DE69907104T2

DE69907104T2 - Verfahren zur Herstellung von Polyguluronsäuren

Info

Publication number: DE69907104T2
Application number: DE69907104T
Authority: DE
Inventors: William Alan Marritt
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: JP2000034302A; US6770756B1; EP0987272B1; EP0987272A1; ATE238324T1; JP3932679B2; DE69907104D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Polyguluronsäuren, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind.
Von Polyguluronsäuren wird wegen ihrer hohen Affinität für Calciumionen erwartet, dass sie als Kesselsteinverhütungsmittel und Mittel zum Entfernen von Kesselsteinablagerungen brauchbar sind. Die biologische Abbaubarkeit von Polyguluronsäuren macht sie im Hinblick auf die Umweltverträglichkeit und die Abfallbeseitigung besonders wertvoll. Außerdem sind Polyguluronsäurederivate, in welchen ein hydrophobes Polymer an das reduzierende Ende der Polyguluronsäure kovalent gebunden ist, als Dispergiermittel in wässrigen Tintenzusammensetzungen mit dispergierten Pigmenten zur Verwendung beim Tintenstrahldrucken brauchbar. Außerdem wurde gezeigt, dass Polyguluronsäuren mit einem niedrigen Polymerisationsgrad eine das Wurzelwachstum fördernde Aktivität in Gerste aufweisen (M. Natsume et al., "Isolation and Characterization of Alginatederived Oligosaccarides with Root-Growth Promoting Activities," Carbohydrate Research, 258, 187-197 (1994)). Es wurde auch gezeigt, dass sie eine die Keimung und das Wachstum des Schösslings fördernde Aktivität in geschältem Reis und Tabakkallus aufweisen (Y. Yonemoto et al., "Promotion of Germination and Shoot Elogation of Some Plants by Alginate Oligomers Prepared with Bacterial Alginate Lyase", Journal of Fermentation and Bioengineering, 75, 68-70 (1993)). Auf der Grundlage von Untersuchungen anderer Polyuronsäuren kann man auch erwarten, dass Polyguluronsäuren mit niedrigem Molekulargewicht antivirale, antitumorale und die Pflanzenabwehr stimulierende Aktivitäten aufweisen.
Alginsäuren, aus denen Polyguluronsäuren erhalten werden können, sind unverzweigte Polymere aus 1 → 4 verknüpfter α-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M) mit variierenden Anteilen und variierender Sequenz. Eine typische Struktur eines Alginsäuremoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden:
Wie man aus der vorstehenden Struktur ersehen kann, ist die Verteilung von Monomeren in Alginsäure nicht statistisch und es gibt keine regelmäßige Wiederholungseinheit. Alginsäuren kann man am besten als Blockcopolymere beschreiben, in welchen es Polyguluronsäuresequenzen (G-Blöcke), Polymannuronsäuresequenzen (M-Blöcke) und Sequenzen, die statistische Anordnungen sowohl von Guluronsäure als auch von Mannuronsäure enthalten, (MG-Blöcke) gibt.
