularbiologischen Techniken hinzugefügt worden sind. (Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6))
Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, umfassen nützliche Exprimierungs-Steuer-Sequenzen, die eingesetzt werden können, den Trp Promoter und Operator (Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); den lac Promoter und Operator (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); den äusseren Membran-Protein-Promoter (Nakamura K. und Inouge, M. EMBO J., 1, 771–775, 1982); die bakteriophagen Lambda-Promoter und -Operatoren (Remaut, E. et al., Nucl, Acids Res., 11, 4677–4688, 1983; den α-Amylase (B. subtilis) Promoter und Operator, Terminierungs-Sequenzen und andere Exprimierungs-Verbesserungen und Steuer-Sequenzen, die mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind.
Wenn die Wirtszelle Hefe ist, umfassen nützliche Exprimierungs-Steuer-Sequenzen beispielsweise den „α-Mating-Faktor" (Sekretions-Signal-Sequenz). Für Insekten-Zellen können Polyhedrin oder p10 Promoter der Baculoviren eingesetzt werden (Smith, G.E. et al., Mol, Cell, Biol, 3, 2156–65, 1983).
Bakterielle, Hefe, Pilz- und Insekten- Zellexprimierungs-Systeme sind sehr häufig eingesetzte Systeme. Solche Systeme sind im Stand der Technik wohl bekannt und in einfacher Weise verfügbar, beispielsweise kommerziell durch Clontech Laboratories, In.c 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303–4607, USA.
Daher bezieht sich die Erfindung in einer bevorzugten Form dieses Ausführungsbeispiels auf ein rekombinantes DNS-Molekül, welches das Polypeptid-Fragment unter der Steuerung von Regulierungs-Sequenzen codiert, die die Exprimierung des Proteins ermitteln, welche durch die besagte Nukleinsäure-Sequenz gesteuert wird.
Ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf lebende rekombinante Träger (LRC's),umfassend ein DNS-Fragment oder ein rekombinantes DNS-Molekül gemäss der Erfindung, welches ein Polypeptid gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon codiert. Solche lebende rekombinante Träger sind Bakterien und Viren. Diese LRC Mikro-Organismen sind Mikro-Organismen, in denen zusätzliche genetische Information eingeklont worden ist. Tiere, die mit solchen LRC's infiziert worden sind, werden eine immunogene Antwort hierfür nicht nur gegen die Immunogene des LRC's erzeugen, sondern auch gegen die immunogenen Teile des Polypeptids oder der Polypeptide, für welche der genetische Code zusätzlich in das LRC geklont worden ist, beispielsweise das Polypeptid gemäss der vorliegenden Erfindung.
Als ein Beispiel für bakterielle LRC's sind gedämpfte Salmonella Stränge, die dem Stand der Technik bekannt sind, in attraktiver Weise einsetzbar. Auch können LRC-Viren eingesetzt werden als Transportweg für das DNS-Fragment in eine Ziel-Zelle.
Lebende rekombinante Träger-Viren sind auch die so genannten Vektor-Viren. Der Ort der Integration der DNS, die das Polypeptid gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon codiert, kann ein Ort im viralen Gen sein, der nicht wesentlich für den Virus ist oder an einem Ort in dem Intergen-Bereich. Viren, die häufig als Vektoren eingesetzt worden sind, sind Vaccinia-Viren (Panicali et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927 (1982), Herpes-Viren (E-P.A. 0473210A2), und Retroviren (Valerio, D. et al; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. und Pluznik, D.H. (Herausgeber), Experimental Haematology today - 1988. Sprinter Verlag, New York: Seiten 92–99 (1989)).
Insbesondere der Geflügelpocken-Virus, ein Vaccinia Virus, der Geflügel infiziert, und Herpesviren von Truthähnen (HVT) sind sehr effektive lebende rekombinante Trägerviren zum Transportieren von DNS, welches ein Polypeptid der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon codiert.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein DNS-Fragment gemäss der Erfindung enthält, eine Wirtszelle, die ein rekombinantes DNS-Molekül enthält, welches ein DNS-Fragment gemäss der Erfindung unter der Steuerung von Regulierungssequenzen enthält, welches die Exprimierung des Proteins ermöglicht, welches durch die besagte Nukleinsäure-Sequenz codiert wird, und eine Wirtszelle, die einen lebenden rekombinanten Träger-Mikro-Organismus (LCR) enthält, der ein DNS-Fragment gemäss der Erfindung enthält.
