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WO2003093481A1 - Nukleinsäure zur autonomen replikation in mikroorganismen der familie der acetobacteraceae - Google Patents

Nukleinsäure zur autonomen replikation in mikroorganismen der familie der acetobacteraceae Download PDF

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Publication number
WO2003093481A1
WO2003093481A1 PCT/EP2003/004644 EP0304644W WO03093481A1 WO 2003093481 A1 WO2003093481 A1 WO 2003093481A1 EP 0304644 W EP0304644 W EP 0304644W WO 03093481 A1 WO03093481 A1 WO 03093481A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acetobacter
family
gluconobacter
acetobacteraceae
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/004644
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christine Beck
Hartwig Schröder
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Priority to AU2003240593A priority Critical patent/AU2003240593A1/en
Publication of WO2003093481A1 publication Critical patent/WO2003093481A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid sequence for autonomous replication in microorganisms of the Acetobacteraceae family.
  • the present invention furthermore relates to vectors containing this nucleic acid sequence or parts or variations thereof and corresponding organisms transformed therewith and their use in industrial processes for the biotechnological production of fine chemicals.
  • Acetobacteraceae which include the genera Gluconobacter and Acetobacter, are interesting organisms for industrial production processes, since they are distinguished, inter alia, by the ability to carry out oxidation reactions (for review articles see, for example, Gupta et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol ., 2001, 3 (3), 445 ff; Lust et al., Appl. Biochem. Microbiol., 1998, 34 (4), 307 ff or Macauley et al., Crit. Rev. Biotechnol., 2001, 21 ( 1), 1ff).
  • D-xylitol from D-xylulose (EP0976827)
  • gluconic acid from which tartaric acid can subsequently be obtained, see, for example, Matzerath et al., Inorganica Chimica Acta, 1995, 237, 203ff
  • 2,5-diketogluconic acid from glucose e.g. US3790444
  • bacterial cellulose from fructose
  • Gluconobacter is also suitable for the fermentative production of vitamin precursors based on D-sorbitol.
  • the biotechnological production of L-sorbose and 2-keto-L-gulonic acid (2-KGS), the precursor of vitamin C, are of great economic interest.
  • Genetic engineering methods are preferably used to provide optimized production strains of the genus Gluconobacter with appropriate properties for improved biosynthesis of the desired products.
  • a vector system is particularly necessary with which the desired nucleotide sequences can be transferred into the organism.
  • shuttle vectors which can be propagated not only in Gluconobacter, but also in microorganisms of other genera, offer themselves as a vector system.
  • Autonomously replicating plasmids from Gluconobacter and also from Escherichia are also known.
  • Endogenous plasmids and endogenous phages and shuttle vectors are described which are capable of replication in Gluconobacter and Escherichia.
  • some of the plasmids are very large, for example up to 26 megadalons or up to 11 kb, and are often only very suitable for an additional insertion of further nucleotide sequences with coding or replicating properties.
  • the object of the present invention was therefore to provide further nucleotide sequences with the ability for replication in microorganisms of the genus Gluconobacter or Acetobacter. Furthermore, it was desirable to provide a further vector system for replication in Gluconobacter or Acetobacter and another microorganism, advantageously the family of enterobacteria.
  • nucleic acid sequence according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof for autonomous replication in microorganisms of the Acetobacteraceae family.
  • the nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof capable of autonomous replication in microorganisms of the genus Gluconobacter or Acetobacter.
  • the nucleic acid mentioned is for the autonomous replication of DNA in Acetobacteraceae, such as, for example, Gluconobacter asaii. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. acetigenum, A. acetosum, A. aurantius, A.
  • Acetobacteraceae such as, for example, Gluconobacter asaii. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. acetigenum, A. acetosum, A. aurantius, A.
  • nucleic acid according to SEQ ID No. is replicated autonomously. 1 in
  • Gluconobacter asaii ,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans,
  • the autonomous replication takes place in G. oxydans, A. aceti, A. liquefaciens or A. suboxydans.
  • Parts of the nucleotide sequence according to the invention are understood to mean those fragments which still enable automatic replication in an organism of the Acetobacteraceae family, which the person skilled in the art can easily check using a functional analysis as follows: Any from the nucleotide sequence according to the invention selected portion of the sequence according to the invention is cloned into a vector which has a selection marker (for example an antibiotic resistance) and in particular is not capable of replication in an organism of the Acetobacteraceae family. A selection of vectors suitable for this purpose is known to the person skilled in the art and can also be obtained commercially.
  • a selection marker for example an antibiotic resistance
  • the transformed cells are cultivated on selection medium (for example with the addition of an antibiotic).
  • selection medium for example with the addition of an antibiotic.
  • those cells which can grow on the selection medium that is to say are able to replicate the marker gene-containing vector, are thus potential carriers of a functional part of the nucleotide sequence according to the invention.
  • the plasmid DNA is isolated from the selected cells according to the usual laboratory routine.
  • the isolated plasmid DNA is then analyzed, for example by restriction analysis or PCR, and compared with the nucleotide sequence according to the invention.
  • the described procedure for the functional proof of arbitrarily selected partial areas of the nucleotide sequence according to the invention are part of the common laboratory routine of a person skilled in the art of the present invention. By means of such functional proof, parts of the sequence according to the invention are clearly defined in the sense of the present invention even if these parts are not predetermined by numerically delimited areas within the nucleotide sequence.
  • “variations” of the nucleotide sequence according to the invention can also be identified analogously. According to the invention, these are to be understood as meaning those sequences which, despite a changed one Nucleotide sequence still have the same function (functional equivalents), ie enable according to the invention for automatic replication in an organism of the Acetobacteraceae family.
  • Functional equivalents include naturally occurring variations of the sequence according to the invention as well as artificial, e.g. B. nucleotide sequences obtained by chemical synthesis.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated sequence which continue to show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the nucleic acid according to SEQ ID No. 1 according to the invention originates from the genome or from an endogenous plasmid or endogenous phage of a microorganism of the family Acetobacteraceae. It advantageously comes from the genome or from an endogenous plasmid or endogenous phage of a microorganism of the genus Gluconobacter or Acetobacter.
  • the nucleic acid sequence particularly advantageously originates from the genome of Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens or Acetobacter suboxydans or endogenous plasmids or enodgenic phages of these microorganisms. Most advantageously, the nucleic acid comes from the genome or from an endogenous plasmid or endogenous phage from Gluconobacter oxydans.
  • this cryptic plasmid is named pGlul.
  • the sequence according to the invention takes on the function of an origin of replication, on which the doubling by Replication apparatus (including DNA and RNA polymerases, ligases, helicases, topoisomerases and exonucleases) is initiated.
