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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von multispezifischen
Antikörpern,
die heteromultimere Schwerketten-Komponenten und gemeinsame Leichtketten-Komponenten
aufweisen, wie z.B. bispezifische Antikörper, bispezifische Immunadhäsine, sowie
Antikörper-Immunadhäsin-Chimären und
die unter Verwendung des Verfahrens hergestellten heteromultimeren
Polypeptide.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Bispezifische
Antikörper
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Bispezifische
Antikörper
(bsAk), die Bindespezifitäten
für zumindest
zwei unterschiedliche Antigene aufweisen, haben in zahlreichen klinischen
Anwendungen als Targeting-Mittel für In-vitro- und In-vivo-Immundiagnose
und -therapie sowie für
diagnostische Immuntests großes
Potential.
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Im
diagnostischen Bereich sind bispezifische Antikörper von großem Nutzen
zur Sondierung der funktionellen Eigenschaften von Zelloberflächenmolekülen und
zur Definition der Fähigkeit
unterschiedlicher Fc-Rezeptoren, Zytotoxizität zu vermitteln (Fanger et
al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101–124 (1992)). Nolan et al., Biochem.
Biophys. Acta 1040, 1–11
(1990), beschreiben andere diagnostische Anwendungsmöglichkeiten
für bsAk.
Genauer gesagt können
bsAk so konstruiert werden, dass sie Enzyme zur Verwendung in Enzymimmuntests
immobilisieren. Um dies zu erreichen, kann ein Arm der bsAk so aufgebaut
werden, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet,
sodass die Bindung keine Enzymhemmung verursacht, wobei der andere
Arm der bsAk an die immobilisierende Matrix bindet, um eine hohe
Enzymdichte an der gewünschten Stelle
sicherzustellen. Beispiele für
solche diagnostischen bsAk umfassen den Kaninchen-Anti-IgG/Antiferritin-bsAk,
der von Hammerling et al., J. Exp. Med. 128, 1461–1473 (1968),
beschrieben wurde und zur Lokalisation von Oberflächenantigenen
verwendet wurde. BsAk mit Bindespezifitäten für Meerrettichperoxidase (HRP)
sowie ein Hormon wurden ebenfalls entwickelt. Eine weitere mögliche immunchemische
Anwendung für
bsAk betrifft ihre Verwendung in Zweistellen-Immuntests. Beispielsweise
werden zwei bsAk hergestellt, die zwei verschiedene Epitope an das
Analytprotein binden – ein
bsAk bindet den Komplex an eine unlösliche Matrix, der andere bindet
ein Indikatorenzym (siehe Nolan et al., w.o.).
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Bispezifische
Antikörper
können
auch für
In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnosen von verschiedenen Krankheiten,
wie z.B. Krebs, verwendet werden (Songsivilai et al., Clin. Exp.
Immunol. 79, 315 (1990)). Um diese diagnostische Verwendung von
bsAk zu vereinfachen, kann ein Arm des bsAk ein tumorassoziiertes
Antigen binden, und der andere Arm kann einen detektierbaren Marker,
wie z.B. einen Chelatbildner, binden, der eng an ein Radionuklid
bindet. Unter Verwendung dieses Ansatzes stellten Le Doussal et
al. bsAk her, die zur Radioimmundetektion von kolorektalen und Schilddrüsenkarzinomen
geeignet waren, wobei ein Arm ein carcinoembryogenes Antigen (CEA)
und der andere Arm Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) bindet. Siehe Le
Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7, 58–62 (1992), und Le Doussal
et al., J. Nucl. Med. 34, 1662–1671 (1993).
Stickney et al. beschreiben eine ähnliche Strategie zur Detektion
von kolorektalem Krebs, der CEA exprimiert, unter Verwendung von
Radioimmundetektion. Diese Forscher beschreiben einen bsAk, der
CEA sowie Hydroxyethylthioharnstoffbenzyl-EDTA (EOTUBE) bindet.
Siehe Stickney et al., Cancer Res. 51, 6650–6655 (1991).
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Bispezifische
Antikörper
können
auch in der Humantherapie von umgeleiteter Zytotoxizität eingesetzt werden,
indem ein Arm bereitgestellt wird, der ein Target (z.B. ein Pathogen
oder eine Tumorzelle) bindet, und ein weiterer Arm, der ein zytotoxisches
Auslösermolekül, wie z.B.
den T-Zellen-Rezeptor oder den Fcγ-Rezeptor,
bindet. Demgemäß können bispezifische
Antikörper
verwendet werden, um die zellulären
Immunabwehrmechanismen eines Patienten spezifisch auf die Tumorzelle
oder das infektiöse
Agens zu richten. Unter Verwendung dieser Strategie wurde gezeigt,
dass bispezifische Antikörper,
die an FcγRIII
(d.h. CD16) binden, Tumorzellabtötung
durch natürliche
Killer- (NK-) Zellen/große
granuläre
Lymphozyten- (LGL-) Zellen in vitro vermitteln können und effektiv zur Verhinderung
von Tumorwachstum in vivo einge setzt werden können. Segal et al., Chem. Immunol.
47, 179 (1989), und Segal et al. Biologic Therapy of Cancer 2(4),
S. 1, DeVita et al., Hrsg., J.B. Lippincott, Philadelphia, USA (1992).
Auf ähnliche
Weise wurde ein bispezifischer Antikörper mit einem Arm, der FcγRIII bindet,
und einem weiteren Arm, der an den HER2-Rezeptor bindet, zur Therapie
von Eierstock- und Brusttumoren entwickelt, die das HER2-Antigen überexprimieren
(Hseih-Ma et al., Cancer Research 52, 6832–6839 (1992), und Weiner et
al., Cancer Research 53, 94–100
(1993)). Bispezifische Antikörper
können
auch Tötung
durch T-Zellen vermitteln. Normalerweise binden die bispezifischen
Antikörper
den CD3-Komplex auf T-Zellen an ein tumorassoziiertes Antigen. Ein
vollständig
humanisierter F(ab')2-bsAk, bestehend aus an Anti-p185HER2 gebundenem Anti-CD3, wurde verwendet,
um auf T-Zellen zu zielen, um Tumorzellen abzutöten, welche den HER2-Rezeptor überexprimieren.