Eine Wirtszelle kann eine Zelle mit bakteriellem Ursprung sein, beispielsweise Escherichia Coli, Bacillus Subtilus und Lactobacillus-Arten, in Kombination mit Bakterien-basierten Vektoren wie pBR322, oder bakterielle Expressions-Vektoren wie pGEX, oder Bakteriophagen. Die Wirtszelle kann auch von eukaryotischem Ursprung sein: Hefe-Zellen in Kombination mit Hefe-spezifischen Vektor-Molekülen oder Insekten-Zellen (Luckow et al; Biotechnology 6: 47–55 (1988)) in Kombination mit Vektoren oder rekombinanten Baculoviren, Pflanzen-Zellen in Kombination mit beispielsweise Ti-Plasmid basierten Vektoren oder pflanzlichen Mineral-Vektoren (Barton, K.A. et al; Cell 32, 1033 (1983)).
Die Technik der in vivo homologen Rekombination, die im Stand der Technik wohl bekannt ist, kann eingesetzt werden, um eine rekombinante Nukleinsäure-Sequenz in das Genom eines Bakteriums, eines Parasiten oder eines Virus nach Wahl einzuführen, welches fähig ist, die Exprimierung des eingeschleusten Gens in dem Wirt-Tier zu exponieren.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf Impfstoffe, die fähig sind, die Vögel gegen pathogene Effekte einer Eimeria-Infektion zu schützen. Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung können beispielsweise durch einfaches Zumischen eines Polypeptids gemäss der Erfindung oder eines immunogenen Fragmentes davon und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers hergestellt werden. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger wird verstanden als eine Verbindung, die nicht in gegensätzlicher Weise die Gesundheit des zu impfenden Tieres beeinträchtigt, zumindest nicht in dem Umfang, dass der nachteilige Effekt schlimmer ist als die Wirkungen, die sich aufgrund der Krankheit einstellen, wenn das Tier nicht geimpft ist. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger kann beispielsweise steriles Wasser oder eine sterile physiologische Salzlösung sein. In einer komplexeren Form kann der Träger beispielsweise ein Puffer sein.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung kann in einer bevorzugten Darstellung auch ein Adjuvant enthalten. Adjuvantien umfassen im Allgemeinen Substanzen, welche die Immunantwort des Wirts in einer nicht spezifischen Weise verstärken. Eine Anzahl von verschiedenen Adjuvantien ist im Stand der Technik bekannt. Beispiele von Adjuvantien sind Freunds Complete and Incomplete Adjuvant, Vitamin E, nicht-ionische Block-Polymere und Polyamine wie Dextransulfat, Carbopol und Pyran. Auch sehr geeignet sind oberflächenaktive Substanzen wie Span, Tween, Hexadecylamin, Lysolecitin, Methoxyhexadecylglycerol und Saponine wie Quill A^(R). Ein bevorzugtes Adjuvant ist Quill A. Dies kann bei einem Niveau von ungefähr 150 μg/Dosis (zum Beispiel) verabreicht werden. Weiterhin werden häufig Peptide wie Muramyldipeptide, Dimethylglycin, Tuftsin eingesetzt. Neben diesen Adjuvantien sind immun-stimulierende Komplexe (ISCOMS), Mineralöl, beispielsweise Bayol^(R) oder Markol^(R), pflanzliche Öle oder Emulsionen davon und Diluvac^(R) Forte in vorteilhafter Weise eingesetzt worden.
Der Impfstoff kann auch ein so genanntes "Vehikel" umfassen. Ein Vehikel ist eine Verbindung, an dem das Polypeptid anhaftet, ohne mit ihm kovalent verbunden zu sein. Häufig eingesetzte Vehikelverbindungen sind beispielsweise Aluminium-Hydroxid, -phosphat, -sulfat, oder -oxid, Quarz, Kaolin und Bentonit. Eine spezielle Form eines solchen Vehikels, in dem das Antigen teilweise in das Vehikel eingelagert ist, ist das so genannte ISCOM ( EP 109 942 , EP 180 564 , EP 242 380 ). Ein bevorzugtes Adjuvant ist Quill A. Dieses kann mit einem Niveau von ungefähr 150 μg/Dosis (beispielsweise) verabreicht werden.
Häufig wird der Impfstoff mit Stabilisierern gemischt, beispielsweise um die gegenüber Zersetzung empfindlichen Polypeptide vor einer solchen Zersetzung zu schützen, um die Lagerzeit des Impfstoffs zu verbessern, oder um die Gefriertrocknungs-Effizienz zu erhöhen. Geeignete Stabilisierer sind u.a. SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), entrahmte Milch, Gelatine, bovines Serumalbumin, Kohlenhydrate, beispielsweise Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glucose, Proteine wie Albumin oder Kasein oder Zersetzungsprodukte davon, und Puffer wie Alkalimetallphosphate.
Gefriertrocknung ist ein wirksames Verfahren zur Konservierung. Gefriergetrocknetes Material kann für viele Jahre gelagert und einsatzfähig gehalten werden. Lagertemperaturen für gefriergetrocknetes Material kann weit über 0°C sein, ohne dass es für das Material schädlich wäre.
Gefriertrocknung kann gemäss allen wohlbekannten standardisierten Gefriertrocknungsverfahren durchgeführt werden.