  • the present invention also relates to a vector containing at least one nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof as well as additional sequences selected from the group of sequences for selection, detection, conjugation, multiple cloning, expression control, transcription termination,
  • the vector according to the invention is further characterized in that it replicates autonomously in a microorganism of the Acetobacteraceae family and additionally in a microorganism of the Enterobacteria family.
  • This means that such a vector according to the invention has, in addition to the origin of replication according to the invention, a further sequence which enables autonomous replication, but this time in enterobacteria.
  • the latter sequences are known to the person skilled in the art.
  • the vector according to the invention is advantageously distinguished by the autonomous replication in a microorganism of the genus Gluconobacter or Acetobacter and additionally in a microorganism of the family of enterobacteria.
  • the vector is particularly advantageous for autonomous replication in Gluconobacter asaii. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. hansenii, A. liquefaciens, A. oxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans or A. xylinus and capable in Escherichia coli.
  • the vector is highly advantageous for autonomous replication in Gluconobacter oxydans or Acetobacter aceti or Acetobacter liquefaciens or Acetobacter suboxydans and in Escherichia coli.
  • An exemplary method for producing the vector according to the invention comprises the following general steps, which are carried out routinely according to common laboratory practice:
  • oxydans can be introduced, the procedures required for this belong to common laboratory practice and are therefore not described in more detail, for example in Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning : a labaratory manual, Cold Spring Harbor Labaratory Press, New York.
  • the vector for selection in the bacterial cell contains antibiotic resistance genes.
  • resistance genes are in Sutcliffe JG., Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1978, 75 (8), 3737ff or in Gray GS. et al., Evolution of antibiotic resistance genes: the DNA sequence of a kanamycin resistance gene from Staphylococcus aureus, Molecular Biology & Evolution, 1983, 1 (1), 57ff.
  • An origin of replication is generally to be understood as a nucleotide sequence from which the duplication of the DNA (or RNA in the case of RNA viruses) by the replication apparatus, consisting inter alia from DNA and RNA polymerases, ligases, helicases, topoisomerases and exonucleases.
  • the vector can contain elements which enable the vector to be transferred between a donor and a recipient cell (conjugation).
  • the nukeotide region required for this is called the mob site (mobilization point).
  • a mob site is to be understood as a nucleotide sequence which encodes a relaxase and has an oriT (origin of transfer) at which the transfer of the vector from the donor cell to the recipient cell is initiated in the broadest sense.
  • the vector according to the invention preferably contains a mob site which enables a transfer from a cell of the genus Escherichia to a recipient of the genus Gluconobacter or Acetobacter.
  • mob sites are in Dougan G. et al., Mobilization of the Escherichia coli plasmid ColE1 (colicin E1) and ColE1 vectors used in recombinant DNA experiments, Journal of Infectious Diseases, 1978, 137 (5), 676ff or Priebe SD.
  • et al. Region of the streptococcal plasmid pMV158 required for conjugative mobilization, Journal of Bacteriology, 1989, 171 (9), 4778ff or Priefer ÜB.
  • the vector according to the invention can contain a gene for a “green fluorescence protein” (as described in Welsh S. et al., Reporter gene expression for monitoring gene transfer, Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8 (5), 617ff), which enables rapid detection of successfully transformed cells in fluorescent light.
  • nucleotide sequence according to the invention according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof or containing the vector according to the invention at least the nucleotide sequence according to the invention according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof, can be transferred into an organism, preferably a microorganism, which is suitable for fermentative production processes, according to common methods. Examples of such transmission methods are transformation, conjugation, electroporation, as described in Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning: a labaratory manual, Cold Spring Harbor Labaratory Press, New York.
  • the present invention thus comprises a transgenic organism containing individually or in combination a nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof and / or a vector which contains at least one nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof.
  • the transgenic organism according to the invention is furthermore distinguished by the fact that it belongs to the family of Acetobacteraceae or Enterobacteria, preferably of the genus Gluconobacter, Acetobacter or Escherichia.
  • a transgenic organism from the group Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti or Acetobacter liquefaciens, Acetobacter suboxydans or Escherichia coli is particularly preferred.
  • a transgenic organism of the Gluconobacter oxydans species is most preferred.
  • a transformed strain of Gluconobacter oxydans is preferred which is suitable for the improved production of fine chemicals, preferably vitamin precursors, in large-scale fermentation processes.
  • the present invention further comprises the use of the nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof for the production of a vector which is replicated in at least one microorganism of the Acetobacteraceae family, preferably of the Gluconobacter or Acetobacter genus.
  • the nucleic acid according to the invention or parts or variations thereof can also be used to produce a vector for the expression of genes in microorganisms of the family Acetobacteraceae, preferably of the genus Gluconobacter or Acetobacter. This may be homologous genes of the relevant organisms family, genus or r act -art or foreign genes, ie heterologous genes. Such genes preferably take key positions in biosynthetic pathways industrially interesting fine chemicals, a.
  • the nucleic acid according to SEQ ID No. is advantageously used. 1 or parts or variations thereof for the production of a production organism of the Acetobacteraceae family, preferably of the genus Gluconcobacter or Acetobacter for use in industrial production processes for the production of fine chemicals, preferably vitamin precursors.
  • production strains within the meaning of the invention include microorganisms from the Acetobacteraceae family, preferably the
  • Enterobacteria preferably of the genus Escherichia, which are modified by classic and / or molecular genetic methods in such a way that their metabolic flow increases in the direction of the biosynthesis of economically interesting fine chemicals or their
  • Descendants runs (metabolic engineering).
  • these production strains one or more genes and / or the corresponding enzymes, which are at crucial and correspondingly complex regulated key positions in the metabolic pathway (bottleneck), are changed or even deregulated.
  • the Production strains introduced one or more homologous and / or heterologous genes which enable reaction sequences in the form of biotransformations in the direction of the biosynthesis of economically interesting fine chemicals or their descendants.
  • the present invention encompasses all known production strains, preferably of the genus Gluconcobacter or Acetobacter.
  • those production strains are also included which the person skilled in the art can produce by analogy with knowledge from other microorganisms, for example enterobacteria, bacillaceae or yeast species, using conventional methods.
  • those production strains are also encompassed in which the degradation of the fine chemicals inside the cell or mediated by excreted enzymes is changed, preferably weakened. This can be done, for example, through targeted genetic engineering changes to degrading enzymes or the corresponding genes.
  • a further improvement in the yield of fine chemicals is achieved according to the invention in that the discharge of the desired compounds from the cells into the medium surrounding them is considerably improved. This is achieved according to the invention by the increased expression of export carrier genes.
  • Fine chemicals for the purposes of the present invention are to be understood as meaning compounds such as vitamins or their precursors, storage materials, sugar alcohols, aldoses or ketoses or sugar acids. These are preferably L-sorbose, L-sorbosone, gluconic acid, 5-ketogluconic acid (which can be converted into tartaric acid) or 2,5-diketogluconic acid, bacterial cellulose, L-erythrulose, D-xylitol, 2-keto-L-gulonic acid ( 2-KGS) and its secondary product vitamin C (ascorbic acid and / or its salts).
