DE69906554T2

DE69906554T2 - P38 inhibitoren

Info

Publication number: DE69906554T2
Application number: DE69906554T
Authority: DE
Inventors: Francesco Salituro; Guy Bemis; Huai Gao
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-09-17
Also published as: US20040142927A1; EP1114051B1; CA2339253C; AR023659A1; MY117696A; AU761599B2; AU6152199A; DK1114051T3; PT1114051E; ES2192864T3; US7169779B2; CA2339253A1; US20020010170A1; US6635644B2; JP2002526501A; DE69906554D1; ATE236167T1; EP1114051A1; WO2000017204A1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren von p38, einer Säugerproteinkinase, die an Zellproliferation, Zelltod und der Reaktion auf extrazelluläre Reize beteiligt ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung dieser Inhibitoren. Die Erfindung stellt auch Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen Inhibitoren umfassen, und Verfahren zur Verwendung dieser Mittel bei der Behandlung und Verhinderung verschiedener Erkrankungen bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteinkinasen sind an verschiedenen Zellreaktionen auf extrazelluläre Signale beteiligt. Vor kurzem ist eine Familie mitogenaktivierter Proteinkinasen (MAPK) gefunden worden. Mitglieder dieser Familie sind Ser/Thr-Kinasen, die ihre Substrate durch Phosphorylierung aktivieren [B. Stein et al., Ann. Rep. Med. Chem., 31, S. 289–98 (1996)]. MAPKs werden selbst durch eine Vielfalt an Signalen einschließlich Wachstumsfaktoren, Cytokinen, UV-Strahlung und Streß auslösender Mittel aktiviert.
Eine besonders interessante MAPK ist p38. p38, auch als Cytokin unterdrückendes entzündungshemmenden Arzneistoff bindendes Protein (CSBP) und RK bekannt, wird aus murinen Prä-B-Lymphozyten isoliert, die mit dem Lipopolysaccharid-(LPS-)Rezeptor, CD14, transfiziert und mit LPS induziert werden. p38 ist seitdem isoliert und sequenziert worden, wie es die cDNA, die es bei Menschen und Maus kodiert, worden ist. Die Aktivierung von p38 ist bei Zellen beobachtet worden, die durch Streß, wie Behandlung von Lipopolysacchariden (LPS), UV, Anisomycin oder osmotischen Schock, und durch Behandlung mit Cytokinen, wie IL-1 und TNF, angeregt wurden.
Hemmung der p38-Kinase führt zu einer Blockade in der Erzeugung von sowohl IL-1 als auch TNF. IL-1 und TNF regen die Erzeugung anderer proentzündlicher Cytokine wie IL-6 und IL-8 an und sind mit akuten und chronischen Entzündungskrankheiten und der postmenopausalen Osteoporose in Verbindung gebracht worden [R. B. Kimble et al., Endocrinol., 136, S. 3054–61 (1995)].
Basierend auf diesem Befund glaubt man, dass p38 zusammen mit anderen MAPKs eine Rolle bei Vermittlung der zellulären Reaktion auf Entzündungsreize, wie Leukozytenakkumulation, Makrophagen/Monozytenaktivierung, Geweberesorption, Fieber, "Akute-Phasen-Reaktionen" und Neutrophilie, hat. Außerdem sind MAPKs, wie p38, mit Krebs, Thrombin-induzierter Blutplättchenaggregation, Immunschwächeerkrankungen, Autoimmunkrankheiten, Zelltod, Allergien, Osteoporose und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Inhibitoren von p38 sind mit dem Gebiet des Schmerzmanagements durch Hemmung der Prostaglandinendoperoxidsynthase-2-Induktion in Zusammenhang gebracht worden. Andere Erkrankungen, die mit der Überproduktion von IL-1, IL-6, IL-8 oder TNF in Zusammenhang stehen, sind in WO 96/21654 dargelegt.
Andere haben schon begonnen, zu versuchen, Arzneistoffe zu entwickeln, die speziell MAPKs hemmen. Zum Beispiel beschreibt die PCT-Veröffentlichung WO 95/31451 Pyrazolverbindungen, die MAPKs und insbesondere p38 hemmen. Die PCT-Veröffentlichung WO 98/27098 beschreibt auch substituierte stickstoffhaltige Heterocyclen als p38-Hemmstoffe. Jedoch wird die Wirksamkeit dieser Inhibitoren in vivo noch untersucht.
Folglich besteht noch ein großer Bedarf an der Entwicklung anderer starker, p38-spezifischer Hemmstoffe, die zur Behandlung verschiedener Beschwerden, die mit einer p38-Aktivierung in Zusammenhang stehen, nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesem Problem durch Bereitstellung von Verbindungen, die starke und spezifische Hemmung von p38 zeigen.
Diese Verbindungen haben die allgemeinen Formeln:
pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
HET ist ein 5- bis 7-gliedriger Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, S- oder O-Atomen, wobei der Heterocyclus mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkylresten substituiert ist. HET kann gegebenenfalls mit einem Halogenatom, einer Cyanogruppe, einem Rest N(R')₂, OR' , CO₂R', CON(R')₂, und SO₂N(R²)₂ substituiert sein.
X ist 0 oder NR'.
n ist 1 bis 3.
R' ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkyl-, (C₂-C₃)-Alkenyl- oder Alkinylrest, einer Phenylgruppe oder einem Phenylrest, der mit 1 bis 3 Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander aus einem Halogenatom, einer Methoxy-, Cyano-, Nitro-, Amino-, Hydroxy-, Methyl- oder Ethylgruppe ausgewählt sind, oder einem 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ringsystem ausgewählt, das gegebenenfalls mit 1 bis 3 Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander aus einem Halogenatom, einer Methoxy-, Cyano-, Nitro-, Amino-, Hydroxy-, Methyl- oder Ethylgruppe ausgewählt sind.
R₁ ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkylrest, OH oder einem O-(C₁-C₃)-Alkylrest ausgewählt.
R₂ ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkyl- oder (C₂-C₃)-Alkenylrest ausgewählt, wobei jeder der Reste gegebenenfalls mit -N(R')₂, -OR', SR', -C(O)-N(R')₂, -S(O₂)-N(R')₂, -C(O)-OR' oder R₃ substituiert ist.
