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DE69836745T2 - Hochtransformierbare bakterienzellen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Hochtransformierbare bakterienzellen und verfahren zu deren herstellung Download PDF

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DE69836745T2
DE69836745T2 DE69836745T DE69836745T DE69836745T2 DE 69836745 T2 DE69836745 T2 DE 69836745T2 DE 69836745 T DE69836745 T DE 69836745T DE 69836745 T DE69836745 T DE 69836745T DE 69836745 T2 DE69836745 T2 DE 69836745T2
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Germany
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cells
hte
strain
coli
competent
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DE69836745T
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Lewis Alan San Diego GREENER
Douglas Bruce San Diego JERPSETH
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Agilent Technologies Inc
Original Assignee
Stratagene California
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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der rekombinanten DNA Technologie. Spezifischer beschreibt die Erfindung eine neue bakterielle Mutation, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, einen Phänotyp mit hoher Transformationseffizienz zu verleihen, sowie Verfahren zur Herstellung von hochkompetenten Zellen unter Verwendung von Bakterien, welche die neue Mutation enthalten.
  • Hintergrund
  • Der Vorgang des Einführens von DNA (und anderen ähnlichen Polynukleotiden) in Wirtszellen ist ein Hauptaspekt der rekombinanten DNA Technologie. Das Verfahren, durch das Polynukleotide in Wirtszellen eingeführt werden, wird Transformation genannt. Bakterienzellen bleiben im allgemeinen die bevorzugten Wirte für die Mehrzahl von Experimenten mit rekombinanter DNA sowie für gentechnologische Manipulationen. Von besonderem Interesse für gentechnologische Experimente ist das Bakterium Escherichia coli. Da die "Kompetenz" (die Fähigkeit zur effizienten Aufnahme exogener DNA) kein natürliches Merkmal des Wachstumszyklus von E. coli ist, müssen künstliche Verfahren verwendet werden, um exogene Polynukleotide in E. coli einzuführen. Von besonderem Interesse sind eine Anzahl von Kompetenz-erzeugenden Kompetenz-induzierenden Verfahren, die Bakterien, einschließlich E. coli, für exogene Nukleinsäuren permeabler (durchlässiger) machen. Bakterienzellen, die behandelt wurden, um ihre Permeabilität gegenüber Polynukleotiden zu erhöhen, werden im allgemeinen als kompetente Zellen bezeichnet.
  • Es gibt zahlreiche etablierte Verfahren zur Herstellung kompetenter Zellen. Diese Verfahren schließen die CaCl2-Inkubationsverfahren von Mandel und Higa, J. of Mol. Biol. 53:159 (1970), ebenso wie eine Vielzahl wohlbekannter Varianten davon ein. Hanahan hat eine detaillierte Studie über Faktoren durchgeführt, welche die Effizienz der Transformation von E. coli Zellen bewirken (J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983)), in der er ein Verfahren zur Herstellung hochkompetenter E. coli Zellen beschreibt, das den Schritt des Waschens der E. coli Zellen in einem Puffer umfasst, der Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2 und Hexaminkobaltchlorid umfasst, und das allgemein als das beste verfügbare Verfahren zur Herstellung hochkompetenter E. coli betrachtet wird. Ein anderes Verfahren zur Herstellung kompetenter E. coli Zellen wird von Jessee et al., US. Patent 4,981,797 beschrieben. Jessee et al. zeigen, dass ein hoher Grad an Kompetenz durch Wachstum von E. coli Zellen in einem Temperaturbereich von 18° C bis 32° C als Teil des Kompetenz-induzierenden Verfahrens erzeugt werden kann.
  • Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung kompetenter E. coli Zellen erzeugen kompetente E. coli Zellen, die variierende Transformationseffizienzen aufweisen. Der genaue Mechanismus, durch den DNA in kompetente E. coli eindringt, ist nicht vollständig verstanden. Auch ist nicht vollständig verstanden, warum eine Zusammensetzung kompetenter E. coli Zellen sich in ihrer Transformationseffizienz von der einer anderen Zusammensetzung kompetenter E. coli Zellen unterscheidet. Hanahan, in Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Herausgeber F.C. Neidhardt, American Society for Mikrobiology, Washington, D.C. (1987).
  • Die obigen Verfahren wurden weiterhin optimiert, um Effizienzen von etwa 1 × 109 cfu/μg Plasmid DNA in Supercoiled-Form zu erreichen. Obwohl diese Zahl hoch erscheint, ist die theoretische Effizienz für das Testplasmid (pUC) 3 × 1011 cfu/μg. Darüber hinaus war, wenn das Verfahren auf die praktischen Laborbedingungen angewendet wurde, wie z.B. die Transformation von DNA-Substraten, die ligiert waren, eher als dass sie in Supercoiled-Form vorlagen, die tatsächliche Anzahl der beobachteten Kolonie-bildenden Einheiten um viele Zehnerpotenzen geringer als die, die erreicht wurde, wenn pUC in Supercoiled-Form als Testsubstrat verwendet wurde,.
  • Selbst mit Hilfe der kürzlichen Weiterentwicklungen ist nur eine winzige Fraktion der Zellen bei der Herstellung von "kompetenten" E. coli Zellen tatsächlich kompetent für die Aufnahme von DNA. Folglich können die derzeit zur Erzeugung von Zusammensetzungen kompetenter E. coli Zellen verwendeten Verfahren und Zellen noch signifikant verbessert werden.
  • Alternativ können auch andere Verfahren zur Herstellung kompetenter Zellen zu der Bildung kompetenter E. coli Zellen führen, die jeweils eine verstärkte Fähigkeit aufweisen, exogen zugeführte DNA zu replizieren und zu exprimieren. Hanahan hat in J. Mol. Bio. 166:557-580 (1983) die Vermutung geäußert, dass kompetente E. coli Zellen Kanäle für den Transport der DNA durch die Zellhülle enthalten und dass der limitierende Schritt bei der Bestimmung der Kompetenz zur Transformation von E. coli Zellen Ereignisse sind, die in der Zelle auftreten, nachdem die Zelle die DNA von Interesse aufgenommen hat, d.h. der Eröffnungsschritt (establishment step). Ein weiterer Faktor, der die Transformationseffizienz einer Zusammensetzung kompetenter E. coli Zellen beeinflusst, ist der Genotyp der Zellen. Von einigen E. coli Stämmen ist bekannt, dass sie zu verbesserten hochtransformierbaren kompetenten Zellzusammensetzungen führen als andere E. coli Stämme, die den selben Kompetenz-induzierenden Prozeduren unterzogen wurden.
  • Nach der ursprünglichen Endeckung, dass E. coli für die Aufnahme von DNA kompetent gemacht werden kann, wurden Studien durchgeführt, um die Transformationseffzienz zu erhöhen. Der maximale Grad der Transformationseffizienz, der unter Verwendung des Verfahrens von Hanahan erhalten wurde, das in J. Mol. Bio. 166:557-580 (1987) beschrieben wurde und das den Schritt des Waschens der Zellen in einem Puffer umfasst, der Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2, Glycerin und Hexaminkobaltchlorid enthält, beträgt etwa 1 × 109 Transformanten pro Mikrogramm pUC18 Plasmid DNA in Supercoiled-Form. Auf einer Basis pro Zelle entspricht dies etwa 1 Zelle von 300 in der Population, die tatsächlich transformiert wird. Jedoch gilt die oben genannte Zahl im allgemeinen nur für kleine Plasmide in Supercoiled-Form. Wenn große Plasmide oder ligierte Moleküle verwendet werden, wie es bei vielen Experimenten mit rekombinanter DNA der Fall ist, wird die Anzahl der "kompetenten" Zellen, die tatsächlich transformiert werden, drastisch reduziert. Daher gibt es weiterhin einen Bedarf an neuen und verbesserten Verfahren zur Herstellung kompetenter E. coli mit besserer Transformationsfähigkeit, ebenso wie an neuen E. coli Stämmen, die eine verbesserte Transformationsfähigkeit aufweisen. Solche Verfahren und Stämme wären von großem Interesse für die meisten Forscher auf dem Gebiet der Gentechnik, insofern als die Anzahl der benötigten Transformationen, um das gewünschte Resultat zu erhalten, minimiert werden würde. Folglich könnten z.B. größere genetische Bibliotheken einfacher erstellt werden, ebenso könnte die Konstruktion komplexer rekombinanter Moleküle einfacher erreicht werden.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die hierin beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung neuer Stämme hochtransformierbarer gramnegativer Bakterienzellen wie z.B. E. coli zur Verfügung, die in einer Vielzahl von Kompetenz-induzierenden Verfahren verwendet werden können. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Verfahren der Mutagenisierung von Bakterienzellen, die Auswahl der mutagenisierten Zellen aufgrund eines Hocheffi zienz-Transformationsphänotyps, und die Verwendung des mutierten genetischen Materials, das für die hocheffiziente Transformation verantwortlich ist (oder damit in Verbindung steht) zum Erzeugen neuer Zusammensetzungen hochkompetenter Bakterien.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein biologisch reiner E. coli Stamm, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Hte Mutation umfasst, die einen Phänotyp mit hoher Effizienz der Transformation (fremder Plasmide) im Vergleich zu E. coli verleiht, dem eine Hte Mutation fehlt.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der neue E. coli Stamm XL10-GOLD, der den Genotyp Δ (mcrA) 183 Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac tetR Hte* {F'proAB laclqZΔ M15 Tn1O(TetR) Amy CamR} aufweist. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf gefrorene Zusammensetzungen solcher Zellen sowie auf Verfahren, um die Zellen kompetent zu machen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Zellen, die eine Hte Mutation tragen, zur Klonierung oder Subklonierung von heterologem genetischen Material von Interesse.
