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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der
rekombinanten DNA Technologie. Spezifischer beschreibt die Erfindung
eine neue bakterielle Mutation, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist,
einen Phänotyp
mit hoher Transformationseffizienz zu verleihen, sowie Verfahren
zur Herstellung von hochkompetenten Zellen unter Verwendung von
Bakterien, welche die neue Mutation enthalten.
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Hintergrund
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Der
Vorgang des Einführens
von DNA (und anderen ähnlichen
Polynukleotiden) in Wirtszellen ist ein Hauptaspekt der rekombinanten
DNA Technologie. Das Verfahren, durch das Polynukleotide in Wirtszellen eingeführt werden,
wird Transformation genannt. Bakterienzellen bleiben im allgemeinen
die bevorzugten Wirte für
die Mehrzahl von Experimenten mit rekombinanter DNA sowie für gentechnologische
Manipulationen. Von besonderem Interesse für gentechnologische Experimente
ist das Bakterium Escherichia coli. Da die "Kompetenz" (die Fähigkeit zur effizienten Aufnahme
exogener DNA) kein natürliches
Merkmal des Wachstumszyklus von E. coli ist, müssen künstliche Verfahren verwendet
werden, um exogene Polynukleotide in E. coli einzuführen. Von
besonderem Interesse sind eine Anzahl von Kompetenz-erzeugenden
Kompetenz-induzierenden Verfahren, die Bakterien, einschließlich E.
coli, für
exogene Nukleinsäuren
permeabler (durchlässiger)
machen. Bakterienzellen, die behandelt wurden, um ihre Permeabilität gegenüber Polynukleotiden
zu erhöhen,
werden im allgemeinen als kompetente Zellen bezeichnet.
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Es
gibt zahlreiche etablierte Verfahren zur Herstellung kompetenter
Zellen. Diese Verfahren schließen die
CaCl2-Inkubationsverfahren von Mandel und
Higa, J. of Mol. Biol. 53:159 (1970), ebenso wie eine Vielzahl wohlbekannter
Varianten davon ein. Hanahan hat eine detaillierte Studie über Faktoren
durchgeführt,
welche die Effizienz der Transformation von E. coli Zellen bewirken
(J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983)), in der er ein Verfahren zur
Herstellung hochkompetenter E. coli Zellen beschreibt, das den Schritt des
Waschens der E. coli Zellen in einem Puffer umfasst, der Kaliumacetat,
KCl, MnCl2, CaCl2 und
Hexaminkobaltchlorid umfasst, und das allgemein als das beste verfügbare Verfahren
zur Herstellung hochkompetenter E. coli betrachtet wird. Ein anderes
Verfahren zur Herstellung kompetenter E. coli Zellen wird von Jessee
et al., US. Patent 4,981,797 beschrieben. Jessee et al. zeigen,
dass ein hoher Grad an Kompetenz durch Wachstum von E. coli Zellen
in einem Temperaturbereich von 18° C
bis 32° C
als Teil des Kompetenz-induzierenden Verfahrens erzeugt werden kann.
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Die
verschiedenen Verfahren zur Herstellung kompetenter E. coli Zellen
erzeugen kompetente E. coli Zellen, die variierende Transformationseffizienzen
aufweisen. Der genaue Mechanismus, durch den DNA in kompetente E.
coli eindringt, ist nicht vollständig
verstanden. Auch ist nicht vollständig verstanden, warum eine Zusammensetzung
kompetenter E. coli Zellen sich in ihrer Transformationseffizienz
von der einer anderen Zusammensetzung kompetenter E. coli Zellen
unterscheidet. Hanahan, in Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium:
Cellular and Molecular Biology, Herausgeber F.C. Neidhardt, American
Society for Mikrobiology, Washington, D.C. (1987).
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Die
obigen Verfahren wurden weiterhin optimiert, um Effizienzen von
etwa 1 × 109 cfu/μg
Plasmid DNA in Supercoiled-Form zu erreichen. Obwohl diese Zahl
hoch erscheint, ist die theoretische Effizienz für das Testplasmid (pUC) 3 × 1011 cfu/μg.
Darüber
hinaus war, wenn das Verfahren auf die praktischen Laborbedingungen angewendet
wurde, wie z.B. die Transformation von DNA-Substraten, die ligiert
waren, eher als dass sie in Supercoiled-Form vorlagen, die tatsächliche
Anzahl der beobachteten Kolonie-bildenden Einheiten um viele Zehnerpotenzen
geringer als die, die erreicht wurde, wenn pUC in Supercoiled-Form
als Testsubstrat verwendet wurde,.
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Selbst
mit Hilfe der kürzlichen
Weiterentwicklungen ist nur eine winzige Fraktion der Zellen bei
der Herstellung von "kompetenten" E. coli Zellen tatsächlich kompetent
für die
Aufnahme von DNA. Folglich können die
derzeit zur Erzeugung von Zusammensetzungen kompetenter E. coli
Zellen verwendeten Verfahren und Zellen noch signifikant verbessert
werden.
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Alternativ
können
auch andere Verfahren zur Herstellung kompetenter Zellen zu der
Bildung kompetenter E. coli Zellen führen, die jeweils eine verstärkte Fähigkeit
aufweisen, exogen zugeführte
DNA zu replizieren und zu exprimieren. Hanahan hat in J. Mol. Bio.
166:557-580 (1983) die Vermutung geäußert, dass kompetente E. coli
Zellen Kanäle
für den
Transport der DNA durch die Zellhülle enthalten und dass der
limitierende Schritt bei der Bestimmung der Kompetenz zur Transformation
von E. coli Zellen Ereignisse sind, die in der Zelle auftreten,
nachdem die Zelle die DNA von Interesse aufgenommen hat, d.h. der
Eröffnungsschritt
(establishment step). Ein weiterer Faktor, der die Transformationseffizienz
einer Zusammensetzung kompetenter E. coli Zellen beeinflusst, ist
der Genotyp der Zellen. Von einigen E. coli Stämmen ist bekannt, dass sie
zu verbesserten hochtransformierbaren kompetenten Zellzusammensetzungen
führen
als andere E. coli Stämme, die
den selben Kompetenz-induzierenden Prozeduren unterzogen wurden.
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Nach
der ursprünglichen
Endeckung, dass E. coli für
die Aufnahme von DNA kompetent gemacht werden kann, wurden Studien
durchgeführt,
um die Transformationseffzienz zu erhöhen. Der maximale Grad der Transformationseffizienz,
der unter Verwendung des Verfahrens von Hanahan erhalten wurde,
das in J. Mol. Bio. 166:557-580 (1987) beschrieben wurde und das
den Schritt des Waschens der Zellen in einem Puffer umfasst, der
Kaliumacetat, KCl, MnCl2, CaCl2,
Glycerin und Hexaminkobaltchlorid enthält, beträgt etwa 1 × 109 Transformanten
pro Mikrogramm pUC18 Plasmid DNA in Supercoiled-Form. Auf einer Basis pro Zelle entspricht
dies etwa 1 Zelle von 300 in der Population, die tatsächlich transformiert
wird. Jedoch gilt die oben genannte Zahl im allgemeinen nur für kleine
Plasmide in Supercoiled-Form. Wenn große Plasmide oder ligierte Moleküle verwendet
werden, wie es bei vielen Experimenten mit rekombinanter DNA der
Fall ist, wird die Anzahl der "kompetenten" Zellen, die tatsächlich transformiert
werden, drastisch reduziert. Daher gibt es weiterhin einen Bedarf
an neuen und verbesserten Verfahren zur Herstellung kompetenter
E. coli mit besserer Transformationsfähigkeit, ebenso wie an neuen
E. coli Stämmen,
die eine verbesserte Transformationsfähigkeit aufweisen. Solche Verfahren
und Stämme
wären von
großem
Interesse für
die meisten Forscher auf dem Gebiet der Gentechnik, insofern als
die Anzahl der benötigten
Transformationen, um das gewünschte
Resultat zu erhalten, minimiert werden würde. Folglich könnten z.B.
größere genetische
Bibliotheken einfacher erstellt werden, ebenso könnte die Konstruktion komplexer
rekombinanter Moleküle
einfacher erreicht werden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
hierin beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung
neuer Stämme
hochtransformierbarer gramnegativer Bakterienzellen wie z.B. E.
coli zur Verfügung,
die in einer Vielzahl von Kompetenz-induzierenden Verfahren verwendet
werden können.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Verfahren
der Mutagenisierung von Bakterienzellen, die Auswahl der mutagenisierten
Zellen aufgrund eines Hocheffi zienz-Transformationsphänotyps,
und die Verwendung des mutierten genetischen Materials, das für die hocheffiziente
Transformation verantwortlich ist (oder damit in Verbindung steht)
zum Erzeugen neuer Zusammensetzungen hochkompetenter Bakterien.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein biologisch reiner E. coli Stamm,
der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Hte Mutation umfasst,
die einen Phänotyp
mit hoher Effizienz der Transformation (fremder Plasmide) im Vergleich
zu E. coli verleiht, dem eine Hte Mutation fehlt.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der neue E. coli Stamm XL10-GOLD,
der den Genotyp Δ (mcrA)
183 Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)
173endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac tetR Hte* {F'proAB laclqZΔ M15
Tn1O(TetR) Amy CamR}
aufweist. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf gefrorene Zusammensetzungen
solcher Zellen sowie auf Verfahren, um die Zellen kompetent zu machen.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Zellen, die eine
Hte Mutation tragen, zur Klonierung oder Subklonierung von heterologem
genetischen Material von Interesse.