Shalaby et al., J. Exp. Med. 175(1), 217 (1992). Bispezifische Antikörper wurden
in mehreren frühen
klinischen Tests mit ermutigenden Ergebnissen getestet. In einem
Test wurden 12 Patienten mit Lungen, Eierstock- oder Brustkrebs
mit Infusionen von aktivierten T-Lymphozyten behandelt, auf die
mit einem bispezifischen Anti-CD3-/Antitumor- (MOC31-) Antikörper gezielt
wurde. DeLeij et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular
Cytotoxicity, S. 249, Romet-Lemonne, Fanger und Segal, Hrsg., Lienhart
(1991). Die gerichteten Zellen induzierten eine bedeutende lokale
Lyse von Tumorzellen, eine schwache Entzündungsreaktion, aber keine
toxischen Nebenwirkungen oder Anti-Maus-Antikörper-Reaktionen. In einer sehr
frühen
Studie eines bispezifischen Anti-CD3/Anti-CD19-Antikörpers in
einem Patienten mit B-Zellen-Malignität wurde außerdem eine signifikante Verringerung
der Anzahl an peripheren Tumorzellen-Counts erreicht. Clark et al.,
Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, S. 243, Romet-Lemonne,
Fanger und Segal, Hrsg., Lienhart (1991). Siehe auch Kroesen et
al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 400–407 (1993), Kroesen et al.,
Br. J. Cancer 70, 652–661
(1994), und Weiner et al., J. Immunol. 152, 2385 (1994), zu therapeutischen
Anwendungen von bsAk.
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Bispezifische
Antikörper
können
auch als fibrinolytische Mittel oder Vakzineadjuvantien verwendet werden.
Außerdem
können
diese Antikörper
bei der Behandlung von infektiösen
Krankheiten (z.B. zum Targeting von Effektorzellen auf viral infizierte
Zel len wie beispielsweise HIV oder Influenzavirus oder Protozoen,
wie z.B. Toxoplasma gondii), zur Verabreichung von Immuntoxinen
an Tumorzellen oder zur Ausrichtung von Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren
verwendet werden (siehe Fanger et al., w.o.).
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Der
Einsatz von bsAk wurde jedoch durch das Problem, dass bsAk nicht
leicht in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden konnten,
verhindert. Traditionellerweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung
der Hybrid-Hybridomtechnik
hergestellt (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)).
Aufgrund der zufälligen
Sortierung der leichten und schweren Immunglobulinketten produzieren
diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches
Gemisch aus 10 unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte
bispezifische Struktur aufweist (siehe 1A).
Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch affinitätschromatographische
Schritte erfolgt, ist sehr aufwendig, und die Produktausbeute ist
gering. Siehe beispielsweise W. Smith et al., Hybridoma 4, 87–98 (1992),
und Y.S. Massimo et al., J. Immunol. Methods 201, 57–66 (1997).
Folglich wurden Verfahren zur Herstellung größerer Ausbeuten von bsAk entwickelt.
Um eine chemische Kupplung von Antikörperfragmenten zu erreichen,
entwickelten Brennan et al., Science 229, 81 (1985), ein Verfahren,
bei dem intakte Antikörper
proteolytisch gespalten werden, um F(ab')2-Fragmente
zu erhalten. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiolkomplexbildners
Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren
und eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die gebildeten
Fab'-Fragmente werden
dann in Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivate übergeführt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird
dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin wieder in das Fab'-Thiol übergeführt und mit
einer äquimolaren
Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats
vermischt, um die bsAk zu bilden. Die produzierten bsAk könne als
Mittel zur selektiven Immobilisation von Enzymen verwendet werden.
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Neuere
Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli vereinfacht,
die chemisch gekuppelt werden können,
um bispezifische Antikörper
zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die
Herstellung eines vollkommen humanisierten bsAk-F(ab')2-Moleküls mit einem
Arm, der p185HER2 bindet, und einem zweiten
Arm, der CD3 bindet. Jedes Fab'-Fragment
wurde separat aus E. coli sekretiert und in vitro einer direkten
chemischen Kupplung unterzogen, um die bsAk zu bilden. Die so gebildeten
bsAk waren zur Bindung an Zellen, die den HER2-Rezeptor überexprimierten,
und an normale menschliche T-Zellen
fähig und
konnten die lytische Aktivität
von menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele
auslösen.
Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992).
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Verschiedene
Verfahren zur Herstellung und Isolierung von bsAk-Fragmenten direkt
aus rekombinanten Zellkulturen wurden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise
wurden bispezifische F(ab')2-Heterodimere unter Verwendung von Leucin-Zippern
hergestellt (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992)).
Die Leucin-Zipper-Peptide
von den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von Anti-CD3- und Anti-Interleukin-2-Rezeptor-
(IL-2R-) Antikörpern
gebunden. Die Antikörper-Homodimere
wurde an der Gelenk-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und
dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere
herzustellen. Die bsAk erwiesen sich als äußerst effektiv bei der Rekrutierung
von zytotoxischen T-Zellen zur Lyse von HuT-102-Zellen in vitro.
Das Auftreten der "Diabody"-Technolgie, die von Hollinger et al.,
PNAS (USA) 90, 6444–6448
(1993), beschrieben wurde, stellte einen alternativen Mechanismus
zur Herstellung von bsAk-Fragmenten bereit. Die Fragmente umfassen
eine variable Schwerkettendomäne
(VH), die über einen Linker, der zu kurz
ist, um eine Paarung zwischen zwei Domänen auf derselben Kette zu
ermöglichen,
an eine variable Leichtkettendomäne
(VL) gebunden ist. Demgemäß sind die
VH- und VL-Domäne eines
Fragments dazu gezwungen, mit den komplementären VH-
und VL-Domänen eines anderen Fragments
Paare zu bilden, wodurch zwei antigenbindende Stellen gebildet werden.
Eine weitere Strategie zur Herstellung von bsAk-Fragmenten unter
Verwendung von Einketten-Fv- (sFv-) Dimeren wurde ebenfalls beschrieben.
Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Diese Forscher
entwarfen einen Antikörper,
der die VH- und VL-Domäne eines gegen
den T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörpers und einen 25 Aminosäuren umfassenden
Linker an die VH- und VL-Domäne eines
Antifluoresceinantikörpers
umfasste. Das rückgefaltete
Molekül
band an Fluorescein und den T-Zell-Rezeptor und leitete die Lyse
von menschlichen Tumorzellen um, die Fluorescein kovalent an ihre
Oberfläche
gebunden hatten.