  • the vector according to the invention of the aforementioned type, containing at least one nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof can be used for the expression of homologous and / or heterologous genes in microorganisms of the family Acetobacteraceae, preferably of the genus Gluconobacter or Acetobacter.
  • the invention also includes the use of the vector mentioned for the production of a production organism of the Acetobacteraceae family, preferably of the Gluconcobacter or Acetobacter genus, for use in industrial production processes for the production of fine chemicals, preferably vitamin precursors. Furthermore, the present invention also relates to the use of a transgenic organism of the type described above, containing at least one nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or parts or variations thereof or a vector of the type mentioned for the production of fine chemicals, preferably vitamin precursors in industrial production processes.
  • the described Sall digested cryptic plasmid was ligated together with the Sall digested vector fragment pBS SK using the Rapid DNA Ligation Kit (Röche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions and transformed into XL-1-Blue (Stratagene).
  • the clones obtained were checked by DNA preparation (DNA mini-preparation kit Röche Diagnostics) and digestion with EcoRI for the incorporation of a fragment of the correct size. A positive clone with a size of approx. 6kB was selected.
  • the insert was then sequenced using the following oligonucleotides using standard methods:
  • nucleotide sequence according to the invention comprises 2687 bases and is described in SEQ ID No. 1 shown.
  • the nucleotide sequence mentioned can also be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the individual nucleotide building blocks or, for example, by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks / fragments of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can, for example, in a known manner, according to the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the addition of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps with the aid of the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • G. oxydans / E. coli shuttle vector pGlul contains all the sequence features required for replication in Gluconobacter oxydans.
  • pGlul For the preparation of a G. oxydans / E. coli shuttle vectors were isolated as described above, pGlul and linearized with the restriction nuclease Hinc II (New England Biolabs, Schwalbach). The successful restriction digestion was checked by electrophoresis on a 1% agarose gel (Sigma). The linearized approximately 2.8 kb fragment was purified from the agarose gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden).
  • the mobilizable E. coli vector pSL18 (see Hee et al., J. Micobiol. Biotechnol., 1996, 6 (5), 315ff) was digested with the restriction endonuclease Sma I (New England Biolabs, Schwalbach). The reaction mixture was then filled up with sterile water and a ClP digestion was carried out using Calf Intestine Phosphatase (Röche Molecular Biochemicals / Röche Diagnostics, Mannheim) according to the manufacturer's protocol. The linearized and dephosphorylated vector (4.8 kb) was purified by electrophoresis on a 1% agarose gel and isolated from the gel using the QIAquick Gel Extraction Kit.
  • the ligation was carried out with T4 DNA ligase (Röche Molecular Biochemicals / Röche Diagnostics, Mannheim) overnight at room temperature.
  • the ligation mixture was transformed into competent E. coli DH5 cells (Invitrogen, Düsseldorf) using standard methods.
  • the ligation mix was on LB agar plates containing the antibiotic Ampicillin (50 mg / l) were supplemented, incubated overnight at 37 ° C.
  • Two bacterial colonies were transferred using a sterile toothpick into LB medium with 50 mg / l ampicillin and incubated for 18 h at 37 ° C. with shaking.
  • Plasmid DNA was isolated by standard methods (miniprep). By restriction digestion of the plasmid DNAs obtained with the restriction endonuclease BamHI (New England Biolabs, Schwalbach), a clone was identified as the correct ligation product, which was designated pCB5.
  • pCB5 was linearized with the restriction endonuclease Sacl ((New England Biolabs, Schwalbach)., CIP was treated and the fragment was purified from a 1% agarose gel using the QIAquick Extraction Kit. To enable easier detection of transformed cells later, a pCB5 was used for the gene coding for "green fluorescence protein" (gfp) is cloned.
  • the preparation of the tufgfp fragment (“green fluorescence protein under the control of the tuf promoter) was carried out by PCR.
  • the primers were chosen so that the resulting PCR fragment could be cut at both ends with the restriction endonuclease Sacl.
  • the sequence of the cut tufgfp fragment is in SEQ ID No. 4 shown.
  • the linearized vector with the tufgfp fragment was ligated using the Rapid Ligation Kit (Röche Molecular Biochemicals / Diagnostics, Mannheim) for 2 hours at room temperature. After transformation of the ligation mixture into E: coli DH5 ⁇ cells (Invitrogen, Düsseldorf), the transformation mixture was incubated overnight at 37 ° C. on LB agar plates supplemented with the antibiotic ampicillin (50 mg / l). Some colonies of bacteria glowed green in UV light. 2 green fluorescent colonies were transferred with a sterile toothpick into LB medium with 50 mg / l ampicillin and kept at 37 ° C for 18 h Shake incubated. Plasmid DNA was isolated by standard methods (miniprep).
  • E. coli DH5 single colony containing pCB-tufgfp was plated out on an LB agar plate with 50 mg / l ampicillin and grown at 37 ° C. overnight.
  • E. coli S17-1 (Qian H. et al., Chinese Journal of Biotechnology, 1994, 10 (1), 55ff) was plated onto an LB agar plate with 20 mg / l kanamycin and at 37 ° C. overnight dressed.
  • oxydans recipient strain DSM2343 was plated onto YSM plates (5 g / l yeast extract, 50 g / l sorbitol, 10 g / l mannitol, 20 g / l agar, pH5.5) and incubated at 35 ° C. overnight.
  • the cell suspensions were transferred to sterile sample tubes.
  • the cell suspensions were then mixed in the ratio of donor strain: auxiliary strain: recipient strain 1: 0.5: 0.5. Approximately 300 ⁇ l of the mixture was plated on YSM agar plates and the plates were incubated at 30 ° C. for about 4 hours. The plate was rinsed with 2 ml of sterile saline solution and transferred to a sterile test tube. 1:10 and 1: 100 dilutions of sterile saline solution were prepared from the cell suspension. From the undiluted solution and the 1:10 and 1: 100 dilutions, 30-100 ⁇ l each were plated onto YSM agar plates which contained 20 mg / l polymyxin B and 50 mg / l ampicillin, and 2 days at 30 ° C.
  • plasmid DNA was isolated by standard methods (miniprep) and the plasmid size was determined after electrophoresis on a 1% agarose gel, which matched the pCB5-tufgfp isolated from E. coli.
  • the GFP-mediated green fluorescence could be detected by excitation of the bacterial cultures in UV light.