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Beste Form
zur Ausführung
der Erfindung
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Die
vorliegend beschriebene Erfindung schließt gramnegative Bakterienzellen
wie z.B. E. coli ein, die genetisch modifiziert wurden, so dass
sie im Vergleich zu E. coli Zellen, denen die genetische Modifikation fehlt,
eine erhöhte
Transformationseffizienz aufweisen, nachdem sie mit Hilfe eines
geeigneten Kompetenz-erzeugenden Verfahrens behandelt wurden. Es
wurde zuvor gezeigt, dass Mikroorganismen, die den geeigneten Genotyp
aufweisen, stark erhöhte
Transformationseffizienzen aufweisen können. Insbesondere beschreibt das
US Patent Nr. 5,512,468, das hiermit durch Referenz eingeschlossen
ist, wie das Vorhandensein des α-Amylasegens
in E. coli die Transformationseffizienz erhöht.
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Die
Bakterienzellen der vorliegenden Erfindung wurden durch Einführen einer
mutierten Hte Region modifiziert. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung ist die Hte Region gekennzeichnet als eine Region, die solchen
Zellen einen Phänotyp
mit hoher Transformationseffizienz verleiht, die die mutierte Form
der Hte Region tragen. Für
die Zwecke der vorliegenden Offenbarung soll die Bezeichnung "Einführung", wie hierin verwendet,
die Insertion einer mutierten Variante der Hte Region in das Bakteriengenom
mit Hilfe der homologen oder nicht-homologen Rekombination oder
das episomale Vorhandensein einer mutierten Variante der Hte Region
bedeuten. Ähnlich
wird eine Hte Mutante definiert als eine mutierte Form des Hte Lokus,
die einem bakteriellen Wirt, der die Hte Mutation trägt, einen
Phänotyp
mit hoher Transformationseffizienz verleiht.
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Vorzugsweise
sollten die bakteriellen Wirte, welche die mutierten Varianten der
Hte Region tragen, biologisch rein sein. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung soll ein "biologisch
reiner" Bakterienstamm
von einer einzigen Zelle abgeleitet sein oder soll wenigstens zu
etwa 99,9 Prozent aus Zellen bestehen, die einen direkten gemeinsamen
Vorläufer
haben.
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Die
Hte Region wurde mit Hilfe des Screenings/der Selektion mutagenisierter
E. coli aufgrund eines Phänotyps
mit erhöhter
Transformationseffizienz identifiziert. Insbesondere wurde eine
Reihe von Transformationsschritten verwendet, um gemischte Populationen
mit bakteriellen Mutanten zu screenen, um selektiv die Population
der "kompetenten" Zellen anzureichern.
Die selektive Eigenschaft des Transformations-Screeningverfahrens hatte seine Ursache
in der Verwendung einer limitierten Menge DNA. Das Limitieren der
während der
Transformation verwendeten DNA Menge erlaubte unerwarteter Weise
die Anreicherung und Identifizierung von Zellen, die eine erhöhte Transformationseffizienz
aufwiesen, nachdem eine Antibiotika-Selektion durchgeführt wurde.
Frühere
Studien hatten darauf hingewiesen, dass nahezu alle Zellen in einer
bestimmten Kultur exogen dazugegebene DNA binden, jedoch nur ein
kleiner Anteil der Zellen, die tatsächlich "kompetent" für
die Aufnahme der DNA sind, transformiert werden. Angesichts dieser
Reaktionskinetiken würde
man nicht erwarten, dass ein Limitieren der Menge an zugegebener
DNA die effiziente Selektion von Zellen erlauben würde, die
eine erhöhte
Transformationseffizienz aufweisen. Im allgemeinen beschreibt eine "limitierende" Menge an DNA eine
Situation, in der das molare Verhältnis von DNA/Zellen weniger
als 1 ist, typischerweise weniger als etwa 0,5, noch typischerweise
weniger als etwa 0,1 und insbesondere weniger als etwa 0,05 und bevorzugterweise
etwa 0, 001.
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Mehrere
Runden (wenigstens zwei Runden bis hin zu irgendeiner durchführbaren
Zahl) der Selektion durch Transformation können verwendet werden, um noch
stringenter nach Zellen zu selektieren, die die Eigenschaft aufweisen,
zur hocheffizienten Transformation fähig zu sein. Vorzugsweise werden
aufeinanderfolgende Runden der Selektion durch Transformation durchgeführt werden,
unter Verwendung einer Reihe verschiede ner Vektoren und selektierbarer
Marker. Gegebenenfalls sollten die verschiedenen während der
mehrfachen Runden der Selektion durch Transformation verwendeten
Vektoren vorzugsweise jeweils Replikationsursprünge enthalten, die aus den
verschiedenen Plasmid-Inkompatibilitätsgruppen ausgewählt sind.
Zusätzlich
können
die verschiedenen, nach einer bestimmten Selektionsrunde erhaltenen
Transformanten einzeln oder gemeinsam vor der nächsten Runde der Selektion
durch Transformation gewonnen werden, obwohl dies nicht notwendig
ist.
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Nachdem
Bakterien identifiziert wurden, die den gewünschten Phänotyp der hohen Transformationseffizienz
zeigen, wurde eine Transposon-Bibliothek erzeugt, und eine allgemeine
P1 Transduktion wurde verwendet, um die mutierte Hte Region in geeignete
Empfängerstämme zu transferieren.
Die resultierenden "Hte " Bakterien zeigten
eine erhöhte
Transformationseffizienz im Vergleich zu Zellen, welche die Hte
Region nicht inkorporiert hatten, und eine besonders erhöhte Transformationseffizienz
für Plasmide
in der Relaxed-Form sowie für
große
Plasmide. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Transformationseffizienz" eine Maßeinheit
für den
Grad der Kompetenz einer bestimmten Zusammensetzung kompetenter Zellen.
Die Transformationseffizienz wird ausgedrückt als die Anzahl der Transformanten,
die für
jedes Mikrogramm (oder einer anderen Menge) exogene DNA erhalten
wird, die zu einer kompetenten Zellzusammensetzung dazugegeben wird.
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Üblicherweise
wird die Gegenwart der Hte Region die Transformationseffizienz eines
bestimmten Bakteriums funktionell wenigstens etwa zweifach erhöhen, noch üblicher
wenigstens etwa vierfach und bevorzugterweise um wenigstens etwa
eine Zehnerpotenz. Von besonderem Interesse ist, dass die Gegenwart
der Hte Region die Transformationseffizienzen für große Plasmide und topologisch
entspannte (relaxed) Plasmide (Plasmide, die weder wesentlich supercoiled
noch unterspiralisiert sind) erhöht.
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung soll sich der Begriff "großes Plasmid" üblicherweise auf Plasmide beziehen,
die wenigstens etwa 15 kb groß sind,
vorzugsweise wenigstens etwa 25 kb bis etwa 100 kb. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird das Vorhandensein einer mutierten
Variante der Hte Region in einem bestimmten Bakterium die Transformationseffizienz
für große und/oder
entspannte Plasmide üblicherweise
um wenigstens das Zweifache, üblicherweise
wenigstens etwa das Vierfache, vorzugsweise um wenigstens etwa das
Sechs- bis Achtfache und am bevorzugtesten um wenigstens etwa ein
bis zwei Zehnerpotenzen erhöhen.
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Eine
spezifische Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der neue E. coli Stamm XL10-GOLD. Am
28 April 1997 wurde der Stamm XL10-GOLD bei der American Type Culture
Collection (ATCC), Rockville, MD, USA unter den Bedingungen des
Budapester Vertrags über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und der dazugehörigen Regeln (Budapester Vertrag)
hinterlegt, und wird folglich gemäß den Bedingungen des Budapester
Vertrages aufrecht erhalten und zugänglich gemacht. Die Verfügbarkeit
eines solchen Stammes ist nicht als Lizenz zu verstehen, die Erfindung in
Zuwiderhandlung der gemäß dem Recht
einer jeden Regierung in Übereinstimmung
mit dessen Patentrecht eingeräumten
Rechten zu praktizieren.
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Der
hinterlegten Kultur wurde die angegebene ATCC Hinterlegungsnummer
zugewiesen: ATCC
Nr.
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Weitere
Aspekte der Erfindung schließen
Verfahren ein, um gramnegative Bakterien, wie z.B. E. coli Zellen,
kompetent für
die Transformation zu machen. Diese Verfahren schließen wenigstens
den Schritt des Transferierens eines Polynukleotids, das für eine geeignete
mutierte Variante der Hte Region kodiert, in E. coli ein. Derartige
modifizierte Zellen können
anschließend
unter Verwendung irgend eines der vielfältigen Kompetenzinduzierenden
Verfahren kompetent gemacht werden. Zum Zwecke der vorliegenden
Erfindung bezieht sich der Begriff "Kompetenz-erzeugendes bzw. Kompetenzinduzierendes
Verfahren" auf ein
jegliches Verfahren, das verwendet wird, um E. coli Zellen für die Transformation
mit Hilfe exogener DNA kompetent zu machen. Kompetenzinduzierende
Verfahren für
E. coli (und andere gramnegative Bakterien) sind dem durchschnittlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohl bekannt. Obwohl
sich Kompetenz-induzierende Methoden beträchtlich voneinander unterscheiden,
schließen
fast alle Kompetenz-induzierenden Methoden das Exponieren der Zellen
gegenüber
multivalenten Kationen und nahe 0° C
ein. Kompetenz-induzierende Verfahren zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt auf:
das CaCl2 Inkubationsverfahren von Mandel
und Higa (J. Mol. Bio., 53:159 (1970)), sowie das Verfahren von
Hanahan, J. Mol. Bio., 166:557-580 (1983), das die Behandlung der
Zellen in einer Reihe von Puffern umfasst, die Kaliumacetat, KCl,
MnCl2, CaCl2, Glycerin
und Hexamincobaltchlorid enthalten. Das Verfahren von Hana han wird
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Zusätzlich zu
den von Hanahan gelehrten Puffern oder anstelle dieser Puffer können Puffer
verwendet werden, die Rubidiumchlorid enthalten. Zusätzliche
Lehren sind unter anderem in US Patent 4,981,797 (Jessee) und Sambrook
et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold
Spring Harbor Press (1989), und in regelmäßigen Neuauflagen davon sowie
in Hanahan und Bloom, in Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium:
Cellular and Molecular Biology, "Mechanisms
of DNA Transformation",
Herausgeber F.C. Neidhardt, American Society for Mikrobiology, Washington,
D.C. (1996) zu finden, die hierin durch Referenz eingeschlossen
sind.
