DE69910216T2

DE69910216T2 - Konjugate zur behandlung von entzündungskrankheiten und von assozierter gewebeschädigung

Info

Publication number: DE69910216T2
Application number: DE69910216T
Authority: DE
Inventors: R. John MCDONALD; J. Philip COGGINS
Original assignee: Osprey Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Osprey Pharmaceuticals USA Inc
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2019-07-22
Also published as: EP1098664A2; CA2335105C; JP4454152B2; WO2000004926A2; IL187389A0; IL140893A0; HK1037133A1; ES2275999T3; AU4891899A; EP1346731B1; CA2335105A1; IL187389A; IL187388A; JP2010075194A; ATE246517T1; EP1098664B1; DK1346731T3; DE69934337T2; DE69910216D1; DE69934337D1

Description

Verwandte Anmeldungen
Für internationale Zwecke wird der Vorteil der Priorität der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/120,523 mit dem Titel "Methods and compositions for treating secondary tissue damage" von McDonald, John R. und Coggins, Philip J. beansprucht, eingereicht am 22. Juli 1998.
Für US-Zwecke ist diese Anmeldung eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/120,523. Es wird der Vorteil der Priorität unter 35 U. S. C. § 120 beansprucht.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung bei der Behandlung von Krankheitszuständen. Insbesondere werden Verbindungen, Zusammensetzungen und deren Verwendungen bereitgestellt zur Behandlung von Krankheitszuständen, die mit der Proliferation, Migration und physiologischen Aktivität von Zellen assoziiert sind, die an Entzündungsreaktionen beteiligt sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf einen Sekundärgewebeschaden.
Chemokine
Chemokine sind eine Superfamilie von vierzig oder mehr kleinen (ungefähr etwa 4 bis etwa 14 kDa), induzierbaren und sekretierten pro-entzündlichen Zytokinen, welche vorwiegend als chemotaktische Faktoren und Aktivatoren für spezifische Subtypen von Leukozytenzellen agieren. Zusammen richten sich Chemokine auf das gesamte Spektrum der Leukozyten-Subtypen; jedes einzelne richtet sich nur gegen nur einen Teil des Spektrums. Chemokine, welche basische Heparin bindende Proteine sind, besitzen vier Cysteine, die fast allen Familienmitgliedern gemeinsam sind. Es gibt vier Hauptgruppen von Chemokinen, drei von ihnen schließen die vier konservierten Cysteine ein. Die Gruppen werden definiert durch die Anordnung der ersten zwei Cysteine. Wenn die ersten zwei Cysteine durch eine einzelne Aminosäure getrennt sind, sind sie Mitglieder der CXC-Familie (auch α genannt); wenn die Cysteine benachbart sind, werden sie in die CC-Familie (auch β genannt) eingeordnet. Wenn sie durch drei Aminosäuren CX₃C getrennt sind, sind sie Mitglieder der dritten Gruppe. Die vierte Gruppe der Chemokine enthält zwei Cysteine, entsprechend dem ersten und dritten Cystein in den anderen Gruppen. Eine Strukturanalyse zeigt, dass die meisten Chemokine als Monomere fungieren, und dass die zwei Regionen, die für die Rezeptorbindung notwendig sind, innerhalb der ersten 35 Aminosäuren des flexiblen N-Terminus residieren (Clark-Lewis et al. (1995) J. Leukoc. Biol. 57, 703–11, Beall et al. (1996) Biochem. J. 313, 633–40 und Steitz et al. (1998) FEBS Lett. 430, 158–64).
In Verbindung mit Adhäsionsmolekülen rekrutieren Chemokine Untergruppen von Leukozyten zu speziellen Stellen der Entzündung und der Gewebeverletzung. Im Allgemeinen ist die Expression von Chemokinen und Chemokinrezeptoren bei Erkrankungen hochreguliert, wobei die Chemokine in einer autokrinen oder parakrinen Art und Weise agieren (Glabinski et al., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153–65, 1995; Furie und Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287–301, 1995; Benveniste, E. N., J. Mol. Med., 75: 165–73, 1997; Schall et al., Current Biol. 6: 865–73, 1994; Taub et al., Ther. Immunol., 1: 229–46, 1994; Baggliolini et al., Adv. Immunol., 55: 97–179, 1994 und Haelens et al., Immunobiol., 195: 499–521, 1996). Mehrere Zytokine und Chemokine arbeiten zusammen, um die meisten Funktionen von mononukleären Phagozyten (MNPs; Monozyten) zu regulieren, einschließlich der Freisetzung von neurotoxischen und cytotoxischen Faktoren.
Wenn sie erst einmal durch infiltrierende mononukleärer Phagozyten (MNPs), so wie insbesondere durch aktivierter Mikroglia, einer bestimmten Klasse von im ZNS gefundenen mononukleären Phagozyten (MNPs), sekretiert werden, sind Chemokine für die Chemoattraktivität von mehreren anderen Leukozytenzelltypen verantwortlich, einschließlich Neutrophiler, Eosinophiler, Basophiler, T-Lymphozyten und natürlicher Killerzellen. Untersuchungen in vitro haben gezeigt, dass verschiedene Stimuli, einschließlich eines Lipopolysaccharids (LPS), IL-1, IFN-γ und TNF-α die Expression und Sekretion von Chemokinen in verschiedenen Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) und anderen Zelltypen (Proost et al., J. Leukoc. Biol., 59: 67–74, 1996; Graves et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109–18, 1995; Hayashi et al., J. Neuroimmunol. 60: 143–50, 1995 und Hurwietz et al., J. Neuroimmunol., 57: 193–8, 1995) induzieren. Zum Beispiel kann die Produktion von Chemokinen, wie etwa dem Monozyten-chemotaktischen Protein-1 (MCP-1), dem Makrophagen-inflammatorischen Protein-1 (MIP-1β) und RANTES („Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted") in Astrozyten, Mikroglia und Leukozyten induziert werden (Proost et al., J. Leukoc. Biol., 059: 67–74, 1996; Graves et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109–18, 1995; Hayashi et al., J. Neurommunol. 60: 143–50, 1995 und Hurwitz et al., J. Neuroimmunol., 57: 193–8, 1995). Es wurde gezeigt, dass diese Chemokine in Untersuchungen an Zellkulturen eine Chemotaxis und eine Aktivierung von Mikroglia und Makrophagen induzieren (Graves et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109–18, 1995; Hayashi et al., J. Neurommunol. 60: 143–50, 1995 und Hurwitz et al., J. Neuroimmunol., 57: 193–3, 1995; Sun et al., J. Neurosci. Res., 48: 192–200, 1997 und Peterson et al., J. Infect. Dis., 175: 478–81, 1997). Somit wird angenommen, dass Chemokine die Produktion und Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies, abbauenden Enzymen und inflammatorischen und toxischen Zytokinen von verschiedenen Leukozyten- und MNP-Zellpopulationen induzieren (Glabinski et al., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153–65, 1995; Furie und Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287–301, 1995; Benveniste, E. N., J. Mol. Med., 75: 165–73, 1997; Schall et al., Current Biol., 6: 865–73, 1994; Taub et al., Ther. Immunol., 1: 229–46, 1994; Proost et al., J. Leukoc. Biol., 59: 67–74, 1996; Graves et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109–18, 1995; Hayashi et al., J. Neurommunol. 60: 143–50, 1995; Hurwitz et al., J. Neuroimmunol., 57: 193–8, 1995; Sun et al., J. Neurosci. Res., 48: 192–200, 1997; Peterson et al., J. Infect. Dis., 175: 478– 81, 1997; Leopard et al., Immunol. Today, 11: 9–103, 1990 und Fahey et al., J. Immunol., 148: 2764–9, 1992; Ali et al., Adv. Rheumatol., 81: 1–28, 1997).
Es ist gezeigt worden, dass die Chemokinmitglieder MCP-1, MIP-1β und RANTES in Astrozyten und Makrophagen nach einer mechanischen Verletzung am Gehirn exprimiert werden (Glabinski et al., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153–65, 1995 und Ghirnikar at al., J. Neurosci. Res., 46: 72–33, 1996). In diesen Untersuchungen korrelierte die Expression der untersuchten Chemokine mit dem Einsetzen der reaktiven Gliose und dem Auftreten von MNPs an der Stelle der Verletzung. Eine Expression von MCP-1 und MIP-1α ist in MNPs und Astrozyten nach einer fokalen zerebralen Ischämie in der Ratte nachgewiesen worden (Kim et al., J. Neuroimmunol., 56: 127–34, 1995; Gourmala et al., J. Neuroimmunol., 74: 35–44, 1997 und Takami et al., Neurosci. Lett., 277: 173–6, 1997), und mehrere Wissenschaftler haben die Expression von verschiedenen Chemokinen in EAE, einem Tiermodell für multiple Sklerose, untersucht (Berman et al., J. Immunol., 156: 3017–23, 1996 und Adamus et al, J. Neurosci. Res., 50: 53–8, 1997). Es ist auch gezeigt worden, dass transgene Mäuse, welche MCP-1 überexprimieren, eine deutliche MNP- und Leukozyteninfiltration in das ZNS aufweisen (Fuentes et al., J. Immunol., 155: 5769–76, 1995).
Es ist berichtet worden, dass die Expressionsniveaus von zahlreichen Zytokinen und Chemokinen in unzähligen Krebsarten erhöht ist und den Verlauf von unzähligen Krebsarten modulieren (Van Mier, Glia, 15: 264–88, 1995). Zum Beispiel scheinen leukämische humane Mastzellen die Quelle von vielfältigen Chemokinen zu sein, einschließlich MCP-1, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES und IL-8. Eine Untersuchung berichtet, dass normale humane adulte Gewebe sehr geringe Spiegel an RANTES exprimieren, dass die Expression aber in zahlreichen Krebsarten, einschließlich Lymphomen stark erhöht war (von Luettichau, et al., Zytokine, 8: 89–98). In ähnlicher Art und Weise sind die MCP-3-Expressionsniveaus in vielen Tumorzelllinien erhöht (Murakami, et al., DNA Cell Biol. 16: 173–831.
Zytokine (zum Beispiel IL-1, IL-6 und TNF-α) und Chemokine (zum Beispiel IL-8, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β und RANTES) sind mit der Pathologie von zahlreichen Bedingungen und Erkrankungen in Verbindung gebracht worden, einschließlich einem Sekundärzellschaden. Sie sind mit der Pathologie von entzündlichen Gelenkerkrankungen in Verbindung gebracht worden, einschließlich rheumatoider Arthritis (Rathanaswami et al., J. Biol. Chem. 268: 5834–9, 1993; Badolato und Oppenhiem, Semin. Arthritis Rheum., 2: 526–38, 1996; De Benedetti et al., Curr. Opin. Rheumatot., 9: 428–33, 1997; Viliger et al., J. Immunol., 149: 722–27, 1992; Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol., 97: 451–7, 1994; Kunkel et al., J. Leukoc. Biol., 59: 6–12, 1996). Die Freisetzung von Entzündungsmediatoren einschließlich reaktiver Sauerstoffspezies, proteolytischer Enzyme und einer Vielzahl von Zytokinen aus MNPs steht im Zusammenhang mit dem Anfang und der Beibehaltung eines Gewebeschadens im arthritischen Zustand (Kunkel et al., J. Leukoc. Biol., 59: 6–12, 1996; Badolato und Oppenhiem, Semin. Arthritis Rheum., 2: 526–38, 1996).
Chemokinrezeptoren
Chemokine vermitteln deren Aktivitäten über G-Protein gekoppelte Zelloberflächenrezeptoren. Fünf Rezeptoren (CXCR1-51, an die CXC-Chemokine binden, und zehn Rezeptoren (CCR1-9, einschließlich CCR-2A und CCR-2B), an die CC-Chemokine binden, sind identifiziert worden. Ein Mitglied, bezeichnet als Duffy-Antigenrezeptor, bindet an CC- und CXC-Chemokine. Entzündungszellen, wie etwa Mikroglia, exprimieren mehrere Chemokinrezeptoren, und es kann mehr als ein Chemokin an einen Rezeptor binden. Zum Beispiel bindet der β-Chemokinrezeptor CCR3 (He et al., Nature, 385: 645–49, 1997) nicht nur MCP-3, MCP-4 und RANTES, sondern auch zwei andere CC-Chemokine, Eotaxin und Eotaxin-2 (Jose et al., J. Exp. Med., 179: 881–7, 1994; Jose et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 788–94; 1994; Ponath et al., J. Clin. Invest., 97: 604–12, 1996; Daugherty et al., J. Exp. Med. 183: 2349–54, 1996 und Forssman et al., J. Exp. Med., 185: 2171–6, 1997). Eotaxin und Eotaxin-2 sind CCR3-spezifisch (Ponath et al., J. Clin. Invest., 97: 604–12, 1996; Daugherty et al., J. Exp. Med. 183: 2349–54, 1996 und Forssman et al., J. Exp. Med., 185: 2171–6, 1997).
Ein zweites Beispiel ist der α-Chemokin-CXCR4 (Fusin)-HIV-Corezeptor. Es sind drei Chemokine (von Stromazellen stammende Faktoren SDF-1α, SDF-1β und SDF-2) identifiziert worden, welche spezifisch an diesen Rezeptor binden, welcher auf verschiedenen Untergruppen von Entzündungszellen vorliegt, und welche sehr starke MNP-Zelllockstoffe sind (Ueda et al., J. Biol. Chem., 272: 24966–70, 1997; Yi et al., J. Virol., 72: 772–7, 1998; Shirozu et al., Genomics, 28: 495–500, 1995; Shirozu et al., Genomics, 37: 273–80, 1996; Bleul et al., J. Exp. Med. 184: 1101–9, 1996; Tanabe et al., J. Immunol. 159: 905–11, 1997 und Hamada et al., Gene, 176: 211–4, 1996).
Entzündungserkrankung, Sekundärgewebeschaden und Chemokine
Chemokine besitzen eine Vielzahl biologischer Wirkungen. Sie wurden anfänglich durch deren Fähigkeit isoliert, Leukozytenmigration und Aktivierung zu stimulieren. Es ist gezeigt worden, dass sie eine hämatopoetische Progenitorproliferation negativ regulieren, und dass mehrere CXC-Chemokine die Angiogenese regulieren können. Sie können eine Rolle in vielen Erkrankungen spielen, welche die Zerstörung von Entzündungsgewebe betreffen, wie etwa das adulte Atemnotsyndrom, Myokardialinfarkt, rheumatoide Arthritis und Atherosklerose.
Entzündungsreaktionen werden durch Immunabwehrzellen vermittelt, welche sich an der Stelle der Gewebeverletzung oder des Traums ansammeln, um den Körper von unerwünschten exogenen Agenzien (zum Beispiel Mikroben) oder endogenen Agenzien (zum Beispiel Krebszellklone) zu befreien; um Zelltrümmer aufzuräumen, und um sich an der Gewebe- und Wundheilung zu beteiligen. Unglücklicherweise können die molekularen Mechanismen, die diese Reparatur-(Entzündungs-)-Prozesse betreffen, einen Sekundärgewebeschaden einleiten, welcher wiederum zur Pathogenese und persistenten Pathologie mehrerer Entzündungserkrankungen beiträgt. Die molekularen Mechanismen und die zellulären und chemischen Mediatoren, die einen Sekundärgewebeschaden betreffen, sind bei den meisten Entzündungskrankheiten des Menschen ähnlich, wenn nicht identisch. Als ein Beispiel werden die einen Sekundärgewebeschaden im zentralen Nervensystem (ZNS)-Trauma und -Erkrankung betreffenden Prozesse unten dargestellt.
Untersuchungen an einer Rückenmarksverletzung (SCI, „spinal cord injury") und einem generalisierten Trauma des zentralen Nervensystems (ZNS) haben einen klaren Beginn eines Sekundärgewebeschadens gezeigt, welcher innerhalb von Stunden beobachtet wird, für mehrere Wochen weitergehen kann, und von einer Periode der teilweisen Wiederherstellung gefolgt wird. Es sind zahlreiche Faktoren in die Ausbreitung eines Sekundärschadens im Rückenmark nach einer traumatischen Verletzung, einschließlich einer Ischämie, einem Ödem, erhöhten exzitatorischen Aminosäuren und einem oxidativen Schaden des Gewebes durch reaktive Oxygenspezies betroffen. Neutrophile und Makrophagen können reaktive Oxygenspezies produzieren, wenn sie aktiviert sind, und somit zur Lipidperoxidation beitragen, welche nach einer Rückenmarksverletzung auftritt. Ein Sekundärgewebeschaden ist nachweisbar als Zelltod, Astrogliose, welche zu Gliavernarbung führt, Gefäßneubildung, Demyelinisierung und einem Verlust der sensorischen und motorischen Funktionen, das bedeutet Paralyse. Der Zeitverlauf eines Sekundärschadens und einer teilweisen Wiederherstellung sind mit dem Ausmaß der Entzündung an der Stelle der Verletzung korreliert (Blight, A. R., J. Neurol. Sci. 103: 156–71, 1991; Dusart et al., Eur. J. Neurosci. 6: 712–14, 1994 und Gehrmann et al., Brain Res. Rev., 20: 269–87, 1995), und die molekularen Mechanismen, welche diesen Ereignissen zugrundeliegen, scheinen ähnlich zu sein mit denjenigen, welche den Schaden vermitteln, der im Zusammenhang steht mit anderen Entzündungserkrankungen des ZNS, einschließlich multipler Sklerose (MS), Enzephalomyelitis, Alzheimer-Erkrankung (AD), AIDS-Demenz-Komplex, spongiformen Enzephalopathien und Adrenoleukodystrophie (Raine, C. S., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 53: 328–37, 1994; Sobel, R. A., Neurol. Clin., 13: 1–21, 1995; Dickson et al., Glia 7: 75–83, 1993; Benveniste, E. N., Res. Publ. Assoc. Res. Nerv. Ment. Dis., 72: 71–88, 1994; Benveniste, E. N., J. Mol. Med., 75: 165–73, 1997; Sippy et al., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511–21, 1995; Giulian et al., Neurochem. Int., 27: 119-37, 1995a; Christie et al., Am. J. Pathol., 148: 399-403, 1996; EI Khoury et al., Nature 382: 716–19, 1996; Powers, J. M., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 54: 710–9, 1995 und Ühleisen et al., Neuropathol. App. Neurobiol., 21: 505–517, 1995).
Es ist im Allgemeinen anerkannt, dass Mikroglia die im ZNS vorliegenden Immuneffektorzellen sind (Gehrmann et al., Brain Res. Rev., 20: 269–87, 1995; Giulian, D., J. Neurosci. Res., 18: 155–171, 1987 und Giulian et al., J. Neurosci., 15: 7712–6, 1995b). Mikroglia und infiltrierende Makrophagen, eine andere Klasse von MNP, welche nach einer Verletzung aktiviert werden, führen zu einem Sekundärzellschaden (Giulian et al., J. Neurosci., 9: 4416–29, 1989; Giulian et al., Ann. Neurol., 27: 33–42, 1990; Gehrmann et al., Brain Res. Rev., 20: 269–87, 1995; Sobel, R. A., Neurol. Clin., 13: 1–21, 1995; Dickson et al., Glia 7: 75–83, 1993; Benveniste, E. N., Res. Publ. Assoc. Res. Nerv. Ment. Dis., 72: 71–88, 1994; Sippy et al., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511–21, 1995 und Giulian et al., Neurochem. Int. 27: 119–37, 1995a), durch Herstellung und Sekretion einer Anzahl von pro-entzündlichen Cyotkinen und neurotoxischen und anderen cytotoxischen Faktoren, und durch de-novo-Expression von Zelloberflächenimmunmolekülen.
Mikroglia produzieren und sekretieren das Zytokin Interleukin-1 (IL-1), welches die Proliferation von Astroglia in vitro fördert (Giulian et al., J. Neurosci., 8: 709–14, 1988). Untersuchungen haben gezeigt, dass eine intrazerebrale Infusion von IL-1 die Astrogliose und Gefäßneubildung stimuliert, welche nur nach dem Auftreten von Mikroglia und Makrophagen an der Stelle der Verletzung nachgewiesen werden kann (Giulian et al., J. Neurosci., 8: 2485–90, 1988 und Giulian et al., J. Neurosci., 8: 709–14, 1988). Die größte Zahl an Mikroglia und hämatogenen Makrophagen treten 1–2 Tage nach dem ZNS-Trauma auf, welches die Zeitdauer ist, welche mit der maximalen Produktion von IL-1 im Zusammenhang steht (Giulian et al., J. Neurosci., 9: 4416–29, 1989). Zusammengenommen deutet dieser Beweis darauf hin, dass MNPs verantwortlich sind für die Stimulierung von Astrogliose über IL-1. Außerdem sekretieren aktivierte Mikroglia den Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α), ein Zytokin, von dem gezeigt wurde, dass es mehrere herausragende Rollen in einer Anzahl von Entzündungserkrankungen des ZNS spielt (Gehrmann et al., Brain Res. Rev., 20: 269–87, 1995). TNF-α und IL-1 induzieren, dass Astrozyten mehrere Zytokine produzieren und sekretieren, einschließlich TNF-α und dem Granulozyten-Makrophagen Koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF, „granulocyte macrophage stimulating factor"). Reaktive Mikroglia, nicht aber Astrozyten, synthetisieren und sekretieren Interleukin-3 (IL-3) auch. GM-CSF, IL-3 und Interleukin-4 (IL-4) sind starke Mitogene für MNPs (Giulian et al., J. Neurosci., 12: 4707–17, 1988; Giulian et al., Dev. Neurosci., 16: 128–36, 1994; Gebicke-Haerter et al., J. Neuroimmunol. 50: 203–14, 1994; Lee et al., Glia 12: 309–18, 1994 und Suzumura et al., J. Neuroimmunol., 53: 209–18, 1994). In physiologischer Hinsicht wird ein positiver Rückkopplungskreis etabliert, wobei proliferierende MNPs mehr astrogliale Faktoren produzieren, was zu einer Gliavernarbung an der Stelle der Verletzung führt. Die Astroglianarbe verschließt die Wunde an der Stelle der Verletzung, kann aber schließlich eine axonale Regeneration der umgebenden Neuronen verhindern.
MNPs sekretieren auch eine Anzahl neurotoxischer Agenzien, die ihre Wirkungen über den exzitatorischen Aminosäure-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor auszuüben scheinen. Diese Neurotoxine schließen Aspartat, Glutamat und Chinolinsäure ein. Die ersten zwei Verbindungen werden in erhöhten Konzentrationen in Modellen einer traumatischen Gehirnverletzung gefunden (Faden et al., Science 244: 798–800, 1989 und Panter et al., Ann. Neurol., 27: 96–99, 1990), und Chinolinsäure wird in Modellen einer Rückenmarkkontusionsverletzung gefunden (Blight et al., Brain Res., 632: 314–16, 1993 und Popovich et al., Brain Res., 633: 348–52, 1994). Es ist über einen anderen neurotoxischen NMDA-Rezeptorliganden berichtet worden, welcher spezifisch zu sein scheint für Neuronen, aber keine Wirkung auf Astroglia oder Oligodendroglia besitzt (Giulian et al., J. Neurosci., 13: 29–37, 1993 und Giulian et al., J. Neurosci. Res., 36: 681–93, 1993). Außerdem ist gezeigt worden, dass von Mikroglia und peripheren MNPs, welche aus HIV-1-positiven Patienten isoliert wurden, ein neurotoxisches Amin (Ntox) produziert wird, die (Giulian et al., J. Neurosci., 16: 3139–53, 1996).
Aktivierte Mikroglia und MNPs setzen mehrere andere schädliche Substanzen frei, einschließlich Proteinasen, reaktive Sauerstoffspezies und Stickstoffoxid (NO) (Hartung et al., J. Neuroimmunol., 40: 197–210, 1992 und Banati et al., Glia 7: 111–8, 1993 und Ali et al., Adv. Rheumatol., 81: 1–28, 1997). Proteinasen können Myelin direkt abbauen und sind mit der Proteolyse von extrazellulären Matrixproteinen in Verbindung gebracht worden (Hartung et al., J. Neuroimmunol., 40: 197–210, 1992 und Romanic et al., Brain Pathol. 4: 145–46, 1994). Somit scheint die erhöhte Freisetzung der von MNPs stammenden Proteasen zum Zusammenbruch der extrazellulären Matrix und des Myelins beizutragen, wobei die Zone des Sekundärgewebeschadens erweitert wird. Auch reaktive Sauerstoffzwischenprodukte werden als Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN-γ) und TNF-α von Mikroglia freigesetzt. Diese Sauerstoffradikale sind verantwortlich für die Lipidperoxidation, welche zum Zusammenbruch der Zellmembranen führt, wobei die spezifischen Ziele Neuronen, Oligodendrozyten und die Myelinscheide selbst ist. Humane Mikroglia können die Produktion von NO durch Astrozyten regulieren, durch Bereitstellen von IL-2, IFN-γ und TNF-α (Chao et al., J. Leukoc. Biol. 1: 65–70, 1995).
MNPs produzieren, sekretieren und reagieren auf mehrere Zytokine, einschließlich IL-1, TNF-α, IL-3, IL-4, GM-CSF und IFN-γ. Diese Zytokine können die meisten Funktionen von MNPs modulieren, insbesondere die Expression von Zelloberflächenmarkern auf MNPs. Untersuchungen in vitro haben gezeigt, dass TNF-α für Oligodendrozyten direkt cytotoxisch ist, und die Mikroglia-Phagozytose von Myelin stimuliert (Zajicek et al., Brain 115: 1611-31, 1992 und Soliven und Szuchet, Int. J. Dev. Neurosci., 13: 351–67, 1995). Außerdem ist TNF-α mit der Pathogenese der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) und mehreren anderen demyelinisierenden Erkrankungen in Verbindung gebracht worden (Selmaj et al., J. Neuroimmunol., 56: 135–41, 1995; Renno et al., J. Immunol, 154: 944–53, 1995; Redford et al., Brain, 118: 869–78, 1995; Probert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11294–8, 1995 und Probert et al., J. Leukoc. Biol., 59: 518–25, 1996).
GM-CSF, IL-3 und IL-4 sind starke Mitogene für MNPs (Giulian et al., J. Neurosci., 12: 4707–17, 1988c; Giulian et al., Dev. Neurosci., 16: 128–36, 1994; Gebicke-Haerter et al., J. Neuroimmunol. 50: 203–14, 1994; Lee et al., Glia 12: 309–18, 1994 und Suzumura et al., J. Neuroimmunol., 53: 209–18, 19941 und sie induzieren wahrscheinlich eine schnellere Phagozytose von Myelin (Giulian et al., J. Neurosci., 12: 4707–17, 1988c und Smith, M. E., J. Neurosci. Res., 5: 480–487, 1993), was zur Pathogenese von autoimmunen Entzündungserkrankungen beiträgt (Giulian et al., J. Neurosci., 12: 4707–17, 1988c; Giulian et al., Dev. Neurosci., 16: 128–36, 1994; Gebicke-Haerter et al., J. Neuroimmunol. 50: 203–14, 1994; Lee et al., Glia 12: 309–18, 1994; Suzumura et al., J. Neuroimmunol., 53: 209–18, 1994 und Smith, M. E., J. Neurosci. Res., 5: 480–487, 1993). Es ist beispielsweise über eine MNPspezifische Hochregulierung von TNF-α-Rezeptoren in AIDS-Patienten berichtet worden (Dickson et al., Glia 7: 75–83, 1993 und Sippy et al., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511–21, 1995), und es ist eine Hochregulierung von GM-CSF-Rezeptoren in einem Tiermodell mit einer Fazialisverletzung nachgewiesen worden (Raivich et al., J. Neurosci. Res. 30: 682–6, 1991).
Außerdem erhöhen frisch aktivierte Mikroglia und infiltrierende Makrophagen die Expression des Rezeptors für Lipoprotein mit niederer Dichte (LDLI/Makrophagen-Radikalfängers bei einem ZNS-Trauma oder einer Erkrankung (Christie et al., Am. J. Pathol. 148: 399–403, 1996; Elkhoury et al., Nature 382: 716–19, 1996; Giulian D., J. Neurosci. Res. 18: 155– 171, 1987; Giulian et al., J. Neurosci., 13: 29–37, 1993a und Bell et al., J. Neurocytol., 23: 605–13, 1994), dies trägt wahrscheinlich zu einer erhöhten phagozytotischen Aktivität in diesen Bedingungen bei.
MNPs und Leukozyten werden auch mit der Pathophysiologie (welche einen Sekundärgewebeschaden einschließt) in Verbindung gebracht, welche assoziiert ist mit mehreren Nicht-ZNS-Entzündungserkrankungen, einschließlich verschiedener neoplastischer, Haut-, Augen-, Nieren-, Lungen- und entzündlichen Gelenkerkrankungen. Zytokine und Chemokine sind förderlich bei der Modulation dieser Reaktionen (Furie und Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287–301, 1995; Baggiolini et al., Adv. Immunol., 55: 97–179, 1994; Schall et al., Current Biol., 6: 865–73, 1994; Howard et al., Trends Biotechnol., 14: 46–51, 1996; Strieter et al., J. Immunol., 156: 3583–86, 1997; Taub et al., Ther. Immunol., 1: 229–46, 1994; Driscoll et al., Environ. Health Perspect., 105 : Suppl. 5 : 64: 1159–64, 1997).
Bei Erkrankungen mit festen Tumoren ist gezeigt worden, dass MNPs die Tumorangiogenese induzieren (Leek et al., J. Leukoc. Biol., 56: 423–35, 1994; Sunderkotter et al., J. Leukoc. Biol., 55: 410–22, 1994) und es ist gefunden worden, dass sie die Hauptkomponente des lymphoretikulären Infiltrats verschiedener Formen von festen Tumoren sind, und nahezu 50% der Zellmasse in Brustkarzinomen (Lewis et al., J. Leukoc. Biol. 57: 747–51, 1995).
MNPs, einschließlich Mikroglia, werden auch mit der Pathogenese von Augenerkrankungen, einschließlich proliferativer vitreoretinaler Retinopathien in Verbindung gebracht (Weiler et al., Exp. Eye Res., 53: 275–81, 1991; Charteris et al., Ophthalmology, 100: 43–46, 1993), ebenso wie erhöhte Spiegel von Zytokinen und Chemokinen, einschließlich IL-2, IL-6, IFN-(, IL-8 und MCP-1 (Abu el Asrar et al., Am. J. Ophthalmol., 123: 599–606, 1997; Aksunger et al., Ophthalmologica, 211: 223–5, 1997; Kernova et al., Eur. J. Ophthalmol., 7: 64–67, 19971. Die oben beschriebenen Beobachtungen demonstrieren, dass eine Anzahl von entzündlichen Erkrankungszuständen, einschließlich der Pathologie einer Rückenmarksverletzung, mit der Proliferation, Migration oder physiologischen Aktivität von Zelltypen assoziiert sind, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern.
Behandlung eines Sekundärgewebeschadens und anderer inflammatorischer pathologischer Befunde
Die gegenwärtige Behandlung eines Sekundärgewebeschadens und anderen assoziierten Erkrankungsszuständen und entzündlichen Erkrankungszuständen ist nicht gut entwickelt. Tiermodelle haben gezeigt, dass eine Kolchizinbehandlung die Anzahl von MNPs in beschädigtem Gewebe senkt und hilft, neben der Hemmung der Phagozytose und sekretorischen Funktionen eine Astrogliose und Neovaskularisierung zu blockieren (Giulian et al., J. Neurosci., 9: 4416–29, 1989; Giulian et al., Ann. Neurol., 27: 33–42, 1990 und Giulian et al., J. Neurosci., 13: 29–37, 19931. Aber Kolchizin ist kein selektives Toxin und folglich wird es nicht als ein realisierbares Therapeutikum für die Behandlung von Menschen betrachtet. Gegenwärtige pharmakologische Versuche zur Behandlung von SCI und zur Prävention eines Sekundärgewebeschadens konzentrieren sich auf einzelne biochemische Vorgänge, welche auf der Zellebene auftreten, zum Beispiel die Hemmung der cytotoxischen Wirkungen von exzitatorischen Aminosäuren oder reaktiven Sauerstoffspezies unter Verwendung von NMDA-Antagonisten und freien Radikalfängern (Faden et al., Trends Pharmacol. Sci. 13: 29–35, 1992 und Mclntosh, T. K., J. Neurotrauma, 10: 215–61, 1993). Wenige Arzneimittel haben eine nachhaltige Wirkung auf einen Sekundärgewebeschaden gezeigt. Die Arzneimittel, die gegenwärtig verwendet werden, um einen sekundären Schaden bei SCI zu adressieren, sind das Steroid Methylprednisolon und seine synthetischen 21-Aminosteroid (Lazaroid)-Derivate (zum Beispiel Trisilazad), welche als sauerstofffreie Radikalfänger agieren. Diese Arzneimittel werden verwendet, um die Membranlipidperoxidation zu hemmen. Die unerwünschten Nebeneffekte von Lazaroiden schließen aber wahrscheinlich die Induktion einer Gliose ein, was in einem SCI-Tiermodell beobachtet wurde (Gonzalez-Deniselle et al., Cell Mol. Neurobiol., 16: 61–72, 1996), sowie den Verlust der motorischen und sensorischen Funktion, wie es in Menschen mit penetrierenden Wunden des Rückenmarks beobachtet wurde (Prendergast et al., J. Trauma, 37: 576–9, 1994). Steroide sind auch das therapeutische Medikament der Wahl für die meisten Entzündungserkrankungen, aber deren förderliche Wirkungen werden größtenteils durch die schwächenden Nebeneffekte behindert, so dass eine Langzeitsteroidbehandlung keine durchführbare klinische Option ist. Somit behandelt keine der verfügbaren Therapien diese Erkrankungen und Krankheiten zufriedenstellend.
Folglich gibt es einen Bedarf für einen umfassenderen Zugang zu einer effektiven Behandlung entzündlicher Erkrankungszustände, welche assoziiert sind mit der Proliferation, Migration und/oder physiologischen Aktivität von Zellen, die Entzündungsreaktionen fördern, einschließlich eines Sekundärgewebeschadens, und zur Behandlung eines Sekundärgewebeschadens.
Roby et al. (Oncology Reports Band 3, 1996, S.175–179) beschreibt diese Verbindung von MGSA/GROα mit Daunorubicin und schlägt ihre Verwendung zur Chemotherapie eines Melanoms vor. Insbesondere schlägt Roby et al. die Verwendung von MGSA/GROα zur zielgerichteten Verabreichung eines chemotherapeutischen Agens an Melanamzellen vor, welche Tumorzellen sind. Aber Roby et al. lehrt oder schlägt keine zielgerichtete Lieferung an Leukozyten vor.
WO 95/12414 stellt Konjugate von PF4 mit einem Cytotoxin zur Behandlung von angiogenen Erkrankungen bereit, durch Ansteuern von Endothelzellen durch ein Toxin, wobei vermutlich eine eine unerwünschte Angiogenese gehemmt wird. Aber WO 95/12414 schlägt nicht die Verwendung von Chemokinen für eine Steuerung von Agenzien hin zu aktivierten Leukozyten oder anderen Immuneffektorzellen vor.
Deshalb liegt hierin eine Aufgabe vor, Zusammensetzungen für solche Behandlungen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung werden Konjugate bereitgestellt, wie sie in Anspruch 65 aufgezählt sind. Ebenso werden Verwendungen bereitgestellt, wie sie in den Ansprüchen 1, 55, 61 aufgezählt werden. Insbesondere werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt für eine Behandlung von Erkrankungszuständen, die assoziiert sind mit der Aktivierung, Proliferation und Migration vom Immuneffektorzellen, einschließlich Zellen, die einen Sekundärgewebeschaden fördern. Insbesondere sind die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen für eine Behandlung dieser Erkrankungszustände durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines therapeutischen Agens, welche die Aktivierung, Proliferation und/oder Migration dieser angesteuerten Immuneffektorzellen hemmt. Bevorzugt ist das therapeutische Agens für solche Zellen direkt toxisch. Angesteuerte Immuneffektorzellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf mononukleäre Phagozyten (MNPs) wie etwa dendritische, Mikroglia-, Monozyten- und Makrophagenzellen; Leukoten wie etwa Basophile, Neutrophile und Eosinophile; und Lymphozyten wie etwa natürliche Killerzellen und T- und B-Lymphozyten.
Ebenso werden therapeutische Agenzien bereitgestellt, welche in diesen Verfahren verwendet werden können. Diese Agenzien sind Ligand-Toxin-Konjugate, enthaltend ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientiertes Agens. Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens steuert Zellen an, welche Chemokinrezeptoren exprimieren. Solche Zellen schließen Immuneffektorzellen ein, die in Entzündungsreaktionen involviert sind, einschließlich Zellen, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern. In einer Ausführungs form schließt das chimäre Ligand-Toxin ein Zelltoxin und einen Proteinligandenanteil oder ein biologisch funktionelles Fragment davon ein, wie etwa ein Chemokin oder ein Nichtchemokin-Zytokin, das für einen oder mehrere Zellen spezifisch ist, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern. Es werden auch die Konjugate bereitgestellt, welche ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens enthalten.
Es werden Konjugate bereitgestellt, welche ein oder mehrere Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien enthalten, die entweder direkt oder über einen Linker mit einem oder mehreren zielorientierten Agenzien verbunden sind. Insbesondere werden hierin Konjugate bereitgestellt, welche die folgenden Bestandteile enthalten: (Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens), (L)_q und (zielorientiertes Agens)_m, worin mindestens ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, wie etwa ein Chemokinpeptid oder ein Chemokinrezeptorspezifischer Antikörper oder ein wirksamer Anteil davon, direkt oder durch einen oder mehrere Linker (L) an mindestens ein zielgerichtetes Agens gebunden ist. L bezieht sich auf einen Linker. Jede geeignete Verbindung unter den Elementen des Konjugats wird in Erwägung gezogen, solange die sich daraus ergebenden Konjugate mit einem angesteuerten Rezeptor wechselwirken, so dass eine Internalisierung eines assoziierten zielorientierten Agens bewirkt wird. Außer einem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens können diese Konjugate auch ein Nichtchemokin-Zytokin enthalten. Solche Nichtchemokin-Zytokine sind im Allgemeinen ausgewählt aus denjenigen, welche an Immuneffektorzellen binden, insbesondere an die Leukozytenpopulationen, an welche eine Chemokinart bindet.
Die Variablen n und m sind ganze Zahlen von 1 oder größer und q ist 0 oder irgendeine ganze Zahl. Die Variablen n, q und m sind so ausgewählt, dass das resultierende Konjugat mit dem angesteuerten Rezeptor wechselwirkt und ein zielorientiertes Agens von einer Zelle internalisiert wird, auf die es gerichtet worden ist. Normalerweise ist n zwischen 1 und 3; q ist 0 oder mehr, in Abhängigkeit von der Anzahl der gebundenen Ansteuerungs- und zielorientierten Agenzien und/oder Funktionen des Linkers, q ist im Allgemeinen 1 bis 4; m ist 1 oder mehr, im Allgemeinen 1 oder 2. Wenn in einem Konjugat mehr als ein zielorientiertes Agens vorhanden ist, können die zielorientierten Agenzien gleich oder verschieden sein. Wenn mehr als ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens in den Konjugaten vorliegt, können sie ebenso gleich oder verschieden sein.
Die hierin bereitgestellten Konjugate können als Fusionsproteine hergestellt werden, können chemisch gekoppelt werden oder einen Fusionsproteinanteil und einen chemisch gebundenen Anteil oder jegliche Kombination davon einschließen. Für die vorliegenden Zwecke ist das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens irgendein Agens, normalerweise ein Polypeptid, welches spezifisch mit einem Chemokinrezeptor wechselwirkt, wie etwa diejenigen auf Leukozyten, und welches während des Wechselwirkens mit dem Rezeptor ein gebundenes oder auf andere Art und Weise assoziiertes zielorientiertes Agens internalisiert, wie etwa ein cytotoxisches Agens oder ein anderes therapeutisches Produkt, welches von der angesteuerten Zelle internalisiert werden soll. Die gegenwärtig bevorzugten Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in Tabelle 1 unten aufgeführt sind. Die hierin bereitgestellten Konjugate machen sich die beschränkte Verteilung von Chemokinrezeptoren und deren Lokalisierung auf Zellen zunutze, welche mit Entzündungsreaktionen verbunden sind, insbesondere diejenigen, die mit einem Sekundärgewebeschaden assoziiert sind, und mit pathologischen Reaktionen, die mit bestimmten Erkrankungszuständen assoziiert sind. Die Vorteile der hierin bereitgestellten Konjugate schließen eine Selektion der Chemokine und anderer solcher Agenzien, wie den Ansteuerungsagenzien ein, welche an relativ kleine Zellpopulationen binden, die mit inflammatorischen Erkrankungen oder inflammatorischen Prozessen assoziiert sind. Wegen der Verteilung und Spezifität solcher Rezeptoren auf solchen Zellpopulationen können die Konjugate verwendet werden, um eine zielgerichtete Lieferung jedes gebundenen Agens einschließlich toxischer Agenzien an ausgewählte Zellen und Gewebe bereitzustellen, um den Tod der Zellen zu bewirken, eine Proliferation zu hemmen oder das Überleben von angesteuerten Zellen zu verstärken oder zu unterstützen. Es ist verständlich, dass die obige Beschreibung nicht die Reihenfolge darstellt, in der jeder Bestandteil gebunden wird, oder die Art und Weise, in der jeder Bestandteil gebunden ist. Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientierte Agens (oder der Linker und das zielorientierte Agens) können in jeglicher Reihenfolge und durch jede geeignete Bindung gebunden werden, solange das resultierende Konjugat an einen Rezeptor bindet, an den ein Chemokin bindet und das zielorientierte Agens/die zielorientierten Agenzien in Zellen internalisiert, welche den Rezeptor tragen. Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ist normalerweise ein Polypeptid und es kann an das zielorientierte Agens oder den Linker bei oder nahe seinem N-Terminus oder bei oder nahe seinem C-Terminus oder an jeder inneren Stelle gebunden sein. Gegenwärtig sind Konjugate bevorzugt, in denen das zielorientierte Agens entweder direkt oder durch einen Linker an oder nahe des Amino-Terminus des Chemokins gebunden ist, bevorzugt innerhalb von etwa 20, bevorzugt 10 Aminosäuren des Amino-Terminus des Chemokins. Ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens kann an mehr als ein zielorientiertes Agens gebunden sein; alternativ können mehr als ein zielgerichtetes Agens an mehr als ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens gebunden sein. Wenn vielfältige Ansteuerungsagenzien und/oder zielorientierte Agenzien gebunden sind, können sie gleich oder verschieden sein. Wenn ein Chemokin ein Ansteuerungsagens ist, ist das zielgerichtete Agens bevorzugt an den C-Terminus des Chemokins gebunden.
Es werden Konjugate bereitgestellt, welche eine Vielfalt von Ansteuerungsagenzien und/oder zielorientierten Agenzien enthalten. Konjugate, welche eine Vielfalt, im Allgemeinen mindestens zwei Chemokine ansteuernde Agenzien enthalten, die an ein oder mehr zielorientierte Agenzien gebunden sind, werden somit auch bereitgestellt. Diese Konjugate, weiche mehrere Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien und zielorientierte Agenzien enthalten, können hergestellt werden durch Verbindung mehrfacher Kopien einer Nukleinsäure, die für das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens als ein Fusionsprotein codiert, bevorzugt Kopf an Kopf und/oder Schwanz and Schwanz, unter der Transkriptionskontrolle einer einzelnen Promotorregion. Es werden zum Beispiel (siehe zum Beispiel 1) Fusionsproteine bereitgestellt, in denen ein Toxin an seinem Aminoterminus an den Carboxyterminus eines Chemokinanteils gebunden ist, dargestellt durch die Formel: Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens – Linker – Toxin. Ebenso werden zum Beispiel Fusionsproteine bereitgestellt, in denen ein Toxin an seinem Aminoterminus und an seinem Carboxyterminus an den Carboxyterminus eines Chemokinrezeptors-Ansteuerungsagens gebunden ist. Die zwei Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien können gleich oder verschieden sein. Diese Fusionsproteine werden durch die Formel dargestellt: Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens – Linker - Toxin – Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens. Konjugate, die ein oder zwei Chemokinrezeptor bindende Proteine enthalten, sind gegenwärtig bevorzugt. Wenn ein zweites Chemokinrezeptor bindendes Protein verwendet wird, ist es über seinen Carboxyterminus mit dem unbesetzten Terminus des Toxins verbunden. Andere Kombinationen der Elemente, in denen ein oder eine Vielzahl von Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien an ein oder eine Vielzahl von zielorientierten Agenzien verbunden sind, werden bereitgestellt. Wie oben angemerkt, können die Konjugate weiterhin ein Nichtchemokin-Zytokin einschließen.
Die Konjugate können durch eine chemische Konjugation oder durch Expression von Fusionsproteinen hergestellt werden, in denen zum Beispiel DNA, die für ein zielorientiertes Agens wie etwa ein Ribosomen inaktivierendes Protein (RIP) codiert, mit oder ohne eine Linkerregion an DNA gebunden ist, die für ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens codiert. Die Konjugate können auch durch chemische Bindung hergestellt werden, normalerweise durch Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten, die in den Bestandteilen vorliegen oder zu den Bestandteilen angefügt werden, oder durch Aminbindungen oder anderen geeignete Bindungen. Ionische oder andere Bindungen sind auch eingeschlossen. Konjugate der Form zielorientiertes Agens – (L)_q - Chemokinrezeptor bindender Anteil – ILI_q- Chemokinrezeptor bindender Anteil sind von besonderem Interesse.
Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ist jedes Agens, welches spezifisch an einen Rezeptor bindet, an den Chemokine spezifisch binden. Diese Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Chemokine, Antikörper und Fragmente von Chemokinen und Antikörpern, welche die Fähigkeit behalten, mit dem Rezeptor wechselzuwirken und eine Internalisierung eines assoziierten oder verbundenen zielorientierten Agens zu bewirken. Diese Agenzien schließen nicht Nichtchemokin-Zytokine ein, wie etwa IL-4, CSFs und andere Zytokine, welche normalerweise nicht spezifisch an Chemokinrezeptoren binden. Wenn Antikörper die Ansteuerungsagenzien sind, sind die Antikörper ausgewählt unter denjenigen, die für Chemokinrezeptoren spezifisch sind, und bevorzugt unter denjenigen, welche einer Bindung eines Chemokins an einen Chemokinrezeptor entgegenwirken, wobei sie nicht nur der Internalisierung gebundener Agenzien dienen, sondern auch kompetitiv die Bindung eines Chemokins hemmen.
Das zielorientierte Agens ist jedes Agens, für das eine gezielte Lieferung an eine ausgewählte Zellpopulation oder ein Gewebe erwünscht ist. Diese Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ein cytotoxisches Agens, insbesondere Ribosomen interaktivierende Proteine (RIPs), DNA- und RNA-Nukleasen, einschließlich bestimmter RIPs und Bakteriozine, wie etwa die Colicine von E. coli, und andere Toxine, oder eine Nukleinsäure, oder ein Arzneimittel, wie etwa Methotrexat, beabsichtigt für eine Internalisierung durch eine Zelle, welche einen Rezeptor exprimiert, an den ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens bindet, und ein gebundenes oder assoziiertes zielorientiertes Agens internalisiert, jegliches Molekül, das, wenn es internalisiert wird, den Metabolismus oder die Genexpression in der Zelle verändert, die Proteinsynthese reguliert oder verändert, die Proliferation hemmt oder die Zelle tötet. Andere solche Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf lichtaktivierte Porphyrine und Antisense-Nukleinsäuren, welche zu einer Hemmung des Wachstums oder dem Zelltod führen; und Antisense-RNA, DNA und trunkierte Proteine, welche die Genexpression durch Interaktionen mit der DNA oder durch Cosuppression oder einen anderen Mechanismus verändern. In bestimmten Ausführungsformen ist das cytotoxische Agens ein Ribosomen-inaktivierendes Protein (RIP), wie etwa beispielsweise Saporin, Ricin, Shigatoxin, obwohl andere cytotoxische Agenzien auch in vorteilhafter Art und Weise verwendet werden können. Somit ist das zielgerichtete Agens jedes Agens, das vorgesehen ist für eine Internalisierung durch eine ausgewählte Zelle, welche einen Rezeptor exprimiert, mit dem ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens wechselwirkt, normalerweise bindet, und bei einer solchen Wechselwirkung die Internalisierung des gebundenen oder assoziierten zielorientierten Agens bewirkt.
Die zielorientierten Agenzien können auch modifiziert werden, um sie für eine Konjugation mit dem Linker und/oder einem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens geeigneter zu machen oder um ihre intrazelluläre Aktivität zu erhöhen. Solche Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das Einbringen eins Cys-Restes an oder nahe dem N-Terminus oder C-Terminus, eine Derivatisierung zum Einzubringen reaktiver Gruppen, wie etwa Thiolgruppen, und eine Addition von Sortiersignalen wie etwa (XaaAspGIuLeu)_n (SEQ ID NO.68, wobei Xaa Lys oder Arg ist, bevorzugt Lys, und n 1 bis 6 ist, bevorzugt 1 bis 3, bevorzugt am Carboxyterminus (siehe zum Beispiel Seetharam et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17376–17381 und Buchner et al. (1992) Anal. Biochem. 205: 263–270), welche das zielorientierte Agens zum endoplasmatischen Retikulum lenken.
Der Linker ist ein Peptid oder ein Nichtpeptid und kann ausgewählt werden, um die sterische Behinderung zu erleichtern oder zu verringern, die durch die Nähe des zielgerichteten Agens zum Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens verursacht wird, und/oder andere Eigenschaften des Konjugats zu verbessern oder zu verändern, wie etwa die Spezifität, Toxizität, Löslichkeit, Serumstabilität und/oder intrazelluläre Verfügbarkeit des zielgerichteten Anteils und/oder um die Flexibilität der Bindung zwischen dem Polypeptid des Chemokinrezeptor bindenden Anteils und dem zielorientierten Agens zu erhöhen oder die sterische Behinderung zu verringern.
Wenn Fusionsproteine in Betracht gezogen werden, wird der Linker so ausgewählt, dass das resultierende Nuklein für ein Fusionsprotein codiert, welches an Zellen bindet und von Zellen internalisiert wird, welche einen Chemokinrezeptor exprimieren, und das ganze oder ein Teil des internalisierten Proteins bevorzugt zum Cytoplasma geleitet wird. Es wird auch in Betracht gezogen, dass mehrere Linker in Reihenfolge verbunden werden können, um die vorteilhaften Eigenschaften jedes Linkers anzuwenden. In einem solchen Fall kann der Linkeranteil des Konjugats mehr als 50 Aminosäurereste enthalten. Die Anzahl der Reste ist nicht wichtig, solange das resultierende Fusionsprotein an einen Chemokinrezeptor bindet und das gebundene zielorientierte Agens über einen Weg internalisiert, der das zielorientierte Agens zum Cytoplasma und/oder Nukleus leitet.
Mehr bevorzugte Linker sind diejenigen, die in Fusionsproteine eingefügt werden können und in einer Wirtszelle, wie etwa E. coli exprimiert werden können. Solche Linker schließen ein: Enzymsubstrate, wie etwa Kathepsin-B-Substrat, Kathepsin-D-Substrat, Trypsinsubstrat, Thrombinsubstrat, Subtilisinsubstrat, Faktor-Xa-Substrat und Enterokinasesubstrat; Linker, welche die Löslichkeit, Flexibilität und/oder intrazelluläre Spaltbarkeit erhöhen, schließen Linker ein wie etwa (gly_mser)_n und (ser_mgly)_n, worin m 1 bis 6 ist, bevorzugt 1 bis 4, mehr bevorzugt 2 bis 4 und n 1 bis 6 ist, bevorzugt 1 bis 4, mehr bevorzugt 2 bis 4 (siehe zum Beispiel die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/06641, welche beispielhafte Linker für eine Verwendung in Konjugaten bereitstellt). In einigen Ausführungsformen können mehrere Linker enthalten sein, um den Vorteil der wünschenswerten Eigenschaften jedes Linkers zu nutzen.
Konjugate, in denen die Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien, wie etwa Chemokine, modifiziert worden sind, wie etwa durch Eliminierung eines oder mehrerer Cysteinreste, werden auch bereitgestellt. Im Allgemeinen sind die konservierten Cysteine nahe den N-Termini von Zytokinen für eine Wirkung wichtig; andere Cysteine können ersetzt werden. Es muss dafür gesorgt werden, dass eine Veränderung der Spezifität des resultierenden modifizierten Chemokins vermieden wird, solange eine solche Veränderung nicht erwünscht ist. In allen Fällen können bestimmte Modifikationen empirisch bestimmt werden.
Zusammensetzungen, die solche Konjugate enthalten, sollten eine verringerte Aggregation aufweisen. Es werden auch Konjugate bereitgestellt, in denen der Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteil und/oder das zielorientierte Agens modifiziert worden sind durch Addition eines Cysteins (Cys)3 an oder nahe einem Terminus, welches durch chemische Verfahren an einen Linker oder ein zielorientiertes Agens gebunden ist.
Es werden Verfahren zur Herstellung der Konjugate bereitgestellt. Diese Verfahren schließen chemische Konjugationsverfahren ein und Verfahren, welche von einer rekombinanten Herstellung der Konjugate abhängen. Die chemischen Verfahren beruhen auf der Derivatisierung des zielorientierten Agens mit dem gewünschten Bindungsagens, und dann auf der Reaktion mit einem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens. Die chemischen Verfahren zur Derivatisierung sind besonders nützlich zur Bindung eines Proteins eines Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteils an DNA oder RNA, und zur Herstellung von Konjugaten der Form zielorientiertes Agens – (L)_q – Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens. Beim Praktizieren des chemischen Verfahrens wird ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, welches durch jegliches Mittel hergestellt wird, normalerweise durch Expression von DNA in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirt, mit dem zielorientierten Agens chemisch gekoppelt. Wenn das Ansteuerungsagens oder zielorientierte Agens keine geeigneten Anteile zum Bewirken einer chemischen Bindung enthält, kann es derivatisiert werden. Zum Beispiel kann das Agens, wie etwa Shigatoxin, Gelonin oder ein anderes solches Agens derivatisiert werden etwa durch Reaktion mit einem Bindungsagens, wie etwa N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP). In anderen Ausführungsformen wird das zielorientierte Agens, wie etwa eine Shiga-A-Kette, an oder nahe dem N-Terminus modifiziert, um einen Cysteinrest einzuschließen, so dass das resultierende modifizierte Agens mit dem Protein des Chemokinrezeptor-Bindungsanteils ohne eine weitere Derivatisierung reagieren kann.
Das rekombinante Verfahren der Herstellung von Konjugaten beruht auf der Expression einer Nukleinsäure, welche für ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenspeptid codiert, gebunden an ein Nuklein, das für einen Linker codiert, oder in Fällen, in denen das zielorientierte Agens ein Protein oder Polypeptid ist, eine Nukleinsäure, die für ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens codiert, gebunden entweder direkt oder über eine Nukleinsäure, die für einen Linker codiert, an eine Nukleinsäure, die für ein zielorientiertes Agens codiert. Beim Einbringen in einen geeigneten Wirt und Expression der Nukleinsäure wird das Polypeptid des Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens mit Linker oder das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, gebunden über einen Linker oder direkt an ein zielorientiertes Polypeptid oder ein Polypeptidagens exprimiert. Die Kombination von Chemokinrezeptor-Ansteuerungsprotein, Linker und gebundenem Agens, oder jeglicher Untergruppe oder Variation davon, wird unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken als eine Chimäre hergestellt. Das Fusionsproteinmolekül wird auf eine solche Art und Weise entworfen und hergestellt, dass der Anteil des Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens für eine Erkennung seines entsprechenden Zelloberflächenrezeptors verfügbar ist und das Konjugat zu Zellen lenken kann, die solch einen Zelloberflächenrezeptor tragen, und die Internalisierung von jedem gebundenen oder assoziierten zielorientierten Agens bewirken kann. Wenn eine rekombinante Expression angewendet wird, insbesondere, wenn bakterielle Wirte verwendet werden, ist die bevorzugte Form der Konjugate Chemokin-Ansteuerungsagens – (L)zielorientiertes Agens (das heißt Ligand- gegebenenfalls Linker – Toxin), worin das zielorientierte Agens an den C-Terminus eines Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens gebunden ist, mit oder ohne andere Linkeranteile, und mit oder ohne einen oder mehrere zusätzliche Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien, gebunden an das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und/oder das zielorientierte Agens. In einer beispielhaften Ausführungsform hat ein Konjugat mit einer Vielzahl von Chemokin-Ansteuerungsagenzien und/oder zielorientierten Agenzien die Form N – Ligand – C – (gegebenenfalls Linker) – N – zielorientiertes Agens – C-(gegebenenfalls Linker) – C – Ligand – N, wobei N und C die Aminotermini bzw. Carboxytermini eines Polypeptids bezeichnen, und der Ligand sich auf das Chemokin-Ansteuerungsagens bezieht.
Die hierin bereitgestellten, resultierenden Konjugate können in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Verfahren der Behandlung verwendet werden. Bevorzugte zu behandelnde Erkrankungen sind pathophysiologische Entzündungsbedingungen. Bei solchen Bedingungen werden die Konjugate mittels des gebundenen Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens auf Zellen gerichtet, welche ausgewählte Chemokinrezeptoren tragen. Wenn ein cytotoxischer Anteil gerichtet wird, resultiert die Internalisierung des Konjugats in einer Hemmung der Proliferation oder dem Tod der Zellen. Solche pathophysiologischen Bedingungen schließen beispielsweise Leukozyten ein, die mit einem Sekundärgewebeschaden im Zusammenhang stehen, Leukozyten, die festen Tumoren im Zusammenhang stehen und Leukozyten und Zellen, die mit anderen unerwünschten Entzündungsreaktionen im Zusammenhang stehen. Insbesondere kann ein Sekundärgewebeschaden und damit verbundene Erkrankungszustände behandelt werden durch Verabreichung einer wirksamen Menge der hierin bereitgestellten Konjugate, welche die Proliferation, Migration oder physiologische Aktivität von Zellen hemmen, die einen Sekundärgewebeschaden fördern, wie etwa mononukleäre Phagozyten (MNP), Leukozyten, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen und T- und B-Lymphozyten an ein Objekt, welches einen Bedarf daran hat. Hierin bereitgestellte Konjugate können entworfen werden, um für solche Zellen und spezifisch für einen G-Protein-gekoppelten Rhodopsin-ähnlichen Rezeptor mit 7 Transmembrandomänen, insbesondere einen ausgewählten Chemokinrezeptor auf der Oberfläche solcher Zellen direkt toxisch zu sein. Die Konjugate binden an diese Rezeptoren und werden von den angesteuerten Zellen aufgenommen. Wenn es einmal im Innern der Zellen ist, kann das therapeutische Agens normale zelluläre Aktivitäten stören und dabei die biologischen Aktivitäten solcher Zellen unterdrücken, oder den Zelltod verursachen. Es werden Verfahren zur Behandlung unter Verwendung solcher Konjugate bereitgestellt.
Die Behandlung wird bewirkt durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Konjugats, zum Beispiel in einem physiologisch akzeptablen Träger. Die Konjugate können auch in Verfahren der Gentherapie verwendet werden, um an Zellen, welche Chemokinrezeptoren tragen, Nukleinsäure zu liefern, welche für korrekte Kopien von defekten Genen oder therapeutische Agenzien wie etwa TNF codiert.
Ein typisches Konjugat ist ein Fusionsprotein, enthaltend einen Rezeptor bindenden Ligandenanteil, verbunden mit einem zellulären Toxin über einen Peptidlinker. Der Ligand kann an entweder an den Carboxy- oder den Aminoterminus des Toxins angeheftet sein. Bei Bindung an den geeigneten Zelloberflächenrezeptor wird das Fusionsprotein internalisiert, und der Toxinanteil wird enzymatisch freigesetzt, um die Wirtszelle zu töten. Das Fusionsprotein muss die intrazelluläre Domäne erreichen, um eine Cytotoxizität aufzuweisen, und das freie Toxin besitzt keine inhärente funktionelle Kapazität, um die Zellmembran zu durchqueren.
Die Erkrankungszustände, die für eine Behandlung unter Verwendung der hierin bereitgestellten Verfahren und Konjugate geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eine ZNS-Verletzung, ZNS-Entzündungserkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, entzündliche Augenerkrankungen, entzündliche Darmerkrankungen, entzündliche Gelenkerkrankungen, entzündliche Nierenerkrankungen oder Nierenleiden, entzündliche Lungenerkrankungen, entzündliche Nasenerkrankungen, entzündliche Schilddrüsenerkrankungen, Zytokin-regulierte Krebsarten. Die Behandlung einer Rückenmarksverletzung und -trauma sind von besonderem Interesse.
In einem Aspekt der Zusammensetzungen und deren therapeutischen Verwendungen, die hierin bereitgestellt sind, sind die verwendeten therapeutischen Agenzien entsprechend chimäre Ligand-Toxine, welche einen proteinartigen Ligandenanteil enthalten, wie etwa ein Chemokin, Interleukin, Lymphokin, Monokin, Kolonie stimulierenden Faktor oder Rezeptor-assoziiertes Protein, welche die in Betracht gezogenen Rezeptoren spezifisch erkennen, gebunden an ein Zelltoxin, wie etwa ein DNA-spaltendes Agens, ein Antimetabolit oder ein proteinartiges Zelltoxin, zum Beispiel ein bakterielles, Pflanzen-, Insekten-, Schlange- oder Spinnentoxin. Die chimären Ligand-Toxine sind formuliert für ausgewählte Verabreichungsarten einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine topische, intraartikuläre, intrazisternale, intraokulare, intraventrikulare, intrathekale, intravenöse, intramuskuläre, intratracheale, intraperitoneale und intradermale Verabreichung.
Somit werden hierin Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens-Toxin-Konjugate bereitgestellt, hierin als Chemokin-Toxin-Konjugate bezeichnet, wobei der Ligandenanteil bevorzugt ein Chemokin oder ein biologisch aktives Fragment davon ist, welches an ein zielorientiertes Agens gebunden ist, das bevorzugt ein Zelltoxin ist. Das Konjugat kann zum Beispiel ein Fusionsprotein sein mit einem Chemokinliganden, der an ein proteinartiges Zelltoxin gebunden ist durch einen Polypeptidlinker mit einer Größe, die so gewählt ist, dass das Konjugat mit dem ausgewählten Rezeptor wechselwirkt und eine Internalisierung des gebundenen zielorientierten Agens bewirkt. Wenn es ein Peptid ist, besteht solch ein Linker normalerweise aus etwa 2 bis etwa 60 Aminosäureresten.
In den Verfahren hierin können auch Konjugate von Nichtchemokin-Zytokinen verwendet werden. Diese Nichtchemokin-Zytokine sind ausgewählt aus denjenigen, welche an Rezeptoren binden, die auf Zellen wie etwa Leukozyten vorliegen, welche in die unerwünschten Entzündungsreaktionen, wie etwa einen Sekundärgewebeschaden, verwickelt sind, für welche eine Behandlung hierin beabsichtigt ist.
Außerdem können die Konjugate, welche die Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien enthalten, in Kombination mit anderen Therapien für die Entzündungsreaktion und/oder die zugrundeliegende Erkrankung verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein hierin bereitgestelltes Konjugat, welches Leukozyten ansteuert, welche Tumoren infiltrieren, in Kombination mit einem Konjugat verabreicht werden, wie etwa einem IL-4-Toxinkonjugat, welches die Tumoren behandelt. Eine Kombinationstherapie kann gleichzeitig, nacheinander oder mit Unterbrechungen durchgeführt werden.
Die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren therapeutische Verwendungen besitzen zahlreiche Vorteile, unter diesen ist der Vorteil, dass das Zelltoxin spezifisch auf die Zellen gerichtet wird, die für entzündliche Erkrankungszustände wie etwa einen Sekundärgewebeschaden, verantwortlich sind, wobei der Schaden und die Toxizität für nicht betroffene Zellen minimiert wird. Da die Zusammensetzungen lokal und spezifisch verabreicht werden können, kann eine höhere und wirksamere Konzentration des Zelltoxins in der zu behandelnden Region erreicht werden als durch eine systemische Verabreichung eines Zelltoxins.
Wie oben erwähnt, können die hierin bereitgestellten Konjugate auch verwendet werden, um andere Agenzien an Zellen zu liefern, welche Chemokinrezeptoren oder Rezeptoren exprimieren, an die Chemokine selektiv binden, und die Internalisierung von assoziierten Agenzien zu bewirken oder zu erleichtern.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Abbildung, die ein hierin bereitgestelltes Fusionsprotein zeigt, in dem der "Ligand" ein proteinartiger Ligand ist, ausgewählt aus einer der Aminosäuresequenzen der in Tabelle 3 aufgezählten Arten, der "Linker" ein proteinartiger Linkeranteil mit der Aminosäuresequenz Ala-Met ist oder ausgewählt ist aus einem Polypeptid wie diejenigen, die hierin als SEQ ID NOS: 1–12 offenbart sind (siehe auch die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/06641, welche beispielhafte Linker zur Verwendung in Konjugaten bereitstellt), und das "Toxin" ein proteinartiges Zelltoxin ist, wie etwa eines der Zelltoxine, deren Aminosäuresequenz in Tabelle 4 aufgelistet ist.
2 ist eine schematische Karte eines beispielhaften Plasmids mit der Bezeichnung pGEMEX-SAP, das für ein Saporin codiert, das in ein pGEMEX-Vektorfusionsprotein kloniert ist, wie es in den Beispielen beschrieben wird.
3 ist eine schematische Karte eines Konjugats MCP-3-AM-Shiga-A1, kloniert in einen pGEMEX-Vektor, wie es in den Beispielen beschrieben wird.
4 ist eine schematische Karte eines Konjugats MCP-1-AM-SAP, kloniert in einen pET11c-Vektor (siehe Beispiele und Tabelle 6).
5 ist eine schematische Karte eines Konjugats MCP3-AM-Shiga-A1, kloniert in einen pET11 c-Vektor (siehe Beispiele und Tabelle 6).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung Inhalt
A. Definitionen
B. Die Entzündungsreaktion
C. Bestandteile der Konjugate