R₃ ist aus 5- bis 6-gliedrigen aromatischen carbocyclischen oder heterocyclischen Ringsystemen ausgewählt.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Arzneimittel bereit, die die erfindungsgemäßen p38-Inhibitoren umfassen. Diese Mittel können bei Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Vielfalt von Erkrankungen, wie Krebs, Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, destruktiven Knochenerkrankungen, proliferativen Erkrankungen, Infektionskrankheiten, Viruserkrankungen und neurodegenerativen Krankheiten verwendet werden. Diese Mittel sind auch nützlich bei Verfahren zur Verhinderung von Zelltod und Hyperplasie und können deshalb verwendet werden, um Reperfusion/Ischämie bei Schlaganfall, Herzattacken und Organhypoxie zu behandeln oder zu verhindern. Die Mittel sind auch bei Verfahren zur Verhinderung Thrombin-induzierter Blutplättchenaggregation nützlich. Jedes dieser vorstehend beschriebenen Verfahren ist auch Teil der vorliegenden Erfindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende ausführliche Beschreibung dargelegt. In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet: Der Begriff "Heterocyclylrest" oder "Heterocyclus" betrifft einen stabilen 5- bis 7-gliedrigen monocyclischen heterocyclischen Ring, der entweder gesättigt oder ungesättigt ist und der gegebenenfalls benzokondensiert sein kann, falls er monocyclisch ist. Jeder Heterocyclus besteht aus einem oder mehreren Kohlenstoffatomen und aus einem bis vier Heteroatomen, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind. Wie sie hier verwendet werden, schließen die Begriffe "Stickstoff- und Schwefelheteroatome" eine beliebige oxidierte Form von Stickstoff und Schwefel und die quarternisierte Form eines beliebigen basischen Stickstoffatoms ein. Ein Heterocyclylrest kann an einem beliebigen endocyclischen Kohlenstoff- oder Heteroatom gebunden sein, das zur Erzeugung einer stabilen Struktur führt. Beispiele solcher Reste schließen eine Imidazolyl-, Imidazolinoyl-, Imidazolidinyl-, Chinolyl-, Isochinolyl-, Indolyl-, Indazolyl-, Indazolinoyl-, Perhydropyridazyl-, Pyridazyl-, Pyridyl-, Pyrrolyl-, Pyrrolinyl-, Pyrrolidinyl-, Pyrazolyl-, Pyrazinyl-, Chinoxolyl-, Piperidinyl-, Pyranyl-, Pyrazolinyl-, Piperazinyl-, Pyrimidinyl-, Pyridazinyl-, Morpholinyl-, Thiamorpholinyl-, Furyl-, Thienyl-, Triazolyl-, Thiazolyl-, Carbolinyl-, Tetrazolyl-, Thiazolidinyl-, Benzofuranoyl-, Thiamorpholinylsulfon-, Oxazolyl-, Benzoxazolyl-, Oxopiperidinyl-, Oxopyrrolidinyl-, Oxazepinyl-, Azepinyl-, Isoxazolyl-, Isothiazolyl-, Furazanyl-, Tetrahydropyranyl-, Tetrahydrofuranyl-, Thiazolyl-, Thiadiazolyl-, Dioxolyl-, Dioxinyl-, Oxathiolyl-, Benzodioxolyl-, Dithiolyl-, Thiophenyl-, Tetrahydrothiophenyl-, Sulfolanyl-, Dioxanyl-, Dioxolanyl-, Tetahydrofurodihydrofuranyl-, Tetrahydropyranodihydrofuranyl-, Dihydropyranyl-, Tetrahydrofurofuranyl- und Tetrahydropyranofuranylgruppe ein.
Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" betrifft erfindungsgemäße Verbindungen, die in Form von Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren und Basen abgeleitet sind.
Unter Säuresalzen sind zum Beispiel die folgenden eingeschlossen: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat.
Salze, die von geeigneten Basen abgeleitet sind, schließen Alkalimetall (z. B. Natrium), Erdalkalimetall (z. B. Magnesium), Ammonium und NW₄ ⁺ (wobei W ein C_1–4-Alkylrest ist) ein. Physiologisch verträgliche Salze eines Wasserstoffatoms oder einer Aminogruppe schließen Salze oder organische Carbonsäuren, wie Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Isethion-, Lactobion- und Bernsteinsäure, organische Sulfonsäuren, wie Methansulfon-, Ethansulfon-, Benzolsulfon- und p-Toluolsulfonsäure, und anorganische Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Phosphor- und Sulfaminsäure, ein. Physiologisch verträgliche Salze einer Verbindung mit einer Hydroxygruppe schließen das Anion dieser Verbindung zusammen mit einem geeigneten Kation, wie Na⁺, NH₄ ⁺ und NW₄ ^– (wobei W ein C_1–4-Alkylrest ist) ein.
Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen Salze organischer Carbonsäuren, wie Ascorbin-, Essig-, Citronen-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Malein-, Isethion-, Lactobion-, p-Aminobenzoe- und Bernsteinsäure, organische Sulfonsäuren, wie Methansulfon-, Ethansulfon-, Benzolsulfon- und p-Toluolsulfonsäure, und anorganische Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Phosphor-, Sulfamin- und Pyrophosphorsäure, ein.
Zur therapeutischen Verwendung sind die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen pharmazeutisch verträglich. Jedoch können Salze von Säuren und Basen, die nicht pharmazeutisch verträglich sind, auch Verwendung finden, zum Beispiel bei der Herstellung oder Reinigung einer pharmazeutisch verträglichen Verbindung.
Bevorzugte Salze schließen Salze ein, die aus Salz-, Schwefel-, Essig-, Bernstein-, Citronen- und Ascorbinsäure gebildet werden.
Der Begriff "chemisch zulässig" betrifft eine Konnektivität von Atomen, so dass die chemische Valenz des jeweiligen Atoms gesättigt ist. Zum Beispiel sind ein Sauerstoffatom mit zwei Bindungen und ein Kohlenstoffatom mit vier Bindungen chemisch zulässig.
Der Begriff "Tautomerisierung" betrifft das Phänomen, bei dem sich ein Proton eines Atoms eines Moleküls zu einem anderen Atom verschiebt. Siehe Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structures, 4. Auflage, John Wiley & Sons, Seiten 69 –74 (1992). Der Begriff "Tautomer" betrifft die Verbindungen, die durch die Protonenverschiebung erzeugt werden. Wenn zum Beispiel R1 in einer Verbindung der Formel I -OH ist, kann die Verbindung als Tautomer vorhanden sein, wie nachstehend gezeigt ist:
Die vorliegende Erfindung stellt Inhibitoren von p38 mit den allgemeinen Formeln:
pharmazeutisch verträgliche Salze davon bereit.
HET ist ein 5- bis 7-gliedriger Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, S- oder O-Atomen, wobei der Heterocyclus mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkylresten substituiert ist. HET kann gegebenenfalls mit einem Halogenatom, einer Cyanogruppe, einem Rest N(R')₂, OR', CO₂R', CON(R')₂ und SO₂N(R²)₂ substituiert sein.
X ist 0 oder NR'.
n ist 1 bis3.
R' ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkyl-, (C₂-C₃)-Alkenyl- oder Alkinylrest, einer Phenylgruppe oder einem Phenylrest, der mit 1 bis 3 Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander aus einem Halogenatom, einer Methoxy-, Cyano-, Nitro-, Amino-, Hydroxy-, Methyl- oder Ethylgruppe ausgewählt sind, oder einem 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ringsystem ausgewählt, der gegebenenfalls mit 1 bis 3 Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander aus einem Halogenatom, einer Methoxy-, Cyano-, Nitro-, Amino-, Hydroxy-, Methyl- oder Ethylgruppe ausgewählt sind.
R₁ ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkylrest, OH oder einem O-(C₁-C₃)-Alkylrest ausgewählt.
R₂ ist aus einem Wasserstoffatom, einem (C₁-C₃)-Alkyl- oder (C₂-C₃)-Alkenylrest ausgewählt; wobei jeder der Reste gegebenenfalls mit -N(R')₂, -OR', -SR', -C(O)-N(R')₂, -S(O₂)-N(R')₂, -C(O)-OR' oder R³ substituiert ist.
R₃ ist aus 5- bis 6-gliedrigen aromatischen carbocyclischen oder heterocyclischen Ringsystemen ausgewählt.
Für einen Fachmann wird auf der Hand liegen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Tautomere vorliegen können. Solche Tautomere können kurzlebig oder als stabiles Produkt isolierbar sein. Diese Tautomere fallen in den Schutzbereich der Erfindung. Diese Verbindungen sind auch p38-Hemmstoffe und fallen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist R₁ H, ist n 1 und ist HET ein Imidazol-, Triazol-, Thiazol-, Oxazol-, Pyridyl- oder Pyrimidylring, der mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkylresten substituiert ist.
Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist R₁ H, ist n 1 und ist HET ein Imidazol- oder Pyridylring, der mit einem C₁-C₃-Alkylrest substituiert ist.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen gemäß Formel I sind
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der vorstehend identifizierten Inhibitoren von p38 der Formeln I und II bereit. Ein Verfahren zur Herstellung von Verbindung 11 wird in Beispiel 1 bereitgestellt.