  • the conjugation of the pGlul derivative pCB5-tufgfp from E. coli to G. oxydans, the propagation of the pCB5-tufgfp vector in Gluconobacter oxydans and the expression of the foreign gene gfp in Glucosnobacter were thus demonstrated.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, einen s Vektor enthaltend wenigstens besagte Nukleinsäure oder Teile oder Variationen davon sowie einen mit besagter Nukleinsäure and/oder besagtem Vektor transformierter Organismus.

Description

Nukleinsaure zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Famile der Acetobacteraceae
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae. Ferner sind Vektoren enthaltend diese Nukleinsäuresequenz oder Teile oder Variationen davon und entsprechende damit transformierte Organismen und deren Verwendung in industriellen Prozessen zur biotechnologischen Herstellung von Feinchemikalien Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Acetobacteraceae, zu denen u.a. die Gattungen Gluconobacter und Acetobacter zählen, sind für industrielle Produktionsprozesse interessante Organismen, da sie sich u.a. besonders durch die Fähigkeit Oxidationsreaktionen auszuführen, auszeichneen (für Übersichtsartikei s. bspw. Gupta et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2001, 3 (3), 445 ff; Lust et al., Appl. Biochem. Microbiol., 1998, 34 (4), 307 ff oder Macauley et al., Crit. Rev. Biotechnol., 2001, 21 (1), 1ff). Sie eignen sich, beispielsweise zur Herstellung von Feinchemikalien, wie z.B. von D-Xylitol aus D-Xylulose (EP0976827), von Gluconsäure, 5-Ketogluconsäure (aus der nachfolgend Weinsäure gewonnen werden kann, siehe z.B. Matzerath et al., Inorganica Chimica Acta, 1995, 237, 203ff) und 2,5-Diketogluconsäure aus Glucose (z.B. US3790444), von bakterieller Cellulose aus Fructose (Chao Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 , 55,6, 673ff), von L-Erythrulose aus Erythritol (Mizanur R. et al., J. Ferment. Bioeng., 2001, 92, 3, 237ff), Dihydroxyaceton aus Glycerin (Wethmar et al, Biotechnology Techniques, 1999, 13, 283ff) oder D-Galactitol zu Tagatose (Manzoni et al., Process Biochem., 2001 , 36 (10), 971ff). Ferner ist Gluconobacter für die fermentative Herstellung von Vitamin-Vorstufen ausgehend von D-Sorbit geeignet. Hierbei ist insbesondere die biotechnologische Produktion von L-Sorbose und 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KGS), der Vorstufe von Vitamin C, wirtschaftlich von großem Interesse.
Zur Bereitstellung von optimierten Produktionsstämmen der Gattung Gluconobacter mit entsprechenden Eigenschaften zur verbesserten Biosynthese der gewünschten Produkte werden bevorzugt gentechnische Methoden herangezogen. Zur genetischen Manipulation des Bakteriums oder zur verstärkten Expression bestimmter homologer oder auch heterologer Gene ist insbesondere ein Vektorsystem erforderlich, mit dem die gewünschten Nukleotidsequenzen in den Organismus transferiert werden können.
Als Vektorsystem bieten sich sogenannte Shuttle-Vektoren an, die nicht nur in Gluconobacter, sondern auch in Mikroorganismen anderer Gattungen vermehrt werden können. Für Klonierungsarbeiten ist es in der Regel von Vorteil, wenn diese in dem in der gängigen Laborroutine etablierten Mikroorganismus Escherichia coli durchgeführt werden können.
Einige Systeme zum Gentransfer in Gluconobacter sind bei Muooka et al. (J. Bacteriol., 1981, 145: 358-368), Fukaya et al. (Agric. Biol. Chem., 1985, 49: 2407-2411) beschrieben. Allerdings sind die Transformationsfequenzen von beispielsweise 10"10 bis 10"3 Transformanten/Rezipient sehr niedrig und zum Beispiel für die Erstellung einer Genbank oder die Konstruktion von Produktionsstämmen unzureichend.
Ferner sind autonom replizierende Plasmide aus Gluconobacter und auch aus Escherichia bekannt. Hierzu sei auf die Schriften EP 0 381 027 oder EP 0 979 875 verwiesen. Auch sind hier bereits endogene Plasmide und endogene Phagen sowie Shuttle-Vektoren beschrieben, die zur Replikation in Gluconobacter und Escherichia fähig sind. Die Plasmide sind allerdings zum Teil sehr groß, z.B. bis zu 26 MegaDaltön oder bis zu 11 kb, und für eine zusätzliche Einfügung weiterer Nukleotidsequenzen mit kodierenden oder replizierenden Eigenschaften oftmals nur in sehr eingeschränktem Maße geeignet.
Die stetig voranschreitende Aufklärung von Biosynthesewegen wirtschaftlich interessanter Stoffwechselprodukte und den daran beteiligten, oftmals komplex regulierten Schlüsselenzymen, erfordert allerdings bei biotechnologischen Produktionsprozessen eine immer komplexere Stammoptimierung.
Für diese komplexen genetischen Veränderungen ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl verschiedener Hilfsmittel, wie u.a. Vektoren und vor allem Shuttlevektoren mit beispielsweise unterschiedlichen Eigenschaften hinsichtlich ihrer Größe, ihres Wirtsspektrums, ihrer Kompatibilität oder ihrer Kopienzahl, von ständigem Interesse.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, weitere Nukleotidsequenzen mit der Fähigkeit zur Replikation in Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter zur Verfügung zu stellen. Ferner war die Bereitstellung eines weiteren Vektorsystems zur Replikation in Gluconobacter oder Acetobacter und einem anderen Mikroorganismus, vorteilhafter Weise der Familie der Enterobakterien, erwünscht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae. Vorteilhafter Weise ist die Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter fähig.
In vorteilhaften Varianten der vorliegenden Erfindung ist die genannte Nukleinsaure zur autonomen Replikation von DNA in Acetobacteraceae, wie beispielsweise Gluconobacter asaii,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. acetigenum, A. acetosum, A. aurantius, A. diazotropicus, Acetobacter estunensis, Acetobacter europaeus, Acetobacter hansenii, Acetobacter intermedius, Acetobacter kuetzingianus, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter lovaniensis, Acetobacter melanogenus, Acetobacter mesoxydans, Acetobacter methanolicus, Acetobacter oboediens, Acetobacter orleanensis, Acetobacter oxydans, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter peroxydans, Acetobacter pomorum, Acetobacter rancens, Acetobacter suboxydans oder Acetobacter xylinus fähig. Diese Aufzählung an Organismen ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
In bevorzugten Ausführungen der vorliegenden Erfindung erfolgt eine autonome Replikation der Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 in
Gluconobacter asaii,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans,
Acetobacter aceti, A. hansenii, A. liquefaciens, A. oxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans oder A. xylinus.
In besonders bevorzugten Varianten erfolgt die autonome Replikation in G. oxydans, A. aceti, A. liquefaciens oder A. suboxydans.