Es ist bekannt, dass Alginate, welches Salze von Alginsäure sind, hydrolysiert werden können und dass die Hydrolyseprodukte aufgetrennt werden können, so dass zwei vorwiegend homopolymere Fraktionen, nämlich Polyguluronsäure und Polymannuronsäure erhalten werden. Das am häufigsten zitierte Verfahren zur Herstellung des Natriumsalzes von Polyguluronsäure ist ein heterogenes saures Hydrolyseverfahren, das in A. Haug et al., "Studies on the Sequence of Uronic Acid Residues in Alginic Acid", Acta Chemica Scandinavica, 21, 691-704 (1967) beschrieben ist. Die darin beschriebene saure Hydrolyse erfordert, dass ein Teil Natriumalginat in zwanzig Teilen 0,3 M Chlorwasserstoffsäurelösung suspendiert wird. Da Alginsäure in der stark sauren Lösung unlöslich ist, ist die Hydrolyse eine heterogene Reaktion. Das heterogene Gemisch wird 10+ Stunden auf 100ºC erwärmt und anschließend wird der Feststoff von der sauren Lösung durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Nachdem der gesammelte Feststoff durch Neutralisieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst wurde, werden 20 Teile 0,3 M Chlorwasserstoffsäurelösung zu der Lösung zugegeben, was zu einer Wiederausfällung der teilweise hydrolysierten Alginsäure führt. Das resultierende heterogene Gemisch wird weitere 10+ Stunden auf 100ºC erwärmt und das feste Produkt wird erneut durch Zentrifugation oder Filtration von der sauren Lösung abgetrennt. Der gesammelte Feststoff wird durch Neutralisieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst und anschließend werden Natriumchlorid und Wasser zugegeben, um eine Lösung zu erhalten, welche einen Gehalt von 0,5 Gew.-% Alginsäure und 0,1 M Natriumchlorid aufweist. Ein ungefähr gleiches Volumen von 0,025 M Chlorwasserstoffsäurelösung wird zu der Alginsäuresalzlösung zugegeben, bis ein pH- Wert von 2,85 erhalten wird. Der ausgefällte Feststoff wird durch Zentrifugation oder Filtration von der sauren Lösung abgetrennt. Der isolierte Feststoff wird durch Neutrali sieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst und anschließend mit überschüssigem Alkohol gefällt. Der gefällte Feststoff wird mit Ethanol gewaschen, mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Natriumsalz der durch dieses heterogene saure Hydrolyseverfahren hergestellten Polyguluronsäure weist einen mittleren Polymerisationsgrad zwischen 15 und 20 auf. Der Mannuronsäuregehalt liegt zwischen 5 und 15% und die Ausbeute des Produkts liegt zwischen 15 und 20%.
Im Laufe des ersten Schrittes der heterogenen sauren Hydrolyse gehen ungefähr 30% des Alginats in Lösung. Weitere 15% des ursprünglichen Alginats gehen im Laufe des zweiten Schrittes in Lösung. Die unlösliche Fraktion, welche nach beiden Schritten isoliert wird, enthält sowohl Polyguluronsäure als auch Polymannuronsäure. Bei der Ansäuerung der verdünnten Lösung, die Natriumsalze sowohl von Polyguluronsäure als auch von Polymannuronsäure enthält, wird Polyguluronsäure selektiv ausgefällt.
Wenngleich das heterogene saure Hydrolyseverfahren von A. Haug et al. für die Herstellung von Polyguluronsäure im Labormaßstab geeignet ist, wäre es schwierig, sie in größerem Maßstab einzusetzen, beispielsweise in einem solchen, welcher bei einer industriellen Produktion verwendet werden würde. Der Grund dafür ist, dass bei dem Trennungsschritt dieses Verfahrens die Konzentration der Alginsäure nur sehr verdünnte 0,25 Gew.-% beträgt. Außerdem weist das Verfahren mehrere Schritte auf und ist kompliziert.
In der gleichen Literaturstelle, welche das heterogene saure Hydrolyseverfahren beschreibt, ist auch ein homogenes saures Hydrolyseverfahren angegeben. Bei diesem Verfahren wird eine 1 Gew.-%ige Natriumalginatlösung mit einem gleichen Volumen einer 0,025 M Citratpufferlösung vermischt, so dass eine kombinierte Lösung mit einem pH-Wert von 3,6 erhalten wird. Die Lösung wird 5+ Stunden zum Rückfluss erhitzt. Wenngleich ein Verfahren zum Isolieren von Polyguluronsäuren nicht angegeben ist, kann vermutlich ein ähnliches Verfahren wie das in dem heterogenen sauren Hydrolyseverfahren verwendete eingesetzt werden.