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Wie
oben ersichtlich wurden verschiedene Strategien zur Herstellung
von bispezifischen Antikörperfragmenten
beschrieben, die direkt aus einer rekombinanten Zellkultur gewonnen
werden können.
BsAk voller Länge
sind bsAk-Fragmenten aber in klinischen Anwendungen aufgrund ihrer
längeren
Serumhalbwertszeit und möglicher
Effektorfunktionen eventuell vorzuziehen.
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Immunadhäsine
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Immunadhäsine (Ia)
sind antikörperähnliche
Moleküle,
welche die Bindungsdomäne
eines Proteins, wie z.B. einen Zelloberflächenrezeptor oder einen Liganden
(ein "Adhäsin") mit den Effektorfunktionen
einer konstanten Immunglobulin-Domäne kombinieren. Immunadhäsine können viele
der wertvollen chemischen und biologischen Eigenschaften von menschlichen
Antikörpern
aufweisen. Da Immunadhäsine
aus einer menschlichen Proteinsequenz mit einer gewünschten
Spezifität,
gebunden an einen geeigneten menschlichen Immunglobulin-Gelenk-Sequenz
und die Sequenz einer konstanten Domäne (Fc), hergestellt werden
können, kann
die Bindespezifität
von Interesse unter Verwendung von vollkommen menschlichen Komponenten
erreicht werden. Solche Immunadhäsine
sind für
den Patienten minimal immunogen und auch bei chronischer oder wiederholter
Anwendung sicher.
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Immunadhäsine, die
in der Literatur beschrieben sind, umfassen Fusionen von T-Zell-Rezeptoren (Gascoigne
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et
al., Nature 337, 525–531 (1989);
Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al.,
DNA Cell Biol. USA 9, 347–353
(1990); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin oder
homing-Rezeptoren (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990);
und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo
et al., Cell 61, 1303–1313
(1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991));
CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic
et al., Cell 66, 1133–1144
(1991)); TNF-Rezeptoren (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88, 10535–10539
(1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991);
und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren
(Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); Inteferon-γ-Rezeptoren
(Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992)); 4-1BB (Chalupny
et al., PNAS (USA) 89, 10360–10364
(1992)) und IgE-Rezeptoren α (Ridgway
und Gorman, J. Cell. Biol., Bd. 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
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Beispiele
für Immunadhäsine, die
in Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen beschrieben wurden,
umfassen das CD4-IgG-Immunadhäsin,
um die Bindung von HIV and Zelloberflächen-CD4 zu blockieren. Daten
von klinischen Studien der Phase I, bei denen CD4-IgG kurz vor der
Geburt an schwangere Frauen verabreicht wurde, lassen vermuten,
dass dieses Immunadhäsin
die Übertragung
von HIV von der Mutter auf das Kind verhindern kann. Ashkenazi et
al., Intern. Rev. Immunol. 10, 219–227 (1993). Ein Immunadhäsin, das den
Tumornekrosefaktor (TNF) bindet, wurde ebenfalls entwickelt. TNF
ist ein proinflammatorisches Zytokin, das erwiesenerweise ein Hauptvermittler
von septischen Schocks ist. In einem Mäusemodell eines septischen Schocks
erwies sich TNF-Rezeptor-Immunadhäsin als viel versprechender
Kandidat für
die klinische Verwendung bei der Behandlung von septischen Schocks
(Ashkenazi et al., w.o.). Immunadhäsine haben aber auch nichttherapeutische
Verwendungsmöglichkeiten.
Beispielsweise wurde das L-Selectin-Rezeptor-Immunadhäsin als Reagens zur histochemischen
Färbung
von peripheren hohen Lymphknoten-Endothelvenülen (HEV) verwendet. Dieses
Reagens wurde außerdem
eingesetzt, um den L-Selectin-Liganden zu isolieren und charakterisieren
(Ashkenazi et al., w.o.). Wenn die beiden Arme der Immunadhäsin-Struktur
unterschiedliche Spezifitäten
aufweisen, wird das Immunadhäsin
analog zu bispezifischen Antikörpern
als "bispezifisches
Immunadhäsin" bezeichnet. Dietsch
et al., J. Immunol. Methods. 162, 123 (1993), beschrieben solch
ein bispezifisches Immunadhäsin,
das die extrazellulären
Domänen
der Adhäsionsmoleküle E-Selectin
und P-Selectin kombiniert. Bindungsstudien zeigten, dass das so
gebildete bispezifische Immunglobulin- Fusionsprotein eine bessere Bindungsfähigkeit
an eine Knochenmarkszelle aufwies als die monospezifischen Immunadhäsine, von
denen es abgeleitet war.
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Antikörper-Immunadhäsin-Chimären
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Antikörper-Immunadhäsin- (Ak/Ia-)
Chimären
wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Diese Moleküle kombinieren
die Bindungsregion eines Immunadhäsins mit der Bindedomäne eines
Antikörpers.
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Berg
et al., PNAS (USA) 88, 4723, 4727 (1991), stellten bispezifische
Antikörper-Immunadhäsin-Chimären her,
die von Mäuse-CD4-IgG
abgeleitet waren. Diese Forscher konstruierten ein tetrameres Molekül mit zwei
Armen. Ein Arm bestand aus CD4, das mit einer konstanten Antikörper-Schwerkettendomäne fusioniert war,
und einer CD4-Fusion mit einer konstanten Antikörper-Leichtkettendomäne. Der
andere Arm bestand aus einer kompletten Schwerkette eines Anti-CD3-Antikörpers und
einer kompletten Leichtkette des gleichen Antikörpers. Aufgrund des CD4-IgG-Arms
bindet dieses bispezifische Molekül an CD3 auf der Oberfläche von
zytotoxischen T-Zellen.
Die Nebeneinanderstellung der zytotoxischen Zellen und HIV-infizierten
Zellen führt
zu einer spezifischen Abtötung
der Letzteren.
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Obwohl
Berg et al., w.o., ein bispezifisches Molekül beschreibt, das eine tetramere
Struktur aufweist, war es möglich,
ein trimeres Hybridmolekül
herzustellen, das nur eine CD4-IgG-Fusion enthält. Siehe Chamow et al., J.
Immunol. 153, 4268 (1994). Der erste Arm dieses Konstrukts besteht
aus einer humanisierten Anti-CD3-κ-Leichtkette und einer
humanisierten Anti-CD3-γ-Schwerkette.