Unter „Teile" der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz sind solche Fragmente zu verstehen, die noch zur automomen Replikation in einem Organismus der Familie der Acetobacteraceae befähigen, was der Fachmann leicht anhand einer Funktionsanlayse, wie folgt, überprüfen kann: Ein beliebig aus der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz ausgewählter Teilbereich der erfindungsgemäßen Sequenz wird in einen Vektor kloniert, der einen Selektionsmarker aufweist (z.B. ein Antibiotikaresisteήzgen) und insbesondere nicht zur Replikation in einem Organismus der Familie der Acetobacteraceae fähig ist. Dem Fachmann ist eine Auswahl hierzu geeigneter Vektoren bekannt, die auch kommerziell bezogen werden können. Nach erfolgter Klonierung des o.g. Teilbereichs der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz und der Transformation des Ligationsansatzes in einen Organismus der Familie der Acetobacteraceae, werden die transformierten Zellen auf Selektionsmedium (z.B. unter Zugabe eines Antibiotikums) kultiviert. Diejenigen Zellen, die auf dem Selektionsmedium wachsen können, also zur Replikation des Markergen-enthaltenen Vektors fähig sind, sind somit potentielle Träger eines funktionsfähigen Teils der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz. Zum Beweis, daß die Befähigung zur Replikation der Zellen auf der Übertragung eines Teilbereichs der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz beruht, wird aus den selektierten Zellen die Plasmid- DNA nach gängiger Laborroutine isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA wird anschließend, z.B. durch Restriktionsanalyse oder PCR, analysiert und mit der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz verglichen. Die beschriebene Vorgehensweise zum funktioneilen Beweis beliebig ausgewählter Teilbereiche der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz gehören zur gängigen Laborroutine eines Fachmanns der vorliegenden Erfindung. Durch einen solchen Funktionsbeweis sind Teile der erfindungsgemäßen Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung auch dann eindeutig definiert, wenn diese Teile nicht durch zahlenmäßige abgegrenzte Bereiche innerhalb der Nukleotidsequenz vorgegeben sind.
Durch einen zuvor beschriebenen Versuchsansatz (Funktionsanalyse) können analog auch „Variationen" der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz identifiziert werden. Hierunter sind erfindungsgemäß solche Sequenzen zu verstehen, die trotz einer veränderten Nukleotidsequenz noch die gleiche Funktion aufweisen (funktioneile Äquivalente), d.h. erfindungsgemäß zur automomen Replikation in einem Organismus der Familie der Acetobacteraceae befähigen. Funktionelle Äquivalente umfassen natürlich vorkommende Variationen der erfindungsgemäßen Sequenz sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene Nukleotid-Sequenzen. Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, weiche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Die Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 stammt erfindungsgemäß aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen eines Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae. Vorteilhaft stammt sie aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen eines Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter. Besonders vorteilhaft stammt die Nukleinsäuresequenz aus dem Genom von Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens oder Acetobacter suboxydans oder endogenen Plasmiden oder enodgenen Phagen dieser Mikroorganismen. Höchst vorteilhaft stammt die Nukleinsaure aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen von Gluconobacter oxydans.
Erfindungsgemäß handelt es sich um ein bislang nicht beschriebenes, endogenes (kryptisches) Plasmid von Gluconobacter oxydans. Dieses kryptische Plasmid wird im Sinne der Erfindung mit pGlul benannt. Die erfindungsgemäße Sequenz übernimmt die Funktion eines Replikationsursprungs, an dem die Verdopplung durch den Replikationsapparat (u.a. bestehend aus DNA- und RNA-Polymerasen, Ligasen, Helikasen, Topoisomerasen und Exonukleasen) initiiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon sowie zusätzliche Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen zur Selektion, Detektion, Konjugation, multiplen Klonierung, Expressionskontrolle, Transkriptionstermination,
Translationsinitiation oder Sequenzen für cos-Stellen oder Signalpeptide.
Der erfindungsgemäße Vektor zeichnet sich ferner dadurch aus, daß er in einem Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae und zusätzlich in einem Mikroorganismus der Familie der Enterobakterien autonom repliziert. Dies bedeutet, daß ein solcher erfindungsgemäßer Vektor neben dem erfindungsgemäßen Replikationsursprung eine weitere Sequenz aufweist, die zur autonomen Replikation, allerdings diesmal in Enterobakterien befähigt. Letzere Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Vorteilhaft zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor durch die autonome Replikation in einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter und zusätzlich in einem Mikroorganismus der Familie der Enterobakterien aus.
Besonders vorteilhaft ist der Vektor zur autonomen Replikation in Gluconobacter asaii,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. hansenii, A. liquefaciens, A. oxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans oder A. xylinus und in Escherichia coli fähig.
Höchst vorteilhaft ist der Vektor zur autonomen Replikation in Gluconobacter oxydans oder Acetobacter aceti oder Acetobacter liquefaciens oder Acetobacter suboxydans und in Escherichia coli fähig. Ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors umfaßt folgende allgemeine Schritte, die nach gängiger Laborpraxis routinemäßig durchgeführt werden:
Herstellung oder Isolierung von Nukleotidsequenzen enthaltend a) ein Markergen, b) einen funktionsfähigen Replikationsursprung zur autonomen Replikation in E. coli, c) einen funktionsfähigen Replikationsursprung gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur autonomen Replikation in G. oxydans, und d) ein „green fluorscence protein", wobei die Komponenten a) bis d) einzeln oder in allen denkbaren Kombinationen durch Restriktion mit geeigneten Endonukleasen und anschließende Ligation verknüpft werden. Zusätzlich kann eine mob-site zur Konjugation von E. coli und G. oxydans eingeführt werden. Die hierzu erforderlichen Vorgehensweisen gehören zur gängigen Laborpraxis und werden deshalb nicht detaillierter ausgeführt. Sie können beispielsweise in Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning: a labaratory manual, Cold Spring Harbor Labaratory Press, New York nachgelesen werden.
In einer Variante der Erfindung enthält der Vektor zur Selektion in der Bakterienzelle Antibiotikaresistenzgene. Beispiele für Resistenzgene sind in Sutcliffe JG., Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1978, 75 (8), 3737ff oder in Gray GS. et al., Evolution of antibiotic resistance genes: the DNA sequence of a kanamycin resistance gene from Staphylococcus aureus, Molecular Biology & Evolution, 1983, 1(1), 57ff beschrieben. Unter einem Replikationsursprung ist im allgemeinen eine Nukeotidsequenz zu verstehen, von der aus die Verdopplung der DNA (oder RNA bei RNA-Viren) durch den Replikationsapparat, bestehend u.a. aus DNA- und RNA-Polymerasen, Ligasen, Helicasen, Topoisomerasen und Exonukleasen, initiiert wird.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Vektors kann dieser Elemente enthalten, welche die Übertragung des Vektors zwischen einer Donor- und einer Rezipientenzelle (Konjugation) ermöglichen. Die dazu erforderliche Nukeotidregion wird als mob-site (Mobilisierungsstelle) bezeichnet. Unter einer mob-site ist eine Nukleotidsequenz zu verstehen, die eine Relaxase kodiert und einen oriT (origin of transfer) aufweist, an dem im weitesten Sinne die Übertragung des Vektors von der Donorzelle auf die Rezipientenzelle initiiert wird.