Wenngleich das homogene saure Hydrolyseverfahren von A. Haug et al. für die Herstellung von Polyguluronsäure im Labormaßstab brauchbar sein mag, wäre es ebenfalls schwierig, es in größerem Maßstab einzusetzen. In diesem Verfahren beträgt die Kon zentration von Natriumalginat in dem Hydrolyseschritt nur sehr verdünnte 0,5 Gew.-%. Wenngleich man sich leicht vorstellen kann, die Konzentration von Natriumalginat zu erhöhen, kann dies in der Praxis nicht durchgeführt werden. Bei Konzentrationen von etwas mehr als 0,5 Gew.-% bleibt Natriumalginat nicht während der gesamten Hydrolysereaktion in dem Bereich von pH-Werten, bei denen die saure Hydrolyse erfolgt, löslich. Die Spezies, welche im Laufe der Hydrolyse ausfallen, sind unvollständig hydrolysiert und wenngleich sie reich an Guluronsäure sind, enthalten sie erhebliche Mengen an Mannuronsäure. Außerdem weisen die unvollständig hydrolysierten Spezies Polymerisationsgrade von mehr als 20 auf. Da die Bedingungen der homogenen sauren Hydrolyse milder sind als die vorstehend beschriebenen Bedingungen in dem heterogenen sauren Hydrolyseverfahren, werden die unvollständig hydrolysierten Spezies nach dem Ausfällen aus der Lösung nicht weiter hydrolysiert.
Somit besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, welches in großtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann. Speziell besteht ein Bedarf für ein Hydrolyseverfahren, in welchem die Konzentration von Alginsäure oder einem Alginatsalz während des gesamten Verfahrens mehr als 5 Gew.-% beträgt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein praktisches Verfahren zur Herstellung von Polyguluronsäuren bereit zu stellen, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass Alginatsalze von organischen Basen in einer wässrigen Lösung ziemlich löslich sind. Außerdem hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass diese Salze während einer Hydrolysereaktion in dem Bereich von pH-Werten, bei denen die Hydrolyse mit einer vernünftig hohen Geschwindigkeit erfolgt, in einer wässrigen Lösung löslich bleiben. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Feststellungen zustande gebracht worden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren bereit gestellt, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und weniger als 8 Gew.-% Mannuronsäure enthalten, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Lösung, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält, hergestellt durch Auflösen von Alginsäure durch Neutralisation mit einer organischen Base;
(b) Hydrolysieren der Alginsäure zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht, einschließlich Polyguluronsäuren, bei pH 3,2 bis 5,0;
(c) Ansäuern der Lösung, um Polyguluronsäuren bei pH 3,0 bis 3,6 selektiv auszufällen; und
(d) Abtrennen der Polyguluronsäuren von der angesäuerten Lösung.
Fig. 1 ist ein Diagramm, das ein ¹H-NMR-Spektrum (chemische Verschiebung = 4,6 bis 5,2 ppm) eines Hydrolysats zeigt, das in dem nachstehend beschriebenen Beispiel erhalten wird.
Die Polyguluronsäuren, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, weisen einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 auf und sind im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung. Der Ausdruck "im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung", bedeutet so, wie er hier verwendet wird, dass der Mannuronsäuregehalt weniger als 8 Gew.-% und vorzugsweise weniger als 5 Gew.-% beträgt.
Wie vorstehend angemerkt wurde, kann eine homogene saure Hydrolyse, in welcher Natriumalginat als das Ausgangsmaterial verwendet wird, nicht bei Konzentrationen durchgeführt werden, die erheblich größer sind als 0,5 Gew.-%. Die Situation ist ähnlich für andere Alkalimetallsalze von Alginsäure, darunter Lithiumalginat, Kaliumalginat, Rubidiumalginat und Cäsiumalginat, und Ammoniumalginat. Alginatsalze von anderen Metallen als Alkalimetallen sind in einer wässrigen Lösung unlöslich oder schwer löslich und können somit in einer homogenen sauren Hydrolyse nicht verwendet werden.