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Die
kompetenten Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
unter Verwendung der meisten wohlbekannten Transformationsverfahren
transformiert werden. Diese Verfahren schließen üblicherweise den Schritt des
Exponierens kompetenter Zellen gegenüber Hitzepulsen in Gegenwart
exogener DNA ein. Beispiele für
derartige Transformationsverfahren sind in Mandel und Higa, J. of
Mol. Biol. 53:159 (1970) und den Standardverfahren zur Erzeugung
einer hohen Kompetenz, das von Hanahan beschrieben wurde (1983)
J. Mol. Bio. 166:557-580 (1983), zu finden.
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Die
zur Einführung
der Hte Region in einen Bakterienwirt verwendeten genetischen Konstrukte
können so
konstruiert werden, dass sie entweder autonom in den Bakterienzellen
replizieren oder in das Genom der Bakterienzelle aufgenommen werden.
Vorzugsweise sind die genetischen Konstrukte, die für die Hte
Region kodieren, so konstruiert, dass sie eine stabile Aufrechterhaltung
der Hte Region in der Wirtszelle gewährleisten. Darüber hinaus
sollte das Konstrukt, wenn das genetische Konstrukt autonom repliziert,
keinen Replikationsursprung, wie z.B. ein colE1 Replicon, umfassen,
der zu einer Plasmid-Inkompatibilität mit weit verbreiteten bakteriellen
Vektoren führt.
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Zusätzlich zu
der Polynukleotidsequenz, die für
die Hte Region kodiert, kann das genetische Konstrukt außerdem irgendeinen
der zahlreichen konventionellen genetischen Vektoren umfassen, wie
z.B. Plasmide, Phagen, Phagemide und dergleichen.
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Vorzugsweise
wird das genetische Konstrukt die wesentlichen Gene, die innerhalb
der Hte Region kodiert werden, exprimieren. Verfahren zur Expression
von Genen von Interesse in E. coli und anderen gramnegativen Bakterien
sind wohl bekannt. Als Beispiel für solche Verfahren siehe Gene
Expression Technology: Methods and Enzymology, Vol. 185, Goeddel,
Herausgeber, Academic Press, Incorporated, San Diego, California
(1991).
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Die
genetischen Konstrukte, die für
die Hte Region kodierenden Polynukleotide enthalten, können unter
Verwendung verschiedenster Transformationsmethoden in die E. coli
Zelle eingeführt
werden, einschließlich
der Transformation, Konjugation, des triparenteralen Matings, der
spezialisierten oder allgemeinen Phagentransduktion, Elektroporation
und dergleichen. Die kompetenten E. coli Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung werden hergestellt, sobald die beschriebenen Hte Zellen
einem Kompetenzinduzierenden Verfahren unterzogen werden. Nachdem
die E. coli Zellen mit Hilfe eines Kompetenz-induzierenden Verfahrens
kompetent gemacht wurden, können
die Zellen eingefroren werde4n, so dass sie ihre Kompetenz beim
Auftauen beibehalten. Gefrorene kompetente Zellen sind besonders
nützliche
Ausführungsformen
der Erfindung, da sie über
lange Zeiträume
gelagert werden können,
wodurch die Notwendigkeit vermieden wird, ständig frische Herstellungen
kompetenter Zellen zu produzieren. Protokolle zur Herstellung gefrorener
kompetenter Zellen sind dem durchschnittlichen Fachmann auf dem
Gebiet bekannt. Ein Beispiel für
ein derartiges Protokoll ist in Hanahan, J. Mol. Bio. 166:557-580
(1983) zu finden.
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Es
ist außerdem
zu berücksichtigen,
dass die gemessene Transformationseffizienz einer bestimmten Zusammensetzung
kompetenter Zellen unter Verwendung eines bestimmten Transformationsprotokolls
im allgemeinen Abhängig
von der jeweiligen exogenen DNA, die verwendet wird, um die Bakterien
zu transformieren, variieren wird. Insbesondere können Faktoren
wie die Größe und Topologie
der exogenen DNA die Transformationseffizienz signifikant beeinflussen.
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Die
Einführung
eines genetischen Konstruktes, das für die Hte Region kodiert, erhöht die Transformationseffizienz
der Zusammensetzungen einer Vielzahl von E. coli Stämmen. Üblicherweise
kann der Genotyp eines bestimmten E. coli Stammes, der die Hte Region
enthält,
in der Weise selektiert werden, dass er für ein bestimmtes gentechnologisches
Experiment besonders nützlich
ist.
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Angesichts
des vorliegend beschriebenen Selektionsverfahrens, der phänotypischen
Screening-Verfahren und der hinterlegten E. coli Stämme, können eine
Vielzahl von genetischen und molekularbiologischen Verfahren angewendet
werden, um die Struktur der Hte Region und die spezifische Mutation
oder Mutationen, die für
den Phänotyp
der hohen Transformationseffizienz verantwortlich ist/sind, weiter
zu definieren. Beispiele für
solche Verfahren wurden in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning,
(1. Herausgeber) und Sambrook, J. et al., (2. Herausgeber), Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har bor (1982, 1989); Methods
in Enzymol., Band 68, 100, 118 und 152-155 (1979, 1983, 1986 und
1987); und Molecular Cloning, D.M. Clover, Herausgeber, IRL Press,
Oxford (1985) beschrieben. Mediumzusammensetzungen und allgemeine
mikrobielle genetische Verfahren wurden in Miller, J.H., A Short
Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York
(1995), die hierin durch Referenz eingeschlossen sind, ebenso wie
in den zuvor angegebenen Referenzen beschrieben. Die DNA Manipulationen
und Enzymbehandlungen werden in Übereinstimmung
mit den von den Herstellern empfohlenen Verfahren ausgeführt.
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Sobald
das spezifische Gen oder die spezifischen Gene (im Falle eines Operons)
in der Hte Region charakterisiert worden sind, die für den Phänotyp der
hoch effizienten Transformation verantwortlich sind, können die
kodierten Produkte, die mit dem Phänotyp der hocheffizienten Transformation
assoziiert sind, ebenso charakterisiert werden. Dem entsprechend
sind Hte Proteine oder funktionelle Derivate davon, die mit dem Phänotyp der
hoch effizienten Transformation assoziiert sind, wie mit Hilfe der
vorliegend beschriebenen Selektionsverfahren und Screening-Verfahren
festgestellt wurde, eine zusätzliche
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Der
Begriff "Hte Proteine", wie hierin verwendet,
bezieht sich nicht nur auf Proteine, die die Sequenz der Aminosäurereste
der mutierten Form des Hte Proteins haben, das den gewünschten
Phänotyp
verleiht, sondern bezieht sich außerdem auf funktionelle Derivate
und Varianten des natürlich
vorkommenden Hte Proteins.
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Ein "funktionelles Derivat" eines Hte Proteins
ist eine Verbindung, die eine gemeinsame qualitative biologische
Aktivität
mit dem Hte Protein aufweist. Vorzugsweise schließen "funktionelle Derivate" Fragmente mutierter
oder nativer Hte Proteine und Derivate der Hte Proteine sowie ihre
Fragmente ein, vorausgesetzt dass diese den gewünschten Phänotyp verleihen, sind jedoch
nicht auf diese beschränkt. "Fragmente" umfassen Regionen
innerhalb der Sequenz eines reifen Polypeptids. Der Begriff "Derivat" wird verwendet,
um Aminosäuresequenz-Varianten
eines Hte Proteins zu definieren, und der Begriff "Variante" bezieht sich ebenfalls auf
Aminosäuresequenzen
und Varianten innerhalb dieser Definition.
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Vorzugsweise
sind die funktionellen Derivate Polypeptide, die wenigstens 65%
Aminosäuresequenzidentität, bevorzugt
etwa 75% Aminosäuresequenzidentität, noch
bevorzugter wenigstens 85% Aminosäuresequenzidentität, am bevorzugtesten
wenigstens etwa 95% Aminosäuresequenzidentität mit der
entsprechenden Region eines entspre chenden Hte Proteins oder Hte
Polypeptids aufweisen. Am bevorzugtesten behalten die funktionellen
Derivate eines Hte Proteins die Region oder die Regionen innerhalb
des Hte Proteins, die direkt für
die Verleihung des Phänotyps
der hohen Transformationseffizienz verantwortlich sind, bei oder
imitieren diese.
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Funktionelle
Derivate des Hte Proteins schließen außerdem chemisch modifizierte
oder derivatisierte Moleküle
ein, die von dem Hte Protein abgeleitet sind.
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Die
Bezeichnung "funktionelles
Derivat" schließt weiterhin
und spezifisch Peptide und kleine organische Moleküle ein,
die eine gemeinsame qualitative biologische Aktivität mit dem
Hte Protein aufweisen.
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"Identität" oder "Homologie" in Bezug auf ein
Hte Protein wird hierin definiert als der prozentuale Anteil der
Aminosäurereste
in der Kandidatensequenz, die identisch mit den entsprechenden Resten
eines nativen Hte Polypeptids sind, nachdem die Sequenzen aligned
wurden und – sofern
nötig – Lücken eingefügt wurden, um
die maximale prozentuale Homologie zu erreichen, wobei konservative
Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Weder
N- oder C-terminale Verlängerungen,
noch Insertionen sollten so gewertet werden, dass sie die Identität oder Homologie
verringern. Verfahren und Computerprogramme zum Alignen sind auf
dem Gebiet wohl bekannt.