  • Beste Form zur Ausführung der Erfindung
  • Die vorliegend beschriebene Erfindung schließt gramnegative Bakterienzellen wie z.B. E. coli ein, die genetisch modifiziert wurden, so dass sie im Vergleich zu E. coli Zellen, denen die genetische Modifikation fehlt, eine erhöhte Transformationseffizienz aufweisen, nachdem sie mit Hilfe eines geeigneten Kompetenz-erzeugenden Verfahrens behandelt wurden. Es wurde zuvor gezeigt, dass Mikroorganismen, die den geeigneten Genotyp aufweisen, stark erhöhte Transformationseffizienzen aufweisen können. Insbesondere beschreibt das US Patent Nr. 5,512,468, das hiermit durch Referenz eingeschlossen ist, wie das Vorhandensein des α-Amylasegens in E. coli die Transformationseffizienz erhöht.
  • Die Bakterienzellen der vorliegenden Erfindung wurden durch Einführen einer mutierten Hte Region modifiziert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Hte Region gekennzeichnet als eine Region, die solchen Zellen einen Phänotyp mit hoher Transformationseffizienz verleiht, die die mutierte Form der Hte Region tragen. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung soll die Bezeichnung "Einführung", wie hierin verwendet, die Insertion einer mutierten Variante der Hte Region in das Bakteriengenom mit Hilfe der homologen oder nicht-homologen Rekombination oder das episomale Vorhandensein einer mutierten Variante der Hte Region bedeuten. Ähnlich wird eine Hte Mutante definiert als eine mutierte Form des Hte Lokus, die einem bakteriellen Wirt, der die Hte Mutation trägt, einen Phänotyp mit hoher Transformationseffizienz verleiht.
  • Vorzugsweise sollten die bakteriellen Wirte, welche die mutierten Varianten der Hte Region tragen, biologisch rein sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll ein "biologisch reiner" Bakterienstamm von einer einzigen Zelle abgeleitet sein oder soll wenigstens zu etwa 99,9 Prozent aus Zellen bestehen, die einen direkten gemeinsamen Vorläufer haben.
  • Die Hte Region wurde mit Hilfe des Screenings/der Selektion mutagenisierter E. coli aufgrund eines Phänotyps mit erhöhter Transformationseffizienz identifiziert. Insbesondere wurde eine Reihe von Transformationsschritten verwendet, um gemischte Populationen mit bakteriellen Mutanten zu screenen, um selektiv die Population der "kompetenten" Zellen anzureichern. Die selektive Eigenschaft des Transformations-Screeningverfahrens hatte seine Ursache in der Verwendung einer limitierten Menge DNA. Das Limitieren der während der Transformation verwendeten DNA Menge erlaubte unerwarteter Weise die Anreicherung und Identifizierung von Zellen, die eine erhöhte Transformationseffizienz aufwiesen, nachdem eine Antibiotika-Selektion durchgeführt wurde. Frühere Studien hatten darauf hingewiesen, dass nahezu alle Zellen in einer bestimmten Kultur exogen dazugegebene DNA binden, jedoch nur ein kleiner Anteil der Zellen, die tatsächlich "kompetent" für die Aufnahme der DNA sind, transformiert werden. Angesichts dieser Reaktionskinetiken würde man nicht erwarten, dass ein Limitieren der Menge an zugegebener DNA die effiziente Selektion von Zellen erlauben würde, die eine erhöhte Transformationseffizienz aufweisen. Im allgemeinen beschreibt eine "limitierende" Menge an DNA eine Situation, in der das molare Verhältnis von DNA/Zellen weniger als 1 ist, typischerweise weniger als etwa 0,5, noch typischerweise weniger als etwa 0,1 und insbesondere weniger als etwa 0,05 und bevorzugterweise etwa 0, 001.
  • Mehrere Runden (wenigstens zwei Runden bis hin zu irgendeiner durchführbaren Zahl) der Selektion durch Transformation können verwendet werden, um noch stringenter nach Zellen zu selektieren, die die Eigenschaft aufweisen, zur hocheffizienten Transformation fähig zu sein. Vorzugsweise werden aufeinanderfolgende Runden der Selektion durch Transformation durchgeführt werden, unter Verwendung einer Reihe verschiede ner Vektoren und selektierbarer Marker. Gegebenenfalls sollten die verschiedenen während der mehrfachen Runden der Selektion durch Transformation verwendeten Vektoren vorzugsweise jeweils Replikationsursprünge enthalten, die aus den verschiedenen Plasmid-Inkompatibilitätsgruppen ausgewählt sind. Zusätzlich können die verschiedenen, nach einer bestimmten Selektionsrunde erhaltenen Transformanten einzeln oder gemeinsam vor der nächsten Runde der Selektion durch Transformation gewonnen werden, obwohl dies nicht notwendig ist.
  • Nachdem Bakterien identifiziert wurden, die den gewünschten Phänotyp der hohen Transformationseffizienz zeigen, wurde eine Transposon-Bibliothek erzeugt, und eine allgemeine P1 Transduktion wurde verwendet, um die mutierte Hte Region in geeignete Empfängerstämme zu transferieren. Die resultierenden "Hte " Bakterien zeigten eine erhöhte Transformationseffizienz im Vergleich zu Zellen, welche die Hte Region nicht inkorporiert hatten, und eine besonders erhöhte Transformationseffizienz für Plasmide in der Relaxed-Form sowie für große Plasmide. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Transformationseffizienz" eine Maßeinheit für den Grad der Kompetenz einer bestimmten Zusammensetzung kompetenter Zellen. Die Transformationseffizienz wird ausgedrückt als die Anzahl der Transformanten, die für jedes Mikrogramm (oder einer anderen Menge) exogene DNA erhalten wird, die zu einer kompetenten Zellzusammensetzung dazugegeben wird.
  • Üblicherweise wird die Gegenwart der Hte Region die Transformationseffizienz eines bestimmten Bakteriums funktionell wenigstens etwa zweifach erhöhen, noch üblicher wenigstens etwa vierfach und bevorzugterweise um wenigstens etwa eine Zehnerpotenz. Von besonderem Interesse ist, dass die Gegenwart der Hte Region die Transformationseffizienzen für große Plasmide und topologisch entspannte (relaxed) Plasmide (Plasmide, die weder wesentlich supercoiled noch unterspiralisiert sind) erhöht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll sich der Begriff "großes Plasmid" üblicherweise auf Plasmide beziehen, die wenigstens etwa 15 kb groß sind, vorzugsweise wenigstens etwa 25 kb bis etwa 100 kb. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Vorhandensein einer mutierten Variante der Hte Region in einem bestimmten Bakterium die Transformationseffizienz für große und/oder entspannte Plasmide üblicherweise um wenigstens das Zweifache, üblicherweise wenigstens etwa das Vierfache, vorzugsweise um wenigstens etwa das Sechs- bis Achtfache und am bevorzugtesten um wenigstens etwa ein bis zwei Zehnerpotenzen erhöhen.
  • Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der neue E. coli Stamm XL10-GOLD. Am 28 April 1997 wurde der Stamm XL10-GOLD bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und der dazugehörigen Regeln (Budapester Vertrag) hinterlegt, und wird folglich gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages aufrecht erhalten und zugänglich gemacht. Die Verfügbarkeit eines solchen Stammes ist nicht als Lizenz zu verstehen, die Erfindung in Zuwiderhandlung der gemäß dem Recht einer jeden Regierung in Übereinstimmung mit dessen Patentrecht eingeräumten Rechten zu praktizieren.
  • Der hinterlegten Kultur wurde die angegebene ATCC Hinterlegungsnummer zugewiesen: ATCC Nr.
    XL10-GOLD 55962
  • Weitere Aspekte der Erfindung schließen Verfahren ein, um gramnegative Bakterien, wie z.B. E. coli Zellen, kompetent für die Transformation zu machen. Diese Verfahren schließen wenigstens den Schritt des Transferierens eines Polynukleotids, das für eine geeignete mutierte Variante der Hte Region kodiert, in E. coli ein. Derartige modifizierte Zellen können anschließend unter Verwendung irgend eines der vielfältigen Kompetenzinduzierenden Verfahren kompetent gemacht werden. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Kompetenz-erzeugendes bzw. Kompetenzinduzierendes Verfahren" auf ein jegliches Verfahren, das verwendet wird, um E. coli Zellen für die Transformation mit Hilfe exogener DNA kompetent zu machen. Kompetenzinduzierende Verfahren für E. coli (und andere gramnegative Bakterien) sind dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohl bekannt. Obwohl sich Kompetenz-induzierende Methoden beträchtlich voneinander unterscheiden, schließen fast alle Kompetenz-induzierenden Methoden das Exponieren der Zellen gegenüber multivalenten Kationen und nahe 0° C ein. Kompetenz-induzierende Verfahren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: das CaCl2 Inkubationsverfahren von Mandel und Higa (J. Mol. Bio., 53:159 (1970)), sowie das Verfahren von Hanahan, J. Mol. Bio., 166:557-580 (1983), das die Behandlung der Zellen in einer Reihe von Puffern umfasst, die Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2, Glycerin und Hexamincobaltchlorid enthalten. Das Verfahren von Hana han wird für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Zusätzlich zu den von Hanahan gelehrten Puffern oder anstelle dieser Puffer können Puffer verwendet werden, die Rubidiumchlorid enthalten. Zusätzliche Lehren sind unter anderem in US Patent 4,981,797 (Jessee) und Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989), und in regelmäßigen Neuauflagen davon sowie in Hanahan und Bloom, in Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology, "Mechanisms of DNA Transformation", Herausgeber F.C. Neidhardt, American Society for Mikrobiology, Washington, D.C. (1996) zu finden, die hierin durch Referenz eingeschlossen sind.