Andererseits sind Alginatsalze von organischen Basen insofern sehr vorteilhaft, als sie in einer wässrigen Lösung ziemlich löslich sind und während einer Hydrolysereaktion in dem Bereich von pH-Werten, bei denen die Hydrolyse mit einer vernünftig hohen Geschwindigkeit erfolgt, in einer wässrigen Lösung löslich bleiben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gehören zu organischen Basen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, organische Amine (z. B. Mono-, Di- und Trialkyl(vorzugsweise C&sub1;&submin;&sub8;-alkyl, mehr bevorzugt C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl)amine, Tetraalkyl(vorzugsweise C&sub1;&submin;&sub8;-alkyl, mehr bevorzugt C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl)ammoniumhydroxide, und aromatische Amine), Tetraarylphosphoniumhydroxid, Tetraarylarsoniumhydroxid und Tetraarylstiboniumhydroxid.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die organische Base aus zwei Gründen ein relativ niedriges Molekulargewicht auf. Erstens sind organische Basen mit niedrigem Molekulargewicht selbst vor einer Protonierung in Wasser nennenswert löslich. Zweitens ergeben organische Basen mit niedrigem Molekulargewicht Salze von Alginsäure, für welche die Viskosität einer wässrigen Lösung geringer ist als die Viskosität einer vergleichbaren Lösung, die unter Verwendung einer organischen Base mit höherem Molekulargewicht hergestellt wurde.
Zu Beispielen für organische Basen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Tetramethylammoniumhydroxid, Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tetraethylammoniumhydroxid, n-Propylamin, Di-n-propylamin, Tri-n-propylamin, Tetra-n-propylammoniumhydroxid, Isopropylamin, Diisopropylamin, N-Methyl-ethylamin, N-Methyl-n-propylamin, N-Methyl-isopropylamin, N,N-Dimethyl-ethylamin, N,N-Dimethyl-n-propylamin, N,N-Dimethyl-isopropylamin, N,N-Diethyl-n-propylamin, N,N-Diethyl-isopropylamin, N,N-Di-n-propyl-isopropylamin, N-Ethyl-n-propylamin, N-Methyl-diethylamin, N-Ethyl-di-n-propylamin, N-Ethyldi-isopropylamin, N-Propyl-di-isopropylamin, N-Methyl-N-ethyl-n-propylamin, N-Methyl- N-ethyt-isopropylamin, N-Methyl-N-n-propyl-isopropylamin, N-Ethyl-N-n-propyl-isopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, N-Methyl-monoethanolamin, N,N-Dimethyl-monoethanolamin, N-Ethyl-monoethanolamin, N,N-Diethyl-monoethanolamin, N-Methyl-N-ethyl-monoethanolamin, N-Methyl-diethanolamin, N-Ethyl-diethanolamin, Morpholin, N-Methyl-morpholin, N-Ethyl-morpholin, Imidazol, N-Methyl-imidazol, Pyridin, 2-Picolin, 3-Picolin, 4-Picolin, Tetraphenylphosphoniumhydroxid, substituiertes Tetraphenylphosphoniumhydroxid, Tetraphenylarsoniumhydroxid, substituiertes Tetra phenylarsoniumhydroxid, Tetraphenylstiboniumhydroxid und substituiertes Tetraphenylstiboniumhydroxid. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Familie von Methylaminen - Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Tetramethylammoniumhydroxid - verwendet, da die Viskositäten der resultierenden Lösungen von Alginsäuresalzen relativ niedrig sind.
Die Alginsäure, die als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung verwendet soll, kann eine beliebige Alginsäure sein. Ferner kann eine beliebige im Handel erhältliche Alginsäure verwendet werden. Da Polyguluronsäure das beabsichtigte Produkt ist, ist eine Alginsäure, welche reich an Guluronsäure ist, bevorzugt. Zum Beispiel sind Alginsäuren, die aus den Meeresalgen Laminaria hyperborea und Lessonia flavicans extrahiert werden, besonders reich an Guluronsäure und weisen Guluronsäure zu Mannuronsäure-Verhältnisse von ungefähr zwei zu eins auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird, um die Viskosität der Hydrolyselösung relativ niedrig zu halten, eine Alginsäure mit einem niedrigen mittleren Molekulargewicht als Ausgangsmaterial bevorzugt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Alginsäure mit einem Molekulargewicht von weniger als oder gleich 50000 g/mol verwendet. Natriumsalze von Alginsäure mit mittleren Molekulargewichten von 10000 g/mol sind derzeit von Kimitsu Chemical Industries (Produktname: ULV-LIG) und Fuji Chemical Industries (Produktname: Snow Algin ULV-51) im Handel erhältlich. Ein besonders brauchbares Alginsäureausgangsmaterial kann durch Ansäuern einer Lösung von einem von diesen Natriumsalzen auf einen pH-Wert von 2 oder weniger und anschließend Sammeln des Feststoffs durch Filtration oder Zentrifugation leicht erhalten werden.