Daher ist der Impfstoff in einem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel in einer gefriergetrockneten Form.
Zusätzlich kann der Impfstoff in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel suspensiert werden. Solch ein Verdünnungsmittel kann beispielsweise einfach steriles Wasser oder eine psychologische Salzlösung sein.
Es ist selbstverständlich, dass andere Wege der Hinzufügung von Adjuvantien, des Hinzufügen von Vehikel-Verbindungen oder Verdünnern zur Emulsifikation oder Stabilisierung eines Polypeptids auch von der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann in einem konventionellen aktiven Imunisierungsschema verabreicht werden: einfache oder wiederholte Verabreichung in einer Art und Weise, die mit der Dosis-Formulierung kompatibel ist, und in solch einer Menge, dass sie prophylaktisch wirksam ist, d.h. die Menge an immunisierendem Antigen oder rekombinantem Mikroorganismus, der fähig ist, das besagte Antigen zu exprimieren, der die Immunität in Vögeln (insbesondere Geflügel) gegen einen Challenge durch virulente Eimeria-Parasiten induzieren wird. Die Immunität wird definiert als die Induktion eines signifikanten Niveaus von Schutz in einer Vogelpopulation nach der Impfung im Vergleich zu einer nicht geimpften Gruppe.
Ein Impfstoff, umfassend das Polypeptid gemäss der Erfindung, kann die Anzahl von Oozysten reduzieren, die von den infizierten Tieren ausgeschieden werden. Normalerweise werden die ausgeschiedenen Oozysten andere Tiere des Schwarms infizieren. Eine Abnahme der Anzahl der Oozysten, die ausgeschieden werden, wird dann auch zu einer Abnahme der Anzahl von Tieren führen, die nachfolgend infiziert werden und auch zu einer Verminderung der Anzahl von ausgeschiedenen Oozysten, was zu einer geringeren infektiösen Last führen wird.
Weiterhin, ohne eine Wirkung auf den Parasiten selbst zu haben, kann der Impfstoff das Auftreten der Krankheit vermindern. Dies gilt insbesondere, wenn die Symptome der Krankheit durch Produkte bewirkt werden, die von den Parasiten ausgeschieden werden. Impfstoffe, die direkt gegen solche Produkte wirken, erleichtern die Symptome, ohne den Parasiten anzugreifen.
In jedem Falle ist es bevorzugt, dass ein Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung fähig ist, die Anzahl von Zäsalläsionen in einem Vogel zu vermindern, wenn er nachfolgend mit einer Eimeria-Infektion gechallengt wird.
Für lebende virale Vector-Impfstoffe kann die Dosisrate je Huhn zwischen 10³ und 10⁸ pBE liegen (aber selbst < 1000 pBE kann beispielsweise für HVT ausreichend sein). Ein typischer Subunit-Impfstoff gemäss der Erfindung umfasst 0.1 bis 100 μg des Polypeptids (oder eine Variante oder Fragment davon) gemäss der Erfindung. Vorzugsweise werden mindestens 5 μg vorhanden sein. Solche Impfstoffe können intradermal, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, oral oder intranasal verabreicht werden.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann auch in effizienter Weise mit anderen antigenen Komponenten derselben und/oder anderen Eimeria-Arten gemischt werden, und/oder mit zusätzlichen Immunogenen, die von einem Geflügel-pathogenen Virus oder Mikroorganismus und/oder Nucleinsäure-Sequenzen gemäss diesen Immunogenen abgeleitet worden sind.
Solch ein Kombinations-Impfstoff kann die parasitäre Last in einem Schwarm von Vögeln vermindern und damit das Niveau des Schutzes gegen Coccidiosis erhöhen und zusätzlich gegen andere Geflügel-Pathogene schützen.
Diese andere Immunogene können beispielsweise aus der Gruppe der für Geflügel pathogenen Viren oder Mikroorganismen ausgewählt werden, bestehend aus Marek's Disease-Virus (MDV), Newcastle Disease-Virus (NDV), infektiöser Bronchitis-Virus (IBV), Hühner-Anämie-Agens (CAA), Reovirus, aviärer Retrovirus, den Geflügel-Adenovirus, den Truthahn-Rhinotracheitusvirus, Salmonella spp. und E. Coli. Somit kann ein multivalenter Impfstoff geliefert werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs.
Solche Verfahren umfassen das Zumischen eines Polypeptids gemäss der Erfindung oder eines immunogenen Fragments davon zu einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Eine alternative und effiziente Art der Impfung ist die direkte Impfung mit DNS, die das relevante Antigen kodiert. Die direkte Impfung mit DNS kodierenden Polypeptiden ist für viele verschiedene Polypeptide erfolgreich gewesen. (Wie dies in beispielsweise Donnelly et al, The Immunologist 2: 20–26 (1993) rezensiert worden ist). Auf dem Feld der anti-parasitären Impfstoffe ist Schutz gegen beispielsweise Plasmodium yoelii mit DNS-Impfung mit dem Plasmodium yoelii circumsporzoiten Gen erreicht worden (Vaccine 12: 1529–1533 (1994)). Schutz gegen Leishmania major ist durch DNS-Impfung mit dem Leishmania major Oberflächen-Glycoprotein gp63 Gen erreicht worden (Vaccine 12: 1534–1536 (1994)).