  • Die kompetenten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung der meisten wohlbekannten Transformationsverfahren transformiert werden. Diese Verfahren schließen üblicherweise den Schritt des Exponierens kompetenter Zellen gegenüber Hitzepulsen in Gegenwart exogener DNA ein. Beispiele für derartige Transformationsverfahren sind in Mandel und Higa, J. of Mol. Biol. 53:159 (1970) und den Standardverfahren zur Erzeugung einer hohen Kompetenz, das von Hanahan beschrieben wurde (1983) J. Mol. Bio. 166:557-580 (1983), zu finden.
  • Die zur Einführung der Hte Region in einen Bakterienwirt verwendeten genetischen Konstrukte können so konstruiert werden, dass sie entweder autonom in den Bakterienzellen replizieren oder in das Genom der Bakterienzelle aufgenommen werden. Vorzugsweise sind die genetischen Konstrukte, die für die Hte Region kodieren, so konstruiert, dass sie eine stabile Aufrechterhaltung der Hte Region in der Wirtszelle gewährleisten. Darüber hinaus sollte das Konstrukt, wenn das genetische Konstrukt autonom repliziert, keinen Replikationsursprung, wie z.B. ein colE1 Replicon, umfassen, der zu einer Plasmid-Inkompatibilität mit weit verbreiteten bakteriellen Vektoren führt.
  • Zusätzlich zu der Polynukleotidsequenz, die für die Hte Region kodiert, kann das genetische Konstrukt außerdem irgendeinen der zahlreichen konventionellen genetischen Vektoren umfassen, wie z.B. Plasmide, Phagen, Phagemide und dergleichen.
  • Vorzugsweise wird das genetische Konstrukt die wesentlichen Gene, die innerhalb der Hte Region kodiert werden, exprimieren. Verfahren zur Expression von Genen von Interesse in E. coli und anderen gramnegativen Bakterien sind wohl bekannt. Als Beispiel für solche Verfahren siehe Gene Expression Technology: Methods and Enzymology, Vol. 185, Goeddel, Herausgeber, Academic Press, Incorporated, San Diego, California (1991).
  • Die genetischen Konstrukte, die für die Hte Region kodierenden Polynukleotide enthalten, können unter Verwendung verschiedenster Transformationsmethoden in die E. coli Zelle eingeführt werden, einschließlich der Transformation, Konjugation, des triparenteralen Matings, der spezialisierten oder allgemeinen Phagentransduktion, Elektroporation und dergleichen. Die kompetenten E. coli Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung werden hergestellt, sobald die beschriebenen Hte Zellen einem Kompetenzinduzierenden Verfahren unterzogen werden. Nachdem die E. coli Zellen mit Hilfe eines Kompetenz-induzierenden Verfahrens kompetent gemacht wurden, können die Zellen eingefroren werde4n, so dass sie ihre Kompetenz beim Auftauen beibehalten. Gefrorene kompetente Zellen sind besonders nützliche Ausführungsformen der Erfindung, da sie über lange Zeiträume gelagert werden können, wodurch die Notwendigkeit vermieden wird, ständig frische Herstellungen kompetenter Zellen zu produzieren. Protokolle zur Herstellung gefrorener kompetenter Zellen sind dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Ein Beispiel für ein derartiges Protokoll ist in Hanahan, J. Mol. Bio. 166:557-580 (1983) zu finden.
  • Es ist außerdem zu berücksichtigen, dass die gemessene Transformationseffizienz einer bestimmten Zusammensetzung kompetenter Zellen unter Verwendung eines bestimmten Transformationsprotokolls im allgemeinen Abhängig von der jeweiligen exogenen DNA, die verwendet wird, um die Bakterien zu transformieren, variieren wird. Insbesondere können Faktoren wie die Größe und Topologie der exogenen DNA die Transformationseffizienz signifikant beeinflussen.
  • Die Einführung eines genetischen Konstruktes, das für die Hte Region kodiert, erhöht die Transformationseffizienz der Zusammensetzungen einer Vielzahl von E. coli Stämmen. Üblicherweise kann der Genotyp eines bestimmten E. coli Stammes, der die Hte Region enthält, in der Weise selektiert werden, dass er für ein bestimmtes gentechnologisches Experiment besonders nützlich ist.
  • Angesichts des vorliegend beschriebenen Selektionsverfahrens, der phänotypischen Screening-Verfahren und der hinterlegten E. coli Stämme, können eine Vielzahl von genetischen und molekularbiologischen Verfahren angewendet werden, um die Struktur der Hte Region und die spezifische Mutation oder Mutationen, die für den Phänotyp der hohen Transformationseffizienz verantwortlich ist/sind, weiter zu definieren. Beispiele für solche Verfahren wurden in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, (1. Herausgeber) und Sambrook, J. et al., (2. Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har bor (1982, 1989); Methods in Enzymol., Band 68, 100, 118 und 152-155 (1979, 1983, 1986 und 1987); und Molecular Cloning, D.M. Clover, Herausgeber, IRL Press, Oxford (1985) beschrieben. Mediumzusammensetzungen und allgemeine mikrobielle genetische Verfahren wurden in Miller, J.H., A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York (1995), die hierin durch Referenz eingeschlossen sind, ebenso wie in den zuvor angegebenen Referenzen beschrieben. Die DNA Manipulationen und Enzymbehandlungen werden in Übereinstimmung mit den von den Herstellern empfohlenen Verfahren ausgeführt.
  • Sobald das spezifische Gen oder die spezifischen Gene (im Falle eines Operons) in der Hte Region charakterisiert worden sind, die für den Phänotyp der hoch effizienten Transformation verantwortlich sind, können die kodierten Produkte, die mit dem Phänotyp der hocheffizienten Transformation assoziiert sind, ebenso charakterisiert werden. Dem entsprechend sind Hte Proteine oder funktionelle Derivate davon, die mit dem Phänotyp der hoch effizienten Transformation assoziiert sind, wie mit Hilfe der vorliegend beschriebenen Selektionsverfahren und Screening-Verfahren festgestellt wurde, eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff "Hte Proteine", wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf Proteine, die die Sequenz der Aminosäurereste der mutierten Form des Hte Proteins haben, das den gewünschten Phänotyp verleiht, sondern bezieht sich außerdem auf funktionelle Derivate und Varianten des natürlich vorkommenden Hte Proteins.
  • Ein "funktionelles Derivat" eines Hte Proteins ist eine Verbindung, die eine gemeinsame qualitative biologische Aktivität mit dem Hte Protein aufweist. Vorzugsweise schließen "funktionelle Derivate" Fragmente mutierter oder nativer Hte Proteine und Derivate der Hte Proteine sowie ihre Fragmente ein, vorausgesetzt dass diese den gewünschten Phänotyp verleihen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. "Fragmente" umfassen Regionen innerhalb der Sequenz eines reifen Polypeptids. Der Begriff "Derivat" wird verwendet, um Aminosäuresequenz-Varianten eines Hte Proteins zu definieren, und der Begriff "Variante" bezieht sich ebenfalls auf Aminosäuresequenzen und Varianten innerhalb dieser Definition.
  • Vorzugsweise sind die funktionellen Derivate Polypeptide, die wenigstens 65% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugt etwa 75% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter wenigstens 85% Aminosäuresequenzidentität, am bevorzugtesten wenigstens etwa 95% Aminosäuresequenzidentität mit der entsprechenden Region eines entspre chenden Hte Proteins oder Hte Polypeptids aufweisen. Am bevorzugtesten behalten die funktionellen Derivate eines Hte Proteins die Region oder die Regionen innerhalb des Hte Proteins, die direkt für die Verleihung des Phänotyps der hohen Transformationseffizienz verantwortlich sind, bei oder imitieren diese.
  • Funktionelle Derivate des Hte Proteins schließen außerdem chemisch modifizierte oder derivatisierte Moleküle ein, die von dem Hte Protein abgeleitet sind.
  • Die Bezeichnung "funktionelles Derivat" schließt weiterhin und spezifisch Peptide und kleine organische Moleküle ein, die eine gemeinsame qualitative biologische Aktivität mit dem Hte Protein aufweisen.
  • "Identität" oder "Homologie" in Bezug auf ein Hte Protein wird hierin definiert als der prozentuale Anteil der Aminosäurereste in der Kandidatensequenz, die identisch mit den entsprechenden Resten eines nativen Hte Polypeptids sind, nachdem die Sequenzen aligned wurden und – sofern nötig – Lücken eingefügt wurden, um die maximale prozentuale Homologie zu erreichen, wobei konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Weder N- oder C-terminale Verlängerungen, noch Insertionen sollten so gewertet werden, dass sie die Identität oder Homologie verringern. Verfahren und Computerprogramme zum Alignen sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
  • Sobald ein Gen, das ein Hte Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodiert, identifiziert und kloniert wurde, werden Aminosäuresequenz-Varianten des Hte Proteins oder funktionelle Fragmente davon mit Hilfe der auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt, indem geeignete Nukleotid-Austausche in eine native Hte DNA Sequenz eingeführt werden, oder mit Hilfe einer in vitro Synthese des gewünschten Polypeptids. Es gibt zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenz-Varianten: die Lokalisation des Mutationsortes und die Art der Mutation. Die Aminosäuresequenz-Varianten des Hte Proteins werden vorzugsweise durch Mutieren des Hte Gens konstruiert, um entsprechende Hte Aminosäuresequenz-Varianten zu erzeugen, die in der Natur nicht vorkommen.