Der zweite Arm ist ein CD4-IgG-Immunadhäsin, das einen Teil der extrazellulären Domäne von CD4,
der für
die gp120-Bindung verantwortlich ist, mit der Fc-Domäne von IgG
kombiniert. Die resultierende Ak/Ia-Chimäre vermittelte die Abtötung von
HIV-infizierten Zellen, wobei entweder reine zytotoxische T-Zell-Präparate oder
ganze Fraktionen von Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL-Fraktionen)
verwendet wurden, die außerdem
Fc-Rezeptoren tragende, große
granuläre
Lymphozyten-Effektorzellen umfassten.
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Bei
der Herstellung der multispezifischen Antikörper-Heteromultimere ist es
wünschenswert,
die Ausbeute des gewünschten
Heteromultimers höher
zu machen als die des/der Homomultimer(e). Das derzeitige Verfahren
der Wahl zur Herstellung von Fc-hältigen bsAk ist immer noch
das Hybrid-Hybridomverfahren, bei dem zwei Antikörper gemeinsam exprimiert werden
(Milstein und Cuello, Nature 305, 537–540 (1983)).
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In
Hybrid-Hybridomen bilden schwere (H-) Ketten typischerweise Homodimere
sowie die gewünschten Heterodimere.
Außerdem
bilden leichte (L-) Ketten oft Fehlpaarungen mit nichtverwandten
schweren Ketten. Somit kann die gemeinsame Expression von zwei Antikörpern bis
zu zehn Paarungen aus schweren und leichten Ketten ergeben (M.R.
Suresh et al., Methods Enzymol. 121, 210–228 (1986)). Diese ungewünschten
Kettenpaarungen beeinträchtigen
die Ausbeute der bsAk und stellen zwangsläufig hohe, manchmal unüberwindbare,
Anforderungen an die Reinigung (Smith et al., w.o. (1992); und Massimo
et al., w.o. (1997)).
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Antikörper-Schwerketten
wurden früher
hergestellt, um die Heterodimerisation durch die Einführung von
sterisch komplementären
Mutationen in Multimerisationsdomänen an der CH3-Domänen-Schnittstelle (Ridgway
et al., Protein Eng. 9, 617–621
(1996)) und Optimierung durch Phagendisplay zu fördern, wie hierin beschrieben.
Ketten, welche die modifizierten CH3-Domänen enthalten,
ergeben bis zu etwa 90 % Heterodimere, wie durch die Bildung eines
Antikörper/Immunadhäsin-Hybrids
(Ab/Ia) belegt wurde. Heterodimerisierte Schwerketten können immer
noch Fehlpaarungen mit den nichtverwandten Leichtketten bilden,
wodurch die Gewinnung der bsAk von Interesse beeinträchtigt wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Diese
Anmeldung beschreibt eine Strategie, die zur Förderung der Bildung eines gewünschten
heteromultimeren bispezifischen Antikörpers aus einem Monomer-Gemisch dient, indem
eine Schnittstelle zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid
zur Heterooligomerisation geschaffen wird und indem eine gemeinsame variable
Leichtkette bereitgestellt wird, die mit jeder der heteromeren variablen
Schwerkettenregionen des bispezifischen Antikörpers wechselwirkt. Es gibt
drei mögliche
Hetero- und Homomultimere, die sich aus einem ersten und zweiten
Polypeptid bilden können
und jeweils mit einer ersten bzw. zweiten Leichtkette assoziiert
sind. Das ermöglicht
insgesamt zehn verschiedene Kettenpaarungen (1A).
Ein Verfahren zur Förderung
der Bildung des gewünschten
Heteromultimers kann die Ausbeute im Vergleich zu ungewünschten
Heteromultimeren und Homomultimeren stark erhöhen.
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Die
bevorzugte Schnittstelle zwischen einem ersten und einem zweiten
Polypeptid des heteromultimeren Antikörpers umfasst zumindest einen
Teil der CH3-Domäne einer konstanten Antikörper-Domäne. Die
Domäne
des ersten und zweiten Polypeptids, die an der Schnittstelle wechselwirkt,
wird als Multimerisations-Domäne
bezeichnet. Vorzugsweise fördert
die Multimerisations-Domäne
die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid
und einem zweiten Polypeptid, wodurch die Ausbeute des gewünschten
Heteromultimers erhöht
wird (1B). Die Wechselwirkung kann
an der Schnittstelle durch die Bildung von komplementären Protuberanz-in-Hohlraum-Regionen;
die Bildung von nicht natürlich
vorkommenden Disulfidbindungen; einen Leucin-Zipper; hydrophobe
Regionen; und hydrophile Regionen gefördert werden. "Protuberanzen" werden durch den
Ersatz von kleinen Aminosäure-Seitenketten
an der Schnittstelle des ersten Polypeptids durch größere Seitenketten
(z.B. Tyrosin oder Tryptophan) hergestellt. Gegebenenfalls können "Kompensationshohlräume", die gleich groß oder ähnlich groß sind wie
die Protuberanzen, an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids
gebildet werden, indem große
Aminosäure-Seitenketten
durch kleinere ersetzt werden (z.B. Alanin oder Threonin). Ist an
der Schnittstelle des ersten oder zweiten Polypeptids eine Protuberanz
oder ein Hohlraum mit geeigneter Position und Größe vorhanden, muss nur ein
entsprechender Hohlraum bzw. eine entsprechende Protuberanz an der
benachbarten Schnittstelle gebildet werden. Nicht natürlich vorkommende Disulfidbindungen
werden hergestellt, indem auf dem ersten Polypeptid eine natürlich vorkommende
Aminosäure
durch einen freies Thiol enthaltenden Rest, wie z.B. Cystein, ersetzt
wird, sodass das freie Thiol mit einem anderen, freies Thiol enthaltenden
Rest auf dem zweiten Polypeptid wechselwirkt, sodass eine Disulfidbindung
zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid gebildet wird (siehe 1B).
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Einketten-Fv-Fragmente
aus einer großen,
nichtimmunisierten Phasendisplay-Bibliothek
(T.J. Vaughan et al., Nature Biotechnology 14, 309–314 (1996),
in seiner Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen) zeigte eine
V-Gen-Verwendung auf, bei der VH- und VL-Sequenzen von bestimmten Keimbahn-V-Gen-Segmenten überwogen.