Bevorzugt enthält der erfindungsgemäße Vektor eine mob-site, die eine Übertragung von einer Zelle der Gattung Escherichia auf einen Rezipienten der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter ermöglicht. Bekannte mob-sites sind in Dougan G. et al., Mobilization of the Escherichia coli plasmid ColE1 (colicin E1) and ColE1 vectors used in recombinant DNA experiments, Journal of Infectious Diseases, 1978, 137 (5), 676ff oder Priebe SD. et al., Region of the streptococcal plasmid pMV158 required for conjugative mobilization, Journal of Bacteriology, 1989, 171 (9), 4778ff oder Priefer ÜB. et al., Extension of the host ränge of Escherichia coli vectors by incorporation of RSF1010 replication and mobilization functions, Journal of Bacteriology, 1985, 163 (1), 324ff beschrieben. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor ein Gen für ein „green fluorescence protein" (wie beschrieben in Welsh S.et al., Reporter gene expression for monitoring gene transfer, Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8 (5), 617ff) enthalten, das die schnelle Detektion erfolgreich transformierten Zellen im Fluoreszenzlicht ermöglicht.
Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz nach SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon bzw. der erfindungsgemäße Vektor enthaltend wenigstens die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon, kann nach gängigen Methoden in einen Organismus, bevorzugt einen Mikroorganismus, der sich für fermentative Produktionsprozesse eignet, übertragen werden. Beispiele für solche Übertragungsmethoden sind Transformation, Konjugation, Elektroporation, wie in Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning: a labaratory manual, Cold Spring Harbor Labaratory Press, New York beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit einen transgenen Organismus enthaltend einzeln oder in Kombination eine Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon und/oder einen Vektor, der wenigstens eine Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon enthält. Der erfindungsgemäß transgene Organismus zeichnet sich ferner dadurch aus, daß er zur Familie der Acetobacteraceae oder Enterobacterien, bevorzugt der Gattung Gluconobacter, Acetobacter oder Escherichia gehört. Besonders bevorzugt ist ein transgener Organismus aus der Gruppe Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti oder Acetobacter liquefaciens, Acetobacter suboxydans oder Escherichia coli. Höchst bevorzugt wird ein transgener Organismus der Art Gluconobacter oxydans. Insbesondere ist ein transformierter Stamm von Gluconobacter oxydans bevorzugt, der zur verbesserten Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitaminvorstufen, in großtechnischen Fermentationsprozessen geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur Herstellung eines Vektors, der wenigstens in einem Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter repliziert wird. Die erfindungsgemäße Nukleinsaure oder Teile oder Variationen davon kann/können außerdem zur Herstellung eines Vektors für die Expression von Genen in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter verwendet werden. Hierbei kann es sich um homologe Gene der entsprechenden Organismenfamilie,r-gattung oder -art handeln oder um Fremdgene, d.h. um heterologe Gene. Solche Gene nehmen bevorzugt Schlüsselpositionen in Biosynthesewegen industriell interessanter Feinchemikalien, ein.
Vorteilhaft erfolgt eine Verwendung der Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur Herstellung eines Produktionsorganismus der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconcobacter oder Acetobacter zum Einsatz in industrielle Produktionsprozesse zur Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitaminvorstufen.
Hierbei sind unter Produktionsstämmen im Sinne der Erfindung Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der
Gattung Gluconobacter oder Acetobacter oder der Familie der
Enterobacterien, bevorzugt der Gattung Escherichia zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von wirtschaftlich interessanten Feinchemikalien oder deren
Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. In einer anderen Ausführungsform sind in die Produktionsstämme ein oder mehrere homologe und/oder heterologe Gene eingebracht, die Reaktionsfolgen in Form von Biotransformationen in die Richtung der Biosynthese von wirtschaftlich interessanten Feinchemikalien oder deren Abkömmlingen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Gluconcobacter oder Acetobacter. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfaßt, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe- Arten nach gängigen Methoden herstellen kann.
Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Produktionsstämme umfaßt, bei denen die zellinterne oder durch exkretierte Enzyme vermittelte Degradation der Feinchemikalien verändert, bevorzugt abgeschwächt ist. Dies kann beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen.
Eine weitere Verbesserung der Ausbeute an Feinchemikalien wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß die Ausschleusung der gewünschten Verbindungen aus den Zellen in das sie umgebende Medium erheblich verbessert wird. Dies wird erfinduήgsgemäß durch die verstärkte Expression von Exportcarrier-Genen erreicht.
Unter Feinchemikalien im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, wie Vitamine oder deren Vorstufen, Speicherstoffe, Zuckeralkohole, Aldosen oder Ketosen oder Zuckersäuren zu verstehen. Bevorzugt sind dies L-Sorbose, L-Sorboson, Gluconsäure, 5- Ketogluconsäure (die in Weinsäure überführt werden kann) oder 2,5- Diketogluconsäure, bakterielle Cellulose, L-Erythrulose, D-Xylitol, 2-Keto- L-Gulonsäure (2-KGS) und deren Folgeprodukt Vitamin C (Ascorbinsäure und/oder deren Salze). Der erfindungsgemäße Vektor der zuvor genannten Art, enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon, kann zur Expression von homologen und/oder heterologen Genen in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter verwendet werden.
Die Erfindung umfaßt dabei auch die Verwendung des genannten Vektors zur Herstellung eines Produktionsorganismus der Famile der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconcobacter oder Acetobacter zum Einsatz in industrielle Produktionsprozesse zur Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitaminvorstufen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines transgenen Organismus der zuvor beschriebenen Art, enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon oder einen Vektor der genannten Art zur Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitamin-Vorstufen in industriellen Produktionsprozessen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, jedoch nicht limitiert.
Allgemeine Methoden Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung, Klonierung oder Sequenzierung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt. Methoden zur Konjugation sind beispielhaft in Biotechniques, 1994, 16, 800f, Gene, 1995, 166, 175f, Gene, 1989, 75, 271ff, Acta Biotechnol, 1989, 9, 219ff sowie Appl. Microbiol. Biotechnol, 1991, 35, 631ff beschrieben.