Als erster Schritt in der vorliegenden Erfindung wird die Alginsäure durch Neutralisation mit einer organischen Base in Wasser gelöst, so dass eine Lösung erhalten wird, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält. Ein leichter Überschuss der organischen Base kann verwendet werden, um die Neutralisation zu bewirken, wobei der pH der resultierenden Lösung im Bereich von 5 bis 9 liegt. Bei handelsüblichen Qualitäten der Alginsäure enthält die resultierende Lösung im Allgemeinen kleine Mengen an unlöslichen Verunreinigungen, welche vor dem sauren Hydrolyseschritt durch Filtration leicht entfernt werden können.
In dem nächsten Schritt wird die Alginsäure zu Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht, darunter Polyguluronsäuren, hydrolysiert. Die Hydrolyse wird unter sauren Bedingungen, vorzugsweise mit Erwärmen durchgeführt. Der pH-Wert liegt im Bereich von 3,2 bis 5,0, bevorzugt im Bereich von 3,5 bis 4,2. Diese Acidität kann durch die Zugabe einer beliebigen wasserlöslichen Säure herbeigeführt werden und zu Beispielen für bevorzugte Säuren, die hier verwendet werden können, gehören Chlorwasserstoffsäure und Milchsäure. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert der Lösung während der Hydrolyse kontinuierlich eingestellt. Der Grund dafür ist, dass man festgestellt hat, dass der pH der Lösung im Laufe der Hydrolyse nach und nach zunimmt. Wenngleich der Grund für diese allmähliche Zunahme des pH-Werts nicht untersucht wurde, ist sie vermutlich auf die Zersetzung der hydrolysierten Mannuronsäurefragmente, möglicherweise durch Decarboxylierung, zurückzuführen. Die Einstellung des pH-Werts kann durch die Verwendung von handelsüblichen Dosiereinrichtungen erfolgen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwenden solche Einrichtungen eine pH-Elektrode als Sensor, der mit einer oder mehreren Spritzenpumpen rückgekoppelt ist, welche Säure oder Base zugeben, um den pH der Lösung auf einem eingestellten Wert zu halten.
Eine Temperatur von 80ºC oder höher ist zum Durchführen der Hydrolysereaktion bevorzugt. Wenngleich Temperaturen von weniger als 80ºC verwendet werden können, ist die Hydrolysegeschwindigkeit entsprechend langsamer. Die Hydrolysereaktion kann auch in Druckgefäsen durchgeführt werden, so dass Temperaturen verwendet werden können, die größer sind als der Siedepunkt von Wasser. Eine Temperatur von weniger als 120ºC ist bevorzugt, da eine nichtselektive Zersetzung der Polysaccharidprodukte in Konkurrenz zu der Hydrolysereaktion bei Temperaturen von mehr als 120ºC in erheblichem Maße auftritt.
Der Hydrolyseschritt kann unter einer Umgebungsatmosphäre oder einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden, wobei eine inerte Atmosphäre bevorzugt ist, da die Luftoxidation der Produkte minimiert wird. Eine inerte Atmosphäre aus hochreinem Stickstoff ist unter Kostengesichtspunkten bevorzugt.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Reaktion während eines Zeitraums ablaufen gelassen, der zum Vervollständigen der Hydrolyse ausreicht. Der Zeitraum, welcher zum Hydrolysieren der Alginsäure zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht einschließlich Polyguluronsäuren ausreicht, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Ein Faktor ist die Temperatur der Reaktion. Ein zweiter Faktor ist die Ausgangskonzentration der Alginsäure. Ein dritter Faktor ist das mittlere Molekulargewicht des Alginsäureausgangsmaterials. Ein vierter Faktor ist der pH-Wert der Hydrolyselösung. Um die Vollständigkeit der Hydrolysereaktion zu bestimmen, kann eine Reihe von analytischen Methoden verwendet werden. Am einfachsten kann die Viskosität der Hydrolyselösung überwacht werden und die Reaktion als vollständig angesehen werden, wenn ein stabiler Wert erhalten wird. Alternativ können Aliquots der Lösung in periodischen Abständen entnommen werden, die Polyguluronsäurefraktion isoliert werden und die Polyguluronsäurefraktion durch eine Reihe von Methoden analysiert werden. Zu brauchbaren Methoden gehören ¹H-NMR, Gelpermeationschromatographie und Kleinwinkellichtstreuung.