Familien überwogen
im Repertoire. Beispiele für
Kettenpromiskuität
wurden im Repertoire gefunden, bei denen eine bestimmte schwere
oder leichte Kette in Kombination mit unterschiedlichen Partnerketten
auftraten (T.J. Vaughan et al., w.o. (1996)).
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Hierin
ist offenbart, dass die Herstellung eines gewünschten heteromultimeren multispezifischen
Antikörpers
unterstützt
wird, wenn eine gemeinsame Leichtkette bereitgestellt wird, die
mit jeder der variablen Schwerketten des multispezifischen Antikörpers Paare
bilden kann. Die Verwendung einer gemeinsamen variablen Leichtkette
verringert die Anzahl an Monomeren, die korrekte Paare bilden müssen, um
die Antikörper-Bindedomänen zu bilden,
indem die Anzahl an Leichtketten von zwei oder mehr Leichtketten
(in einem bispezifischen bzw. multispezifischen Antikörper, vor
der Offenbarung der vorliegenden Erfindung) auf eine Leichtkette
(in einem multispezifischen Antikörper der Erfindung, siehe 1C) verringert wird.
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Demgemäß betrifft
die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heteromultimeren
multispezifischen Antikörpers,
wobei der Antikörper
Folgendes umfasst: 1) ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid
(und weitere Polypeptide gemäß der Multiplizität des Antikörpers),
die an einer Schnittstelle zusammenkommen, worin das erste und weitere
Polypeptide (d.h. ein erstes und ein zweites Polypeptid) jeweils
eine Multimerisations-Domäne
umfassen, die eine Schnittstelle zwischen dem ersten und zweiten
(oder zumindest einem weiteren) Polypeptid bildet, und die Multimerisations-Domänen eine
stabile Wechselwirkung zwischen dem ersten und weiteren Polypeptiden
fördern,
und 2) in dem ersten und zumindest einem weiteren Polypeptid (d.h.
einem zweiten Polypeptid) jeweils eine Bindedomäne, wobei jede Bindedomäne eine
variable Schwerkette und eine variable Leichtkette umfasst, worin
die variable Leichtkette des ersten Polypeptids und die variable Leichtkette
des zweiten Polypeptids eine gemeinsame Aminosäuresequenz aufweisen, wobei
die gemeinsame Sequenz eine Aminosäuresequenz-Identität mit einer
ursprünglichen
Leichtkette der einzelnen Polypeptide von zumindest 80 %, vorzugsweise
zumindest 90 %, noch bevorzugter zumindest 95 %, insbesondere zumindest
100 %, aufweist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte:
- (i) das Kultivieren einer Wirtszelle, die Nucleinsäure umfasst,
die für
das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid und die gemeinsame Leichtkette
kodiert, worin das Kultivieren so erfolgt, dass die Nucleinsäure exprimiert
wird; und
- (ii) die Gewinnung des multispezifischen Antikörpers aus
der Wirtszellkultur.
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In
einer damit in Zusammenhang stehenden Ausführungsform der Erfindung wurden
die Nucleinsäure, die
für das
erste Polypeptid kodiert, oder die Nucleinsäure, die für das zweite Polypeptid kodiert,
oder beide in Bezug auf die ursprüngliche Nucleinsäure so geändert, dass
sie für
die Schnittstelle oder einen Teil davon kodiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens umfasst die Schnittstelle des ersten Polypeptids
einen freies Thiol enthaltenden Rest, der so positioniert ist, dass
er mit einem freies Thiol enthaltenden Rest der Schnittstelle des
zweites Polypeptids wechselwirkt, sodass eine Disulfidbindung zwischen
dem ersten und zweiten Polypeptid gebildet wird. Gemäß der Erfindung
wurde die Nucleinsäure,
die für
das erste Polypeptid kodiert, in Bezug auf die ursprüngliche
Nucleinsäure
so geändert,
dass sie für
den freies Thiol enthaltenden Rest kodiert, oder die Nucleinsäure, die
für das
zweite Polypeptid kodiert, wurde in Bezug auf die ursprüngliche Nucleinsäure so geändert, dass
sie für
den freies Thiol enthaltenden Rest kodiert, oder beides.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens werden die Nucleinsäuren, die für das erste und zumindest ein
weiteres Polypeptid (d.h. ein zweites Polypeptid) kodieren, so geändert, dass
sie für
die Protuberanz bzw. den Hohlraum kodieren. Vorzugsweise umfassen
das erste und zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörper-Domäne, wie
z.B. die CH3-Domäne eines menschlichen IgG1.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Heteromultimer
(wie beispielsweise einen bispezifischen Antikörper, ein bispezifisches Immunadhäsin oder
Antikörper/Immunadhäsin-Chimäre) bereit,
das ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, die
an einer Schnittstelle zusammenkommen. Die Schnittstelle des ersten
Polypeptids umfasst eine Multimerisations-Domäne, die so positioniert ist, dass
sie mit einer Multimerisations-Domäne auf dem zumindest einen
weiteren Polypeptid (d.h. einem zweiten Polypeptid) wechselwirkt,
um eine Schnittstelle zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid
zu bilden. In bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden die Multimerisations-Domänen so geändert, dass sie die Wechselwirkung
zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid und einem spezifischen
zweiten Polypeptid fördern,
wobei die Änderungen
die Bildung einer Protuberanz oder eines Hohlraums oder beides;
die Bildung einer nicht natürlich
vorkommenden Disulfidbindung; die Bildung von komplementären hydrophoben
Regionen; und die Bildung von komplementären hydrophilen Regionen umfassen,
nicht jedoch auf diese eingeschränkt
sind. Der heteromultimere multispezifische Antikörper kann in Form einer Zusammensetzung
bereitgestellt werden, die außerdem
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
-
Die
Erfindung betrifft außerdem
eine Wirtszelle, die Nucleinsäure
umfasst, die für
den heteromultimeren multispezifischen Antikörper des vorigen Absatzes kodiert,
worin die Nucleinsäure,
die für
das erste Polypeptid und zumindest ein weiteres Polypeptid (d.h.
ein zweites Polypeptid) kodiert, in einem einzelnen Vektor oder
in separaten Vektoren vorhanden ist. Die Wirtszelle kann in einem
Verfahren zur Herstellung eines heteromultimeren multispezifischen
Antikörpers
verwendet werden, welches das Kultivieren der Wirtszelle, sodass die
Nucleinsäure
exprimiert wird, und die Gewinnung des heteromultimeren Antikörpers aus
der Zellkultur umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines heteromultimeren multispezifischen Antikörpers bereit, das Folgendes
umfasst:
- (a) das Auswählen einer ersten Nucleinsäure, die
für ein
erstes Polypeptid kodiert, das einen Aminosäurerest an der Schnittstelle
des ersten Polypeptids umfasst, der so positioniert ist, dass er
mit dem Aminosäurerest
der Schnittstelle zumindest eines weiteren Polypeptids wechselwirkt.