Antikörper oder Derivate davon (beispielsweise Fragmente wie Fab, (F(ab')₂ oder Fv Fragmente, die gegen ein Polypeptid gemäss der Erfindung gerichtet sind, haben mögliche Einsätze in passiver Immunotherapie, Diagnose-Immunoassays und in der Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern. Vorzugsweise sind diese spezifisch für die Eimeria-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder Varianten/Fragmente davon. Das Serum umfassend Antikörper oder Derivate davon kann auch geliefert werden.
Die Eimeria-Polypeptide (oder Varianten oder Fragmente davon), wie sie oben charakterisiert worden sind, können eingesetzt werden, um Antikörper zu erzeugen, die polyklonal, monospezifisch oder monoklonal sein können (oder Derivate davon). Falls polyklonale Antikörper gewünscht sind, sind Techniken zur Herstellung und Verarbeitung von polyklonalen Seren im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Mayer and Walter, Herausgeber, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987).
Monoklonale Antikörper, die gegen Eimeria-Polypeptide reaktiv sind (oder Varianten oder Fragmente davon) gemäss der vorliegenden Erfindung, können durch Immunisieren von (In)zuchtmäusen durch Techniken des Standes der Technik hergestellt werden (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495–497, 1975).
Anti-idiotypische Antikörper sind Immunoglobuline, die ein "internes Bild" des Antigens des Pathogens mit sich tragen, gegen den Schutz gewünscht ist und können eingesetzt werden als ein Immunogen in einem Impfstoff (Dreesman et al., J. Infect. Disease, 151, 761, 1985). Techniken zur Vermehrung von antiidiotypischen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (MacNamara et al., Science 226, 1325, 1984).
Antikörper gegen jegliche der Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung und beispielsweise in einer der oben beschriebenen Arten und Weisen hergestellt, können insbesondere für Impfzwecke eingesetzt werden, speziell in immunokompromittierten Tieren.
Daher ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung bezogen auf Antikörper gegen jegliche der Polypeptide gemäss der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung eines Polypeptids gemäss der Erfindung an ein geeignetes Tier, d.h. ein Tier, welches fähig ist, Antikörper gegen Polypeptide zu erzeugen.
Es kann wünschenswert sein, Eimeria als Ursache der Krankheit in Geflügel zu erfassen: eine insbesondere frühe Erkennung von einer Eimeria-Infektion in einem Schwarm bietet die Möglichkeit an, adäquate Massnahmen zur Vermeidung der Ausbreitung der Infektion einzuleiten. Die Erfassung von Eimeria-Infektion kann durchgeführt werden durch Erfassen des Eimeria-Parasiten in dem Wirt oder durch Erfassen der Wirts-Antikörper gegen Eimeria.
Die Erfassung von Eimeria-Parasiten kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: DNS, hergestellt aus den Inhalten des Verdauungstraktes eines kranken Tieres kann mit DNS-Fragmenten gemäss der Erfindung sondiert werden und standardisierter Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterworfen werden. Falls Eimeria-DNS vorhanden ist, selbst in sehr geringen Mengen, wird dies in einem PCR Produkt resultieren, welches auf standardisierten Agarose-Gels nach einigen Runden des PCR sichtbar wird. PCR-Techniken sind beispielsweise in Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, ISBN 0-879693096) beschrieben.
Daher betrifft die Erfindung in einem nochmals weiteren Ausführungsbeispiel Verfahren zur Erfassung von Eimeria, welche Verfahren das Inkubieren einer DNS-Präparation, die aus Geflügel isoliert ist, mit einem DNS-Fragment gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen.
Alternativ können Antikörper gegen Eimeria erfasst werden. Die Erfassung von Antikörpern kann beispielsweise unter Einsatz eines ELISA-Assays durchgeführt werden, in dem ein Polypeptid gemäss der Erfindung an die Wand einer ELISA-Platte beschichtet ist. Der erste Schritt eines solchen ELISA kann beispielsweise das Hinzufügen von Serum des zu testenden Tieres zu der ELISA-Platte umfassen. Antikörper gegen Eimeria, falls überhaupt vorhanden, werden an dem Polypeptid anbinden, welches an der Wand beschichtet ist. Die Abwesenheit oder Anwesenheit von diesen Antikörpern kann in einem nächsten Schritt durch Inkubation mit einem markierten Anti-Geflügel-Antikörper erfasst werden. Falls Antikörper gegen Eimeria in dem zu testenden Serum vorhanden wären, würde der markierte Anti-Geflügel-Antikörper an diesen anbinden und der Marker würde ihre Präsenz aufzeigen. Diese Standard-Techniken werden in ausführlicher Weise in „Antibodies: a laboratory manual" von Harlow, E. und Lane D. ISBN 0-87969-314-2 beschrieben.