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Sobald
ein Gen, das ein Hte Protein oder ein funktionelles Derivat davon
kodiert, identifiziert und kloniert wurde, werden Aminosäuresequenz-Varianten
des Hte Proteins oder funktionelle Fragmente davon mit Hilfe der
auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt, indem geeignete
Nukleotid-Austausche in eine native Hte DNA Sequenz eingeführt werden,
oder mit Hilfe einer in vitro Synthese des gewünschten Polypeptids. Es gibt
zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenz-Varianten:
die Lokalisation des Mutationsortes und die Art der Mutation. Die
Aminosäuresequenz-Varianten
des Hte Proteins werden vorzugsweise durch Mutieren des Hte Gens
konstruiert, um entsprechende Hte Aminosäuresequenz-Varianten zu erzeugen,
die in der Natur nicht vorkommen.
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Solche
Mutanten können
z.B. als Frame-shift-Mutationen hergestellt werden, die zu einem
veränderten
Leserahmen und zu einer verfrühten
Termination der Translation führen,
um ein trunkiertes Hte Molekül herzustellen.
In ähnlicher
Weise können
In-Frame-Deletionen
in dem Hte Gen vorgenommen werden, die in effizienter Weise zu der
Entfernung eines erheblichen Teils des Hte Proteins führen. Derartige
Aminosäuresequenz- Deletionen bewegen
sich im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter
im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten und sind üblicherweise, jedoch nicht
unbedingt, zusammenhängend.
Deletionen werden im allgemeinen in Regionen eingeführt, die
nicht direkt in die Ligandenbindung involviert sind.
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Alternativ
oder zusätzlich
können
Aminosäureänderungen
an Stellen, die sich in Hte Proteinen aus anderen Bakterienspezies
unterscheiden, oder in hoch konservierte Regionen eingeführt werden,
abhängig
von dem zu erreichenden Ziel.
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Stellen
an derartigen Orten werden üblicherweise
der Reihe nach modifiziert, z.B. durch (1) Substituieren zunächst mit
einer konservativen Auswahl und anschließend mittels einer radikaleren
Auswahl, abhängig von
den erzielten Ergebnissen, (2) Deletieren des Zielrestes oder der
Zielreste, oder (3) Insertieren von Resten der gleichen oder einer
anderen Klasse neben die lokalisierte Stelle oder durch Kombinationen
der Alternativen 1-3.
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Eine
hilfreiche Methode wird "Alanin
Scanning" genannt,
Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989). Hierbei wird
ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert und durch
Alanin oder Polyalanin substituiert. Domänen, die eine funktionelle
Sensibilität
gegenüber
der dem Alanin-Substitutionen zeigen, werden anschließend durch
Einführen
weiterer oder anderer Substituenten am Ort oder anstelle der Alanin-Substitution verfeinert.
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Nachdem
die gewünschte(n)
Mutation(en) identifiziert wurde(n), kann das Gen, das für eine Variante des
Hte Proteins kodiert, z.B. mit Hilfe der chemischen Synthese erhalten
werden.
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Bevorzugter
wird die DNA, die für
eine Aminosäuresequenz-Variante
des Hte Proteins kodiert, mit Hilfe der ortspezifischen Mutagenese
der DNA, die für
eine zuvor hergestellte variante oder nicht-variante Version des
Hte Proteins kodiert, hergestellt. Die ortsgerichtete (ortspezifische)
Mutagenese ermöglicht
die Herstellung von Hte Protein-Varianten
durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA
Sequenz der gewünschten
Mutation kodieren, ebenso wie für
eine ausreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz
mit einer ausreichenden Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu
stellen, um eine stabile Duplex auf beiden Seiten der Deletionsstelle
zu bilden. Üblicherweise
wird ein Primer mit einer Länge
von etwa 20 bis 50 Nukleotiden bevorzugt, wobei wenigstens etwa
5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindung der zu ändernden
Sequenz vorhanden sind. Im allgemeinen sind die Verfahren der ortspezifischen Mutagenese
auf dem Gebiet wohl bekannt, wie durch Veröffentlichungen wie z.B. Edelmann
et al., DNA 2:183 (1983), veranschaulicht wird. Wie klar sein wird,
verwendet die Methode der ortspezifischen Mutagenese üblicherweise
einen Phagenvektor, der sowohl in einzelsträngiger wie auch in doppelsträngiger Form
vorkommt. Übliche,
für die
ortsgerichtete Mutagenese nützliche
Vektoren schließen
Vektoren wie z.B. den M13 Phagen ein. Dieser und andere Phagenvektoren
sind kommerziell erhältlich,
und ihre Verwendung ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt.
Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Ausbildung von Oligodeoxyribonukleotid-vermittelten
ortspezifischen Mutationen in DNA Fragmenten unter Verwendung von
Vektoren, die von M13 abgeleitet sind, wurde von Zoller, M.J. und
Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982, veröffentlicht.
Außerdem
können
Plasmid-Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung
enthalten, Veira et al. Meth. Enzymol. 153:3 (1987,) verwendet werden,
um einzelsträngige
DNA zu erhalten.
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Alternativ
werden Nukleotidsubstitutionen eingeführt, indem das geeignete DNA
Fragment in vitro synthetisiert wird und mit Hilfe von auf dem Gebiet
bekannten PCR Verfahren amplifiziert wird.
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Im
allgemeinen kann die ortspezifische Mutagenese durchgeführt werden,
indem zunächst
ein einzelsträngiger
Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA Sequenz
umfasst, die für
das relevante Protein kodiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die
gewünschte
mutierte Sequenz enthält,
wird hergestellt, im allgemeinen synthetisch, z.B. mit Hilfe des
Verfahrens von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978).
Dieser Primer wird anschließend
mit dem Vektor annealed, der die einzelsträngige Proteinsequenz enthält und einer
Behandlung mit DNA-polymerisierenden Enzymen wie z.B. dem Klenow
Fragment der E. coli Polymerase 1 behandelt, um die Synthese des
die Mutation enthaltenden Stranges zu vervollständigen. Folglich wird eine
Heteroduplex gebildet, in der ein Strang für die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz
kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation enthält. Dieser
Heteroduplex-Vektor wird anschließend verwendet, um geeignete
Wirtszellen, wie z.B. HB101 Zellen zu transformieren, und Klone
werden selektiert, welche die rekombinanten Vektoren enthalten,
die die mutierte Sequenz-Zusammensetzung enthalten. Anschließend kann
die mutierte Region ausgeschnitten werden und für die Proteinherstellung in
einen geeigneten Expressions-Vektor eingefügt werden.
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Die
PCR Technik kann ebenfalls bei der Erzeugung von Aminosäuresequenz-Varianten
des Hte Proteins verwendet werden. Wenn geringe Mengen der Template
DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer,
die sich in ihrer Sequenz etwas von der entsprechenden Region in
einer Template DNA unterscheiden, verwendet werden, um relativ große Mengen
eines spezifischen DNA Fragmentes zu erzeugen, das sich von der
Template Sequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen die
Primer sich von dem Template unterscheiden. Zur Einführung einer
Mutation in eine Plasmid DNA wird einer der Primer so konstruiert,
dass er die Position der Mutation umfasst und die Mutation enthält; die
Sequenz des anderen Primers muss mit dem Sequenzabschnitt des gegenüberliegenden
Stranges des Plasmids identisch sein, diese Sequenz kann jedoch
irgendwo innerhalb der Plasmid DNA liegen. Es wird jedoch bevorzugt,
dass die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nukleotiden
von der des ersten Primers liegt, so dass am Ende die gesamte amplifizierte
Region der DNA, die von dem Primer gebunden wird, leicht sequenziert
werden kann. Eine PCR Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaares
wie dem gerade beschriebenen führt
zu einer Population von DNA Fragmenten, die sich an der von dem
Primer spezifizierten Position unterscheiden und wenn möglich an
weiteren Positionen, da die Vervielfältigung des Templates in gewisser
Weise fehleranfällig
ist.
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Weitere
Details der zuvor beschriebenen sowie ähnlicher Mutagenese-Verfahren
sind in allgemeinen Lehrbüchern,
wie z.B. Sambrock et al., Molecular Cloning: H. Laboratory Manual
2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1989),
und Current Protokols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausgeber John
Wiley and Sons (1995), zu finden.
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Natürlich vorkommende
Aminosäuren
können
auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt
werden:
- (1) hydrophob: Norleucin, met, ala,
val, leu, ile;
- (2) neutral hydrophob: cys, ser, thr;
- (3) sauer: asp, glu;
- (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
- (5) Reste, welche die Kettenorientierung beinflussen: gly, pro;
und
- (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
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Konservative
Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds einer Gruppe
durch ein anderes Mitglied innerhalb der selben Gruppe, wobei nicht-konservative
Substitutionen den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen
durch ein anderes mit sich bringen wird (siehe allgemein Orcutt,
B.C. und Dayhoff, M.O.,Scoring Matrices, PIN Report MAT-0285, Februar
1985). Es ist zu erwarten, dass durch nicht-konservative Substitutionen
erhaltene Varianten zu signifikanten Veränderungen der biologischen
Eigenschaften/Funktion der erhaltenen Variante führen und zu Hte Protein-Varianten
führen
kann, die die normale Hte Funktion blockieren. Aminosäurepositionen,
die innerhalb verschiedener Arten konserviert sind, werden im allgemeinen in
einer relativ konservativen Art und Weise substituiert, wenn es
das Ziel ist, die biologische Funktion zu erhalten.
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Aminosäureinsertionen
schließen
Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen ein, die im Bereich einer
Länge von
einem Rest bis hin zu Polypeptiden liegen, die hundert oder mehr
Reste enthalten, ebenso wie Intrasequenz-Insertionen eines einzigen
oder mehrerer Aminosäurereste.
Intrasequenz-Insertionen (d.h. Insertionen innerhalb der Hte-kodierenden Region)
können
im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, bevorzugter
im Bereich von 1 bis 5 Resten, bevorzugter im Bereich von 1 bis
3 Resten liegen. Beispiele für
teminale Insertionen schließen
variante Hte Proteine ein, die eine heterologe N-terminale Signalsequenz angefügt an den
N-Terminus des Hte Proteins enthalten, um die direkte zelluläre Lokalisierung
oder Sekretion des Hte Proteins aus den rekombinanten Wirtszellen
zu ermöglichen.