1. Zusammenfassung
2. Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteile a. Chemokine b. Selektion eines Chemokins c. Nichtchemokin-Zytokine d. Antikörper-Ligandanteile
3. Zielorientierte Agenzien a. Zelltoxinanteile (1) DNA-spaltende Agenzien (2) Antimetaboliten (3) Proteinartige Zelltoxine (4) Bakterielle Toxine (5) Porphyrine und andere lichtaktivierte Toxine b. Nukleinsäuren für eine zielgerichtete Verabreichung (1) Antisense-Nukleotide einschließlich: Antisense-Oligonukleotide; Triplexmoleküle; Dumbbell-Oligonukleotide; DNA; extrazelluläre proteinbindende Oligonukleotide und kleine Nukleotidmoleküle (2) Ribozyme (3) Nukleinsäuren, codierend für therapeutische Produkte zur gezielten Verabreichung (4) Kopplung der Nukleinsäuren an Proteine
4. Linkeranteile a. Heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien b. Säurespaltbare, photospaltbare und wärmesensitive Linker c. Andere Linker d. Peptidlinke

D. Herstellung von Konjugaten

1. Herstellung von Fusionsproteinen a. Plasmide und Wirtszellen zur Expression von Konstrukten, die für Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenspeptide, Konjugate, Linker, Fusionsproteine und Peptid ansteuernde Agenzien codieren b. Klonierung und Expression eines Chimären Ligand-Toxin-Fusionsproteins c. Konstruktion und Expression von beispielhaften Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens-Toxin-Fusionsgenen
2. Herstellung von chemischen Konjugaten

E. Tiermodelle zur Untersuchung von Konjugaten
F. Formulierung und Verabreichung von Zusammensetzungen, welche die Konjugate enthalten
G. Erkrankungszustände, die mit der Entzündungsreaktion und einem Sekundärgewebeschaden assoziiert sind
A. Definitionen
Solange es nicht anders definiert ist, besitzen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Fachmann des Fachgebiets, zu dem das hierin beschriebene Thema gehört, gewöhnlich verstanden wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Konjugat auf die hierin bereitgestellten Verbindungen, welche einen oder mehrere Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien (hierin auch als ein Chemokinrezeptor-Bindungsagens bezeichnet) und ein zielorientiertes Agens enthalten. Diese Konjugate werden hierin auch als Chemokin-Toxine bezeichnet und schließen diejenigen ein, die durch rekombinante Mittel als Fusionsproteine erzeugt werden, diejenigen, die durch chemische Mittel erzeugt werden und diejenigen, die durch jedes andere Verfahren erzeugt werden, wobei mindestens ein Chemokinrezeptor-Bindungsanteil direkt oder indirekt mit einem zielorientierten Agens verbunden ist, wobei das zielorientierte Agens beim Binden an einen Chemokinrezeptor in die angesteuerte Zelle internalisiert wird. Folglich bezieht sich ein Konjugat auf ein Molekül, das mindestens einen Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteil und mindestens ein zielorientiertes Agens enthält, welche direkt oder über einen Linker verbunden sind, und welche hergestellt werden durch chemische Kopplungsverfahren oder durch eine rekombinante Expression von Chimären Nukleinsäuremolekülen zur Produktion von Fusionsproteinen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens auf jedes Molekül oder jeden Liganden, der spezifisch an einen Chemokinrezeptor auf einer Zelle bindet und eine Internalisierung eines gebundenen oder anders assoziierten zielorientierten Agens bewirkt. Chemokinrezeptorbindungsanteile schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf jedes Polypeptid, das an ein Zelloberflächenprotein binden kann, auf welches ein Chemokin gerichtet sein würde und das die Internalisierung eines Ligandenthaltenden Fusionsproteins in die Zelle erleichtern kann. Solche Liganden schließen Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Fragmente davon, Hormone, Chemokine, Antikörper, die spezifisch an Chemokinrezeptoren binden und eine Internalisierung von jedem gebundenen zielorientierten Agens bewirken, und Fragmente von Chemokinen oder Antikörpern, welche dieses erreichen, ein. Die Identifizierung von Fragmenten oder Teilen von Antikörpern, welche bei der Bindung an Rezeptoren und der Internalisierung gebundener zielorientierter Agenzien wirksam sind, kann empirisch durchgeführt werden, zum Beispiel durch Testen eines Fragments, das an ein cytotoxisches Agens gebunden ist und durch Untersuchung des Zelltods unter Verwendung irgendeines Assays dafür, der hierin beschrieben ist oder Fachleuten bekannt ist. Folglich schließt ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens alle die Peptide ein, die als Chemokine charakterisiert und bezeichnet sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf hierin beschriebene Klassen und trunkierte Versionen und Teile davon, welche ausreichend sind, um ein gebundenes zielorientiertes Agens auf einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Protein zu richten, an das das Peptid mit voller Länge spezifisch bindet, und eine Internalisierung durch die Zelle, auf der der Rezeptor oder das Protein vorliegt, zu erleichtern oder zu ermöglichen.
Wie hierin verwendet, soll der Bezug auf Chemokine die Chemolockstoff(chemotaktischen) Zytokine umfassen, welche an Chemokinrezeptoren binden, und Proteine einschließen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden, ebenso wie solche, die synthetisch hergestellt werden, etwa durch rekombinante Mittel oder durch chemische Synthese. Beispielhafte Chemokine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf IL-8, GCP-2, GRO-α, GRO-β, GRP-γ, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, PF4, IP-10, SDF-1α, SDF-1 β, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1-α, MIP-1 β, MIP-1 γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, Tim-1, Eotaxin-1, Eotaxin-2, I-309, SCYA17, TARC, RANTES, DC-CK-1, Lymphotactin, ALP, Lungkin und Fraktalkin, und andere, welche Fachleuten bekannt sind.
Chemokine umfassen auch Muteine von Chemokinen, welche die Fähigkeit besitzen, ein gebundenes zielorientiertes Agens auf Chemokinrezeptor tragende Zellen zu richten. Muteine von Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien kommen für eine Verwendung in den Konjugaten auch in Frage. Solche Muteine werden konservative Aminosäureveränderungen besitzen, wie etwa diejenigen, die unten in der folgenden Tabelle angeführt sind. Nukleinsäuren, die für solche Muteine codieren, werden, solange sie nicht durch Ersetzen von degenerierten Codons modifiziert sind, unter Bedingungen einer zumindest geringen Stringenz an DNA, im Allgemeinen einer hohen Stringenz an DNA hybridisieren, die für ein Wildtypprotein codiert. Muteine und Modifikationen der Proteine schließen auch ein, sind aber nicht beschränkt auf kleinere allelische oder Speziesvariationen und Insertionen oder Deletionen von Resten, insbesondere Cysteinresten. Geeignete konservative Substitutionen von Aminosäuren sind Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt und können im Allgemeinen durchgeführt werden, ohne die biologische Aktivität des resultierenden Moleküls zu verändern. Fachleute erkennen, dass im Allgemeinen einzelne Aminosäuresubstitutionen in nicht essentiellen Regionen eines Polypeptids die biologische Aktivität nicht wesentlich verändern (siehe zum Beispiel Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4.

Ausgabe, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., S. 224). Solche Substitutionen werden bevorzugt durchgeführt in Übereinstimmung mit denjenigen, die wie folgt dargestellt sind:

Originaler Rest	Konservative Substitution
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn (N)	Gln; His
Cys (C)	Ser; neutrale Aminosäure
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

Andere Substitutionen sind auch zulässig und können empirisch oder in Übereinstimmung mit bekannten konservativen Substitutionen bestimmt werden. Eine jede solche Modifikation des Polypeptids kann durch alle Mittel durchgeführt werden, die Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt sind.
Auch umfasst sind Muteine, hergestellt wie hierin durch Ersetzen eines oder mehrerer der Cysteine mit Serin, oder solche, bei denen beliebige andere Aminosäuren deletiert oder ersetzt sind, unter der Bedingung, dass das resultierende Protein die Fähigkeit besitzt, entweder als Monomer oder als Dimer an Chemokinrezeptor tragende Zellen zu binden und bei einer solchen Bindung internalisiert werden oder ein gebundenes zielorientiertes Agens zu internalisieren. Normalerweise werden solche Muteine konservative Aminosäureveränderungen besitzen, wie etwa diejenigen, die in der Tabelle oben aufgeführt sind. Nukleinsäuren, die für solche Muteine codieren, werden, solange sie nicht durch Ersetzen von degenerierten Codons modifiziert sind, unter Bedingungen einer zumindest geringen Stringenz, im Allgemeinen einer hohen Stringenz an DNA binden, die für ein Chemokin codiert, wie etwa diejenigen, die in den SEQ ID NO: 25–28 aufgeführt sind oder einem Exon davon (SEQ ID O: 16–241.
Fachleuten sind verschiedene in vitro-Assays bekannt zur Identifizierung von Chemokinen und Chemokinaktivität, insbesondere chemotaktischen Aktivitäten (siehe zum Beispiel Walz et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 : 755, zur Identifizierung der Chemotaxis von Neutrophilen; Larsen et al. (1989) Science 243 : 1464 und Carr et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 : 3652, zur Untersuchung der Chemotaxis von Lymphozyten; siehe auch die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 99/33990, welche zahlreiche Assays beschreibt und Mittel zur Identifizierung von Chemokinen erläutert). Solche Assays können verwendet werden, um Chemokine, modifizierte Chemokine und aktive Fragmente davon zu identifizieren. Bindungsassays, wie hierin beschrieben und wie Fachleuten bekannt ist, können verwendet werden, um Anteile zu identifizieren, welche Chemokinrezeptoren spezifisch erkennen, und cytotoxische Assays können verwendet werden, um diejenigen zu identifizieren, welche auch gebundene oder assoziierte zielorientierte Agenzien internalisieren.
Es wird betont, dass die Chemokin-Ansteuerungsagenzien keine Agenzien einschließen, welche nicht die Eigenschaften von Chemokinen besitzen, wie etwa Nichtchemokin-Zytokine, wie etwa die CSFs, TNFs, IL-2, IL-3, IL-4 und andere.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Teil eines Chemokins auf ein Fragment oder ein Stück eines Chemokins, welches entweder alleine oder als ein Dimer mit einem anderen Fragment oder einem Chemokinmonomer ausreichend ist, um an einen Rezeptor zu binden, an den Chemokindimere binden, und ein gebundenes zielorientiertes Agens zu internalisieren.
Wie hierin verwendet, ist ein Aminosäurerest von Chemokin nicht essentiell, wenn ein Chemokindimer, in dem eines oder beide Chemokinmonomere durch Deletion des Rests modifiziert worden sind, im Wesentlichen die gleiche Fähigkeit besitzt, an einen Chemokinrezeptor zu binden und ein gebundenes Agens zu internalisieren, wie es das Dimer mit der Aminosäure/Aminosäuren besitzt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Nukleinsäure, die für ein Chemokinpeptid oder Polypeptid codiert, auf jedes der Nukleinsäurefragmente, die hierin aufgelistet ist und für solche Peptide codieren, auf jedes solcher Nukleinsäurefragmente, die Fachleuten bekannt sind, jedes Nukleinsäurefragment, welches für ein Chemokin codiert, das an einen Chemokinrezeptor bindet und dabei internalisiert wird und aus einer humanen Zellbibliothek unter Verwendung aller der vorhergehenden Nukleinsäurefragmente als eine Sonde isoliert werden kann, oder jedes Nukleinsäurefragment, welches für irgendeines der bekannten Chemokinpeptide codiert, einschließlich derjenigen, die in den SEQ ID NO. 25–28 aufgeführt sind, und jedes DNA-Fragment, welches hergestellt werden kann aus den vorhergehenden Nukleinsäurefragmenten durch Substitution von degenerierten Codons. Es ist verständlich, dass es eine Routine ist, degenerierte Codons zu substituieren und jedes der möglichen Nukleinfragmente herzustellen, welche für solch ein Peptid codieren, wenn die komplette Aminosäuresequenz eines Peptids, wie etwa eines Chemokinpeptids verfügbar ist, und wenn ein Nukleinsäurefragment, welches für solch ein Peptid codiert, für Fachleute dieses Fachgebiets verfügbar ist. Es ist im Allgmeinen auch möglich, Nukleine, die für solch ein Peptid codieren, basierend auf der Aminosäuresequenz zu synthetisieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Chemokin-vermittelte pathophysiologische Bedingung auf eine schädliche Bedingung, gekennzeichnet durch oder verursacht durch Proliferation von Zellen, welche gegenüber einer mitogenen Chemokinstimulierung, proliferativen Stimulierung und/oder Lockstoffaktivität empfindlich sind.
Wie hierin verwendet, beziehen sich Chemokinrezeptoren auf Rezeptoren, welche spezifisch mit einem natürlich vorkommenden Mitglied der Chemokinfamilie der Proteine wechselwirkt und es in eine Zelle transportiert, die solche Rezeptoren trägt. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die fünf Rezeptoren (CXCR1-5), an die CXC-Chemokine binden und die neun Rezeptoren (CCR1-9), an die CC-Chemokine binden und alle anderen Rezeptoren, an die irgendein Chemokin spezifisch binden wird und die Internalisierung eines gebundenen zielorientierten Agens erleichtert.
Wie hierin verwendet, ist ein zielorientiertes Agens jedes Agens, welches für eine Internalisierung durch Bindung an einen Ansteuerungsanteil, wie hierin definiert, vorgesehen ist und das bei Internalisierung auf verschiedene Art und Weise den zellulären Metabolismus, das Wachstum, die Aktivität, die Lebensfähigkeit oder eine andere Eigenschaft oder ein charakteristisches Merkmal der Zelle verändert oder beeinflusst. Die zielorientierten Agenzien sind bevorzugt therapeutische Agenzien, einschließlich cytotoxischer Agenzien, und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Proteine, Polypeptide, organische Moleküle, Arzneimittel, Nukleinsäuren und andere solche Moleküle. Markierungen, wie etwa fluoreszente Anteile, gebunden an ein Chemokin oder einen Teil davon, sollen nicht innerhalb der Definition eines zielorientierten Agens, wie es hierin betrachtet wird Erwägung gezogen werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet das Steuern eines zielorientierten Agens, es zu einer Zelle zu leiten, welche einen ausgewählten Rezeptor exprimiert, durch Binden des Agens an ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens. Beim Binden des Rezeptors wird das zielorientierte Agens oder das zielorientierte Agens, verbunden mit dem Chemokinrezeptorbindungsanteil von der Zelle internalisiert.
Wie hierin verwendet, ist ein zielorientiertes Agens jedes Agens, welches für eine Internalisierung durch Bindung an einen Ansteuerungsanteil, wie hierin definiert, vorgesehen ist und welches bei der Internalisierung auf verschiedene Art und Weise den zellulären Metabolismus, das Wachstum, die Aktivität, die Lebensfähigkeit oder eine andere Eigenschaft oder ein charakteristisches Merkmal der Zelle verändert oder beeinflusst. Die zielorientierten Agenzien schließen Proteine, Polypeptide, organische Moleküle, Arzneimittel, Nukleinsäuren und andere solche Moleküle ein.
Obwohl erkannt wurde, dass Chemokine eine Familie der Zytokine mit den oben beschriebenen Struktureigenschaften und biologischen Eigenschaften sind, bezieht sich die hierin verwendete Referenz auf "Zytokine". als Liganden für die Zwecke hierin auf Zytokine, welche keine Chemokine sind. Ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens bezieht sich auf Chemokine, auf Zytokine, welche selektiv an Chemokinrezeptoren binden, auf Antikörper, welche spezifisch sind für solche Rezeptoren, und auf jeden anderen Anteil, der die Rezeptorselektivität nachahmen wird und die Fähigkeit besitzt, eine Internalisierung eines gebundenen zielorientierten Agens von jedem Chemokin zu erleichtern.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff cytotoxisches Agens auf ein zielorientiertes Agens, das eine Zellfunktion hemmen kann. Das Agens kann die Proliferation hemmen oder kann für die Zellen toxisch sein. Alle Agenzien werden in den Bereich dieses Begriffs fallen, welche, wenn sie von einer Zelle internalisiert werden, den zellulären Metabolismus stören oder schädigend verändern oder in irgendeiner Art und Weise das Zellwachstum oder die Proliferation hemmen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Agenzien, deren toxische Effekte vermittelt werden, wenn sie in die Zelle transportiert werden und ebenso diejenigen, deren toxische Effekte an der Zelloberfläche vermittelt werden. Eine Vielzahl von cytotoxischen Agenzien kann verwendet werden und schließt diejenigen ein, welche die Proteinsynthese hemmen und diejenigen, welche die Expression bestimmter Gene hemmen, die für das zelluläre Wachstum oder das Überleben essentiell sind. Cytotoxische Agenzien schließen diejenigen ein, welche einen Zelltod ergeben und diejenigen, welche das Zellwachstum, die Proliferation und/oder Differenzierung hemmen. Cytotoxische Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in den vorliegenden Tabellen und Sequenzprotokollen aufgeführt sind, Gelonin, Saporin, die Ricine, Abrin und andere Ribosomen inaktivierende Proteine (RIPs), aquatisch gewonnene Cytotoxine, Pseudomonas-Exotoxin, Inhibitoren von DNA, RNA oder der Proteinsynthese, wie etwa Antisense-Nukleinsäuren und andere metabolische Inhibitoren, wie etwa DNA-spaltende Moleküle und lichtaktivierte Porphyrine, welche Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt sind. Shigatoxin, insbesondere die modifizierte katalytische Shiga-Untereinheit, wie hierin bereitgestellt, ist hierin ein bevorzugtes Toxin, aber andere geeignete RIPs schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Shiga-A1, Ricin, Ricin-A-Kette, Saporin, von E. coli erzeugte Colicine, Shiga-ähnliche Toxine, Mais-RIP, Gelonin, Diphtherietoxin, Diphtherietoxinkette A, Trichosanthin, Tritin, antivirales Pokeweed-Protein (PAP), antivirales Mirabilis-Protein (MAP), Dianthine 32 und 30, Abrin, Monordin, Bryodin, ein katalytischer Inhibitor der Proteinbiosynthese, isoliert aus Gurkensamen (siehe zum Beispiel WO 93/24620), cytotoxisch aktive Fragmente dieser Cytotoxine und Toxine und andere, die Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt sind. Der Begriff RIP wird hierin verwendet, um solche Toxine, ebenso wie andere cytotoxische Moleküle weitläufig einzuschließen, welche den zellulären metabolischen Prozess hemmen, einschließlich der Transkription, der Translation, biosynthetischer oder degradativer Stoffwechselwege, der DNA-Synthese und anderer solcher Prozesse, oder welche Zellen töten oder die Zellproliferation hemmen.
Wie hierin verwendet, ist ein Linker ein Peptid oder ein anderes Molekül, welches ein Chemokin-Polypeptid an das zielorientierte Agens bindet. Der Linker kann über den N- oder C-Terminus gebunden sein oder durch einen inneren Rest nahe bei, normalerweise innerhalb von 20 Aminosäuren, einem Terminus eines Chemokins und/oder zielorientierten Agens, wenn das Agens ein Polypeptid oder Peptid ist. Die hierin verwendeten Linker können bloss dazu dienen, die Bestandteile des Konjugats zu verbinden, die intrazelluläre Verfügbarkeit, die Serumstabilität, die Spezifität und Löslichkeit des Konjugats zu erhöhen oder eine verbesserte Flexibilität bereitzustellen oder die sterische Behinderung im Konjugat zu erleichtern. Die Spezifität oder intrazelluläre Verfügbarkeit des zielorientierten Agens können beispielsweise durch Beifügen eines Linkers verliehen werden, welcher ein Substrat für bestimmte Proteasen ist, wie etwa eine Protease, die in Tumorzellen in höheren Spiegeln vorliegt als in normalen Zellen.
Wie hierin verwendet, ist ein Mitotoxin ein cytotoxisches Molekül, das mittels eines Mitogens, wie etwa eines Chemokins auf spezifische Zellen gerichtet wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Fusionsprotein auf ein Polypeptid, welches mindestens zwei Bestandteile enthält, wie etwa ein Chemokinmonomer und ein zielorientiertes Agens oder ein Chemokinmonomer und einen Linker, und durch Expression von DNA in Wirtszellen erzeugt wird.
Wie hierin verwendet, wird eine Modifikation, welche im Wesentlichen nahe dem N-Terminus oder C-Terminus eines cytotoxischen Agens, wie etwa der Shiga-A-Untereinheit oder einem Chemokinmonomer bewirkt wird, im Allgemeinen innerhalb von 20 oder bevorzugt 10 Resten vom Terminus durchgeführt. Solche Modifikationen schließen die Addition oder Deletion von Resten ein, wie etwa die Addition eines Cysteins, um eine Konjugation zwischen dem Polypeptid, das reaktiv ist mit einem Chemokinrezeptor, oder einem Fragment des Polypeptids und dem zielorientierten Agensteil zu erleichtern, um Konjugate zu bilden, welche ein definiertes Molverhältnis enthalten, bevorzugt ein Verhältnis von 1 : 1 von zielorientiertem Agens und Polypeptid, das mit einem Chemokinrezeptor reaktiv ist, oder einem Fragment des Polypeptids.
Wie hierin verwendet, beziehen sich Nukleinsäuren auf RNA oder DNA, welche als zielorientierte Agenzien vorgesehen sind, welche einschließen, aber nicht beschränkt sind auf DNA, die für therapeutische Proteine codiert, Fragmente von DNA für eine Cosuppression, DNA, die für cytotoxische Proteine codiert, Antisense-Nukleinsäuren oder andere solche Moleküle. Die Bezugnahme auf Nukleinsäuren schließt Duplex-DNA, einzelsträngige DNA, RNA in jeglicher Form, einschließlich Triplex, Duplex oder einzelsträngige RNA, Antisense-RNA, Polynukleotide, Oligonukleotide, einzelne Nukleotide und Derivate davon ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine therapeutische Nukleinsäure auf eine Nukleinsäure, welche verwendet wird, um eine Gentherapie zu bewirken, dadurch dass sie als ein Ersatz für ein defektes Gen dient, oder durch Codieren für ein therapeutisches Produkt, wie etwa ein Hormon, Zytokin, einschließlich Nichtchemokin-Zytokine und/oder einem Wachstumsfaktor. Die therapeutische Nukleinsäure kann für das ganze oder für einen Teil eines Gens codieren und kann durch Rekombination mit bereits in der Zelle vorliegender DNA fungieren, wobei ein defekter Teil eines Gens ersetzt wird. Sie kann auch für einen Teil eines Proteins codieren und ihren Effekt mittels Cosuppression eines Genprodukts ausüben.
Wie hierin verwendet, beschreibt Antisense alle verschiedenen Verfahren und Nukleinsäuren, die in den Verfahren verwendet werden, welche sequenz spezifische Nukleinsäuren anwenden, um eine Gentranskription oder Translation zu modifizieren. Dieser Begriff schließt auch Nukleinsäuren und Verfahren ein, welche Nukleinsäuren bereitstellen, die an Stellen auf Proteinen und an Rezeptoren binden. Antisense schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf die folgenden Arten von Nukleinsäuren: Antisense-mRNA, DNA, welche Triplexmoleküle bilden soll, Oligonukleotide; welche extrazelluläres Protein binden und kleine Nukleotidmoleküle, welche unten beschrieben sind. Wie hierin beschrieben, umfasst Antisense die folgenden Moleküle:
(a) Antisense-mRNA und DNA
Antisense-Nukleinsäuren sind einzelsträngige Nukleinsäurekonstrukte, welche spezifisch an mRNA binden, die komplementäre Sequenzen besitzt, wobei eine Translation der mRNA verhindert wird (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,168,053 von Altman et al., US-Patent Nr. 5,190,931 von Inouye, US-Patent Nr. 5,135,917 von Burch und US-Patent Nr. 5,087,617 von Smith).
Antisense-Nukleinsäure schließt auch doppelsträngige zyklische Oligonukleotide ein, wie etwa Hammerkopf- oder Dumbbell-Oligonukleotide, von denen gezeigt wurde, dass sie die RNA-Synthese spezifisch hemmen (siehe zum Beispiel Clusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3405 : 3411).
(b) Triplexmoleküle
Triplexmoleküle beziehen sich auf DNA-Einzelstränge, welche auf Duplex-DNA zielen, unter Bildung colinearer Triplexe durch Bindung an die Hauptrinne, und dabei die Transkription verhindern oder verändern (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,176,996 von Hogan et al.). Es ist Triplex-DNA konstruiert worden, welche eng und spezifisch an ausgewählte DNA-Stellen bindet.
(c) Ribozyme
Ein Ribozym ist ein Enzym, welches aus RNA hergestellt ist und welches primär auf RNA-Substrate wirkt. Wie hierin verwendet, beziehen sich Ribozyme auf RNA- (oder RNA-Analoga) Konstrukte, welche Messenger-RNA spezifisch spalten (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 5,180,818; 5,116,742 und 5,093,246 von Cech et al.), und bezieht sich insbesondere auf Ribozyme, welche konstruiert werden, um RNA-Moleküle zur Spaltung anzusteuern, und welche dabei auf verschiedene Art und Weise das Zellwachstum oder die Expression einer angesteuerten mRNA oder eines Proteins hemmen oder stören.
(d) Extrazelluläre proteinbindende Oligonukleotide
Extrazelluläre proteinbindende Oligonukleotide beziehen sich auf Oligonukleotide, welche spezifisch an Proteine binden.
(e) Kleine Nukleotidmoleküle
Kleine Nukleotidmoleküle beziehen sich auf Nukleinsäuren, welche eine Rezeptorstelle ansteuern.
Wie hierin verwendet, werden heterologe oder fremde Nukleinsäuren austauschbar verwendet, und beziehen sich auf DNA oder RNA, welche nicht natürlicherweise als ein Teil des Genoms, in dem es vorliegt, vorkommt oder welche an einer Stelle oder an Stellen im Genom gefunden wird, welche sich von denen unterscheidet, an denen sie natürlicherweise auftritt. Eine heterologe Nukleinsäure ist im Allgemeinen nicht endogen für die Zelle, in die sie eingebracht ist, sondern ist von einer anderen Zelle erhalten worden oder synthetisch hergestellt worden. Im Allgemeinen, obgleich nicht notwendigerweise, codiert eine solche Nukleinsäure für RNA und Proteine, welche normalerweise nicht von der Zelle, in denen sie exprimiert wird, hergestellt werden. Jede DNA oder RNA, welche ein Fachmann als heterolog oder fremd in der Zelle, in der sie exprimiert wird, erkennen oder betrachten würde, wird hierin von heterologer DNA umfasst. Beispiele für heterologe DNA schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf DNA, welche für Transkriptions- und Translationsregulatorsequenzen und selektierbare oder nachweisbare Markerproteine codiert, wie etwa für ein Protein, welches eine Arzneimittelresistenz verleiht. Heterologe DNA kann auch für DNA codieren, welche vermittelt oder für Mediatoren codiert, welche die Expression von endogener DNA durch Beeinflussen der Transkription, Translation oder andere regulierbare biochemische Prozesse veränder.
Wie hierin verwendet, bezieht sich Vektor oder Plasmid auf eigenständige Elemente, welche verwendet werden, um heterologe DNA in Zellen einzubringen, entweder für eine Expression der heterologen DNA oder für eine Replikation der klonierten heterologen DNA. Die Selektion und Verwendung solcher Vektoren und Plasmide liegen innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns.
Wie hierin verwendet, bezieht sich Expression auf den Prozess, in dem Nukleinsäure in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert wird. Wenn die Nukleinsäure von genomischer DNA stammt, kann die Expression, wenn eine geeignete eukaryontische Wirtszelle oder ein Organismus ausgewählt wird, Splicing der mRNA einschließen.
Wie hierin verwendet, schließt ein Expressionsvektor Vektoren ein, die DNA-Fragmente exprimieren können, welche in funktionsfähiger Art und Weise mit Regulatorsequenzen verbunden sind, wie etwa Promotorregionen, welche eine Expression solcher DNA-Fragmente bewirken können. Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie etwa ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderen Vektor, welcher nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle eine Expression der klonierten DNA ergibt. Geeignete Expressionsvektoren sind Fachleuten gut bekannt und schließen diejenigen ein, die in eukaryontischen Zellen und/oder prokaryontischen Zellen replizierbar sind und diejenigen, welche episomal verbleiben oder in das Wirtszellgenom integrieren können.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine funktionsfähige Bindung oder funktionsfähige Vereinigung von heterologer DNA mit regulatorischen und Effektorsequenzen von Nukleotiden, wie etwa Promotoren, Enhancern, Transkriptions- und Translations-Stoppstellen und anderen Signalsequenzen auf die funktionelle Beziehung zwischen solcher DNA und solchen Nukleotidsequenzen. Zum Beispiel bezieht sich eine funktionsfähige Verbindung von heterologer DNA mit einem Promotor auf die physische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, so dass die Transkription solcher DNA vom Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, welche die DNA spezifisch erkennt, an die DNA bindet und die DNA in Leserahmen transkribiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Promotorregion auf den Teil der DNA eines Gens, welcher die Transkription der DNA kontrolliert, mit dem er funktionsfähig verbunden ist. Ein Teil der Promotorregion schließt spezielle Sequenzen der DNA ein, welche ausreichend sind für eine RNA-Polymeraseerkennung, Bindung und Transkriptionsinitiation. Dieser Teil der Promotorregion wird als der Promotor bezeichnet. Außerdem schließt die Promotorregion Sequenzen ein, welche diese Erkennung, Bindung und Transkriptionsinitiationsaktivität der RNA-Polymerase regulieren. Diese Sequenzen können in cis agieren oder können auf trans-agierende Faktoren ansprechen. Promotoren können in Abhängigkeit von der Art der Regulierung konstitutiv oder reguliert sein. Zur Verwendung hierin werden induzierbare Promotoren bevorzugt. Die Promotoren werden von einer RNA-Polymerase erkannt, welche vom Wirt exprimiert wird. Die RNA-Polymerase kann endogen für den Wirt sein oder kann durch genetische Manipulation in den Wirt eingebracht werden, entweder als ein Teil des Wirtschromosoms oder als ein episomales Element, einschließlich eines Plasmids, das die DNA enthält, welche für das Polypeptid codiert, das die Shiga-A-Untereinheit enthält. Die zur Verwendung hierin am meisten bevorzugten Promotoren sind eng reguliert, so dass in Abwesenheit einer Induktion die DNA, welche für das Saporin enthaltende Protein codiert, nicht exprimiert wird.
Wie hierin verwendet, besitzt eine Transkriptionsterminationsregion entweder (a) ein Untersegment, welches für ein Polyadenylierungssignal und eine Polyadenylierungsstelle im Transkript codiert, und/oder (b) ein Untersegment, welches ein Transkriptionsterminationssignal bereitstellt, welches die Transkription durch die Polymerase, die den ausgewählten Promotor erkennt, beendet. Der komplette Transkriptionsterminator kann von einem Protein-codierenden Gen erhalten werden, welches das gleiche oder verschieden sein kann von dem Gen, welches die Quelle des Promotors ist. Bevorzugte Transkriptionsterminationsregionen sind diejenigen, welche in E. coli funktionell sind. Transkriptionsterminatoren sind optionale Bestandteile des vorliegenden Expressionssystems, werden aber in bevorzugten Ausführungsformen verwendet.
Der Begriff "Nukleotidsequenz, codierend für die Expression" eines Polypeptids bezieht sich, wie verwendet, auf eine Sequenz, welche bei Transkription und nachfolgender Translation der resultierenden mRNA das Polypeptid produziert. Dies kann Sequenzen einschließen, die zum Beispiel Introns enthalten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Expressionskontrollsequenzen" auf Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression einer Nukleinsäuresequenz regulieren, an die sie in funktionsfähiger Art und Weise gebunden sind. Expressionskontrollsequenzen sind in funktionsfähiger Art und Weise an eine Nukleinsäuresequenz gebunden, wenn die Expressionskontrollsequenzen die Transkription und, falls angemessen, die Translation der Nukleinsäuresequenz kontrollieren und regulieren. Somit können Expressionskontrollsequenzen passende Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, ein Startcodon (das heißt ATG) vor einem für ein Protein codierenden Gen, Splicingsignale für Introns, das Aufrechterhalten des korrekten Leserahmens eines für ein Protein codierenden Gens, um eine richtige Translation der mRNA zu erlauben, und Stoppcodons einschließen. Außerdem können die DNA-Sequenzen, die für ein fluoreszentes Indikatorpolypeptid, wie etwa ein grünes oder blaues fluoreszentes Protein codieren, eingeschlossen sein, um positive Klone zu selektieren (das heißt diejenigen Wirtszellen, die das gewünschte Polypeptid exprimierenl.
Wie hierin verwendet, sind "Wirtszellen" Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und seine Nukleinsäure exprimiert werden kann. Der Begriff schließt auch alle Nachkommen der vorliegenden Wirtszelle ein. Es ist verständlich, dass nicht alle Nachkommen mit der parentalen Zelle identisch sein können, da es Mutationen geben kann, welche während der Replikation auftreten. Solche Nachkommen sind eingeschlossen, wenn der Begriff "Wirtszelle" verwendet wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Sekretionssignal auf eine Peptidregion innerhalb des Vorläuferproteins, welche die Sekretion des Vorläuferproteins vom Cytoplasma des Wirts in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Wachstumsmedium richtet. Solche Signale können entweder am Aminoterminus oder am Carboxyterminus des Vorläuferproteins vorliegen. Das bevorzugte Sekretionssignal ist an den Aminoterminus gebunden und kann zu dem Protein, an das es gebunden ist, heterolog sein. Typische Signalsequenzen werden während Durchtritts durch den zellulären Sekretionsweg gespalten. Eine Spaltung ist nicht essentiell oder muss präzise platziert sein, solange das sekretierte Protein seine erwünschte Aktivität beibehält.
Wie hierin verwendet, ist eine nukleäre Translokations- oder Targetingsequenz (NTS) eine Sequenz von Aminosäuren in einem Protein, welche für eine Translokation des Proteins in einen Zellnukleus erforderlich sind. Ein Vergleich mit bekannten NTS, und falls nötig, eine Untersuchung der potentiellen Sequenzen, sollte es Fachleuten erlauben, andere Aminosäuresequenzen, welche als NTSs fungieren ohne weiteres zu identifizieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich heterologes NTS auf ein NTS, welches verschieden ist von dem NTS, welches im Wildtypeptid, Polypeptid oder Protein auftritt. Zum Beispiel kann das NTS von einem anderen Polypeptid stammen, es kann synthetisiert sein oder es kann von einer anderen Region im gleichen Polypeptid stammen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Transfektion auf das Aufnehmen von DNA oder RNA durch eine Wirtszelle. Transformation bezieht sich auf diesen Prozess, durchgeführt in einer Art und Weise, so dass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder als ein Teil der chromosomalen DNA des Wirtes. Verfahren und Mittel zum Durchführen einer Transfektion und Transformation sind Fachleuten dieses Fachgebiets gut bekannt (siehe zum Beispiel Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373–1376; Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 : 2110).
Wie hierin verwendet, bezieht sich die biologische Aktivität auf die in vitro-Aktivitäten einer Verbindung oder physiologischen Reaktionen, welche sich aus einer in vivo-Verabreichung einer Verbindung, Zusammensetzung oder eines anderen Gemischs ergeben. Somit umfasst die biologische Aktivität therapeutische Wirkungen und pharmazeutische Aktivität von solchen Verbindungen, Zusammensetzungen und Gemischen. Solch eine biologische Aktivität kann aber definiert werden unter Bezugnahme auf besondere in vitro-Aktivitäten, wie in einem definierten Assay gemessen wird. Somit bezieht sich beispielsweise eine Bezugnahme hierin auf die biologische Aktivität von Chemokin, einem Dimer davon, einem Monomer oder einem Fragment davon oder einer anderen Kombination von Chemokinmonomeren und Fragmenten auf die Fähigkeit des Chemokins, an Zellen zu binden, die Chemokinrezeptoren tragen, und ein gebundenes Agens zur internalisieren. Solch eine Aktivität wird normalerweise in vitro bewertet durch Bindung des Chemokins (Dimer, Monomer oder Fragment) an ein cytotoxisches Agens, wie etwa die Shiga-A-Untereinheit, Inkontaktbringen von Zellen, die Chemokinrezeptoren tragen, wie etwa Leukozyten, mit dem Konjugat und Bewerten der Zellproliferation oder des Wachstums. Solch eine in vitro-Aktivität sollte extrapolierbar sein mit der in vivo-Aktivität. Nachfolgend wird auf zahlreiche Tiermodelle verwiesen und werden zahlreiche Tiermodelle beschrieben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff biologisch aktiv oder ein Verweis auf die biologische Aktivität eines Konjugats eines Chemokinrezeptor- Ansteuerungsagens, wie etwa eines Konjugats, enthaltend ein Chemokin und ein zielorientiertes Agens, wie etwa die Shiga-A-Untereinheit, in diesem Fall auf die Fähigkeit eines solchen Polypeptids, enzymatisch die Proteinsynthese zu hemmen durch Inaktivierung von Ribosomen entweder in vivo oder in vitro oder das Wachstum von Zellen zu hemmen oder Zellen zu töten durch Internalisierung des Toxin enthaltenden Polypeptids durch die Zellen. Solch eine biologische oder cytotoxische Aktivität kann bewertet werden durch jedes Verfahren, das Fachleuten bekannt ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die in vitro-Assays, welche die Proteinsynthese messen und die in vivo-Assays, welche die Cytotoxizität bewerten durch Messung der Wirkung einer Testverbindung auf die Zellproliferation oder auf die Proteinsynthese. Besonders bevorzugt sind aber Assays, welche die Cytotoxizität in angesteuerten Zellen bewerten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Binden an einen Rezeptor auf die Fähigkeit eines Liganden, spezifisch solche Rezeptoren zu erkennen und nachweisbar zu binden, wie durch in vitro-Standardassays bewertet wird. Eine Bindung, wie hierin verwendet, bedeutet beispielsweise die Messung der Kapazität eines Chemokinkonjugats, Chemokinmonomers oder eines anderen Gemischs, einen Chemokinrezeptor auf Leukozytenzellunterarten, wie etwa Mikroglia, Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und T-Zellen zu erkennen, unter Verwendung gut beschriebener Ligand-Rezeptor-Bindungsassays, chemotaktischer Assays, histopathologischer Analysen, Durchflusszytometrie und Analysen mittels eines konfokalen Mikroskops und anderen Assays, die Fachleuten bekannt sind und/oder hierin erläutert werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet im Wesentlichen rein ausreichend homogen, um frei zu scheinen von leicht nachweisbaren Unreinheiten, wie durch Standardverfahren der Analyse bestimmt wird, wie etwa Dünnschichtchromatographie (TLC), Gelelektrophorese, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), welche von Fachleuten verwendet werden, um solch eine Reinheit zu bewerten, oder ausreichend rein, so dass eine weitere Reinigung die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie etwa enzymatische und biologische Aktivitäten der Substanz nicht nachweisbar verändern würden. Verfahren zur Reinigung der Verbindungen, um im Wesentlichen chemische reine Verbindungen zu erzeugen, sind Fachleuten bekannt. Eine im Wesentlichen chemisch reine Verbindung kann aber ein Gemisch aus Stereoisomeren sein. In solchen Fällen kann eine weitere Reinigung die spezifische Aktivität der Verbindung erhöhen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich isolierte, im Wesentlichen reine DNA auf DNA-Fragmente, welche durch von Fachleuten verwendeten Standardverfahren gereinigt worden sind, siehe zum Beispiel Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
Wie hierin verwendet, beschreibt die Hybridisierung unter Bedingungen einer speziellen Stringenz die Stabilität von Hybriden, die zwischen zwei einzelsträngigen DNA-Fragmenten gebildet werden und bezieht sich auf die Bedingungen der ionischen Stärke und Temperatur, bei der selche Hybride gewaschen werden nach einem Annealing unter Bedingungen der Stringenz, die geringer sind oder gleich sind wie diejenigen des Waschschritts. Normalerweise umfasst eine hohe, mittlere und geringe Stringenz die folgenden Bedingungen oder dazu äquivalente Bedingungen:

1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE oder SSC, 0,1 % SDS, 65°C
2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE oder SSC, 0,1 % SDS, 50°C
3) geringe Stringenz: 1,0 × SSPE oder SSC, 0,1 % SDS, 50°C.