Die Wirksamkeit der p38-Inhibitoren dieser Erfindung kann in vitro, in vivo oder in einer Zelllinie untersucht werden. In vitro-Untersuchungen schließen Untersuchungen ein, die die Hemmung entweder der Kinase-Aktivität oder der ATPase-Aktivität von aktivierter p38 bestimmen. Alternativ-in vitro-Untersuchungen quantifizieren die Fähigkeit des Inhibitors, an p38 zu binden, und dies kann entweder dadurch gemessen werden, dass der Inhibitor vor Bindung radiomarkiert, der Inhibitor/p38-Komplex isoliert und die Menge gebundener Radiomarkierung bestimmt wird, oder dadurch, dass eine kompetitive Bindungsanalyse durchgeführt wird, bei dem neue Hemmstoffe mit p38, gebunden an bekannte Radioliganden, inkubiert werden.
Zellkulturuntersuchungen der hemmenden Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen können verwendet werden, um die Mengen an TNF, IL-1, IL-6 oder IL-8, die im Vollblut oder Zellfraktionen davon erzeugt werden, in mit Inhibitor behandelten Zellen im Vergleich zu mit negativen Kontrollen behandelten Zellen zu bestimmen. Der Pegel dieser Cytokine kann durch die Verwendung im Handel erhältlicher ELISAs bestimmt werden.
Eine in vivo-Untersuchung, die zur Bestimmung der hemmenden Wirkung der p38-Inhibitoren dieser Erfindung verwendbar ist, ist die Unterdrückung des Hinterpfotenödems bei Ratten mit Mycobacterium butyricum-induzierter Adjuvans Arthritis. Dies ist bei J. C. Boehm et al., J. Med. Chem., 39, S. 3929–37 (1996), beschrieben, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die erfindungsgemäßen p38-Inhibitoren können auch an Tiermodellen für Arthritis, Knochenresorption, Endotoxinschock und Immunfunktion untersucht werden, wie es bei A. M. Badger et al., J. Pharmacol. Experimental Therapeutics, 279, S. 1453–61 (1996), beschrieben ist, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die p38-Hemmstoffe oder pharmazeutische Salze davon können in Arzneimittel zur Verabreichung an Tiere oder Menschen formuliert werden. Diese Arzneimittel, die eine wirksame Menge p38-Inhibitor, um einen p38-vermittelten Zustand zu behandeln oder zu verhindern, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, sind eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff "p38-vermittelter Zustand", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine beliebige Erkrankung oder einen anderen gesundheitsschädlichen Zustand, von der oder dem bekannt ist, dass p38 eine Rolle spielt. Dies schließt Beschwerden ein, die durch eine IL-1-, TNF-, IL-6- oder IL-8-Überproduktion hervorgerufen werden. Solche Beschwerden schließen ohne Beschränkung Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, destruktive Knochenerkrankungen, proliferative Erkrankungen, Infektionskrankheiten, neurodegenerative Krankheiten, Allergien, Reperfusion/Ischämie bei Schlaganfall, Herzattacken, angiogene Erkrankungen, Organhypoxie, vaskuläre Hyperplasie, Herzhypertrophie, Thrombin-induzierte Blutplättchenaggregation und mit Prostaglandinendoperoxidasesynthase-2 in Zusammenhang stehende Beschwerden ein.
Entzündungskrankheiten, die behandelt oder verhindert werden können, schließen akute Pankreatitis, chronische Pankreatitis, Asthma, Allergien und Atemnotsyndrom (Schocklunge, ARDS) ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Autoimmunkrankheiten, die behandelt oder verhindert werden können, schließen Glomerulonephritis, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematosus, Sclerodermie, chronische Thyroiditis, Basedow Krankheit, Autoimmungastritis, Diabetes, autoimmunhämolytische Anämie, Autoimmunneutropenie, Thrombozytopenie, atopische Dermatitis, chronische aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Multiple Sklerose, entzündliche Darmerkrankung, Colitis ulcerosa, Enteritis regionalis Crohn, Psoriasis oder Transplantat-Wirt-Reaktion ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Destruktive Knochenerkrankungen, die behandelt oder verhindert werden können, schließen Osteoporose, Osteoarthrose und eine mit multiplem Myelom in Zusammenhang stehende Knochenerkrankung ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Proliferative Erkrankungen, die behandelt oder verhindert werden können, schließen akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie, metastatisches Melanom, Kaposi Sarkom und multiples Myelom ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Angiogene Erkrankungen, die behandelt oder verhindert werden können, schließen solide Tumoren, okuläre Revaskularisation und infantile Hämangiome ein.
Infektionskrankheiten, die behandelt oder verhindert werden können, schließen Sepsis, septischen Schock und Shigellose ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Viruserkrankungen, die behandelt oder verhindert werden können, schließen akute Hepatitis-Infektion (einschließlich Hepatitis A, Hepatitis B und Hepatitis C), HIV-Infektion und CMV-Retinitis ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Neurodegenerative Krankheiten, die durch die Verbindungen dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, schließen Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, cerebrale Ischämien oder eine neurodegenerative Krankheit, die durch eine traumatische Verletzung hervorgerufen wird, ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
"p38-vermittelte Zustände" schließen auch Ischämie/Reperfusion bei Schlaganfall, Herzattacken, Myokardischämie, Organhypoxie, vaskuläre Hyperplasie, Herzhypertrophie und Thrombin-induzierte Blutplättchenaggregation ein.
Außerdem können p38-Hemmstoffe in dieser Erfindung auch die Expression induzierbarer proentzündlicher Proteine, wie Prostaglandinendoperoxidsynthase-2 (PGHS-2), auch als Cyclooxygenase-2 (COX-2) bezeichnet, hemmen. Deshalb sind andere "p38-vermittelte Zustände" Ödem, Analgesie, Fieber und Schmerz, wie neuromuskulärer Schmerz, Kopfschmerz, Schmerz, der durch Krebs hervorgerufen wird, Zahnschmerz und Arthritisschmerz.
Die Erkrankungen, die durch die p38-Inhibitoren dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, können zweckmäßigerweise auch durch das Cytokin (IL-1, TNF, IL-6, IL-8), von dem man annimmt, dass es für die Erkrankung verantwortlich ist, unterteilt werden.
So schließen IL-1-vermittelte Erkrankungen oder Beschwerden rheumatoide Arthritis, Osteoarthrose, Schlaganfall, Endotoxämie und/oder toxisches Schocksyndrom, durch Endotoxin induzierte entzündliche Reaktion, entzündliche Darmerkrankung, Tuberkulose, Atherosklerose, Muskeldegeneration, Kachexie, Arthritis psoriatica, Reiter-Syndrom, Gicht, posttraumatische Arthritis, Rötelnarthritis, akute Synovitis, Diabetes, pankreatische β-Zellerkrankung und Alzheimer Krankheit ein.
TNF-vermittelte Erkrankungen oder Beschwerden schließen rheumatoide Arthritis, Bechterew-Krankheit, Osteoarthritis, Gichtarthritis und andere arthritische Beschwerden, Sepsis, septischen Schock, Endotoxinschock, Gram-negative Sepsis, toxisches Schocksyndrom, Atemnotsyndrom (Schocklunge, ARDS), cerebrale Malaria, chronische pulmonale entzündliche Erkrankung, Silikose, pulmonale Sarkoidose, Knochenresorptionserkrankungen, Reperfusionsverletzung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Allotransplantatabstoßungen, Fieber und Myalgien aufgrund einer Infektion, Kachexie nach einer Infektion, AIDS, ARC oder Malignom, Keloidbildung, Narbengewebebildung, Enteritis regionalis Crohn, Colitis ulcerosa oder Sodbrennen ein. TNF-vermittelte Erkrankungen schließen auch Virusinfektionen, wie HIV, CMV, Influenza und Herpes, und Virusinfektionen beim Tier, wie Lentivirusinfektionen, einschließlich des Virus der infektiösen Anämie der Pferde, des Ziegenarthritisvirus, des Visna-Virus oder Maedi-Virus, aber nicht darauf beschränkt; oder Retrovirusinfektionen, einschließlich des Katzen-Immundefizienzvirus, Rinder-Immundefizienzvirus oder Hunde-Immundefizienzvirus, ein.