Derartige Signalsequenzen werden im allgemeinen von der vorgesehenen
Wirtszellart stammen und folglich homolog zu dieser sein. Geeignete
Sequenzen schließen
STII oder Ipp für
E. coli ein. Andere Insertionsvarianten des Hte Proteins schließen C-terminale
Fusionen ein. Darüber
hinaus können
weitere Varianten des Hte Proteins durch chemische Modifikation der
einzelnen Aminosäuren
oder durch die Inkorporation nicht-natürlicher Aminosäuren oder
Aminosäuren
mit nicht-biologischer Herkunft erhalten werden.
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Da
es häufig
schwierig ist, im Voraus die Eigenschaften eines bestimmten varianten
Hte Proteins vorauszusagen, wird klar sein, dass ein Screening notwendig
sein wird, um die optimalen Varianten zu selektieren. Zu diesem
Zwecke werden genetische Screening-Assays, wie z.B. die hierin unten beschriebenen,
unverzichtbar sein.
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Angesichts
der Tatsache, dass eine veränderte
Transformationseffizienz mit veränderten
Zellhüllen (z.B.
verändertem
LPS in der äußeren Membran
und eine veränderte
Memb ran-Fluidität)
in Zusammenhang gebracht wurden, ist es außerdem möglich, dass der durch die Hte
Region bereitgestellte gewünschte
Phänotyp
mit einer strukturellen Anomalie in Zusammenhang steht, die durch
ein verändertes
oder funktionell inaktives zelluläres Protein verursacht wird.
Z.B. kann die Mutagenese des Hte Gens zu der Erzeugung eines Stop-Kodons
in einer kodierenden Schlüsselregion
durch ein oder mehrere Transitions- oder Transversions-Mutationen
geführt
haben. Darüber
hinaus kann eine Frame-shift-Mutation einen nativen offenen Leseraster
zerstört
haben, um den gewünschten
Phänotyp
der hohen Transformationseffizienz zu erzeugen. Wenn eine solche
Mutation beteiligt ist, ist es ein besonders bevorzugtes Verfahren
zur Erzeugung des gewünschten Phänotyps,
das vollständige
oder einen wesentlichen Teil des mutierten Gens zu eliminieren.
Optimalerweise wird wenigstens ein essentieller Teil des Hte Gens
eliminiert oder eine geeignete Frame-shift-Mutation kann erzeugt
werden, indem eine Anzahl von Basen deletiert wird, die nicht durch
die Zahl 3 teilbar ist. Durch Eliminieren des mutierten Gens werden
die Möglichkeiten
einer Reversion drastisch reduziert.
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Optional
kann das Hte Gen durch Insertionsmutagenese inaktiviert werden,
indem ein selektierbarer Marker in oder nahe des Hte kodierenden
Bereiches insertiert wird. Entsprechend kann die stabile Aufrechterhaltung
der Hte Mutation sichergestellt werden, indem die richtige Antibiotika-Selektionsmethode
zur Verfügung
gestellt wird. Die Inaktivierung des Hte Lokus durch Deletion oder
Insertionsaktivierung wird ebenfalls bevorzugt, wenn das Hte Gen
für einen
Repressor oder ein Aktivatormolekül für ein Gen oder Operon kodiert, wobei
die resultierende konstitutive Expression (oder Inaktivierung) des
Gens oder des Operons zu dem Hte Phänotyp beiträgt.
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Es
ist weiterhin möglich,
dass die vorliegend beschriebene Hte Mutation zu einer verstärkten Expression
oder Überexpression
eines Genproduktes oder Operons führt. Umgekehrt ist es außerdem möglich, dass das
Mutieren der Hte Region zu einer Unterexpression eines bestimmten
Genproduktes oder Operons führt.
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Zusätzliche
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, welche die normale Funktion
des Hte Proteins inhibieren oder verstärken, so dass die Mikroorganismen,
welche die Verbindung exprimieren oder einer solchen Verbindung
ausgesetzt oder mit einer solchen Verbindung behandelt wurden, eine
verstärkte
Transformationseffizienz zeigen oder den Hte Phänotyp.
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Die
vorliegend beschriebenen Hte- kompetenten
Zellen können
außerdem
mit anderen gewünschten genetischen
Markern kombiniert werden. Z.B. kann die relevante Hte- Re gion
in ein Bakterium überführt werden,
das genetisch so manipuliert wurde, dass es ein Gen enthält und exprimiert,
das für
ein Kohlehydrat-degradierendes Enzym oder ein funktionelles Derivat
davon kodiert. Vorzugsweise ist das Kohlehydrat-abbauende Enzym
fähig,
Stärke
abzubauen. Das exprimierte Enzym ist vorzugsweise in dem periplasmatischen
Raum der Zelle lokalisiert; jedoch ist die Ausführung der Erfindung nicht abhängig von
irgend einer bestimmten Theorie, was die zelluläre Lokalisierung der exprimierten
Kohlehydrat-abbauenden Enzyme angeht.
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Darüber hinaus
kann die Hte Region in Verbindung mit Klonierungsvektoren verwendet
werden, die unter Verwendung der LacZα Fragment-Komplementierung in
Zusammenhang mit einer bestimmten Mutation innerhalb des LacZ Gens
gescreent werden können.
In ähnlicher
Weise kann die Zelle verschiedene andere Deletionen oder Mutationen
enthalten, um für
die Komplementierung durch die transformierende DNA zur Verfügung zu
stehen. Die Wirtszelle kann entweder ein Restriktions-Modifikations-System
besitzen oder es kann ihr fehlen, um die Klonierung zu beschleunigen.
Den Wirtszellen kann außerdem
ein oder mehrere Kombinationssystem(e), z.B. RecA, RecBC fehlen.
Besonders bevorzugte E. coli Stämme
zur Verwendung in der Erfindung sind der XL1-BlueTM Stamm
(Stratagene, La Jolla, California), der XL1-Blue MR Stamm und der
SURETM Stamm (Stratagene, La Jolla, California),
die durch die Zugabe eines genetischen Konstruktes zur Expression von
Alpha-Amylase modifiziert wurden, die aus einem thermophilen Bakterium
isoliert wurde, und sie haben die ATCC Zugangsnummern 69480, 69481
bzw. 69482. Das Plasmid, das das Alpha-Amylasegen in den E. coli
Stämmen
mit den ATCC Zugangsnummern 69480, 69481 und 69482 enthält, kann
einfach in andere Bakterienstämme
transferiert werden, unter Verwendung von Methoden, die dem durchschnittlichen
Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. In ähnlicher Weise kann der durchschnittliche
Fachmann auf dem Gebiet das Alpha-Amylasegen aus Plasmiden in den
E. coli Stämmen
mit den Zugangsnummern 69480, 69481 und 69482 ausschneiden und kann
das Alpha-Amylasegen in ein neues genetisches Konstrukt transferieren,
bevor das Gen in einen neuen Bakterienstamm transferiert wird.
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Obwohl
auf E. coli Bezug genommen wird, können auch andere gramnegative
Bakterien und Zellen durch die Einführung der Hte Region kompetenter
gemacht werden. Z. B. Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Rhizobium,
Agrobacterium, Salmonella, Proteus, Shigella, Klebsiella und dergleichen.
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Obwohl
spezifische Beispiele von Mutagenese-Methoden hierin beschrieben
wurden, wird der Fachmann auf dem relevanten Gebiet für fähig gehalten,
jedes der vielen Mutagenese-Verfahren durchzuführen, um die in der vorliegenden
Offenbarung beschriebene Erfindung zu praktizieren.
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Angesichts
der erhöhten
Transformationseffizienz der Hte Mutanten, sind die vorliegend beschriebenen
Zellen besonders nützlich
für die
Klonierung und Subklonierung von heterologem genetischem Material von
Interesse. Üblicherweise
schließt
derartiges genetisches Material prokaryontische Gene von Interesse oder
tierische Gene oder cDNA und insbesondere Gene und cDNA von Säugetieren
ein. Optional wird das genetische Material von Interesse in einer
genomischen Bibliothek oder cDNA Bibliothek vorkommen. Darüber hinaus
sind die Hte Mutanten angesichts der verstärkten Transformationseffizienz
von großen
Plasmiden auch besonders nützlich
bei der Klonierung, Subklonierung und Veränderung genetischen Materials
von Interesse, an der große
Plasmide, wie z.B. Shuttle-Vektoren aus Hefe, Virus-Vektoren von
Säugern
(Retrovirus, Adenovirus, Papillomavirus, Herpesvirus, Adeno-assoziierter
Virus, Tollwutvirus und dergleichen beteiligt sind. Siehe allgemein
Sambrock et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, Vol. 3:16.1-16.89 (1989)),
Virusvektoren der Pflanze oder Insektenvektoren (z.B. Baculovirus).
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Die
Erfindung, die oben beschrieben worden ist, kann besser verstanden
werden unter Hinweis auf die folgenden Beispiele. Diese Beispiele
dienen nur dem Zwecke der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung
und sollten nicht als die Erfindung in irgend einer Weise beschränkend interpretiert
werden.
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Beispiele
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Mutagenese des E. coli
Chromosoms
-
Die
Mutagenese des E. coli Chromosoms wurde mit Hilfe von durch Miller,
J., (1995), A short Course in Bacterial Genetics., Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY adaptierten Standardverfahren durchgeführt. 50
ml einer logarithmisch wachsenden Kultur des E. coli Stammes CAG1001
(von C. Gross, U. Wisconsin) wurden bei 4000 rpm in einer Sorvall-Zentrifuge
pelletiert, einmal mit MC Puffer (100 mM MgSO4, 5
mM CaCl2) gewaschen und in 40 ml MC suspendiert.