Daher bezieht sich die Erfindung in einem nochmals weiteren Ausführungsbeispiel auf Verfahren zur Erfassung von Eimeria, welche Verfahren die Erfassung von Wirt Anti-Eimeria Antikörper gegen jegliche der Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen.
Beispiele
Beispiel 1: Isolation von Proteinen und Protein-Sequenzierung
Hühner
Nicht nach Geschlechtern getrennte, nicht nah verwandte, sogenannte Outbred Weise Leghorn Hühner, die unter spezifischen pathogen-freien Bedingungen aufgezogen worden sind, sind mit freiem Zugang zu Futter in Isolatoren gehalten worden und Wasser. Die Ausscheidungen sind wöchentlich überwacht worden, um zu gewährleisten, dass die Tiere frei sind von coccidialen Infektionen. Für die Infektion sind Hühner eingesetzt worden, die 5–7 Wochen alt waren. Für die Impfung sind 3 Wochen alte Hühner eingesetzt worden.
Parasiten und Reinigung von Sporozoiten
Der Weybridge Stamm von E. tenella ist eingesetzt worden (Shirley M.W. In: Research in Avian Coccidiosis. Proceedings of the Georgia Coddidiosis Conference (Herausgeber: L.R. McDougald, Joyner L.P. und P.L. Long) Athens, University of Georgia, Seiten 13–35 (1986)). Die Parasiten sind in regulären Intervallen durch Coccidia freie Hühner hindurchgeleitet worden. Die Handhabung von Oozysten, die Freigabe von Sporozysten und Sporozoiten aus sporulierten Oozysten ist wie früher beschrieben durchgeführt worden (Long P.L., Millard B.J., Joyner L.P. & Norton C.C. Folia Veterinaria Latina 6, 201–217 (1976)) unter Einsatz von 0.4 % Taurocholat (Sigma, St. Louis, MO, USA) anstelle von Gallensalzen (Toyama T. & Kitano N. Japanese Journal of Veterinary Science 45, 139–141 (1983)). Die Sporozoiten sind weiter gereinigt worden durch Hindurchführen durch Nylon-Wolle (Larsen R.A., Kyle J.E., Whitmire W.M. & Speer C.A. Journal of Parasitology 70, 597–601 (1984)) und als Kügelchen bei –70°C gelagert worden.
Sporozoiten Protein-Fraktionierung
Triton-X114 Extraktion
Eine Triton X-114 Extraktion ist durchgeführt worden, um die hypdrophile Phase der gesamten Sporozoit-Proteine zu isolieren (HPS) (Bordier C. Journal of Biological Chemistry 256, 1604–1607 (1981)). Hierfür sind 5 × 10⁹ gereinigte E. tenella Sporozoiten suspensiert worden (2 × 10⁸/ml) in 10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl pH-Wert 7.4 (TBS) versehen mit DNAse (20 μg/ml) und Protease-Inhibitoren; 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Serva, Heidelberg, Deutschland), 5 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin und 1 μg/ml Pepstatin A und dies ist drei Mal über 20 Sekunden bei der Position 7 auf Eis unter Schall gesetzt worden (unter Einsatz eines Schall-Bestrahlungsgerätes von Branson, Soest, Niederlande). Prekondensiertes Triton X-114 (Serva) in TBS ist zu der Sporozoiten-Suspension bis zu einer endgültigen Konzentration von 10% (v/v) hinzugefügt und gut gemischt worden, um die Proteine aufzulösen. Nicht aufgelöstes Material ist durch Zentrifugierung (20 Minuten bei 120008 bei 4°C) in Kügelchen abgeschieden worden. Der wiedergewonnene Supernatant ist über ein 6%-iges Saccharose-Kissen gelegt worden und 15 Minuten bei 40°C (Phasen-Trennung) inkubiert worden und bei 400 g bei Raumtemperatur (RT) gesponnen worden. Eine Extraktion der hydrophilen Fraktion ist wiederholt worden, einmal in 10% (v/v) und nachfolgend in 20% (v/v) prekondensiertem Triton X-114. Die Gesamtprotein-Konzentration ist durch Einsatz des Bicinchonsäure (BCA) Assay Verfahrens (Pierce Chemicals, Rockford, Illinois, USA) bestimmt worden. Diese hydrophile Phase ist bei -70°C für die weitere Verwendung gelagert worden.