IL-8-vermittelte Erkrankungen oder Beschwerden schließen Erkrankungen ein, die durch massive Neutrophileninfiltration gekennzeichnet sind, wie Psoriasis, entzündliche Darmerkrankung, Asthma, Herz- und Nierenreperfusionsverletzung, Atemnotsyndrom (Schocklunge, ARDS), Thrombose und Glomerulonephritis.
Außerdem können die Verbindungen dieser Erfindung topisch verwendet werden, um Beschwerden, die durch IL-1 oder TNF hervorgerufen oder verschlimmert werden, zu behandeln oder zu verhindern. Solche Beschwerden schließen entzündete Gelenke, Ekzem, Psoriasis, entzündliche Hautbeschwerden, wie Sonnenbrand, entzündliche Augenbeschwerden, wie Bindehautentzündung, Sodbrennen, Schmerz und andere Beschwerden, die mit einer Entzündung in Zusammenhang stehen, ein.
Zusätzlich zu den Verbindungen dieser Erfindung können auch pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen dieser Erfindung in Zusammensetzungen verwendet werden, um die vorstehend identifizierten Erkrankungen zu behandeln oder zu verhindern.
Pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen dieser Erfindung schließen diejenigen ein, die von pharmazeutisch verträglich anorganischen und organischen Säuren und Basen abgeleitet sind. Beispiele geeigneter Säuresalze schließen Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Formiat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Glycolat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Malonat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Nitrat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Phosphat, Picrat, Pivalat, Propionat, Salicylat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat ein. Andere Säuren, wie Oxalsäure, können, obgleich sie an sich nicht pharmazeutisch verträglich sind, bei der Herstellung von Salzen verwendet werden, die als Zwischenprodukte beim Erhalten der Verbindungen der Erfindung und ihrer pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze nützlich sind. Salze, die von geeigneten Basen abgeleitet sind, schließen Alkalimetall- (z. B. Natrium- und Kalium-), Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium-), Ammonium- und N-(C_1–4-Alkyl)₄ ⁺-Salze ein. Diese Erfindung stellt sich auch die Quarternisierung beliebiger basischer stickstoffhaltiger Reste der hier offenbarten Verbindungen vor. Wasser- oder öllösliche oder -dispergierbare Produkte können durch eine solche Quarternisierung erhalten werden.
Pharmazeutisch verträgliche Träger, die in diesen Arzneimitteln verwendet werden können, schließen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie Humanserumalbumin, Pufferstoffe, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische gesättigter pflanzlicher Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Stoffe auf Cellulosebasis, Polyethylenglycol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglycol und Wollwachs ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Der Begriff "parenteral", wie er hier verwendet wird, schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale und intrakraniale Injektion oder Infusionsverfahren ein.
Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen oral, intraperitoneal oder intravenös verabreicht.
Sterile injizierbare Formen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können wässrige oder ölige Suspensionen sein. Diese Suspensionen können gemäß Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden sterile, nichtflüchtige Öle üblicherweise als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate, sind bei der Herstellung von Injectabilia nützlich, wie es natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch ein langkettiges Alkoholverdünnungsmittel oder Dispergiermittel, wie Carboxymethylcellulose oder ähnliche Dispergiermittel, die häufig bei der Formulierung pharmazeutisch verträglicher Dosierungsformen, einschließlich Emulsionen und Suspensionen, verwendet werden, enthalten. Andere häufig verwendete oberflächenaktive Stoffe, wie Tweens, Spans und andere Emulgiermittel oder Verbesserer der biologischen Verfügbarkeit, die häufig bei der Herstellung pharmazeutisch verträglicher fester, flüssiger oder anderer Dosierungsformen verwendet werden, können auch zu Zwecken der Formulierung verwendet werden.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können oral in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verabreicht werden, die Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden typischerweise auch zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform schließen verwendbare Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können auch bestimmte Süßungsmittel, Geschmackstoffe oder Farbstoffe zugesetzt werden.
In einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel dieser Erfindung in Form von Zäpfchen zur rektalen Verabreichung verabreicht werden. Diese können durch Mischen des Wirkstoffs mit einem geeigneten nichtreizenden Hilfsstoff hergestellt werden, der bei Raumtemperatur fest, aber bei Rektaltemperatur flüssig ist und deshalb im Rektum schmelzen wird, um den Arzneistoff abzugeben. Solche Materialien schließen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglycole ein.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch topisch verabreicht werden, insbesondere wenn das Ziel der Behandlung Bereiche oder Organe einschließt, die durch topische Anwendung leicht erreichbar sind, einschließlich Erkrankungen des Auges, der Haut oder des unteren Intestinaltraktes. Geeignete topische Formulierungen werden für jeden/s dieser Bereiche oder Organe leicht hergestellt.
Die topische Anwendung für den unteren Intestinaltrakt kann in einer Rektalzäpfchenformulierung (siehe vorstehend) oder in einer geeigneten Einlaufformulierung ausgeführt werden. Topische Transdermalpflaster können auch verwendet werden.
Für topische Anwendungen können die Arzneimittel in einer geeigneten Salbe formuliert werden, die den Wirkstoff in einem oder mehreren Träger(n) suspendiert oder gelöst enthält. Träger für topische Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung schließen Mineralöl, flüssige Rohvaseline, weiße Vaseline, Propylenglycol, Polyoxyethylen, Polyoxypropylenverbindung, Emulgierwachs und Wasser ein, aber sind nicht darauf beschränkt. Alternativ können die Arzneimittel in einer geeigneten Lotion oder Creme formuliert werden, die die Wirkstoffe in einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern suspendiert oder gelöst enthält. Geeignete Träger schließen Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetearylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Für eine ophthalmische Verwendung können die Arzneimittel als mikronisierte Suspensionen in isotonischer, pH-eingestellter steriler Kochsalzlösung oder vorzugsweise als Lösungen in isotonischer, pH-eingestellter steriler Kochsalzlösung entweder mit oder ohne Konservierungsmittel, wie Benzalkoniumchlorid, formuliert werden. Alternativ können die Arzneimittel für ophthalmische Anwendungen in einer Salbe, wie Vaseline, formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch durch Nasenaerosol oder Inhalation verabreicht werden. Solche Mittel werden gemäß Verfahren, die im Fachgebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannt sind, hergestellt und können als Lösungen in Kochsalzlösung unter Verwendung von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsbeschleunigern zum Verbessern der biologischen Verfügbarkeit, fluorierten Kohlenwasserstoffen und/oder anderen herkömmlichen Lösungsvermittlern oder Dispergiermittel hergestellt werden.
Die Menge an p38-Inhibitor, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, wird in Abhängigkeit vom behandelten Wirt und der jeweiligen Verabreichungsart variieren. Vorzugsweise sollten die Zusammensetzungen so formuliert werden, dass einem Patienten, der diese Zusammensetzungen erhält, eine Dosierung des Inhibitors zwischen 0,01–100 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht werden kann.