Äquivalente Bedingungen beziehen sich auf Bedingungen, welche im Wesentlichen hinsichtlich der gleichen Prozentzahl an Fehlpaaren in den resultierenden Hybriden selektieren. Die Zugabe von Bestandteilen, wie etwa Formamid, Ficoll und Denhardt-Lösung beeinflussen Parameter wie etwa die Temperatur, bei der die Hybridisierung durchgeführt werden sollte und die Reaktionsgeschwindigkeit. Somit ist eine Hybridisierung in 5 × SSC, in 20% Formamid bei 42°C im Wesentlichen die gleiche wie die oben zitierten Bedingungen einer Hybridisierung bei Bedingungen einer geringen Stringenz.
Die Rezeptur für SSPE, SSC und Denhardt's und die Herstellung von entionisiertem Formamid sind beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8; siehe Sambrook et al., Band 3, S. B13, siehe auch zahlreiche Kataloge, welche normalerweise verwendete Laborlösungen beschreiben) beschrieben. SSPE ist ein Phosphat-gepuffertes 0,18 NaCl mit pH 7,4.
Wie hierin beschrieben, bedeutet eine Kultur eine Vermehrung von Zellen in einem Medium, welches zu deren Wachstum beiträgt, und alle Subkulturen davon. Der Begriff Subkultur bezieht sich auf eine Zellkultur , angezogen aus Zellen einer anderen Kultur (Ursprungskultur) oder auf jede Subkultur der Ursprungskultur, ungeachtet der Anzahl der Subkulturen, welche zwischen der interessierenden Subkultur und der Ursprungskultur durchgeführt wurden. Der Begriff "Kultivieren" bezieht sich auf den Prozess, durch den eine solche Kultur vermehrt wird.
Wie hierin verwendet, ist eine wirksame Menge einer Verbindung zur Behandlung einer speziellen Erkrankung eine Menge, welche ausreichend ist, um die Symptome, die mit der Erkrankung verbunden sind, zu verbessern oder auf verschiedene Art und Weise zu verringern. Solch eine Menge kann als eine Einzeldosis verabreicht werden oder kann gemäß einem Gesundheitsplan verabreicht werden, wodurch sie wirksam ist. Die Menge kann die Erkrankung heilen, wird aber normalerweise verabreicht, um die Symptome der Erkrankung zu verbessern. Eine wiederholte Verabreichung kann erforderlich sein, um die erwünschte Besserung der Symptome zu erzielen.
Wie hierin verwendet, schließen pharmazeutisch akzeptable Salze, Ester oder andere Derivate der Konjugate alle Salze, Ester oder Derivate ein, welche von Fachleuten dieses Fachgebiets leicht hergestellt werden können unter Verwendung bekannter Verfahren für solch eine Derivatisierung, und welche Verbindungen erzeugen, die Tieren oder Menschen ohne wesentliche toxische Wirkungen verabreicht werden können und welche entweder pharmazeutisch aktiv sind oder Prodrugs sind.
Wie hierin verwendet, bedeutet Behandlug jede Art und Weise, auf welche die Symptome von einer Bedingung, einer Erkrankung oder Krankheit verbessert werden oder auf andere Art und Weise vorteilhaft verändert werden. Behandlung umfasst auch jede pharmazeutische Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Verbesserung der Symptome einer speziellen Erkrankung durch Verabreichung einer speziellen pharmazeutischen Zusammensetzung auf jegliche Verringerung, entweder permanent oder zeitweilig, anhaltend oder transient, welche der Verabreichung der Zusammensetzung zugeschrieben werden kann oder damit assoziiert ist.
Wie hierin verwendet, ist eine Prodrug eine Verbindung, welche nach in vivo-Verabreichung in die biologisch, pharmazeutisch oder therapeutisch aktive Form der Verbindung metabolisiert oder auf andere Art und Weise umgewandelt wird. Um eine Prodrug zu erzeugen, wird die pharmazeutisch aktive Verbindung so modifiziert, dass die aktive Verbindung mittels eines metabolischen Prozesses regeneriert wird. Die Prodrug kann gestaltet werden, um die metabolische Stabilität oder Transportcharakteristika eines Arzneimittels zu verändern, Nebenwirkungen oder Toxizität zu maskieren, den Geschmack eines Arzneimittels zu verbessern oder andere Charakteristika oder Eigenschaften eines Arzneimittels zu verändern. Durch Kenntnis von pharmakodynamischen Prozessen und dem Arzneimittelmetabolismus in vivo können Fachleute dieses Fachgebiets Prodrugs der Verbindung gestalten, wenn eine pharmazeutisch aktive Verbindung einmal bekannt ist (siehe zum Beispiel Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, S. 388–392).
Wie hierin verwendet, bezieht sich ED₅₀ auf die Konzentration, bei der 50% der Zellen nach einer festgesetzten Zeitdauer der Inkubation mit einem hierin bereitgestellten Konjugat getötet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ID₅₀ auf die Konzentration eines hierin bereitgestellten Konjugats, welche erforderlich ist um nach einer festgelegten Zeitdauer die Anzahl zu verringern oder 50% der Zellen, die dem Konjugat ausgesetzt sind, zu eliminieren, im Vergleich zu nicht behandelten Zellen.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Zytokin" Interleukine, Chemokine, Lymphokine, Monokine, Kolonie-stimulierende Faktoren und Rezeptor-assoziierte Proteine und funktionelle Fragmente davon. Für die vorliegenden Zwecke beziehen sich Nichtchemokin-Zytokine auf alle Zytokine außer auf Chemokine, welche eine Wirkung als chemotaktischer Faktor besitzen, die im Allgemeinen von anderen Zytokine nicht gezeigt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Chemokin auf ein Mitglied der Superfamilie von 40 oder mehr kleinen (ungefähr etwa 6 bis etwa 14 kDa), induzierbaren und sekretierten proinflammatorischen Polypeptiden, welche primär als chemotaktische Faktoren und Aktivatoren von speziellen Leukozytenzellsubtypen agieren. Zusammen zielen Chemokine auf das gesamte Spektrum der Leukozytensubtypen; jedes einzelne zielt nur auf einen Teil des Spektrums. Chemokine, welche basische, Heparin bindende Proteine sind, besitzen normalerweise, jedoch nicht notwendigerweise vier Cysteine, welche fast allen Familienmitgliedern gemeinsam sind. Es gibt vier Hauptgruppen von Chemokinen, drei davon schließen die vier konservierten Cysteine ein; es könnten andere Gruppen identifiziert werden. Die Gruppen werden durch die Anordnung der ersten zwei Cysteine definiert. Wenn die ersten zwei Cysteine durch eine einzelne Aminosäure getrennt sind, sind sie Mitglieder der CXC- Familie (auch α genannt); wenn die Cysteine benachbart sind, werden sie in die CC-Familie klassifiziert (auch β genannt). Wenn sie durch drei Aminosäuren CX₃C getrennt sind, sind sie Mitglieder der dritten Gruppe. Die vierte Gruppe der Chemokine enthält zwei Cysteine, entsprechend den ersten und dritten Cysteinen in den anderen Gruppen. Für vorliegende Zwecke schließen die Chemokine Zytokine, wie etwa GM-CSF, IL-1, IL-4, welche nicht mit CC-, CXC-, CX3C- und XC-Rezeptoren wechselwirken, nicht ein, agieren nicht primär als chemotaktische Faktoren für Leukozyten und weisen keine regulatorischen Wirkungen auf das Wachstum, die Differenzierung und Funktion der meisten Zelltypen auf. Weil einige Zytokine an Rezeptoren binden, welche auf Zellen vorliegen, welche auch Chemokinrezeptoren exprimieren, können bestimmte Konjugate von auf Zytokin gerichteten Agenzien, wie etwa IL-4-Konjugate, in den Verfahren zur Behandlung von entzündlichen Bedingungen verwendet werden, insbesondere bei der Entzündung, die mit einem hierin bereitgestellten Sekundärgewebeschaden assoziiert ist.
Wie hierin verwendet, ist ein Chemokin-Toxin ein Konjugat, welches ein Chemokin und ein Toxin enthält.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "funktionelles Fragment" auf ein Polypeptid, welches eine biologische Funktion oder Aktivität besitzt, die durch einen definierten funktionellen Assay identifiziert wird und welche mit einer bestimmten biologischen, morphologischen oder phänotypischen Veränderung in einer Zelle oder einem Zellmechanismus im Zusammenhang steht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "enzymatische Untereinheit" auf die A-Untereinheit eines bestimmten Toxins, welches entweder für die N-Glykosidase- oder ADP-Ribosylierungsaktivität des Toxins verantwortlich ist (Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 331–54, 1992; Stirpe et al., Bio/Technology 10: 405–12, 1992 und Sandvig und Van Deurs, Physiol. Rev. 76: 949–66, 1996).
Wie hierin verwendet, schließt der hierin verwendete Begriff "Antikörper" intakte Moleküle ebenso wie funktionelle Fragmente davon ein, wie etwa Fab, F(ab)'₂ und Fv, welche die Epitopdeterminante binden können. Diese funktionellen Antikörperfragmente behalten etwas von der Fähigkeit bei, entweder mit derem entsprechenden Antigen oder Rezeptor selektiv zu binden, und werden wie folgt definiert:

(1) Fab, das Fragment, welches ein monovalentes Antigen bindendes Fragment eines Antikörpermoleküls enthält, kann durch Verdau eines gesamten Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugt werden, um eine intakte leichte Kette und einen Teil einer schwerden Kette zu ergeben;
(2) Fab', das Fragment eines Antikörpermoleküls, welches durch Behandlung des ganzen Antikörpers mit Pepsin erhalten werden kann, gefolgt von einer Reduktion, um eine intakte leichte Kette und einen Teil der schweren Kette zu ergeben; pro Antikörpermolekül werden zwei Fab'-Fragmente erhalten,
(3) (Fab')₂, das Fragment des Antikörpers, welches durch Behandlung des gesamten Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne nachfolgende Reduktion erhalten werden kann; F(ab)'₂ ist ein Dimer aus zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfidbindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv definiert als gentechnisch verändertes Fragment, enthaltend die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette, exprimiert als zwei Ketten; und
(5) Einzelkettenantikörper ("SCA", „Single Chain Antibody"), ein genetisch verändertes Molekül, enthaltend die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette, verbunden durch einen geeigneten Polypeptidlinker, als ein genetisch fusioniertes Einzelkettenmolekül.

Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind im Fachbereich bekannt (siehe zum Beispiel Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988).
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Epitop" jede antigene Determinante auf einem Antigen, an die das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitope Determinanten enthalten chemisch aktive Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie etwa Aminosäuren oder Kohlenhydratseitenketten, und besitzen normalerweise spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristika ebenso wie spezifische Ladungscharakteristika.
Wie hierin verwendet, bedeutet Peptid und/oder Polypeptid ein Polymer, in dem die Monomere Aminosäurereste sind, welche durch Amidbindungen verbunden sind, alternativ wird es als ein Polypeptid bezeichnet. Wenn die Aminosäuren α-Aminosäuren sind, kann entweder das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer verwendet werden, wobei die L-Isomere bevorzugt sind. Außerdem sollen nichtnatürliche Aminosäuren, wie etwa β-Alanin, Phenylgylcin und Homoarginin eingeschlossen sein. Häufig angetroffene Aminosäuren, welche nicht durch ein Gen codiert sind, können in hierin bereitgestellten Ligand-Toxin-Chimären auch verwendet werden, obwohl bevorzugte Aminosäuren diejenigen sind, welche codierbar sind.
Wie hierin verwendet, ist die effektive Menge die Menge eines therapeutischen Agens, die notwendig ist, um ein Symptom eines Sekundärgewebeschadens in einem Objekt oder bei einem damit assoziierten Erkrankungszustand zu verhindern, zu heilen, zu bessern oder zumindest teilweise aufzuhalten, Ein Objekt ist jedes Säugetier, bevorzugt ein Mensch.
B. Die Entzündungsreaktion
Eine Entzündung wird durch die Aktivierung und Rekrutierung von mehreren Gruppen von Abwehrzellen des Immunsystems (Leukozyten) an die Stelle der Verletzung oder des Traumas in die Wege geleitet. Proinflammatorische Leukozyten schließen ein: Makrophagen, Monzyten und Mikroglia (alle zusammen sind als mononukleäre Phagozyten, MNPs bekannt), Neutrophile, Eosinophile und Subtypen der T-Lymphozytenabstammung. Diese Zellen dienen dazu, den Körper von unerwünschten exogenen Agenzien (zum Beispiel Mikroben) oder endogenen Agenzien (zum Beispiel Krebszellklonen) zu befreien, Zelltrümmer zu entfernen und an der Gewebe- und Wundenreparatur teilzunehmen.
Leukozyten werden aktiviert und setzen nachfolgend eine große Menge von inflammatorischen Mediatoren frei, als eine Antwort auf lösliche Faktoren, freigesetzt von verletzten Zellen, die eine Nekrose durchlaufen. Die von Leukozyten stammenden Mediatoren sind für den Heilungsprozess essentiell, sie scheinen aber auch für den Sekundärgewebeschaden verantwortlich zu sein, welcher schließlich zu einer Organfunktionsstörung führen kann. Die erste Welle der von Leukozyten stammenden Mediatoren schließt zahlreiche Mitglieder der Zytokinsuperfamilie und mehrere wirksame Leukozytenchemolockstoffe der Chemokinsuperfamilie ein.
Zytokine und Chemokine halten ihre eigene Produktion aufrecht und werden von Leukozyten über autokrine und parakrine Mechanismen freigesetzt. Sie induzieren auch die Synthese und Freisetzung einer zweiten Welle von Entzündungsmediatoren aus den Zellen, welche sie ansteuern. Diese zweite Welle von Entzündungsmediatoren schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf Neurotoxine, proteolytische Enzyme, kationische Proteine, Arachidonsäuremetaboliten und reaktive Sauerstoffspezies. Zytokine und Chemokine induzieren auch die Expression von Zelladhäsionsmolekülen und Zelloberflächenantigen auf Leukozyten, Endothelzellen und Gliazellen, und beide Ereignisse sind integrale Bestandteile der Entzündungsreaktion.
Rückenmarks- und ZNS-Verletzung
Die auslösenden Ereignisse, wie etwa Unfälle von Motorfahrzeugen, welche zu einer Rückenmarksverletzung führen, werden sinnvollerweise als die initiale oder erste Verletzung bezeichnet. Das traumatisierte Rückenmark reagiert schnell durch Hervorrufen einer normalen Entzündungsreaktion, welche gestaltet ist, um die Verletzungsstelle von allem eindringenden fremden Material wie Bakterien oder Viren zu befreien, die Wunde zu verschließen und die Gewebereparatur zu fördern. In diesem Umfang gleicht die Entzündungsreaktion des Rückenmarks der Reaktion der Haut auf einen kleineren Schnitt oder eine Abschürfung, und in beiden Fällen kann eine bleibende Narbe gebildet werden.
Während die periphere Reaktion auf eine Verletzung als ein einzelnes enthaltenes Ereignis gedacht werden kann, entwickelt die Rückenmarksreaktion sich zu einem Punkt, wobei "normal" zu "ungeeignet" wird und im Wesentlichen eine zweite Verletzung zugefügt wird. Kurz gesagt, die Entzündungsreaktion des Rückenmarks schafft an der Stelle der Verletzung eine Umgebung, welche zu ungünstig ist, um eine Nervenregeneration oder Reparatur zu unterstützen, den Umfang dieser Region unter Einbeziehung nicht beschädigter Gegenden des Strangs ausdehnt und tatsächlich sowohl gesunde Neuronen als auch Oligodendrozyten tötet. Folglich ist SCI ein Zweistufenverfahren, umfassend eine initiale oder auslösende Verletzung, welche von einem Sekundärgewebeschaden gefolgt wird.
Wie hierin beschrieben, ist ein ungeeigneter Verlauf einer Rückenmarksentzündung der Hauptbeitrag zu dem Ausmaß der Paralyse und sekundären medizinischen Bedingungen, welche das typische Resultat einer SCI sind. Aus einer klinischen Perspektive bedeutet dies, dass dem am Rückenmark verletzten Patienten viel mehr damit gedient wäre, wenn die Entzündungsreaktion nie ausgelöst worden wäre. Wegen der weitergehenden Rückenmarksentzündung sind die Aussichten einer erfolgreichen therapeutischen Intervention düster.
Untersuchungen bei SCI und generalisiertem ZNS-Trauma haben einen klaren Beginn eines Sekundärgewebeschadens gezeigt, welcher innerhalb von Stunden beobachtet wird, für mehrere Wochen weitergehen kann, und von einer Periode der teilweisen Wiederherstellung gefolgt wird. Ein Sekundärschaden ist nachweisbar als Zelltod, Astrogliose, was zu einer Gliavernarbung, Neovaskularisation, Demyelinisierung und einem Verlust der sensorischen und motorischen Funktion (das heißt Paralyse) führt. Der Zeitverlauf des Sekundärschadens und der teilweisen Wiederherstellung sind mit dem Ausmaß der Entzündung an der Stelle der Verletzung eng korreliert.
Die frühen Ereignisse bei einer ZNS-Entzündung schließen die Aktivierung und Proliferation vorhandener Mikroglia und infiltrierender MNPs ein. Mikroglia sind eine bestimmte Klasse von MNPs und die vorliegenden Immuneffektorzellen des ZNS. Es sind die inflammatorischen Wirkungen dieser Zellen, welche auf zellulärem Niveau einen Sekundärschaden verursachen. Weiterhin helfen von MNP stammende Zytokine und Chemokine bei der Aktivierung und Rekrutierung von Monozyten, Neutrophilen und T-Lymphozyten an der Stelle der Verletzung, ein Prozess, welcher gestartet wird als eine Konsequenz der Hochregulierung von Zelloberflächenantigenen und Zelladhäsionsmolekülen, einschließlich Integrine, Selektive und intrazelluläres Adhäsionsmolekül-1 (I-CAM) auf Leukozytensubtypen, Endothelzellen und Astrozyten. Neutrophile und T-Zellen tragen zum Sekundärschaden bei durch Freisetzung ihrer eigenen Zytokine, Chemokine, reaktiven Sauerstoffspezies und Proteinasen in das Entzündungsmilieu. Diese Entzündungsereignisse führen zu einem fokalen Tod von Neuronen und Oligodendrozyten (die Myelin produzierenden Zellen des ZNS), kombiniert mit der Demyelinisierung von umgebenden Axonen.
Die Rolle der Zytokine bei einem Sekundärschaden des ZNS
MNPs, Neutrophile, T-Lymphozyten und Astrozyten erzeugen, sekretieren und reagieren auf mehrere Zytokine, einschließlich IL-1, TNF-α, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF und IFN. Diese Zytokine modulieren die meisten Leukozytenfunktionen, einschließlich: phagozytotische Aktivität, die Expression von Zelloberflächenantigenen und Zelladhäsionsmolekülen und die Herstellung von Sauerstoffradikalen. Weiterhin können diese Zytokine direkt mit dem Gliavernarbungsprozess verbunden sein oder in einigen Fällen über die induzierte Freisetzung von neurotoxischen und cytotoxischen Faktoren verbunden sein. TNF-α ist mit der Pathogenese von EAE und mehreren anderen demyelinisierenden Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel ist eine MNP-spezifische Hochregulierung von TNF-α und TNF-α-Rezeptoren im Nervensystem von AIDS-Patienten gezeigt worden. In vitro-Untersuchungen zeigen, dass TNF-α für Oligodendrozyten direkt cytotoxisch ist und die mikrogliale Phagozytose von Myelin stimuliert. Außerdem steigert TNF-α den IFN-γ-induzierten Zelltod von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen.
Leukozytisches und astrogliales GM-CSF und IL-3 sind zusammen mit Tlymphozytischem IL-4 starke Mitogene und Aktivatoren von MNPs. Diese Faktoren tragen zusammen mit anderen zur Pathogenese von entzündlichen Autoimmunerkrankungen bei, sehr wahrscheinlich über die schnellere Phagozytose von Myelin, die zuvor diskutiert wurde. In mehreren interessanten Untersuchungen wurden transgene Mäuse hergestellt, um chronische geringe Spiegel von entweder IL-3, IL-6 oder TNF-α im ZNS zu erzeugen, welches zu einer Proliferation und Aktivierung von MNPs in der weißen ZNS-Substanz führte und anschließend zu einer primären Demyelinisierung und einer motorischen Erkrankung.
Die Rolle der Chemokine bei einem Sekundärschaden des ZNS
Wie oben angemerkt sind Chemokine eine Superfamilie von kleinen (ungefähr etwa 6 bis etwa 14 kDa), induzierbaren und sekretierten chemotaktischen Zytokinen, welche primär auf Leukozytensubtypen wirken. Die Superfamilie wird unterteilt in vier Unterfamilien, basierend auf der Position (oder Existenz) von vier konservierten Cysteinresten in den Primärsequenzen. Die Mitglieder der CXC- oder "α"-Familie besitzen eine zwischenliegende Aminosäure zwischen den ersten zwei konservierten Cysteinen, wohingegen die CC- oder "β"-Familie dies nicht besitzt. Die C- oder "γ"-Chemokine besitzen nur die zweiten und vierten konservierten Cysteinreste. Es ist eine vierte "δ"-Familie beschrieben worden. Diese Familie hat drei zwischenliegende Aminosäuren zwischen den ersten zwei konservierten Cysteinen (somit werden sie als die CX3C-Familie bezeichnet) gemeinsam. Das CX3C-Chemokin Fraktalkine unterscheidet sich von Mitgliedern der anderen Familie darin, dass es in löslichen und membrangebundenen Formen existiert.
Die Rezeptorbindung von Chemokinen an deren Zielzellen ist ein komplexes und sich ständig entwickelndes Gebiet der Untersuchung. Es ist gezeigt worden, dass die α-Chemokinfamilie an einen oder mehrere von fünf CXC-Rezeptoren (CXCR 1-5) bindet, während die β-Chemokinfamilie an einen oder mehrere von 10 CC-Rezeptoren (CC1-9) bindet. Die Rezeptorbindungspiofile für eine ausgewählte beispielhafte nicht beschränkende Gruppe von αund (3-Chemokinen werden in Tabelle 1 dargestellt. Nichtwiderstehend des Vorliegens von passenden Rezeptoren, ist die Zellspezifität eines gegebenen Chemokins in großem Ausmaß, obwohl nicht ausschließlich eine Angelegenheit, ob es MNPs oder Neutrophile oder beide ansteuert. Außerdem sind Eosinophile herausragende Ziele für die β-Chemokine (siehe Tabelle 1).
Die Bindungsaffinitäten, Spezifitäten und die unterschiedliche Verteilung von Rezeptorsubtypen auf den Zielzellen bestimmen im Allgemeinen den Beitrag, den ein bestimmtes Chemokin zu dem Entzündungsprozess leisten wird. Das biologische Profil eines bestimmten Chemokins, das in einer Einstellung bestimmt wird, kann sich in einer anderen nicht bewahrheiten, insbesondere, wenn sich das Verhältnis und der Aktivierungszustand von Zielzellen während eines Traumas oder einer Erkrankung verändert. Folglich muss das biologische Profil eines gegebenen Chemokins von Fall zu Fall etabliert werden. Zum Beispiel sind die Wirkungen des chemotaktischen Monozytenproteins-3 (MCP-3) ähnlich wie denjenigen von MCP-1, aber das erstere bindet an einen größeren Zellbereich. Zusätzlich zu einer bereits komplizierten Situation binden Chemokine auch auf eine Art und Weise an Heparin und Glykosaminoglykane an der Zelloberfläche, welche vermutlich die Beibehaltung eines Gradienten erleichtert, der für eine Leukozytenaktivierung und einen Transport (Extravasation) aus dem Kreislauf in das entzündete Gewebe benötigt wird.
Chemokine agieren auf eine autokrine oder parakrine Art und Weise, und deren Rezeptoren sind während einer Erkrankung hochreguliert. In vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass verschiedene Stimuli, einschließlich Lipopolysaccharid (LPS), IL-1, IFN und TFN-α die Expression und Sekretion von Chemokinen aus verschiedenen ZNS- und Nicht-ZNS-Zelltypen induzieren. Zum Beispiel MCP-1, das inflammatorische Makrophagenprotein-1β (MIP-1β) und RANTES (reguliert bei Aktivierung, exprimiert und sekretiert von normalen T-Zellen; „Regulated on Activation, Normal T cell Expressed und Secreted") von Astrozyten, Mikroglia und Leukozyten. Einmal freigesetzte Chemokine bewirken gleichzeitig eine Chemoattraktion und Aktivierung von Mikroglia, Makrophagen, Neutrophilen und T-Lymphozyten an der Stelle der Verletzung. Eine Chemokin-vermittelte Aktivierung bedeutet die induzierte Synthese und Sekretion von reaktiven Sauerstoffspezies, Proteasen und Zytokinen aus den passenden Zielzellen, mit einem nachfolgenden Anstieg des Sekundärschadens, welcher direkt den sekretierten Agenzien zuzuschreiben ist.
Um sich spezifischeren Beispielen zuzuwenden, die CC-Chemokine, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β und RANTES werden von Astrozyten und Makrophagen nach einer mechanischen Verletzung des Gehirns exprimiert, und deren Expression korreliert mit dem Beginn einer reaktiven Gliose und dem Auftreten von MNPs an der Stelle der Verletzung. In einem ähnlichen Beispiel ist die Expression von MCP-1 und MIP-1α in MNPs und Astrozyten nach einer fokalen zerebralen Ischämie in der Ratte nachgewiesen worden. In einem komplexeren Beispiel ist eine selektive und zeitabhängige Hochregulierung von wachstumsreguliertem Onkogen (GRO-α) gezeigt worden. Das Interferon-γ-induzierbare Protein (IP-10) und MCP-1 und 5 wurden innerhalb der ersten 6 bis 24 h nach einer Rückenmarksprellungsverletzung in der Ratte beobachtet. GRO-α-Expression und Chemoattraktion von Neutrophilen ist ein frühes Ereignis (innerhalb von 6 h), IP-10-Expression und T-Zellchemoattraktion ist ein mittleres Ereignis (6 bis 12 h) und schließlich ist die MCP-1 und 5-Expression und eine MNP-Chemoattraktion ein spätes Ereignis (12 bis 24 h). Im Gegensatz dazu schien die Expression von MIP-1α und RANTES bei einer Rückenmarksprellung wenig beeinflusst zu sein, womit nicht gesagt ist, dass die infiltrierenden und proliferierenden Zellen keine Rezeptoren für diese zwei β-Chemokine besitzen.
Mehrere Wissenschaftler haben Chemokine bei einer experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) untersucht und gezeigt, dass Endothelzellen, MNPs und Astrozyten MCP-1 zu Beginn der akuten Phase exprimieren. Monozyten infiltrieren die Verletzungsstellen 24 h später und dies wird gefolgt von einer weltverbreiteten Expression von MCP-1 im Rückenmark. Die Expression von MIP-1α, MIP-1β, RANTES und MCP-3 schwankt entsprechend der Schwere oder des Status von EAE. Die zeitlichen und räumlichen Muster der Chemokinexpression regulieren die Pathogenese der Erkrankung, und MIP-1α und MCP-1 kontrollieren die MNP-Infiltration während einer akuten bzw. rezidivierenden EAE. Schließlich zeigen transgene Mäuse, die MCP-1 überexprimieren, eine deutliche MNP-Infiltration in das ZNS.
Der Beitrag von Apoptose zu einem Sekundärschaden
In der anfänglichen Phase eines ZNS-Traumas, einschließlich SCI, beginnen schwer geschädigte Zellen fast sofort zu sterben; der passive Prozess einer Nekrose. Nachfolgend einer Zellaktivierung leiten Entzündungsmediatoren eine zweite, verzögerte und anhaltende Periode des Zelltods in die Wege, welche einen aktiven zellulären Selbstmordprozess ergibt, der manchmal "programmierter Zelltod" oder häufiger Apoptose genannt wird. Apoptotische Wirkungen erstrecken sich sowohl auf Neuronen als auch Oligodendrozyten, und deren Beitrag zum sekundären Schaden ist progressiv. Wenn sie einmal induziert ist, kann Apoptose über eine verlängerte Zeitperiode und in Gebieten auftreten, welche von der anfänglichen Stelle der Verletzung anatomisch entfernt sind. Die zeitliche und räumliche Wirkung der Apoptose kann auch erklären, warum der Zelltod noch immer beobachtet wird, wenn Immunzellen an oder nahe der Stelle der Verletzung nicht mehr länger nachweisbar sind.
Apoptose ist in einer Vielzahl von entzündlichen und traumatischen Bedingungen beobachtet worden, einschließlich SCI, AD, MS, traumatischer Gehirnverletzung und Schlaganfall, Lungenerkrankung und Krebs. Zum Beispiel ist die Apoptose von Neuronen und Oligodendrozyten (assoziiert mit einer Demyelinisierung) in einer Anzahl von Tiermodellen für ZNS-Trauma und SCI sichtbar. Daten von typischen Tiermodellen eines ZNS-Traumas zeigen, dass die Apoptose ziemlich früh beginnt (innerhalb von Stunden) und sich auf mindestens 1 Woche nach der Verletzung erstreckt. In einigen Fällen ist das experimentelle Protokoll verlängert worden und die Apoptose ist 3 Wochen nach der Verletzung immer noch nachweisbar. In mindestens einer veröffentlichten Studie weisen die Daten darauf hin, dass es zwei unterschiedliche apoptotische Wellen gibt. Eine immunhistochemische Untersuchung von humanem Rückenmark von Patienten, welche zwischen 3h und 2 Monaten nach einer SCI starben, zeigten in 93% der Fälle eine Apoptose von Neuronen und Oligodendrozyten. In den Tier- und postmortalen Untersuchungen wurden apoptotische Ereignisse in einer Entfernung von der Stelle der Verletzung nachgewiesen.
Apoptotische Mechanismen schließen Veränderungen in den intrazellulären Signalwegen und der Genexpression ein. Die Aktivierung von intrazellulären Endonucleasen und Proteasen (zum Beispiel Caspasen) führt zu einer DNA-Spaltung (der charakteristischen "DNA-Leiter", beobachtet mitttels Gelektrophorese), teilweiser Degradation des intrazellulären Cytoskeletts und der Organellen und schließlich zu einem verzögerten Zelltod. In ZNS wird Apoptose initiiert durch von Leukozyten und Astroglia stammenden Entzündungsmediatoren einschließlich Zytokinen, Chemokinen, reaktiven Sauerstoffspezies, NO und exzitatorischen Aminosäuren. Erneut unterstreicht dies den Beitrag dieser Mediatoren zum Sekundärgewebeschaden.
Die Bedeutung und relative Intensität von Apoptose und Nekrose scheinen für einen bestimmten Mediator unterschiedlich zu sein und NMDA-Rezeptorantagonisten und NO töten beispielsweise Neuronen unter Verwendung beider Mechanismen. NMDA- oder NO-vermittelte Apoptose beteiligt die Aktivierung der intrazellulären Caspase-Kaskade. Reaktive Sauerstoffspezies, eine Folge der NMDA- und NO-Aktivierung, sind wahrscheinlich auch in die Apoptose involviert, aber es scheint, dass die Sauerstoffradikalbildung und Lipidperoxidation stromabwärts der Caspase-Aktivierung auftritt. Im Gegensatz dazu können von Leukozyten stammende Zytokine die Apoptose entweder aktivieren oder supprimieren. Zum Beispiel induziert TNA-α Apoptose in einer Vielzahl von Zellitypen durch mindestens zwei verschiedene intrazelluläre Signalwege. IL-1 β besitzt mit NO eine synergistische Rolle bei der Aktivierung der Apoptose, aber GM-CSF und IL-3 supprimieren die Apoptose von humanen und Rattenleukozyten. GM-CSF supprimiert die Apoptose von humanen Neutrophilen, was der Aktivierung des FAS oder sogenannten "Todes"-Rezeptor folgt, und die Zellen behalten ihre Fähigkeit, Sauerstoffradikale und Proteasen zu erzeugen. IL-4, ein starkes Mitogen für Mikroglia supprimiert die Apoptose in humanen Neutrophilen über einen Mechanismus, der die Induktion der de novo-Proteinsynthese einschließen kann. Diese Beispiele deuten darauf hin, dass eine Suppression oder Aktivierung der Apoptose zu einem Sekundärgewebeschaden führt, welcher von dem exakten Gemisch der Entzündungsmediatoren an der Stelle der Verletzung abhängt.
Leukozyten-vermittelte Entzündung in ZNS- und Nicht-ZNS-Erkrankungen und Bedingungen
Die Unterscheidung zwischen einer Erkrankung und einer klinischen Bedingung ist nicht immer einfach zu treffen. Zum Beispiel kann ein Profiboxer im Verlauf seiner Karriere eine Vielzahl von geschlossenen Kopfverletzungen (eine Bedingung) erleiden und kann dahingehend eine Form der Demenz (Dementia pugilistica) im späteren Leben entwickeln, die sehr ähnlich ist mit der Alzheimer-Krankheit. Die Ähnlichkeiten zwischen einer traumatischen Verletzung des Nervensystems, welche primär abhängen von aggressiven Entzündungsprozessen und einem Sekundärschaden, und einer Anzahl von neurodegenerativen Erkrankungen sind auffallend. In der Tat zeigt ein neuerer Bericht, dass die Entzündungsreaktion, ausgelöst durch ein Kopftrauma, einen Patienten gegenüber AD anfällig macht, und dass eine Gehirnentzündung bei AIDS-Patienten die amyloide Plaquebildung, ein Merkmal der AD, begünstigt. Von dieser Perspektive aus gesehen teilen die Erkrankungen, die durch die hierin bereitgestellten Konjugate angesteuert werden, eine gemeinsame Ethyologie und/oder Pathologie.
Ein Sekundärschaden des ZNS ist beispielhaft für den Verlauf von Ereignissen und die Rolle von Chemokinen und Chemokinrezeptor-tragenden Zellen im progressiven Schaden, der bei pathophysiologischen Entzündungsreaktionen beobachtet wird. Wie unten beschrieben wird und wie es Fachleuten bekannt ist, spielen Immuneffektorzellen eine Rolle bei der Pathologie zahlreicher Erkrankungen und entzündlicher Prozesse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine entzündliche Lungenerkrankung, Krebsarten, insbesondere bei festen Tumoren, in denen große Mengen an infiltrierenden Leukozyten beobachtet werden, Angiogenese, viralen und bakteriellen Infektionen einschließlich einer HIV-Infektion, Autoimmunerkrankungen und anderen.
C. Bestandteile der Konjugate
1. Zusammenfassung
Hierin werden Verbindungen und Zusammensetzungen bereitgestellt, und deren Verwendungen zur Behandlung pathologischer Bedingungen, die verbunden sind mit Entzündungsreaktionen, insbesondere Entzündungsreaktionen, welche assoziiert sind mit der Aktivierung, Proliferation und Migration von Immuneffektorzellen, einschließlich Leukozytenzelltypen, Neutrophilen, Makrophagen; Eosinophilen und andere solche Zellen, und die pathophysiologischen Bedingungen, die mit diesen Entzündungsreaktionen verbunden sind.
Im Folgenden werden bereitgestellt:

(1) Zusammensetzungen und deren Verwendungen zur Behandlung der pathophysiologischen Bedingungen, die verbunden sind mit Entzündungsreaktionen, vermittelt durch Immuneffektorzellen, durch Ansteuern und Liefern cytotoxischer Agenzien an diese Zellen. Diese pathophysiologischen Bedingungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf den Sekundärgewebeschaden, der assoziiert ist mit oder eine Konsequenz dieser Entzündungsreaktionen ist. In Abhängigkeit vom Timing der Behandlung, der Dauer der Behandlung und der Bedingung oder Erkrankung hemmen, verbessern oder blockieren die Verfahren diese Reaktionen.

Das Ansteuern und die Lieferung werden durch Rezeptoren bewirkt, welche auf diesen Zellen exprimiert werden. Solche Rezeptoren schließen diejenigen für Zytokine und insbesondere Rezeptoren für Chemokine ein. Folglich werden insbesondere Chemokinrezeptoren angesteuert. Auch angesteuert werden andere Rezeptoren, wie etwa Rezeptoren für Nichtchemokin-Zytokine, wie etwa IL-4 und GM-CSF, welche auf diesen Zellen exprimiert werden. Die hierin bereitgestellten Konjugate (siehe (2)) sind für eine Verwendung in diesen Verfahren vorgesehen. Es können auch andere Konjugate, die Fachleuten bekannt sind, wie etwa IL-4 und Toxin enthaltende Konjugate verwendet werden, um alle Zelltypen anzusteuern, die dafür spezifische Rezeptoren exprimieren.
Bereitgestellt werden folglich Zusammensetzungen und deren Verwendungen, welche die hierin bereitgestellten Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien verwenden und Zusammensetzungen und deren Verwendungen, welche bekannte Konjugate verwenden, die Liganden enthalten, die an Rezeptoren binden, welche auf Zellen vorliegen, die in diese pathophysiologischen Entzündungserkrankungen involviert sind.

(2) Es werden auch Konjugate bereitgestellt, welche ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und ein zielorientiertes Agens enthalten. Diese Konjugate sind vorgesehen für eine Verwendung in den obigen Verfahren, können aber auch verwendet werden, um irgendein Agens an Zellen zu lieferen, welche Rezeptoren exprimieren, mit denen Chemokine wechselwirken und eine Internalisierung von gebundenen Anteilen bewirken oder erleichtern.
(3) Es werden auch Zusammensetzungen und deren Verwendungen bereitgestellt, in denen die obigen Verfahren kombinert werden mit anderen im Fachgebiet bekannten Verfahren zur Behandlung der Erkrankungen, die verbunden sind mit den pathophysiologischen Entzündungsreaktionen.

2. Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteile
Zur Verwendung hierin ist jedes Agens vorgesehen, welches selektiv Rezeptoren ansteuert, die auf der Palette von Zellen gefunden werden, an die irgendein Chemokin selektiv bindet. Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens wird bevorzugt ausgewählt aus der Familie der Chemokine (ungefähr etwa 6 bis etwa 14 kDa), die 40 oder mehr Polypeptide darstellt, welche die Aktivierung, Migration, Proliferation von verschiedenen Immuneffektorzellen fördern, die in Entzündungsreaktionen involviert sind. Wie oben angemerkt, ist diese Familie in mindestens vier Untergruppen unterteilt, basierend auf der Position oder Existenz von vier konservierten Cysteinresten. Die Mitglieder der CXC-Chemokin- (oder α) Unterfamilie besitzen eine zwischenliegende Aminosäure zwischen den ersten zwei konservierten Cysteinen, wohingegen die Mitglieder der CC- (oderβ) Unterfamilie dies nicht tun. Den C- (oder γ)-Chemokinen fehlt der erste und dritte Cysteinrest. Im Allgemeinen wirken die α-Chemokinmitglieder bevorzugt auf Neutrophile und T-Lymphozyten und die β-Chemokine wirken auf Monozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten. Außerdem wirken mehrere Mitglieder der α- und β-Chemokinunterfamilien auf dendritische Zellen, welche migratorische Zellen sind, die wirksame Antigenpräsentierende Eigenschaften aufweisen, und vermutlich bei der Pathophysiologie von vielen Entzündungserkrankungen beteiligt sind (Xu et al., L. Leukoc. Biol., 60: 365–71, 1996 und Sozzani et al., J. Immunol., 159: 1993-2000, 19971. Kürzlich ist über ein viertes humanes Chemokin des CX3C-Typs, bezeichnet als Fraktalkine, berichtet worden (Bazan et al., Nature 385: 640–4, 1997; Imai et al., Cell, 91: 521-30, 1997; Mackay, Curr. Biol. 7: R384-6, 1997). Anders als andere Chemokine existiert Fraktalkine in Membran- und löslichen Formen. Die lösliche Form ist ein wirksamer chemotaktischer Faktor für Monozyten und T-Zellen. Der Zelloberflächenrezeptor für dieses Chemokin wird CX3CR1 bezeichnet. Es sollte erwähnt werden, dass es feine Unterschiede zwischen der chemischen Natur und den physiologischen Wirkungen von Chemokinen geben kann, die von verschiedenen Spezies stammen (Baggiolini et al., Adv. Immunol., 55: 97–179, 1994 und Haelens et al., Immunobiol., 195: 499–521, 19961.
a. Chemokine
Chemokine üben ihre Wirkungen durch Bindung an spezifische Zielzellrezeptoren aus (zum Beispiel CXCR-1 mit 5 und CCR-1 mit 9, XCR1 und CX3CR-1 ). Diese Rezeptoren binden an die verschiedenen Chemokinliganden in einer überlappenden und komplexen Art und Weise (siehe Tabelle 1 unten). Die Spezifität (oder die Spezifitäten) der Rezeptorbindung und die zelluläre Verteilung von bestimmten Rezeptoren bestimmen die inflammatorischen Zelltypen, die ein bestimmtes Chemokin beeinflussen wird. Zum Beispiel besitzt MCP-3 ähnliche Wirkungen wie MCP-1, bindet aber an einen breiteien Bereich von Zellsubtypen (Combadiere et al., J. Biol. Chem., 270: 29671–5, 1995; Franci et al., J. Immunol., 154: 6511–7, 1995; Weber et al., J. Immunol., 154: 4166-72, 1995; Gong et al., J. Biol. Chem., 271: 10521–27, 1996 und Proost et al., J. Leukoc. Biol., 59: 67–74, 1996). Außerdem binden Chemokine an Heparin und Glykosaminoglykane der Zelloberfläche auf eine Art und Weise, welche vermutlich die Aufrechterhaltung eines Chemokingradienten erleichtert, der für die Aktivierung und die Verschiebung von Leukozyten benötigt wird (Schall et al., Current Biol., 6: 865–73, 1994 und Tanaka et al., Immunology Today, 14: 111–15, 1993).
Nicht beschränkende Beispiele für Chemokine zur Verwendung in den hierin bereitgestellten Konjugaten und Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die α-, β- und γ-Untergruppen der Chemokine. Insbesondere schließen momentan bevorzugte Chemokine zur Verwendung als der proteinartige Ligandenanteil in den Chimären Ligand-Toxinen ein, sind aber nicht bechränkt auf die α-Chemokine, die im Fachgebiet als IL-8 bekannt sind, Granulozyten-chemotaktisches Protein-2 (GCP-2); wachstumsbezogenes Onkogen-α (GRO-α), GRO-β und GRO-γ; das von Epithelzellen abgeleitete Neutrophile aktivierende Peptid-78 (ENA-78); das basische Plättchenprotein (PBP); das Bindegewebe aktivierende Peptid III (CTAP III); das Neutrophile aktivierende Peptid-2 (NAP-2); der Plättchenfaktor 4 mit geringer Affinität (LAPF-4); Monokin, induziert durch Interferon γ (MIG); der Plättchenfaktor 4 (PF4); das Interferon-induzierbare Protein 10 (IP-10, welches für Monozyten, T-Zellen und glatte Muskelzellen wirksame Funktionen als chemotaktischer Faktor besitzt); die von Stromazellen stammenden Faktoren SDF-1 a, SDF-1β und SDF-2; die β-Chemokine, die im Fachgebiet als die Monozytenchemotaktischen Proteine MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 und MCP-5 bekannt sind; die Makrophagen-inhibitorischen Proteine MIP-1α MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-2β, MIP-3α MIP-3β, MIP-4 und MIP-5; das von Makrophagen stammende Chemokin (MDC); das humane Chemokin 1 (HCC-1); RANTES; Eotaxin 1; Eotaxin 2; TARC; SCYA17 und I-309; das Dendritenzell-Chemokin 1 (CD-CK-1); das γ-Chemokin, Lymphotaktin; die lösliche Form des CXC3-Chemokins Fraktalkine, alle anderen, die Fachleuten bekannt sind; und alle synthetischen oder modifizierten Proteine, die entworfen wurden, um and die Chemokinrezeptoren zu binden. Chemokine können unter Verwendung von Routineverfahren aus natürlichen Quellen isoliert werden, oder unter Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Chemokin codiert, exprimiert werden. Biologisch aktive Chemokine sind rekombinant in E. coli exprimiert worden (zum Beispiel diejenigen, welche von R&D Systems, Minneapolis, MN kommerziell erhältlich sind).
Chemokinrezeptoren auf Zellen, die einen Sekundärgewebeschaden fördern, gehören im Allgemeinen zu der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rhodopsin-ähnlichen Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen. Es ist bevorzugt, dass das Chemokin in chimärem Ligand-Toxin mit einer Spezifität für mindestens einen Chemokinrezeptor auf einer Immuneffektorzelle bindet, welche in Entzündungsprozesse involviert ist, wie etwa diejenigen, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern. Solche Rezeptoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf beispielsweise ein oder mehrere der Rezeptoren, die im Fachgebiet als der Duffy-Antigenrezeptor für Chemokine (DARC) bekannt sind, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX3CR-1, CD97, XCR1 und andere Chemokinrezeptoren.
Tabelle 1 unten zeigt eine Liste typischer Chemokine, die in Zusammenhang stehen mit pathophysiologischen Entzündungsreaktionen, einschließlich einem Sekundärgewebeschaden, den Rezeptor (die Rezeptoren), an die sie binden, und die Zelltypen, welche durch jedes von ihnen in Menschen beeinflusst werden. Tabelle 1

M: von MNP abstammende Zellen (Monzyten, Makrophagen und Mikroglia)
N: Neutrophile
T: T-Lymphozytenzellsubtypen
L: Leukozytenzellsubtypen
E: Eosinophile
B: Basophile
NK: natürliche Killerzellen
Dc: dendritische Zellen.