  • Solche Mutanten können z.B. als Frame-shift-Mutationen hergestellt werden, die zu einem veränderten Leserahmen und zu einer verfrühten Termination der Translation führen, um ein trunkiertes Hte Molekül herzustellen. In ähnlicher Weise können In-Frame-Deletionen in dem Hte Gen vorgenommen werden, die in effizienter Weise zu der Entfernung eines erheblichen Teils des Hte Proteins führen. Derartige Aminosäuresequenz- Deletionen bewegen sich im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten und sind üblicherweise, jedoch nicht unbedingt, zusammenhängend. Deletionen werden im allgemeinen in Regionen eingeführt, die nicht direkt in die Ligandenbindung involviert sind.
  • Alternativ oder zusätzlich können Aminosäureänderungen an Stellen, die sich in Hte Proteinen aus anderen Bakterienspezies unterscheiden, oder in hoch konservierte Regionen eingeführt werden, abhängig von dem zu erreichenden Ziel.
  • Stellen an derartigen Orten werden üblicherweise der Reihe nach modifiziert, z.B. durch (1) Substituieren zunächst mit einer konservativen Auswahl und anschließend mittels einer radikaleren Auswahl, abhängig von den erzielten Ergebnissen, (2) Deletieren des Zielrestes oder der Zielreste, oder (3) Insertieren von Resten der gleichen oder einer anderen Klasse neben die lokalisierte Stelle oder durch Kombinationen der Alternativen 1-3.
  • Eine hilfreiche Methode wird "Alanin Scanning" genannt, Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989). Hierbei wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert und durch Alanin oder Polyalanin substituiert. Domänen, die eine funktionelle Sensibilität gegenüber der dem Alanin-Substitutionen zeigen, werden anschließend durch Einführen weiterer oder anderer Substituenten am Ort oder anstelle der Alanin-Substitution verfeinert.
  • Nachdem die gewünschte(n) Mutation(en) identifiziert wurde(n), kann das Gen, das für eine Variante des Hte Proteins kodiert, z.B. mit Hilfe der chemischen Synthese erhalten werden.
  • Bevorzugter wird die DNA, die für eine Aminosäuresequenz-Variante des Hte Proteins kodiert, mit Hilfe der ortspezifischen Mutagenese der DNA, die für eine zuvor hergestellte variante oder nicht-variante Version des Hte Proteins kodiert, hergestellt. Die ortsgerichtete (ortspezifische) Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Hte Protein-Varianten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, ebenso wie für eine ausreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz mit einer ausreichenden Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu stellen, um eine stabile Duplex auf beiden Seiten der Deletionsstelle zu bilden. Üblicherweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 50 Nukleotiden bevorzugt, wobei wenigstens etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindung der zu ändernden Sequenz vorhanden sind. Im allgemeinen sind die Verfahren der ortspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet wohl bekannt, wie durch Veröffentlichungen wie z.B. Edelmann et al., DNA 2:183 (1983), veranschaulicht wird. Wie klar sein wird, verwendet die Methode der ortspezifischen Mutagenese üblicherweise einen Phagenvektor, der sowohl in einzelsträngiger wie auch in doppelsträngiger Form vorkommt. Übliche, für die ortsgerichtete Mutagenese nützliche Vektoren schließen Vektoren wie z.B. den M13 Phagen ein. Dieser und andere Phagenvektoren sind kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Ausbildung von Oligodeoxyribonukleotid-vermittelten ortspezifischen Mutationen in DNA Fragmenten unter Verwendung von Vektoren, die von M13 abgeleitet sind, wurde von Zoller, M.J. und Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982, veröffentlicht. Außerdem können Plasmid-Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthalten, Veira et al. Meth. Enzymol. 153:3 (1987,) verwendet werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten.
  • Alternativ werden Nukleotidsubstitutionen eingeführt, indem das geeignete DNA Fragment in vitro synthetisiert wird und mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten PCR Verfahren amplifiziert wird.
  • Im allgemeinen kann die ortspezifische Mutagenese durchgeführt werden, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA Sequenz umfasst, die für das relevante Protein kodiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz enthält, wird hergestellt, im allgemeinen synthetisch, z.B. mit Hilfe des Verfahrens von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Dieser Primer wird anschließend mit dem Vektor annealed, der die einzelsträngige Proteinsequenz enthält und einer Behandlung mit DNA-polymerisierenden Enzymen wie z.B. dem Klenow Fragment der E. coli Polymerase 1 behandelt, um die Synthese des die Mutation enthaltenden Stranges zu vervollständigen. Folglich wird eine Heteroduplex gebildet, in der ein Strang für die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation enthält. Dieser Heteroduplex-Vektor wird anschließend verwendet, um geeignete Wirtszellen, wie z.B. HB101 Zellen zu transformieren, und Klone werden selektiert, welche die rekombinanten Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenz-Zusammensetzung enthalten. Anschließend kann die mutierte Region ausgeschnitten werden und für die Proteinherstellung in einen geeigneten Expressions-Vektor eingefügt werden.
  • Die PCR Technik kann ebenfalls bei der Erzeugung von Aminosäuresequenz-Varianten des Hte Proteins verwendet werden. Wenn geringe Mengen der Template DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich in ihrer Sequenz etwas von der entsprechenden Region in einer Template DNA unterscheiden, verwendet werden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA Fragmentes zu erzeugen, das sich von der Template Sequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen die Primer sich von dem Template unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid DNA wird einer der Primer so konstruiert, dass er die Position der Mutation umfasst und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit dem Sequenzabschnitt des gegenüberliegenden Stranges des Plasmids identisch sein, diese Sequenz kann jedoch irgendwo innerhalb der Plasmid DNA liegen. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nukleotiden von der des ersten Primers liegt, so dass am Ende die gesamte amplifizierte Region der DNA, die von dem Primer gebunden wird, leicht sequenziert werden kann. Eine PCR Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaares wie dem gerade beschriebenen führt zu einer Population von DNA Fragmenten, die sich an der von dem Primer spezifizierten Position unterscheiden und wenn möglich an weiteren Positionen, da die Vervielfältigung des Templates in gewisser Weise fehleranfällig ist.
  • Weitere Details der zuvor beschriebenen sowie ähnlicher Mutagenese-Verfahren sind in allgemeinen Lehrbüchern, wie z.B. Sambrock et al., Molecular Cloning: H. Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1989), und Current Protokols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausgeber John Wiley and Sons (1995), zu finden.
  • Natürlich vorkommende Aminosäuren können auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt werden:
    • (1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
    • (2) neutral hydrophob: cys, ser, thr;
    • (3) sauer: asp, glu;
    • (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
    • (5) Reste, welche die Kettenorientierung beinflussen: gly, pro; und
    • (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
  • Konservative Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds einer Gruppe durch ein anderes Mitglied innerhalb der selben Gruppe, wobei nicht-konservative Substitutionen den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen durch ein anderes mit sich bringen wird (siehe allgemein Orcutt, B.C. und Dayhoff, M.O.,Scoring Matrices, PIN Report MAT-0285, Februar 1985). Es ist zu erwarten, dass durch nicht-konservative Substitutionen erhaltene Varianten zu signifikanten Veränderungen der biologischen Eigenschaften/Funktion der erhaltenen Variante führen und zu Hte Protein-Varianten führen kann, die die normale Hte Funktion blockieren. Aminosäurepositionen, die innerhalb verschiedener Arten konserviert sind, werden im allgemeinen in einer relativ konservativen Art und Weise substituiert, wenn es das Ziel ist, die biologische Funktion zu erhalten.
  • Aminosäureinsertionen schließen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen ein, die im Bereich einer Länge von einem Rest bis hin zu Polypeptiden liegen, die hundert oder mehr Reste enthalten, ebenso wie Intrasequenz-Insertionen eines einzigen oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenz-Insertionen (d.h. Insertionen innerhalb der Hte-kodierenden Region) können im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, bevorzugter im Bereich von 1 bis 5 Resten, bevorzugter im Bereich von 1 bis 3 Resten liegen. Beispiele für teminale Insertionen schließen variante Hte Proteine ein, die eine heterologe N-terminale Signalsequenz angefügt an den N-Terminus des Hte Proteins enthalten, um die direkte zelluläre Lokalisierung oder Sekretion des Hte Proteins aus den rekombinanten Wirtszellen zu ermöglichen. Derartige Signalsequenzen werden im allgemeinen von der vorgesehenen Wirtszellart stammen und folglich homolog zu dieser sein. Geeignete Sequenzen schließen STII oder Ipp für E. coli ein. Andere Insertionsvarianten des Hte Proteins schließen C-terminale Fusionen ein. Darüber hinaus können weitere Varianten des Hte Proteins durch chemische Modifikation der einzelnen Aminosäuren oder durch die Inkorporation nicht-natürlicher Aminosäuren oder Aminosäuren mit nicht-biologischer Herkunft erhalten werden.
  • Da es häufig schwierig ist, im Voraus die Eigenschaften eines bestimmten varianten Hte Proteins vorauszusagen, wird klar sein, dass ein Screening notwendig sein wird, um die optimalen Varianten zu selektieren. Zu diesem Zwecke werden genetische Screening-Assays, wie z.B. die hierin unten beschriebenen, unverzichtbar sein.