5 ml wurden in Aliquots jeweils zu 6 sterilen Petrischalen gegeben.
Fünf dieser
Proben wurden mit ultraviolettem Licht verschiedener Intensitäten in dem
Stratagene Stratalinker 2400 (Katalog #400075) wie folgt behandelt:
Der Deckel der Schale wurde entfernt und neben die Zellen gelegt
und entweder mit 100uJ, 200uJ, 300uJ, 400uJ oder 600uJ exponiert;
die sechste Probe wurde nicht behandelt. Vor der Exposition wurden
5 μl eines
jeden Aliquots entfernt, 10-4 verdünnt, und
100 μl wurden auf
einer LB Platte ausplattiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen.
Nach der Exposition wurden die Zellen zurück in ein 50 ml konisches Testgefäß pipetiert,
und 1,2 ml 5 × LB
wurde dazugegeben. Die mutagenisierten (und Kontroll) Proben wurden
1 Stunde lang inkubiert, und 5 μl
wurden entfernt für
die Ausplattierung zur Bestimmung der Lebensfähigkeit. 100 μl der 10-2-, 10-3- und 10-4-Verdünnungen
wurden anschließend
auf LB Platten aufplattiert, während
die Kultur über
Nacht wachsen gelassen wurde.
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Am
nächsten
Tag wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte bestimmt und
mit ihren nicht-mutagenisierten Gegenstücken verglichen. Die UV-Intensitäten, die
zu einem 95%- bis
99%-igen Zelltod führten, wurden
als geeignet ausgewählt;
die Übernacht-Kulturen,
die diesen Proben entsprachen, wurden vereinigt, DMSO mit einer
Endkonzentration von 8% wurde dazugegeben, und die Zellen wurden
bei -80° C
gelagert.
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Um
einen E. coli Mutanten zu gewinnen, der eine erhöhte Transformationseffizienz
sowohl für
große als
auch für
kleine Plasmidmoleküle
zeigte, wurden die oben beschriebenen UV-Überlebenden vereinigt, bis zur
mittleren logarithmischen Phase wachsen gelassen, und die kompetenten
Zellen wurden mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt. Diese
Zellen wurden anschließend
mit einer limitierenden Menge an pUC DNA (1 pg) transformiert, und
Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. Der Hintergrund
für dieses Screening
war, dass wenn weniger DNA Moleküle
als Zellen zu der Transformation dazugegeben wurden, jede spezifische
Zelle, die "transformierbarer" war, eine höhere Wahrscheinlichkeit
zur Aufnahme des pUC DNA Moleküls
hätte.
E. coli CAG1001 wurde als Ausgangsstamm verwendet, da er keine Mutationen
trug und sup0 war (keine bekannte Suppressor tRNA Aktivität). Darüber hinaus
war er im Vergleich zu Stämmen
wie z.B. XL1-Blue/DHSa schwer zu transformieren (nicht veröffentlichte
Beobachtungen). Folglich wäre,
da die Hintergrund-Transformationseffizienz geringer war, jede Mutante
mit den gewünschten
Eigenschaften sichtbarer. Aus diesem Experiment wurden 1500 Transformanten
aus jedem Pool erhalten. Es wurde angenommen, dass unter diesen
Zellen die Mutanten wären,
die eine höhere
Transformationseffizienz aufwiesen (zusammen mit der Mehrheit, die
unverändert
aber aufgrund der statistischen Wahrscheinlichkeit transformiert
war). Diese Transformanten wurde anschließend vereinigt, bis zur mittleren
logarithmischen Phase wachsen gelassen, und kompetente Zellen wurden
erneut hergestellt. Diese Pools wurden anschließend mit 1 ng pQL1, einem pACYC
184 Derivat (Quinn Lu, nicht veröffentlicht)
transformiert, der zusammen mit pUC stabil aufrecht erhalten werden
kann und der einen anderen Antibiotika-selektierbaren Marker (Chloramphenicol)
trägt.
Die Platten mit mehr als 200 Transformanten wurden ausgewählt und
aufgehoben. Als Verfahren zur Anreicherung der Zahl von Mutanten
von Interesse wurde die Anzahl der Transformanten/Pool reduziert.
Durch Verwendung dieser Anzahl wurde festgestellt, dass jeder Pool
so wenig wie eine einzige Mutante enthalten kann, der tatsächlich einen
Phänotyp
mit erhöhter
Transformation aufwies. Eine Analyse dieser 200 Kolonien wurde anschließend durchgeführt, indem
zufällig
90 der Kolonien ausgewählt
und Präparationen
kompetenter Zellen in geringem Maßstab hergestellt wurden. Die
90 wurden mit pAL205 transformiert, einem RSF1010 Derivat, das relativ groß ist (15
kb), Tetracyclin-resistent und dessen Replikationsursprung mit denen
von pUC und pACYC184 kompatibel ist. Von diesen 90 wurden die 15
für die
weitere Analyse ausgewählt,
die die größte Anzahl
an Transformanten zur Verfügung
stellten (die tatsächlichen
Effizienzen wurden nicht bestimmt, da die Zelldichte und andere
Faktoren, die normalerweise kontrolliert werden, nicht kontrolliert
wurden und da so viele gleichzeitig analysiert wurden).
-
Anschließend wurden
mit Hilfe des Standardverfahrens kompetente Zellen von diesen 15
Stämmen hergestellt,
wobei die optische Dichte und die verschiedenen anderen Parameter
beobachtet wurden. Vier dieser Stämme zeigten eine signifikante
Erhöhung
der Transformationseffizienz, und diese vier bildeten den nächsten Pool
für die
Gewinnung von Mutanten (die Nummern 7, 12, 33 und 59).
-
Herstellung
kompetenter Zellen zur Anreicherung und Auswertung
-
Kompetente
Zellen von jedem der Pools potentieller Mutanten oder isolierter
Mutanten (siehe unten) wurden auf identische Weise hergestellt.
Die geeignete Zellmenge (10 ml -250 ml, abhängig von dem Experiment) wurde
in LB Medium bis zu einer optischen Dichte (O.D. 600)
von etwa 0,35 wachsen gelassen. Die Zellen wurden in die geeigneten
Zentrifugenröhrchen überführt (für die 10
ml Kulturen, die in einem 50 ml konischen Testgefäß wachsen
gelassen wurden, war kein Transfer notwendig) und bei 1.400 rpm
bei 4° C
pelletiert. Das Pellet wurde in der Hälfte seines Anfangsvolumens
in FSB (10 mM Kaliumacetat pH 7,6, 45 mM Manganchlorid, 10 mM Kalziumchlorid,
3 mM Hexa mincobaltchlorid und 8% Glycerin) suspendiert und wie zuvor
zentrifugiert. Die Zellen wurden anschließend in 1/20 des ursprünglichen
Volumens an FSB suspendiert, DMSO wurde mit einer Endkonzentration
von 8% zugegeben, und die kompetenten Zellpräparationen wurden bei -80° C eingefroren.
Wenn geringe Volumina an kompetenten Zellpräparationen für die sofortige
Auswertung hergestellt wurden, wurden die Schritte der DMSO-Zugabe
und des Einfrierens übersprungen,
und 100 μl
der Zellsuspension wurden direkt getestet.
-
Die
Transformation der kompetenten Zellen wurde unter Standardbedingungen
durchgeführt
(siehe Stratagene Competent Cell Manual für Details). (3-Mercaptoethanol
oder UltraBeta wurden, wie in diesen Handbüchern beschrieben, entweder
dazugegeben oder nicht, abhängig
von der Anwendung (siehe Text für Einzelheiten).
-
λ:: Tn10 Mutagenese
-
Die
Zufalls-Insertion des Transposons Tn10 (Tetracycline-Resistenz)
wurde wie von Kleckner et al., 1991, Methods in Enzymology 20:139,
beschrieben durchgeführt. λ: 1098 (Tn10)
ist ein defekter λ Virus,
der aufgrund von Amber-Mutationen, die in dem λ 0 Gen (DNA Replikation) und
int Gen (Lysogenisierung) vorhanden sind, unfähig ist, in einem sup0 E. coli
Wirt zu replizieren oder diesen zu lysogenisieren. Folglich sind
diese Phagen beim Eindringen in ein sup0 E. coli unfähig zur
weiteren Progagierung, bleiben jedoch fähig, die kodierten Gene zu
exprimieren. Dieser Phage trägt
ein DNA Segment, das für
das Tn10 Tetracyclin-Resistenz-Gen kodiert (umgeben von den IS10
Elementen, die für
die Transposition benötigt
werden). Der Phage trägt
außerdem
das Tn10 Transposase-Protein, das benötigt wird, um die Zufalls-Transposition
zu katalysieren. Werden sup0 E. coli mit λ: 1098 infiziert, können Tetracyclin-resistente
Bakterien selektiert werden, die eine Kopie des tet Resistenzgenes
enthalten, das irgendwo in dem Chromosom lokalisiert ist (beachte:
die Stammlösung
von λ: 1098
kann auf einem sup0 E. coli hergestellt werden, da die Suppression
der Amber-Mutationen in dem λ:Gen
die Replikation und die anschließende Lyse dieses Wirtes erlaubt).
-
Die λ: 1098 Insertionen
werden durch Infektion von 100 μl
logarithmisch wachsenden E. coli mit 108 Phagenpartikeln
erzeugt; da die Transpositions-Frequenz 10-4 bis
10-5 beträgt, können etwa 103 bis
10" Tetracyclin-resistente
Kolonien unter Verwendung dieses Systems erhalten werden. Wurde
eine größere Anzahl von
Tn10 Zufallsinsertionen gewünscht,
wurden mehrfache Infektionen durchgeführt.