Außerdem schließen Chemokine ALP und Lungkine (siehe zum Beispiel SEQ NO.69 bzw. 70; siehe auch Hromas et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 258: 737–740) und Lungkine (siehe Rossi et al. (1999) J. Immunol.
162: 5490–5497), Tim-1, ein humanes CXC-Chemokin (siehe zum Beispiel internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 99/33990, basierend auf der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/026,546; siehe auch EMBL-Datenbank ID HS1301003, Signaturnummer AA5056541, Chemokine und Chemokinähnliche Peptide, die in der internationalen PCT-Anmeldung Nr. WO 99/32631 beschrieben werden, Lkn-1, beschrieben in der internationalen PCT-Anmeldung Nr. WO 99/28473, Chemokin α-5, Chemokin α-6, Chemokin β15 und andere ein.
Die Daten in Tabelle 1 betreffen Menschen. Es kann Speziesunterschiede zwischen den spezifischen Eigenschaften der Chemokinrezeptoren geben, und Chemokine können verschiedene Affinitäten für verschiedene Rezeptoren besitzen. Folglich können speziesspezifische Konjugate hergestellt werden. Es können sogar allelische Unterschiede in Rezeptoren unter Mitgliedern einer Spezies vorhanden sein, und falls nötig können Allel-spezifische Konjugate hergestellt werden. Außerdem können verschiedene Spezies Homologe des humanen Chemokins exprimieren. Zum Beispiel ist TCR-3 das murine Homologe des humanen I-309 (Goya et al., J. Immunol. 160: 1975–81, 1998).
Es ist verständlich, dass andere Chemokine bekannt sind und dass solche Chemokine und dafür spezifische Rezeptoren identifiziert werden können, und falls notwendig hergestellt werden können und verwendet werden können, um Konjugate, wie hierin beschrieben, zu erzeugen. Die Erkrankungen, für die die resultierenden Konjugate verwendet werden können, können durch die Spezifität und durch Zellpopulationen, auf denen Rezeptoren dafür exprimiert werden, bestimmt werden, und können auch empirisch bestimmt werden unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Modellen, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich derjenigen, die hierin erläutert, beschrieben werden und/oder auf die hierin verwiesen wird.
b. Selektion eines Chemokins
Chemokine zur Verwendung in den Konjugaten werden ausgewählt entsprechend der zu behandelnden Erkrankung oder Krankheit und auch entsprechend dem Timing und der Dauer der Behandlung. Ein Chemotoxin, welches ein höheres Ausmaß an Rezeptorspezifität aufweist, kann zum Beispiel in einem frühen Stadium eines Sekundärgewebeschadens wünschenswert sein, wo beispielsweise Mikroglia und/oder Makrophagen eine Entzündung einleiten. Das Entfernen dieser Zellen mit einem sehr spezifischen Agens kann das Potential zur Aktivierung der Umgebung und bislang gutartiger Zellen verringern. Wenn in einem Zwischenstadium oder in späten Stadien der Erkrankung andere Leukozytenuntergruppen rekrutiert werden, kann ein breiteres Spektrum der Zellspezifität wünschenswert sein. Außerdem würde ein passendes Chemotoxin mit breitem Spektrum einen sehr starken Schlag für diese beschränkten Leukozytenpopulationen liefern, welche mehrere Typen von Chemokinrezeptoren exprimieren. Es scheint, dass bestimmte Chemokine in speziellen Erkrankungsstadien mehr Einfluss besitzen als es andere tun. Zum Beispiel scheint die MCP-1-Expression akutes EAE zu regulieren, wohingegen die MIP-1β-Expression mit der Schwere der rezidivierenden EAE korreliert, und eine immunhistochemische Färbung von AD-Gehirnproben zeigt eine Vorherrschaft der MIP-1α-Expression gegenüber mehreren anderen Chemokinen. Somit wären beispielsweise MIP-1α und MIP-1β die Liganden der Wahl für ein Chemotoxin, um MS bzw. die Alzheimer-Krankheit zu behandeln. Liganden wie etwa IP-10 und RANTES, welche für die Rezeptoren CXCR3 und CCR5 spezifisch sind, welche in Fällen von humaner MS hochreguliert sind, würden für eine Behandlung von MS verwendet werden. Schließlich zeigen die Eotaxine 1 und 2 eine hohe Spezifität für den CCR3-β-Chemokinrezeptor, welcher bevorzugt von Eosinophilen exprimiert wird. Deshalb können Eotaxin-Chemotoxine verwendet werden für eosinophile Erkrankungen, einschließlich verschiedener Lungenerkrankungen, Eosinophilie-Myalgiesyndrom, nasale Allergie und Polyposis.
Eotaxin und SDF-1β sind Beispiele für Chemokinliganden, welche ein beschränktes und sehr spezifisches Rezeptorbindungsprofil aufweisen. Ein Ligand, der sehr spezifische Zelltypen durch eine beschränkte Untermenge von verfügbaren Rezeptoren ansteuert. MCP-3 und MCP-1 sind Beispiele für Liganden mit breiten Zell- und Rezeptorbindungsprofilen. Solche Chemokinliganden können für eine einzelne oder einen breiten Bereich von klinischen Bedingungen relevant sein. Ein Ligand, der einen breiten Bereich an Zelltypen ansteuert, unter Verwendung von Rezeptorsubtypen, kann auf allen Zellen oder nur auf bestimmten Zellen exprimiert werden. Dies ist weitgehend eine Funktion der Zelltypen, welche für eine bestimmte Bedingung spezifisch sind oder für einen Bereich von Bedingungen gemeinsam vorliegen.
Die folgende Tabelle fasst einige beispielhafte Liganden für die Behandlung ausgewählter Erkrankungen und Bedingungen zusammen.
Tabelle 2 Beispielhafter Ligand (Beispsielhafte Liganden) und behandelte Krankheit
Kursiv gedruckte Liganden sind α oder Mitglieder der CXC-Chemokinfamilie, die anderen sind β oder Mitglieder anderer Chemokinfamilien.
Die angegebenen Liganden können in Kombinationen zur Behandlung der angegebenen Erkrankungen verwendet werden.
Eine Kombinationsbehandlung kann auch durch Verwendung von Molekülen erreicht werden, die aus zwei oder mehreren zusammengesetzt sind, wie etwa zwei verschiedenen Chemokine, angeheftet an jedes Ende eines Toxinanteils. In diesem Fall werden diese dualen Chemokinfusionen bevorzugt einen Liganden von jeder der α- und β-Chemokinfamilien enthalten.
Aminosäuresequenzen von beispielhaften Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien (Liganden) zur Eingliederung in die hierin bereitgestellten Konjugate sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Beispielhafte Aminosäuresequenzen von Liganden
Alle Sequenzen außer ALP (siehe Hromas et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 258: 737–740) und Lungkine (siehe Rossi et al. (1999) J. Immunol. 162: 5490–5497), die in der Tabelle aufgelistet sind, sind Sequenzen des humanen Proteins. Eine Nukleotidsequenz für MCP-2 ist in SEQ ID NO: 67 aufgeführt, und Nukleotidsequenzen für Maus-ALP und Maus-Lungkine sind in den SEQ ID NO: 69 bzw. 70 aufgeführt.
c. Nichtchemokin-Zytokine
Konjugate, welche Nichtchemokin-Zytokine enthalten, die auch an Zelltypen binden, die Chemokinrezeptoren exprimieren, oder an Zelltypen, die mit einem Sekundärgewebeschaden in Zusammenhang stehen, können in den hierin bereitgestellten Verfahren auch verwendet werden. Konjugate, welche solche Nichtchemokin-Zytokine enthalten, sind für andere Behandlungen verwendet worden, wie etwa der Behandlung von Krebsarten durch Ansteuern der Tumorzellen. Es ist hierin beabsichtigt, dass Zytokine aufgrund deren Fähigkeit ausgewählt werden, an Chemokinrezeptor-tragende Zellen zu binden, wie etwa Leukozyten, welche Tumoren infiltrieren und andere Zellen, die mit unerwünschten Entzündungsreaktionen in Zusammenhang stehen.
Die Nichtchemokin-Zytokine, Kolonie-stimulierenden Faktoren (CSF) und Nichtchemokin-Interleukine (IL), die als ein proteinartiger Ligandenanteil zur Ansteuerung von Rezeptoren auf Zellen geeignet sind, welche Chemokinrezeptoren tragen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das endotheliale Monozyten-aktivierende Polypeptid II (EMAP-II), Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF), Granulozyten-CSF (G-CSF), Makrophagen-CSF (M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 und IL-13, welche entsprechend an die EMAP-II-, GM-CSF-, G-CSF-, M-CSF-, IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-12-, IL-13-Familien der Zytokinrezeptoren auf Zellen binden, die in eine Entzündungsreaktion involviert sind, wie etwa auf Zellen, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern.
Beispiele für andere Rezeptor-assoziierte Proteine, welche als Ansteuerungsagenzien zur Behandlung oder Hemmung pathophysiologischer Bedingungen, verbunden mit Entzündungsreaktionen, verwendet werden können sind diejenigen, welche an Nichtchemokin-Rezeptoren auf ein oder mehreren der Zellen, welche den Sekundärgewebeschaden fördern, binden und/oder ein oder mehrere der Zellen, welche den Sekundärgewebeschaden fördern, aktivieren, wie etwa, aber nicht beschränkt auf, die acylierten LDL-Radikalfängerrezeptoren 1 und 2 und die Rezeptoren für das LDL, Lipoprotein-1 mit sehr geringer Dichte (VLDL-1), VLDL-2, Glykoprotein 330/Megalin, Lipoproteinrezeptor-verwandtes Protein (LRP), α-2-Makroglobulin, sorLA-1. Ein besonders nützliches Rezeptor-assoziiertes Protein, bis jetzt nicht benannt, besitzt ein Molekulargewicht von etwa 39000 Dalton und bindet an und moduliert die Aktivität von Proteinen, wie etwa Mitgliedern der Rezeptorfamilie für das Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL).
d. Antikörper-Ligandanteile
Der proteinartige Ligandanteil im Chemokinrezeptor-Ansteueiungskonjugat kann auch ein Antikörper sein, insbesondere ein monoklonaler Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, welcher spezifisch ist für einen Rezeptor, der auf Zellen exprimiert wird, die mit der Entzündungsreaktion in Zusammenhang stehen, insbesondere einen Chemokinrezeptor und Rezeptoren, die auf Zellen exprimiert werden, welche Chemokinrezeptoren exprimieren. Es ist bevorzugt, dass der monoklonale Antikörper spezifisch ist für einen Chemokinrezeptor, zum Beispiel DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXC4-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, XCR1, CX3CR-1, CD97 und andere solche Rezeptoren.
In einigen Fällen kann der Antikörper spezifisch sein für einen Nichtchemokin-Zytokiniezeptor EMAPII, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13. Konjugate, die diese Antikörper ernthalten, werden für ein Ansteuern von Zellen verwendet werden, welche Chemokinrezeptoren exprimieren und auch die angesteuerten Zytokinrezeptoren, oder von Zellen, die in einen Sekundärgewebeschaden involviert ist, welche solche Nichtchemokin-Rezeptoren exprimieren.
Nicht beschränkende Beispiele für monoklonale Antikörper, welche in den Konjugaten verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf MAC-1, MAC-3, ED-1, ED-2, ED-3 und monoklonale Antikörper gegen die folgenden Antigene CD5, 14, 15, 19, 22, 34, 35, 54 und 68; OX4, 6, 7, 19 und 42; Ber-H2, BR96, Fib75, EMB-11, HLA-DR, LN-1 und Agglutinin-1 von Ricinus communis.
Antikörperfragmente können hergestellt werden durch proteolytische Hydrolyse des Antikörpers oder durch Expression von DNA, welche für das Fragment codiert, in E. coli. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papainverdau von ganzen Antikörpern mittels konventioneller Verfahren erhalten werden. Antikörperfragmente können zum Beispiel durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin hergestellt werden, um ein 5S-Fragment bereitzustellen, welches als F(ab')₂ bezeichnet wird. Dieses Fragment kann weiterhin gespalten werden unter Verwendung eines thiolreduzierenden Agens und gegebenenfalls einer Blockierungsgruppe für Sulfhydrylgruppen, die sich aus der Spaltung von Disulfidbindungen ergeben, um monovalente 3,5S-Fab'-Fragmente zu erzeugen. Alternativ produziert eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Pepsin direkt zwei monovalente Fab'-Fragmente und ein Fc-Fragment (siehe zum Beispiel die US-Patente Nr. 4,036,945 und 4,331,647, und darin enthaltene Referenzen, siehe auch Porter, R. R., Biochem. J. 73: 119–126, 1959). Andere Verfahren zur Spaltung von Antikörpern, wie etwa eine Trennung schwerer Ketten, um monovalente leicht-schwere Kettefragmente zu bilden, eine weitere Spaltung der Fragmente oder andere enzymatische, chemische oder genetische Verfahren können auch verwendet werden, solange die Fragmente an das Antigen binden, welches von dem intakten Antikörper erkannt wird.
Fv-Fragmente enthalten eine Verbindung von V_H- und V_L-Ketten. Diese Verbindung kann nichtkovalent sein, wie es von Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659–62, 1972 beschrieben wird. Alternativ können die variablen Ketten durch eine intermolekulare Disulfidbindung verbunden sein oder durch Chemikalien, wie etwa Glutaraldehyd, vernetzt sein. Bevorzugt enthalten die Fv-Fragmente durch einen Peptidlinker verbundene V_H- und V_L-Ketten. Diese Einzelketten-Antigen-bindenden Proteine (sFv) werden hergestellt durch Konstruieren eines Strukturgens, umfassend DNA-Sequenzen, welche für die V_H- und V_L-Domänen codieren, verbunden durch ein Oligonukleotid. Das Strukturgen wird in einen Expressionvektor insertiert, welcher nachfolgend in eine Wirtszelle, wie etwa E. coli, eingebracht wird. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine einzelne Polypeptidkette mit einem Linkerpeptid, welches die 2V-Domänen überbrückt. Verfahren zur Herstellung von sFvs werden zum Beispiel von Whitlow und Filpula, Methods, 2: 97–105, 1991; Bird et al., Science 242: 423–426, i 988; Pack et al., Bio/Technology 1 1: 1271–77, 1993 und Ladner et al., US-Patent Nr. 4,946,778 beschrieben.
Eine andere Form eines Antikörperfragments ist ein Peptid, welches für eine einzelne komplementaritätsbestimmende Region (CDR, „complementarydetermining region") codiert. CDR-Peptide ("minimale Erkennungseinheiten") können erhalten werden durch Konstruktion von Genen, welche für die CDR eines Antikörpers von Interesse codieren. Solche Gene werden zum Beispiel hergestellt unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, um die variable Region aus RNA von Antikörper-produzierenden Zellen zu synthetisieren (siehe zum Beispiel Larrick et al., Methods, 2: 106–10, 1991 und Orlandi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837, 1989).
Antikörper, welche an einen Chemokinrezeptor oder Nichtchemokin-Zytokinrezeptor auf einer Zelle, welche einen Sekundärgewebeschaden fördert, binden, können hergestellt werden unter Verwendung eines intakten Polypeptids oder eines biologisch funktionellen Fragments, das kleine Peptide von Interesse als das immunisierende Antigen enthält. Die Polypeptide oder ein Peptid, welches verwendet wird, um ein Tier zu immunisieren (zum Beispiel abgeleitet von translatierter cDNA oder chemischer Synthese) können, falls erwünscht, an ein Carrierprotein konjugiert werden. Normalerweise verwendete Carrier, welche chemisch an die Peptide gekoppelt sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke (KLH, „keyhole limpet hemocyanin"λ, Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanustoxoid. Das gekoppelte Peptid wird dann verwendet, um das Tier (zum Beispiel eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) zu immunisieren.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist konventionell und gut bekannt (siehe zum Beispiel Kohler et al., Nature 256: 495–7, 1975 und Harlow et al., in: Antibodies: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Pub., 1988). Kurz gesagt können monoklonale Antikörper erhalten werden durch Injektion von Mäusen mit einer Zusammensetzung umfassend ein Antigen, Überprüfen der Anwesenheit der Antikörperproduktion durch Entnehmen einer Serumprobe, Entfernen der Milz, um B-Lymphozyten zu erhalten, Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomzellen, um Hybridomzellen zu erzeugen, Klonieren der Hybridomzellen, Selektion positiver Klone, welche Antikörper gegen das Antigen produzieren und Isolieren der Antikörper aus der Hybridomkultur. Monoklonale Antikörper können aus Hybridomkulturen isoliert und gereinigt werden durch eine Vielzahl von gut etablierten Verfahren. Solche Isolierungsverfahren schließen eine Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose, eine Größenausschlusschromatographie und eine Ionenaustauschchromatographie ein und sind Fachleuten gut bekannt (siehe zum Beispiel Pharmacia Monoclonal Antibody Purification Handbook (zum Beispiel Katalog Nr.18-1037-461).
Antikörper können auch von subhumanen Primatenantikörpern stammen. Allgemeine Verfahren zum Anziehen therapeutisch verwendbarer Antikörper in Pavianen können beispielsweise in Goldenberg et al., Internationale Patentveröffentlichung WO 91/11465 (1991) und Losman et al., Int. J. Cancer, 46: 310–314, 1990 gefunden werden. Alternativ kann ein therapeutisch verwendbarer Antikörper von einem "humanisierten" monoklonalen Antikörper stammen. Humanisierte monoklonale Antikörper werden produziert durch Transferieren von komplementaritätsbestimmenden Regionen der Maus von schweren und leichten variablen Ketten des Mausimmunglobulins in eine humane variable Domäne, und dann durch Substituieren humaner Reste in Gerüstregionen der murinen Gegenstücke. Die Verwendung von Antikörperbestandteilen, welche von humanisierten monoklonalen Antikörpern abgeleitet sind, vermeidet mögliche Probleme, die mit der Immunogenität von konstanten Mausregionen assoziiert sind. Allgemeine Verfahren zum Klonieren von murinen variablen Immunglobulindomänen werden zum Beispiel von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–7, 1989 beschrieben, Verfahren zur Herstellung humanisierter monoklonaler Antikörper werden zum Beispiel beschrieben von Jones et al., Nature 321: 522–5, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323–7, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534–6, 1988; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285–9, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437–62, 1992 und Singer et al., J. Immunol. 150: 2844–67, 1993.
Es ist auch möglich, eine Anti-Idiotyp-Technologie zu verwenden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, welche ein Epitop nachahmen. Ein antiidiotypischer monoklonaler Antikörper, hergestellt für einen ersten monoklonalen Antikörper, wird zum Beispiel eine Bindungsdomäne in der hypervariablen Region besitzen, welche das "Bild" des Epitops ist, gebunden von dem ersten monoklonalen Antikörper.
3. Zielorientierte Agenzien
Zielorientierte Agenzien schließen alle Agenzien ein, deren Lieferung an einen ausgewählten Zelltyp erwünscht ist, welcher einen angesteuerten Chemokinrezeptor exprimiert. Diese Agenzien schließen die Cytotoxine ein, wie etwa die Shiga-A-Kette, Ricin und Saporin, Arzneimittel von im Wesentlichen allen Klassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf beispielweise antibakterielle, antivirale, antifungizide, gegen Krebs wirkende Arzneimittel, Antimykoplasmata, Nukleinsäuren und andere Verbindungen, deren zielorientierte Lieferung an eine hierin interessierende Zelle erwünscht ist. Arzneimittel für eine Krebstherapie schließen im Allgemeinen alkylierende Agenzien, antiproliferative Agenzien, Tubulin-bindende Agenzien und andere solche Arzneimittel ein. Andere cytotoxische Agenzien schließen beispielsweise Nukleosidanaloga, die Arzneimittelfamilie der Anthacycline, die Vinca-Arzneimittel, die Mitomycine ein. Die so konstruierten Arzneimittelkonjugate sind wirksam für Verwendungszwecke, für die die entsprechenden Arzneimittel wirksam sind, und besitzen eine überlegene Wirksamkeit aufgrund der Fähigkeit, das Arzneimittel zu der Zelle zu transportieren, wo es von besonderem Nutzen ist, wobei die effektive Konzentration an der Stelle erhöht wird.
a. Zelltoxinanteile
Zelltoxine, die geeignet sind für eine Verwendung in den Zusammensetzungen und deren Verwendungen schließen kleine Moleküle ein, wie etwa DNA-spaltende Agenzien und proteinartige Zelltoxine, einschließlich, aber nicht beschränkt auf bakterielle, Pilz-, Pflanzen-, Insekten-, Schlangen-und Spinnentoxine.
Aminosäuresequenzen für beispielhafte Zelltoxine, die für eine Inkorporation in die hierin bereitgestellten Konjugate in Frage kommen, sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Tabelle 4: beispielhafte Aminosäuresequenzen von Toxinen
(1) DNA-spaltende Agenzien
sBeispiele für DNA-spaltende Agenzien, die für einen Einschluss als das Zelltoxin im chimären Ligand-Toxin geeignet sind, welche beim Praktizieren der Zusammensetzungen und deren Verwendungen Verwendung finden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Anthrachinon-oligopyrrol-carboxamid, Benzimidazol, Leinamycin; Dynemycin-A; Enediyne; ebenso wie biologisch aktive Analoga oder Derivate davon (das heißt solche mit einer im Wesentlichen äquivalenten biologischen Aktivität). Bekannte Analoga und Derivate werden zum Beispiel in Islam et al., J. Med. Chem. 34 2954–61, 1991; Skibo et ., J. Med. Chem. 37: 78–92, 1994; Behroozi et al., Biochemistry 35: 1568–74, 1996; Helissey et al., Anticancer Drug Res. 11: 527–51, 1996; Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45: 125–33, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem, 5: 903–19, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem, 5: 883–901, 1997 und Xu et al., Biochemistry 37: 1890–7, 1998) offenbart. Andere Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Endiynechinonimine (US-Patent Nr.5,622,958); 2,2r-Bis(2-aminoethyl)-4-4'-bithiazol (Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40: 151–7, 1996); Epilliticin-Salen.Kupfer-Konjugate (Routier et al., Bioconjug. Chem, 8: 789–92, 1997).
(2) Antimetaboliten
Beispiele für Antimetaboliten, die zum Einschluss als das Zelltoxin im Chimären Ligand-Toxin verwendbar sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf 5-Fluoruracil, Methotrexat, Melphalan, Duanomycin, Doxorubicin, Stickstofflost und Mitomycin C.
(3) Proteinartige Zelltoxine
Beispiele für proteinartige Zelltoxine, verwendbar zum Inkorporieren in die _Chimären Ligand-Toxine, verwendet in den Zusammensetzungen und deren Verwendungen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Typ 1- und Typ 2-Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIP). Verwendbare Pflanzen-RIPs des Typs 1 schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Dianthin 30, Dianthin 32, Lychnin, Saporine 1–9, Pokeweed-aktiviertes Protein (PAP), PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, Mapalmin, Dodecandrin, Bryodin-L, Bryodin, Colocin 1 und 2, Luffin-A, Luffin-B, Luffin-S, 19K-Proteinsynthese-inhibierendes Protein (PSI), 15K-PSI, 9K-PSI, Alpha-Kirilowin, Beta-Kirilowin, Gelonin, Momordin, Momordin-II, Momordin-Ic, MAP-30, Alpha-Momorcharin, Beta-Momorcharin, Trichosanthin, TAP-29, Trichokirin; Gersten-RIP, Flachs-RIP, Tritin, Getreide-RIP, Asparin 1 und 2 (Stirpe et al., Bio/Technology 10: 405–12, 1992).
Verwendbare RIPs des Typs 2 schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Volkensin, Ricin, Nigrin-b, CIP-29, Abrin, Modeccin, Ebulitin-α, Eublitin-β, Ebultin-γ, Vircumin, Porrectin sowie die biologisch aktiven enzymatischen Untereinheiten davon (Stirpe et al., Bio/Technology 10: 405–12, 1992; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 331–54; Brinkmann und Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198: 27–45, 1994 und Sandvig und Van Deurs, Physiol. Rev. 76: 949–66, 1996).
(4) Bakterielle Toxine
Beispiele für bakterielle Toxine, verwendbar als Zelltoxine, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Shiga-Toxin und Shiga-ähnliche Toxine (das heißt Toxine, welche die gleiche Aktivität oder Struktur besitzen), ebenso wie die katalytischen Untereinheiten und biologisch funktionellen Fragmente davon. Diese bakteriellen Toxine sind auch RIPs des Typs 2 (Sandvig und Van Deurs, Physiol. Rev. 76: 949–66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171: 1042–5, 1995; Kim et al., Microbiol. Immunol. 41: 805–8, 1997 und Skinner et al., Microb. Pathog. 24: 117–22, 1998). Weitere Beispiele für verwendbare bakterielle Toxine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Pseudomonas-Exotoxin und Diphtherie-Toxin (Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 331–54 und Brinkmann und Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198: 27–45, 1994). Trunkierte Formen und Mutanten der enzymatischen Toxinuntereinheiten können auch als ein Zelltoxinanteil verwendet werden (Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 331–54; Brinkmann und Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198: 27–45, 1994; Mesri et al., J. Biol. Chem. 268: 4852–62, 1993; Skinner et al., Microb. Pathog. 24: 117–22, 1998 und US-Patent Nr. 5,082,927). Andere zielorientierte Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die mehr als 34 beschriebenen Colicin-Familien von RNAse-Toxinen, welche die Colicine A, B, D, E1-9, Cloacin DF13 und die Pilz-RNAse, α-Sarcin einschließen (Ogawa et al. Science 283: 2097–100, Smarda et al., Folia Microbiol (Praha) 43: 563–82, 1998; Wool et al., Trends Biochem. Sci. 17: 266–69, 1992).
(5) Porphyrine und andere lichtaktivierte Toxine
Porphyrine sind gut bekannte lichtaktivierbare Toxine, welche leicht mit Proteinen vernetzt werden können (siehe zum Beispiel US-Patent Nr.5,257,970; US-Patent Nr. 5,252,720; US-Patent Nr. 5,238,940; US-Patent Nr. 5,192,788; US-Patent Nr. 5,171,749; US-Patent Nr. 5,149,708; US-Patent Nr. 5,202,317; US-Patent Nr. 5,217,966; US-Patent Nr. 5,053,423; US-Patent Nr. 5,109,016; US-Patent Nr. 5,087,636; US-Patent Nr. 5,028,594; US-Patent Nr. 5,093,349; US-Patent Nr. 4,968,715; US-Patent Nr. 4,920,143 und die Internationale Anmeldung WO 93/02192).
b. Nukleinsäuren für eine zielgerichtete Verabreichung
Die hierin bereitgestellten Konjugate können auch verwendet werden, um Nukleinsäuren zu angesteuerten Zellen zu liefern. Die Nukleinsäuren schließen DNA ein, welche das Genom einer Zelle modifizieren soll und dabei eine Genherapie bewirken soll, und DNA und RNA zur Verwendung als Antisenseagenzien. Die Nukleinsäuren schließen Antisense-RNA, -DNA, Ribozyme und andere Oligonukleotide ein, welche als Antisenseagenzien verwendet werden sollen. Die Nukleinsäuren können auch RNA-Trafficking-Signale einschließen, wie etwa virale Verpackungssequenzen (siehe zum Beispiel Sullenger et al. (1994) Science 262: 1566–1569). Die Nukleinsäuren schließen auch DNA-Moleküle ein, welche für intakte Gene codieren oder welche für Proteine codieren, die in einer Gentherapie verwendet werden sollen.
DNA (oder RNA), welche an eine Zelle geliefert werden kann, um eine Gentherapie zu bewirken, schließt DNA ein, welche für tumorspezifische cytotoxische Moleküle codiert, wie etwa einen Tumornekrosefaktor, virale Antigene und andere Proteine, um eine Zelle empfindlich gegenüber Antikrebsmitteln zu machen, und DNA, welche für Gene codiert, wie etwa solche für das fehlerhafte Gen (CFTR), welches mit cystischer Fibrose in Zusammenhang steht (siehe zum Beispiel die Internationale Anmeldung WO 93/03709, welche auf der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/745,900 basiert, und Riordan et al. (1989) Science 245: 1066–1073), um fehlerhafte Gene zu ersetzen. Von besonderem Interesse wären hierin beispielsweise Gene, welche ZNS-Wachstumsfaktoren exprimieren, welche an Zellen im ZNS geliefert werden könnten, wie etwa diejenigen, die in SCI involviert sind, und um bei der Regeneration von beschädigtem Gewebe zu helfen.
Nukleinsäuren und Oligonukleotide für eine Verwendung, wie hierin beschrieben, können durch jedes Verfahren, das Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt ist, synthetisiert werden (siehe zum Beispiel WO 93/01286, welche auf der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/723,454 basiert, US-Patent Nr. 5,218,088; US-Patent Nr. 5,175,269; US-Patent Nr. 5,109,124). Die Identifizierung von Oligonukleotiden und Ribozymen für eine Verwendung als Antisenseagenzien ist innerhalb dieses Fachgebiets gut bekannt. Die Auswahl von DNA, codierend für Gene für eine zielgerichtete Lieferung für die Gentherapie ist ebenso im Bereich von Fachleuten dieses Fachgebiets. Die erwünschten Eigenschaften, Längen und andere Charakteristika solcher Oligonukleotide sind beispielsweise gut bekannt. Antisense-Oligonukleotide sind gestaltet, um einem Abbau durch endogene nukleolytische Enzyme zu widerstehen und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Phosphorothioat, Methylphosphonat, Sulfon, Sulfat, Ketyl, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester und andere solche Verbindungen (siehe zum Beispiel Agrawal et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28: 3539–3542; Miller et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93: 6657–6665; Stec et al. (1985) Tetrahedron Lett. 26: 2191–2194; Moody et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 4769–4782; Letsinger et al. (1984) Tetrahedron 40: 137–143; Eckstein (1985) Annu. Rev. Biochem. 54: 367–402; Eckstein (1989) Trends Biol. Sci. 14: 97–100; Stein (1989) in: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed. Macmillan Press, London, S. 97–117; Jager et al. (1988) Biochemistry 27: 7237–7246).
(1) Antisense-Nukleotide einschließlich: Antisense-Oligonukleotide, Triplexmoleküle; Dumbbell-Oligonukleotide; DNA; extrazelluläre proteinbindende Oligonukleotide und kleine Nukleotidmoleküle
Antisense-Nukleotide sind Oligonukleotide, welche spezifisch an mRNA mit komplementären Sequenzen binden, wobei die Translation der mRNA verhindert wird (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,168,053 von Altman et al., US-Patent Nr. 5,190,931 von Inouye, US-Patent Nr. 5,135,917 von Burch, US-Patent Nr. 5,087,617 von Smith und Clusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3405–341 1, welche Dumbbell-Antisense-Oligonukleotide beschreiben). Triplexmoleküle beziehen sich auf DNA- Einzelstränge, welche Duplex-DNA ansteuern und dabei die Transkription verhindern (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,176,996 von Hogan et al., welches Verfahren zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide beschreibt, welche an Zielstellen auf Duplex-DNA binden).
(2) Ribozyme
Ribozyme sind RNA-Konstrukte, welche Messenger-RNA spezifisch spalten. Es gibt mindestens fünf Klassen von Ribozymen, welche bekannt sind, die in die Spaltung und/oder Ligation von RNA-Ketten involviert sind. Ribozyme können auf jedes RNA-Transkript gerichtet sein und können katalytisch solch ein Transkript spalten (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,272,262; US-Patent Nr. 5,144,019, und die US-Patente mit den Nummern. 5,168,053; 5,180,818; 5,116,742 und 5,039,246 von Cech et al., welche Ribozyme und Verfahren zur Herstellung davon beschrieben). Jedes solche Ribozym kann mit dem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens verbunden werden für eine Lieferung an Zellen, welche einen Chemokinrezeptor tragen.
Die Ribozyme können zu den angesteuerten Zellen geliefert werden als DNA, codierend für das Ribozym, gebunden an einen eukaryontischen Promotor, wie etwa einen eukaryontischen viralen Promotor, im Allgemeinen einen späten Promotor, so dass bei Einbringen in den Nukleus das Ribozym direkt transkribiert werden wird. In solchen Fällen wird das Konstrukt auch eine nukleäre Translokationssequenz einschließen, im Allgemeinen als Teil des zielorientierten Agens oder als Teil eines Linkers, um es in eine Form zu bringen, die für die Lieferung der gebundenen Nukleinsäuren an den Nukleus geeignet ist.
(3) Nukleinsäuren, codierend für therapeutische Produkte zur gezielten Verabreichung
Unter der DNA, welche für therapeutische Produkte codiert, die für eine Verwendung vorgesehen ist, ist DNA, die für korrekte Kopien von fehlerhaften Genen codiert, wie etwa das defekte Gen (CFCR), das mit cystischer Fibrose in Zusammenhang steht (siehe zum Beispiel die Internationale Anmeldung WO 93/03709, welche auf der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/745,900 basiert, und Riordan et al. (1989) Science 245: 1066-1073), und Mittel gegen Krebs, wie etwa Tumornekrosefaktoren, und cytotoxische Agenzien, wie etwa Shiga-A1-Toxin oder Saporin an Zellen, welche einen Chemokinrezeptor tragen. Das Konjugat sollte eine NTS einschließen. Wenn das Konjugat so entworfen ist, dass das zielorientierte Agens und die gebundene DNA im Cytoplasma gespalten wird, dann sollte die NTS in einem Teil des Linkers enthalten sein, der an die DNA gebunden bleibt, so dass bei einer Internalisierung das Konjugat zu dem Nukleus geleitet werden wird. Die nukleäre Translokationssequenz (NTS) kann eine heterologe Sequenz sein oder kann von dem ausgewählten Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens stammen. Eine typische Konsensus-NTS-Sequenz enthält ein aminoterminales Prolin oder Glycin, gefolgt von mindestens drei basischen Resten in einer Anordnung von sieben bis neun Aminosäuren (siehe zum Beispiel Dang et al. f 1989) J. Biol. Chem. 264: 18019–18023, Dang et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4048–4058 und Tabelle 2, welche Beispiele für NTS und Regionen von Proteinen darlegt, welche mit bekannten NTS eine Homologie teilen).
(4) Kopplung der Nukleinsäuren an Proteine
Um die chemische Konjugation hierin zu bewirken, wird das zielorientierte Agens entweder direkt oder durch einen oder mehrere Linker an die Nukleinsäure gebunden. Verfahren zur Konjugation von Nukleinsäuren, an den 5'-Enden, 3'-Enden und anderswo an die Amino- und Carboxytermini und andere Stellen in Proteinen sind Fachleuten bekannt (für eine Überblick siehe zum Beispiel Goodchild, (1993) in: "Perspectives in Bioconjugate Chemistry", Mears, Editor, American Chemical Society, Washington, D. C., S. 77–99). Zum Beispiel sind Proteine an Nukleinsäuren gebunden worden unter Verwendung ultravioletter Strahlung (Sperling et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5: 2755-2773; Fiser et al. (1975) FEBS Lett. 52: 281–283), bifunktionelle Chemikalien (Bäumen et al. (1978) Eur. J. Biochem. 89: 353–359 und Oste et al. (1979) Mol. Gen. Genet. 168: 81–86), photochemische Vernetzung (Vanin et al. (1981) FEBS Lett. 124: 89–92; Rinke et al. (1980) J. Mol. Biol. 137: 301–314; Millon et al. (1980) Eur. J. Biochem. 110: 485–454).
Insbesondere sind die Reagenzien (N-Acetyl-N'-(p-glyoxylylbenzolyllcystamin und 2-Iminothiolan verwendet worden, um DNA an Proteine zu koppeln, wie etwa α₂Makroglobulin (α₂M) über eine gemischte Disulfidbildung (siehe Cheng et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 659–669). N-Acetyl-N'(p-glyoxylylbenzolyl)cystamin reagiert spezifisch mit nicht gepaarten Guaninresten und erzeugt bei Reduktion eine freie Sulfhydrylgruppe. 2-Iminothiolan reagiert mit Proteinen, um Sulfhydrylgruppen zu erzeugen, welche dann an die derivatisierte DNA durch eine intermolekulare Disulfidaustauschreaktion konjugiert werden. Es kann jede Bindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass bei Internalisierung des Konjugats die angesteuerte Nukleinsäure aktiv ist. Somit wird erwartet, dass eine Spaltung der Bindung notwendig sein kann, obwohl es für manche Reagenzien in Erwägung gezogen wird, dass eine solche Spaltung nicht notwendig sein muss, wie etwa für DNA, die für Ribozyme codiert, gebunden an Promotoren oder DNA, die für therapeutische Agenzien zur Lieferung an den Nukleus codiert.
Thiolbindungen können leicht unter Bildung von heterobifunktionellen Reagenzien gebildet werden. Es sind auch Amine an das terminate 5'-Phosphat von ungeschützten Oligonukleotiden oder Nukleinsäuren in wäßrigen Lösungen angeheftet worden durch Umsetzen der Nukleinsäure mit einem wasserlöslichen Carbodiimid, wie etwa 1-Ethyl-3'(3-dimethylaminopropyl]-carbodiimid (EDC) oder N-Ethyl-N'(3-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI) in Imidazolpuffer bei pH 6, um das 5'Phosphorimidazolid zu erzeugen. Das Inkontaktbringen des 5' Phosphorimidazolids mit Aminenthaltenden Molekülen und Ethylendiamin ergibt stabile Phosphoramidate (siehe zum Beispiel Chu et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 6513-6529 und WO 88/05077, in dem die USA bestimmt ist). Insbesondere wird eine Lösung von DNA mit EDC gesättigt, bei pH 6 und unter Bewegung bei 4°C über Nacht inkubiert. Die resultierende Lösung wird dann durch Zugabe zum Beispiel von etwa 3 Volumen 100 mM Citratpuffer auf pH 8,5 gepuffert, und es werden etwa 5 μg bis etwa 20 μg eines Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens zugegeben, und das resultierende Gemisch wird bei 4°C für etwa 48 h bewegt. Das nicht umgesetzte Protein kann aus dem Gemisch durch Säulenchromatographie entfernt werden, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75 (Pharmacia), unter Verwendung einer 0,1 M Ammoniumcarbonatlösung, pH 7,0 als einen Elutionspuffer. Das isolierte Konjugat kann lyophilisiert werden und bis zur Verwendung gelagert werden.
Das US-Patent Nr. 5,237,016 stellt Verfahren zur Herstellung von Nukleotiden bereit, die an ihren 5'-Termini bromacetyliert sind, und Umsetzen der resultierenden Oligonukleotide mit Thiolgruppen. Oligonukleotide, die an ihren 5'-Termini mit Bromacetylgruppen derivatisiert sind, können hergestellt werden durch Umsetzen von 5'-Aminohexylphosphoramidat-Oligonukleotiden mit Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester, wie es im US-Patent Nr. 5,237,016 beschrieben wird. Das US-Patent Nr. 5,237,016 beschreibt auch Verfahren zur Herstellung von mit Thiol derivatisierten Nukleotiden, welche dann mit Thiolgruppen an dem ausgewählten Wachstumsfaktor umgesetzt werden können. Kurz gesagt, mit Thiol derivatisierte Nukleotide werden hergestellt unter Verwendung eines 5'-phosphorylierten Nukleotids in zwei Schritten: (1) Reaktion der Phosphatgruppe mit Imidazol in Gegenwart eines Diimids und Ersetzen der austretenden Imidazolgruppe durch Cystamin in einem Reaktionsschritt; und Reduktion der Disulfidbindung des Cystaminlinkers mit Dithiothreitol (siehe auch Chu et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 5671-5691, welche ein ähnliches Verfahren beschreibt). Die 5'-phosphorylierten Ausgangsoligonukleotide können durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind (siehe zum Beispiel Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S.122).
Das Antisense-Oligomer oder die Nukleinsäure, wie etwa ein Methylphosphonat-Oligonukleotid (MP-Oligomer), kann durch Reaktion mit SPDP oder SMPB derivatisiert werden. Das resultierende MP-Oligomer kann mittels HPLC gereinigt werden und dann an das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens gekoppelt werden. Das MP-Oligomer (etwa 0,1 μM) wird in etwa 40–50 μl 1 : 1 Acetonitril/Wasser gelöst, zu dem Phosphatpuffer (pH 7,5, Endkonzentration 0,1 M) und 1 mg eines MP-Oligomers in etwa 1 ml phosphatgepufferter Saline zugegeben wurde. Die Reaktion wird für etwa 5–10 h bei Raumtemperatur fortgeführt und wird dann mit etwa 15 μl 0,1 Jodacetamid gequencht. Die Konjugate können auf Heparinsepharose Hi-Trap-Säulen (1 ml, Pharmacia) gereinigt werden und mit einem linearen oder Stufengradienten eluiert werden. Das Konjugat sollte in 0,6 M NaCl eluieren.
4. Linkeranteile
Beim Herstellen der hierin bereitgestellten Konjugate wird das Zelltoxin entweder direkt oder indirekt an das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens in dem chimären Ligand-Toxin gebunden, durch irgendein Verfahren, das gegenwärtig im Fachgebiet zum Verbinden von zwei Anteilen bekannt ist, solange die Anlagerung des Linkeranteils an den proteinartigen Liganden die Bindung des proteinartigen Liganden an die Zielzelle nicht wesentlich behindert, das bedeutet, an einen Rezeptor auf der Zielzelle, oder die Internalisierung oder den Metabolismus des Ligand-Toxins im Wesentlichen behindert, so dass die Toxizität des Zelltoxins für die angesteuerte Zelle verringert wird. Die Bindung kann jede Art der Bindung sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf ionische und kovalente Bindungen und jegliche andere ausreichend stabile Verbindung, wobei das zielorientierte Agens durch eine Zelle internalisiert wird, auf die das Konjugat gerichtet ist.
Das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ist gegebenenfalls über einen oder mehrere Linker an das zielorientierte Agens gebunden. Der Linkeranteil wird ausgewählt in Abhängigkeit von den gewünschten Eigenschaften. Zum Beispiel kann die Länge des Linkeranteils gewählt werden, um Kinetiken zu optimieren und die Spezifität der Ligandenbindung zu optimieren, einschließlich aller Konformationsänderungen, induziert durch das Binden des Liganden an einen Zielrezeptor. Der Linkeranteil sollte lang genug und flexibel genug sein, dass der proteinartige Ligandenanteil und der Zielzellrezeptor frei wechselwirken können. Wenn der Linker zu kurz oder zu steif ist, kann eine sterische Behinderung zwischen dem proteinartigen Ligandenanteil und dem Zelltoxin auftreten. Wenn der Linkeranteil zu lang ist, kann das Zelltoxin im Verfahren der Herstellung proteolysiert werden, oder kann seine toxische Wirkung nicht wirksam zu der Zielzelle liefern. Diese chemischen Linker können angeheftet werden an gereinigte Liganden, unter Verwendung zahlreicher Protokolle, die im Fachgebiet bekannt sind, wie etwa diejenigen, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben werden (siehe Pierce Chemicals "Solutions, Crass-linking of Proteins: Basic Concepts and Strategies", Seminar Nr. 12, Rockford, IL).
Beispielhafte Linker
Hierin können alle Linker, die Fachleuten bekannt sind, verwendet werden. Im Allgemeinen wird ein unterschiedlicher Satz an Linkern in Konjugaten, welche Fusionsproteine sind, verwendet werden aus Linkern in chemisch hergestellten Konjugaten. Linker und Bindungen, welche für chemisch verbundene Konjugate geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie etwa Amin- und Thiolgruppen. Diese Bindungen werden unter Vewendung heterobifunktioneller Reagenzien erzeugt, um reaktive Thiolgruppen an einem oder an beiden Polypeptiden zu erzeugen, und dann Umsetzen der Thiolgruppen an einem Polypeptid mit reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen, an welche reaktive Maleimidogruppen oder Thiolgruppen an dem anderen Polypeptid angeheftet werden können. Andere Linker schließen säurespaltbare Linker, wie etwa Bismaleimidothoxipropan, säurelabile Tiansferrinkonjugate und Adipinsäuiedihydrazide ein, welche in saureren intrazellulären Kompartimenten gespalten werden; Vernetzer, welche bei einer Exposition gegenüber UV- oder sichtbarem Licht gespalten werden und Linker, wie etwa die verschiedenen Domänen, wie etwa C_H1, C_H2 und C_H3 von der konstanten Region des humanen IgG₁, (siehe Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379–386). In einigen Ausführungsformen können mehrere Linker enthalten sein, um die Vorteile von gewünschten Eigenschaften jedes Linkers auszunutzen.
Chemische Linker und Peptidlinker können durch kovalentes Koppeln des Linkers an das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens (TA) und das zielorientierte Agens insertiert werden. Die heterobifunktionellen Agenzien, welche unten beschrieben werden, können verwendet werden, um solch eine kovalente Kopplung zu bewirken. Peptidlinker können auch verbunden werden durch Exprimieren von DNA, die für den Linker und das TA, den Linker und das zielorientiertes Agens oder den Linker, das zielorientierte Agens und das TA als ein Fusionsprotein codiert. Flexible Linker, und Linker, welche die Löslichkeit der Konjugate erhöhen, sind zur Vewendung vorgesehen, entweder alleine oder mit anderen Linkern, welche hierin auch vorgesehen sind.
a. Heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien
Fachleuten dieses Fachgebiets sind zahlreiche heterabifunktionelle vernetzende Reagenzien bekannt, welche verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen Aminogruppen und Thiolgruppen zu bilden, und Thiolgruppen in Proteine einzubringen (siehe zum Beispiel Pierce Katalog, „Immuno Technology Catalog & Handbook", 1992–1993, welcher die Herstellung von und die Verwendung von solchen Reagenzien beschreibt, und eine kommerzielle Quelle für solche Reagenzien bereitstellt, siehe auch zum Beispiel Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3: 397–401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924–5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 308–312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2: 191–197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723–737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163–170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589). Diese Reagenzien können verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen dem Ansteuerungsagens, dem Chemokin und dem zielorientierten Agens zu bilden. Diese Reagenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SDPD; Disulfidlinker); Sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamidolhexanoat (sulfo-LC-SPDP); Succinimidyloxycarbonyl-α-methylbenzylthiosulfat (SMBT, gehinderter Disulfatlinker); Succinimidyl 6-[3-12-pyridylthiolpropionamido]hexanoat (LC-SPDP); Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC); Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)butyrat (SPDP; gehinderter Disulfidbindungslinker); Sulfosuccinimidyl 2-(7-azido-4-methylkumarin-3-acetamid)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED); Sulfo-succinimidyl 7-azido-4-methylkumarin-3-acetat (SAMCA); sulfosuccinimidyl 6-[α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluamido]-hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); 1,4-di-[3'-(2'-Pyridyldithiolpropionamido]butan (DPDPB); 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridylthio)toluol (SMPT, gehinderter Disulfatlinker); Sulfosuccinimidyl 6[-α-methyl-α-(2-pyridyldithioltoluamido]hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester (Sulfo-MBS); N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (SIAB; Thioetherlinker); Sulfosuccinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (Sulfo-SIAB); Succinimidyl4(p-maleimidphenyl)butyrat (SMPB); Sulfosuccinimidyl4-(p-maleimidphenyl)butyrat (Sulfo-SMPB); Azidobenzoylhydrazid (ABH).
Andere heterobifunktionelle spaltbare Vernetzer schließen N-Succinimidyl (4-jodacetyl)-aminobenzoat; sulfosuccinimidyl (4-jodacetyl)-aminobenzoat; 4-Succinimidyl-oxycarbonyl-a-(2-pyridyldithio)toluol; Sulfosuccinimidyl-6-[α-(pyridyldithio)-toluamido]hexanoat; N-Succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionat; Succinimidyl 6[3(-(-2-pyridyldithiol-propionamido]hexanoat; Sulfosuccinimidyl 6[3(-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat; 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazid, Ellman-Reagenz, Dichlortriazinsäure, S-(2-Thiopyridyl)-L-cystein ein. Weitere beispielhafte bifunktionelle Linkerverbindungen werden in den US-Patenten Nr.5,349,066; 5,618,528; 4,569,789; 4,952,394 und 5,137,877 offenbart.
b. Säurespaltbare, photospaltbare und wärmesensitive Linker
Es können auch säurespaltbare Linker, photospaltbare und wärmesensitive Linker verwendet werden, insbesondere wenn es notwendig sein kann, das zielorientierte Agens zu spalten, um eine schnellere Erreichbarkeit für eine Reaktion zu erlauben. Säurespaltbare Linker schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bismaleimidothoxypropan und Adipinsäuredihydrazidlinker (siehe zum Beispiel Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589) und säurelabile Transferrinkonjugate, welche einen ausreichenden Anteil an Transferrin enthalten, um den Eingang in den intrazellulären Transferrinzyklusweg zu erlauben (siehe zum Beispiel Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309–4314).
Photospaltbare Linker sind Linker, welche bei einer Exposition gegenüber Licht gespalten werden (siehe zum Beispiel Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107, wobei das zielorientierte Agens bei einer Exposition gegenüber Licht freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, welche bei einer Exposition gegenüber Licht gespalten werden, sind bekannt (siehe zum Beispiel Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp. 16th, Brunfeldt, K. (Editor), S. 105–110, worin die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als eine photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschrieben wird; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69–82, worin wasserlösliche photospaltbare Copolymere beschrieben werden, einschließlich Hydroxypropylmethacrylamidcopolymer, Glycincopolymer, Fluoresceincopolymer und Methylrhodamincopolymer; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107, worin ein Vernetzer und ein Reagens beschrieben wird, welches bei Exposition gegenüber Licht nahe dem UV (350 nm) eine photolytische Degradation durchläuft und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42: 231–237, worin Nitrobenzoylcarbonylchlorid-Vernetzungsreagenzien beschrieben werden, welche photospaltbare Linker erzeugen), wobei das zielorientierte Agens bei Exposition gegenüber Licht freigesetzt wird. Solche Linker werden eine besondere Verwendung bei der Behandlung dermatologischer oder ophthalmologischer Bedingungen besitzen, welche unter Verwendung von Faseroptik gegenüber Licht exponiert werden können. Nach der Applikation des Konjugats kann das Auge oder die Haut oder ein anderer Körperteil dem Licht ausgesetzt werden, was in der Freisetzung des zielorientierten Anteils des Konjugats resultiert. Solche photospaltbaren Linker sind nützlich in Verbindung mit diagnostischen Protokollen, in denen es wünschenswert ist, das Ansteuerungsagens zu entfernen, um eine schnelle Clearance aus dem Körper des Tiers zu erlauben.