In einer Ausführungsform
ist die Nucleinsäure
im Vergleich zu ursprünglichen
so geändert,
dass sie für
die wechselwirkenden Aminosäurereste
kodiert. In einer weiteren Ausführungsform
ist die erste Nucleinsäure
so geändert,
dass sie für
einen Aminosäurerest
mit einem größeren Seitenkettenvolumen
kodiert, wodurch eine Protuberanz auf dem ersten Polypeptid erzeugt
wird;
- (b) das Ändern
einer zweiten Nucleinsäure,
die für
ein zweites Polypeptid kodiert, sodass ein Aminosäurerest
an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids durch einen Aminosäurerest
mit einem geringeren Seitenkettenvolumen ersetzt wird, wodurch ein
Hohlraum im zweiten Polypeptid erzeugt wird, worin die Protuberanz
so positioniert ist, dass sie mit dem Hohlraum wechselwirkt;
- (c) das Einführen
der ersten und zweiten Nucleinsäure
in eine Wirtszelle und das Kultivieren der Wirtszelle, sodass die
erste und zweite Nucleinsäure
exprimiert werden; und
- (d) die Gewinnung des heteromultimeren Antikörpers aus der Zellkultur.
-
Es
mag auch wünschenswert
sein, einen multispezifischen Antikörper (wie z.B. einen bispezifischen Antikörper) herzustellen,
der einen oben identifizierten Antikörper umfasst. Unter diesen
Umständen
ist es wünschenswert,
eine schwere Kette zu identifizieren, die beim Paaren mit der ursprünglichen
leichten Kette spezifisch an ein zweites Antigen von Interesse bindet.
Die Verfahren von Figini et al. (M. Figini et al., J. Mol. Biol.
239, 68–78
(1994)) können
zur Identifikation solch einer schweren Kette verwendet werden.
Zuerst wird eine Phagenbibliothek mit Guanidinhydrochlorid behandelt,
um die ursprüngliche
leichte Kette aufzuspalten. Als Nächstes werden die schweren
Ketten, die auf einem Phagen exprimiert sind, mit der leichten Kette
von Interesse wiederhergestellt, indem das Denaturierungsmittel
entfernt wird (etwa durch Dialyse). Dann wird Panning gegen das
zweite Antigen von Interesse durchgeführt, um die gewünschte schwere
Kette zu identifizieren. Die Erfindung stellt außerdem einen multispezifischen
Antikörper,
der mithilfe dieses Verfahrens des Auswählens einer schweren Kette
zum Paaren mit einer ausgewählten
leichten Kette hergestellt wird, Nucleinsäure, die für den Antikörper kodiert, und eine Wirtszelle,
welche die Nucleinsäure
umfasst, bereit.
-
Ferner
stellt die Erfindung einen Mechanismus zur Erhöhung der Ausbeute des Heteromultimers
im Vergleich zu anderen ungewünschten
Endprodukten, wie z.B. ungewünschten
Heteromultimeren und/oder Homomultimeren, bereit (siehe 1A–1C).
Vorzugsweise ist die Ausbeute des gewünschten Heteromultimers, das
aus der rekombinanten Zellkultur gewonnen wird, im Vergleich zu
dem als Nebenprodukt gebildeten Heterodimere oder den Homomultimeren
zumindest größer als
80 Gew.-% und vorzugsweise größer als
90 Gew.-%.
-
Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
-
1A–1C. 1A ist eine graphische Darstellung der Bildung
von Fc-hältigen
bispezifischen Antikörpern,
wenn keine Bearbeitung durchgeführt
wird, um die Heteromultimerisation gegenüber der Homomultimerisation
zu fördern. 1B ist eine graphische Darstellung, welche die
Paarung zeigt, die stattfindet, wenn schwere (H-) Ketten so bearbeitet
werden, dass die gewünschte
Heteromultimerisation der ungewünschten
Heteromultimerisation oder Homomultimerisation vorgezogen wird. 1C ist eine graphische Darstellung, welche die
Paarung zeigt, die auftritt, wenn Antikörper ausgewählt werden, welche die gleiche
leichte (L-) Kette aufweisen, um das Problem zu umgehen, dass leichte
Ketten Paare mit nichtverwandten schweren Ketten bilden.
-
2A–2C. 2A zeigt
ein Selektionsschema für
ein CH3-Heterodimer unter Verwendung des
Phagendisplay-Vektors pRA2. Phagen, die stabile CH3-Heterodimere
exprimieren, werden unter Verwendung eines Antikörpers eingefangen, der gegen
das gD-Flag gerichtet ist. 2B zeigt
ein dicistronisches Operon, worin von einem synthetischen Gen exprimiertes
CH3 gemeinsam mit einer zweiten Kopie von
CH3, die vom natürlichen Gen exprimiert wird,
sekretiert wird (Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071–4079 (1982)),
und zwar als Fusionsprotein mit einem M13-Gen-III-Protein. Dem synthetischen
CH3-Gen geht eine Sequenz, für die ein
Peptid kodiert, das vom Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein D stammt
(gD-Flag, L.A. Lasky und D.J. Bowbenko, DNA 3, 23–29 (1984);
P.W. Bergman et al., Science 227, 1490–1492 (1985)) und eine Spalt-
(G-) Stelle für
die ortsspezifische Protease Genenase I (P. Carter et al., Proteins:
Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989)) voraus. 2C zeigt die Nucleinsäuresequenz des dicistronischen
Operons (Seq.-ID Nr. 1) aus 2B,
worin die Reste der translatierten CH3-Gene
gemäß dem Eu-System
von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,
5. Aufl., Bd. 1, S. 688–696,
NIH, Bethesda, MD, USA (1991), nummeriert sind. Die Protuberanzenmutation
T366W ist ebenso dargestellt wie die Reste, die im natürlichen CH3-Gen Ziel einer Randomisierung sind (366,
368 und 407).