Es sollte auch selbstverständlich sein, dass eine spezielle Dosierungs- und Behandlungsvorschrift für einen beliebigen besonderen Patienten von einer Vielfalt an Faktoren abhängen wird, die die Wirksamkeit der speziellen verwendeten Verbindung, das Alter, das Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Ernährung, die Verabreichungsdauer, die Ausscheidungsrate, die Arzneistoffkombination und das Urteil des behandelnden Arztes und die Schwere der besonderen Erkrankung, die behandelt wird, einschließen. Die Menge an Inhibitor wird auch von der jeweiligen Verbindung in der Zusammensetzung abhängen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung eines p38-vermittelten Zustands bereit, die den Schritt des Verabreichens eines der vorstehend beschriebenen Arzneimittel an einen Patienten umfassen. Der Begriff "Patient", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Tier, vorzugsweise einen Menschen.
Vorzugsweise wird das Verfahren verwendet, um einen Zustand zu behandeln oder zu verhindern, der aus Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, destruktiven Knochenerkrankungen, proliferativen Erkrankungen, Infektionskrankheiten, degenerativen Erkrankungen, Allergien, Reperfusion/Ischämie bei Schlaganfall, Herzattacken, angiogenen Erkrankungen, Organhypoxie, vaskulärer Hyperplasie, Herzhypertrophie und Thrombininduzierter Blutplättchenaggregation ausgewählt ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform werden die Inhibitoren dieser Erfindung verwendet, um eine(n) durch IL-1, IL-6, IL-8 oder TNF vermittelte(n) Erkrankung oder Zustand zu behandeln oder zu verhindern. Solche Zustände sind vorstehend beschrieben.
In Abhängigkeit von dem besonderen p38-vermittelten Zustand, der zu behandeln oder zu verhindern ist, können zusätzliche Arzneistoffe, die normalerweise verabreicht werden, um diesen Zustand zu behandeln oder zu verhindern, zusammen mit den erfindungsgemäßen Inhibitoren verabreicht werden. Zum Beispiel können Chemotherapeutika oder andere antiproliferative Mittel mit den p38-Inhibitoren dieser Erfindung kombiniert werden, um proliferative Erkrankungen zu behandeln.
Diese zusätzlichen Wirkstoffe können getrennt von der den p38-Inhibitor enthaltenden Zusammensetzung, als Teil einer Mehrfachdosierungsvorchrift, verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform können diese Mittel Teil einer Einzeldosierungsform sein, zusammen mit dem p38-Inhibitor in einer einzigen Zusammensetzung gemischt.
Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, sind die folgenden Beispiele dargelegt. Selbstverständlich dienen diese Beispiele nur veranschaulichenden Zwecken und sollen diese Erfindung in keinerlei Weise beschränken.
BEISPIEL 1 Herstellung der Verbindung 11
Verbindung 1 wurde in einem 1 : 20-Verhältnis in einer Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und Eisessig (1 : 4) gelöst. Wässrige NaNO₂-Lösung wurde der Lösung tropfenweise über zwei Stunden (h) zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 60°C eine Stunde gerührt. Diese Lösung wurde zu einem Äquivalent CuBr und drei Äquivalenten HBr (Stammkonzentration von HBr war 48%) bei 100°C über eine Stunde eingetragen. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 100°C eine Stunde gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde in Eis gegossen. Verbindung 2 wurde ausgefällt, abfiltriert und weiter durch Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute der Verbindung 2 war 90%.
Ein Äquivalent der Verbindung 2 und ein Äquivalent Cyanessigsäuremethylester wurden in Dimethylformamid (DMF) gelöst. Zwei Äquivalente K₂CO₃ wurden der DMF-Lösung bei 50°C zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 50°C über Nacht gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde in ein Bad aus HCl und zerstoßenem Eis gegossen. Verbindung 3 wurde ausgefällt, abfiltriert und direkt für den nächsten Schritt verwendet. Die Ausbeute der Verbindung 3 war 90%.
Verbindung 3 wurde in einer Lösung aus 5% konzentrierter Schwefelsäure, 47,5% Essigsäure und 47,5% Wasser gelöst. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 125°C fünf Stunden gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde in einen Überschuss aus zerstoßenem Eis gegossen. Verbindung 4 wurde ausgefällt, abfiltriert und ohne weitere Reinigung direkt für den nächsten Schritt verwendet. Die Ausbeute der Verbindung 4 war 90%.
Verbindung 4 wurde in Ethylalkohol suspendiert. Konzentrierte HCl, die 4,5 Äquivalente SnCl₂ enthielt, wurde bei 75°C zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde 30 min bei 75°C unter Rückfluss erhitzt. Dünnschichtchromatographie (DC) zeigte, dass die Umsetzung abgeschlossen war. Die Umsetzungslösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Essigester gelöst, und die organische Phase wurde mit gesättigter K₂CO₃- und NaCl-Lösung gewaschen, dann wurde mit MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Verbindung 5 wurde rein in einer Ausbeute von 90% erhalten.
Ein Äquivalent der Verbindung 5 und ein Äquivalent 3,6-Dichlorpyridazin wurden in Tetrahydrofuran (THF) bei 60°C gelöst. Zwei Äquivalente Kalium-t-butylhydroxid wurden zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 60°C eine Stunde gerührt. Gesättigte NaCl-Lösung und Essigester wurden dem Umsetzungsgemisch zugesetzt. Der pH-Wert der wässrigen Phase wurde mit HCl auf 7 eingestellt und mit Essigester extrahiert. Die organische Phase wurde zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und mit MgSO₄. getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Verbindung 6 wurde durch Chromatographie bei einer Ausbeute von 60% gereinigt.
Eine THF-Lösung aus 2,4-Difluorthiophenol bei 0–5°C wurde zu NaH zugesetzt. Die Suspension wurde bei 0–5°C gerührt, bis keine Bläschen mehr abgegeben wurden und das Umsetzungsgemisch eine klare Lösung war. Die Lösung wurde dann auf 60°C erwärmt. Verbindung 6 wurde bei 60°C dieser Lösung zugesetzt. Die Umsetzung wurde unter Rückfluss erhitzt, bis eine DC zeigte, dass Verbindung 6 verbraucht war. Gesättigte NaCl-Lösung und Essigester wurden dem Umsetzungsgemisch zugesetzt. Die organische Phase wurde zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Verbindung 7 wurde durch Chromatographie bei einer Ausbeute von 90% gereinigt.
Eine Toluollösung aus Verbindung 7 und Aldehyd 8 wurde 24 h unter Rückfluss erhitzt. Das gebildete Imin wurde durch Chromatographie gereinigt, in wasserfreiem Methylalkohol gelöst und mit NaBH₄ in Gegenwart einer katalytischen Menge Essigsäure zum Amin 9 reduziert. Die Umsetzung wurde mit Wasser abgeschreckt und mit Essigester extrahiert. Die organische Phase wurde unter Vakuum entfernt und das rohe Amin wurde mit konzentrierter Schwefelsäurelösung bei 100°C 30 min gerührt. Das Amid 10 wurde von einem Bad aus NaCl und zerstoßenem Eis ausgefällt, abfiltriert und direkt im Ringschlussschritt verwendet. Amid 10 wurde in THF gelöst. Überschüssiges DMF-DMA wurde der Lösung zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde bei 70°C ein bis zwei Stunden gerührt. Das Produkt 11 wurde durch Kristallisation aus Essigester gereinigt.