Isolierung des endogenen Plasmids pGul
Aus der Kultur eines Abkömmlings von Gluconobacter oxydans DSM2343
(Deutsche Sammlung Mikroorganismen) oder ATCC621 H (American Type Culture Collection) in YSM-Medium (5 g/l Hefeextract, 50 g/l Sorbit, 10 g/l Mannit, pH5,5) wurde mit Standardmethoden (Maxi-Präparationskit Qiagen Hilden) Plasmid-ähnliche DNA gewonnen. Ungefähr 5 μg dieser isolierten DNA wurde mit folgenden Enzymen verdaut: EcoRI, BamHI, Hindill, Sall, und Pstl, Smal, Notl (New England Biolabs, Schwalbach). Es zeigte sich, dass besonders der Verdau mit den Enzymen Sall, Smal und Notl jeweils zu einer spezifischen linearisierten Bande mit einer apparenten Größe von 2,8kB führte. Die Enzyme EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, Acc65l wiesen im untersuchten DNA-Fragment keine Restriktionsschnittstellen auf. Mit Hilfe des GFX Gelextraktionskit (Pharmacia, Freiburg) wurde die bereits beschriebene Bande mit einer Größe von 2,8 kB aus dem Agarosegel isoliert. Es handelt sich hierbei um das endogene Plasmid pGlul. Parallel dazu wurde der Vektor pBS SK (Stratagene, Amsterdam, NL) mit dem Enzym Sall verdaut und durch Einsatz der Shrimp Alkaline Phosphatase (Röche Diagnostics) dephosphoryliert. Das beschriebene Sall verdaute kryptische Plasmid wurde zusammen mit dem Sall verdauten Vektorfragment pBS SK mit Hilfe des Rapid DNA-Ligation Kit (Röche Diagnostics) nach der Vorschrift des Herstellers ligiert und in XL-1- Blue transformiert (Stratagene). Erhaltenen Klone wurden durch eine DNA-Präparation (DNA-Minipräparationskit Röche Diagnostics) und Verdau mit EcoRI auf Einbau eines Fragments der richtigen Größe hin überprüft. Ein positiver Klon mit einer Größe von ca. 6kB wurde ausgewählt. Mit Hilfe folgender Oligonukleotide wurde dann das Insert nach Standardmethoden sequenziert:
CAGGAAACAGCTATGACC (SEQ ID No. 2) TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID No. 3)
Erhaltene Sequenzen wurden für die Herstellung neuer Oligonukleotide und das sogenannte Primer-Walking genutzt. Die Sequenzierung wurde mit Hilfe dieser neu hergestellten Oligonukleotide solange fortgesetzt, bis auf beiden Strängen die Sall Schnittstelle des Vektors pBS SK erreicht worden war. Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz umfaßt 2687 Basen und ist in SEQ ID No. 1 dargestellt.
Die erwähnte Nukleotidsequenz ist weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den einzelnen Nukleotidbausteinen oder beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine/-fragmente der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Herstellung des G. oxydans/E. coli-Shuttle- Vektors pGlul enthält alle zur Replikation in Gluconobacter oxydans benötigten Sequenzmerkmale. Zur Herstellung eines G. oxydans/E. coli Shuttle Vektors wurde, wie oben beschrieben, pGlul isoliert und mit der Restriktionsnuklease Hinc II (New England Biolabs, Schwalbach) linearisiert. Der erfolgreiche Restriktionsverdau wurde durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel (Sigma) geprüft. Das iinearisierte ca. 2,8 kb lange Fragment wurde mittels des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel aufgereinigt.
Parallel wurde der mobilisierbare E. coli Vektor pSL18 (s. Hee et al., J. Micobiol. Biotechnol., 1996, 6 (5), 315ff) mit der Restriktionsendonuclease Sma I verdaut (New England Biolabs, Schwalbach). Anschließend wurde der Reaktionsansatz mit sterilem Wasser auf gefüllt und ein ClP-Verdau mit Calf Intestine Phosphatase (Röche Molecular Biochemicals/ Röche Diagnostics, Mannheim) laut Protokoll des Herstellers durchgeführt. Der Iinearisierte und dephosphorylierte Vektor (4,8 kb) wurde per Elektrophorese an einem 1 %igen Agarosegel aufgereinigt und mittels des QIAquick Gel Extraction Kits aus dem Gel isoliert. Die Ligation erfolgte mit T4 DNA Ligase (Röche Molecular Biochemicals/ Röche Diagnostics, Mannheim) über Nacht bei Raumtemperatur. Die Transfomation des Ligationsansatzes erfolgte nach Standardmethoden in kompetente E. coli DH5 Zellen (Invitrogen, Karlsruhe). Der Ligationsansatz wurde auf LB-Agarplatten, die mit dem Antibiotikum Ampicillin (50 mg/l) supplementiert waren, über Nacht bei 37°C inkubiert. Zwei Bakterienkolonien wurden mittels einen sterilen Zahnstochers in LB- Medium mit 50 mg/l Ampicillin überführt und für 18 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Plasmid-DNA wurde durch Standardmethoden isoliert (Minipräp). Durch Restriktionsverdau der gewonnenen Plasmid-DNAs mit der Restriktionsendonuklease BamHI (New England Biolabs, Schwalbach) konnte ein Klon als korrektes Ligationsprodukt identifiziert werden, dieser wurde mit pCB5 bezeichnet.
pCB5 wurde mit der Restriktionsendonuklease Sacl ((New England Biolabs, Schwalbach) linearisiert., CIP behandelt und das Fragment aus einem 1%igen Agarosegel mittels des QIAquick Extraction Kits aufgereinigt. Um später eine einfachere Detektion transformierter Zellen zu ermöglichen, wurde in pCB5 ein für das „green fluorscence protein" kodierendes Gen (gfp) kloniert.
Die Präparation des tufgfp-Fragments („green fluorescence protein unter Kontrolle des tuf-Promotors) erfolgte per PCR. Die Primer wurden so gewählt, dass das resultierende PCR-Fragment an beiden Enden mit der Restriktionsendonuklease Sacl geschnitten werden konnte. Die Sequenz des geschnittenen tufgfp Fragments ist in SEQ ID No. 4 dargestellt.
Die Ligation des linearisierten Vektors mit dem tufgfp Fragment erfolgte mit dem Rapid Ligation Kit (Röche Molecular Biochemicals/Diagnostics, Mannheim) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Transformation des Ligationsansatzes in E: coli DH5α Zellen (Invitrogen, Karlsruhe) wurde der Transformationsansatz auf LB-Agarplatten, die mit dem Antibiotikum Ampicillin (50 mg/l) supplementiert waren über Nacht bei 37°C inkubiert. Einige Bakterienkolonien leuchteten grün im UV-Licht. 2 grün fluoreszierenden Kolonien wurden mittels einen sterilen Zahnstochers in LB-Medium mit 50 mg/l Ampicillin überführt und für 18 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Plasmid-DNA wurde durch Standardmethoden isoliert (Minipräp). Durch Restriktionsverdau der gewonnenen Plasmid-DNAs mit der Restriktionsendonuklease Kpn I (New England Biolabs, Schwalbach) konnte ein Klon als korrektes Ligationsprodukt identifiziert werden, dieser wurde mit pCB5-tufgfp bezeichnet.