  • Angesichts der Tatsache, dass eine veränderte Transformationseffizienz mit veränderten Zellhüllen (z.B. verändertem LPS in der äußeren Membran und eine veränderte Memb ran-Fluidität) in Zusammenhang gebracht wurden, ist es außerdem möglich, dass der durch die Hte Region bereitgestellte gewünschte Phänotyp mit einer strukturellen Anomalie in Zusammenhang steht, die durch ein verändertes oder funktionell inaktives zelluläres Protein verursacht wird. Z.B. kann die Mutagenese des Hte Gens zu der Erzeugung eines Stop-Kodons in einer kodierenden Schlüsselregion durch ein oder mehrere Transitions- oder Transversions-Mutationen geführt haben. Darüber hinaus kann eine Frame-shift-Mutation einen nativen offenen Leseraster zerstört haben, um den gewünschten Phänotyp der hohen Transformationseffizienz zu erzeugen. Wenn eine solche Mutation beteiligt ist, ist es ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung des gewünschten Phänotyps, das vollständige oder einen wesentlichen Teil des mutierten Gens zu eliminieren. Optimalerweise wird wenigstens ein essentieller Teil des Hte Gens eliminiert oder eine geeignete Frame-shift-Mutation kann erzeugt werden, indem eine Anzahl von Basen deletiert wird, die nicht durch die Zahl 3 teilbar ist. Durch Eliminieren des mutierten Gens werden die Möglichkeiten einer Reversion drastisch reduziert.
  • Optional kann das Hte Gen durch Insertionsmutagenese inaktiviert werden, indem ein selektierbarer Marker in oder nahe des Hte kodierenden Bereiches insertiert wird. Entsprechend kann die stabile Aufrechterhaltung der Hte Mutation sichergestellt werden, indem die richtige Antibiotika-Selektionsmethode zur Verfügung gestellt wird. Die Inaktivierung des Hte Lokus durch Deletion oder Insertionsaktivierung wird ebenfalls bevorzugt, wenn das Hte Gen für einen Repressor oder ein Aktivatormolekül für ein Gen oder Operon kodiert, wobei die resultierende konstitutive Expression (oder Inaktivierung) des Gens oder des Operons zu dem Hte Phänotyp beiträgt.
  • Es ist weiterhin möglich, dass die vorliegend beschriebene Hte Mutation zu einer verstärkten Expression oder Überexpression eines Genproduktes oder Operons führt. Umgekehrt ist es außerdem möglich, dass das Mutieren der Hte Region zu einer Unterexpression eines bestimmten Genproduktes oder Operons führt.
  • Zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, welche die normale Funktion des Hte Proteins inhibieren oder verstärken, so dass die Mikroorganismen, welche die Verbindung exprimieren oder einer solchen Verbindung ausgesetzt oder mit einer solchen Verbindung behandelt wurden, eine verstärkte Transformationseffizienz zeigen oder den Hte Phänotyp.
  • Die vorliegend beschriebenen Hte- kompetenten Zellen können außerdem mit anderen gewünschten genetischen Markern kombiniert werden. Z.B. kann die relevante Hte- Re gion in ein Bakterium überführt werden, das genetisch so manipuliert wurde, dass es ein Gen enthält und exprimiert, das für ein Kohlehydrat-degradierendes Enzym oder ein funktionelles Derivat davon kodiert. Vorzugsweise ist das Kohlehydrat-abbauende Enzym fähig, Stärke abzubauen. Das exprimierte Enzym ist vorzugsweise in dem periplasmatischen Raum der Zelle lokalisiert; jedoch ist die Ausführung der Erfindung nicht abhängig von irgend einer bestimmten Theorie, was die zelluläre Lokalisierung der exprimierten Kohlehydrat-abbauenden Enzyme angeht.
  • Darüber hinaus kann die Hte Region in Verbindung mit Klonierungsvektoren verwendet werden, die unter Verwendung der LacZα Fragment-Komplementierung in Zusammenhang mit einer bestimmten Mutation innerhalb des LacZ Gens gescreent werden können. In ähnlicher Weise kann die Zelle verschiedene andere Deletionen oder Mutationen enthalten, um für die Komplementierung durch die transformierende DNA zur Verfügung zu stehen. Die Wirtszelle kann entweder ein Restriktions-Modifikations-System besitzen oder es kann ihr fehlen, um die Klonierung zu beschleunigen. Den Wirtszellen kann außerdem ein oder mehrere Kombinationssystem(e), z.B. RecA, RecBC fehlen. Besonders bevorzugte E. coli Stämme zur Verwendung in der Erfindung sind der XL1-BlueTM Stamm (Stratagene, La Jolla, California), der XL1-Blue MR Stamm und der SURETM Stamm (Stratagene, La Jolla, California), die durch die Zugabe eines genetischen Konstruktes zur Expression von Alpha-Amylase modifiziert wurden, die aus einem thermophilen Bakterium isoliert wurde, und sie haben die ATCC Zugangsnummern 69480, 69481 bzw. 69482. Das Plasmid, das das Alpha-Amylasegen in den E. coli Stämmen mit den ATCC Zugangsnummern 69480, 69481 und 69482 enthält, kann einfach in andere Bakterienstämme transferiert werden, unter Verwendung von Methoden, die dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. In ähnlicher Weise kann der durchschnittliche Fachmann auf dem Gebiet das Alpha-Amylasegen aus Plasmiden in den E. coli Stämmen mit den Zugangsnummern 69480, 69481 und 69482 ausschneiden und kann das Alpha-Amylasegen in ein neues genetisches Konstrukt transferieren, bevor das Gen in einen neuen Bakterienstamm transferiert wird.
  • Obwohl auf E. coli Bezug genommen wird, können auch andere gramnegative Bakterien und Zellen durch die Einführung der Hte Region kompetenter gemacht werden. Z. B. Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Proteus, Shigella, Klebsiella und dergleichen.
  • Obwohl spezifische Beispiele von Mutagenese-Methoden hierin beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem relevanten Gebiet für fähig gehalten, jedes der vielen Mutagenese-Verfahren durchzuführen, um die in der vorliegenden Offenbarung beschriebene Erfindung zu praktizieren.
  • Angesichts der erhöhten Transformationseffizienz der Hte Mutanten, sind die vorliegend beschriebenen Zellen besonders nützlich für die Klonierung und Subklonierung von heterologem genetischem Material von Interesse. Üblicherweise schließt derartiges genetisches Material prokaryontische Gene von Interesse oder tierische Gene oder cDNA und insbesondere Gene und cDNA von Säugetieren ein. Optional wird das genetische Material von Interesse in einer genomischen Bibliothek oder cDNA Bibliothek vorkommen. Darüber hinaus sind die Hte Mutanten angesichts der verstärkten Transformationseffizienz von großen Plasmiden auch besonders nützlich bei der Klonierung, Subklonierung und Veränderung genetischen Materials von Interesse, an der große Plasmide, wie z.B. Shuttle-Vektoren aus Hefe, Virus-Vektoren von Säugern (Retrovirus, Adenovirus, Papillomavirus, Herpesvirus, Adeno-assoziierter Virus, Tollwutvirus und dergleichen beteiligt sind. Siehe allgemein Sambrock et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Vol. 3:16.1-16.89 (1989)), Virusvektoren der Pflanze oder Insektenvektoren (z.B. Baculovirus).
  • Die Erfindung, die oben beschrieben worden ist, kann besser verstanden werden unter Hinweis auf die folgenden Beispiele. Diese Beispiele dienen nur dem Zwecke der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als die Erfindung in irgend einer Weise beschränkend interpretiert werden.
  • Beispiele
  • Mutagenese des E. coli Chromosoms
  • Die Mutagenese des E. coli Chromosoms wurde mit Hilfe von durch Miller, J., (1995), A short Course in Bacterial Genetics., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY adaptierten Standardverfahren durchgeführt. 50 ml einer logarithmisch wachsenden Kultur des E. coli Stammes CAG1001 (von C. Gross, U. Wisconsin) wurden bei 4000 rpm in einer Sorvall-Zentrifuge pelletiert, einmal mit MC Puffer (100 mM MgSO4, 5 mM CaCl2) gewaschen und in 40 ml MC suspendiert. 5 ml wurden in Aliquots jeweils zu 6 sterilen Petrischalen gegeben. Fünf dieser Proben wurden mit ultraviolettem Licht verschiedener Intensitäten in dem Stratagene Stratalinker 2400 (Katalog #400075) wie folgt behandelt: Der Deckel der Schale wurde entfernt und neben die Zellen gelegt und entweder mit 100uJ, 200uJ, 300uJ, 400uJ oder 600uJ exponiert; die sechste Probe wurde nicht behandelt. Vor der Exposition wurden 5 μl eines jeden Aliquots entfernt, 10-4 verdünnt, und 100 μl wurden auf einer LB Platte ausplattiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Nach der Exposition wurden die Zellen zurück in ein 50 ml konisches Testgefäß pipetiert, und 1,2 ml 5 × LB wurde dazugegeben. Die mutagenisierten (und Kontroll) Proben wurden 1 Stunde lang inkubiert, und 5 μl wurden entfernt für die Ausplattierung zur Bestimmung der Lebensfähigkeit. 100 μl der 10-2-, 10-3- und 10-4-Verdünnungen wurden anschließend auf LB Platten aufplattiert, während die Kultur über Nacht wachsen gelassen wurde.
  • Am nächsten Tag wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte bestimmt und mit ihren nicht-mutagenisierten Gegenstücken verglichen. Die UV-Intensitäten, die zu einem 95%- bis 99%-igen Zelltod führten, wurden als geeignet ausgewählt; die Übernacht-Kulturen, die diesen Proben entsprachen, wurden vereinigt, DMSO mit einer Endkonzentration von 8% wurde dazugegeben, und die Zellen wurden bei -80° C gelagert.