Fraktionierung mit präparativer Elektrophorese (Prep-Zell Fraktionierung)
Alle Verfahrensschritte sind bei 4°C durchgeführt worden. Vor der Fraktionierung ist HPS durch Aceton-Ausfällung konzentriert worden (HPS: Aceton + 1:9). Nach der Zentrifugierung für 60 Minuten bei 150008 und 4°C und Lufttrocknung sind Kügelchen in reduzierenden Probe-Puffern aufgelöst worden (Laemmli 1970), welcher 30 mg/ml Dithiotreitol (DTT) enthalten hat, und sind für 3 Minuten bei 100°C gekocht worden. Die hydrophilen Proteine sind fraktioniert worden unter Einsatz eines 12%-igen (w/v) Polyacrylamid (PAA) trennenden Gels (7 cm) und einem 4%-igen (w/v) stapelnden PAA Gel in der einen 37 mm Durchmesser aufweisenden Röhre der Bio-Rad Prep-Zell Apparatur (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) gemäss dem Protokoll des Herstellers. Die sogenannte Prep-Zelle ist bei 40mA, 500V maximal betrieben worden. Fraktionen (± 3 ml) sind über Nacht gesammelt worden und bei –85°C gelagert worden. Proben der Fraktionen sind einmal in 2 × Stärke-reduzierenden Probe-Puffern verdünnt worden und mit Natrium-Dodecyl-Sulfat Polyacrylamid Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter Einsatz eines 12%-igen (w/v) PAA Gels (Laemmli 1970) analysiert worden. Die Gels sind gemäss Wray et al. (Wray W., Boulikas T., Wray V.P. & Hannock R. (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamid) silber gefärbt worden. Fünfzig Fraktionen sind analysiert worden, basierend auf ihren relativen Molekularmassen und gegen 0.01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) pH-Wert 7.3 dialysiert worden. Diejenigen Fraktionen, die Proteine mit einer Masse zwischen 26 und 30 kD (+/– 5 kD) enthielten, sind für eine weitere Analyse ausgewählt worden.
Die gesamte Protein-Konzentration in den Fraktionen ist unter Einsatz des BCA-Assays bestimmt worden.
Charakterisierung von ausgewählten Antigenen und Protein-Sequenzieruag
Fraktionen, die Polypeptide enthielten, die unter dem Titel Prep-Zell Fraktionierung beschrieben worden sind und im Bereich zwischen 26–30 kD lagen (± 5 kDa, um mögliche Begrenzungen bei den verwendeten Messtechniken zu gestatten), sind auf ein Gel für die weitere Analyse aufgebracht worden.
Sie sind weiter auf einem präparativen 12%-igen (w/v) Polyacrylamid-Gel fraktioniert worden, mit Coomassie blau gefärbt worden und nachfolgend aus dem Gel herausgeschnitten worden. Bänder aus diesen Gels sind für weitere Sequenzier-Zwecke, wie unten beschrieben, eingesetzt worden:
Die Polypeptide in den Gel-Stücken sind einem Tryptin-Aufschluss wie beschrieben in Rosenfeld et al., Anal. Biochem. 203: 173–179 (1992) unterworfen worden.
Danach sind die Tryptin-Aufschlüsse aus dem Gel herausgelöst und vorgereinigt worden auf präparativem HPLC unter Einsatz von einem Trifluoressigsäure (TFA)-System, gefolgt von präparativem HPLC unter Einsatz von einem Ammonium-Acetat-System. Die gereinigten Polypeptid-Fragmente sind gemäss dem standardisierten Edman-Verfahren sequenziert worden, wie es in (Edman, P., Acta Chem. Scand. 10: 761–768 (1956) und Ilse, D. & Edman, P., Aust. J. Chem. 16: 411–416 (1963)) beschrieben worden ist.
Beispiel 2: Isolierung/Klonierung von DNS und DNS-Sequenzierung
Das Klonieren und Sequenzieren eines Fragmentes des Gens, welches SOD-ähnliches 25 kD Polypeptid kodiert.