c. Andere Linker für eine chemische Konjugation
Andere Linker schliessen Trityllinker ein, insbesondere derivatisierte Tritylgruppen, um eine Gattung von Konjugaten zu erzeugen, welche eine Freisetzung von therapeutischen Agenzien bei verschiedenen Stufen der Azidität oder Alkalinität bereitstellen. Die so geleistete Flexibilität durch die Fähigkeit, den pH-Bereich, bei dem das therapeutische Agens freigesetzt werden wird, vorher auszuwählen, erlaubt die Selektion eines Linkers, basierend auf den bekannten physiologischen Unterschieden zwischen Geweben, die einer Lieferung eines therapeutischen Agens bedürfen (siehe zum Beispiel US-Patent Nr.5,612,474). Die Azidität von Tumorgeweben scheint beispielsweise geringer zu sein als die von normalen Geweben.
d. Peptidlinker
Die Linkeranteile können Peptide sein. Peptidlinker können in Fusionsproteinen und auch in chemisch verbundenen Konjugaten verwendet werden. Das Peptid besitzt normalerweise etwa 2 bis etwa 60 Aminosäurereste, zum Beispiel etwa 5 bis etwa 40 oder etwa 10 bis etwa 30 Aminosäurereste. Die ausgewählte Länge wird von Faktoren abhängen, wie etwa der Verwendung, für die der Linker eingeschlossen wird.
Der proteinartige Ligand bindet mit einer Spezifität an einen Rezeptor (an Rezeptoren) an einer oder mehreren der Zielzelle(n) und wird von der Zielzelle (den Zielzellen) aufgenommen. Um die Passage des chimären Ligand-Toxins in eine Zielzelle zu erleichtern, ist es gegenwärtig bevorzugt, dass die Größe des chimären Ligand-Toxins nicht diejenige Größe nicht übersteigt, welche von der interessierenden Zielzelle aufgenommen werden kann. Im Allgemeinen ist die Größe des chimären Ligand-Toxins von seiner Zusammensetzung abhängig. In dem Fall, in dem das chimäre Ligand-Toxin einen chemischen Linker und ein chemisches Toxin enthält (das heißt eher als ein proteinartiges), ist die Größe des Ligand-Toxins im Allgemeinen kleiner, als wenn das chimäre Ligand-Toxin ein Fusionsprotein ist. Peptidlinker können bequemerweise durch Nukleinsäuren codiert werden und bei der Expression in einer Wirtselle, wie etwa E. coli, in Fusionsproteine eingebracht werden.
Peptidlinker sind vorteilhaft, wenn das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens proteinartig ist. Zum Beispiel kann der Linkeranteil eine flexible Spacer-Aminosäuresequenz sein, wie etwa diejenigen, die im Forschungsgebiet der Einzelkettenantikörper bekannt sind. Beispiele für solche bekannten Linkeranteile schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf GGGGS
Alternativ kann der Peptidlinkeranteil VM oder AN sein, oder die durch die Formel: AM(G₂ bis ₄S)_xAM beschriebene Struktur besitzen, worin X eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist (SEQ ID NO: 12). Zusätzliche Linkeranteile werden zum Beispiel in Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; 1988; Whitlow, M. et al. Protein Engineering 6: 989–995, 1993; Newton et al., Biochemistry 35: 545–553, 1996; A. J. Cumber et al., Bioconj. Chem. 3: 397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273: 330–337, 1997 und im US-Patent Nr. 4,894,443 beschrieben.
Andere Linker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Enzymsubstrate, wie etwa Cathepsin B-Substrat, Cathepsin D-Substrat, Trypsinsubstrat, Thrombinsubstrat, Subtilisinsubstrat, Faktor Xa-Substrat und Enterokinasesubstrat; Linker, welche die Löslichkeit, Flexibilität und/oder intrazelluläre Spaltbarkeit verbessern, schließen Linker ein, so wie (gly_mser)_n„ und (ser_mgly)_n, worin m 1 bis 6 ist, bevorzugt 1 bis 4, mehr bevorzugt 2 bis 4, und n 1 bis 30 ist, bevorzugt 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 4 (siehe die Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/06641, welche beispielhafte Linker zur Verwendung in Konjugaten bereitstellt). In einigen Ausführungsformen können mehrere Linker enthalten sein, um Vorteil aus den gewünschten Eigenschaften jedes Linkers zu ziehen.
D. Herstellung von Konjugaten
Konjugate mit gebundenen zielorientierten Agenzien können entweder durch chemische Konjugation, rekombinante DNA-Technologie oder Kombinationen aus rekombinanter Expression und chemischer Konjugation hergestellt werden. Die Verfahren hierin sind veranschaulicht mit besonderer Bezugnahme auf Chemokine und Shiga-A1 oder Saporin. Es ist aber verständlich, dass die gleichen Verfahren verwendet werden können, um Konjugate von jedem Ansteuerungsagens mit jedem zielorientierten Agens herzustellen und zu verwenden, wie etwa RIP, eine Nukleinsäure oder jedes andere zielorientierte Agens, entweder direkt oder über Linker, wie hierin beschrieben wird. Das Ansteuerungsagens und zielorientierte Agens können in jeder Orientierung verbunden sein, und es kann mehr als ein Ansteuerungsagens und/oder zielorientiertes Agens in einem Konjugat vorhanden sein.
1. Herstellung von Fusionsproteinen
Die Chemokin-Ligand- und/oder chimären Fusionsproteine können hergestellt werden durch gut bekannte Verfahren der Proteinsynthese, wenn die Aminosäuresequenz des Chemokins und/oder Zelltoxins bekannt sind, oder die Sequenz kann zuerst durch gut bekannte Verfahren, unten beschrieben, bestimmt werden, falls nötig. Einige der Ligandengene sind nun kommerziell erhältlich. Ein Vorteil beim Erhalten von kommerziell erhältlichen Genen ist es, dass sie im Allgemeinen für eine Expression in E. coli optimiert worden sind. Ein Polynukleotid, codierend für ein Protein, Peptid oder Polynukleotid von Interesse, kann unter Verwendung der DNA-Synthesetechnologie hergestellt werden. Verfahren zum Erhalten der DNA, codierend für ein nicht verfügbares Gen und Exprimieren eines Genprodukts daraus sind unten beschrieben und sind in Beispiel 1 hierin veranschaulicht.
Das chimäre Ligand-Toxin, welches einen Chemokinliganden, einen proteinartigen Linkeranteil und ein proteinartiges Zelltoxin enthält, kann auch als ein Fusionsprotein erzeugt werden mit der allgemeinen Struktur, wie es in 1 veranschaulicht ist. Das Fusionsprotein wird unter Verwendung gut bekannter Verfahren erzeugt, worin eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transfiziert wird, der eine Expressionskontrollsequenz enthält, die in funktionsfähiger Weise mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für die Expression des Fusionsproteins codiert (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sambrook et al., Editoren, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 1989).
Tabelle 5 unten veranschaulicht die theoretische Größe und den pl von beispielhaften Chemokinrezeptor-Ansteuerungsligand-Konjugaten und auch von Konjugaten, welche Nichtchemokin-Zytokine enthalten, die an Zellpopulationen binden, welche Chemokinrezeptoren exprimieren. Konjugate mit Nichtchemokin-Zytokinen, wie etwa IL-4 enthaltende Konjugate, sind zuvor verwendet worden, um eine zielgerichtete Lieferung an Tumorzellen bereitzustellen, sind aber nicht verwendet worden, um pathologische Entzündungsbedingungen, wie etwa einen Sekundärgewebeschaden zu behandeln.
Tabelle 5 Theoretische Molekulargewichte und isoelektrische Punkte von freien humanen Liganden und Ligand-Saporin-6-Fusionsproteinen (verbunden durch einen ALA-MET-Linker)
a. Plasmide und Wirtszellen zur Expression von Konstrukten, die für Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenspeptide, Konjugate, Linker, Fusionsproteine und Peptid ansteuernde Agenzien codieren
Die Konstruktion von Expressionsvektoren und die Expression von Genen in transfizierten Zellen bringt die Verwendung von molekularen Klonierungstechniken mit sich, die im Fachgebiet auch gut bekannt sind (siehe zum Beispiel Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook et al., Editoren, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, NY (1989) und „Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, „Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, Ausubel et al. Editoren, Current Protocols, 1987–1994; John Wiley and Sons, Inc. 1994–1999; Cloning Vectors – A Laboratory Manual, Band I-IV, Pouwels, et al., Editoren, und Ergänzungen darin, Elsebier, N. Y., 1995–1998). Solche Verfahren schließen die Konstruktion von Expressionsvektoren ein, die eine für ein Fusionsprotein codierende Sequenz und passende Transkriptions-/Translations-Kontrollsignale enthalten, wie in den 2–5 veranschaulicht ist. Diese Verfahren schließen auch rekombinante in vitro-DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und eine Rekombination/genetische Rekombination in vivo ein (siehe zum Beispiel die Verfahren, welche beschrieben sind in „Molecular Cloning A Laboratory Manual", Sambrook et al., Editoren, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989 und "Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, "Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, Ausubel et al. Editoren, "Current Protocols", 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc. 1994-1999; "Cloning Vectors – A Laboratory Manual", Band I-IV, Pouwels, et al., Editoren, und Ergänzungen darin, Elsebier, N. Y., 1995–1998).
Zur Transfektion von Zellen verwendete Nukleinsäuren mit Sequenzen, welche für eine Expression des interessierenden Polypeptids codieren, werden im Allgemeinen in Form eines Expressionvektors vorliegen, der Expressionskontrollsequenzen enthält, die in funktionsfähiger Art und Weise mit einer Nukleotidsequenz verbunden sind, die für die Expression des Polypeptids . codiert. Verfahren zum Erhalten eines stabilen Transfers, so dass die fremde Nukleinsäure kontinuierlich im Wirt verbleibt, sind im Fachgebiet bekannt. Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch konventionelle Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten gut bekannt sind. Wenn der Wirt prokaryontisch ist, wie etwa E. coli, können durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren kompetente Zellen, welche DNA aufnehmen können, aus Zellen hergestellt werden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und nachfolgend mittels des CaCl₂-Verfahrens behandelt wurden. Alternativ kann MgCl₂ oder RbCl verwendet werden. Die Transformation kann auch durchgeführt werden nach der Bilbung eines Protoplasten aus der Wirtszelle oder durch Elektroporation. Bevorzugt wird ein prokaryontischer Wirt als die Wirtszelle verwendet.
Wenn der Wirt eukaryontisch ist, schließen die Transfektionsverfahren für DNA die Bildung von Calciumphosphat-Copräzipitaten und konventionelle mechanische Verfahren, wie etwa Mikroinjektion, Elektroporation und Insertion eines Plasmids, eingeschlossen in Liposomen ein. Ein anderes Verfahren ist die Verwendung eines eukaryontischen Virusvektors, wie etwa Simianvirus 40 (SV40), Schweine-Papillomavirus oder einen rekombinantem autonomen Parvovirusvektor (wie im US-Patent Nr.5,585,254 beschrieben), um eukaryontische Zellen transient zu infizieren oder transformieren und das Protein zu exprimieren (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman Editor, 1982). Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen cotransfiziert werden, welche für das Fusianspolypeptid codieren und einem zweiten Fremd-DNA-Molekül, das für einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie etwa das Thymidinkinasegen aus Herpes simplex.
Eukaryontische Expressionssysteme können weitere posttranslationale Modifikationen von exprimierten Säugetierproteinen auftreten lassen. Solche Zellen besitzen die zelluläre Maschinerie für ein posttranslationales Prozessieren des Primärtranskripts, falls erwünscht. Solche Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Glykosylierung, Phosphorylierung, Farnesylierung. Solche Wirtszelllinien können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293 und WI38.
Verfahren zur Isolierung und Reinigung von entweder durch Prokaryonten oder Eukaryonten exprimiertem Protein kann durch alle konventionellen Mittel bewirkt werden, wie etwa beispielsweise präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen wie etwa diejenigen, die die Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder einem Antigen einschließen.
Eine Vielzahl von Systemen aus Wirt-Expressionsvektor können verwendet werden, um die für das Fusionsprotein codierende Sequenz zu exprimieren. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie etwa Bakterien, transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, enthaltend eine für ein Fusionsprotein codierende Sequenz; Hefen, transformiert mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, enthaltend die für das Fusionsprotein codierende Sequenz; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (zum Beispiel Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (zum Beispiel Ti-Plasmid), enthaltend eine für ein Fusionsprotein codierende Sequenz; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (zum Beispiel Baculovirus), enthaltend für ein Fusionsprotein codierende Sequenz; oder tierische Zellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionvektoren (zum Beispiel Retroviren, Adenoviren, Vaccinia-Virus), enthaltend eine für ein Fusionsprotein codierende Sequenz oder transformierte tierische Zellsysteme, konstruiert für eine stabile Expression.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt/Vektor-System kann jedes einer Vielzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen in dem Expressionsvektor verwendet werden, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, Transkriptionsenhancer-Elementen, Transkriptionsterminatoren usw. (siehe zum Beispiel Bitter et al., Methods in Enzymology 153: 516–544, 1987). Wenn in bakteriellen Systemen kloniert wird, können beispielsweise induzierbare Promotoren verwendet werden, wie etwa, aber nicht beschränkt auf pL des Bakteriophagen S, plac, ptrp, ptac, tac, T7 (ptrp-Iac-Hybridpromotor). Wenn in Säugetierzellsystemen kloniert wird, können Promotoren verwendet werden, die von dem Genom von Säugetierzellen (zum Beispiel Metallothionein-Promotor) oder von Säugetierviren (zum Beispiel das Long-Terminal-Repeat von Retrovirus, der späte Promotor von Adenovirus, der 7,5k-Promotor von Vaccinia-Virus) stammen. Es können auch Promotoren verwendet werden, erzeugt durch rekombinante DNA- oder synthetische Verfahren, um die Transkription der insertierten, für das Fusionsprotein codierenden Sequenz bereitzustellen.
In bakteriellen Systemen kann vorteilhafterweise eine Anzahl von Expressionsvektoren ausgewählt werden, in Abhängigkeit von den gewünschten Eigenschaften des Systems. Wenn zum Beispiel große Mengen des Fusionsproteins produziert werden sollen, können Vektoren wünschenswert sein, welche die Expression von hohen Mengen des Fusionsproteinprodukts steuern, welche schnell gereinigt sind. Diejenigen, welche entworfen sind, um eine Schnittstelle zu enthalten, um bei der Wiedergewinnung des Fusionsproteins behilflich zu sein, sind bevorzugt. Ausgezeichnete Ergebnisse können erhalten werden und sind erhalten worden unter Verwendung mehrerer kommerziell erhältlicher Vektoren, einschließlich pET 11a, b, c oder d (Novagen, Madison, WI).
Besonders bevorzugte Plasmide für eine Transformation in E. coli-Zellen schließen die pET-Expressionsvektoren ein (siehe US-Patent 4,953,496; erhältlich von Novagen, Madison, WI; siehe auch Literatur, veröffentlicht von Novagen, die das System beschreibt). Solche Plasmide schließen pET 11c und/oder pET 11a ein, welches den T7-lac-Promotor, T7-Terminator, den induzierbaren lac-Operator aus E. coli und das lac-Repressorgen enthält; pET 12a-c, welches den T7-Promotor, T7-Terminator und das ompT-Sekretionssignal aus E. coli enthält und pET 15b (Novagen, Madison, WI), welches eine His-Tag^TM-Leadersequenz (SEQ ID NO: 40) enthält, zur Verwendung bei der Reinigung mit einer His-Säule und einer Thrombin-Schnittstelle, welche die Spaltung nach der Reinigung über die Säule erlaubt; die T7-lac-Promotorregion und den T7-Terminator.
Eine Nukleinsäure, welche für ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, verbunden mit einem zielorientierten Agens mit oder ohne Linker codiert und andere solche Konstrukte können in den pET-Vektoren, pET 11c, pET-11a und pET-15b-Expresseionsvektoren (Novagen, Madison, WI) enthalten sein, für eine intrazelluläre bzw. periplasmatische Expression des Fusionsproteins.
Andere Plasmide schließen die pKK-Plasmide ein, insbesondere pKK 223–3, welches den TAC-Promotor enthält (erhältlich von Pharmacia; siehe auch Brosius et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6929; Ausubel et . Current Protocols in Molecular Biology; US-Patente Nr. 5,122,463; 5,173,403; 5,187,153; 5,204,254; 5,212,058; 5,212,286; 5,215,907; 5,220,013; 5,223,483 und 5,229,279), welches den TAC-Promotor enthält. Das Plasmid pKK ist modifiziert worden durch die Insertion einer Kanamycinresistenzkassette mit klebrigen EcoRI-Enden (bezogen von Pharmacia; erhalten von pUC4K, siehe zum Beispiel Vieira et al. (1982) Gene 19: 259–268 und US-Patent Nr. 4,719,179) in das Ampicillinresistenz-Markergen.
Andere bevorzugte Vektoren schließen den pP_L-Lambda-induzierbaren Expressionsvektor und den tac-Promotorvektor pDR450 (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 5,281,525; 5,262,309; 5,240,831; 5,231,008; 5,227,469; 5,227,293; erhältlich von Pharmacia P. L. Biochemicals; siehe auch Mott, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 88 und De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21) ein, und Baculovirus-Vektoren, wie etwa einen pBlueBac-Vektor (auch pJVETL genannt) und Derivate davon; siehe zum Beispiel die US-Patente Nr. 5,278,050; 5,244,805; 5,243,041; 5,242,687; 5,266,317; 4,745,051 und 5,169,784) einschließlich pBlueBac III.
Andere Plasmide schließen die pIN-IIIompA-Plasmide ein (siehe US-Patent Nr. 4,575,013 von Inouye; siehe auch Duffaud et al. (1987) Meth. Enz. 153: 492–5071, wie etwa pIN-IIIompA2. Die pIN-IIIompA-Plasmide enthalten eine Insertionsstelle für heterologe DNA, gebunden im transkriptionellen Leserahmen mit funktionellen Fragmenten, abgeleitet von dem Lipoproteingen von E. coli. Die Plasmide schließen auch ein DNA-Fragment ein, codierend für die Signalpeptide des ompA-Proteins von E. coli, so angeordnet, dass das gewünschte Polypeptid mit dem ompA-Signalpeptid an seinem Aminoterminus exprimiert wird, was eine effiziente Sekretion durch die Cytoplasmamembran ermöglicht. Die Plasmide schließen weiterhin DNA ein, welche für ein spezielles Segment des E. coli-lac-Promotor-Operators codiert, das in der richtigen Orientierung für eine transkriptionelle Expression des gewünschten Polypeptids angeordnet ist, ebenso wie ein separates funktionelles lacl-Gen aus E. coli, welches für das assoziierte Repressormolekül codiert, das in Abwesenheit des lac-Operon-Inducers mit dem lac-Promotor-Operator wechselwirkt, um eine Transkription davon zu verhindern.
Die Expression des gewünschten Polypeptids ist unter der Kontrolle des Lipoprotein- (Ipp) Promotors und des lac-Promotor-Operators, obwohl eine Transkription von jedem der Promotoren normalerweise durch das Repressormolekül blockiert wird. Der Repressor wird selektiv mittels eines Inducer-Moleküls inaktiviert, wobei die transkriptionelle Expression des gewünschten Polypeptids von beiden Promotoren induziert wird.
Das Repressorprotein kann codiert werden durch das Plasmid, welches das Konstrukt enthält oder durch ein zweites Plasmid, welches ein Gen enthält, das für ein Repressorprotein codiert. Das Repressorprotein kann die Transkription eines Promotors reprimieren, der Sequenzen von Nukleotiden enthält, an welche das Repressorprotein bindet. Die Repression des Promotors kann durch Verändern der physiologischen Bedingungen der Zelle rückgängig gemacht werden. Die Veränderung kann erreicht werden durch die Zugabe eines Moleküls, das zum Beispiel die Fähigkeit, mit dem Operator oder mit regulatorischen Proteinen oder anderen Regionen der DNA zu interagieren, hemmt, oder durch Veränderung der Temperatur des Wachstumsmediums. Bevorzugte Repressorproteine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf den lacl-Repressor von E. coli, der auf IPTG-Induktion anspricht, den temperatursensitiven cI857-Repressor. Der lacl-Repressor von E. coli ist bevorzugt.
In bestimmten Ausführungsformen enthalten die Konstrukte auch eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Promotorregionen und Transkriptionsterminatoren sind jeweils unabhängig ausgewählt aus denselben oder verschiedenen Genen. In einigen Ausführungsformen wird das DNA-Fragment in Bakterienzellen, bevorzugt in E. coli repliziert. Das DNA-Fragment enthält normalerweise auch einen bakteriellen Replikationsursprung, um die Erhaltung des DNA-Fragments von Generation zu Generation der Bakterien sicherzustellen. Auf diese Art und Weise können große Mengen der DNA durch Replikation in Bakterien hergestellt werden. Bevorzugte bakterielle Replikationsursprünge schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die f1-ori- und col-E1-Replikationsursprünge.
Für Insektenwirte können auch Baculovirusvektoren, wie etwa ein pBlueBac- (auch als pJVETL bezeichnet, und Derivate davon) Vektor, insbesondere pBlueBacIII (siehe zum Beispiel die US-Patente Nr. 5,278,050; 5,244,805; 5,243,041; 5,242,687; 5,266,317; 4,745,051 und 5,169,784; erhältlich von INVITROGEN, San Diego) zur Expression der Polypeptide verwendet werden. Der pBlueBacIII-Vektor ist ein Vektor mit doppeltem Promotor und ermöglicht die Selektion von Rekombinanten durch Blau/Weiß-Screening, da dieses Plasmid das β-Galactosidasegen (lacZ) unter der Kontrolle des von Insekten erkennbaren ETL-Promotors enthält, und mit IPTG induzierbar ist. Ein DNA-Konstrukt wird in einen Baculovirusvektor pBlueBacIII (INVITROGEN, San Diego, CA) eingebracht und wird dann mit einem Wildtypvirus in Insektenzellen von Spodoptera frugiperda (sf9-Zellen; siehe zum Beispiel Luckow et al. (1988) Bio/technology 6: 47–55 und US-Patent Nr. 4,745,051) cotransfiziert.
Bevorzugte bakterielle Wirte enthalten chromosomale Kopien der DNA, die für T7-RNA-Polymerase, in funktionsfähiger Weise mit einem induzierbaren Promotor, wie etwa dem lacUV-Promotor verbunden, codiert (siehe US-Patent Nr. 4,952,496). Solche Wirte schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf lysogene E. coli-Stämme HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) und BL21(DE3). Stamm BL21(DE3) ist bevorzugt. Die pLys-Stämme stellen geringe Spiegel an T7-Lysozym, einem natürlichen Inhibitor der T7-RNA-Polymerase bereit. Bevorzugte bakterielle Wirte sind die Insektenzellen Spodoptera frugiperda (sf9-Zellen; siehe zum Beispiel Luckow et al. (1988) Bio/technology 6: 47–55 und US-Patent Nr. 4,745,051).
Ein alternatives Expressionssystem, welches zur Expression des Fusionsproteins verwendet werden kann, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird das nukleäre Autographa californica-Polyhedrosisvirus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Das für das Fusionsprotein codierende Sequenz kann in nicht essentielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedringen) des Virus kloniert werden und unter der Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel des Polyhedrinpromotors) angeordnet werden. Eine erfolgreiche Insertion der Sequenz, die für das Fusionsprotein codiert, wird in einer Inaktivierung des Polyhedringens und in der Produktion von nicht eingeschlossenem rekombinanten Virus (das heißt Virus, dem die proteinartige Hülle fehlt, die durch das Polyhedringen codiert wird) resultieren. Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das insertierte Gen exprimiert wird, siehe US-Patent Nr. 4,215,051.
Die hierin bereitgestellten Konstrukte werden auch in den Baculovirusvektor insertiert, der kommerziell unter dem Namen pBLUEBACIII verkauft wird (INVITROGEN, San Diego, CA; siehe INVITROGEN KATALOG; siehe Vialard et al. (1990) J. Virol. 64: 37; siehe auch US-Patent Nr. 5,270,458; US-Patent Nr. 5,243,041 und veröffentlichte Internationale PCT-Anmeldung WO 93/10139, welche auf der US-Patentanmeldung mit der Seriennumner 07/792,600 basiert. Der pBlueBacIII-Vektor ist ein Vektor mit doppeltem Promotor und ermöglicht die Selektion von Rekombinanten durch Blau/Weiß-Screening, da dieses Plasmid das (3-Galactosidasegen (lacZ) unter der Kontrolle des von Insekten erkennbaren ETL-Promtors enthält, und mit IPTG induzierbar ist. Das Konstrukt oder ein anderes Konstrukt wird in diesen Vektor unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors insertiert. Blaue Einschlüsse minus virale Plaques werden selektiert und die Plaques werden gereinigt, und auf die Anwesenheit der Chemokin-Toxin-codierenden DNA durch mittels irgendeinem Standardverfahren durchsucht, wie etwa Western Blotting unter Verwendung eines passenden Antiserums oder Southern Blotting unter Verwendung einer passenden Sonde. Gereinigtes ausgewähltes rekombinantes Virus wird dann mit Wildtyp-Baculovirus in Spodoptera frugiperda-Zellen (sf9-Zellen) cotransfiziert, wie etwa durch CaPO₄-Transfektion oder Liposomen, und in Gewebekulturflaschen oder in Suspensionskulturen angezogen.
Bei der Hefe kann eine Anzahl von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten. Solche Vektoren sind gut bekannt (für einen Überblick siehe „Current Protocols in Molecular Biology", Band 2, Ausubel et al., Editoren, Ch 13, „Current Protocols", 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc., 1994-1999; Bitter, et al., Methods in Enzymol., 153: 516–544, 1987; Rothstein in: DNA Cloning, Band II, Glover, D. M., Editoren, IRL Press, Wash., D. C. Ch.3, 1986 und Bitter et al., Methods in Enzymol., 152: 673–684, 1987 und "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces", Strathern et al., Editoren, Cold Spring Harbor Press, Vols.I und II, 1982). Ein konstitutiver Hefepromotor, wie etwa ADH oder LEU2, oder ein induzierbarer Promotor, wie etwa GAL, kann verwendet werden (DNA Cloning, Band II, Glover, D. M., Editor, IRL Press, Wash., D. C., Ch.3, 1986). Alternativ können Vektoren verwendet werden, welche eine Integration fremder DNA-Sequenzen in das Hefechromosom fördern.
In Fällen, in denen Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer für ein Fusionsprotein codierenden Sequenz durch jeglichen einer Anzahl von Promotoren gesteuert werden. Zum Beispiel können virale Promotoren verwendet werden, wie etwa die 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., Nature 310 :511–514, 1984) oder der Hüllproteinpromotor von TMV (Takamatsu et al., EMBO J. 6: 307–311, 1987); alternativ können Pflanzenpromotoren, wie etwa die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671–1680, 1984; Broglie et al., Science 224: 838–843, 1984); oder Hitzeschockpromotoren, zum Beispiel hsp17.5-E oder hsp17.3-B aus der Sojabohne (Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6: 559–565, 1986) verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen eingebracht werden unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, usw. Für einen Überblick über solche Verfahren siehe beispielsweise Weissbach und Weissbach, „Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, NY, Section VIII, S. 421–463, 1988 und Plant Molecular Biology, 2.Ausgabe, Covey, S. N.; Editor, Ch.7–9, Blackie, London 1988).
Säugetierzellsysteme, welche rekombinante Viren oder virale Elemente verwenden, um die Expression zu steuern, können entworfen werden. Zum Beispiel kann bei der Verwendung von Adenovirus-Expressionsvektoren die für das Fusionsprotein codierende Sequenz an einen Transkriptions-/Translationskontrollkomplex von Adenovirus ligiert werden, zum Beispiel den späten Promotor und die dreigeteilte Leadersequenz. Dieses Chimäre Gen kann dann in das adenovirale Genom insertiert werden durch in vitro- oder in vivo-Rekombination. Eine Insertion in eine nicht essentielle Region des viralen Genoms (zum Beispiel Region E1 oder E3) wird ein rekombinantes Virus ergeben, welches lebensfähig ist und das Fusionsprotein in infizierten Wirten exprimieren kann (siehe zum Beispiel Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655–3659, 19841. Alternativ kann der 7,5K-Promotor aus Vaccinia-Virus verwendet werden (siehe zum Beispiel Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415–7419, 1982; Mackett et al., J. Virol. 49: 857–864, 1984; Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927–4931, 19821. Von besonderem Interesse sind Vektoren, basierend auf dem Schweine-Papillomavirus, welches die Fähigkeit besitzt, als extrachromosomale Elemente zu replizieren (Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486–96, 1981). Kurz nach dem Eintritt dieser DNA in Mauszellen repliziert das Plasmid auf etwa 100–200 Kopien pro Zelle. Die Transkription der insertierten cDNA erfordert keine Integration des Plasmids in das Wirtschromosom, wobei ein hohes Expressionsniveau erreicht wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression verwendet werden durch Einschließen eines selektierbaren Markers in das Plasmid, wie etwa das neo-Gen. Alternativ kann das retrovirale Genom zur Verwendung als ein Vektor modifiziert werden, der das Fusiansproteingen in Wirtszellen einbringen und dessen Expression steuern kann (Cone und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349–6353, 1984). Ein hohes Expressionsniveau kann auch erreicht werden unter Verwendung induzierbarer Promotoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Metallothionin-IIA-Promotor und Hitzeschockpromotoren.
Für eine Langzeitproduktion von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, welche virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit cDNA transformiert werden, die für das Fusionsprotein codiert, kontrolliert durch passende Expressionskontrollelemente (zum Beispiel Promotoren, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einem selektierbaren Marker. Der selektierbare Marker im rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt es Zellen, das Plasmid stabil in deren Chromosomen zu integrieren und zu wachsen und Foci zu bilden, welche wiederum kloniert und zu Zelllinien expandiert werden können. Nach dem Einbringen fremder DNA lässt man veränderte Zellen beispielsweise für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, und übersiedelt sie dann in ein Selektionsmedium. Es kann eine Anzahl von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Gene Thymidinkinase aus dem Herpes simplex-Virus (Wigler et al., Cell, 11: 223–32, 1977), Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska und Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026–30, 1962) und Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy et al., Cell, 22: 817–31, 1980), welche verwendet werden können in tk-, hgprt- bzw. aprt-Zellen. Es kann auch eine Antimetabolitresistenz verwendet werden als Basis einer Selektion auf dhfr, was eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3657–70, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527-31, 19811; gpt, was eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072–6, 1981; neo, was eine Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1–14, 1981) und hygro, was eine Resistenz gegen Hygromycingene (Santerre et al., Gene, 30: 147–56, 1984) verleiht. Kürzlich sind zusätzliche selektierbare Gene beschrieben worden, nämlich trpB, welches es den Zellen ermöglicht, anstelle von Tryptophan Indol zu verwenden; hisD, welches es den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartmann und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8047–51, 1988) und ODC (Ornithindecarboxylasel, welche eine Resistenz gegen den Ornithindecarboxylaseinhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO verleiht (McConlogue et al. J. Biol. Chem., 258: 8384–8388).
In einer Ausführungsform wird das Fusionsprotein durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt, worin ein einzelnes Polypeptid ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, einen Peptidlinkeranteil und ein proteinartiges zielorientiertes Agens, wie etwa einen Zelltoxinanteil enthält. Der Chemokinrezeptor-Ansteuerungsanteil kann bezogen auf den Zelltoxinanteil im Polypeptid am Aminoterminus angeordnet sein. Solch ein Fusionsprotein besitzt die verallgemeinerte Struktur: (Aminoterminus) Chemokinligandanteil – Peptidlinkeranteil – proteinartiger Zelltoxinanteil (Carboxyterminus). Solch ein Fusionsprotein besitzt die verallgemeinerte Struktur: (Aminoterminus) Chemokinligandanteil – Peptidlinkeranteil – proteinartiger Zelltoxinanteil (Carboxyterminusl, und wird in 1 veranschaulicht. Alternativ kann der Chemokinanteil bezogen auf den Zelltoxinanteil innerhalb des Fusionsproteins am Carboxyterminus angeordnet sein. Hierin sind auch Fusionsproteine vorgesehen, welche zusätzliche Aminosäuresequenzen am Amino- und/oder Carboxyterminus enthalten, zum Beispiel Polyhistidintags.
Nach einer Transformation können große Mengen des Proteins isoliert und gereinigt werden, gemäß konventioneller Verfahren. Zum Beispiel kann ein Lysat von dem Expressionswirt hergestellt werden, und das erwünschte Protein (oder Fusionsprotein) kann unter Verwendung von HPLC, Ausschluss chromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie oder andere Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das gereinigte Protein wird im Allgemeinen etwa 80% bis etwa 90% rein sein, und kann bis zu und einschließlich 100% Reiheit besitzen. Rein soll die Bedeutung besitzen, frei von anderen Proteinen, ebenso wie von Zelttrümmern.
b. Klonierung und Expression eines chimären Ligand-Toxin-Fusionsproteins Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Gesamt-RNA wird von einer Zelllinie isoliert, von der bekannt ist, dass sie den gewünschten proteinartigen Liganden erzeugt, und durch Fraktionierung über Oligo(dT)-Zellulose gereinigt, um RNA mit einem PolyA-Schwanz zu binden. Ein erster Strang der cDNA-Synthese wird durchgeführt unter Verwendung einer reversen Transkriptase und eines Primers mit einer geeigneten Restriktionsstelle, wie etwa Notl. Es sind mehrere reverse Transkriptasen erhältlich, wobei diejenigen von Vogel und Maus am häufigsten verwendet werden. Dieses DNA-RNA-Hybridmolekül wird dann verwendet, um einen cDNA-Doppelstrang zu erzeugen, durch eine von mehreren verschiedenen Verfahren, welche erhältlich sind. Es werden Linker an die DNA angeheftet, und die DNA wird dann mittels Agarosegelelektrophorese größenfraktioniert. Die so erhaltene DNA wird direkt in einen geeigneten Vektor kloniert, oder zuerst durch Sondieren durchmustert. Zur Sondierung werden zwei Oligonukleotide von der bekannten Gensequenz hergestellt, eines für jedes Ende des Gens, und die Oligonukleotide werden verwendet, um das Gel zu sondieren. Jede Region des Gels, welche eine Hybridisierung mit beiden Proben zeigt, wird ausgeschnitten und die DNA wird gereinigt. Diese gereinigte DNA wird kloniert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Erhaltene Kolonien werden erneut sondiert und positive Klone werden selektiert.
Expression des Genprodukts
Zweitens wird das Genprodukt exprimiert. Wenn einmal ein positiver Klon erhalten wurde, wird eine Sequenzierungsreaktion ausgeführt, um sicherzustellen, dass der selektierte Klon die gewünschte Sequenz besitzt.
PCR-Oligonukleotide werden so hergestellt, dass eine Restriktionsschnittstelle im Expiessionsvektor pKK223-3 (Pharmacia, Piscataway, NJ) dem ATG-Startcodon des Gens direkt vorausgeht. Nach dem 3-Ende des Gens befinden sich zwei Restriktionsstellen. Die erste Restriktionssteile wird von einem Enzym erkannt, welches 10–12 Basen vor der Erkennungssequenz schneidet, um einen nachfolgenden Verdau zu erlauben, um das Stoppcodon zu entfernen, und um eine Fusion an ein zweites Gen zu ermöglichen. Die zweite Erkennungsstelle wird verwendet, um das Gen in den Expressionvektor zu klonieren. Ein PCR wird unter Standardbedingungen durchgeführt, um die Sequenz zu verlängern, die resultierende DNA wird auf einem Agarosegel aufgetrennt, und ein Klon mit einer Bande mit der richtigen Größe wird ausgeschnitten und in den Expressionvektor kloniert. Da eine PCR Fehler einbringen kann, wird das gesamte Gen nun sequenziert, um zu bestätigen, dass es die erwünschte korrekte Sequenz besitzt. Wenn ein Klon mit der korrekten Sequenz auf diese Art und Weise isoliert worden ist, wird der Vektor in E. coli transfiziert, und der Klon wird bis zur mittleren log-Phase angezogen, induziert mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid für 4–6 h.
Exprimierte Proteine werden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und werden zur Isolierung mit Coomassie Blue-Farbstoff gefärbt. In diesem Stadium wird das Protein in einer löslichen Phase mit hoher Ausbeute exprimiert. Falls das Protein unlöslich ist oder die Ausbeute zu gering ist, werden verschiedene Modifikationen der Ribosomenbindungsstelle oder der Wachstumsbedingungen durchgeführt, um das Problem zu korrigieren.
Das zweite Nukleinsäurefragment, das mit dem Ligandengen fusioniert werden soll (zum Beispiel eine für einen proteinartigen Linker codierende Polynukleotidsequenz), wird durch Synthese aus einer bekannten Aminosäuresequenz, wie etwa die SEQ ID NO: 1–12, erhalten (Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/06641, welche beispielhaft Linker für eine Verwendung in Konjugaten bereitstellt), außer, dass am 5'-Ende ein PCR-Primer angefügt wird mit doppelten Restriktionsstellen, eine Stelle, um eine direkte Klovierung zur Expression zu erleichtern, und eine Stelle, welche eine Klovierung des Oligonukleotids in einen Expressionsvektor zur Herstellung eines Fusionsproteins erlaubt. Das zweite Protein würde entweder alleine oder in einem Fusionsprotein exprimiert werden, das die Produkte beider Gene enthält. Ein drittes Gen (zum Beispiel ein für ein proteinartiges Zelltoxin codierendes Gen) wird von einer passenden Zelllinie in der Art und Weise, wie oben beschrieben, erhalten und wird zu dem Expressionsvektor vor seiner Transfektion in die Wirtszelle zugefügt.
c. Konstruktion und Expression von beispielhaften Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens-Toxin-Fusionsgenen
Zwölf Ligand-Toxin-Fusionsgene (Tabelle 6) sind konstruiert worden. Die Genprodukte enthalten vier Liganden, die genetisch an jedes von drei. Toxinen fusioniert sind. Die HIS-markierten Gene wurden so konstruiert, dass eine kleine Menge jeder Fusion zweckmäßig exprimiert, gereinigt und in vitro getestet werden konnte. Die HIS-Markierung bietet auch eine alternative Route zur Proteinreinigung, falls eine benötigt werden sollte. Die Saporin enthaltende Chemokin-Toxin-Fusion dient als Prototyp, mit dem andere Toxine verglichen und charakterisiert werden können.
Teilweise gereinigtes OPL898110 ist an Zielzellen und an Nichtzielzellen in vitro getestet worden. In einem relativ ruhigen Stadium werden Zielzellen (humane primäre periphäre Blutmonozyten und die humane THP-1-Zelllinie) langsam ausgerottet, in Übereinstimmung mit einem apoptotischen Mechanismus, wohingegen aktivierte Zielzellen (die humane THP-1-Zelllinie und humane primäre T-Lymphozyten) in einem kürzeren Zeitrahmen ausgerottet wurden. Der letztere Effekt rührt zumindest teilweise her von der hochregulierten metabolischen Rate der Zellen, Expression eines geeigneten Chemokinrezeptors und dem hemmenden Effekt von OPL98110 auf eine erhöhte Proteinsyntheserate. Metabolisch aktive Nichtzielzellen (präaktivierte humane fötale Neuronen und humane Gliomzellen) werden durch das Chemokin-Toxin bei Konzentrationen, bei denen Zielzellen deutlich anormal oder tot aussehen, nicht betroffen. Das in Gewebekultur getestete Chemokin-Toxin-Fusionsprotein tötet von Leukozyten abstammende Zielzellen, betrifft aber keine Nichtzielzellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass OPL98110 bei der Behandlung einer Rückenmarksverletzung nützlich sein würde.
Dieses Chemokin-Toxinprotein wird vewendet, um die Zellen auszurotten, welche einen Sekundärgewebeschaden verursachen, während die vitalen Neuronen und Astrozytenpopulationen, welche für ein normales ZNS-Überleben und eine normale ZNS-Funktion notwendig sind, verschont werden.
Wie oben angemerkt, wurden zwölf beispielhafte Konstrukte konstruiert, welche für eine Reihe von Chemokin-Toxin-Fusionsproteinen codieren, enthaltend ein Chemokin, angeheftet an ein zelluläres Toxin über einen Peptidlinker. Die Zusammensetzungen, Codebezeichnungen und ausgewählte theoretische Charakteristika dieser Fusionsproteine werden in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6. Zusammensetzung, Bezeichnung, theoretisches Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt von Chemokin-Toxinen und freien Toxinen
Die Expression jedes Chemokin-Toxins war klar nachweisbar, aber schätzungsweise im Wesentlichen weniger als 0,1 % des Gesamtproteins der rohen Zellpasten. Diese geringen Mengen sind völlig übereinstimmend mit zuvor veröffentlichten Beobachtungen, dass Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIPs), einschließlich Shiga- und Saporin-Toxinen, für die bakteriellen Wirtszellen, welche sie exprimieren, toxisch sind. Genauer gesagt ist die Shiga-A1-Untereinheit das wirksamste RIP-Toxin, das gegen E. coli-Ribosomen untersucht wurde. Um die Mengen der exprimierten Proteine zu verbessern, wird ein Signalpeptid in funktionsfähiger Weise mit dem Expressionsprotein verbunden, um es in den periplasmatischen Raum zu transportieren, Alternativ und bevorzugt wird das Fusionsprotein in eng regulierte Expressionsvektoren eingebracht und unter Verwendung optimierter Medien und Fermentationsverfahren angezogen.
Die hierin bereitgestellten Fusionsproteine wurden exprimiert unter Verwendung des eng regulierten pET11c-Vektors (T7-Promotor), aber die Fermentationsbedingungen waren für eine Routineproteinproduktion noch nicht optimiert. Übereinstimmend damit beginnen mit Chemokin-Toxin transformierte E, coli ungefähr 4 h nach der Induktion und bei einer relativ geringen Zelldichte zu sterben. Neuere Experimente mit OPL98110 und OPL98106 zeigen, dass diese Chemokin-Toxine zunehmend mit der unlöslichen Fraktion assoziiert sind, wenn die Fermentation fortschreitet, was darauf hindeutet, dass sie mit Einschlusskörpern assoziiert sind. Unlösliche Einschlusskörper sind ein praktischer Vorteil bei der Proteinisolierung und Reinigung. Die Optimierung der Fermentation der Stämme, welche die Chemokin-Toxin-Konjugat codierenden Proteine enthalten, einschließlich der Übernahme automatisierter Fermentatoren und geeigneteren Wachstumsmedien und Wachstumsbedingungen werden den vollen Nutzen des pET11c-Systems ausnützen.
2. Herstellung von chemischen Konjugaten
Um hierin eine chemische Konjugation zu bewirken, wird das Ansteuerungsagens durch einen oder mehrere ausgewählte Linker oder direkt an das zielorientierte Agens gebunden. Eine chemische Konjugation muss verwendet werden, wenn das zielorientierte Agens etwas anderes als ein Peptid oder Protein ist, wie etwa eine Nukleinsäure oder ein Nichtpeptid-Arzneimittel. Es können alle Mittel verwendet werden, die Fachleuten im Fachgebiet für eine chemische Konjugation ausgewählter Anteile bekannt sind. Mehrere Verfahren werden in den Beispielen beschrieben.
E. Tiermodelle zur Untersuchung von Konjugaten
Die hierin bereitgestellten Konjugate und verfügbare Konjugate, wie etwa IL-2, IL-4, GM-CSF, Anti-CD4 und Anti-CD5 enthaltende Konjugate, verwendet für andere Indikationen, können in verschiedenen Tiermodellen für die hierin in Erwägung gezogenen Entzündungserkrankungen und Bedingungen verwendet und getestet werden, um die Wirkung zu bestätigen und/oder die Konjugate zu identifizieren, die für die Behandlung einer hierin in Erwägung gezogenen, bestimmten Krankheit oder Bedingung geeignet sind.
Auch die hierin bereitgestellten Chemokinrezeptor-Ansteuerungskonjugate können in Modellen für Erkrankungen getestet werden, für die andere Konjugate verwendet worden sind. Zum Beispiel das Maus-Xenotransplantat-Modell für die Identifizierung einer Antitumoraktivität (siehe zum Beispiel Beitz et al. (1992) Cancer Research 52: 227–230; Houghton et al. (1982) Cancer Res. 42: 535–539; Bogden et al. (1981) Cancer (Philadelphia) 48: 10–20; Hoogenhout et al. (1983) Int. J. Radiat. Oncol., Biol. Phys. 9: 871–879; Stastny et al. (1993) Cancer Res. 53: 5740–5744).
Tiermodelle zur Selektion von Kandidaten für die Behandlung von Säugetieren sind gut bekannt und es gibt zahlreiche bekannte Modelle. Außerdem ist die Rolle von aktivierten Immunzellen in diesen Erkrankungszuständen demonstriert worden. Beispielhafte Modelle für solche Erkrankungen und Bedingungen schließen diejenigen der folgenden Diskussion ein, sind aber nicht beschränkt darauf.
Rückenmarksverletzung (SCI)
Einige beispielhafte Referenzen, welche Tiermodelle für eine SCI bereitstellen und verwenden, die zur Untersuchung von Chemokinrezeptor-Ansteuerungskonjugaten verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden.
Bennett et al. (1999) „Spasticity in rats with sacral spinal cord injury" [Zitat in Arbeit] J. Neurotrauma 16: 69–84 stellt ein Rattenmodell der Muskelspastizität bereit, welches minimal disruptiv ist, die Bewegungsfunktion von Blase, Darm oder unteren Gliedmaßen nicht stört. Rückenmarksdurchtrennungen wurden auf der Sakralhöhe S2 durchgeführt und betrafen somit nur die Schwanzmuskulatur. Nach der Rückenmarksdurchtrennung waren die Muskeln des Schwanzes für 2 Wochen inaktiv. Nach diesem anfänglichen Zeitraum entwickelten sich im Schwanz eine Hypertonie, Hyperreflexie und ein Klonus, und wurden mit der Zeit ausgeprägter. Diese Veränderungen wurden in der wachen Ratte bewertet, da der Schwanz leicht zugänglich und leicht zu manipulieren ist. Eine Muskeldehnung oder Hautstimulation des Schwanzes erzeugte Muskelkrämpfe und deutliche Anstiege im Muskeltonus, wie durch Aufzeichnungen der Kraft und alektromyographischen Aufzeichnungen gemessen wurde. Wenn der Schwanz nicht angespannt war, rollten spontane oder durch Reflex induzierte Krämpfe von Beugemuskel und Streckmuskel den Schwanz auf. Eine Bewegung während der Krämpfe löste oft einen Klonus am Ende des Schwanzes aus. Das Schwanzhaar und die Haut waren gegenüber leichter Berührung extrem hyperreflexiv, wobei bei einem Kontakt schnell zurückgezogen wurde, und zeitweise zog ein wiederholter Kontakt des Schwanzes mit einer Oberfläche einen Klonus nach sich. Reflexe von Schwanzmuskelsegmenten, zum Beispiel Hoffman-Reflexe (N-Reflexe), wurden vor und nach der Spinalisierung gemessen, und stiegen 2 Wochen nach der Durchtrennung signifikant an. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sakralrückenmarks-Ratten Symptome der Spastizität in Schwanzmuskeln mit ähnlichen Charakteristika entwickeln wie diejenigen, die in Muskeln von Gliedmaßen bei Menschen mit einer Rückenmarksverletzung beobachtet werden, und somit eine geeignete Präparation zur Untersuchung dieser Bedingung bereitstellen.
Taoka et al. (1998) „Spinal cord injury in the rat", Prog. Neurobiol. 56: 341–58 stellt einen Überblick über die pathologischen Mechanismen einer Trauma-induzierten Rückenmarksverletzung in Ratten zur weiteren Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bereit. Eine durch ein Trauma induzierte Rückenmarksverletzung ist eine Konsequenz einer anfänglichen physischen Verletzung und einem nachfolgenden fortschreitenden Verletzungsprozess, welcher verschiedene pathochemische Ereignisse betrifft, die zu einer Gewebezerstörung führen; der letztere Prozess sollte deswegen ein Ziel der pharmakologischen Behandlung sein. Kürzlich ist gezeigt worden, dass aktivierte Neutrophile mit dem letzteren Prozess der Rückenmarksverletzung in Ratten verbunden sind. Aktivierte Neutrophile schädigen die Endothelzellen durch Freisetzung von Entzündungsmediatoren, wie etwa neutrophile Elastase und freie Sauerstoffradikale. Eine Adhäsion aktivierter Neutraphile an die Endothelzelle könnte bei der Endothelzellverletzung auch eine Rolle spielen. Diese Endothelzellverletzung könnte wiederum mikrozirkulatorische Störungen induzieren, welche zu einer Rückenmarksischämie führen. Einige therapeutische Agenzien, welche die Aktivierung von Neutrophilen hemmen, lindern die Bewegungsstörungen, die in dem Rattenmodell der Rückenmarksverletzung beobachtet wurden. Methylprednisolon (MPS) und GM1-Gangliosid, welche die zwei einzigen pharmakologischen Agenzien sind, welche gegenwärtig klinisch für eine Behandlung einer akuten Rückenmarksverletzung verfügbar sind, hemmen in diesem Rattenmodell die Aktivierung der Neutrophilen nicht. Zusammengenommen erheben diese Beobachtungen die Möglichkeit, dass die Verwendung anderer pharmakologische Agenzien, welche die Aktivierung von Neutrophilen hemmen, in Verbindung mit MPS oder GM1-Gangliosid bei der Behandlung einer traumatischen Rückenmarksverletzung bei Menschen einen synergistischen Effekt haben könnte.