BEISPIEL 2
Klonen von p38-Kinase in Insektenzellen
Zwei Spleißvarianten menschlicher p38-Kinase, CSBP1 und CSBP2, sind identifiziert worden. Spezifische Oligonucleotidstartermoleküle wurden verwendet, um den Kodierungsbereich von CSBP2-cDNA unter Verwendung einer HeLa-Zellbank (Stratagene) als Templat zu verstärken. Das Produkt der Polymerasekettenreaktion wurde in den pET-15b-Vektor (Novagen) geklont. Der Baculovirus-Transfervektor pVL-(His)₆-p38 wurde durch Subklonen eines XbaI-BamHI-Fragmentes von pET15b-(His)₆-p38 in die komplementären Stellen im Plasmid pVL1392 (Pharmingen) konstruiert.
Das Plasmid pVL-(His)₆-p38 lenkte die Synthese eines rekombinanten Proteins, das aus einem Peptid mit 23 Resten (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLE, wobei LVPRGS eine Thrombin-Spaltstelle wiedergibt), im Leserahmen an den N-Terminus von p38 fusioniert, wie es durch DNA-Sequenzierung und durch N-terminale Sequenzierung des exprimierten Proteins bestätigt wurde, besteht. Eine Monoschichtkultur von Spodoptera frugiperda (Sf9)-Insektenzellen (ATCC) wurde in TNM-FH-Medium (Gibco BRL), das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt war, in einer T-Flasche bei 27°C gehalten. Sf9-Zellen in der log-Phase wurden mit linearer Virus-DNA des Virus Autographa califonica nuclear polyhedrosis (Pharmingen) und dem Transfervektor pVL(His)₆-p38 unter Verwendung von Lipofectin (Invitrogen) kotransfiziert. Die einzelnen rekombinanten Baculovirus-Klone wurden durch Plaque-Assay unter Verwendung von 1% niedrig schmelzender Agarose gereinigt.
BEISPIEL 3
Expression und Reinigung rekombinanter p38-Kinase
Trichoplusia ni (Tn-368) High-Five^TM-Zellen (Invitrogen) wurden in Suspension in Excel-405 proteinfreiem Medium (JRH Bioscience) in einem Schüttelkolben bei 27°C gezüchtet. Zellen bei einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml wurden mit dem vorstehend beschriebenen rekombinanten Baculovirus bei einer Infektionsmultiplizität von 5 infiziert. Das Expressionslevel an rekombinanter p38 wurde durch Immunoblotting unter Verwendung eines Kaninchen-anti-p38-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) überwacht. Die Zellmasse wurde 72 Stunden nach Infektion geerntet, wenn der Expressionsanteil von p38 sein Maximum erreichte.
Gefrorene Zellpaste von Zellen, die (His)₆-markierte p38 exprimieren, wurde in 5 Volumina Puffer A (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 0,2 mM PMSF) aufgetaut. Nach mechanischer Zerstörung der Zellen in einem Mikrofluidisator wurde das Lysat 30 Minuten bei 30.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde ansatzweise 3–5 Stunden bei 4°C mit Talon^TM(Clontech) Metallaffinitätsharz bei einem Verhältnis 1 ml Harz pro 2–4 mg der erwarteten p38 inkubiert. Das Harz wurde durch 5 minütige Zentrifugation bei 500 × g abgeschieden und vorsichtig ansatzweise mit Puffer A gewaschen. Das Harz wurde aufgeschlämmt und in eine Säule (ca. 2,6 × 5,0 cm) gegossen und mit Puffer A + 5 mM Imidazol gewaschen.
Die (His)₆-p38 wurde mit Puffer A + 100 mM Imidazol eluiert und anschließend über Nacht bei 4°C gegen 2 Liter Puffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM β-Glycerophosphat, 5% Glycerin, 2 mM DTT) dialysiert. Die His₆-Markierung wurde durch Zugabe von 1,5 Einheiten Thrombin (Calbiochem) pro mg p38 und 2–3 stündige Inkubation bei 20°C entfernt. Das Thrombin wurde durch Zugabe von 0,2 mM PMSF abgeschreckt und dann wurde die gesamte Probe auf eine 2 ml Benzamidinagarose-Säule (American International Chemical) aufgegeben.
Die Durchlauffraktion wurde direkt auf eine vorher in Puffer B + 0,2 mm PMSF äquilibrierte 2,6 × 5,0 cm Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgegeben. Die p38 wurde mit einem linearen Gradienten von 20 Säulenvolumen bis 0,6 M NaCl in Puffer B eluiert. Der eluierte Proteinpeak wurde vereinigt und über Nacht bei 4°C gegen Puffer C (50 mM HEPES, pH 7,5, 5% Glycerin, 50 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,2 mM PMSF) dialysiert.
Das dialysierte Protein wurde in einem Centriprep (Amicon) auf 3–4 ml eingeengt und auf eine 2,6 × 100 cm Sephacryl S100HR-Säule (Pharmacia) aufgebracht. Das Protein wurde bei einer Flußrate von 35 ml/Std. eluiert. Der Hauptpeak wurde vereinigt, auf 20 mM DTT eingestellt, auf 10–80 mg/ml eingeengt und in Aliquots bei –70°C eingefroren oder sofort verwendet.
BEISPIEL 4
Aktivierung von p38
p38 wurde durch Kombinieren von 0,5 mg/ml p38 mit 0,005 mg/ml DD-doppelt mutiertem MKK6 in Puffer B + 10 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 0,2 mM Na₂VO₄ 30 Minuten bei 20°C aktiviert. Das Aktivierungsgemisch wurde dann auf eine 1,0 × 10 cm MonoQ-Säule (Pharmacia) aufgegeben und mit einem linearen Gradienten von 20 Säulenvolumen bis 1,0 M NaCl in Puffer B eluiert. Die aktivierte p38 eluierte nach dem ADP und ATP. Der Peak von aktivierter p38 wurde vereinigt und gegen Puffer B + 0,2 mM Na₂VO₄ dialysiert, um das NaCl zu entfernen. Das dialysierte Protein wurde durch Zugabe einer 4,0 M Stammlösung auf 1,1 M Kaliumphosphat eingestellt und auf eine vorher in Puffer D (10% Glycerin, 20 mM β-Glycerophosphat, 2,0 mM DTT) + 1,1 M K₂HPO₄ äquilibrierte 1,0 × 10 cm HIC-Säule (Rainin Hydropore) aufgegeben. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 Säulenvolumen bis Puffer D + 50 mM K₂HPO₄ eluiert. Die doppelt phosphorylierte p38 eluierte als Hauptpeak und wurde zur Dialyse gegen Puffer B + 0,2 mM Na₂VO₄ vereinigt. Die aktivierte p38 wurde bei –70°C gelagert.
BEISPIEL 5
P38-Hemmungsuntersuchungen
A. Hemmung der Phosphorylierung des EGF- Rezeptorpeptids
Diese Untersuchung wird in Gegenwart von 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 10% Glycerin und 100 mM HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 7,6 ausgeführt. Für eine typische IC₅₀-Bestimmung wird eine Stammlösung hergestellt, die alle vorstehenden Komponenten und aktivierte p38 (5 nM) enthält. Die Stammlösung wird in Vials aliquotiert. Ein festgesetztes Volumen DMSO oder Inhibitor in DMSO (Endkonzentration DMSO bei Umsetzung ist 5%) wird in jedes Vial eingetragen, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. EGF-Rezeptorpeptid, KRELVEPLTPSGEAPNQALLR, ein Phosphorylakzeptor bei der p38-katalysierten Kinasereaktion, wird jedem Vial zu einer Endkonzentration von 200 μM zugesetzt. Die Kinasereaktion wird mit ATP (100 μM) eingeleitet und die Vials werden bei 30°C inkubiert. Nach 30 Minuten werden die Umsetzungen mit gleichem Volumen 10%iger Trifluoressigsäure (TFA) abgeschreckt.