Wenn die Hydrolyse für vollständig gehalten wird, wird die Lösung auf Umgebungstemperatur gekühlt und wird die Lösung weiter angesäuert, um Präzipitate von Polyguluronsäuren zu erhalten. Der pH-Bereich des Ansäuerungsschrittes, in welchem Polyguluronsäuren selektiv ausgefällt werden, bezieht sich speziell auf einen pH-Bereich, in welchem Polyguluronsäuren selektiv ausgefällt und somit von Polymannuronsäuren abgetrennt werden. Der pH-Wert liegt im Bereich von 3,0 bis 3,6, vorzugsweise im Bereich von 3,1 bis 3,5. Die berichteten pKa-Werte von Polyguluronsäure und Polymannuronsäure sind 3,65 bzw. 3,38. Auf der Grundlage dieses Unterschieds führt die Ansäuerung in dem pH-Bereich der vorliegenden Erfindung zu einer selektiven Ausfällung von Polyguluronsäuren gegenüber Polymannuronsäuren, welche in Lösung bleiben. In diesem pH-Bereich sind möglicherweise nicht alle Carbonsäuregruppen der Polyguluronsäure protoniert und einige organische Basensalze können zusammen mit der Polyguluronsäure ausfallen. Falls dies für die Anwendung, in welcher die Polyguluronsäure verwendet werden soll, ein Problem darstellt, kann die selektiv ausgefällte Polyguluronsäure isoliert, in Wasser gelöst und anschließend durch Ansäuerung auf einen pH-Wert von weniger als 2 wieder ausgefällt werden. Die Ansäuerung für die Ausfällung von Polyguluronsäure kann durch die Zugabe einer beliebigen wasserlöslichen Säure erfolgen. Zu Beispielen für bevorzugte Säuren gehören Chlorwasserstoffsäure und Milchsäure.
Nach der selektiven Ausfällung werden die Polyguluronsäuren von der angesäuerten Lösung durch herkömmliche Verfahren abgetrennt. Zu solchen Verfahren gehören eine Filtration und eine Zentrifugation. Das Produkt kann anschließend mit angesäuertem Wasser und/oder einer wässrigen Alkohollösung gewaschen werden und anschließend durch herkömmliche Verfahren getrocknet werden.
Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Polyguluronsäuren weisen einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 auf und enthalten weniger als 8% Mannuronsäure, bestimmt durch ¹H-NMR. Eine Probe für die NMR-Analyse wird durch Auflösen der Polyguluronsäure in Deuteriumoxid (D&sub2;O) durch Neutralisation mit einer Lösung von Natriumdeuteroxid (NaOD) in D&sub2;O hergestellt. Bei 90ºC treten die H-1- Peaks (im Inneren) von Guluronsäure und Mannuronsäure in Polyguluronsäuren bei 5,05 ppm bzw. 4,67-4,70 ppm, bezogen auf den internen Vergleichsstandard Natrium- 3-(trimethylsilyl)propionat-d&sub4; auf. Aus den integrierten Flächen dieser zwei Peaks kann die Menge der Mannuronsäureverunreinigung in dem Polyguluronsäureprodukt berechnet werden. Bei 90ºC treten die H-1-Peaks (am reduzierenden Ende) der α- und β- Anomere von Polyguluronsäure und Polymannuronsäure bei 5,21 ppm bzw. 4,84 - 4,89 ppm, bezogen auf den internen Vergleichsstandard Natrium-3-(trimethylsilyl)propionat-d&sub4; auf. Aus einem Vergleich der kombinierten integrierten Flächen der α- und β- Anomerenpeaks mit den kombinierten integrierten Flächen aller H-1-Peaks (α-Anomerenpeak, β-Anomerenpeak, H-1-Peak (im Inneren) von Guturonsäure in der Polyuronsäure, H-1-Peak (im Inneren) von Mannuronsäure in der Polyuronsäure) kann der Polymerisationsgrad des Polyguluronsäureproduktes berechnet werden.