Carlson et al. (1998) „Acute innflamatory response in spinal cord following impact injury", Exp Neurol 151: 77–88, stellt eine Studie bereit, welche die rostral-kaudale Verteilung von Neutrophilen und Makrophagen/ Mikroglia zum Zeitpunkt von 4, 6, 24 und 48 h nach einer Kontusionsverletzung des T10-Rückenmarks von Ratten (10 g Gewicht, 50 mm Fall) untersucht. Die Neutrophilen waren vorwiegend in nekrotischen Regionen lokalisiert, mit einem Zeitverlauf, welcher bei 24 h einen Höhepunkt besaß, wie durch Myeloperoxidase-Aktivitätsassays (MPO) gemessen wurde. Der schärfste Peak der MPO-Aktivität wurde zwischen 4 mm rostral und kaudal zur Verletzung gemessen. Makrophagen/Mikroglia wurden mit Antikörpern gegen ED1 und OX-42 sichtbar gemacht. Nach 24 h waren zahlreiche Zellen mit einer phagozytischen Morphologie vorhanden, wobei eine höhere Anzahl bei 48 h vorhanden war. Diese Zellen waren überwiegend innerhalb der grauen Substanz und der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz des Funiculus dorsalis lokalisiert. Die Anzahl der Zellen nahm allmählich bis 6 mm rostral und kaudal zur Läsion ab. Die OX42-Färbung zeigte auch reaktive Mikroglia mit stumpfen Prozessen, insbesondere an Flächen, die fern von der Läsion waren. Die Anzahl von Makrophagen/Mikroglia korrelierte signifikant mit dem Ausmaß des Gewebeschadens an jeder Fläche.
Bartholdi et al. (1997) „Expression of pro-inflammatory Zytokine and chemokine mRNA upon experimental spinal cord injudy in mouse: an in situ hybridisation study", Eur J Neurosci 9: 1422–38 beschreibt eine Untersuchung des Expressionmusters von proinflammatorischen und von als chemotaktische Faktoren fungierenden Zytokinen in einem experimentellen Maumodell mit einer Rückenmarksverletzungs. Eine in situ-Hybridisierung zeigt, dass Transkripte der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1 ebenso wie der Chemokine MIP-1α und MIP-1β innerhalb der ersten Stunde nach der Verletzung hochreguliert sind. In dieser frühen Phase ist die Expression der proinflammatorischen Zytokine auf Zellen in den Umgebungen des Läsionsbereichs beschränkt, wahrscheinlich vorhandene ZNS-Zellen. Während TNF-α in einem sehr engen Zeitfenster exprimiert wird, kann IL-1 in einer zweiten Phase in einer Untergruppe polymorphonukleärer Granulozyten nachgewiesen werden, welche nach etwa 6 h in das Rückenmark einwandern. Boten für die Chemokine MIP-1α und -β werden in einer verallgemeinerten Art und Weise in der grauen Substanz des gesamten Rückenmarks nach etwa 24 h exprimiert, und werden nach 4 Tagen nach der Verletzung wieder auf das zelluläre Infiltrat an der Läsionsstelle beschränkt. Die Daten weisen darauf hin, dass vorhandene ZNS-Zellen, sehr wahrscheinlich Mikrogliazellen, und nicht periphere Entzündungszellen die Hauptquelle für Zytokin- und Chemokin-mRNAs sind. Das beobachtete definierte Zytokinmuster deutet darauf hin, dass die inflammatorischen Ereignisse nach einer Verletzung des ZNS eng kontrolliert sind. Die sehr frühe Expression von proinflammatorischen Zytokin- und Chemokin-Boten können ein wichtiges Element der Rekrutierung von Entzündungszellen darstellen.
Blight et al. (1991) „Morphometric analysis of blood vessels in chronic experimental spinal cord injury: hypervascularity and recovery of function", J Neurol Sci 106: 158–74 stellt ein Modell eines Rückenmarkstraumas in Meerschweinchen dar, basierend auf einer Kompression zu einer festgelegten Dicke, wurde zuvor beschrieben wird. Kompressionsverletzungen des unteren Thorakalstrangs wurden in 11 anästhesierten, adulten Meerschweinchen erzeugt, und das Ergebnis wurde unter Verwendung nachfolgender Verhaltenstests und einer Morphometrie der Läsion nach 2–3 Monaten überwacht. Dieser Bericht beschreibt Veränderungen in der Vaskularisation des Rückenmarks, basierend auf einer lichtmikroskopischen Analyse von Plastik-Querschnitten durch das Zentrum der Läsion von 1 Mikrometer. Die mittlere Dichte der Blutgefäße in diesen Läsionen betrug ungefähr das Zweifache von dem, was in äquivalenten Regionen von normalem, unverletzten Rückenmark gefunden wurde, und die Hypervaskularisation der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz erstreckte sich mindestens vier Rückenmarkssegmente in kranialer und kaudaler Richtung von dem Läsionszentrum. Die Verteilung des Kapillardurchmessers war signifikant zu größeren Werten hin verschoben und größere perivaskuläre Räume umgaben die meisten kapillaren und präkapillaren und postkapillaren Gefäße. Das Ausmaß der Hypervaskularisation war nicht mit der Schwere der Verletzung insgesamt korreliert, sondern es gab eine signifikante positive Korrelation zwischen der Dichte der Blutgefäße in den äußeren 400 Mikrometern der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz und dem sekundären Verlust einer neurologischen Funktion unterhalb der Läsion, beobachtet zwischen 1 Tag und 8 Wochen nach der Verletzung. Diese Daten zeigen, dass eine Hypervaskularisation der Läsion mit den sekundären pathologischen Mechanismen einer Rückenmarksverletzung verbunden ist, wahrscheinlich mit Entzündungsreaktionen, welche von der primären mechanischen Verletzung relativ unabhängig sind, aber mit dem Verlust und der Wiedergewinnung der Funktion enger verbunden sind.
Blight et al. (1993) „Increased levels of the exotoxin quinolinic acid in spinal cord following contusion injury", Brain Res 632: 314–6 zeigt, dass die Produkte von inflammatorischen Phagozyten möglicherweise zur sekundären Pathologie nach einem Rückenmarkstrauma beitragen und stellt eine Untersuchung dar, welche die Spiegel des Neurotoxins und eines Produkts von aktivierten Makrophagen, Chinolinsäure (QUIN) in dem unteren thorakalen Rückenmark von adulten Meerschweinchen 5 Tage nach einer kurzen Kompressionverletzung quantifiziert. An der verletzten Stelle (T 13) begleiteten Erhöhungen der Gewebe-QUIN-Spiegel (> 10-fach) proportional die Anstiege in der Aktivität der Indolamin-2,3-dioxygenase (> 2-fach) und die Konzentrationen an L-Kynurenin (> 2,5-fach). Im Gegensatz dazu traten im Vergleich zu Kontrollen keine signifikanten Veränderungen in 2 nicht verletzten Regionen auf, welche untersucht wurden, nämlich dem zervikalen Rückenmark (C 2) und dem somatosensorischen Kortex.
Forbes et al. (1994) „Inhibition of neutrophil adhesion does not prevent ischemic spinal cord injury", Ann Thorac Surg 58: 1064–8, beruht auf Tiermodellen, um zu zeigen, dass eine Paraplegie nach einer transienten Aortaokklusion als eine Konsequenz einer primären Ischämie des Rückenmarks oder einer Verletzung während der Reperfusionsperiode auftreten kann. Bei Tiermodellen mit Ischämie/Reperfusion gibt es einen Anhaltspunkt dafür, dass die Reperfusionsverletzung teilweise durch Neutrophile moduliert werden kann. Die Effizienz des murinen monoklonalen Antikörpers (Mab 60.3), der die Neutrophilenadhärenz blockiert wurde bei einer Rückenmarksischämie/ Reperfusion in Kaninchen bewertet. Eine Rückenmarksischämie wurde durch eine Ballonkatheterokklusion der Aorta unterhalb der Niere erreicht. Eine neurologische Bewertung wurde eingeteilt in normal, teilweise neurologisch defizient oder komplett paralytisch. Eine elektrophysiologische Überwachung mit somoatosensorisch hervorgerufenen Potentialen wurde verwendet, um die optimale Länge der Okklusionsdauer zu bestimmen. Die Tiere wurden zufällig mit 2 mg/kg Mab 60.3 intravenös (n = 8) oder mit Salinelösung (n = 9) behandelt, wobei der Wissenschaftler die Behandlung nicht kannte. Mittlere Okklusionszeiten waren zwischen den Gruppen nicht unterschiedlich (Kontrolle 32,± 3,6 min gegenüber MAb, 32,4 t 6,0 min). Fünf (55%) mit Saline behandelte und vier (50%) mit MAb 60.3 behandelte Tiere wurde paraplegisch. Tiere mit anfänglicher Paraparese entwickelten sich innerhalb von 24 h alle zur schlaffen Paraplegie. Die Untersuchung schlussfolgert, dass eine Rückenmarksverletzung nach einer transienten Aortaokklusion unabhängig ist vom CD11/CD18-Glykoproteinkomplex der Neutrophilen. Eine Verletzung in diesem Rahmen kann während einer Ischämie auftreten, und muss somit nicht abhängig sein von Neutrophilen oder von einer Reperfusion.
Liu et al. (1997) „Neuronal und glial apoptosis after traumatic spinal cord injury", J Neurosci 17: 5395–406 untersucht das Rückenmark von Ratten, die traumatischen Verletzungen leichter bis mittlerer Schwere unterzagen wurden. Innerhalb von Minuten nach einem Aufprall mit geringem Gewicht (10 g Gewicht fallen 6,25 mm) zeigten Neuronen im unmittelbaren Aufprallbereich einen Verlust der cytoplasmatischen Nissl-Substanzen. Über die nächsten 7 Tage weitete sich dieses Läsionsgebiet aus und höhlte sich aus. Neuronen, die gegenüber einer Desoxynukleotidyltransferase (TdT)-vermittelten Desoxyuridintriphosphat-Biotin-Nick-Endmarkierung (TUNEL) positive waren, wurden primär wahrgenommen, beschränkt auf das grobe Läsionsgebiet, 4–24 h nach der Verletzung, mit einem maximalen Auftreten bei 8 h nach der Verletzung. TUNEL-positive Glia waren in allen untersuchten Stadien zwischen 4 h und 14 Tagen vorhanden, mit einem maximalen Vorliegen innerhalb des Läsionsbereichs bei 24 h nach der Verletzung. 7 Tage nach der Verletzung wurde eine zweite Welle TUNEL-positiver Gliazellen in der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz peripher zur Läsion und sich zumindest mehrere Millimeter weg von dem Läsionszentrum ausdehnend beobachtet. Der Hinweis auf Apoptose wurde durch Elektronenmikroskopie ebenso wie durch Kernfärbung mit Hoechst 33342-Farbstoff unterstützt, und durch Untersuchung der DNA, welche von der Läsionsstelle präpariert wurde. Weiterhin erzeugten wiederholte intraperitoneale Injektionen von Cyclheximid, beginnend unmittelbar nach einem Gewichtsaufprall aus 12,5 mm, eine wesentliche Verringerung der histologischen Anhaltspunkte einer Strangschädigung und einer motorischen Fehlfunktion, welche 4 Wochen später bewertet wurden. Die Daten stützen die Hypothese, dass Apoptose, die von der aktiven Proteinsynthese abhängig ist, zum neuronalen und Gliazelltod beiträgt, ebenso wie zur neurologischen Fehlfunktion, induziert durch traumatische Verletzungen des Rückenmarks der Ratte von leichter bis mittlerer Schwere.
Traumatische Hirnverletzung und Schlaganfall
Ghirnikar et al. (1996) „Chemokine expression in rat stab wound brain injury", J Neurosci Res 46: 727–33 beschreibt, dass eine traumatische Verletzung des adulten Säugetierzentralnervensystems (ZNS) in reaktiver Astrogliose und in der Einwanderung von hämatogenen Zellen in das verletzte Nervengewebe resultiert. Chemokine, eine Klasse von chemotaktischen Zytokinen werden als Mediatoren der inflammatorischen Verändungern erkannt, welche nach einer Verletzung auftreten. Die Expression von MCP-1 (chemotaktisches Makrophagenpeptid-1), ein Mitglied der β-Familie der Chemokine, ist bei einem Trauma im Rattengehirn nachgewiesen worden (Berman (1996) et al. J Immunol 156: 3017–3023). Unter Verwendung eines Stichwundenmodells für eine mechanische Verletzung wird die Expression von zwei anderen β-Chemokinen im Rattengehirn untersucht: RANTES (reguliert bei Aktivierung, exprimiert und sekretiert von normalen T-Zellen) und MIP-1β (Makrophagen-inflammatorisches Protein-1β). Die Stichwundenverletzung wurde durch eine weitgestreute Gliose und Infiltration hämatogenen Zellen charakterisiert. Eine immunhistochemische Färbung ergab die Anwesenheit von RANTES und MIP-1β im verletzten Gehirn. RANTES und MIP-1β wurden beide im nekrotischen Gewebe verstreut exprimiert und wurden bereits 1 Tag nach Verletzung (dpi, "day post-injury") nachgewiesen. Doppelmarkierungsstudien zeigten, dass MIP-1β, nicht aber RANTES von reaktiven Astrozyten nahe der Läsionsstelle exprimiert wurde. Außerdem wurde eine MIP-1β-Färbung auch auf Makrophagen an der Stelle der Verletzung nachgewiesen. Die anfängliche Expression der Chemokine korrelierte mit dem Auftreten inflammatorischer Zellen im verletzten ZNS, was darauf hindeutet, dass RANTES und MIP-β eine Rolle in den Entzündungsereignissen einer traumatischen Hirnverletzung spielen können. Diese Untersuchung zeigt auch eine MIP-1β-Expression in reaktiven Astrozyten nach einem Trauma des Ratten-ZNS.
Wang et al. (1998) „Prolonged expression of interferon-inducible protein-10 in ischemic cortex after permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat", J. Neurochem 71: 1194–204 untersucht die Rolle von IP-10 bei fokalem Schlag, und untersucht die temporäre Expression von IP-10-mRNA nach Okklusion der mittleren Gehirnarterie in der Ratte mittels einer Northern-Analyse. Die Expression von IP-10-mRNA nach einem fokalen Schlag zeigte ein einzigartiges zweiphasisches Profil, mit einem deutlichen frühen Anstieg nach 3 h (4,9-fach gegenüber der Kontrolle; p 0,01), ein Peakniveau bei 6 h (14,5-fach; p 0,001) nach Okklusion der mittleren Gehirnarterie, und eine zweite Induktionswelle 10–15 Tage nach der ischämischen Verletzung (7,2- und 9,3-fachen Anstieg für 10 bzw. 15 Tage; p 0,001). Eine in situ-Hybridisierung bestätigte die induzierte Expression der IP-10-mRNA und ergab deren räumliche Verteilung nach einem fokalen Schlag. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten die Expression des IP-10-Peptids in Neuronen (3–12 h) und Astrogliazellen (6 h–15 Tage) der ischämischen Zone. Es wurde eine dosisabhängige chemotaktische Wirkung von IP-10 auf C6-Gliazellen und ein verstärktes Anhaften von granulären Cerebrellum-Neuronen gezeigt. Die Daten weisen darauf hin, dass Ischämie IP-10 induziert, welches eine pleiotrope Rolle in einer verlängerten Leukozytenrekrutierung, Astrozytenmigration/Aktivierung und Neuronenanheftung/Auswachsen nach einem fokalen Schlag spielt.
Galasso et al. (1998) „Excitotoxic brain injmury stimulates expression of the chemokine receptor CCR5 in neonatal rats", Am J Pathol 153: 1631–40, bewertet den Einfluss von intrahippokampalen Injektionen von NMDA auf die CCR5-Expression bei Ratten am postnatalen Tag 7. Eine reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion ergab einen Anstieg der hippokampalen CCR5-mRNA-Expression 24 h nach der Verletzung, und eine in situ-Hybridisierungsanalyse zeigte, dass CCR5-mRNA in dem verletzten Hippokampus und benachbarten Regionen exprimiert wurde. Eine Western-Blot-Analyse zeigte erhöhtes CCR5-Protein in Hippokampusgewebeextrakten 32 h nach dem Verletzen. Komplementäre immunhistochemische Untersuchungen identifizierten infiltrierende Mikroglia/Monozyten und verletzte Neuronen als die hauptsächlichen CCR5-immunreaktiven Zellen. Diese Ergebnisse beweisen, dass eine akute exzitotoxisch wirkende Verletzung die CCR5-Expression reguliert.
Vannucci et al. (1999) „Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage", J Neurosci Res 55: 158–63, verwendet ein Modell mit unreifen Ratten, um Einblicke in die Pathogenese und die Leitung eines perinatalen hypoxisch-ischämischen Gehirnschadens zu gewinnen. Das Modell ist verbunden mit der Ligation einer Halsschlagader, anschließend gefolgt von einer systemischen Hypoxie. Die Verletzung produziert einen dauerhaften hypoxisch-ischämischen Hirnschaden, beschränkt auf die Großhirnhälfte, die auf gleicher Seite ist wie die Karotis-Okklusion. Dieses Modell wird in Untersuchungen verwendet, um therapeutische Strategien zu identifizieren, um einen hypoxisch-ischämischen Gehirnschaden zu verhindern oder zu minimieren.
Alzheimer-Krankheit
Hauss-Wegrzyniak et a. (1998) „Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer sdisease", Brain Res 780: 294–303, beschreibt, dass inflammatorische Prozesse bei der Pathogenese von degenerativen Veränderungen und kognitiven Beeinträchtigungen eine Rolle spielen, die verbunden sind mit der Alzheimer Krankheit (AD), und beschreibt die Verwendung von Lipopolysaccharid (LPS) aus der Zellwand von gram-negativen Bakterien, um eine chronische, globale Entzündung innerhalb des Gehirns von jungen Ratten zu erzeugen. Eine chronische Infusion von LPS (0,25 μg/h) in das vierte Ventrikel für 4 Wochen erzeugte (1) einen Anstieg der Anzahl der aktivierten Astrozyten, die gegenüber dem sauren gliafibrillären Protein positiv sind, und der OX-6-positiven, reaktiven Mikroglia, verteilt über das ganze Gehirn, wobei der größte Anstieg innerhalb des Schläfenlappens auftritt, insbesondere im Hippokampus, (2) eine Induktion der mRNA-Spiegel von Interleukin-1β, Tumornekrosefaktor-α und (β-Amyloidvorläuferprotein innerhalb der basalen Vorhirnregion und dem Hippokampus, (3) die Degeneration von hippokampalen CA3-Pyramidalneuronen, und (4) eine signifikante Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses, wie durch einen verminderten spontanten Verhaltenswechsel in einem T-Labyrinth bestimmt wird.
Zahlreiche andere Modelle der Alzheimer-Krankheit, einschließlich Nagetieren, welche genetisch verändert sind, um die mutierte Form eines humanen Gens zu exprimieren, welches in die Produktion von Aβ in Familien mit einem frühen Beginn der AD involviert ist, sind Fachleuten dieses Fachgebiets bekannt und verfügbar.
Multiple Sklerose
Multiple Sklerose (MS) ist eine Entzündungskrankheit des zentralen Nervensystems (ZNS), charakterisiert durch lokalisierte Bereiche der Demyelinisierung. Obwohl die Ätiologie und Pathogenese von MS größtenteils unbekannt geblieben ist, wird im Allgemeinen angenommen, dass Immunreaktionen gegen Myelinantigene zum Krankeitsprozess beitragen. Die genaue Reihenfolge der Ereignisse, ebenso wie die molekularen Mediatoren, welche zur Myelinzerstörung führen, muss noch bestimmt werden.
Liu et al. (1998) „TNF is a potent anti-inflammatory Zytokine in autoimmune-mediated demyelination", Nat Med 4: 78–83, beschreibt die Verwendung eines Nagetiermodells für experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) zur Untersuchung von MS.
Arthritis und Autoimmunerkrankung
Barnes et al. (1998) „Polyclonal antibody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model", J Clin Invest 101: 2910–9, beschreibt, dass die Adjuvans-induzierte Arthritis (AIA) eine von vielen Tiermodellen der rheumatoiden Arthritis ist, eine Erkrankung, charakterisiert durch ein zelluläres Infiltrat von T-Lymphozyten und Makrophagen. Garnes et al. beschreiben die Entwicklung dieses Erkrankungsmodells im Hinblick auf Chemokinexpression und zeigen, dass erhöhte Spiegel von zwei Chemokinen, RANTES, einem chemotaktischen Faktor für T-Lymphozyten und Monozyten, und KC, einem chemotaktischen Faktor für Neutrophile, in gesamtem Blut und im Gelenk gefunden wurden. Spiegel von MIP-1α, einem anderen chemotaktischen Faktor für T-Lymphozyten und Monozyten, waren während des Verlaufs der Erkrankung im gesamten Blut unverändert und im Gelenk nur leicht erhöht. Die RANTES-Expression spielt eine wichtige Rolle bei der Erkrankung, da polyklonaler Antikörper gegen RANTES die Symptome bei Tieren, in denen AIA induziert ist, stark lindert, und es wurde gefunden, dass er als Behandlung ebenso effizient ist wie Indomethacin, ein nicht steroider Stoff gegen Entzündungen. Polyklonale Antikörper entweder gegen MIP-1α oder gegen KC waren nicht wirksam.
Weinberg, A. D. (1998) „Antibodies to OX-40 (CD 134) can identify and eliminate autoreactive T cells: implications for human autoimmune disease", Mol Med Today 4: 76–83, beschreibt, dass Autoantigen-spezifische CD4+-T-Zellen als der ursächliche Zelltyp in Verbindung gebracht worden sind mit: multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Autoimmunuveitis, Diabetes mellitus, entzündlichere Darmerkrankung und Transplantat-Wirtreaktion, beschreibt die Verwendung von experimentell induzierten Autoimmunerkrankungen bei der Entwicklung einer wirksamen Therapie, welche die autoreaktiven T-Zellen an der Stelle der autoimmunen Gewebezerstörung auslöscht.
Schriet et al. (1998) „Rote of chemokines and Zytokines in a reactivation model of arthritis in rats induced by injection with streptococcal walls", J Leukoc Biol 63: 359–63, stellt eine Untersuchung der Rolle der Chemokine in einem Arthritis-Tiermodell bereit. Eine intraartikuläre Injektion von Streptokokkenzellwand- (SCW-) Antigen, gefolgt von einer intravenösen Herausforderung, resultiert bei kranken, weiblichen Lewis-Ratten in einer T- Zell-vermittelten monoartikulären Arthritis. Anfängliche Untersuchungen zeigten, dass diese Reaktivierungsreaktion auf intravenöses SCW-Antigen von der Anwesenheit von Interleukin-1 (IL-1) und dem Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) abhängt, und dass die frühre Phase des Anschwellens von Neutrophilen abhängig ist. Eine Neutrophilenerschöpfung oder passive Immunisierung mit Antikörpern gegen P-Selectin oder das Makrophagen-Entzündungsprotein-2 verringerte die Intensität eines Knieödems und den Einstrom von Neutrophilen. Nach den ersten paar Tagen wird aber die arthritische Reaktion primär durch mononukleäre Zellen vermittelt. Gelenkgewebe zeigten eine Hochregulierung der mRNA für das chemotaktische Monozytenprotein-1 (MCP-1), welches teilweise durch Anti-IL-4 gehemmt werden konnte; eine Behandlung der Ratten mit Antikörpern gegen IL-4 oder MCP-1 unterdrückte deutlich die Entwicklung eines Knieödems und den histopathologischen Beweis der Entzündung. Antikörper gegen Interferen-γ oder IL-10 besaßen keine Wirkung. Eine Behandlung mit Anti-MCP-1 unterdrückte auch den Einfluss von ⁽¹¹¹⁾Inmarkierten T-Zellen in das obere Sprunggelenk. Diese Daten deuten darauf hin, dass die späte, von Mononukleären abhängige Phase der SCW-induzierten Arthritis in weiblichen Lewis-Ratten Cytotoxine erfordert, welche MCP-1 hochregulieren, was wiederum eine Rekrutierung und Extravasation von mononukleären Zellen in das Gelenk erleichtern kann.
Oppenheimer-Marks et al. (1998) „Interleukin 15 is produced by endothelial cells und increases the transendothelial migration of T cells In vitro and the SCID mouse-human treumatoid arthritis model In vivo", J Clin Invest 101: 1261–72, untersucht die Kapazität von Endothelzellen (EC), IL-15 zu erzeugen, und die Kapazität von IL-15, die transendotheliale Migration von T-Zellen zu beeinflussen. Humane Endothelzellen der Umbilikalvene exprimieren IL-15-mRNA und Protein. Von Endothel stammendes IL-15 steigerte die transendotheliale Migration von T-Zellen, wie durch die Hemmung dieses Prozesses durch blockierende monoklonale Antikörper gegen IL-5 bewiesen wurde. IL-5 steigerte die transendotheliale Migration von T-Zellen durch Aktivieren der Bindungskapazität des Integrinadhäsionsmoleküls LFA-1 (CD11a/CD18) und steigerte auch die T-Zellbeweglichkeit. Außerdem induzierte IL-15 die Expression des frühen Aktivierungsmoleküls CD69. Die Bedeutung von IL-15 bei der Regulation der Migration von T-Zellen in vivo wurde durch seine Kapazität gezeigt, die Akkumulierung von adoptiv transferierten humanen T-Zellen in rheumatoidem Arthritis-Synovialgewebe zu steigern, das in immundefiziente SCID-Mäuse eingepflanzt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass EC IL-15 produzieren, welches eine kritische Rolle bei der Stimulation von T-Zellen beim Austreten in Entzündungsgewebe spielt.
Kasama et al. (1995) „Interleukin-10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II colllagen-induced arthritis", J Clin Invest 95: 2868–76, untersucht die Expression und den Beitrag spezifischer Chemokine, des Makrophagen-Entzündungsproteins-1α (MIP-1α) und des Makrophagenentzündungsproteins-2 (MIP-2) und Interleukin 10 (IL-10) während der Entwicklung der Collagen-induzierten Arthritis des Typs II (CIA). Nachweisbare Spiegel des chemotaktischen Zytokinproteins für MIP-1α und MIP-2 wurden zuerst zwischen Tag 32 und 36 beobachtet, nach einer anfänglichen Herausforderung mit Typ-II-Collagen, während Anstiege von IL-10 zwischen Tag 36 und 44 gefunden wurden. CIA-Mäuse, die mit Antikörpern entweder gegen MIP-1αoder MIP-2 passiv immunisiert wurden, zeigten eine Verzögerung des Beginns der Arthritis und eine Verringerung der Schwere der Arthritis. CIA-Mäuse, die neutralisierende Anti-IL-10-Antikörper erhielten, zeigten eine Beschleunigung des Beginns und einen Anstieg in der Schwere der Arthritis. Interessanterweise steigerte eine Behandlung mit Anti-IL-10 die Expression von MIP-1α und MIP-2, ebenso wie eine verstärkte Myeloperoxidase- (MPO-) Aktivität und Leukozyteninfiltration in die entzündeten Gelenke. Diese Daten zeigen, dass MIP-1α und MIP-2 eine Rolle bei der Einleitung und Aufrechterhaltung spielen, während IL-10 eine regulatorische Rolle während der Entwicklung der experimentellen Arthritis zu spielen scheint.
Keffer et al. (1991) „Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis", Embo J 10: 4025–31, stellt transgene Mäuselinien bereit, die Wildtyp- und 3'-modifizierte Transgene des humanen Tumornekrosefaktors (hTNF-α, Cachectin) tragen und exprimieren, zeigt, dass eine korrekte Endotoxin-responsive und Makrophagen-spezifische hTNF-Genexpression in transgenen Mäusen etabliert werden kann, und stellt Anhaltspunkte dar, dass die 3'-Region des hTNF-Gens in die Makrophagenspezifische Transkription verwickelt sein kann. Transgene Mäuse, welche die 3'-modifizierten hTNF-Transgene tragen, zeigen deregulierte Muster der Expression und entwickeln chronische inflammatorische Polyarthritis. Keffer et al. zeigen, dass transgene Mäuse, welche vorhersagbar eine Arthritis entwickeln, ein genetisches Modell darstellen, mit dem die Pathogenese und Behandlung dieser Erkrankung beim Menschen weiter untersucht werden kann.
Sakai et al. (1998) „Potential withdrawal of rheumatoid synovium by the induction of apoptosis using a novel in vivo model of rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum 41: 1251–7, untersucht, ob eine Fas-vermittelte Apoptose ein Potenzial als eine therapeutische Strategie bei der rheumatoiden Arthritis (RA) besitzt, unter Verwendung eines RA-Modells, in dem humanes RA-Gewebe in SCID-Mäuse eingepflanzt wird. Es wurde frisches rheumatoides Synovialgewebe einschließlich Gelenkknorpel subkutan in die Rücken von SCID-Mäusen eingepflanzt. 6 Wochen nach der Verpflanzung wurde intraperitoneal ein monoklonaler Anti-Fas-Antikörper injiziert. Die zeitbezogenen apoptotischen Veränderungen, verursacht durch den monoklonalen Anti-Fas-Antikörper im verpflanzten Synovium, wurden mittels Nick-End-Markierungshistochemie bewertet. 36 h nach der Injektion wurden diffuse apoptotische Veränderungen in dem verpflanzten Synovium beobachtet. 4 Wochen nach der Injektion ging das rheumatoide Synovialgewebe zurück.
Smith et al. (1999) „Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis", Arthritis Rheum 42: 545–54, beschreibt ein Hundemodell mit Osteoarthritis (OA). OA wurde in 20 adulten Mischlingshunden durch Durchtiennung des vorderen Kreuzbands am linken Knie induziert, und das Modell wurde verwendet, um Behandlungen für OA zu untersuchen.
Entzündliche Lungenerkrankungen
Kumagai et al. (1999) „inhibition of Matrix Metalloproteinases Prevents Alleigen-Induced Airway Inflammation in a Murine Model of Asthma", J Immunol 162: 4212–4219, untersucht die Rolle von MMPs bei der Pathogenese von Bronchialasthma, unter Verwendung eines Mausmodells mit allergischem Asthma. Unter Verwendung dieses Modells wird von einem Anstieg der Freisetzung von MMP-2 und MMP-9 in bronchoalveolaren Spülflüssigkeiten nach einer Ag-Inhalation in den mit OVA sensitivierten Mäusen berichtet, welcher begleitet war von der Infiltration von Lymphozyten und Eosinophilen. Eine Applikation des Gewebeinhibitors der Metalloproteinase-2 in die Luftwege hemmte die Ag-induzierte Infiltration von Lymphozyten und Eosinophilen in Luftwegswände und Lumen, verringerte die Ag-induzierte Luftwegs-Hyperresponsitivität und steigerte die Anzahl von Eosinophilen und Lymphozyten im peripheren Blut. Die Hemmung der zellulären Infiltration ins Luftwegslumen wurde auch mit dem Gewebeinhibitor der Metalloproteinase-1 und einem Inhibitor der synthetischen Matrixmetalloproteinase beobachtet. Die Daten zeigen, dass MMPs, inbesondere MMP-2 und MMP-9 für die Infiltration von Entzündungszellen und für die Induktion einer Luftwegs-Hyperresponsivität, welches pathophysiologische Merkmale von Bronchialasthma sind, entscheidend sind.
Griffiths-Johnson et al. (1997) „Animal models of asthma: rolee of chemokines", Methods Enzymol 288: 241–66, beschreibt, dass zahlreiche Chemokine entdeckt wurden durch die Verwendung von (1) einem Bioassay von in vitro-Zellkulturüberständen und in vivo-Ausscheidungen von Tiermodellen mit einer Entzündung und (2) Molekularbiologieverfahren. Jedes Chemokin kann oft durch eine Anzahl veischiedener Zelltypen hergestellt werden und übt seine Effekte auf verschiedene Zielzellen aus, und es gibt einen zwingenden Beweis von Tier- und klinischen Studien, dass Eosinophile wichtige Effektorzellen bei Asthma sind. Griffiths-Johnson et al. identifizieren zwei Ziele, um eine Eosinophilenrekrutierung der Lunge zu verhindern: IL-5 und seinen Rezeptor, welche im Hinblick auf mehrere Aspekte der Biologie von Eosinophilen wichtig sind, und Eotaxin und sein Rezeptor CCR3. Der Eotaxinrezeptor wird in hohen Zahlen auf Eosinophilen exprimiert, aber nicht auf anderen Leukozyten, und scheint der Hauptdetektor der Eosinophilen für Eotaxin und andere Chemokine, wie etwa MCP-4 zu sein. Sie zeigen, dass Eotaxin- und CCR3-Knockout-Mäuse entwickelt werden, und dass Tiermodelle weiterhin von unschätzbarem Wert sind.
Campbell et al. (1998) „Temporal rote of chemokines in a murine model of cockroach allergen-inducedd airway hyperreaktivity and eosinophilia", J Immunol 161: 7047–53, stellt ein Mausmodell bereit für eine durch Kakerlakenallergen induzierte Atemwegserkrankung und bewertet spezielle Mechanismen der Reaktion, welche atopischem humanem Asthma ähneln. Die allergischen Reaktionen in diesem Modell schließen eine Allergen-spezifische Luftwegseosinophilie und signifikant veränderte Luftwegsphysiologie ein, welche direkt mit der Entzündung korrelieren. Es werden spezielle Rollen für CC-Chemokine während dieser Stadien identifiziert, wobei MIP-1α ein wichtiger Eosinophilenlockstoffl während des primären Stadiums, und Eotaxin während des sekundären Stadiums der erneuten Herausforderung ist. Diese Modelle erlauben die Bewertung von Mediatoren, die in beide Stadien der Kakerlakenallergen-Herausforderung involviert sind ebenso wie die Untersuchung spezifischer therapeutischer Verfahrensweisen.
Piguet et al. (1989) Tumor necrosis factor/cachecin plays aa key rote in bleomycin-induced pneumopathy and fibrosis", J Exp Med 170: 655–63 und Schriet et al. (1983) „The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycininduced pulmonary fibrosis", Am Rev Respir Dis 127: 614–617, beschreiben ein Mausmodell einer Lungenfibrose.
Steinhauser et al. (1999) „IL-10 is a major mediator of sepsis-induced impaiment in lung antibacterial host defense", J Immunol 162: 392–399, beschreibt ein Mausmodell der Sepsis-induzierten Pseudomonas aeruginosa-Pneumonie, um den Mechanismus der Immunsuppression zu untersuchen, der mit Sepsis assoziiert ist. CD-1-Mäuse wurden entweder einer Ligation und einer Punktion mit einer Nadel mit 26-er Maß (CLP) oder einer vorgetäuschten Operation unterzogen, gefolgt von der intratrachealen (i.t.) Verabreichung von P. aeruginosa oder Salzlösung. Das Überleben der Mäuse, die eine CLP, 24 h später gefolgt von der i.t. Verabreichung von Saline oder P. aeruginosa durchliefen, betrug 58% bzw. 10%, wohingegen 95% der Tiere überlebten, die einer vorgetäuschten Operation unterzogen wurden, gefolgt von einer P. aeruginosa-Verabreichung. Die erhöhte Sterblichkeit in der Gruppe CLP/P. aeruginosa war der deutlich geschädigten Clearance der Lungenbakterien und der frühen Entwicklung der P. aeruginosa-Bakterämie zuzuschreiben. Die i.t.-Verabreichung von Bakterien an CLP-, nicht aber vorgetäuscht operierten Mäusen, ergab eine beeindruckende intrapulmonäre Ansammlung von Neutrophilen. Weiterhin ergab eine Herausforderung mit P. aeruginosa in septischen Mäusen eine relative Verschiebung in Richtung einer verstärkten Produktion von IL-10 in der Lunge, einhergehend mit einem Trend in Richtung verringertem IL-12. Die i.p., nicht aber die i.t. Verabreichung von IL-10-Antikörpern, gegeben unmittelbar vor der Herausforderung mit P. aeruginosa verbesserte bi septischen Mäusen sowohl das Überleben als auch die Clearance der Bakterien aus den Lungen der septischen Tiere, denen P. aeruginosa verabreicht wurde, signifikant. Schließlich zeigten alveolare Markophagen, isoliert von Tieren, die eine CLP durchlaufen, eine deutliche Schädigung in der Fähigkeit, P. aeruginosa ex vivo einzunehmen und zu töten, und dieser Defekt wurde teilweise umgekehrt durch die in vivo-Neutralisierung von IL-10. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass die septische Reaktion im Wesentlichen die natürliche Immunität der Lunge gegenüber P. aeruginosa schädigt, und diese Wirkung wird durch endogen produziertes IL-10 vermittelt.
Entzündung nach Gentherapie
Muruve et al. (1999) „Adenoviral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo" [Zitat in Vorbereitung], Hum Gene Ther 10: 965–76 untersucht die molekularen Mechanismen, durch die Replikations-defiziente Adenoviren eine akute Schädigung und Entzündung infizierter Gewebe induzieren, was deren Verwendung für eine Gentherapie beim Menschen beschränkt. Um diese Reaktion zu charakterisieren, wurde die Chemokinexpression in DBA/2-Mäusen nach der intravenösen Verabreichung verschiedener adenoviraler Vektoren evaluiert. Die intravenöse Verabreichung von adCMVβ-gal, adCMV-GFP oder FG 140 induzierte schnell ein übereinstimmendes Muster der C-X-C- und C-C-Chemokinexpression in der Mäuseleber in einer dosisabhängigen Art und Weise. 1 h nach der Infektion mit 10 (10) PFU von adCMVβ-gal waren die hepatischen Spiegel von MIP-2-mRNA > 60-fach über der Basislinie erhöht. MCP-1 und IP-10-mRNA-Spiegel waren auch sofort nach der Infektion mit verschiedenen adenoviralen Vektoren erhöht, mit einer Spitze bei 6 h mit > 25- bzw. > 100-facher Expression. Eine frühe Induktion von RANTES und MIP-1β-mRNA durch adenovirale Vektoren trat ebenso auf, aber in einem geringeren Ausmaß. Die Induktion der Chemokine trat unabhängig von der viralen Genexpresison auf, da Psoralen-inaktivierte adenovirale Partikel ein identisches Muster der Chemokingentranskription innerhalb der ersten 16 h nach Verabreichung erzeugten. Die Expression der Chemokine korrelierte wie erwartet mit dem Einstrom der Neutrophilen und CD11b+-Zellen in die Lebern der infizierten Tiere. Bei hohen Titern verursachten alle adenoviralen Vektoren eine signifikante hepatische Nekrose und Apoptose nach der systemischen Verabreichung an DBA/2-Mäuse. Um die Rolle der Neutrophilen bei dieser Adenovirus-induzierten Leberschädigung zu untersuchen, wurden die Tiere mit neutralisierenden Anti-MIP-2-Antikörpern vorbehandelt oder hinsichtlich der Neutrophilen abgereichert. MIP-2-Antagonismus und Neutrophilendepletion resultierten beide in verringerten Serum-ALT/AST-Spiegeln und einer Abschwächung der Adenovirus-induzierten Leberschädigung in histologischer Hinsicht, was bestätigt, dass diese frühe Schädigung größtenteils von der Chemokinproduktion und Neutrophilenrekrutierung herrührt. Die Ergebnisse stellen die frühe Immunreaktion gegen replikationseffiziente adenovirale Vektoren klar und schlagen eine Strategie vor, um eine Adenovirus-vermittelte Entzündung und Gewebeschädigung durch Störung der Chemokin- oder Neutrophilenfunktion zu verhindern.
Angiogenese, einschließlich ihrer Rolle bei Arthritis, anderen Entzündungserkrankungen und Tumorwachstum
Die Rekrutierung von Zellen, die in Angiogenese und Entzündung involviert sind, ist mit dem Tumorwachstum und der Tumorentwicklung assoziiert. Die folgenden Referenzen beschreiben diese Beziehungen und dass Fachleuten Tiermodelle bekannt sind zur Identifizierung von Therapien gegen Tumoren, Angiogenese und Inhibitoren gegen eine Entzündungsreaktion. Die verwendeten Konjugate und die angesteuerten Zellen sind in einigen dieser Untersuchungen verschieden von den Konjugaten und angesteuerten Zellen hierin. Diese Referenzen beweisen die Verfügbarkeit von Tiermodellen für die Untersuchung von Therapeutika zur Hemmung von Tumorwachstum und damit assoziierten Zellen.
Tumorwachstum
Phillips et al. (1994) „Transforming growth factor-α-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGF-α-PE38) treatment of subcutaneous and intracranial human glioma and medulloblastoma xenografts in athymic mice", Cancer Res 54: 1008–15, nutzt die differenzielle Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR), welcher in vielen malignen Gliomen oder anderen primären Hirntumoren amplifiziert oder überexprimiert wird, aber in normalem Gehirn gering oder nicht nachweisbar ist, für eine gezielte Gehirntumortherapie unter Verwendung eines rekombinanten TGF-α-Pseudomonas-Exotoxin-Toxins, TGF-α-PE38, unter Verwendung von Nacktmäusen, die subkutane Xenotransplantate von Glioblastom oder Medullablastom tragen. Das Xenotransplantatmodell sollte zur Untersuchung von Chemokinrezeptor-Ansteuerungskonjugaten zur Behandlung von Entzündungsreaktionen und zur Ansteuerung von Zellen, die in die Tumorentwicklung involviert sind, nützlich sein.
Debinski et al. (1994) „Interleuckin-4 receptors expressed on tumor cells may serve as a target for anticancer therapy using chimeric Pseudomonas exotoxin", Int J Cancer 58: 744–748, berichtet über die Verwendung chimärer Proteine, zusammengesetzt aus humanem IL-4 (hIL4) und zwei verschiedenen mutanten Formen eines wirksamen Bakterientoxins, Pseudomonas-Exotoxin A (PE) in einem humanen Xenotransplantatmodell mit einem festem Tumor. Die zwei Chimären Toxine, hIL4-PE4E und hIL4-PE38QQR genannt, zeigten spezifische hIL4R-abhängige und dosisabhängige Antitumorwirkungen.
Husain, S. R.; Behari, N.; Kreitman, R. J.; Pastan, I; Puri, R. K. 1998, "Complete Regression of established human glioblastoma tumor xenograft by interleukin-4 toxin therapy", Cancer Res 58: 3649–53, zeigt die Verwendung eines IL-4-Toxinkonjugats für eine gezielte Behandlung von Glioblastom-Seitentumoren in Nacktmäusen. Kreitman et al. (1998) „Accumulation of a recombinant immunotoxin in a tumor in vivo: fewer than 1000 molecules per cell aare sufficient for complete responses", Cancer Res 58: 968–975, zeigt auch eine Verwendung dieses Modells.
Angiogenese
Folkman et al. (1987) "Angiogenic factors" Science 235: 442–7, etabliert die Rolle der Angiogenese und von Faktoren, wie etwa dem sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, Angiogenin, und transformierenden Wachstumsfaktoren α und β und deren Bedeutung beim Verständnis der Wachstumsregulation des Gefäßsystems. Wenn sie nach deren mutmaßlichen Zielen bewertet werden, fallen die Faktoren in Gruppen: diejenigen, welche direkt an vaskulären Endothelzellen agieren, um die Fortbewegung oder Mitose zu stimulieren und diejenigen, welche indirekt durch Mobilisierung von Wirtszellen (zum Beispiel Makrophagen) agieren, um endotheliale Wachstums faktoren freizusetzen. Außer deren Gegenwart in Tumoren, welche eine Neovaskularisation unterlaufen, werden die gleichen angiogenen Peptide in vielen normalen Geweben gefunden, wo eine Neovaskularisation nicht auftritt. Dies deutet darauf hin, dass die physiologische Expression angiogener Faktoren eng reguliert ist. Außer der durch Tumoren induzierten anhaltenden Angiogenese scheint es nun, dass eine Vielzahl von nicht neoplastischen Erkrankungen, von denen zuvor gedacht wurde, dass sie nicht damit zusammenhängen, als "angiogene Erkrankungen" betrachtet werden können, weil sie durch ein pathologisches Wachstum von kapillaren Blutgefäßen beherrscht werden.
Leibovich et al. (1987) "Makrophage-induced angiogenesis is mediated by tumor necrosis factor-α", Nature 329: 630–632, beschreibt, dass Makrophagen bei der Induktion ' des Wachstums neuer Blutgefässe während der Wundheilung, Entzündung und dem Tumorwachstum wichtig sind, und untersucht dies durch Betrachtung der Bildung kapillarer Blutgefässe in der Hornhaut der Ratte und der Entwicklung der Choieoallantois-Membran bei Küken.
Koch et al. (1992) "Interleukin-8 as a makrophage-derived mediator of angiogenesis", Science 258: 1798–1801, beschreibt, dass angiogene Faktoren, die von Monozyten-Makrophagen erzeugt werden, in die Pathogenese von chronischen Entzündungserkrankungen, die durch eine persistierende Angiogenese charakterisiert sind, involviert sind. Die Rolle von interleukin-8 (IL-8), welches für Lymphozyten und Neutrophile chemotaktisch ist, erwies sich als deutlich angiogenetisch, wenn es in die Hornhaut der Ratte implantiert wurde, und induziert die Proliferation und Chemotaxis von humanen Endothelzellen der Umbilikalvene. Diese Daten zeigen eine Rolle des von Markophagen stammenden IL-8 bei Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, wie etwa rheumatoider Arthritis, Tumorwachstum und Wundheilung.
Humanes Immundefizienzvirus (HIV)
sWestmoreland et al. (1998) "Chemokine receptor expression on resident and inflammatory cells in the brain of macaques with simian immunodeficiency virus encephalitis", Am J Pathol 152: 659–665, beschreibt, dass ein Zusammenhang zwischen Monozyten/Makrophagen-Infiltraten im Gehirn und neurologischen Erkrankungen existiert, und dass Chemokine und Chemokinrezeptoren bei der Neuropathogenese von HIV eine Rolle spielen können und beschreibt deren Expressionsmuster im SIV-infizierten Rhesus-Makaken-Modell der HIV-Enzephalitis. Es wurde eine erhöhte Expression der Chemokine Makroehen-Entzündungsprotein- (MIP)-1α, MIP-1β, RANTES und des Interferon-induzierbaren Proteins (IP)-10 im Gehirn von Makaken-Affen mit SIV-Enzephalitis gezeigt, und in dieser Untersuchung wurde gezeigt, dass die entsprechenden Chemokinrezeptoren CCR3, CCR5, CXCR3 und CXCR4 in perivaskulären Infiltraten in diesen gleichen Geweben exprimiert werden. Außerdem werden CCR3, CCR5 und CXCR4 auf Subpopulationen von großen hippokampalen und neokortikalen Pyramidenzellen nachgewiesen, und auf Gliazellen sowohl im normalen als auch im enzephalitischen Gehirn. Diese Daten und Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Chemokine und deren Rezeptoren zur Rekrutierung von Monozyten und Lymphozyten im Gehirn bei SIV-Enzephalitis beitragen. Außerdem deutet die Expression von bekannten HIV/SIV-Corezeptoren auf Neuronen einen möglichen Mechanismus an, wobei HIV oder SIV direkt mit diesen Zellen wechselwirken können, deren normale physiologische Funktion stören können und zur Pathogenese des AIDS-Demenz-Komplex beitragen können.
Tyor et al. (1993) "A model of human immunodeficiency virus encephalitis in scid mice", Proc Natl Acad Sci USA 90: 8568–62, stellt ein Tiermodell eines HIV-assoziierten Demenzkomplex bereit, welcher bei der Entwicklung von Behandlungen hilfreich ist. Mäuse mit einer schweren kombinierten Immundefizienz (Scid-Mäuse), welche Xenotransplantate ohne Abstoßung akzeptieren, wurden intrazerebral mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen und HIV inokuliert. 1 bis 4 Wochen nach der Impfung enthielten die Gehirne dieser Mäuse, durch immunzytochemische Färbung, humane Makrophagen (wovon einige positiv waren bezüglich des HIVp24-Antigens), gelegentlich vielkernige Zellen und eine bemerkenswerte Gliose. Auch humane Makrophagen waren häufig im Hinblick auf den Tumornekrosefaktor Typ-α positiv und gelegentlich im Hinblick auf Interleukin 1 und VLA-4. Kulturen dieser Gehirne waren HIV-positiv. Im Allgemeinen waren humane Makrophagen in den Gehirnen der Kontrollmäuse nicht vorhanden, ebensowenig wie eine signifikante Gliose, und NIV wurde aus Mäusen, welche HIV nur intrazerebral erhielten, nicht wiedergewonnen. Pathologisch ähnelt dieses Modell der HIV-Enzephalitis bei Scid-Mäusen der HIV-Enzephalitis beim Menschen, und die Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von Makrophagen durch Infektion mit HIV in deren Anhäufung und Persistenz im Gehirn und in der Entwicklung einer Gliose resultiert. Dieses Modell einer HIV-Enzephalitis bietet Einblicke in die Pathogenese und Behandlung dieser Erkrankung.
Toggas et al. (1994) "Central nervous system damage produced by expression of the HIV-1 coat protein gp120 in transgenic mice", Nature 367: 188–193, stellt transgene Mäuse bereit, welche gp120 in deren Gehirnen exprimieren und verwendet diese Mäuse, um die Rolle von gp120 in den Neuronen und Glia zu untersuchen, welche beim Menschen beobachtet wird. Die in den Gehirnen der transgenen Mäuse beobachteten Veränderungen ähneln Anomalitäten in Gehirnen von HIV-1-infizierten Menschen. Die Schwere der Schädigung korrelierte positiv mit dem Expressionsniveau von gp120 im Gehirn. Diese Ergebnisse liefern einen in vivo-Hinweis, dass gp120 eine Hauptrolle bei der HIV-1-assoziierten Nervensystemschädigung spielt. Dies erleichtert die Bewertung und Entwicklung therapeutischer Strategien, die auf HIV-Gehirnwechselwirkungen abzielen.
Wykrzykowska et al. (1998) "Early regeneration of thymic progenitors in rhesus macaques infected with simian immunodeficiency virus", J Exp Med 187: 1767–1778, verwendet das SIV/Makaken-Modell mit AIDS, untersucht die frühen Wirkungen von SIV auf den Thymus.
Krucken et al. (1998) "Transgenic mice with cerebral expression of human immunodeficiency virus type-1 coat protein gp120 show divergent changes in short- and long-term potentiation in CA1 hippocampus", Neuroscience 83: 691–700, untersucht transgene Mäuse, die konstitutiv ein über ein saures Protein aus Gliafibrillen gesteuertes gp 120 aus Gehirnastrozyten, neuronale und gliale Veränderungen zeigen, welche Anomalitäten in menschlichen Gehirnen ähneln, die mit humanem Immundefizienzvirus Typ-1 infiziert sind.
Power et al. (1998) "Neurovirulence in feline immunodeficiency virusinfected neonatal cats is viral strain specific and dependent on systemic immune suppression", J Virol 72: 9109–15, stellt ein Tiermodell von HIV und seine Rolle bei der Immunsuppression bereit. Das Katzenimmundefizienzvirus (FIV) ist ein Lentivirus, welcher in Katzen eine Immunsuppression und neurologische Erkrankung verursacht. Um das Ausmaß zu bestimmen, in dem verschiedene FIV-Stämme eine neurologische Erkrankung verursachten, wurden FIV V 1 CSF und Petaluma in ex vivo-Assays und in vivo verglichen. Beide Viren infizierten Makrophagen und gemischte Gliazellkulturen und replizierten darin mit ähnlichen Niveaus, aber V1CSF induzierte in einem Neurotoxizitätsassay einen signifikant größeren neuronalen Tod als Petaluma. Mit V1 CSF infizierte Tiere zeigten eine signifikante Verzögerung in der Neuroentwicklung im Vergleich zu den mit Petaluma infizierten und nicht infizierten Tieren. Magnetresonanzspektroskopie-Untersuchungen des frontalen Kortex ergaben signifikant verminderte Verhältnisse von N-Acetylaspartat/Creatin in der V1CSF-Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen. Eine Behandlung mit Cyclosporin A der Petaluma-infizierten Tiere verursachte eine Verzögerung der Neuroentwicklung und verringerte Verhältnisse von N-Acetylaspartat/Creatin im Gehirn. Es wurden verringerte CD4(+)- und CD8(+)-Zellzahlen in der mit V1CSF infizierten Gruppe beobachtet, im Vergleich zu den nicht infizierten und mit den mit Petaluma infizierten Gruppen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Verzögerung der Neuroentwicklung und eine neuronale Schädigung FIV-stammspezifisch ist, aber dass eine systemische Immunsuppression auch ein wichtiger Faktor einer FIV-induzierten Neurovirulenz ist.
F. Formulierung und Verabreichung von Zusammensetzungen, welche die Konjugate enthalten
sZusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit pathophysiologischen Entzündungsreaktionen assoziiert sind, einschließlich eines sekundären Gewebeschadens, und damit verbundene Erkrankungszustände werden hierin bereitgestellt. Solche Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge eines Chimären Ligand-Toxins, umfassend ein Chemokin oder ein biologisch funktionelles Fragment davon und ein Zelltoxin, wie oben beschrieben.
Wirksame Konzentrationen von einem oder mehreren Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagenzien oder pharmazeutisch akzeptablen Derivaten davon werden mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger oder Vehikel für eine systemische, topische oder lokale Verabreichung gemischt. Verbindungen sind in einer Menge enthalten, die zur Behandlung der ausgewählten Erkrankung wirksam sind. Die Konzentration des Wirkstoffs in der Zusammensetzung wird von der Absorption, Inaktivierung, Ausscheidungsraten des Wirkstoffs, dem Dosierungsplan und der verabreichten Menge abhängen, ebenso wie von anderen Faktoren, welche Fachleuten bekannt sind.
Pharmazeutische Träger oder Vehikel, die für eine Verabreichung der Konjugate und für die hierin bereitgestellten Verfahren geeignet sind, schließen alle solche Träger ein, die Fachleuten als geeignet für die bestimmte Art der Verabreichung bekannt sind. Außerdem können die Verbindungen als der einzige pharmazeutisch aktive Bestandteil in der Zusammensetzung formuliert sein, oder sie können mit anderen wirksamen Bestandteilen kombiniert werden.