Das phosphorylierte Peptid wird durch HPLC-Analyse quantitativ bestimmt. Die Trennung des phosphorylierten Peptids vom unphosphorylierten Peptid wird an einer Umkehrphasensäule (Deltapak, 5 μm, C18 100D, Lieferungs-Nr. 011795) mit einem Zweistoffgradienten aus Wasser und Acetonitril erreicht, die jeweils 0,1% TFA enthalten. Der IC₅₀-Wert (Konzentration an Inhibitor, die 50% Hemmung ergibt) wird durch Aufzeichnen der verbleibenden % Aktivität gegen die Inhibitorkonzentration bestimmt.
B. Hemmung der ATPase-Aktivität
Diese Untersuchung wird in Gegenwart von 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 10% Glycerin und 100 mM HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 7,6 ausgeführt. Für eine typische Ki-Bestimmung wird der Km-Wert für ATP in der ATPase-Aktivität der Umsetzung von aktivierter p38 in Abwesenheit von Inhibitor und in Gegenwart von zwei Konzentrationen an Inhibitor bestimmt. Der Ki-Wert wird aus den Geschwindigkeitsdaten als Funktion von Inhibitor und ATP-Konzentrationen bestimmt. Eine Stammlösung, die alle vorstehenden Komponenten und aktivierte p38 (60 nM) enthält, wird hergestellt. Die Stammlösung wird in Vials aliquotiert. Ein festgesetztes Volumen DMSO oder Inhibitor in DMSO (Endkonzentration DMSO bei Umsetzung ist 2,5%) wird in jedes Vial eingetragen, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugeben verschiedener Konzentrationen an ATP eingeleitet und dann bei 30°C inkubiert. Nach 30 Minuten werden die Reaktionen mit 50 μl EDTA (0,1 M, Endkonzentration), pH 8,0 abgeschreckt. Das Produkt der p38-ATPase-Aktivität, ADP, wird durch HPLC-Analyse quantitativ bestimmt.
Die Trennung des ADP von ATP wird an einer Umkehrphasensäule (Supelcosil, LC-18, 3 um, Lieferungs-Nr. 5-8985) unter Verwendung eines Zweistofflösungsmittelgradienten der folgenden Zusammensetzung erreicht: Lösungsmittel A – 0,1 M Phosphatpuffer, der 8 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (Sigma Chemical Co., Katalog-Nr. T-7158) enthält, Lösungsmittel B – Lösungsmittel A mit 30% Methanol.
C. Hemmung der Erzeugung von IL-1 TNF IL-6 und IL-8 in LPS-stimulierten PBMCs
Die Inhibitoren werden seriell in DMSO aus einer 20 mM Stammlösung verdünnt. Mindestens 6 serielle Verdünnungen werden hergestellt. Dann werden 4 × Inhibitorstammlösungen durch Zugeben von 4 μl einer Inhibitorverdünnung zu 1 ml aus RPMI1640-Medium/10% fetalem Rinderserum hergestellt. Die 4 × Inhibitorstammlösungen enthielten Inhibitor bei Konzentrationen von 80 μM, 32 μM, 12,8 μM, 5,12 μM, 2,048 μM, 0,819 μM, 0,328 μM, 0,131 μM, 0,052 μM, 0,021 μM usw.. Die 4 × Inhibitorstammlösungen werden bei 37°C bis zur Verwendung vorgewärmt.
Frische Leukozytenmanschettenzellen aus menschlichem Blut werden von anderen Zellen in einem Vacutainer CPT von Becton & Dickinson (der 4 ml Blut und genug DPBS ohne Mg²⁺/Ca²⁺ enthält, um die Röhre zu füllen) durch 15 minütige Zentrifugation bei 1500 × g getrennt. Periphäre mononucleare Blutzellen (PBMCs), die an der Spitze des Gradienten in dem Vacutainer lokalisiert sind, werden entfernt und zweimal mit RPMI1640-Medium/10% fetalem Rinderserum gewaschen. PBMCs werden durch 10 minütige Zentrifugation bei 500 × g gesammelt. Die Gesamtzellzahl wird unter Verwendung einer Neubauer-Zellkammer bestimmt und die Zellen werden auf eine Konzentration von 4,8 × 10⁶ Zellen/ml in Zellkulturmedium (RPMI1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum) eingestellt.
In einer anderen Ausführungsform wird das Vollblut, das ein Antikoagulans enthält, direkt in der Untersuchung verwendet.
100 μl der Zellsuspension oder des Vollblutes werden in jede Vertiefung einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen eingetragen. Dann werden 50 μl der 4 × Inhibitorstammlösungen den Zellen zugesetzt. Schließlich werden 50 μl einer Lipopolysaccharid- (LPS) Arbeitsstammlösung (16 ng/ml in Zellkulturmedium) zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von 4 ng/ml LPS bei der Untersuchung erhalten wird. Das Gesamtuntersuchungsvolumen der Vehikelkontrolle wird durch Zugeben von 50 μl Zellkulturmedium auch auf 200 μl eingestellt. Die PBMC-Zellen oder das ganze Blut werden dann über Nacht (12–15 Stunden) bei 37°C/5% CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert.
Am nächsten Tag werden die Zellen vor 5 minütiger Zentrifugation bei 500 × g auf einer Schüttelmaschine 3–5 Minuten gemischt. Die Zellkulturüberstände werden eingesammelt und durch ELISA auf Gehalte an IL-1b (R & D Systems, Quantikine kits, #DBL50), TNF-α (BioSource, #KHC3012), IL-6 (Endogen, #EH2-IL6) und IL-8 (Endogen, #EH2-IL8) gemäß den Vorschriften des Herstellers analysiert. Die ELISA-Daten werden verwendet, um Dosis-Wirkungs-Kurven zu erzeugen, aus denen IC₅₀-Werte abgeleitet werden.
Die erfindungsgemäßen p38-Inhibitoren hemmen die Phosphorylierung des EGF-Rezeptorpeptids und die Produktion von IL-1, TNF und IL-6 sowie IL-8 in LPS-stimulierten PBMCs oder im Vollblut.
D. Hemmung der Erzeugung von IL-6 und IL-8 in IL-1-stimulierten PBMCs
Diese Untersuchung wird an PBMCs ausgeführt, die genau die gleichen wie vorstehend sind, nur dass der Untersuchung statt der LPS-Arbeitsstammlösung 50 μl einer IL-1b-Arbeitsstammlösung (2 ng/ml in Zellkulturmedium) zugesetzt werden.
Zellkulturüberstände werden wie vorstehend beschrieben eingesammelt und durch ELISA auf Gehalte an IL-6 (Endogen, #EH2IL6) und IL-8 (Endogen, #EH2-IL8) gemäß den Vorschriften des Herstellers analysiert. Die ELISA-Daten werden verwendet, um Dosis-Wirkungs-Kurven zu erzeugen, aus denen IC₅₀-Werte abgeleitet werden.
E. Hemmung der LPS-induzierten Prostaglandinendoperoxidsynthase-2- (PGHS-2 oder COX-2) Induktion in PBMCs
Menschliche periphäre mononucleare Blutzellen (PBMCs) werden aus frischen Leukozytenmanschettenzellen aus menschlichem Blut durch Zentrifugation in einem Vacutainer CPT (Becton & Dickinson) isoliert. 15 × 10⁶ Zellen werden in eine Gewebekulturschale mit 6 Vertiefungen gesetzt, die RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin enthält. Ein Inhibitor der vorliegenden Erfindung wird bei 0,2, 2,0 und 20 μM Endkonzentrationen in DMSO zugesetzt. Dann wird LPS bei einer Endkonzentration von 4 ng/ml zugesetzt, um Enzymexpression auszulösen. Das endgültige Kulturvolumen ist 10 ml/Vertiefung.