BEISPIEL

Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende spezielle Beispiel weiter erläutert.

(1)ALGINSÄURE

Die in dem folgenden speziellen Beispiel verwendete Alginsäure wurde aus einem handelsüblichen Natriumalginat (Kimitsu Chemical Industries; Produktname: ULV-LIG; mittleres Molekulargewicht: 10000) hergestellt. 200 g ULV-LIG wurden in 1,8 Liter entioni siertem Wasser gelöst, wobei gerührt wurde. Während die Lösung gerührt wurde, wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure tropfenweise zugegeben, was zur Ausfällung von Alginsäure führte. Die Zugabe von Chlorwasserstoffsäure wurde fortgesetzt, bis der pH des Gemisches einen Wert von 0,90 erreichte. Das Gemisch wurde weitere 4 Stunden gerührt und anschließend beiseite gestellt und 12 Stunden stehen gelassen. Der größte Teil des klaren Überstands wurde verworfen und das verbleibende Gemisch wurde durch ein #2 Whatman-Filterpapier filtriert, um den gebrochen weißen Feststoff zu sammeln. Der Feststoff wurde mehrere Tage luftgetrocknet und anschließend unter Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet.

(2) HERSTELLUNG VON POLYGULURONSÄURE

100 g Alginsäure wurden in 700 ml entionisiertem Wasser in einem 1000 ml-Becher aufgeschlämmt. Zu dieser Aufschlämmung wurden 150 g wässrige Trimethylaminlösung (30 Gew.-%) unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde auf 40ºC erwärmt und das Rühren wurde 4 Stunden fortgesetzt, zu welchem Zeitpunkt sich die Alginsäure im Wesentlichen aufgelöst hatte. Die Lösung wurde dann durch ein #5 Whatman-Filterpapier filtriert, um eine kleine Menge an unlöslichen Verunreinigungen zu entfernen. Das Filtrat wurde in einen 2 l-Zweihalsrundkolben überführt, der mit einem magnetischen Rührstab ausgestattet war. Die Lösung wurde unter Rühren auf 90ºC erwärmt und anschließend wurde 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung tropfenweise zu der Lösung zugegeben, bis der pH einen Wert von ungefähr 3,9 erreichte, welcher mit Hydrion Microfine pH-Testpapier mit einem Bereich von 2,9 bis 5,2 bestimmt wurde. Ein Rückflusskühler, der mit einer Stickstoffeinlassleitung und einer Waschflasche verbunden war, wurde in einen der Hälse des Kolbens eingesteckt und ein Glasstopfen wurde in den anderen Hals des Kolbens gesteckt. Die Lösung wurde dann 12 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Während dieses Zeitraums wurde der pH in periodischen Abständen durch Probenahme durch den Einlass bestimmt, welcher mit dem Glasstopfen verschlossen war, und 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung wurde je nach Bedarf zugegeben, um den pH der Lösung auf einem Wert von ungefähr 3,9 zu halten. Nach diesem 12-stündigen Rückfluss wurde der pH durch die tropfenweise Zugabe von 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung auf einen Wert von ungefähr 3,8 weiter verringert. Die Lösung wurde dann weitere 12 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Während dieses Zeitraums wurde der pH in periodischen Abständen durch Probennahme durch den Einlass, welcher mit dem Glasstopfen verschlossen war, bestimmt und 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung wurde je nach Bedarf zugegeben, um den pH der Lösung auf einem Wert von ungefähr 3,8 zu halten. Nach diesem 12-stündigen Rückfluss wurde der pH durch die tropfenweise Zugabe von 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung auf einen Wert von ungefähr 3,7 weiter verringert. Die Lösung wurde dann weitere 12 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Während dieses Zeitraums wurde der pH in periodischen Abständen durch Probennahme durch den Einlass, welcher mit dem Glasstopfen verschlossen war, bestimmt und 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung wurde je nach Bedarf zugegeben, um den pH der Lösung auf einem Wert von ungefähr 3,7 zu halten. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und anschließend auf einen pH-Wert von 3, 3 angesäuert, wobei 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung verwendet wurde. Das Gemisch wurde 12 Stunden beiseite gestellt, wobei sich in dieser Zeit die feste Polyguluronsäure am Boden des Kolbens absetzte. Der pH-Wert wurde erneut gemessen und weitere 1 M Chlorwasserstoffsäure wurde zugegeben, um den pH-Wert wieder auf 3, 3 einzustellen. Der Feststoff wurde Vakuumfiltration an einem Glasfrittenfilter mit feiner Porosität gesammelt und dann mehrmals mit 50 Gew.-%iger wässriger Methanollösung gewaschen. Der Feststoff wurde mit weiteren Portionen von Methanol weiter gewaschen und beiseite gestellt, um an der Luft zu trocknen. Schließlich wurde der Feststoff unter Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Die Ausbeute des Produkts betrug 19,5 g. Ungefähr 10 mg der Probe wurden in 0,4 ml Deuteriumoxid durch Zugabe einer kleinen Menge von Natriumdeuteroxid in Deuteriumoxid unter Verwendung einer Mikrospritze gelöst. Das ¹H-NMR-Spektrum wurde bei 80ºC gemessen und die Peaks, die dem H-1-Peak (im Inneren) von Guluronsäure in Polyguluronsäuren, dem H-1-Peak (im Inneren) von Mannuronsäure in Polyuronsäuren, dem H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der α-Anomere und dem H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der β-Anomere entsprechen, wurden integriert. Die Integrationswerte sind in der nachstehend gezeigten Tabelle 1 angegeben. Dieser Bereich des Spektrums ist in Fig. 1 gezeigt. Tabelle 1
Die Menge der Mannuronsäureverunreinigung in dem Polyguluronsäureprodukt wurde aus den Integrationswerten für die H-1-Peaks (im Inneren) von Guluronsäure und Mannuronsäure berechnet. Die Berechnung ist wie folgt:
Mannuronsäureverunreinigung (%) = 100 · 0,0707/(0,0707 + 1,0000) = 6,6%
Der Polymerisationsgrad des Polyguluronsäureprodukts wurde aus den kombinierten integrierten Flächen der α- und β-Anomerenpeaks und den kombinierten integrierten Flächen aller H-1-Peaks (α-Anomerenpeak, β-Anomerenpeak, H-1-Peak (im Inneren) von Guluronsäure in Polyuronsäure, H-1-Peak (im Inneren) von Mannuronsäure in Polyuronsäure) berechnet. Die Berechnung ist wie folgt:
Polymerisationsgrad = (0,0707 + 1,0000 + 0,0611 + 0,0154)/(0,0611 + 0,0154) = 15

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und weniger als 8 Gew.-% Mannuronsäure enthalten, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Lösung, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält, hergestellt durch Auflösen von Alginsäure durch Neutralisation mit einer organischen Base;

(b) Hydrolysieren der Alginsäure zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht, einschließlich Polyguluronsäuren, bei pH 3,2 bis 5,0;

(c) Ansäuern der Lösung, um Polyguluronsäuren bei pH 3,0 bis 3,6 selektiv auszufällen; und

(d) Abtrennen der Polyguluronsäuren von der angesäuerten Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die organische Base ein organisches Amin, Tetraarylphosphoniumhydroxid, Tetraarylarsoniumhydroxid oder Tetraarylstiboniumhydroxid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die organische Base ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Tetramethylammoniumhydroxid und Gemischen davon.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hydrolyse bei einer Temperatur von 80ºC oder höher durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Molekulargewicht von Alginsäure nicht mehr als 50000 g/mol beträgt.