Die Menge des verabreichten therapeutischen Agens liegt im Bereich von etwa 0,1 pg bis etwa 1 ng pro kg Körpergewicht. Sie kann in einem Verabreichungsvehikel mit einer langsamen Freisetzung verabreicht werden, wie etwa, aber nicht beschränkt auf Mikrosphären, Liposomen, Mikropartikel, Nanopartikel und kolloidalem Kohlenstoff. Normalerweise sollte eine therapeutisch wirksame Dosis eine Serumkonzentration des Wirkstoffs von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 50–100 μg/ml erzeugen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sollten normalerweise eine Dosierung von etwa 0,01 mg bis 100–2000 mg des Konjugats bereitstellen, in Abhängigkeit von dem ausgewählten Konjugat, pro kg Körpergewicht pro Tag. Normalerweise sollte für eine intravenöse oder systemische Behandlung eines Tagesdosis von zwischen etwa 0,05 und 0,5 mg pro Körpergewicht ausreichend sein. Eine lokale Verabreichung sollte pro verabreichte Einzeldosis etwa 1 ng bis zu 100 μg bereitstellen, bevorzugt etwa 1 μg bis etwa 10 μg. Es ist verständlich, dass die zu verabreichende Menge das Resultat des ausgewählten Konjugats, der behandelten Indikation und möglicherweise der Nebenwirkungen sein wird, welche toleriert werden. Dosierungen können unter Verwendung anerkannter Modelle für jede Erkrankung empirisch bestimmt werden.
Der Wirkstoff kann auf einmal verabreicht werden oder kann in eine Anzahl von kleineren Dosen unterteilt werden, um in Zeitintervallen verabreicht zu werden. Es ist verständlich, dass die genaue Dosis und Behandlung der Dauer aus dem zu behandelnden Gewebe resultiert und empirisch bestimmt werden kann unter Verwendung bekannter Testprotokolle oder durch Extrapolation aus in vivo- oder in vitro-Testdaten. Es muss erwähnt werden, dass die Konzentrationen und Dosierungswerte auch mit dem Alter des behandelten Individuums variieren können. Es sollte weiterhin verstanden werden, dass für jedes bestimmte Objekt spezielle Dosierungspläne über die Zeit angepasst werden sollten, entsprechend des individuellen Bedarfs und der professionellen Beurteilung der Person, welche die Verabreichung der Zusammensetzungen verabreicht oder überwacht, und dass die Konzentrationsbereiche, die hierin angeführt sind, lediglich beispielhaft sind und nicht den Umfang oder die Praxis der beanspruchten Zusammensetzungen beschränken sollen.
Die Verbindung kann in mikrovisierter oder in einer anderen geeigneten Form suspendiert werden oder kann derivatisiert werden, um ein löslicheres aktives Produkt zu erzeugen oder um eine Prodrug zu erzeugen. Die Form des resultierenden Gemischs hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, einschließlich der beabsichtigten Verabreichungsart und der Löslichkeit der Verbindung in dem ausgewählten Träger oder Vehikel. Die wirksame Konzentration ist ausreichend zur Verbesserung der angestrebten Bedingung und kann empirisch bestimmt werden. Um eine Zusammensetzung zu formulieren, wird die Gewichtsfraktion der Verbindung gelöst, suspendiert, dispergiert oder auf eine andere Art und Weise in einem ausgewählten Vehikel mit einer wirksamen Konzentration gemischt, so dass die angestrebte Bedingung gelindert oder verbessert wird.
Für eine lokale innerliche Verabreichung, wie etwa eine intramuskuläre, parenterale oder intraartikuläre Verabreichung, werden die Verbindungen bevorzugt als eine Lösungssuspension in einem auf Wasser basierenden Medium formuliert, wie etwa einer isotonisch gepufferten Salzlösung, oder werden mit einem biokompatiblen Träger oder einem biologischen Klebemittel, welches für eine innere Verabreichung beabsichtigt ist, kombiniert.
Die resultierenden Gemische können Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder dergleichen sein und können als wäßrige Gemische, Cremes, Gele, Salben, Emulsionen, Lösungen, Elixiere, Lotionen, Suspensionen, Tinkturen, Pasten, Schäume, Aerosole, Spülungen, Sprays, Suppositorien, Bandagen oder jede andere Formulierung formuliert sein, weiche für eine systemische, topische oder lokale Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische und kosmetische Träger oder Vehikel, die für eine Verabreichung der hierin bereitgestellten Verbindungen geeignet sind, schließen alle solchen Träger ein, die Fachleuten für die bestimmte Art der Verabreichung als geeignet bekannt sind. Außerdem können die Verbindungen als der einzige pharmazeutische Wirkstoff in der Zusammensetzung formuliert sein oder können mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden. Der aktive Bestandteil ist im Träger in einer Menge enthalten, die ausreichend ist, um eine therapeutisch nützliche Wirkung in Abwesenheit von ernsten toxischen Wirkungen auf das behandelte Individuum auszuüben. Die wirksame Konzentration kann empirisch bestimmt werden durch Untersuchung der Verbindungen unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Systemen, einschließlich der hierin beschriebenen Tiermodelle.
Für eine lokale Anwendung verwendete Lösungen oder Suspensionen können alle der folgenden Bestandteile enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel wie etwa Wasser für eine Injektion, Salzlösung, gehärtetes Öl, Polyethylenglykol, Glycerin, Propylenglykol oder ein anderes synthetisches Lösungsmittel; antimikrobielle Agenzien wie etwa Benzylalkohol und Methylparabene; Antioxidanzien wie etwa Ascorbinsäure und Natriumbisulfit, Komplexbildner wie etwa Ethylendiamintetraacetat [EDTA]; Puffer wie etwa Acetate, Citrate und Phosphate und Agenzien für die Einstellung des Tonus wie etwa Natriumchlorid oder Dextrose. Flüssige Präparationen können in Ampullen, Einwegspritzen oder Vials für Mehrfachdosen aus Glas, Plastik oder einem anderen geeigneten Material enthalten sein. Geeignete Träger können physiologische Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS] einschließen, und die Suspensionen und Lösungen können Verdickungsmittel und Solubilisierungsmittel wie etwa Glukose, Polyethylenglykol und Poly propylenglykol und Gemische daraus enthalten. Liposomale Suspensionen können auch als pharmazeutisch akzeptable Träger geeignet sein. Diese können hergestellt werden gemäß der Verfahren, welche Fachleuten bekannt sind.
Die therapeutischen Agenzien und Zusammensetzungen können durch jede dem Fachmann bekannte Art und Weise verabreicht werden, wie etwa, aber nicht beschränkt auf eine topische, intraartikuläre, intrazisternale, intraokular, intraventrikuläre, intrathekale, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale, intratracheale Verabreichung, ebenso wie jede Kombination von beliebigen zwei oder mehreren davon.
Die am meisten geeignete Art und Weise der Verabreichung wird abhängig sein von dem zu behandelnden Erkrankungszustand, zum Beispiel dem Ort der Entzündungsbedingung. Verabreichungsarten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ein topische, lokale, intraartikuläre, intrazisternale, intraokulare, intraventrikuläre, intrathekale, intravenöse, intramuskuläre, intratracheale, intraperitoneale, intradermale Verabreichung und eine Kombination von beliebigen zwei oder mehreren davon. Für eine Behandlung von SCI und anderen ZNS-Entzündungsbedingungen stellt beispielsweise eine lokale Verabreichung, einschließlich einer Verabreichung in die ZNS-Flüssigkeit oder in das Gehirn (zum Beispiel intrathekal, intraventrikulär oder intrazisternal) den Vorteil bereit, dass das therapeutische Agens mit einer hohen Konzentration verabreicht werden kann ohne das Risiko von Komplikationen, welche eine systemische Verabreichung eines therapeutischen Agens begleiten können. Für die Behandlung von entzündlichen Gelenkerkrankungen kann in ähnlicher Weise eine lokale Verabreichung durch Injektion des therapeutischen Agens in das entzündete Gelenk (zum Beispiel intraartikulär) bevorzugt sein. Als ein anderes Beispiel kann ein Erkrankungszustand, assoziiert mit einer entzündlichen Hautbedingung, vorteilhafterweise durch topische Verabreichung des therapeutischen Agens behandelt werden, zum Beispiel formuliert als eine Creme, ein Gel oder eine Salbe. Zur Behandlung eines Erkrankungszustands, assoziiert mit einer entzündlichen Lungenbedingung, kann die bevorzugte Art der Verabreichung des therapeutischen Agens die Inhalation in einem Aerosol oder intratracheal sein.
Das therapeutische Agens wird in einer wirksamen Menge verabreicht. Wirksame Mengen für eine therapeutische Verwendung werden natürlich von der Schwere der Erkrankung und dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Objekts ebenso wie von der Art und Weise der Verabreichung abhängen. Eine lokale Verabreichung eines therapeutischen Agens wird normalerweise eine kleinere Dosis erfordern als jede Art der systemischen Verabreichung, obwohl die lokale Konzentration des therapeutischen Agens in manchen Fällen nach einer lokalen Verabreichung höher ist als sie mit Sicherheit durch eine systemische Verabreichung erreicht werden kann.
Da einzelne Objekte in einer breiten Variation der Schwere der Symptome vorhanden sein können, und da jedes therapeutische Agens seine einzigartigen therapeutischen Charakteristika besitzt, liegt es am Praktizierenden, die Reaktion eines Objekts auf die Behandlung zu bestimmen und die Dosierungen entsprechen zu variieren. In vitro verwendete Dosierungen können eine nützliche Anleitung bereitstellen im Hinblick auf die Mengen, die für eine in situ-Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendbar sind, und Tiermodelle können in manchen Fällen verwendet werden, um wirksame Dosierungen für eine Behandlung bestimmter Erkrankungen zu bestimmen. Aber im Allgemeinen wird bei einer lokalen Verabreichung in Erwägung gezogen, dass eine wirksame Menge des therapeutischen Agens eine Menge im Bereich von etwa 0,1 Pikogramm (pg) bis hin zu 1 ng/kg Körpergewicht ist. Verschiedene Betrachtungen beim Erreichen einer wirksamen Menge werden zum Beispiel in et al., Editoren, "Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", B. Ausgabe, Pergamon Press 1990 und in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17.Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, Pa, 1990 und in den Untersuchungen von Mantyh et al., (Science, 278: 275–79, 1997) beschrieben, welche eine intrathekale Injektion eines neuronenspezifischen Ligand-Toxins einschließen.
Die Konjugate können durch jede geeignete Route verabreicht werden, zum Beispiel oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch, in flüssiger, halbflüssiger oder fester Form, und werden in einer Art und Weise formuliert, welche für jede Verabreichungsart geeignet ist. Bevorzugte Arten der Verabreichung hängen von der zu behandelnden Indikation ab. Dermatologische und ophthalmologische Indikationen werden normalerweise lokal behandelt wohingegen Tumoren und SCI und andere solche Erkrankungen normalerweise mittels systemischen, intradermalen oder intramuskulären Arten der Verabreichung behandelt werden.
In einer Ausführungsform der Zusammensetzungen und deren hierin bereitgestellten Verwendungen wird das therapeutische Agens lokal in einem Verabreichungsvehikel mit langsamer Freisetzung verabreicht, zum Beispiel eingekapselt in ein kolloidales Dispersionssystem oder in polymerstabilisierte Kristalle. Nützliche kolloidale Dispersionssysteme schließen Nanokapseln, Mikrosphären, Beads und auf Lipiden basierende Systeme ein, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposomen. Das gegenwärtig bevorzugte kolloidale System ist ein Liposom oder Mikrosphäre. Liposomen sind artifizielle Membranvesikel, welche als Verabreichungsvehikel mit langsamer Freisetzung verwendbar sind, wenn sie injiziert oder implantiert werden. Einige Beispiele von Lipid-Polymerkonjugaten und Liposomen werden im US-Patent Nr. 5,631,018 offenbart. Andere Beispiele für Verabreichungsvehikel mit langsamer Freisetzung sind bioabbaubare Hydrogelmatrizen (US-Patent Nr. 5,041,292), dendritische Polymerkonjugate (US-Patent Nr. 5,714,166) und multivesikuläre Liposomen (Depofoam^®, Depotech, San Diego, CA) (US-Patente Nr. 5,723,147 und 5,766,6271. Eine Art von Mikrosphären, welche für die Einkapselung therapeutischer Agenzien für eine lokale Injektion (zum Beispiel in subdermales Gewebe) geeignet sind, sind Poly(D,L)lactidmikrosphären, welche von D.Fletcher in Anesth. Analg. 84: 90-94, 1997 beschrieben sind.
Neben der Lieferung einer wirksamen therapeutischen Dosis an die Stelle des Traumas und der Verringerung der Möglichkeit der systemischen Toxizität verringert eine lokale Verabreichung auch die Exposition des therapeutischen Agens für Abbauprozesse, wie etwa einem proteolytischer Abbau und einer immunologischen Intervention über antigene und immunogene Reaktionen. Auch eine Derivatisierung des Arzneimittels mit beispielsweise Monomethoxypoly(ethylenglykol) kann die Wahrscheinlichkeit der oben erwähnten Nachteile verringern. Es ist berichtet worden, dass eine Pegylierung von Therapeutika die Resistenz gegenüber einer Proteolyse steigert, die Halbwertszeit im Plasma erhöht und die Antigenität und Immunogenität verringert. Ein Verfahren zur Anheftung von PEG-Polymeren (im Größenbereich von etwa 2000–8000 Da) wird im Beispiel 5 hierin veranschaulicht. Andere Beispiele für Pegylierungsmethodiken werden von Lu und Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu und Felix, Peptide Res., 6: 142–6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253–64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088–95, 1995 gegeben.
Die hierin bereitgestellte Zusammensetzung enthält weiterhin ein oder mehrere Adjuvanzien, welche die Lieferung erleichtern, wie etwa, aber nicht beschränkt auf inerte Träger oder kolloidale Dispersionssysteme. Repräsentative und nicht beschränkende Beispiele solcher inerter Träger können ausgewählt werden aus Wasser, Isopropylalkohol, gasförmigen Fluorkohlenstoffen, Ethylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Propylenglykol, einem gelerzeugenden Material, Stearylalkohol, Stearinsäure, Spermacet, Sorbitanmonooleat, Methylcellulose, ebenso wie geeignete Kombinationen von zwei oder mehreren davon.
Eine hierin bereitgestellte Zusammensetzung kann auch als eine sterile injizierbare Suspension gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, unter Verwendung geeigneter dispergierender oder benetzender Agenzien und suspendierender Agenzien. Die sterile injizierbare Präparation kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral akzeptablen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, zum Beispiel als eine Lösung in 1,4-Butandiol. Sterile gehärtete Öle werden konventionell als ein Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes milde gehärtete Öl verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf synthetische Mono- oder Diglyceride, Fettsäuren (einschließlich Ölsäure), natürlich vorkommende pflanzliche Öle wie Sesamöl, Kokosnussöl, Erdnussöl, Baumwollsamenöl usw., oder synthetische Fettvehikel wie Ethyloleat. Puffer, Konservierungsstoffe, Antioxidantien und die geeigneten Bestandteile können wie erfordert eingebracht werden oder alternativ die Formulierung umfassen.
Orale Zusammensetzungen werden im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen genusstauglichen Träger einschließen und können in Tabletten komprimiert oder in Gelatinekapseln eingeschlossen sein. Für den Zweck einer oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung oder die Verbindungen mit Arzneimittelträgern inkorporiert sein und in Form von Tabletten, Kapseln oder Pastillen verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible bindende Agenzien und adjuvante Materialien können als ein Teil der Zusammensetzung enthalten sein.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jeden der folgenden Bestandteile, oder Verbindungen mit einer ähnlichen Beschaffenheit enthalten: ein Bindemittel, wie etwa mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi und Gelatine; einen Arzneimittelträger wie etwa Stärke und Lactose, ein Aufschlussmittel wie etwa, nicht aber beschränkt auf Alginsäure und Maisstärke; ein Schmiermittel wie etwa, aber nicht beschränkt auf Magnesiumstearat; ein Gleitmittel wie etwa, aber nicht beschränkt auf kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel wie etwa Saccharose oder Saccharin und ein Aromastoff wie etwa Pfefferminze, Methylsalicylat und Fruchtaroma.
Wenn die Einheitsdosierungsform eine Kapsel ist, kann sie außer dem Material der oben genannten Art einen flüssigen Träger wie etwa ein fettes Öl enthalten. Außerdem können Einheitsdosierungsformen verschiedene andere Materialien enthalten, welche die physikalische Form der Einheitsdosierung modifizieren, zum Beispiel Beschichtungen von Zucker oder anderen enteralen Agenzien. Die Konjugate können auch als ein Bestandteil eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Waffel, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann außer den aktiven Verbindungen Saccharose als ein Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsmittel, Farbstoffe und Färbungsmittel und Aromen enthalten.
Die aktiven Materialien können auch mit anderen aktiven Materialien gemischt werden, welche die gewünschte Wirkung nicht stören, oder mit Materialien, welche die gewünschte Wirkung ergänzen, wie etwa Cis-Platin für die Behandlung von Tumoren.
Schließlich können die Verbindungen verpackt sein als Fabrikationsartikel, enthaltend Verpackungsmaterial, innerhalb des Verpackungsmaterials ein oder mehrere Konjugate oder Zusammensetzungen, wie hierin bereitgestellt, und einem Etikett, welches die Indikation anzeigt, für welche das Konjugat bereitgestellt ist.
G. Erkrankungszustände, die mit der Entzündungsreaktion und einem Sekundärgewebeschaden assoziiert sind
SCI und eine Anzahl von anderen Erkrankungszuständen sind mit der Proliferation, Aktivierung und Migration verschiedener Leukozytentypen assoziiert. Diese Ereignisse verbinden sich unter Bildung einer sehr aggressiven und unwirtlichen Umgebung an der Stellung der Verletzung oder Erkrankung. Gegenwärtige Ansätze der Behandlung tendieren ungeachtet ihres Erfolges dazu, sich um einzelne Bestandteile des proentzündlichen Prozesses zu konzentrieren. Zum Beispiel haben sich viele Wissenschaftler auf die Transplantation von Neuronen oder ZNS-Gewebe in das verletzte Nervensystem konzentriert, in der Hoffnung, das Überleben und die Regeneration entweder der transplantierten Zellen oder der existierenden Zellen, welche wachstums- und neurotrophe Faktoren produzieren, zu fördern. Andere Ansätze haben versucht, sich durch ionotrope Kanalantagonismen an den sekundären Schaden zu wenden, durch Hemmen der cytotoxischen Wirkungen der exzitatorischen Aminosäuren unter Verwendung von NMDA-Antagonisten, und durch Hemmen der Lipidperoxidation unter Verwendung von Antioxidantien, zum Beispiel mit dem Steroid Methylprednisolon. Alle diese Ansätze haben einen geringen oder keinen Langzeitnutzen gezeigt. Kurz gesagt, die Konzentration auf einzelne biochemische Mechanismen scheitert daran, die Kapazität der Traumareaktion (oder des Erkrankungsprozesses) als ein Ganzes zu würdigen, um ausgleichende Veränderungen durchzuführen, welche entweder die Wirkung der therapeutischen Intervention zunichte machen oder in manchen Fällen tatsächlich die Dinge verschlimmern.
Es ist hierin gefunden worden, dass eine Behandlung wirksamer ist, wenn die normale Entzündungsreaktion nicht in die Wege geleitet wird, und dass die Wahrscheinlichkeit für eine Verbesserung und Wiedergewinnung signifikant beeinträchtigt wird, umso länger dieser Prozess weitergehen kann. Die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen sind so gestaltet, dass sie die Aktivität von entscheidenden Leukozyten-Subtypen (und/oder Astrozyten) transient hemmen oder unterdrücken, und die wesentlichen Quellen entfernen, welche Entzündungsmechanismen und sekundäre Schäden schüren.
Die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen erlauben die selektive, bewusste und heimliche Lieferung eines therapeutischen Agens an Zellen, welche die Reaktion auf eine Verletzung oder Erkrankung organisieren. Um einen Erkrankungsprozess (zum Beispiel Krebs) oder eine Entzündungsreaktion in die Wege zu leiten und zu erhalten, werden die involvierten Zellen aktiviert und deren Expression von Zelloberflächenrezeptoren für eine Vielzahl von Liganden hochreguliert. Weil in ein Trauma und eine Erkrankung involvierte Rezeptoren oft hochreguliert sind, wird die Wahrscheinlichkeit, dass das therapeutische Agens von den richtigen Zellen internalisiert wird, erhöht.
Es ist hierin gefunden worden, dass die Zellbiologie von mehr als 70 Erkrankungen und Bedingungen, welche die meisten Organsysteme betreffen, pathophysiologische Entzündungsreaktionen in einer Art und Weise, die mit der Zellbiologie einer akuten SCI ähnlich ist, betreffen. Die folgende, nicht erschöpfende Liste und die ausführlichere Behandlung von vier klinischen Gebieten sind gestaltet, um einige der wichtigeren Ähnlichkeiten zu veranschaulichen. Beispielhafte Erkrankungen und Bedingungen außer einer Rückenmarksverletzung, schließen Schlaganfall, eine akute Lungenverletzung und das akute Atemnotsyndrom (ARDS), die Alzheimer-Krankheit, das Down Syndrom, eine entzündliche Gelenkerkrankung, HIV-Enzephalitis, Wachstum, Neovaskularisierung (Angiogenese) und Metastasen von mehreren Formen von Krebs, einschließlich Gehirn-, Brust- und Lungenkrebsarten, multiple Sklerose, spongiforme Enzephalopathien, Sepsis, Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, proliferative Vitreoretinopathie und Uveitis ein.
HIV-Infektion und AIDS und Infektionen mit anderen Pathogenen
Die Aktivierung und Infektion von ZNS-Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen ist ein Kennzeichen der Pathogenese von HIV-induzierten Erkrankungen. Das humane Immundefizienzvirus (HIV) kann nur in eine Zelle gelangen, wenn der CD4-Rezeptor mit einem spezifischen Chemokin-Corezeptor assoziiert ist. CXCR4, CCR2b, CCR3, CCR5, CCR6, CCR8 und CX3CR1 können alle mit der Fähigkeit eines Corezeptors agieren. Zum Beispiel verwendet der Makrophagen-tropische HIV-1-Stamm im Allgemeinen CCR5-Corezeptoren, während T-Zell-tropische Stämme im Allgemeinen CXCR4 verwenden. Außerdem können zweifach tropische Viren CXCR4- und CCR5-Corezeptoren zum Eintritt verwenden, während andere Untergruppen der HIV-Virusstämme eine Vielzahl von anderen Chemokin-Corezeptoren vewenden.
In Patienten mit HIV-Enzephalitis (HIVE) wird CXCR4 auf MNPs, Astrozyten und einer Unterpopulation von cholinergen Neuronen exprimiert, wohingegen CCR5 hauptsächlich auf MNPs exprimiert wird. Es sollte angemerkt werden, dass die Mehrzahl der infizierten Zellen in HIVE-Patienten (Kinder und Erwachsene) MNPs zu sein scheinen und dass eine erhöhte Expression von CCR5 mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren scheint. Dies deutet darauf hin, dass MNP-vermittelte Ereignisse wichtiger sein können, zumindest in den letzten und heftigen Stadien von HIVE. Der CCR5-Rezeptor ist auch nach einer bakteriellen Infektion des ZNS und in einem Rattenmodell mit ischämischer Gehirnverletzung hochreguliert.
Eine erhöhte Produktion von Zytokinen (zum Beispiel TNF-α) und Chemokinen (zum Beispiel RANTES, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β) wird mit einer HIV-Infektion assoziiert. Erhöhte ZNS-Chemokine bei HIV würden die periphere Leukozytenrekrutierung und Zytokinfreisetzung mit direkten cytotoxischen Wirkungen (zumindest im Fall von von TNF-α) auf Neuronen und Oligodendrozyten erklären, was präzise die Erfahrung bei ZNS-Trauma wiederspiegelt. Mehrere Zytokine, einschließlich GM-CSF, Makrophagen-CSF, IL-1β, 1L2, IL-3, IL-6, TNFα und TNF-β können auch zur Pathogenese der HIV-Erkrankung beitragen durch Aktivierung und/oder Verstärkung der HIV-Replikation.
Bei HIV-1-positiven asymptomatischen Prä-AIDS-Patienten tritt ein sekundärer Schaden auf (An et al. (1997) Arch Anat Cytol Pathol 45, 94-105). Diese Wissenschaftler konnten HIV-1-DNA in 50% der Gehirne von asymptomatischen Patienten nachweisen, und nahezu 90% zeigten eine Astrogliose. Diese Patienten haben auch erhöhte Spiegel von Immunmolekülen und Zytokinen einschließlich TNF-α, IL-1, IL-4 und IL-6. Ein Nervenschaden wurde durch den Nachweis von apoptotischen Neuronen bestätigt.
Eine direkte Neurotoxizität und Hochregulierung der CCR5-Corezeptors durch MNP-abgeleitete exzitatorische Aminosäuren ist auch mit der Pathologie einer HIV-Infektion in Verbindung gebracht worden. Eine Erhöhung der induzierbaren Stickoxidsynthaseaktivität ist in HIV-infizierten Mikroglia aus AIDS-Patienten nachgewiesen worden. Dies deutet darauf hin, dass die Produktion von Stickoxid zur Bildung der Schädigung in HIV-infizierten Bereichen des Nervensystems beitragen könnte. Erneut scheint die Pathologie von HIV-Enzephalopathien und prä- und vollständig ausgeprägtem AIDS, welches das ZNS betrifft, den Sekundärgewebeschaden nachzuahmen, der bei SCI und anderen Entzündungserkrankungen beobachtet wird.
Es ist auch gefunden worden, dass einige Chemokine und Chemokinrezeptoren auch promikrobielle Faktoren sind und Infektionskrankheiten ermöglichen (siehe Pease et al. (1998) Seminar in Immunol 10: 169–178). Pathogene machen sich das Chemokinsystem zunutze. Zum Beispiel werden zelluläre Chemokinrezeptoren von intrazellulären Pathogenen, einschließlich HIV für einen Eintritt in die Zelle benutzt. Außerdem verwenden Viren viral codierte Chemokinrezeptoren, um die Wirtszellproliferation zu fördern. Pathogene unterminieren auch das Chemokinsystem. Es sind viral codierte Chemokinantagonisten und viral codierte Chemokinradikalfänger bekannt. Somit können hierin bereitgestellte Konjugate verwendet werden, um eine virale und bakterielle Infektion durch eine Vielzahl von Mechanismen zu stören.
Entzündliche Gelenkerkrankung und Autoimmunerkrankung
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine entzündliche Autoimmunerkrankung, gekennzeichnet durch einen chronischen Bindegewebsschaden und Knochenverschleiß. Die Pathogenese der Erkrankung schließt die Infiltration von Leukozyten in den Synovialraum, deren Aktivierung und Freisetzung von Entzündungsmediatoren ein, welche das betroffene Gelenk schließlich deformieren und zerstören. Die eigentliche arthritische Reaktion scheint in Gang gesetzt zu werden, wenn MNPs proinflammatorische Zytokine und Chemokine freisetzen. TNF-α, IL-1, IL-6, GM-CSF und das Chemokin IL-8 werden im Gelenkgewebe von RA-Patienten in Hülle und Fülle gefunden, und deren wahrscheinlichste Quelle schließt außer MNPs Synovialfibroblasten ein. Die Kombination von MNPs, Neutrophilen und T-Zellen, unter Beteiligung von Synovialfibroblasten und Synoviozyten setzt eine Entzündungskaskade in Gang.
Es wird angenommen, dass IL-1 und TNF-α für die Produktion von Chemokinen im arthritischen Gelenk verantwortlich sind. In einer Untersuchung induzierten erhöhte Konzentrationen dieser zwei Zytokine die Expression von IL-8 (einem wirksamen chemotaktischen Faktor für T-Zellen) und RANTES (einem wirksamen chemotaktischen Faktor für neutrophile) in humanen Synovialfibroblasten, isoliert aus RA-Patienten (Rathanaswami et al. (1993) J Biol Chem 268, 5834–91. Andere Wissenschaftler haben gezeigt, dass entzündetes Synovialgewebe aus Patienten mit RA und Osteoarthritis hohe Konzentrationen an MCP-1 enthält und dass TNF-α und IL-1 die mRNA-Expression dieses Chemokins in kultivierten Synoviozyten, die von diesen Proben stammen, deutlich erhöht hat. Es scheint, dass Chemokine von MNPs und Zytokin die Synovialfibroblasten stimuliert haben und dass Synoviozyten eine Rolle in der Pathologie von RA spielen, durch Erleichterung der Rekrutierung und Extravasation von peripheren Monozyten, Neutrophilen und T-Zellen. Gemeinsam mit anderen Erkrankungen und Bedingungen setzen aktivierte Leukozyten eine große Auswahl an anderen gewebeschädigenden Mediatoren frei. Insbesondere sind von Leukozyten stammende reaktive Sauerstoffspezies und proteolytische Enzyme (zum Beispiel Matrixmetalloproteinasen, Kathepsin und von Neutrophilen stammende Elastase) mit der Einleitung und Beibehaltung eines Gewebeschadens bei entzündlichen Gelenkerkrankungen in Verbindung gebracht worden.
Lungenerkrankung
Eine Lungenverletzung deckt einen breiten Bereich klinischer Bedingungen ab. Für die Zwecke hierin werden sie alle zusammen als entzündliche Erkrankungen der Lunge (ILD, „Inflammatory Diseases of the Lung") bezeichnet. Eine ILD ist normalerweise das Ergebnis einer speziellen Verletzung, zum Beispiel durch systemische bakterielle Infektionen (zum Beispiel Sepsis), eines Traumas (zum Beispiel Ischämie-Reperfusionsverletzung) und der Inhalation von Antigenen (zum Beispiel Toxine wie etwa Zigarettenrauch). ILDs schließen auch allergische Alveolitis, ARDS (akutes oder adultes Atemnotsyndrom), verschiedene Formen von Asthma, Bronchitis, Collagengefäßerkrankung, Lungensarkoidose, eosinophile Lungenerkrankungen, Lungenentzündung und Lungenfibrose ein. Kurz gesagt, die Pathologie dieser Erkrankungen und Bedingungen involviert die Aktivierung von Makrophagen, insbesondere derjenigen, welche in den Alveolen lokalisiert sind. Neutrophile, Eosinophile und T-Zellen werden aktiviert und an die Stelle der Verletzung rekrutiert, nach der Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen, die von Makrophagen und benachbarten Endothel- und Epithelzell stammen. Die speziellen involvierten Zytokine und Chemokine schließen ein: GM-CSF, TNF-α, IL-1, IL-3, IL-5, IL-8, MCP-1, MCP-3, MIP-1α, RANTES und Eotaxin.
Leukozyten reagieren auf die proinflammatorischen Zytokine und Chemokine durch Freisetzung von vielen Mediatoren eines Sekundärgewebeschadens einschließlich Proteasen, reaktiven Sauerstoffspezies und biologisch aktiven Lipiden, und durch Expression von Zelloberflächenantigenen und Zelladhäsionsmolekülen. Außerdem scheint es, dass spezifische Leukozytenpopulationen eine herausragendere Rolle in einigen ILDs spielen, als sie es in anderen tun. Neutrophile und MNPs sind herausragendere Mitwirkende eines Sekundärschadens bei akuten Lungenverletzungen wie ARDS und verschiedene Lungenfibrosen; wohingegen T-Zellen und Eosinophile Hauptverursacher bei eosinophilen Lungenerkrankungen sind, welche allergisches Asthma, fibrosierende Alveolitis und Sarkoidose einschließen.
Krebs
Es ist gezeigt worden, dass von Tumorzellen und MNP erzeugte Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine die Tumorangiogenese und Leukozytenrekrutierung in der Mikroumgebung des Tumors regulieren. Obwohl Leukozyten eine tumorizide Funktion besitzen, resultiert eine Leukozyteninfiltration und eine Überproduktion von angiogenen Faktoren in einer Neovaskularisierung, welche die Tumorzellen nährt und die Tumorprogression begünstigt. Eine quantitative Untersuchung von Leukozyteninfiltraten ergab zum Beispiel, dass MNPs bis zu 50% der Zellmasse in Brustkarzinomen ausmachen. Eine neuere Studie schlussfolgerte, dass eine MCP-1-Überexpression für die Leukozyteninfiltration und die hohen Zahlen an Makrophagen und T-Zellen, welche mit Eierstocktumoren assoziiert sind, verantwortlich sind. In der Tat ist eine Überexpression von anderen Chemokinen und Zytokinen in anderen Krebsarten, einschließlich Lymphomen und Gliomen, beobachtet worden. Eine erhöhte Neutrophilenzahl ist mit broncheoalveolarem Karzinom in Zusammenhaang gebracht worden und korreliert mit der erhöhten Konzentration von IL-8, einem starken chemotaktischen Faktor für Neutrophile, in Lungenbiopsien und bronchoalveolaren Waschproben.
Eine Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmolekülen und Proteinasen als Reaktion auf eine Zytokin- und Chemokinaktivierung sind ein wesentlicher Teil der Tumormetastasierung. Proteasen von Leukozyten und Epithelzellen durchbrechen die extrazellulären Matrizes und sind in die Verbreitung von Zellen aus Primärtumoren involviert. Zum Beispiel ist die Elastase von Neutrophilen mit der direkten Invasion von Zellen aus nicht kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC, „non-samll cell lung cancer") in die Aorta verbunden. Weiterhin tragen Tumorzellen durch Produktion ihrer eigenen Proteasen zum metastatischen Prozess bei. Eine Expression eines Zelladhäsionsmoleküls (CAM) ist für eine Metastasierung auf allen Zelltypen (zum Beispiel Tumor, Endothel- und Leukozytenzellen) wesentlich. Integrin-CAMs spielen nicht nur bei der Metastasierung eine Rolle, sondern stehen mit dem Wachstum und Überleben der Tumorzellen in Zusammenhang und kooperieren mit verschiedenen Proteinasen, um die Metastasierung und Angiogenese zu fördern.
Sekundärgewebeschaden
sErkrankungszustände, die mit einem Sekundärgewebeschaden assoziiert sind, können entsprechend der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen behandelt werden und unter Verwendung der hierin bereitgestellten Konjugate ebenso wie verschiedener Nicht-ChemokinZytokine, welche Fachleuten zur Behandlung anderer Bedingungen bekannt sind. Diese Erkrankungszustände schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eine ZNS-Verletzung, ZNS-Entzündungserkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, Herzerkrankungen, entzündliche Augenerkrankungen, entzündliche Darmerkrankungen, entzündliche Gelenkerkrankungen, entzündliche Nierenerkrankungen oder Nierenleiden, entzündliche Lungenerkrankungen, entzündliche Nasenerkrankungen, entzündliche Schilddrüsenerkrankungen, Zytokin-regulierte Krebsarten und andere Erkrankungszustände, welche einen Sekundärgewebeschaden involvieren oder mit einem Sekundärgwebeschaden assoziiert sind.
Beispiele für ZNS-Entzündungserkrankungen und/oder neurodegenerative Erkrankungen, welche unter Verwendung der hierin bereitgestellten Verfahren und Konjugate behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Schlaganfall, eine geschlossenen Kopfverletzung, Leukoenzephalopathie, Choriomeningitis, Meningitis, Adrenoleukodystrophie, AIDS-Demenzkomplex, Alzheimer-Krankheit, Down Syndrom, chronisches Ermüdungssyndrom, Enzephalitis, Enzephalomyelitis, spongiforme Enzephalopathien, multiple Sklerose, Parkinson-Krankheit, Rückenmarksverletzung/ Trauma (SCT) und traumatische Hirnverletzung; Herzerkrankungen, welche unter Verwendung der hierin bereitgestellten Verfahren behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Atherosklerose, neointimale Hyperplasie und Restenose; entzündliche Augenerkrankungen, welche unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen und Konjugate behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf proliferative Diabetes-Retinopathie, proliferative Vitreoretinopathie, Retinitis, Skleritis, Skleroiritis, Choroiditis und Uveitis. Beispiele für eine entzündliche Darmerkrankung, welche unter Verwendung der Zusammensetzungen, deren Verwendungen und Konjugate behandelt werden können, welche hierin bereitgestellt sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf chronische Colitis, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Beispiele für entzündliche Gelenkerkrankungen, welche behandelt werden können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen, deren Verwendungen und Konjugate schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die juvenile Form der rheumatoiden Arthritis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Spondylarthropathien wie etwa Morbus Bechterev, Reiter Krankheit, reaktive Arthritis, Arthropathia psoriatica, Spondylitis, undifferenzierte Spondylarthropathien und Behcet-Krankheit; Beispiele für entzündliche Nierenerkrankung oder Nierenleiden, welche behandelt werden können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen und Konjugate schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Glomerulonephritis, Lupus nephritis und Iga-Nephropathie. Beispiele für entzündliche Lungenerkrankungen, welche behandelt werden können unter Verwendung der Zusammensetzungen und deren Verwendungen und Konjugate, die hierin bereitgestellt sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eine eosinophile Lungenerkrankung, chronische eosinophile Pneumonie, fibrotische Lungenerkrankungen, akute eosinophile Pneumonie, Bronchokonstriktion, einschließlich Asthma, bronchopulmonale Dysplasie, bronchoalveolare Eosinophilie, allergische bronchopulmonale Aspergillose, Pneumonie, akutes Atemnotsyndrom und chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD); Beispiele für entzündliche Nasenerkrankungen, welche unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen und Konjugate behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyposis, Rhinitis, Sinusitis; Beispiele für entzündliche Schilddrüsenerkrankungen, welche behandelt werden können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen, deren Verwendungen und Konjugate, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Thyroiditis und Beispiele für Zytokin-regulierte Krebsarten, welche unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Gliome, Atherome, Karzinome, Adenokarzinome, Granulome, Glioblastome, Granulomatose, Lymphome, Leukämien, Melanome, Lungen krebsarten, Myelome, Sarkome, Sarkoidose, Mikrogliome, Meningiome, Astrozytome, Oligodendrogliome, Morbus Hodgkins und Brust- und Prostatakrebsarten. Andere Entzündungserkrankungen, welche einer Behandlung unter Verwendung der hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und deren Verwendungen und Konjugaten zugänglich sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Vaskulitis, Autoimmundiabetes, insulinabhängige Diabetes mellitus, Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD), Psoriasis, systemischer Lupus erythematodes, Sepsis, systemisches Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS) und eine schädliche Entzündung aufgrund von Verbrennungen.
Wie oben bemerkt wurde, teilen diese Erkrankungen, obwohl sie verschieden sind, die gemeinsamen Merkmale, verbunden mit der Entzündungsreaktion. Eine Rückenmarksverletzung oder Trauma, welches durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines therapeutischen Agens wie hierin beschrieben an ein Objekt, welches dieser bedarf, behandelt werden kann, ist für die vorgesehenen Erkrankungen beispielhaft. Die Behandlungen hierin sind gestaltet, um die nachteiligen Ergebnisse dieser Reaktionen einschließlich der Proliferation und Migration von Leukozyten zu bekämpfen. Die Behandlungen werden die Leukozytenproliferation und Migration beseitigen oder verringern und aufgrund dessen zu einer Besserung der Symptome, einer Verringerung der Nebenwirkungen oder zu anderen günstigen Ergebnissen führen, welche die Wirksamkeit anderer Behandlungen verbessern.
Die folgenden Beispiele sind lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung enthalten und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1
Konstruktion von Genen
Um den Entwicklungsprozess voranzutreiben, wurde ein genetisches Konstrukt, ein Kassettenkonstrukt, welches den Austausch von Fusionsprotein-Ligand, Toxin und Linkersequenzen erleichtert, entworfen.
Dieses "Kassettenkonstrukt" wurde chemisch synthetisiert mit der vollständigen codierenden Sequenz von OPL98101 (siehe Tabelle 6 und siehe SEQ ID NO.551. Das Gen wurde so gestaltet, dass das Fusionsprotein mit einem Methionin- (Met-) Rest startet, gefolgt von der publizierten Sequenz des reifen MCP-3 und einem Alanin- (Ala-) Rest. Diese Sequenz wurde von einem Met-Rest (wobei der Ala-Met-Linker gebildet wurde) und den Resten 23–268 der Untereinheit des Shiga-Al-Toxins gefolgt.
Um die Entfernung und das Ersetzen mit verschiedenen Ligand- und Toxingenen zu erleichtern, wurden in jede Gensequenz nahe ihrer 3'- und 5'-Enden Restriktionsendonukleasestellen eingebracht (siehe SEQ ID NO.52–67). Außerdem wurde ein zweites Toxingen synthetisiert mit geeigneten inneren Restriktionsstellen, welches für die reife Form des Saporin-6- (OPL982) Proteins codiert. Das Shiga-Toxin wurde auf ähnliche Art und Weise subkloniert. Die Chemokin-Toxin-Fusionen und freien Toxingene enthalten flankierende Xbal(5')- und BamHI(3')-Restriktionsstellen. Sie wurden einzeln in einen pGemex-1-Vektor kloniert (Promega Inc.). Das resultierende Plasmid, enthaltend das freie Saporintoxin war pOPL2 (freies Saporintoxin). Die Plasmidkarte des freien Saporintoxins (pOPL2) ist in 2 dargestellt. In 3 ist die Plasmidkarte einer Ligand-Toxin-Fusion (MCP3-AM-SHIGA, in Tabelle 6 als OPL98101 bezeichnet) gezeigt, wobei das Plasmid pOPL1 genannt wird.
Das ATG-Startcodon beider Gene enthielt eine Ndel-Stelle zur Subklonierung in das pET11c-Expressionssystem (T7-Promotor, Novagen Inc.). Die Codonauswahl in beiden DNA-Konstrukten wurde während der Gestaltungsphase für eine Expression in E. coli optimiert. Die Gene der pGemex-1-Vektoren wurden unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme in das pET11c-Expressionssystem subkloniert. Plasmidkarten von Chemokin-Toxin enthaltenden Beispielplasmiden in pET11c-Plasmiden sind in den 4 (MCP1-AM-SAP) und 5 (MCP3-AM-SHIGA) aufgeführt. Die Expression von Konstrukten wie diesen ergab Proteine wie etwa OPL98101 und OPL983 (siehe Tabelle 6).
Klovierung von Ligand- und Toxingenen
Alle verbleibenden Gene und Varianten der originalen Sequenzen wurden unter Verwendung geeigneter Oligonukleotidprimer (siehe Tabelle 7) und dem Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) kloniert. Primer des Vorwärtsstrangs wurden mit einer Restriktionsstelle für eine Subklonierung des Gens in pET11c gestaltet. Die Primer des Rückwärtsstrangs überlappten den Linker und einen Teil der erforderlichen Toxinsequenz und codierten für geeignete Restriktionsstellen für eine nachfolgende Entfernung und Ersetzen von Ligand und Toxin und für eine Subklonierung in den Expressionsvektor. MCP-1 wurde aus der DNA des ATCC 65933-Plasmids (Rockwelt, MD) kloniert, während das humane Eotaxin und SDF-1β aus einer humanen "Quick-Clone" Lungen-cDNA-Bibliothek (Clonetech, Palo Alto, CA) stammten. Die trunkierten Shiga-A1-Gene (mit oder ohne eine C-terminate Histidin-Tag-Sequenz mit 6 Resten im reifen Fusionsprotein) wurden aus pOPL98101 kloniert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines Qiagen-Gelextraktionskits aus Agarosegelen isoliert und in den Vektor pCR2.1 kloniert, unter Verwendung eines TOPO-Klonierungskits (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die fertigen Gene unter Verwendung von M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern und einem ABI Prism 310 Genetic Analyzer sequenziert, um deren Identitität zu bestätigen.
Tabelle 7
Screening auf Expression der Chemokin-Toxin-Konjugate
sDie Chemokin-Toxin tragenden pET1 1 C-Konstrukte (Tabelle 6) wurden in E. coli BL21DE3 pLysS (Stratagene) transformiert und auf Luria-Nährmedium mit 1 % Glukose und 100 μg/ml Carbenicillin (LB-car) ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht wurde eine Einzelkolonie verwendet, um 10 ml LB-car anzuimpfen, es wurde bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 angezogen und mit 1 mM IPTG induziert. 1 und 2 h nach der Induktion wurden Proben entnommen, und die Zellen wurden durch Zentrifugation aufkonzentriert und in SDS-Probenpuffer mit OD 13 resuspendiert. Die exprimierten Proteine wurden einer SDS-PAGE unterzogen und mittels Coomassie-Färbung sichtbar gemacht, während ein paralleler Gelansatz unter Verwendung geeigneter Antikörper (R&D Systems, Minneapolis, MN) einem Western Blotting und Immunoblotting unterzogen wurden. Alle diese Chemokin-Toxine (siehe Tabelle 6) sind positiv exprimiert worden. Aliquots von transformierten Zellen (1 ml LE enthaltend 15% Glycerol mit einer OD₆₀₀ von ungefähr 0,85) wurden bei –70°C für eine weitere Verwendung eingefroren.
Reinigung ausgewählter Fusionsproteine
Reinigung von OPL98110 durch Nickel-Affinitätschromatographie
Chemokin-Toxingene mit HIS-Tag wurden so konstruiert, dass kleine Mengen Untersuchungsmaterial schnell exprimiert werden konnten und in einem in vitro-Bioassay zügig gereinigt werden konnten, und um einen zusätzlichen Weg für eine Reinigung in großem Maßstab einzubringen, falls sie erforderlich sein sollte. Eine kleine Menge an teilweise gereinigtem OPL981 10 (ungefähr 65% Reinheit auf SDS-Gelen) wurde unter Verwendung einer Nickel-Affinitätschromatographie erhalten. Ein Zweistufenverfahren von Kationenaustausch- und Nickel-Affinitätschromatographie ergab im Wesentlichen reines Chemokin-Toxin.
Zellen, die mit pOPL981 10 transformiert waren, wurden bis zu OD₆₀₀ von 1,28 (7 h Inkubationsdauer bei 37°C) in einem Schüttelkolben mit 500 ml LB angezogen, mit 1 mM IPTG für 1,5 h (OD₆₀₀ = 2,53) induziert und durch Zentrifugation geerntet. Die Hälfte des Pellets (d. h. das Äquivalent von 250 ml der Originalkultur) wurde auf Eis in 6 ml 10 mM Natriumphosphat (pH 7,5), enthaltend 300 mM NaCl und 8 M Harnstoff beschallt. Das Lysat wurde bei 13000 rpm in Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde bei 100000 g bei 4°C für 1 h zentrifugiert. Der letzte Überstand wurde mit 1 ml eines Breies (50% v/v) von Nickel-NTA-Harz (Qiagen) gemischt, welcher zuvor equilibriert worden war in Lysepuffer, welcher 5 mM Imidazol, aber keinen Harnstoff enthielt. Das Gemisch wurde für 5 h bei 4°C sanft rotiert, in eine kleine Säule geschüttet und mit 4 ml 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4) enthaltend 300 mM NaCl und 60 mM Imidazol gewaschen. Die Säule wurde mit 4 × 1 ml Puffer eluiert, der 10 mM Natriumphosphat (pH7,4) und 0,5 M Imidazol enthielt. OPL98110-positive Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE mit Western und Immunoblotting identifiziert. Als sie vereinigt waren, wurde die Ausbeute und Reinheit des Fusionsproteins auf 200 μg bzw. 65 % geschätzt.
Reinigung eines nicht mit His markierten Fusionsproteins (OPL98101)
OPL98101 wurde unter Verwendung einer leicht modifizierten Version eines veröffentlichten Verfahrens (McDonald et al. (1996) Protein Expr Purif 8, 97-108) wie folgt gereinigt. OPL98101-Plasmid enthaltende Bakterienzellen (Stamm BL21(DE3)pLysS) aus einer Übernacht-Kultur (1 : 100 Verdünnung) wurden bei 30°C in einem Schüttelinkubator auf eine OD₆₀₀ von 0,7 angezogen. IPTG (Sigma Chemical, St.Louis, MO) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben und die Anzucht wurde für 1,5 h fortgeführt, nach dieser Zeit wurden die Zellen geerntet. Ein Anziehen der BL21(DE3)pLysS-Zellen bei 30°C anstelle von 37°C verbessert die Ausbeuten. Wenn die Zellen bei 30°Cangezogen werden, werden sie vor der Induktion auf eine OD₆₀₀ von 1,5 angezogen. Nach der Induktion wird das Wachstum für etwa 2-2,5 h weitergeführt, nach dieser Zeit werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Nach der Fermentation wurden die Bakterien beschallt, in 5 Volumina 10 mM Natriumphosphat (pH 7,4) enthaltend 10 mM EGTA, 10 mM EDTA und 50 mM NaCl, und bei 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Q-Sepharose-FF-Säule (equilibriert mit dem gleichen Puffer) aufgetragen, die mit dem Einlass einer S-Sepharose-FF-Säule verbunden war. Unter diesen Bedingungen fließt OPL98101 durch das Anionenaustauschharz und haftet an das Kationenaustauschharz. Die Q-Säule wurde abgetrennt und die S-Sepharosesäule wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl (0,05–1 ,0 M, 10 Säulenvolumina) in 10 mM Natriumphosphat (1 mM EGTA und 1 mM EDTA, pH 7,4) eluiert. Das Chemokin-Toxin wurde durch Immunoblotting nachgewiesen und geeignet vereinigte Fraktionen wurden auf eine Sephacryl S100-Säule aufgetragen.
Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden mittels Gelektrophorese und Coomassie-Blau-Färbung der Gele analysiert. Das hochangereicherte Chemokin-Toxin wurde gemeinsam mit einem sauren (pl 6,3) Protein von ungefähr 28 kDa in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1 (Fusions protein : Kontaminante) aufgereinigt. Auf den mit Coomassie Blue gefärbten Gelen wurden keine anderen Proteinbanden nachgewiesen. Eine N-terminale Sequenzierung bestätigte die Anwesenheit von OPL98101, und dass die Kontaminante ein „Housekeeping-Protein" von E. coli war. Weitere Versuche, sie zu trennen, einschließlich einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) waren nicht erfolgreich. Es erscheint wahrscheinlich, dass die saure Kontaminante während der ganzen Reinigung eng mit dem basischen Fusionsprotein verbunden war. Bei der Lyse der Zellen bei niedrigem pH (ungefähr 5,0 – 5,8) in Gegenwart eines denaturierenden Agens, wie etwa 8 M Harnstoff, beseitigten die zwei Proteine solch enge Verbindungen. Die nachfolgende Erfahrung mit OPL98110 (in Gegenwart von Harnstoff stabil) unterstützt diese Schlussfolgerung.
Beispiel 2
In vitro-Bioaktivität von ausgewählten Chemokin-Toxin-Fusionsproteinen Proteinsyntheseinhibitions- (RIP-) Assays in vitro
Eine Hemmung der Proteinsynthese, vermittelt durch Fusionsprotein und freies Ribosomen-inaktivierendes Toxin, kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kaninchen-Retikulozytenlysatsystems gemessen werden, welches die Translation von Luciferase-RNA untersucht (Promega, Madison, WI). Kurz gesagt, die Proben wurden nacheinander in 20 mM Tricin, pH 7,8 verdünnt, und 5 μl des verdünnten Proteins wurden mit 5 ml Reaktionsgemisch (50 μg/ml Luciferase-RNA, 0,1 mM Aminosäuregemisch ohne Methionin) und 15 μl des Kaninchen-Retikulozytenlysats kombiniert. Neben mehreren Negativkontrollen (Puffer und einem Reagenzienvergleich) wurde freies Saporin (0,03–1 nM) als eine Positivkontrolle verwendet. Die Proben wurden bei 30°C für 1 h inkubiert, ehe 2,5 μl des Reaktionsgemischs auf eine Dynex 96-Wellplatte (Dynex Technologies Inc. Chentilly, VA) übertragen wurden, und unter Verwendung eines vorgewärmten (30°C) LUMIstar*-Luminometers (BMG Lab Technologies, Durham, NC) analysiert wurden.