  • Um einen E. coli Mutanten zu gewinnen, der eine erhöhte Transformationseffizienz sowohl für große als auch für kleine Plasmidmoleküle zeigte, wurden die oben beschriebenen UV-Überlebenden vereinigt, bis zur mittleren logarithmischen Phase wachsen gelassen, und die kompetenten Zellen wurden mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt. Diese Zellen wurden anschließend mit einer limitierenden Menge an pUC DNA (1 pg) transformiert, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. Der Hintergrund für dieses Screening war, dass wenn weniger DNA Moleküle als Zellen zu der Transformation dazugegeben wurden, jede spezifische Zelle, die "transformierbarer" war, eine höhere Wahrscheinlichkeit zur Aufnahme des pUC DNA Moleküls hätte. E. coli CAG1001 wurde als Ausgangsstamm verwendet, da er keine Mutationen trug und sup0 war (keine bekannte Suppressor tRNA Aktivität). Darüber hinaus war er im Vergleich zu Stämmen wie z.B. XL1-Blue/DHSa schwer zu transformieren (nicht veröffentlichte Beobachtungen). Folglich wäre, da die Hintergrund-Transformationseffizienz geringer war, jede Mutante mit den gewünschten Eigenschaften sichtbarer. Aus diesem Experiment wurden 1500 Transformanten aus jedem Pool erhalten. Es wurde angenommen, dass unter diesen Zellen die Mutanten wären, die eine höhere Transformationseffizienz aufwiesen (zusammen mit der Mehrheit, die unverändert aber aufgrund der statistischen Wahrscheinlichkeit transformiert war). Diese Transformanten wurde anschließend vereinigt, bis zur mittleren logarithmischen Phase wachsen gelassen, und kompetente Zellen wurden erneut hergestellt. Diese Pools wurden anschließend mit 1 ng pQL1, einem pACYC 184 Derivat (Quinn Lu, nicht veröffentlicht) transformiert, der zusammen mit pUC stabil aufrecht erhalten werden kann und der einen anderen Antibiotika-selektierbaren Marker (Chloramphenicol) trägt. Die Platten mit mehr als 200 Transformanten wurden ausgewählt und aufgehoben. Als Verfahren zur Anreicherung der Zahl von Mutanten von Interesse wurde die Anzahl der Transformanten/Pool reduziert. Durch Verwendung dieser Anzahl wurde festgestellt, dass jeder Pool so wenig wie eine einzige Mutante enthalten kann, der tatsächlich einen Phänotyp mit erhöhter Transformation aufwies. Eine Analyse dieser 200 Kolonien wurde anschließend durchgeführt, indem zufällig 90 der Kolonien ausgewählt und Präparationen kompetenter Zellen in geringem Maßstab hergestellt wurden. Die 90 wurden mit pAL205 transformiert, einem RSF1010 Derivat, das relativ groß ist (15 kb), Tetracyclin-resistent und dessen Replikationsursprung mit denen von pUC und pACYC184 kompatibel ist. Von diesen 90 wurden die 15 für die weitere Analyse ausgewählt, die die größte Anzahl an Transformanten zur Verfügung stellten (die tatsächlichen Effizienzen wurden nicht bestimmt, da die Zelldichte und andere Faktoren, die normalerweise kontrolliert werden, nicht kontrolliert wurden und da so viele gleichzeitig analysiert wurden).
  • Anschließend wurden mit Hilfe des Standardverfahrens kompetente Zellen von diesen 15 Stämmen hergestellt, wobei die optische Dichte und die verschiedenen anderen Parameter beobachtet wurden. Vier dieser Stämme zeigten eine signifikante Erhöhung der Transformationseffizienz, und diese vier bildeten den nächsten Pool für die Gewinnung von Mutanten (die Nummern 7, 12, 33 und 59).
  • Herstellung kompetenter Zellen zur Anreicherung und Auswertung
  • Kompetente Zellen von jedem der Pools potentieller Mutanten oder isolierter Mutanten (siehe unten) wurden auf identische Weise hergestellt. Die geeignete Zellmenge (10 ml -250 ml, abhängig von dem Experiment) wurde in LB Medium bis zu einer optischen Dichte (O.D. 600) von etwa 0,35 wachsen gelassen. Die Zellen wurden in die geeigneten Zentrifugenröhrchen überführt (für die 10 ml Kulturen, die in einem 50 ml konischen Testgefäß wachsen gelassen wurden, war kein Transfer notwendig) und bei 1.400 rpm bei 4° C pelletiert. Das Pellet wurde in der Hälfte seines Anfangsvolumens in FSB (10 mM Kaliumacetat pH 7,6, 45 mM Manganchlorid, 10 mM Kalziumchlorid, 3 mM Hexa mincobaltchlorid und 8% Glycerin) suspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Die Zellen wurden anschließend in 1/20 des ursprünglichen Volumens an FSB suspendiert, DMSO wurde mit einer Endkonzentration von 8% zugegeben, und die kompetenten Zellpräparationen wurden bei -80° C eingefroren. Wenn geringe Volumina an kompetenten Zellpräparationen für die sofortige Auswertung hergestellt wurden, wurden die Schritte der DMSO-Zugabe und des Einfrierens übersprungen, und 100 μl der Zellsuspension wurden direkt getestet.
  • Die Transformation der kompetenten Zellen wurde unter Standardbedingungen durchgeführt (siehe Stratagene Competent Cell Manual für Details). (3-Mercaptoethanol oder UltraBeta wurden, wie in diesen Handbüchern beschrieben, entweder dazugegeben oder nicht, abhängig von der Anwendung (siehe Text für Einzelheiten).
  • λ:: Tn10 Mutagenese
  • Die Zufalls-Insertion des Transposons Tn10 (Tetracycline-Resistenz) wurde wie von Kleckner et al., 1991, Methods in Enzymology 20:139, beschrieben durchgeführt. λ: 1098 (Tn10) ist ein defekter λ Virus, der aufgrund von Amber-Mutationen, die in dem λ 0 Gen (DNA Replikation) und int Gen (Lysogenisierung) vorhanden sind, unfähig ist, in einem sup0 E. coli Wirt zu replizieren oder diesen zu lysogenisieren. Folglich sind diese Phagen beim Eindringen in ein sup0 E. coli unfähig zur weiteren Progagierung, bleiben jedoch fähig, die kodierten Gene zu exprimieren. Dieser Phage trägt ein DNA Segment, das für das Tn10 Tetracyclin-Resistenz-Gen kodiert (umgeben von den IS10 Elementen, die für die Transposition benötigt werden). Der Phage trägt außerdem das Tn10 Transposase-Protein, das benötigt wird, um die Zufalls-Transposition zu katalysieren. Werden sup0 E. coli mit λ: 1098 infiziert, können Tetracyclin-resistente Bakterien selektiert werden, die eine Kopie des tet Resistenzgenes enthalten, das irgendwo in dem Chromosom lokalisiert ist (beachte: die Stammlösung von λ: 1098 kann auf einem sup0 E. coli hergestellt werden, da die Suppression der Amber-Mutationen in dem λ:Gen die Replikation und die anschließende Lyse dieses Wirtes erlaubt).
  • Die λ: 1098 Insertionen werden durch Infektion von 100 μl logarithmisch wachsenden E. coli mit 108 Phagenpartikeln erzeugt; da die Transpositions-Frequenz 10-4 bis 10-5 beträgt, können etwa 103 bis 10" Tetracyclin-resistente Kolonien unter Verwendung dieses Systems erhalten werden. Wurde eine größere Anzahl von Tn10 Zufallsinsertionen gewünscht, wurden mehrfache Infektionen durchgeführt.
  • Die vier potentiellen, in Abschnitt 5.1 oben beschriebenen Mutanten befanden sich in einem CAG kanR prototrophen Hintergrund. Daher war es notwendig, sämtliche chromosomalen Abschnitte aus diesen vier in ein geeignetes Derivat von XL2-Blue (XL1-MRA) zu "transferieren", in welchem das Screening wiederholt werden konnte. Das Zufalls-Transpositions-Kartienangsschema wurde verwendet, um das tet Resistenzgen zufällig in das E. coli Chromosom einzuführen. Das Zufalls-Transpositionsverfahren erforderte, dass die Zellen nicht-supprimierend (sup0) und Tetracyclin-sensitiv waren.
  • Jede der vier potentiellen Mutanten wurde der Zufalls-Transposition des Tetracyclin-Resistenzgens unterzogen und etwa 5.000 Kolonien wurden gewonnen. Wäre die Transposition zufällig, würden 50 Insertionen statistisch 1 Insertion/100 Kilobasen-Paare in dem E. coli Genom bedeuten (der Grund für die Verwendung der 1 Insertion/100 kb wird unten erklärt). Jedoch wählten wir ungefähr 5.000 TetR Derivate aus, um sicher zu stellen, dass sämtliche Bereiche des Pools repräsentiert waren und während der allgemeinen Transduktion gewonnen werden könnten.
  • Herstellung von P1 Lysaten
  • P1 Phagen-Lysate wurden wie in Miller (1995) beschrieben hergestellt. 5 ml einer Kultur des Stammes von Interesse wurde bis zur mittleren log Phase bei 37° C in LB wachsen gelassen, das mit 5 ml CaCl2 angereichert war. 1 ml der Zellen wurde in ein 12 ml Falcon 2059 Gefäß pipettiert, und 1 μl der P1 Stammlösung mit hohem Titer (108-109 pfu/ml; hergestellt auf JM101) wurde dazugegeben. Für die meisten Stammkulturen wurden die Infektionen 4-fach durchgeführt und zusammengeführt. Der Phage und die Zellen wurden bei 35° C 15 bis 20 Minuten lang ohne Schütteln inkubiert. Das Lysat wurde anschließend durch Zugabe von 2,5 ml Topagar (angereichert mit CaCl2 auf 5 mM) ausplattiert, und die Probe wurde auf NY Platten gegossen und bei 37° C über Nacht inkubiert. Am folgenden Morgen wurde der Topagar in ein 12 ml Zentrifugengefäß gegeben. Die Platten wurden mit 1 ml LB gewaschen und der verbleibende Agar/Aufschlämmung wurde in das Gefäß dazugegeben. 5 Tropfen (dazugegeben mit Hilfe einer Pasteur-Pipette) Chloroform wurden anschließend zu dem Gefäß gegeben, und die Suspension wurde gevortext (10-20 sec auf höchster Stufe). Die Proben wurden bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert, anschließend bei 5.000 rpm in einer Sorvall-Zentrifuge (4° C) für 15 Minuten zentrifugiert. Der den Phagen enthaltene Überstand wurde gewonnen und in ein neues 12 ml Zentrifugengefäß transferiert, fest verschlossen und bei 4° C gelagert.