-
Die
vier potentiellen, in Abschnitt 5.1 oben beschriebenen Mutanten
befanden sich in einem CAG kanR prototrophen
Hintergrund. Daher war es notwendig, sämtliche chromosomalen Abschnitte
aus diesen vier in ein geeignetes Derivat von XL2-Blue (XL1-MRA)
zu "transferieren", in welchem das
Screening wiederholt werden konnte. Das Zufalls-Transpositions-Kartienangsschema wurde
verwendet, um das tet Resistenzgen zufällig in das E. coli Chromosom
einzuführen.
Das Zufalls-Transpositionsverfahren erforderte, dass die Zellen nicht-supprimierend
(sup0) und Tetracyclin-sensitiv waren.
-
Jede
der vier potentiellen Mutanten wurde der Zufalls-Transposition des
Tetracyclin-Resistenzgens unterzogen
und etwa 5.000 Kolonien wurden gewonnen. Wäre die Transposition zufällig, würden 50
Insertionen statistisch 1 Insertion/100 Kilobasen-Paare in dem E.
coli Genom bedeuten (der Grund für
die Verwendung der 1 Insertion/100 kb wird unten erklärt). Jedoch
wählten
wir ungefähr
5.000 TetR Derivate aus, um sicher zu stellen,
dass sämtliche
Bereiche des Pools repräsentiert
waren und während
der allgemeinen Transduktion gewonnen werden könnten.
-
Herstellung von P1 Lysaten
-
P1
Phagen-Lysate wurden wie in Miller (1995) beschrieben hergestellt.
5 ml einer Kultur des Stammes von Interesse wurde bis zur mittleren
log Phase bei 37° C
in LB wachsen gelassen, das mit 5 ml CaCl2 angereichert
war. 1 ml der Zellen wurde in ein 12 ml Falcon 2059 Gefäß pipettiert,
und 1 μl
der P1 Stammlösung
mit hohem Titer (108-109 pfu/ml;
hergestellt auf JM101) wurde dazugegeben. Für die meisten Stammkulturen
wurden die Infektionen 4-fach durchgeführt und zusammengeführt. Der
Phage und die Zellen wurden bei 35° C 15 bis 20 Minuten lang ohne
Schütteln
inkubiert. Das Lysat wurde anschließend durch Zugabe von 2,5 ml
Topagar (angereichert mit CaCl2 auf 5 mM)
ausplattiert, und die Probe wurde auf NY Platten gegossen und bei
37° C über Nacht
inkubiert. Am folgenden Morgen wurde der Topagar in ein 12 ml Zentrifugengefäß gegeben.
Die Platten wurden mit 1 ml LB gewaschen und der verbleibende Agar/Aufschlämmung wurde
in das Gefäß dazugegeben.
5 Tropfen (dazugegeben mit Hilfe einer Pasteur-Pipette) Chloroform
wurden anschließend
zu dem Gefäß gegeben,
und die Suspension wurde gevortext (10-20 sec auf höchster Stufe).
Die Proben wurden bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert,
anschließend
bei 5.000 rpm in einer Sorvall-Zentrifuge (4° C) für 15 Minuten zentrifugiert.
Der den Phagen enthaltene Überstand
wurde gewonnen und in ein neues 12 ml Zentrifugengefäß transferiert,
fest verschlossen und bei 4° C
gelagert.
-
P1 Transduktion
-
Die
P1 Transduktion wurde wie von Miller (1995) beschrieben durchgeführt. 5 ml
des Empfängerstammes
wurden über
Nacht in LB Medium wachsen gelassen, dem 5 mM CaCl2 zugesetzt
war. Die stationäre
Kultur wurde mit Hilfe der Zentrifugation in einer Sorvall-Zentrifuge
bei 5.000 rpm für
5 Minuten geerntet und in dem gleichen Volumen MC Puffer (100 mM
MgSO4, 5 mM CaCl2)
suspendiert. Die Zellen wurden zurück in einen 37° C Luftschüttler gegeben
und für
20 Minuten inkubiert, anschließend
wie zuvor zentrifugiert. Die Pellets wurden in einem Volumen von
500 μl MC
Puffer suspendiert; 100 μl
der Zellsuspension wurden anschließend in ein 12 ml Falcon Zentrifugenröhrchen transferiert.
1 bis 100 μl
des P1 Lysates (die Menge variiert abhängig von dem individuellen
Titer; entsprechend wurden für
jede Transduktion 1, 5, 25 und 100 μl getestet) wurden zu jedem
Gefäß dazugegeben.
Eine Probe wurde jeweils immer als Kontrolle unbehandelt gelassen. Die
mit P1 infizierten Zellen wurden bei 37° C für etwa 15 bis 20 Minuten inkubiert.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 200 μl 1 M Natriumcitrat gestoppt.
0,5 ml LB wurden zu jeder Probe dazugegeben, und die Zellen wurden
bei 37° C
eine Stunde lang wachsen gelassen, um die Expression des Arzneimittel-Resistenzgenes (Tetracyclinresistenz
in den hier beschriebenen Experimenten) zu ermöglichen. Nach der Expression wurden
die gesamten Inhalte der Gefäße auf LB-
oder NZY-Platten mit dem geeigneten Antibiotikum ausplattiert.
-
Die
Wiedergewinnung der Tetracylin-Resistenzgene (und folglich der Zufallsregionen
der vier in Abschnitt 5.3 beschriebenen E. coli Genome) wurde mit
Hilfe der P1 Transduktion erreicht. P1 ist ein Bakteriophage, der
bei der Infektion eines sensitiven E. coli Stammes seine DNA repliziert,
sie verpackt, schließlich
die Lyse der Wirtszelle verursacht und ihren Tod. 99% aller verpackten
Partikel sind infektiöse
P1 Partikel, und 1 % sind 100 kb Zufallsstücke der Wirtszellen DNA (d.h.
der chromosomalen DNA von E. coli), die versehentlich verpackt wurden.
Wenn diese Lysate verwendet werden, um einen neuen Wirt zu infizieren,
werden 99% dieser neuen Zellen infiziert und getötet und 1 % werden zu Empfängern für die 100
kb Segmente der genomischen DNA von E. coli aus den vorangegangenen
Stämmen.
Wenn das Lysat in einem E. coli Stamm hergestellt wurde, der einen
integrierten selektierbaren Marker hat (wie das Tn10 tet Resistenzgen),
und der Empfänger
fähig ist
zur homologen Rekombination, dann kann ein chimerer E. coli Stamm
erzeugt werden, der diese 100 kb Region aus den P1-gewachsenen Wirt
anstelle seiner eigenen enthält.
Auf diese Weise wurden durch Vereinigung der 5.000 tet resistenten
Kolonien aus dem mutierten Pool und ihren Transfer in einen neuen
Stamm (XL1- MRA,
eine recA-, F- Version
von XL2-Blue), zufällige
chromosomale Bereiche aus dem Pool mit höherer Transformation selektiert.
Etwa 5.000 tetR Transduktanten wurden für jede der
vier Mutanten ausgewählt,
gepoolt und den oben beschriebenen Transformationsanreicherungsexperimenten
unterzogen. 1 ng pACYC177 (kanR) wurde verwendet,
um jeden Pool zu transformieren, und 300 bis 500 Transformanten
wurden anschließend
vereinigt und mit 1 ng pAL205 (Chloramphenicol-resistent) transformiert,
und 50 bis 150 Kolonien selektiert. Diese 50 bis 150 Kolonien wurden
anschließend
vereinigt und mit pUC transformiert, und 20 bis 40 der resultierenden
Kolonien wurden erneut vereinigt.
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Diese
drei weiteren Anreicherungsrunden wurden durchgeführt, um
im Hinblick auf die TetR Transposons zu
screenen, die neben der Mutation liegen, eher als TetR Transposons,
die woanders integrierten. Die 20-40 Transformanten wurden anschließend mit
P1 infiziert, und neue Lysate wurden hergestellt, die das TetR Gen neben einem Segment liegend aufwiesen,
das eine verbesserte Transformationseffizienz zur Verfügung stellte.
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Diese
vier P1 Lysate wurden anschließend
in XL1-Blue MR transduziert, der pJC859 enthält. Dieses Plasmid ist ein
pBR322 Derivat, das das E. coli recA' Gen enthält (das notwendig ist für den Fortgang
der P1 Transduktion), und einzelne Transduktanten wurden ausgestrichen
und aufgrund ihrer Transformationseffizienz im Vergleich zu parentalen
XL1-Blue, die pJC8S7 enthalten, analysiert (Tabelle 1).
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Aus
jedem der vier identifizierten P1 Pools wurde eine einzelne Kolonie
ausgewählt,
die eine Erhöhung der
Transformationseffizienz zeigte. Diese Mutanten wurden 7, 12, 33
und 59 genannt, in Übereinstimmung mit
den ursprünglich
isolierten Mutanten. TABELLE
1: VERGLEICH DER TRANSFORMATIONSEFFIZIENZEN POTENTIELLER MUTANTEN
UND DER ELTERNSTÄMME
WIRT | ANZAHL
DER TRANSFORMANTEN |
# 7 | 168 |
# 12 | 190 |
# 33 | 140 |
# 59 | 154 |
XL1MR/pJC857 | 104 |
-
Transferieren
potentieller Mutationen in den XL1-Blue Hintergrund XL1-MR/pJC859
ist ein F- Derivat von XL1/XL2 blue, das
ein Plasmid enthält,
welches das E. coli recA+ Genprodukt exprimiert.
Um diesen Stamm in eine isogene Version von XL2-Blue umzuwandeln,
war es notwendig, das recA Plasmid aus der Zelle zu entfernen. Dies
wurde durch ein verlängertes
Wachstum in LB Tet (keine Ampicillinselektion) für 50 bis 100 Generationen und
durch Screenen einzelner Kolonien im Hinblick auf ihre Ampicillinsensivität erreicht.
Wenigstens einer wurde jeweils für
die vier Mutanten identifiziert; etwa 100 bis 500 einzelne Kolonien
wurden untersucht, um die Ampicillinsensitive Zelle von Interesse
zu isolieren.