Hemmung der Proteinsynthese – Der RIP-Assay
Die toxische Wirkung von OPL98101 wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen in vitro-Proteinsynthese-Inhibitionsassays gemessen. Bei einer Konzentration von 30 pM war Saporin 90% hemmend, während eine Probe enthaltend die gleiche geschätzte Konzentration des Chemokin-Toxins 500-fach verdünnt werden musste, um ein ähnliches Ergebnis zu ergeben. Unter der Annahme, dass die Konzentrationsschätzung korrekt war, stimmt dieses Ergebnis mit den veröffentlichten Daten überein, dass in diesem Assay die Shiga-A-Untereinheit wirksamer ist als Saporin (siehe Zollman et al. (1994) Protein Expr Purif 5, 291–5; McDonald et al. (1996) Protein Expr Purif 8, 97–108 und Chandler et al. (1998) Int J Cancer 78, 106–11].
Gewebekulturprotokolle
Primärkulturen
Protokolle für eine adulte humane Gehirnzellkultur sind bekannt (siehe zum Beispiel Yong et al. (1997) "Culture of glial cells from human brain biopsies" in "Protocols for Neural cell Culture" (A. Richardson und S. Fedoroff, Editoren), Humna Press, St. Louis 157–172). Kurz gesagt, chirurgisch resektiertes Gehirngewebe wird in Würfel von 1 mm geschnitten und in 0,25% Trypsin bei 37°C für 1 h inkubiert. Die Suspension wird durch ein 130 μm Nylonfilter passiert, welches das Gewebe in Einzelzellen dissoziiert. Nach einer Zentrifugation (15000 rpm, 25 min) in 30% Percoll enthält der Überstand lebensfähige Neuronen, während das Pellet aus Zelttrümmern, Myelin und roten Blutzellen zusammengesetzt ist. Die Nervenzellen werden gesammelt und auf nicht beschichtetem Gewebekulturkunststoff ausplattiert. Die Kulturen werden für 24 h bei 37°C inkubiert, während dieser Zeit haften die Mikroglia an den Kunsstoff an, während die Oligodendrozyten in Lösung bleiben. Die Oligodendrozyten werden abgeschüttet, zentrifugiert und auf Poly-L-Lysin ausplattiert, an das sie anhaften. Neuronen und Astrozyten überleben dieses Isolierungsverfahren nicht, aber die resultierenden Populationen von Oligodendroglia und Mikroglia besitzen eine Reinheit von mehr als 95%.
Neuronen und Astrozyten stammen von fötalen Gehirnproben. Das Gehirngewebe wird in kleine Würfel geschnitten und mit 0,25% Trypsin und 100 μg/ml DNAse bei 37°C inkubiert (siehe Oh et al. (1996) Glia 17, 237–53). Die Suspension wird durch ein 130 μm Nylonfilter passiert und das Filtrat wird gesammelt, gewaschen und auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Gewebekulturkunststoff ausgesät, damit die Zellen anhaften können. Ein Percoll-Zentrifugationsschritt ist nicht erforderlich, da die meisten fötalen Axonalsysteme nicht myelinisiert sind. Um die Neuronenpopulation zu reinigen, wird die gemischte Kultur mit 25 μm Cytosinarabinosid (Sigma, St. Louis) behandelt, welches die mitotisch aktiven Astrozyten zerstört. Um die Astrozytenpopulation zu reinigen, wird die gemischte Kultur in Gegenwart von 0,25% Trypsin passagiert, was die Neuronen abtötet. Adulte Astrozyten werden auf eine ähnliche Art und Weise isoliert. Es wurden kultivierte adulte und fötale primäre Astrozyten und fötale Neuronen wurden präpariert.
Im Allgemeinen werden Nervenzellkulturen zweimal wöchentlich mit Minimalnährmedium (MEM) gefüttert, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 20 μg/ml Gentamicin und 0,1% Dextrose (Gibco, Grand Island, N. Y.).
Humane periphere Blutleukozyten werden gemäß veröffentlichter Verfahren geerntet (siehe zum Beispiel Chabot et al. (1997) J Clin Invest 100, 604–12). Kurz gesagt, venöses Blut wird auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia) geschichtet und für 30 min bei 2500 rpm zentrifugiert. Die mononukleäre Zellfraktion wird gesammelt, zweimal gewaschen und auf nicht beschichtete Gewebekultursubstrate ausgesät. 2 h später werden schwimmende Zellen (meist T-Lymphozyten) entfernt, um eine adhärente Population zurückzulassen, welche primär aus Monozyten besteht. Diese Zellen werden sofort in Cytotoxizitätsexperimenten verwendet, oder sie werden vor den Experimenten (3 Tage, 1 mg/ml Anti-CD3-Rezeptorligation für T-Zellen oder 1 mg/ml Lipopolysaccharid für Monozyten) aktiviert.
Im Allgemeinen werden alle hämatopoetischen Zellen (primäre Zellen oder die oben beschriebenen Zelllinien) in RPMI-Medium gehalten, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 20 mg/ml Gentamicin und 0,1 % Dextrose (Gibcol.
Zelllinien
Zelllinien, die von humanen mononukleären Phagozyten stammen, werden routinemäßig kultiviert. Zum Beispiel sind von Monozyten stammende U937-und THP-1-Zellen und die Mikroglia-ähnliche CHME-Linie aus fötalem Gehirn (erhalten von Dr. Tardieu, Frankreich, siehe auch Janabi et al. (1995) Neurosci Lett 195, 105–8) verwendet worden, um die Verbindungen zu untersuchen. Zahlreiche Zelllinien, einschließlich solchen von astrozytischer und neuronaler Abstammung, können leicht von der ATCC (Rackwell, MD) erhalten werden und unter Verwendung der Anweisungen, welche in der Lieferung enthalten sind, erfolgreich kultiviert werden.
Immunhistochemie
Eine indirekte Immunhistochemie wird routinemäßig durchgeführt, um die Reinheit von angereicherten Kulturen zu bestätigen, und durch Erweiterung, um zwischen verschiedenen Zelltypen in einer gemischten Kultur zu unterscheiden. Es gibt eine Vielzahl von akademisch und kommerziell erhältlichen Zelltyp-spezifischen Antikörpern, welche verwendet werden können, um dieses Verfahren zu erleichtern. Beispiele schließen einen Anti-G-Galactocerebrosid(GaIC)-Antikörper zur Identifizierung von Oligodendrozyten, einen Antikörper gegen das Glia-fibrilläre saure Protein (GFAP) für Astrozyten, einen Anti-Mac-1-Antikörper gegen Mikroglia und einen Anti-Neurofilamentantikörper für Neuronen (Anti-NFL) ein.
Kurz gesagt, lebende Zellen auf Deckgläschen werden mit einem geeigneten Fixierungsmittel (zum Beispiel 4% Paraformaldehyd für Galactocerebrosid und 95% Ethanol/5% Eisessig, V/V). Eine vorbestimmte Konzentration des primären Antikörpers wird aufgetragen, gefolgt von einem geeigneten sekundären Antikörper (normalerweise Rhodamin oder Fluoresceinkonjugiertes Ziege-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG). Die gefärbten Zellen werden unter Verwendung eines Mikroskops, das mit einem Immunfluoreszenznachweis ausgestattet ist, untersucht. Die Analyse von adhärenten Zellkulturen ist auf eine indirekte immunhistochemische Färbung und Markierung und auf Doppelmarkierungsverfahren angewiesen. Jeder Zelltyp wird in einer ausreichend großen Anzahl von zufällig ausgewählten Mikroskopfeldern gezählt und die Daten werden einer geeigneten statistischen Analyse unterworfen. In Abhängigkeit der Art und Weise und/oder dem Ausmaß der Toxizität, d. h. Apoptose gegenüber Nekrose und/oder eine feine gegenüber einer groben Toxizität, wird das Ausmaß des Zelltods entweder qualitativ (Toxizitätsgrad von 0–4, siehe zum Beispiel Noble et al. (1994) Brain Res 633, 83–90) oder quantitativ (die Anzahl von toten Zellen als eine Prozentangabe der Gesamtpopulation; siehe zum Beispiel Oh et al. (1997) Brain Res 757, 236–44) aufgezeichnet. In den meisten Fällen werden die Daten unter Verwendung eines Einweganalyse der Varianz (ANOVA) mit Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichen analysiert. Suspendierte Zellen werden unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert, welcher normalerweise die Sammlung von Daten und eine geeignete statistische Analyse automatisiert (zum Beispiel Ausstattung von Becton Dickinsonl.
Cytotoxizitätsassays
Kurz gesagt, Testzellen werden mit frischem Medium versorgt, das Kontroll- und Testsubstanzen enthält (in verschiedenen Konzentrationen) und für eine bestimmte Zeitdauer (24–36 h) inkubiert. Dann wird die Cytotoxizität gemessen als die Fähigkeit von adhärenten Zellen, den Lebendfarbstoff MTT zu reduzieren, wie ausführlich anderswo beschrieben wird (Mosmann, T. (1983) J Immunol Methods 65, 55–63; Gieni et al. (1995) J Immunol Methods 187, 85–931. Die Cytotoxizität in suspendierten Zellkulturen wird unter Verwendung eines Coulter-Counters gemessen, wobei die absolute Zahl von Zellen als ein Index der Zahl der überlebenden Zellen pro Testbedingung genommen wird. Schließlich wird das allgemeine Überleben von Zellen und die Morphologie während der Experimente unter Verwendung eines Umkehrphasenmikroskops und Ausschluss des Farbstoffs Trypan Blau überwacht (Yong et al. (1997) "Culture of glial cells from human brain biopsies", in "Protocols for Neural cell Culture" (A. Richardson und S. Fedoroff, Editoren), Humana Press, St. Louis 157–172).
Chemotaktische Assays
Die chemotaktische Wirkung jedes rekombinanten Chemokin-Toxins ist von Interesse, hauptsächlich als ein Test der biologischen Aktivität des Ligandenbestandteils. Es sind Fachleuten zahlreiche chemotaktische Assays bekannt (siehe zum Beispiel Stuve et al. (1996) Ann Neurol 40, 853–63 und Stuve et al (1997) J Neuroimmunol 80, 38–461. Kurz gesagt, die oberen und unteren Kompartimente einer modifizierten Boyden-Kammer werden durch eine 3 μm Membran, beschichtet mit Fibronectin, getrennt. Hämatopoetische Responderzellen, welche geeignet sind für das getestete Chemokin, werden in dem oberen Kompartiment der Kammer platziert, während die Testmaterialien in dem unteren platziert werden. Nach einer geeigneten Zeitdauer wird die Anzahl von Zellen aufgezeichent, welche als Antwort auf den chemotaktischen Stimulus gewandert sind. Wandernde T-Lymphozyten fallen von der Membran in die untere Kammer und können unter Verwendung eines Coulter-Counters gezählt werden. Im Gegensatz dazu verbleiben wandernde MNPs an der Unterseite der Membran, und folglich muss vor dem Färben mit Coomassie Blue und einer lichtmikroskopischen Analyse die obere Fläche gewaschen werden und die untere Fläche fixiert werden.
OPL98110-Aktivität an stationären Zielzellen
Bemerkung: Kontrolle A ist ein Gewebekulturmedium. Kontrolle B ist eine Waschfraktion, die vor der Elution des Chemokintoxins von dem Nickel-Affinitätsharz erhalten wurde. Diese Fraktion war stark mit E. coli-Proteinen angereichert. Solange es nicht anders angegeben ist, wurden alle Verfahren im dreifachen Ansatz durchgeführt.
Humane periphere Blutmonozyten (von gesunden Spendern) und THP-1-Zellen (eine humane monozytische Zelllinie) wurden mit 1 : 10- und 1 : 50-Verdünnungen der Kontrolle B und OPL98101 behandelt. 24 h später wurden die Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie untersucht und repräsentative Felder wurden photographiert und gezählt. OPL98110 verursachte bei beiden Zelltypen eine ausgeprägte Membranzerstörung und Vakuolisierung. Die meisten der behandelten Zellen erschienen anormal, und eine erhöhte Menge an Zelltrümmern zeigte, dass einige bereits tot waren. Bei der geringeren Konzentration des Chemokin-Toxins (1 : 50) waren 20–25% beider Zelltypen betroffen.
In einem anderen Experiment wurden THP-Zellen für 48 h in Gegenwart und Abwesenheit von OPL98110 (1 : 10-Verdünnung) angezogen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde entweder mittels des Mikroskops oder durch die Fähigkeit, Trypan Blau auszuschließen, untersucht. Zellen, welche den Farbstoff ausschließen, leben, während gefärbte Zellen tot sind. Da THP-1-Zellen normalerweise nicht adhärent sind, und um eine genauere Zählung zu erzeugen, wurden die Kontroll- und behandelten Zellen von Zelltrümmern dissoziiert unter sanftem Pipettieren vor dem Zählen. Nach 48 h waren 7,4 f 3% der Kontrollzellen tot (d. h. gefärbt) im Vergleich mit 58,8 ± 13% der mit OPL981 10 behandelten Gruppe. Dies ist ein Unterschied von 51,4%. Entsprechende Wells, die nach 96 h untersucht wurden, ergaben, dass Kontrollzellen proliferiert hatten und weiterhin ziemlich normal und gesund erschienen, während die mit dem Chemokin-Toxin behandelten Kulturen eine Menge Zelttrümmer enthielten, aber wenn überhaupt, wenige lebende Zellen.
Diese Kulturen wurden aufgeteilt und für weitere 7 Tage inkubiert. Kontroll-THP-1-Zellen gediehen und proliferierten weiterhin. Es gab keine überlebenden Zellen in Wells, die von den mit OPL981 10 behandelten Kulturen ausgesät wurden. Diese Untersuchungen zeigen, dass behandelte Zellen krank werden und schließlich sterben, über eine verlängerte Zeitdauer, was auf einen apoptotischen Mechanismus hindeutet.
OPL98110-Aktivität auf Nichtzielzellen
OPL98110 wurde an nicht angesteuerten, primären humanen fötalen Neuronen und einer humanen U251-Gliom- (astrozytischer Tumor) Zelllinie getestet. Die Neuronen wurden mit TNF-α aktiviert, um eine Entzündung zu stimulieren. Die Gliomzellen proliferierten aggressiv und waren somit aktiviert. Nach einer Exposition von 24 h gegenüber OPL98110 (1 : 50-Verdünnung) gab es keinen nachweisbaren Effekt auf einen der Zelltypen. Eine immunhistochemische Färbung der Neuronen auf β-Tubulin und der Nachweis von Apoptose (TUNEL) ergab gesunde, intakte Zellen.
OPL98110-Aktivität auf migrierende Zielzellen
In der ersten Serie der Experimente wurden Zielzellen mit Leukozytenabstammung (humane periphere Monozyten und THP-1-Zellen) in deren ruhendem, stationären Zustand untersucht. Wie oben diskutiert, werden Immunzellen bei einer fokalen Verletzung oder Entzündung in vivo durch eine Vielzahl von Stimuli (zum Beispiel Zytokinen und Chemokinen) aktiviert und reagieren unter anderem durch Hochregulierung der Expression von Chemokinrezeptoren und migrieren an die Stelle der Entzündung. Es ist gut etabliert, dass die charakteristischen in vivo-Reaktionen in vitro durch Exposition von Zielzellen gegenüber verschiedenen exogenen Agenzien wie etwa Zytokinen, Chemokinen, Phorbolestern und bakteriellen Lipopolysacchariden nachgeahmt werden können. Insbesondere kann die in vitro-Migration von Leukozyten durch Chemokine induziert werden, und durch Zählen der Zellen gemessen werden, welche durch einen 3 μm Filter wandern, der die oberen und unteren Kammern einer modifizierten Boyden-Gewebekulturschale trennt. Kurze (zum Beispiel 2–3 h) Inkubationen von Testchemokin und Zellen werden normalerweise angewendet, um die temporären Chemoattraktionswirkung zu beobachten. Nicht jedes Chemokin ist auf jeden Zelltyp ein wirksamer chemotaktischer Faktor, sogar wenn eine gegebene Zelle den geeigneten Rezeptor besitzt.
Im Fall von THP-1-Zellen ist MCP-3 ein chemotaktischer Faktor, aber MCP-1 (und somit OPL98110) ist es nicht. MCP-3 zog THP-1-Zellen in die untere Kammer an mit 185 ± 8% der Kontrolle A. Außerdem macht es die Beschaffenheit von OPL98110 schwierig, eine Chemoattraktionswirkung zu quantifizieren, wenn angenommen wird, dass MCP-1-responsive Zellen getötet werden. Aber normale THP-1-Zellen migrieren normalerweise ohne einen speziellen exogenen Stimulus (der Zugang zu einer Region mit einer geringen Zelldichte ist alles, was erforderlich scheint), obwohl mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als die bei einer Induktion mit Chemokinen.
Bewaffnet mit diesen Kentnissen, wurden Experimente mit länger dauernden Inkubationen entworfen, um die cytotoxischen Wirkungen von OPL98110 auf natürlich migrierende und migrierte THP-1-Zellen (d. h. Zellen, welche die untere Kammer der modifizierten Boyden-Gewebekulturschalen erreichen) zu testen. THP-1-Zellen wurden in die oberen Zellen von modifizierten Boyden-Kammern ausplattiert. Die unteren Kammern enthielten Kulturmedium mit oder ohne Verdünnungsreihen von OPL98110. Nach 24 h wurden die Zellen in den oberen und unteren Kammern unter Verwendung eines Coulter-Counters gezählt. Es gab keinen Unterschied in den Zellzahlen in den oberen Kammern zwischen Kontrolle und Versuch, was darauf hindeutet, dass gleiche Zahlen von Zellen unter allen Bedingungen migrierten. Im Vergleich zur Kontrolle verringerten sich die Zellzahlen in den unteren Kammern von behandelten Zellen, wenn die Konzentration an OPL98110 anstieg. Migrierte THP-1-Zellen wurden von OPL98110 in einer dosisabhängigen Art und Weise getötet.
Die "aktiven" Zellen in den Experimenten mit der modifizierten Boyden-Kammer scheinen gegenüber OPL98110 empfänglicher zu sein als Zellen, die im "stationären" (ruhenden) Gewebekulturmodell getestet wurden. Nach 24 h schienen beispielsweise ungefähr 75–80% der stationären THP-1-Zellen, die mit OPL98110 (1 : 50%-Verdünnung) behandelt wurden, gesund, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet wurden. Die mittlere Zellüberlebensrate in Migrationsassays unter Verwendung dergleichen Verdünnung des Chemokin-Toxins betrug 50 ± 15% (Mittelwert von drei Experimenten in dreifacher Wiederholung).
Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung aktivierter (mit Anti-CD3 +) humaner T-Lymphozyten, isoliert von gesunden Freiwilligen, durchgeführt. OPL98110 (1 : 50-Verdünnung) tötete 32 ± 7% (p < 0,05) dieser Zellen, im Vergleich mit 49 ± 2% (p < 0,001) der THP-1-Zellen, die zur selben Zeit getestet wurden.
Beispiel 3
Herstellung von chemisch verbundenen Chemokin-Toxin-Konjugaten Anheften eines bifunktionellen Vernetzers über primäre Amingruppen
Es wird ein bifunktionellen Vernetzer verwendet, um einen monoklonalen Antikörper (IgG) an eine Verbindung mit einem primären Amin wie folgt zu binden: Der vewendete Vernetzer ist N-Succinimidyl 3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP), Sulfosuccinimidyl-6-exanoat (Sulfo-LC-SPDP) oder Sulfosuccinimidyl 6-(3'(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat (Pierce Chemicals, Rockford, IL). Das Toxin und das IgG werden anfänglich mit dem Vernetzer derivatisiert.
Zu 10 mg des Toxins in 1,0 ml BBS wird eine 20 nM Stammlösung des Vernetzers, hergestellt nach den Instruktionen des Herstellers, zugegeben, und das Gemisch wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Um den nicht konjugierten Vernetzer zu entfernen, wird die Probe auf eine 5- oder 10-ml Entsalzungssäule aufgetragen, die mit PBS equilibriert ist, und es werden 1 ml-Fraktionen gesammelt, die Absorption wird bei 280 nm überwacht und die Peak-Fraktionen werden bestimmt und vereinigt. Die gesammelten Peak- Fraktionen werden auf ein Endvolumen von 1,0 ml aufkonzentriert, zum Beispiel unter Verwendung einer Mikrodialyse.
Als nächstes werden 25 mg des Antikörpers zu 30 μl der Stammlösung des Vernetzers zugegeben, und das Gemisch wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Peak-Fraktionen werden gesammelt und aus einer Entsalzungssäule, die mit Acetatpuffer equilibriert ist, wie oben aufkonzentriert. Zu dem Konzentrat werden 12 mg Dithiothreitol in 500 μl des Acetatpuffers zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 30 min gerührt.
Das Gemisch wird auf eine 10 ml-Entsalzungssäule, die mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) equilibriert ist, aufgetragen, um überschüssiges Reduktionsmittel zu entfernen. Es werden Fraktionen von 1 ml gesammelt, und die Absorption von wird jeweils bei 280 nm überwacht. Die erste Fraktion mit einem Absorptionspeak bei 280 nm wird zu dem zu derivatisierenden Toxin zugegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 18 h inkubiert, dann auf eine Sephadex^® G-200-Säule (1,5 × 45 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit PBS equilibriert, während 1 ml-Fraktionen gesammelt und im Hinblick auf die Absorption bei 280 nm überwacht werden. Die Fraktionen, die das Konjugat enthalten, werden vereinigt.
Beispiel 4
Herstellung von chemisch verbundenen Chemokin-Toxin-Konjugaten Anheften eines bifunktionellen Vernetzers über Sulfhydrylgruppen
Die Konjugation eines monoklonalen Antikörperliganden an ein Toxin mit einer Sulfhydrylgruppe wird wie folgt ausgeführt, unter Verwendung der oben beschriebenen Vernetzer. Zu 5 mg des Liganden in 1,0 ml PBS werden 25 μl einer 20 mM Stammlösung des Vernetzers zugegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Um den überschüssigen Vernetzer zu entfernen, wird die Probe auf eine 5 ml-Entsalzungssäule aufgetragen, die mit PBS/Ethylendiamintetraacetat (EDTA) equilibriert ist, und 1 ml-Fraktionen werden gesammelt und im Hinblick auf die Absorption bei 280 nm überwacht. Die Peak-Fraktionen, die das Protein enthalten, werden vereinigt und auf ein Endvolumen von 1,0 ml aufkonzentriert. Zu dem Proteinkonzentrat werden 3 mg (3-Galactosidase zugegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Reaktionsgemisch auf eine Sephadex° G-200-Säule (1,5 × 45 cm) (Pharmacia) aufgetragen, mit PBS equilibriert und es werden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Die Absorption der Fraktion wird bei 280 nm überwacht, und der erste Absorptionspeak, der aus der Säule austritt, enthält das Proteinkonjugat.
Beispiel 5
Herstellung von chemisch verbundenen Chemokin-Toxin-Konjugaten Pegylierung eines Chemokin-Toxin-Konjugats
Die Pegylierung eines gereinigten Chemokin-Toxin-Konjugat-Toxins wird durch Mischen des Toxins mit Methoxy-PEG-Maleimid (MPEG-MAL) (MW 5000) (Sigma, St. Louis, MO) mit einem molaren Verhältnis von 1 : 10 in Puffer A (20 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0) ausgeführt. Nach 30 minütiger Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe eines molaren 30-fachen Überschusses an Cys gegenüber MPEG-MAL gequencht. Um das Protein aufzukonzentrieren, wird das Reaktionsgemisch auf ein geeignetes Chromatographieharz aufgetragen und in einer konzentrierteren Form mit einem Salz-enthaltenden Puffer (neutraler pH) eluiert. Das Reaktionsgemisch wird zum Beispiel auf eine S-Sepharosesäule (Pharmacia), equilibriert mit 50 mM NaCl in Puffer B (10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 6,0) aufgetragen. Die Proteine werden chargenweise mit 1 ml NaCl in Puffer eluiert. Das aufkonzentrierte Protein wird auf eine Gelfiltrationssäule geladen und mit Puffer C (50 mM Natriumcitrat, 80 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 6,0) eluiert. Das Chemokin-Toxin-Konjugat mit angehefteten PEG-Polymeren wird von dem nicht derivatisierten Chemokin-Toxin-Konjugat mittels seines Molekulargewichtsunterschieds getrennt.
Da Modifikationen für Fachleute offensichtlich sind, ist beabsichtigt, dass diese Erfindung lediglich durch den Umfang der angehefteten Ansprüche beschränkt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Konjugats für die Formulierung eines Medikaments zur Behandlung pathologischer Bedingungen, die verbunden sind mit Entzündungsreaktionen und/oder einem Sekundärgewebeschaden, verbunden mit der Aktivierung, Proliferation und Migration von Immuneffektorzellen, durch Hemmung der Aktivierung, Proliferation oder Migration der Immuneffektorzellen, umfassend das Verabreichen eines Konjugats an ein Tier, wobei die Aktivierung, Proliferation, Migration der Immuneffektorzellen gehemmt wird, und wodurch die Entzündungsreaktion und/oder der Sekundärgewebeschaden gehemmt wird, worin: das Konjugat die folgenden Bestandteile umfasst: (Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens)_n, (L)_q und (zytotoxisches Agens)_m, worin: L ein Linker ist zur Bindung des Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens an ein zielorientiertes zytotoxisches Agens; das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens jeglicher Teil ist, der selektiv an einen Chemokinrezeptor bindet; das zielorientierte zytotoxische Agens oder der Teil davon, wenn er in eine Zelle internalisiert wird, den Metabolismus oder die Genexpression in der Zelle verändert, die Proteinsynthese in der Zelle reguliert oder verändert, die Proliferation der Zelle hemmt oder die Zelle tötet; m und n, welche jeweils unabhängig ausgewählt sind, mindestens 1 sind; q 0 oder mehr ist, so lange das resultierende Konjugat an den angesteuerten Rezeptor bindet, internalisiert wird, und das zielorientierte zytotoxische Agens liefert; und das resultierende Konjugat an einen Rezeptor bindet, der mit einem Chemokin interagiert und ein Chemokin internalisiert, wobei das/die zielorientierte/n zytotoxischen Agens/Agenzien in eine Zelle internalisiert wird/werden, die den Rezeptor trägt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Tier ein Säugetier ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin die Bedingung einen Sekundärgewebeschaden umfasst.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin die Bedingung ausgewählt ist aus einer Verletzung des zentralen Nervensystems (ZNS), ZNS-Entzündungserkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen, entzündlichen Augenerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen, entzündlichen Gelenkerkrankungen, entzündlichen Nierenerkrankungen oder Nierenleiden, entzündlichen Lungenerkrankungen, entzündlichen Nasenerkrankungen, entzündlichen Schilddrüsenerkrankungen und Zytokin-regulierten Krebsarten.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die ZNS-Entzündungskrankheiten und/oder neurodegenerativen Erkrankungen ausgewählt sind aus Schlaganfall, einer geschlossenen Kopfverletzung, Leukoenzephalopathie, Choriomeningitis, Menigitis, Adrenoleukodystrophie, AIDS-Demenz-Komplex, Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, chronischem Ermüdungssyndrom, Enzephalitis, Enzephalomyelitis, spongiformen Enzephalopathien, Multipler Sklerose, Parkinson-Krankheit und Rückenmarksverletzung/Trauma (SCI, „spinal cord injury").
Verwendung nach Anspruch 4, worin die Herzerkrankung Atherosklerose ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Augenerkrankung ausgewählt ist aus proliferativer Diabetesretinapathie, proliferativer Vitreoretinopathie, Retinitis, Skleritis, Skleroiritis, Choroiditis und Uevitis.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Darmerkrankung ausgewählt ist aus chronischer Colitis, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Gelenkerkrankung ausgewählt ist aus der juvenilen Form der rheumatoiden Arthritis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis und Spondylarthropatien.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Spondylarthropatie ausgewählt ist aus Morbus Bechterew, Reiter-Krankheit, reaktiver Arthritis, Psoriasis-Arthropathie, Spondylitis, undifferenzierten Spondylarthropathien und Behcet-Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Nierenerkrankung oder Nierenleiden ausgewählt ist aus Glomerulonephritis, IgA-Nephropatie und Lupusnephritis.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Lungenerkrankung ausgewählt ist aus akutem Atemnotsyndrom, eosinophiler Lungenerkrankung, chronischer eosinophiler Pneumonie, akuter eosinophiler Pneumonie, Bronchuskonstriktion, bronchopulmonaler Dysplasie, bronchoalveolarer Eosinophilie, allergischer bronchopulmonaler Erkrankung, Aspergillose, Pneumonie und fibrotischer Lungenerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Nasenerkrankung ausgewählt ist aus Polyposis, Sinusitis und Rhinitis.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die entzündliche Schilddrüsenerkrankung Thyroiditis ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die Zytokin-regulierten Krebsarten ausgewählt sind aus Gliomen, Atheromen, Karzinomen, Adenokarzinomen, Granulomen, Glioblastomen, Granulomatose, Lymphomen, Leukämien, Lungenkrebsarten, Melanomen, Myelomen, Sarkomen, Sarkoidose, Mikrogliomen, Meningiomen, Astrozytomen und Oligodendrogliomen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–15, worin: das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Chemokin, ein Antikörper, der spezifisch an einen Chemokinrezeptor bindet, oder ein Fragment des Chemokins oder des Antikörpers ist, worin das Chemokin, der Antikörper oder Fragment davon an den Rezeptor bindet und das zielorientierte zytotoxische Agens in eine Zelle internalisiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, worin m und n, welche jeweils unabhängig ausgewählt sind, 1–6 sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, worin q 1 ist, n 1 ist und m 1 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–18, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Chemokin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–19, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens spezifisch an Chemokinrezeptoren auf Leukozyten bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–19, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens spezifisch an Chemokinrezeptoren auf Zellen bindet, ausgewählt aus mononukleären Phagozyten (MNP), Leukozyten, natürlichen Killerzellen, dendritischen Zellen, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten.
Verwendung nach Anspruch 20, worin die Leukozyten ausgewählt sind aus Basophilen, Neutrophilen, Eosinophilen und Kombinationen aus beliebigen zwei oder mehreren davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–22, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ausgewählt ist aus IL-8, GCP-2, GRO-α, GRO-β, GRP-γ, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, IP-10, SDF-1α, SDF-1β, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, ALP, Lungkine, Eotaxin-1, Eotaxin-2, I-309, SCYA17, Tim-1, TARC, RANTES, DC-CK-1, Lymphotactin und Fractalkine.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–23, worin das zielorientierte Agens ein Toxin ist.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das Toxin ein DNA-spaltendes Agens ist.
Verwendung nach Anspruch 25, worin das DNA-spaltende Agens ausgewählt ist aus Anthrachinon-Oligopyrrolcaboxamid, Benzimidazol, Leinamycin, Dynemycin A, Enediyne, Endiynchinoniminen, 2,2r-Bis(2-aminoethyl)-4-4'-bithiazol, Epilliticin-Salen.Kupfer-Konjugaten und funktionellen Analoga oder Derivaten davon.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das Toxin ein Antimetabolit ist.
Verwendung nach Anspruch 27, worin der Antimetabolit ausgewählt ist aus 5-Fluoruracil, Methotrexat, Melphalan, Daunomycin, Doxorubicin, Stickstofflost, Mitomycin C und funktionellen Analoga oder Derivaten davon.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das Toxin ausgewählt ist aus bakteriellen, Pflanzen-, Insekten-, Schlangen- und Spinnentoxinen.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das Toxin ein Ribosomeninaktivierendes Protein (RIP) ist.
Verwendung nach Anspruch 30, worin das RIP ein Typ-eins-RIP oder ein biologisch funktionelles Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 31, worin das Typ-eins-RIP ausgewählt ist aus Dianthin 30, Dianthin 32, Lychnin, Saporin-1, Saporin-2, Saporin-3, Saporin-4, Saporin-5, Saporin-6, Saporin-7, Saporin-8 und Saporin-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, Mapalmin, Dodecandrin, Bryodin-L, Bryodin, Colicin-1, Colicin-2, Luffin-A, Luffin-B, Luffin-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, α-Kirilowin, β-Kirilowin, Gelonin, Momordin, Momordin-II, Momordin-Ic, MAP-30, α-Momorcharin, β-Momorcharin, Trichosanthin, TAP-29, Trichokirin, Gersten-RIP, Tritin, Flachs-RIP, Getreide-RIP, Asparin-1 und Asparin-2.
Verwendung nach Anspruch 30, worin das RIP ein Typ-zwei-RIP, die katalytische Untereinheit davon oder eine biologisch funktionelle Untereinheit oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 33, worin das Typ-zwei-RIP ausgewählt ist aus Volkensin, Ricin, Nigrin-CIP-29, Abrin, Vircumin, Modeccin, Ebulitin-α, Ebulitin-β, Ebulitin-γ und Porrectin.
Verwendung nach Anspruch 24, worin das Toxin ein Bakterientoxin ist, ausgewählt aus Pseudomonas-Exotoxin, Diphtherie-Toxin, Shigatoxin, Shiga-ähnlichen Toxinen, katalytischen Untereinheiten davon und biologisch funktionellen Fragmenten davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–35, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientierte zytotoxische Agens direkt über eine kovalente oder ionische Bindung verbunden sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–35, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientierte zytotoxische Agens über einen Linker verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 37, worin der Linker ein Polypeptid oder ein chemischer Linker ist.
Verwendung nach Anspruch 37, worin der chemische Linker ein heterobifunktioneller, spaltbarer Vernetzer ist.
Verwendung nach Anspruch 39, worin der chemische Linker ausgewählt ist aus N-Succinimidyl (4-Iodacetyl)-aminobenzoat, Sulfosuccinimidyl (4-Iodacetyl)-aminobenzoat, 4-Succinimidyl-oxycarbonyl-α-(2- pyridyldithio)toluol, Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α-(pyridyldithiol)-toluamido]-hexanoat; N-Succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionat, Succinimidyl 6[3(-2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Sulfosuccinimidyl 6[3(-2-pyridyldithio)-propionamidolhexanoat, 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid, Ellman's Reagenz, Dichlortriazinsäure und S-(2-thiopyridyl)-L-Cystein.
Verwendung nach Anspruch 37, worin der Linker ein Peptid oder eine Aminosäure ist.
Verwendung nach Anspruch 41, worin das Peptid zwischen 1 und 60 Aminosäuren umfasst.
Verwendung nach Anspruch 42, worin der Linker ausgewählt ist aus Peptiden, weiche die sterische Behinderung zwischen dem zielorientierten zytotoxischen Agens und dem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens verringern, intrazellulären Enzymsubstraten, Linkern, welche die Flexibilität des Konjugats erhöhen, Linkern, welche die Löslichkeit des Konjugats erhöhen, Linkern, welche die Serumstabilität des Konjugats erhöhen, photospaltbaren Linkern und säurespaltbaren Linkern.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–43, worin der Chemokinrezeptor ein Mitglied der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rhodopsin-ähnlichen Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen ist.
Verwendung nach Anspruch 44, worin der Chemokinrezeptor ausgewählt ist aus DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX3CR-1, XCR-1 und CD97.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–45, weiter umfassend ein Nichtchemokin-Zytokin oder ein Rezeptor-assoziiertes Protein, welches an andere Rezeptoren als Chemokinrezeptoren auf einer oder mehreren der Zellen, welche Sekundärgewebeschäden fördern, bindet und/oder eine oder mehrere der Zellen aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 46, worin das Rezeptor-assoziierte Protein ein Molekulargewicht von etwa 38 bis 40 kDa besitzt und an ein Mitglied der Rezeptorfamilie der Lipoproteine mit niederer Dichte (LDL) bindet und dessen Aktivität moduliert.
Verwendung nach Anspruch 47, worin der LDL-Rezeptor ausgewählt ist aus den acylierten LDL-Radikalfänger-Rezeptoren 1 und 2, LDL, VLDL-1, VLDL-2, Glycoprotein 330/Megalin, LRP Alpha-2-Makroglobulin und sorLA-1-Rezeptoren.
Verwendung nach Anspruch 46, worin das Zytokin an einen Zytokinspezifischen Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 46, worin das Zytokin ausgewählt ist aus Interleukinen, Lymphokinen, Monokinen, Kolonie-stimulierenden Faktoren und Rezeptor-assoziierten Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 46, worin das Zytokin ausgewählt ist aus EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 und IL-13.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–22, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-spezifisches Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 52, worin der Antikörper spezifisch ist für ein Antigen, ausgewählt aus DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX3CR-1, XCR-1 und CD97.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–45, weiter umfassend einen Antikörper, der an einen Nichtchemokin-Zytokinrezeptor und/oder ein Nichtchemokin-Zytokin bindet.
Verwendung eines Konjugats, umfassend ein zielorientiertes Agens und ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens oder einen Teil davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung pathologischer Bedingungen, die verbunden sind mit Entzündungsreaktionen und einem Sekundärgewebeschaden, verbunden mit der Aktivierung, Proliferation und Migration von Immuneffektorzellen, durch Hemmung der Aktivierung, Proliferation oder Migration von Immuneffektorzellen in einem Tier, wobei die Aktivierung, Proliferation, Migration der Immuneffektorzellen gehemmt wird, wodurch die Entzündungsreaktion gehemmt wird, worin: das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Chemokin, ein Antikörper, der spezifisch an einen Chemokinrezeptor bindet, oder ein Fragment des Chemokins oder Antikörpers ist, worin das Chemokin, der Antikörper oder das Fragment davon an den Rezeptor bindet und das zielorientierte Agens in eine Zelle internalisiert; das zielorientierte Agens oder ein Teil davon, wenn es in eine Zelle internalisiert wird, den Metabolismus oder die Genexpression in der Zelle verändert, die Proteinsynthese in der Zelle reguliert oder verändert, die Proliferation der Zelle hemmt oder die Zelle tötet; und das Konjugat an einen Chemokinrezeptor bindet, was in der Internalisierung des zielorientierten Agens in Zellen, die den Rezeptor tragen, resultiert.
Verwendung nach Anspruch 55, worin die Entzündungsreaktion in einem Sekundärgewebeschaden resultiert.
Verwendung nach Anspruch 55 oder 56, worin die Zellen Leukozyten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 55–57, worin die Zellen ausgewählt sind aus mononukleären Phagozyten (MNP), Leukozyten, natürlichen Killerzellen, dendritischen Zellen, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 55–58, worin das Nichtchemokin-Zytokin ausgewählt ist aus EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 und IL-13.
Verwendung nach Anspruch 55, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Chemokin ist.
Verwendung eines Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens in Verbindung mit einem zielorientierten Agens bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur gezielten Verabreichung des zielorientierten Agens in Zellen, welche Chemokinrezeptoren exprimieren, worin die Zellen Leukozyten sind, das zielorientierte Agens irgendein Agens ist für eine Internalisierung in die Zellen durch Bindung an ein Ansteuerungsagens, und dass bei der Internalisierung der zelluläre Metabolismus, das Wachstum, die Aktivität, die Lebensfähigkeit oder eine andere Eigenschaft oder ein charakteristisches Merkmal der Zellen verändert oder beeinflusst wird; ein Ansteuerungsagens ein Molekül oder Ligand ist, der spezifisch an einen Chemokinrezeptor auf den Zellen bindet und die Internalisierung des zielorientierten Agens beeinflusst; und das Ansteuerungsagens das zielorientierte Agens zu Rezeptoren auf Leukozyten leitet, wobei die Verbindung von den Zellen internalisiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 55–61, worin das therapeutische Agens verabreicht wird durch ein Verfahren, ausgewählt aus topischer, lokaler, intraartikulärer, intrazisternaler, intraokularer, intraventrikulärer, intrathekaler, intravenöser, intramuskulärer, intratrachealer, intraperitonealer, intradermaler Verabreichung und einer Kombination von zwei beliebigen oder mehr davon.
Verwendung nach Anspruch 56, worin der Sekundärgewebeschaden aus einer Rückenmarksverletzung oder einem Trauma resultiert.
Verwendung nach Anspruch 55 oder Anspruch 56, worin die Entzündungsreaktion verbunden ist mit einem Krankheitszustand, ausgewählt aus einer ZNS-Verletzung, ZNS-Entzündungskrankheiten, neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankung, entzündlichen Augenerkrankungen, entzündlichen Darmerkrankungen, entzündlichen Gelenkerkrankungen, entzündlichen Nierenerkrankungen oder Nierenleiden, entzündlichen Lungenerkrankungen, entzündlichen Nasenerkrankungen, entzündlichen Schilddrüsenerkrankungen und Zytokin-regulierten Krebsarten.
Konjugat, umfassend ein zielorientiertes Agens, umfassend ein zytotoxisches Agens oder eine Nukleinsäure, die für ein zytotoxisches Agens codiert, und ein Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens, ausgewählt aus einem Chemokin oder einem Teil davon und einem Antikörper, welches/der an einen Chemokinrezeptor oder einen Teil davon bindet, worin: das Konjugat an einen Chemokinrezeptor bindet, was in einer Internalisierung des gebundenen zielorientierten Agens in Zellen, die den Rezeptor tragen, resultiert; worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens spezifisch an Chemokinrezeptoren auf mononukleären Phagozyten (MNP), Leukozyten, natürlichen Killerzellen, dendritischen Zellen, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten bindet; und das Chemokin ausgewählt ist aus IL-8, GCP-2, GRP-γ, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, IP-10, SDF-1α, SDF-1β, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, Eotaxin-1, Eotaxin-2, I-309, SCYA17, Tim-1, TARC, RANTES, DC-CK-1, Lymphotactin, ALP, Lungkine und Fractalkine.
Konjugat nach Anspruch 65, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Chemokin ist, ausgewählt aus Eotaxin-1, Eotaxin-2, MCP-1, MCP-3, SDF-1α, SDF-1β, I-309, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-3β, MIP-3β, MIP-4, MIP-5, RANTES und IL-8.
Konjugat nach Anspruch 65, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ALP oder Lungkine ist.
Konjugat nach Anspruch 65, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein Antikörper oder ein Teil davon ist, welcher an einen Chemokinrezeptor bindet, ausgewählt aus DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX3CR-1, XCR-1 und CD97.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–68, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens spezifisch an Chemokinrezeptoren auf Leukozyten bindet.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–68, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens spezifisch an Chemokinrezeptoren auf Zellen bindet, ausgewählt aus mononukleären Phagozyten (MNP), Leukozyten, natürlichen Killerzellen, dendritischen Zellen, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten.
Konjugat nach Anspruch 69, worin die Leukozyten ausgewählt sind aus Basophilen, Neutrophilen, Eosinophilen und Kombinationen aus beliebigen zwei oder mehreren davon.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–71, worin das zielorientierte Agens ein Toxin oder eine Nukleinsäure ist.
Konjugat nach Anspruch 72, worin das Zelltoxin ein DNA-spaltendes Agens ist.
Konjugat nach Anspruch 73, worin das DNA-spaltende Agens ausgewählt ist aus Anthrachinon-Oligopyrrolcaboxamid, Benzimidazol, Leinamycin, Dynemycin A, Enediyne, Endiynchinoniminen, 2,2r-Bis(2-aminoethyl)-4-4'-bithiazol, Epilliticin-Salen.Kupfer-Konjugaten und funktionellen Analoga oder Derivaten davon.
Konjugat nach Anspruch 72, worin das Toxin ein Antimetabolit ist.
Konjugat nach Anspruch 75, worin der Antimetabolit ausgewählt ist aus 5-Fluoruracil, Methotrexat, Melphalan, Daunomycin, Doxorubicin, Stickstofflost, Mitomycin C und funktionellen Analoga oder Derivaten davon.
Konjugat nach Anspruch 72, worin das Toxin ausgewählt ist aus bakteriellen, Pflanzen-, Insekten-, Schlangen- und Spinnentoxinen.
Konjugat nach Anspruch 77, worin das Toxin ein Ribosomeninaktivierendes Protein (RIP) ist.
Konjugat nach Anspruch 78, worin das RIP ein Typ-eins-RIP oder ein biologisch funktionelles Fragment davon ist.
Konjugat nach Anspruch 79, worin das Typ-eins-RIP ausgewählt ist aus Dianthin 30, Dianthin 32, Lychnin, Saporin-1, Saporin-2, Saporin-3, Saporin-4, Saporin-5, Saporin-6, Saporin-7, Saporin-8 und Saporin-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, Mapalmin, Dodecandrin, Bryodin-L, Bryodin, Colicin-1, Colicin-2, Luffin-A, Luffin-B, Luffin-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, α-Kirilowin, β-Kirilowin, Gelonin, Momordin, Momordin-II, Momordin-Ic, MAP-30, α-Momorcharin, β-Momorcharin, Trichosanthin, TAP-29, Trichokirin, Gersten-RIP, Tritin, Flachs-RIP, Getreide-RIP, Asparin-1 und Asparin-2.
Konjugat nach Anspruch 78, worin das RIP ein Typ-zwei-RIP, die katalytische Untereinheit davon, oder eine biologisch funktionelle Untereinheit oder Fragment davon ist.
Konjugat nach Anspruch 81, worin das Typ-zwei-RIP ausgewählt ist aus Volkensin, Ricin, Nigrin-CIP-29, Abrin, Vircumin, Modeccin, Ebulitin-α, Ebulitin-β, Ebulitin-γ und Porrectin.
Konjugat nach Anspruch 77, worin das Toxin ein Bakterientoxin ist, ausgewählt aus Pseudomonas-Exotoxin, Diphtherie-Toxin, Shigatoxin, Shigaähnlichen Toxinen, katalytischen Untereinheiten davon und biologisch funktionellen Fragmenten davon.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–83, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientierte Agens direkt über eine kovalente oder ionische Bindung verbunden sind.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–83, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens und zielorientierte Agens über einen Linker verbunden sind.
Konjugat nach Anspruch 85, worin der Linker ein Polypeptid oder ein chemischer Linker ist.
Konjugat nach Anspruch 85, worin der chemische Linker ein heterobifunktioneller, spaltbarer Vernetzen ist.
Konjugat nach Anspruch 87, worin der chemische Linker ausgewählt ist aus N-Succinimidyl (4-Iodacetyl)-aminobenzoat, Sulfosuccinimidyl (4-Iodacetyl)-aminobenzoat, 4-Succinimidyl-oxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α-(pyridyldithiol)-toluamido]hexanoat; N-Succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionat, Succinimidyl 6[3(-2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Sulfosuccinimidyl 6[3(-2-pyridyldithio)-propionamido)-hexanoat, 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid, Ellman's Reagenz, Dichlortriazinsäure und S-(2-Thiopyridyl)-L-Cystein.
Konjugat nach Anspruch 85, worin der Linker ein Peptid oder eine Aminosäure ist.
Konjugat nach Anspruch 89, worin das Peptid zwischen 1 und 60 Aminosäuren umfasst.
Konjugat nach Anspruch 90, worin der Linker ausgewählt ist aus Peptiden, welche die sterische Behinderung zwischen dem zielorientierten zytotoxischen Agens und dem Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens verringern, intrazellulären Enzymsubstraten, Linkern, welche die Flexibilität des Konjugats erhöhen, Linkern, welche die Löslichkeit des Konjugats erhöhen, Linkern, welche die Serumstabilität des Konjugats erhöhen, photospaltbaren Linkern und säurespaltbaren Linkern.
Konjugat nach Anspruch 55, worin der Chemokinrezeptor ein Mitglied der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rhodopsin-ähnlichen Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–92, weiter umfassend ein Nichtchemokin-Zytokin oder ein Rezeptor-assoziiertes Protein, welches an andere Rezeptoren als Chemokinrezeptoren auf einer oder mehreren der Zellen, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern, bindet und/oder eine oder mehrere der Zellen aktiviert.
Konjugat nach Anspruch 93, worin das Rezeptor-assoziierte Protein ein Molekulargewicht von etwa 38 bis 40 kDa besitzt und an ein Mitglied der Rezeptorfamilie der Lipoproteine mit niederer Dichte (LDL) bindet und dessen Aktivität moduliert.
Konjugat nach Anspruch 94, worin der LDL-Rezeptor ausgewählt ist aus den acylierten LDL-Radikalfänger-Rezeptoren 1 und 2, LDL, VLDL-1, VLDL-2, Glycoprotein 330/Megalin, LRP α-2-Makroglobulin und sorLA-1-Rezeptoren.
Konjugat nach Anspruch 93, worin das Zytokin an einen Zytokinspezifischen Rezeptor bindet.
Konjugat nach Anspruch 93, worin das Zytokin ausgewählt ist aus Interleukinen, Lymphokinen, Monokinen, Kolonie-stimulierenden Faktoren und Rezeptor-assoziierten Proteinen.
Konjugat nach Anspruch 93, worin das Zytokin ausgewählt ist aus EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 und IL-13.
Konjugat nach Anspruch 65, worin das Chemokinrezeptor-Ansteuerungsagens ein monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-spezifisches Fragment davon ist.
Konjugat nach Anspruch 99, worin der monoklonale Antikörper spezifisch ist für ein Antigen, ausgewählt aus DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX3CR-1, XCR-1 und CD97.
Konjugat nach einem der Ansprüche 65–92, weiter umfassend einen Antikörper, der an einen Nichtchemokin-Zytokinrezeptor und/oder ein Nichtchemokin-Zytokin bindet.
Konjugat nach Anspruch 65, worin das zielorientierte Agens eine Nukleinsäure ist.
Konjugat nach Anspruch 65, welches ausgewählt ist aus OPL98104, OPL98112, OPL98108, OPL98102, OPL98110, OPL98106, OPL98101, OPL98109, OPL98105, OPL98103, OPL98111 und OPL98107.
Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche für ein Konjugat nach einem der Ansprüche 68–73, 75, 77–85, 89–101 und 103 codiert, worin das Konjugat ein zytotoxisches Agens umfasst, welches ein Polypeptid ist.
Plasmid, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 104.
Wirtszelle, umfassend das Plasmid nach Anspruch 105.
Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, umfassend: Kultivieren der Zelle nach Anspruch 106 unter Bedingungen, wobei ein Fusionprotein exprimiert wird, welches das Konjugat umfasst; und Isolieren des Fusionsproteins.
Nukleinsäure nach Anspruch 104, welche DNA ist. i 09. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Konzentration oder Menge eines Konjugats nach einem der Ansprüche 65–103 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 109 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Sekundärgewebeschadens und damit verbundenen Erkrankungszuständen, worin die Zusammensetzung die Proliferation, Migration oder physiologische Aktivität von Entzündungszellen, welche einen Sekundärgewebeschaden fördern, hemmt.