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3A–3C. 3A und 3B sind
Balkendiagramme der Ergebnisse einer densitometrischen Scanning-Analyse
eines SDS-PAGE von Protein-A-gereinigten Produkten der Cotransfektion
der schweren und leichten Kette eines Antikörper (ab) mit Immunadhäsin (Ia).
Die angeführten
Daten zeigten das Mittel aus zwei unabhängigen Versuchen. Die x-Achse
gibt das Verhältnis
der eingeführten
DNA in Bezug auf die Masse (Ia:H:L) an, und die y-Achse gibt den
Prozentsatz der einzelnen Produkt-Multimertypen in Bezug auf das gesamte
Produktprotein an. 3C ist eine Darstellung der
möglichen
Produktmultimere.
-
4 ist
ein Vergleich zwischen den VL-Sequenzen
von acht verschiedenen Antikörpern
mit Spezifitäten
für AxI,
Rse, IgER, Ob-R und VEGF. Die Position der antigenbindenden CDR-Reste
gemäß der Sequenzdefinition
(Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (C. Chothia
und A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen
bzw. # hervorgehoben. Reste, die sich von der AxI. 78-Sequenz unterscheiden,
sind doppelt unterstrichen.
-
5 ist
ein Vergleich zwischen den schweren und leichten Ketten von ausgewählten Anti-Ob-R-
und Anti-HER3-Klonen. Dargestellt sind die VH-
und die gemeinsamen VL-Sequenzen des Anti-Ob-R-Klons
26 und des Anti-HER3-Klons 18, die zur Herstellung eines bispezifischen
Antikörpers
verwendet wurden.
-
6.
Sandwich-ELISA zur Detektion einer gleichzeitigen Bindung an MpI-IgG
und HER3-IgG. Getestet wurden die Antikörper Anti-MpI × Anti-HER3-BsIgG,
welche die Mutationen Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:S354'C zusammen mit dem
ent sprechenden parentalen Anti-MpI- oder Anti-HER3-IgG mit mutierten
Fc-Regionen enthielten.
-
7 ist
ein Balkendiagramm der Ergebnisse einer antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts- (ADCC-)
Studie. Die ADCC wurde durch huMAb4D5-5 vermittelt (P. Carter et
al., PNAS USA 89, 4285–4289
(1992)), das entweder ein mutiertes (S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407'V) oder Wildtyp-Fc
oder einen mit dem Isotyp übereinstimmenden
Kontrollantikörper
(E25, L.G. Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993)) enthielt. Die
Antikörper
(125 ng/ml) wurden mit mononuklearen Effektorzellen aus menschlichem
peripherem Blut und SK-BR-3-Target-Zellen in den angegebenen Verhältnissen
inkubiert. Die angeführten
Daten sind das Mittel aus dreifachen Messungen und repräsentativ
für drei
separate Versuche.
-
8 ist
eine Matrix, welche die Aminosäuresequenz-Identität zwischen
den leichten Ketten von Antikörpern
zu HER3 und den leichten Ketten von Antikörpern zu Ob-R zeigt. Antikörper mit
leichten Ketten mit 100 % Sequenzidentität sind in schwarz hinterlegten
Kästen
dargestellt. Antikörper
mit leichten Ketten mit 98–99
% Sequenzidentität
sind in weißen
Kästen
dargestellt. Die Antikörperklonidentität ist unter
der Matrix angeführt.
-
I. Definitionen
-
Im
Allgemeinen weisen die nachstehenden Worte oder Phrasen bei Verwendung
in der Beschreibung, in den Beispielen und in den Ansprüchen die
angeführte
Definition auf.
-
Ein "Heteromultimer", "heteromultimeres
Polypeptid" oder "heteromultimerer
multispezifischer Antikörper" ist ein Molekül, das zumindest
ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, worin
sich das zweite Polypeptid in der Aminosäuresequenz um zumindest einen
Aminosäurerest
vom ersten Polypeptid unterscheidet. Vorzugsweise weist das Heteromultimer
Bindespezifität
für zumindest
zwei unterschiedliche Liganden oder Bindestellen auf. Das Heteromultimer
kann ein "Hetero dimer" umfassen, das aus
dem ersten und zweiten Polypeptid besteht, oder kann tertiäre Strukturen
höherer
Ordnung bilden, wenn neben dem ersten und zweiten Polypeptid weitere
Polypeptide vorhanden sind. Beispiele für Strukturen des Heteromultimers
umfassen Heterodimere (z.B. das von Dietsch et al., w.o., beschriebene
bispezifische Immunadhäsin),
Heterotrimere (z.B. die von Chamow et al., w.o., beschriebenen Ak/Ia-Chimären), Heterotetramere
(z.B. einen bispezifischen Antikörper)
und weitere oligomere Strukturen.
-
Der
Begriff "Multimerisations-Domäne" bezieht sich hierin
auf eine Region, die in allen Polypeptiden des Heteromultimers vorhanden
ist. Die "Multimerisations-Domäne" fördert eine
stabile Wechselwirkung der chimären
Moleküle
innerhalb des heteromultimeren Komplexes. Vorzugsweise fördert die
Multimerisations-Domäne
die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid
und einem spezifischen zweiten Polypeptid, wodurch die Bildung des
gewünschten
Heteromultimers gefördert
und die Wahrscheinlichkeit der Bildung von ungewünschten Heteromultimeren oder
Homomultimeren stark verringert wird. Die Multimerisations-Domänen können über eine
Immunglobulinsequenz, einen Leucin-Zipper, eine hydrophobe Region,
eine hydrophile Region oder ein freies Thiol wechselwirken, die
eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen den chimären Molekülen des
chimären
Heteromultimers bildet. Das freie Thiol kann in die Schnittstelle von
einem oder mehreren wechselwirkenden Polypeptiden eingeführt werden,
indem ein natürlich
vorkommender Rest des Polypeptids durch beispielsweise ein Cystein
ersetzt wird, und zwar an einer Position, welche die Bildung einer
Disulfidbindung zwischen den Polypeptiden ermöglicht. Die Multimerisations-Domäne kann eine
konstante Immunglobulin-Region umfassen. Eine mögliche Multimerisations-Domäne, die
in der vorliegenden Erfindung nützlich
ist, ist in der PCT/US90/106849 offenbar, in der Hybridimmunglobuline
beschrieben sind. Außerdem
kann eine Multimerisations-Region hergestellt werden, sodass sterische
Wechselkwirkungen nicht nur eine stabile Wechselwirkung fördern, sondern
auch die Bildung von Heterodimeren im Gegensatz zu Homodimeren aus
einem Monomer-Gemisch fördern.