Nach Inkubation über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ werden die Zellen durch Abschaben und anschließende Zentrifugation eingesammelt, dann wird der Überstand entfernt, und die Zellen werden zweimal in eiskalter DPBS (Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, BioWhittaker) gewaschen. Die Zellen werden auf Eis 10 min in 50 μl kaltem Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 1% Desoxycholsäure, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 2% Aprotinin (Sigma), 10 μg/ml Pepstatin, 10 μg/ml Leupeptin, 2 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 1 mM DTT), der 1 μl Benzonase (DNAse von Merck) enthält, lysiert. Die Proteinkonzentration jeder Probe wird unter Verwendung von dem BCA-Assay (Pierce) und Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Dann wird die Proteinkonzentration jeder Probe mit kaltem Lysepuffer auf 1 mg/ml eingestellt. Zu 100 μl Lysat wird ein gleiches Volumen an 2 × SDS PAGE-Ladepuffer zugesetzt und die Probe wird 5 min gekocht. Proteine (30 μg/Bahn) werden an 4–20% SDS PAGE-Gradientgelen (Novex) nach der Größe aufgetrennt und anschließend mittels 2 stündiger Elektrophorese bei 100 mA in Towbin-Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin), der 20% Methanol enthält, auf Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wird 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Blockpuffer (5% fettfreie Trockenmilch in DPBS, ergänzt mit 0,1% Tween-20) vorbehandelt und dreimal in DPBS/0,1% Tween-20 gewaschen. Die Membran wird über Nacht bei 4°C mit einer 1 : 250-Verdünnung von monoklonalem Anti-COX-2-Antikörper (Transduction Laboratories) in Blockpuffer inkubiert. Nach 3 Waschungen in DPBS/0,1% Tween-20 wird die Membran mit einer 1 : 1000-Verdünnung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Schafantiserum zu Maus Ig (Amersham) in Blockpuffer 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird die Membran wieder dreimal in DPBS/0,1% Tween-20 gewaschen und ein ECL Nachweissystem (SuperSignaI^TMCL-HRP Substrate System, Pierce) wird verwendet, um die Höhe der Expression von COX-2 zu bestimmen.
Obgleich wir vorstehend eine Zahl von Ausführungsformen dieser Erfindung dargestellt haben, ist es offensichtlich, dass unsere Grundkonstruktion abgeändert werden kann, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die Verfahren dieser Erfindung verwenden.

Claims

Verbindung der Formel:
oder Tautomere oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon; wobei: HET einen 5- bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, S- oder O-Atomen darstellt, wobei der Heterocyclus mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkylresten substituiert ist und gegebenenfalls mit einem Halogenatom, einer Cyanogruppe, einem Rest N(R')₂, OR', CO₂R', CON(R')₂ und SO₂N(R₂)₂ substituiert ist; X gleich 0 oder NR' ist; n gleich 1 bis 3 ist; R' ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom, C₁-C₃-Alkyl-, C₂-C₃-Alkenyl- oder Alkinylrest, einer Phenylgruppe oder einem Phenylrest, welcher mit 1 bis 3 Substituenten substituiert ist, welche unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einem Halogenatom, einer Methoxy-, Cyano-, Nitro-, Amino-, Hydroxy-, Methyl- oder Ethylgruppe; R₁ ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom; C₁-C₃-Allcylrest, OH oder O-(C₁-C₃)-Alkykest; R₂ ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom, C₁-C₃-Alkyl- oder C₁-C₃-Alkenylrest; wobei jeder der Reste gegebenenfalls mit N(R')₂, -OR', -SR', -C(O)-N(R')₂, -S(O₂)-N(R')₂, -C(O)-OR' oder R³ substituiert ist; und R₃ ausgewählt ist aus 5- bis 6-gliedrigen aromatischen carbocyclischen oder heterocyclischen Ringsystemen.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁ ein Wasserstoffatom ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei n gleich 1 ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei HET ein Imidazol-, Triazol-, Thiazol-, Oxazol-, Pyridyl- oder Pyrimidylring ist, welcher mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkykesten substituiert ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R₁ ein Wasserstoffatom ist, n gleich 1 ist und HET ein Imidazol-, Triazol-, Thiazol-, Oxazol-, Pyridyl- oder Pyrimidylring ist, welchen mit 1 bis 3 verzweigten oder geradkettigen C₁-C₄-Alkylresten substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei R₁ gleich H ist, n gleich 1 ist und HET ein Imidazol- oder Pyridylring ist, welcher mit einem C₁-C₃-Alkylrest substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung
Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einer zur Inhibierung von p38 wirksamen Menge zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung von Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, destruktiven Knochenerkrankungen, proliferativen Erkrankungen, Infektionskrankheiten, neurodegenerativen Krankheiten, Allergien, Reperfusion/Ischämie bei Schlaganfall, Herzinfarkten, angiogenen Erkrankungen, Hypoxie der Organe, vaskulärer Hyperplasie, Herzhypertrophie; Thrombin-induzierter Aggregation der Blutplättchen oder mit Prostaglandin Endoperoxidase Synthase-2 in Zusammenhang stehenden Zuständen.
Verwendung gemäß Anspruch 9, zur Behandlung oder Verhinderung von Entzündungskrankheiten, ausgewählt aus akuter Pankreatitis, chronischer Pankreatitis, Asthma, Allergien oder Atemnotsyndrom (Schocklunge), einer Autoimmunkrankheit, ausgewählt aus Glomerulonephritis, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus Erythematosus, Sclerodermie, chronischer Thyroiditis, Basedowsche-Krankheit, Autoimmungastritis, Diabetes, autoimmunhämolytische Anämie, Autoimmunneutropenie, Thrombozytopenie, atopischer Dermatitis, chronische aktive Hepatitis, Myasthenia Gravis, Multiple Sklerose, entzündliche Darmerkrankung, Colitis Ulcerosa, Enteritis Regionalis Crohn, Psoriasis oder Transplantat-Wirt-Reaktion, einer destruktiven Knochenerkrankung, ausgewählt aus Osteoarthrose, Osteoporose oder einer mit multiplem Myelom in Zusammenhang stehenden Knochenerkrankung, einer proliferativen Erkrankung, ausgewählt aus akuter myeloischer Leukämie, chronischer myeloischer Leukämie, metastatischem Melanom, Kaposi-Sarkom oder multiplem Myelom, einer Infektionskrankheit ausgewählt aus Sepsis, septischem Schock oder Shigellose, einer Viruskrankheit, ausgewählt aus akute Hepatitisinfektion, HIV-Infektion oder CMV-Retinitis, einer neurodegenerativen Krankheit, ausgewählt aus Alzheimersche-Krankheit, Parkinsonsche-Krankheit, cerebrale Ischämie oder neurodegenerativer Krankheit, welche durch eine traumatische Verletzung hervorgerufen ist, Ischämie/Reperfusion bei Schlaganfall oder Myokardischämie, Nierenischämie, Herzinfarkt, Organhypoxie oder Thrombininduzierte Blutplättchenaggregation, oder einer angiogenen Erkrankung, ausgewählt aus soliden Tumoren, okkulärer Revaskularisation oder infantilen Hämangiomen.
Verwendung gemäß Anspruch 9, zur Behandlung oder Verhinderung eines Zustandes, der mit Prostaglandin Endoperoxid Synthase-2 in Zusammenhang steht, ausgewählt aus Ödem, Fieber, Analgesie oder Schmerz.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Schmerz ausgewählt ist aus neuromuskulärem Schmerz, Kopfschmerz, Krebsschmerz, Zahnschmerz oder Arthritisschmerz.