Übertragung und Nachweis des Shuttle-Vektors in G. oxydans
Die Übertragung von pCB5-tufgfp nach G. oxydans DSM2343 erfolgte per triparentaler Konjugation. Dazu wurde als Donor eine pCB-tufgfp enthaltende E. coli DH5 Einzelkolonie auf eine LB-Agarplatte mit 50 mg/l Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37°C angezogen. Als Hilfsstamm wurde E. coli S17-1 (Qian H. et al., Chinese Journal of Biotechnology, 1994, 10 (1), 55ff) auf eine LB-Agarplatte mit 20 mg/l Kanamycin ausplattiert und über Nacht bei 37°C angezogen. Der G. oxydans Empfängerstamm DSM2343 wurde auf YSM-Platten (5 g/l Hefeextract, 50 g/l Sorbit, 10 g/l Mannit, 20 g/l Agar, pH5,5) ausplattiert und bei 35 °C über Nacht inkubiert.
Die über Nacht inkubierten Platten wurden mit je 2 ml steriler Saline- Lösung abspülen. Die Zellsuspensionen wurden in sterile Probenröhrchen überführt.
Anschließend erfolgte die Mischung der Zellsuspensionen im Verhältnis Donor-Stamm : Hilfsstamm : Empfänger-Stamm 1 : 0,5 : 0,5. Ca. 300 μl der Mischung wurde auf YSM-Agar-Platten ausplattiert und die Platten ca. 4 Stunden bei 30 °C inkubiert. Die Platte wurde mit 2 ml steriler Saline-Lösung abgespült und in ein steriles Proberöhrchen überführt. Von der Zellsuspension wurden 1:10 und 1 :100 Verdünnungen mit steriler Saline-Lösung angesetzt. Von der unverdünnten Lösung sowie den Verdünnungen 1:10 und 1 :100 wurden je 30-100 μl auf YSM-Agar-Platten, die 20 mg/l Polymyxin B und 50 mg/l Ampicillin enthielten, ausplattiert und 2 Tage bei 30°C inkubiert . Als Kontrollen wurden Empfänger und Hilfsstamm ohne Donor dem Prozeß der Konjugation unterworfen und entsprechend auf YSM-Agar- Platten die 20 mg/l Polymyxin B und 50 mg/l Ampicillin enthielten ausplattiert. Als Donorkontrolle wurde der Donorstamm alleine dem Prozeß der Konjugation unterworfen und auf YSM-Agar-Platten die 20 mg/l Polymyxin B und 50 mg/l Ampicillin enthielten ausplattiert. Von den Konjugationsplatten wurden einzelne Kolonien als Inokkulum für 20 ml Kulturen in YSM mit 50 mg/l Ampicillin und 20 mg/l Polymyxin B mit einem sterilen Zahnstocher gepickt. Nach Inkubation über Nacht bei 30 °C unter Schütteln wurde Plasmid-DNA durch Standardmethoden isoliert (Minipräp) und die Plasmidgröße nach Elektrophorese an einem 1%igen Agarosegel bestimmt, die mit dem aus E. coli isolierten pCB5-tufgfp übereinstimmte. Durch Anregung der Bakterienkulturen im UV-Licht konnte die gfp-vermittelte grüne Fluoreszenz detektiert werden. Die Konjugation des pGlul-Derivats pCB5-tufgfp von E. coli nach G. oxydans, die Propagation des pCB5-tufgfp Vektors in Gluconobacter oxydans und die Expression des Fremdgens gfp in Glucosnobacter wurden somit nachgewiesen.

Claims

Ansprüche:
1. Nukleinsaure gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Variationen davon zur autonomen Replikation in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae.
2. Nukleinsaure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter autonom repliziert.
3. Nukleinsaure gemäß Ansprüche 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie in Gluconobacter asaii,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, Acetobacter aceti, A. hansenii, A. liquefaciens, A. oxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans oder A. xylinus autonom repliziert.
4. Nukleinsaure gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie in G. oxydans, A. aceti, A. liquefaciens oder A. suboxydans autonom repliziert.
5. Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen eines Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae stammt.
6. Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen eines Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter stammt.
7. Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Genom oder aus einem endogenen Plasmid oder endogenen Phagen von G. oxydans, A. aceti, A. liquefaciens oder A. suboxydans stammt.
8. Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Genom oder aus einem endogenen
Plasmid oder endogenen Phagen von Gluconobacter oxydans stammt.
9. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Teile oder Variationen davon sowie zusätzliche Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen zur Selektion,
Detektion, Konjugation, multiplen Klonierung, Expressionskontrolle, Transkriptionstermination, Translationsinitiation oder Sequenzen für cos-Stellen oder Signalpeptide.
10. Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae und zusätzlich in einem Mikroorganismus der Familie der Enterobacteraceae autonom repliziert.
11. Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er in Gluconobacter asaii,. G. cerinus, G. frateurii, G. liquefaciens, G. oxydans, A. aceti, A. hansenii, A. liquefaciens, A. oxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans oder A. xylinus und in Escherichia coli autonom repliziert.
12. Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Selektion Antibiotikaresistenzgene enthält.
13. Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Detektion ein Gen für ein „green fluorescence protein" enthält.
14. Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Konjugation eine mob-site enthält.
15. Transgener Organismus enthaltend eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Teile oder Variationen davon und/oder einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14.
16. Transgener Organismus gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Familie der Acetobacteraceae oder
Enterobacterien, bevorzugt zur Gattung Gluconobacter, Acetobacter oder Escherichia gehört.
17. Transgener Organismus gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß er zu der Gruppe der Spezies
Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, A. liquefaciens, A. suboxydans oder Escherichia coli gehört.
18. Verwendung einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Vektors, der wenigstens in einem
Mikroorganismus der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter repliziert wird.
19. Verwendung einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Vektors für die Expression von homologen oder heterologen Genen in Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter.
20. Verwendung einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Produktionsorganismus der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconcobacter oder Acetobacter zum Einsatz in industrielle Produktionsprozesse.
21. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 zur Expression von homologen oder heterologen Genen in
Mikroorganismen der Familie der Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter.
22. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 zur Herstellung eines Produktionsorganismus der Familie der
Acetobacteraceae, bevorzugt der Gattung Gluconcobacter oder Acetobacter zum Einsatz in industrielle Produktionsprozesse zur Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitaminvorstufen.
23. Verwendung eines transgenen Organismus gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung von Feinchemikalien, bevorzugt Vitamin-Vorstufen, in industriellen Produktionsprozessen.
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