mRNS ist aus E. tenella Trophozoiten erster Generation (erhalten aus MDBK-Zellen, die mit frisch aus der Zyste entstandenen Sporozoiten infiziert worden sind) bei 40–48 Stunden nach der Infektion unter Einsatz eines Ultraspec Total RNS Isolations-Reagenz (Biotecx, Lab. Inc., Houston, Texas) isoliert worden. 1-strängige cDNS ist synthetisiert worden unter Einsatz von einem SOD-spezifischen Backward-Primer, gemäss dem sogenannten Ambiguity Code GCRAARTCCCARTTIACIAC, der von einem Teil (VVNWDFA) des Oligopeptids YLDAWWSVVNWDFANENLK abgeleitet worden ist, welcher wie oben genannt isoliert und sequenziert worden ist und welcher Teil der Sequenz ist, die in SEQ ID Nr. 1 angegeben worden ist. Zu der mRNS sind 0.5 μg Primer hinzugefügt worden und dies ist bei 70°C für 10 Minuten inkubiert worden. Die cDNS- Synthese ist unter einer sogenannten Superscript Reverse Transcriptase („cDNA synthesis kit", Gibco BRL) durchgeführt worden. Die Reaktion ist bei 41°C für 50 Minuten inkubiert worden. Die cDNS-Synthese ist durch schnelles Kühlen auf Eis gestoppt worden. Danach ist die cDNS durch Phenol/Chloroform Extraktion gereinigt worden, gefolgt von einer Ausfällung in Ethanol gemäss den Standard-Verfahren (Sambrook T, et al). Dieses spezifisch geprimte cDNS ist einer PCR unter Einsatz des Backward Primers unterworfen worden und eines spezifischen Forward Primers, gemäss dem Abiguity Code (CCIGAYGCTYTIGARCCITAYAT), der aus einem Teil (PDALEPYI) eines anderen Oligopeptids abgeleitet worden ist, FSLPPLPYKPDALEPYIS, welches wie oben beschrieben isoliert und sequenziert worden ist und auch Teil der Sequenz ist, die in der SEQ ID Nr. 1 angegeben worden ist. Die Reaktion ist in einem GeneAmp PCR-System (Perkin Elmer) durchgeführt worden, welches wie folgt programmiert worden ist: 10 Minuten 94°C–1 Minuten 94°C; 30 Sekunden 55°C; 90 Sekunden 68°C (30 Zyklen)–10 Minuten 68°C; 4°C. Die erhaltenen PCR-Produkte sind auf einem 1%-igen TAE Agarose Gel laufen gelassen worden, welches Ethidium-Bromid enthalten hat. Spezifische PCR-Fragmente sind unter Einsatz von UV-Licht visualisiert worden und aus dem Gel ausgeschnitten worden. Die Fragmente sind aus dem Gel durch Inkubieren des Gels in einer gleichen Menge von deionisiertem Wasser über Nacht eluiert worden. Die PCR-Fragmente sind in einem pCRII-Topo stumpfen Vektor („Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit", Invitrogen, Leek, Niederlande) gemäss den Spezifikationen des Herstellers kloniert worden. Der Einsatz von pcRII-topo spezifischen Primern erlaubt die Sequenzierung des eingefügten PCR-Fragmentes unter Einsatz eines „ABI Prism 310 genetic analyzers" (Perkin Elmer).
Das Klonieren und Sequenzieren eines Fragmentes, welches das Peroxidoxin-ähnliche 25 kD Polypeptid kodiert.
Die Prozedur war ähnlich zu der oben beschriebenen Prozedur, obwohl der Backward Primer (TCIGTIGTRCAIACIGGIGTRAARTC), der für die spezifische cDNS-Synthese eingesetzt worden ist, aus einem konservierten Teil (DFTPVCTTE) der Peroxidoxin-Moleküle abgeleitet worden ist. Bei der PCR-Reaktion ist dieser Backward Primer in Zusammenhang mit einem Vorwärts-Primer (TTYCCIGAYTTYCARGCIGARGC) eingesetzt worden, welcher aus einem Teil des isolierten Oligopeptids (FPDFQAE) gewonnen worden ist.
Beispiel 3: Impf-Experimente
Bestimmung des Impf-Potentials von ausgewählten Polypeptiden Gruppen von Hühnern sind mit den ausgewählten Polypeptiden immunisiert worden. Tiere haben eine Vorimpfung, sogenanntes Priming, am Tag 0 und eine Booster-Impfung am Tag 21 erhalten.
Vierzehn Tag nach der Booster-Impfung sind alle Tiere mit E. tenella sporulierten Oozysten gechallenged worden. Sieben Tage später sind die Tiere getötet worden, um den Läsions-Wert im Zäkum zu bestimmen. Die Gruppe von Tieren, die mit den Polypeptiden gemäss der Erfindung geimpft worden sind, hatten verminderte zäkale Läsions-Werte im Vergleich zu nicht geimpften Kontroll-Gruppen. Diese Reduktion war statistisch signifikant (P < 0.05).
Impfexperimente
Die selektierten Polypeptid-Volumina sind zusammengepoolt worden und eingestellt worden, um 5–10 μg eines Polypeptids gemäss der Erfindung/Dosis (0.5ml) zu erhalten, ausser in anderweitig benannten Fällen. Zu jeder Dosis sind 150 μg/Dosis Quill A (Superfos Biosector, Vedbaek, Dänemark) als Adjuvant hinzugefügt worden. Die verschiedenen Impfstoff-Präparationen sind subkutan in Gruppen von ±10 Hühnern injiziert worden. Der Kontrollgruppe ist lediglich das Adjuvant in PBS injiziert worden. Nach ±3 Wochen sind die Hühner mit derselben Präparation geboostet worden, die frisch aus gefrorenem Antigen-Material hergestellt worden ist.