  • P1 Transduktion
  • Die P1 Transduktion wurde wie von Miller (1995) beschrieben durchgeführt. 5 ml des Empfängerstammes wurden über Nacht in LB Medium wachsen gelassen, dem 5 mM CaCl2 zugesetzt war. Die stationäre Kultur wurde mit Hilfe der Zentrifugation in einer Sorvall-Zentrifuge bei 5.000 rpm für 5 Minuten geerntet und in dem gleichen Volumen MC Puffer (100 mM MgSO4, 5 mM CaCl2) suspendiert. Die Zellen wurden zurück in einen 37° C Luftschüttler gegeben und für 20 Minuten inkubiert, anschließend wie zuvor zentrifugiert. Die Pellets wurden in einem Volumen von 500 μl MC Puffer suspendiert; 100 μl der Zellsuspension wurden anschließend in ein 12 ml Falcon Zentrifugenröhrchen transferiert. 1 bis 100 μl des P1 Lysates (die Menge variiert abhängig von dem individuellen Titer; entsprechend wurden für jede Transduktion 1, 5, 25 und 100 μl getestet) wurden zu jedem Gefäß dazugegeben. Eine Probe wurde jeweils immer als Kontrolle unbehandelt gelassen. Die mit P1 infizierten Zellen wurden bei 37° C für etwa 15 bis 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 200 μl 1 M Natriumcitrat gestoppt. 0,5 ml LB wurden zu jeder Probe dazugegeben, und die Zellen wurden bei 37° C eine Stunde lang wachsen gelassen, um die Expression des Arzneimittel-Resistenzgenes (Tetracyclinresistenz in den hier beschriebenen Experimenten) zu ermöglichen. Nach der Expression wurden die gesamten Inhalte der Gefäße auf LB- oder NZY-Platten mit dem geeigneten Antibiotikum ausplattiert.
  • Die Wiedergewinnung der Tetracylin-Resistenzgene (und folglich der Zufallsregionen der vier in Abschnitt 5.3 beschriebenen E. coli Genome) wurde mit Hilfe der P1 Transduktion erreicht. P1 ist ein Bakteriophage, der bei der Infektion eines sensitiven E. coli Stammes seine DNA repliziert, sie verpackt, schließlich die Lyse der Wirtszelle verursacht und ihren Tod. 99% aller verpackten Partikel sind infektiöse P1 Partikel, und 1 % sind 100 kb Zufallsstücke der Wirtszellen DNA (d.h. der chromosomalen DNA von E. coli), die versehentlich verpackt wurden. Wenn diese Lysate verwendet werden, um einen neuen Wirt zu infizieren, werden 99% dieser neuen Zellen infiziert und getötet und 1 % werden zu Empfängern für die 100 kb Segmente der genomischen DNA von E. coli aus den vorangegangenen Stämmen. Wenn das Lysat in einem E. coli Stamm hergestellt wurde, der einen integrierten selektierbaren Marker hat (wie das Tn10 tet Resistenzgen), und der Empfänger fähig ist zur homologen Rekombination, dann kann ein chimerer E. coli Stamm erzeugt werden, der diese 100 kb Region aus den P1-gewachsenen Wirt anstelle seiner eigenen enthält. Auf diese Weise wurden durch Vereinigung der 5.000 tet resistenten Kolonien aus dem mutierten Pool und ihren Transfer in einen neuen Stamm (XL1- MRA, eine recA-, F- Version von XL2-Blue), zufällige chromosomale Bereiche aus dem Pool mit höherer Transformation selektiert. Etwa 5.000 tetR Transduktanten wurden für jede der vier Mutanten ausgewählt, gepoolt und den oben beschriebenen Transformationsanreicherungsexperimenten unterzogen. 1 ng pACYC177 (kanR) wurde verwendet, um jeden Pool zu transformieren, und 300 bis 500 Transformanten wurden anschließend vereinigt und mit 1 ng pAL205 (Chloramphenicol-resistent) transformiert, und 50 bis 150 Kolonien selektiert. Diese 50 bis 150 Kolonien wurden anschließend vereinigt und mit pUC transformiert, und 20 bis 40 der resultierenden Kolonien wurden erneut vereinigt.
  • Diese drei weiteren Anreicherungsrunden wurden durchgeführt, um im Hinblick auf die TetR Transposons zu screenen, die neben der Mutation liegen, eher als TetR Transposons, die woanders integrierten. Die 20-40 Transformanten wurden anschließend mit P1 infiziert, und neue Lysate wurden hergestellt, die das TetR Gen neben einem Segment liegend aufwiesen, das eine verbesserte Transformationseffizienz zur Verfügung stellte.
  • Diese vier P1 Lysate wurden anschließend in XL1-Blue MR transduziert, der pJC859 enthält. Dieses Plasmid ist ein pBR322 Derivat, das das E. coli recA' Gen enthält (das notwendig ist für den Fortgang der P1 Transduktion), und einzelne Transduktanten wurden ausgestrichen und aufgrund ihrer Transformationseffizienz im Vergleich zu parentalen XL1-Blue, die pJC8S7 enthalten, analysiert (Tabelle 1).
  • Aus jedem der vier identifizierten P1 Pools wurde eine einzelne Kolonie ausgewählt, die eine Erhöhung der Transformationseffizienz zeigte. Diese Mutanten wurden 7, 12, 33 und 59 genannt, in Übereinstimmung mit den ursprünglich isolierten Mutanten. TABELLE 1: VERGLEICH DER TRANSFORMATIONSEFFIZIENZEN POTENTIELLER MUTANTEN UND DER ELTERNSTÄMME
    WIRT ANZAHL DER TRANSFORMANTEN
    # 7 168
    # 12 190
    # 33 140
    # 59 154
    XL1MR/pJC857 104
  • Transferieren potentieller Mutationen in den XL1-Blue Hintergrund XL1-MR/pJC859 ist ein F- Derivat von XL1/XL2 blue, das ein Plasmid enthält, welches das E. coli recA+ Genprodukt exprimiert. Um diesen Stamm in eine isogene Version von XL2-Blue umzuwandeln, war es notwendig, das recA Plasmid aus der Zelle zu entfernen. Dies wurde durch ein verlängertes Wachstum in LB Tet (keine Ampicillinselektion) für 50 bis 100 Generationen und durch Screenen einzelner Kolonien im Hinblick auf ihre Ampicillinsensivität erreicht. Wenigstens einer wurde jeweils für die vier Mutanten identifiziert; etwa 100 bis 500 einzelne Kolonien wurden untersucht, um die Ampicillinsensitive Zelle von Interesse zu isolieren.
  • Jede der vier E. coli Mutanten wurde anschließend als Empfänger für die F' konjugative Paarung mit dem F' Amylase-Episom von XL2-Blue verwendet. Kompetente Zellpräparationen in kleinem Maßstab wurden anschließend von diesen Exkonjuganten hergestellt, und die Transformationseffizienzen wurden unter Verwendung von pUC und pRK2013 (ein 25 kb Plasmid) bestimmt (siehe Tabelle 2). Der Stamm, der die höchste relative Effizient sowohl mit pUC als auch mit pRK2013 aufwies (Mutante # 12) wurde anschließend für die Präparationen im großen Maßstab verwendet.
  • TABELLE 2: TRANSFORMATION MIT KLEINEN UND GROBEN SUPERCOILED PLASMID DNA MOLEKÜLEN
    Figure 00250001
  • Die in Tabelle 2 gezeigten Transformationseffizienzen wurden wie folgt bestimmt. 100 pg pUC oder 500 ng pRK2013 wurden zu 100 μl kompetenten Zellen gegeben und gemäß dem Standardprotokoll transformiert. Aliquots (0,1 %, 1 %, 10%, usw.) eines jeden Transformationsgemisches wurden anschließend auf die geeigneten Selektionsplatten ausplattiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Diese Daten zeigen, dass – obwohl die relative Transformationseffizienz für ein kleines Plasmid (pUC) im Vergleich zu XL2-Blue unverändert blieb – die Transformationseffizienz mit dem 25 kb pRK2013 Plasmid in XL10-GOLD drastisch erhöht war. Der beobachtete Anstieg der Transformationseffizienz von großen Plasmiden ist ein besonders nützliches Merkmal der Zellen, welche die Hte- Mutation tragen.
  • Anschließende Transduktionsstudien haben gezeigt, dass – wenn die Hte Region aus XL10-GOLD in einen heterologen E. coli Stamm transferiert wurde – eine etwa 6-fache Verstärkung der Transformationseffizienz zu beobachten war. Da die P1 Transduktion verwendet werden kann, um die Hte Region zwischen verschiedenen Wirten zu transferieren, kann die Hte Region weiter als innerhalb der DNA Region lokalisiert gekennzeichnet werden, die innerhalb von 100 kb des durch das Transposon kodierten tet Gens liegt, das in XL10-GOLD enthalten ist.