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Jede
der vier E. coli Mutanten wurde anschließend als Empfänger für die F' konjugative Paarung
mit dem F' Amylase-Episom
von XL2-Blue verwendet. Kompetente Zellpräparationen in kleinem Maßstab wurden anschließend von
diesen Exkonjuganten hergestellt, und die Transformationseffizienzen
wurden unter Verwendung von pUC und pRK2013 (ein 25 kb Plasmid)
bestimmt (siehe Tabelle 2). Der Stamm, der die höchste relative Effizient sowohl
mit pUC als auch mit pRK2013 aufwies (Mutante # 12) wurde anschließend für die Präparationen
im großen
Maßstab
verwendet.
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TABELLE
2: TRANSFORMATION MIT KLEINEN UND GROBEN SUPERCOILED PLASMID DNA
MOLEKÜLEN
-
Die
in Tabelle 2 gezeigten Transformationseffizienzen wurden wie folgt
bestimmt. 100 pg pUC oder 500 ng pRK2013 wurden zu 100 μl kompetenten
Zellen gegeben und gemäß dem Standardprotokoll
transformiert. Aliquots (0,1 %, 1 %, 10%, usw.) eines jeden Transformationsgemisches
wurden anschließend
auf die geeigneten Selektionsplatten ausplattiert, um die Transformationseffizienz
zu bestimmen. Diese Daten zeigen, dass – obwohl die relative Transformationseffizienz
für ein
kleines Plasmid (pUC) im Vergleich zu XL2-Blue unverändert blieb – die Transformationseffizienz
mit dem 25 kb pRK2013 Plasmid in XL10-GOLD drastisch erhöht war.
Der beobachtete Anstieg der Transformationseffizienz von großen Plasmiden
ist ein besonders nützliches Merkmal
der Zellen, welche die Hte- Mutation tragen.
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Anschließende Transduktionsstudien
haben gezeigt, dass – wenn
die Hte Region aus XL10-GOLD in einen heterologen E. coli Stamm
transferiert wurde – eine
etwa 6-fache Verstärkung
der Transformationseffizienz zu beobachten war. Da die P1 Transduktion verwendet
werden kann, um die Hte Region zwischen verschiedenen Wirten zu
transferieren, kann die Hte Region weiter als innerhalb der DNA
Region lokalisiert gekennzeichnet werden, die innerhalb von 100
kb des durch das Transposon kodierten tet Gens liegt, das in XL10-GOLD
enthalten ist.
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Optimierung
der Transformation
-
Die
Zugabe bestimmter Verbindungen zu kompetenten Zellen 10 Minuten
vor der Zugabe der DNA kann die Transformation drastisch verbessern.
Für die
Zelllinie, die oben am besten abschnitt, wurde die Transformationseffizienz
durch Herstellung von Matrices der beiden in dem derzeitigen UltraBeta
vorhandenen Verbindungen optimiert. Sowohl pUC as auch pRK2013 wurden
als Substrate verwendet, und die optimale Konzentration von jeder
Komponente wurde bestimmt. Weitere Beispiele solcher Optimierungsparameter
schließen
u.a. die Verwendung einer 110 mM NaCl Lösung und 50 mM 2-Mercaptoethanol
ein.
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Analyse weiterer
Merkmale der kompetenten Zellen
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Weitere
Merkmale der kompetenten Zellen, die in jeder verbesserten Version
vorhanden sein müssen, sind
die Fähigkeit
zur Durchführung
eines blau-weiß-Farbscreenings
(Vorhandensein von F laclgZΔM15),
das Fehlen bekannter Restriktionssysteme (Hsd-,
McrBCF-, McrA-),
und das Fehlen der EndA1 Nuklease, die für die Beeinträchtigung
der Miniprep DNA Isolationen verantwortlich ist. Im Hinblick auf
diese Merkmale wurde die # 12 Mutante getestet. Die Zellen behielten
alle diese Eigenschaften bei. Folglich wurde die Mutante # 12 verwendet,
um weitere Experimente zur Auswertung seines Nutzens zur PCR Klonierung
und zur Bibliothekenkonstruktion durchzuführen.
-
Effizienz
mit ligierter DNA
-
Im
allgemeinen lässt
sich ligierte DNA mit signifikant geringerer Effizienz transformieren
als DNA in supercoiled-Form. Um diesen Unterschied zu untersuchen
und zu bestimmen, ob die Mutante # 12 Variante im Vergleich zu existierenden
E. coli Stämmen
besser in der Lage war, ligierte Moleküle zu transformieren, wurde
das folgende Experiment durchgeführt.
10 ng pCAL n-EK Plasmid DNA wurde für eine Ligations-unabhängige Klonierung
hergestellt (LIC, Stratagene Katalog #214310), wobei die zur Verfügung gestellten
Angaben befolgt wurden. Ein Kanamycin-Resistenzgen wurde unter Verwendung
von Primem, die kompatible LIC Enden enthalten, mit Hilfe der PCR
amplifiziert, und das amplifizierte Produkt wurde wie zuvor beschrieben
behandelt, um die geeigneten kompatiblen Enden herzustellen. Diese
DNAs wurden unter Berücksichtigung
der vorgegebenen Bedingungen für
die LIC annealt. Ein Aliquot der annealten DNA Mischung wurde anschließend verwendet,
um Mutante #12 (im folgenden als XL10-GOLD bezeichnet) und DH5 von
Life Technologies zu transformieren. Die Anzahl der koloniebildenden
Einheiten (colony forming unit, cfu) wurde mit der Anzahl verglichen,
die beobachtet wurde, wenn pUC DNA in supercoiled-Form als Substrat
verwendet wurde. Die Daten zeigten, dass die Anzahl der cfu für die annealte
(d.h. ligierte DNA), 20-fach höher
für XL10-GOLD im Vergleich zu
DH5 war, und die Effizienz für
pUC war 5-fach höher.
Diese Verbesserung der Transformation für ligierte DNA Moleküle stellt
einen signifikanten Unterschied zwischen diesen Stämmen dar.
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Eine
zweite Reihe von Ligationen wurde anschließend unter Verwendung der Plasmide
pADGal4 (7,6 kb) und pCMV-Script (4,3 kb) als Vektoren hergestellt.
Diese Plasmide wurden mit EcoRI und XhoI verdaut. Etwa 10 ng einer
cDNA Bibliothek des Maus-Gehims
(hergestellt unter Verwendung des cDNA Synthesekits von Stratagene)
wurden mit 30 ng pCMV-Script (oder 60 ng pADGal4) ligiert. Die Ligationsreaktionen
wurden bei 4° C über Nacht
durchgeführt
und wurden anschließend
in XL10-GOLD, DH10B und XL2-Blue transformiert. Die Daten für beide
Experimente sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass
XL10-GOLD bei der Transformation der pUC DNA etwa 5-fach besser
war und bei der Transformation der ligierten (d.h. größeren) DNA
Moleküle
etwa 20 bis 40 mal besser war als DH10B. Der beobachtete Unterschied
ist sehr bedeutend bei Klonierungsanwendungen, wie z.B. bei der
Konstruktion von cDNA Bibliotheken oder der PCR Klonierung und stellt
ein weiteres der besonders nützlichen
Merkmale von Zellen dar, welche die Hte Mutation tragen.
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TABELLE
3: Transformation mit cDNA Bibliotheken in zwei Plasmid Vektoren
-
Bibliothek
1: pADGal4, ein von pBluescript abgeleitetes Plasmid (7,6 kb) wurde
mit Eco-RI und Xho1 verdaut.
60 ng des verdauten Vektors wurden mit 10 ng der cDNA wie oben beschrieben
ligiert. Die Transformationen wurden auf dieselbe Weise durchgeführt, und
die Anzahl der Ampicillin-resistenten Transformanten wurde bestimmt.
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Bibliothek
2: pCMV-Script, ein von pBluescript abgeleitetes Plasmid (4,3 kb)
wurde mit EcoRI und Xho1 verdaut. 30 ng des verdauten Vektors wurden
mit 10 ng cDNA ligiert, die mit Hilfe eines Standardprotokolls hergestellt
wurde. Die DNA wurde über
Nacht bei 4° C
in 10 μl
Volumen ligiert, und 1 μl
wurde zu kompetenten Zellen aus den angegebenen Stämmen dazugegeben.
-
Die
genauen Einzelheiten des bevorzugten Verfahrens zur Transformation
von XL10-GOLD sind
die folgenden:
- 1. Aliquotieren von 100 μl der Zellen
in ein Falcon 2059 Gefäß.
- 2. Zugabe von 3-Mercaptoethanol mit einer Endkonzentration von
50 mM (2 μl).
- 3. Zugabe von NaCl mit einer Endkonzentration von 110 mM (2 μl).
- 4. Inkubieren der Gefäße auf Eis
für 10
Minuten.
- 5. Zugabe von DNA.
- 6. Inkubieren auf Eis für
30 Minuten.
- 7. Hitzepuls bei 42° C
für 30
Sekunden.
- 8. Inkubieren der Gefäße auf Eis
für 2 Minuten.
- 9. Zugabe von 0,9 ml vorgewärmtem
NZY Medium und inkubieren bei 37° C
für 60
Minuten unter Schütteln bei
225-250 rpm.
- 10. Ausplattieren der Aliquots wie gewünscht und Inkubieren über Nacht
bei 37° C.
-
Äquivalente
-
Sämtliche
in der obigen Beschreibung erwähnten
Veröffentlichungen
und Patente sind hierin durch Referenz eingeschlossen. Die vorangehende
schriftliche Beschreibung wird als ausreichend betrachtet, um den
Fachmann auf dem Gebiet zu befähigen,
die Erfindung zu praktizieren. Es ist beabsichtigt, dass verschiedene
Modifikationen der oben beschriebenen Arten zur Durchführung der
Erfindung, die für
die Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie oder verwandten
Gebieten offensichtlich sind, von dem Umfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen
sind.