Sequenz Listing

(1) Allgemeine Informationen: (i) Anmelder: A) Name: Akzo Nobel N.V. B) Street: Velpenweg 76 C) Stadt: Anhem E) Land: Niederlande F) PLZ: 6824 BM G) Tel: 0412 666379 H) Fax: 0412 650592 (ii) Titel der Erfindung: Impfstoffe gegen Coccidiosis (iii) Anzahl der Sequenzen: 41 (iv) Computer lesbare Form: A) Medium: Diskette B) Computer: IBM compatibler PC C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS Software: Patentin Release #1.0, Version # 1.30 (EPA)

Übersetzung der Header der einzelnen Sequenzen:

Claims

Hydrophiles Polypeptid von Eimeria, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Polypeptid ein Peroxidoxin-ähnliches Polypeptid ist, ein Molekulargewicht von 25 kD hat und eine Aminosäurensequenz, die mindestens 70% Homologie mit der Aminosäurensequenz teilt, die in der SEQ ID NR: 3 dargestellt ist, oder ein immunogenes Fragment von dem besagten Polypeptid umfasst, welche (s) fähig ist, eine Immunantwort gegen das besagte Polypeptid zu induzieren.
Hydrophiles Polypeptid von Eimeria nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Homologie 100% ist.
Hydrophiles Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Eimeria Art Eimeria tenella ist.
DNS-Fragment, umfassend eine Nukleotidsequenz, kodierend ein hydrophiles Polypeptid oder ein immunogenes Fragment des besagten Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
DNS-Fragment nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz die SEQ ID NR: 40 oder ein Fragment der SEQ ID NR: 40 ist, wobei das Fragment der SEQ ID NR: 40 die Fähigkeit beibehält, ein immunogenes Fragment eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zu kodieren.
DNS-Fragment nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz die SEQ ID NR: 41 oder ein Fragment der SEQ ID NR: 41 ist, wobei das Fragment der SEQ ID NR: 41 die Fähigkeit beibehält, ein immunogenes Fragment eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zu kodieren.
Rekombinantes DNS-Molekül, umfassend ein DNS-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
Lebender rekombinanter bakterieller oder viraler Träger-Mikroorganismus, umfassend zusätzliche genetische Information, wobei die zusätzliche genetische Informationen ein DNS-Fragment gemäss einem der Ansprüche 4 bis 6 oder ein rekombinantes DNS-Molekül nach Anspruch 7 umfasst.
Eine bakterielle, Hefe-, Insekten- oder Pflanzen-Wirtszelle, umfassend ein DNS-Fragment gemäss einem der Ansprüche 4 bis 6, ein rekombinantes DNS-Molekül gemäss Anspruch 7 oder einen lebenden rekombinanten Träger-Mikroorganismus, umfassend zusätzliche genetische Information nach Anspruch 8.
Impfstoff, fähig zum Schutze von Geflügel gegen eine Eimeria-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ein DNS-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6, ein rekombinantes DNS-Fragment nach Anspruch 7, einen lebenden rekombinanten Träger-Mikroorganismus, umfassend zusätzliche genetische Informationen nach Anspruch 8 oder eine Wirtszelle gemäss Anspruch 9, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich ein Adjuvans umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein zusätzliches Immunogen umfasst, welches von einem Geflügel-pathogenen Virus oder Mikroorganismus abgeleitet ist.
Impfstoff nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunogen aus der Gruppe von für Geflügel-pathogene Viren oder Mikroorganismen ausgewählt ist, umfassend den Marek's Disease-Virus, den Newcastle Disease-Virus, den infektiösen Bronchitis-Virus, das Hühneranämie-Agens, den Reo-Virus, den aviären Retrovirus, den Geflügel-Adeno-Virus, den Truthahn-Rhinotracheitis-Virus, Salmonella spp. und E. coli.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass er in gefriergetrockneter Form vorliegt.
Antikörper ansprechend gegen ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Bekämpfung von Eimeria-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Verfahren das Zumischen eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, eines DNS-Fragmentes nach einem der Ansprüche 4 bis 6, eines rekombinanten DNS-Fragmentes gemäss Anspruch 7, eines lebenden rekombinanten Träger-Mikroorganismus, umfassend zusätzliche genetische Informationen gemäss Anspruch 8, oder einer Wirtszelle gemäss Anspruch 9, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Bekämpfung von Eimeria-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Verfahren das Zumischen von Antikörpern gemäss Anspruch 15 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Erfassung von Eimeria-Parasiten in Geflügel, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Inkubieren einer DNS-Präparation, welche von Geflügel isoliert worden ist, mit einem DNS-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst.
Verfahren zur Erfassung von Antikörpern gegen Eimeria-Parasiten in Geflügelserum, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Verfahren das Inkubieren des besagten Serums mit dem hydrophilen Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.