  • Optimierung der Transformation
  • Die Zugabe bestimmter Verbindungen zu kompetenten Zellen 10 Minuten vor der Zugabe der DNA kann die Transformation drastisch verbessern. Für die Zelllinie, die oben am besten abschnitt, wurde die Transformationseffizienz durch Herstellung von Matrices der beiden in dem derzeitigen UltraBeta vorhandenen Verbindungen optimiert. Sowohl pUC as auch pRK2013 wurden als Substrate verwendet, und die optimale Konzentration von jeder Komponente wurde bestimmt. Weitere Beispiele solcher Optimierungsparameter schließen u.a. die Verwendung einer 110 mM NaCl Lösung und 50 mM 2-Mercaptoethanol ein.
  • Analyse weiterer Merkmale der kompetenten Zellen
  • Weitere Merkmale der kompetenten Zellen, die in jeder verbesserten Version vorhanden sein müssen, sind die Fähigkeit zur Durchführung eines blau-weiß-Farbscreenings (Vorhandensein von F laclgZΔM15), das Fehlen bekannter Restriktionssysteme (Hsd-, McrBCF-, McrA-), und das Fehlen der EndA1 Nuklease, die für die Beeinträchtigung der Miniprep DNA Isolationen verantwortlich ist. Im Hinblick auf diese Merkmale wurde die # 12 Mutante getestet. Die Zellen behielten alle diese Eigenschaften bei. Folglich wurde die Mutante # 12 verwendet, um weitere Experimente zur Auswertung seines Nutzens zur PCR Klonierung und zur Bibliothekenkonstruktion durchzuführen.
  • Effizienz mit ligierter DNA
  • Im allgemeinen lässt sich ligierte DNA mit signifikant geringerer Effizienz transformieren als DNA in supercoiled-Form. Um diesen Unterschied zu untersuchen und zu bestimmen, ob die Mutante # 12 Variante im Vergleich zu existierenden E. coli Stämmen besser in der Lage war, ligierte Moleküle zu transformieren, wurde das folgende Experiment durchgeführt. 10 ng pCAL n-EK Plasmid DNA wurde für eine Ligations-unabhängige Klonierung hergestellt (LIC, Stratagene Katalog #214310), wobei die zur Verfügung gestellten Angaben befolgt wurden. Ein Kanamycin-Resistenzgen wurde unter Verwendung von Primem, die kompatible LIC Enden enthalten, mit Hilfe der PCR amplifiziert, und das amplifizierte Produkt wurde wie zuvor beschrieben behandelt, um die geeigneten kompatiblen Enden herzustellen. Diese DNAs wurden unter Berücksichtigung der vorgegebenen Bedingungen für die LIC annealt. Ein Aliquot der annealten DNA Mischung wurde anschließend verwendet, um Mutante #12 (im folgenden als XL10-GOLD bezeichnet) und DH5 von Life Technologies zu transformieren. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (colony forming unit, cfu) wurde mit der Anzahl verglichen, die beobachtet wurde, wenn pUC DNA in supercoiled-Form als Substrat verwendet wurde. Die Daten zeigten, dass die Anzahl der cfu für die annealte (d.h. ligierte DNA), 20-fach höher für XL10-GOLD im Vergleich zu DH5 war, und die Effizienz für pUC war 5-fach höher. Diese Verbesserung der Transformation für ligierte DNA Moleküle stellt einen signifikanten Unterschied zwischen diesen Stämmen dar.
  • Eine zweite Reihe von Ligationen wurde anschließend unter Verwendung der Plasmide pADGal4 (7,6 kb) und pCMV-Script (4,3 kb) als Vektoren hergestellt. Diese Plasmide wurden mit EcoRI und XhoI verdaut. Etwa 10 ng einer cDNA Bibliothek des Maus-Gehims (hergestellt unter Verwendung des cDNA Synthesekits von Stratagene) wurden mit 30 ng pCMV-Script (oder 60 ng pADGal4) ligiert. Die Ligationsreaktionen wurden bei 4° C über Nacht durchgeführt und wurden anschließend in XL10-GOLD, DH10B und XL2-Blue transformiert. Die Daten für beide Experimente sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass XL10-GOLD bei der Transformation der pUC DNA etwa 5-fach besser war und bei der Transformation der ligierten (d.h. größeren) DNA Moleküle etwa 20 bis 40 mal besser war als DH10B. Der beobachtete Unterschied ist sehr bedeutend bei Klonierungsanwendungen, wie z.B. bei der Konstruktion von cDNA Bibliotheken oder der PCR Klonierung und stellt ein weiteres der besonders nützlichen Merkmale von Zellen dar, welche die Hte Mutation tragen.
  • TABELLE 3: Transformation mit cDNA Bibliotheken in zwei Plasmid Vektoren
    Figure 00270001
  • Bibliothek 1: pADGal4, ein von pBluescript abgeleitetes Plasmid (7,6 kb) wurde mit Eco-RI und Xho1 verdaut. 60 ng des verdauten Vektors wurden mit 10 ng der cDNA wie oben beschrieben ligiert. Die Transformationen wurden auf dieselbe Weise durchgeführt, und die Anzahl der Ampicillin-resistenten Transformanten wurde bestimmt.
  • Bibliothek 2: pCMV-Script, ein von pBluescript abgeleitetes Plasmid (4,3 kb) wurde mit EcoRI und Xho1 verdaut. 30 ng des verdauten Vektors wurden mit 10 ng cDNA ligiert, die mit Hilfe eines Standardprotokolls hergestellt wurde. Die DNA wurde über Nacht bei 4° C in 10 μl Volumen ligiert, und 1 μl wurde zu kompetenten Zellen aus den angegebenen Stämmen dazugegeben.
  • Die genauen Einzelheiten des bevorzugten Verfahrens zur Transformation von XL10-GOLD sind die folgenden:
    • 1. Aliquotieren von 100 μl der Zellen in ein Falcon 2059 Gefäß.
    • 2. Zugabe von 3-Mercaptoethanol mit einer Endkonzentration von 50 mM (2 μl).
    • 3. Zugabe von NaCl mit einer Endkonzentration von 110 mM (2 μl).
    • 4. Inkubieren der Gefäße auf Eis für 10 Minuten.
    • 5. Zugabe von DNA.
    • 6. Inkubieren auf Eis für 30 Minuten.
    • 7. Hitzepuls bei 42° C für 30 Sekunden.
    • 8. Inkubieren der Gefäße auf Eis für 2 Minuten.
    • 9. Zugabe von 0,9 ml vorgewärmtem NZY Medium und inkubieren bei 37° C für 60 Minuten unter Schütteln bei 225-250 rpm.
    • 10. Ausplattieren der Aliquots wie gewünscht und Inkubieren über Nacht bei 37° C.
  • Äquivalente
  • Sämtliche in der obigen Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patente sind hierin durch Referenz eingeschlossen. Die vorangehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend betrachtet, um den Fachmann auf dem Gebiet zu befähigen, die Erfindung zu praktizieren. Es ist beabsichtigt, dass verschiedene Modifikationen der oben beschriebenen Arten zur Durchführung der Erfindung, die für die Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, von dem Umfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen sind.

Claims (13)

  1. Ein E. coli Stamm, der eine Hte Mutation umfasst, die in dem Stamm enthalten ist, der unter ATCC Nr. 55962 hinterlegt wurde und der eine effizientere Transformation mit fremden Plasmiden aufweist als E. coli, dem die genannte Hte Mutation fehlt.
  2. Der Stamm gemäß Anspruch 1, der von einem Stamm abgeleitet wurde, der die kennzeichnenden Merkmale des ATCC Nr. 55962 aufweist.
  3. Ein Verfahren zur Herstellung gram-negativer Bakterien mit verbesserter Kompetenz, wobei das genannte Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transferieren eines Polynukleotids, das für eine Hte Mutation codiert, die in dem unter ATCC Nr. 55962 hinterlegten Stamm enthalten ist, in gramnegative Bakterienzellen; und b) Behandeln der Zellen aus (a) mit einem Kompetenz-induzierenden Verfahren, wodurch kompetente Zellen hergestellt werden.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die genannten Bakterien E. coli sind.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Kompetenz-induzierende Verfahren das Waschen der Zellen mit einem Puffer umfasst, der wenigstens zwei der folgenden Komponenten umfasst: Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2, Glycerin, Rubidiumchlorid und Hexamincobaltchlorid.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die genannten E. coli den Genotyp Δ (mcrA) 183 Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1 lac tetR Hte* {F'proAB laclqZΔ M15 Tn1O(TetR) Amy CamR} haben.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das genannte Verfahren weiterhin das Einfrieren der kompetenten Zellen umfasst.
  8. Der Stamm gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen des genannten Stammes kompetent gemacht wurden.
  9. Der Stamm gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen des genannten Stammes mit Hilfe eines Verfahrens zur Erzeugung einer hohen Kompetenz kompetent gemacht wurden, welches das Waschen der Zellen mit einem Puffer umfasst, der wenigstens eine der folgenden Komponenten umfasst: Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2, Glycerin, Rubidiumchlorid und Hexamincobaltchlorid.
  10. Der Stamm gemäß Anspruch 9, wobei die genannten Zellen des genannten Stammes eingefroren worden sind.
  11. Kompetente Zellen, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 hergestellt wurden.
  12. Ein Verfahren zur Klonierung oder Subklonierung von heterologem genetischen Material in eine Zelle, welches das Klonieren oder Subklonieren von heterologem genetischen Material in eine Zelle gemäß Anspruch 11 umfasst.
  13. Ein Verfahren zur Klonierung oder Subklonierung von heterologem genetischen Material in eine Zelle eines Stammes, das die Klonierung oder Subklonierung von heterologem genetischen Material in eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 umfasst.
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