Siehe beispielsweise PCT/US96/01598, worin eine "Protuberanz-in-Hohlraum"-Strategie für eine Schnittstelle
zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid zur Heterooligomerisation
offenbart ist. "Protuberan zen" werden hergestellt,
indem kleine Aminosäure-Seitenketten
an der Schnittstelle des ersten Polypeptids durch größere Seitenketten
(z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt werden. "Kompensationshohlräume" mit der gleichen oder einer ähnlichen
Größe wie die
Protuberanzen können
gegebenenfalls an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids gebildet
werden, indem große Aminosäure-Seitenketten
durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Die Immunglobulin-Sequenz
ist vorzugsweise, nicht aber notwendigerweise, eine konstante Immunglobulin-Domäne. Die
Immunglobulin-Gruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung
kann von IgG1-, IgG2-,
IgG3- oder IgG4-Subtypen,
IgA, IgE, IgD oder IgM, aber vorzugsweise von IgG1,
IgG2, IgG3 oder
IgG4, stammen.
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Mit "freies Thiol enthaltende
Verbindung" ist
eine Verbindung gemeint, die in eine Aminosäure einer Polypeptid-Schnittstelle
gemäß der Erfindung
inkorporiert oder mit dieser umgesetzt werden kann, sodass die freie
Thiolgruppierung der Verbindung so positioniert ist, dass sie mit
einem freien Thiol einer Gruppierung an der Schnittstelle eines
weiteren Polypeptids gemäß der Erfindung
wechselwirken kann, um eine Disulfidbindung zu bilden. Vorzugsweise
ist die freies Thiol enthaltende Verbindung Cystein.
-
Der
Begriff "epitopmarkiert" bezieht sich hierin
auf ein chimäres
Polypeptid, das das gesamte chimäre Heteroadhäsin oder
ein Fragment davon an ein "Markierungspolypeptid" fusioniert enthält. Das
Markierungspolypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen,
gegen das ein Antikörper
hergestellt werden kann, ist aber kurz genug, sodass es die Aktivität des chimären Heteroadhäsins nicht
stört.
Das Markierungspolypeptid ist ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper dagegen
im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete
Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste
und normalerweise zwischen etwa 8–50 Aminosäureresten (vorzugsweise zwischen
etwa 9–30
Aminosäureresten) auf.
Eine Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein chimäres
Heteroadhäsin,
das an eine Epitopmarkierung gebunden ist, wobei die Markierung
zur Detektion des Adhäsins
in einer Probe oder zur Gewinnung des Adhäsins aus einer Probe verwendet
wird.
-
Der
Begriff "gemeinsame
leichte Kette bzw. Leichtkette" oder "gemeinsame Aminosäuresequenz
der leichten Kette bzw. Leichtkette" bezieht sich hierin auf die Aminosäuresequenz
der leichten Kette im multispezifischen Antikörper der Erfindung. Panels
von Antikörpern
gegen zumindest zwei unterschiedliche Antigene wurde erzeugt, indem
eine Phagendisplay-Bibliothek einem Panning unterzogen wurde, wie
es von Vaughan et al., w.o. (1996), beschrieben wurde. Die Leichtkettensequenzen
wurden mit den variablen Leichtketten-Aminosäuresequenzen vergleichen. Nützliche
Leichtketten aus den verglichenen Panels sind solche, die eine Aminosäuresequenz-Identität von zumindest
80 %, vorzugsweise zumindest 90 %, noch bevorzugter zumindest 95
%, insbesondere 100 %, aufweisen. Eine gemeinsame Leichtkettensequenz
ist eine Sequenz, die eine Approximation der beiden verglichenen
Leichtkettensequenz darstellt. Wenn die verglichenen Leichtketten
auf Aminosäureebene
100 % Sequenzidentität
aufweisen, ist die gemeinsame Leichtkette mit den Leichtketten von
den ausgewählten
Bibliotheksklonen identisch, obwohl die Leichtkettenfunktionen in
einer anderen Bindedomäne
des multispezifischen Antikörpers
wirkt. Wenn die verglichenen Leichtketten sich wie oben beschrieben
unterscheiden, kann sich die gemeinsame Leichtkette von der einen
oder anderen oder von beiden verglichenen Leichtketten von den Bibliotheksklonen
unterscheiden. Unterscheidet sich die Leichtkette von der einen
oder anderen oder von beiden von den Bibliotheksklonen, treten die
unterschiedlichen Reste vorzugsweise außerhalb der antigenbindenden
CDR-Reste der Antikörper-Leichtkette
auf. Die Position der antigenbindenden CDR-Reste kann beispielsweise
gemäß der Sequenzdefinition
(Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (Chothia
und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) bestimmt werden.
-
Der
Begriff "Aminosäuresequenz-Identität" bezieht sich auf
den Prozentsatz an Aminosäuren
einer Sequenz, die gleich sind wie die Aminosäuren einer zweiten Aminosäuresequenz.
100 % Sequenzidentität zwischen
Polypeptidketten bedeutet, dass die Ketten identisch sind.
-
Der
Begriff "Polypeptid" bezieht sich hierin
im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa zehn Aminosäuren. Vorzugsweise
werden Säugetier-Polypeptide (Polypeptide,
die ursprünglich
von einem Säugetier-Organismus
stammen) verwendet, noch bevorzugter solche, die direkt in das Medium
sekretiert werden. Beispiele für
bakterielle Polypeptide umfassen alkalische Phosphatase und β-Lactamase.
Beispiele für
Säugetier-Polypeptide
umfassen Moleküle,
wie beispielsweise Renin, Wachstumshormone, wie z.B. menschliches
Wachstumshormon; Rinderwachstumshormon; Somatoliberin; Parathormon;
thyreoidstimulierendes Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette;
Insulin-B-Kette; Proinsulin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin;
luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z.B.
Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebethromboplastin und von-Willebrand-Faktor;
Antigerinnungsfaktoren, wie z.B. Protein C; atrialer natriuretischer
Faktor; Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase
oder menschliches Urin oder Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA);
Bombesin; Thrombin; hämopoetischer
Wachstumsfaktor; Tumor-Nekrose-Faktor-α und -β; Enkephalinase; RANTES (regulated
on activation, normally T-cell expressed and secreted); menschliches
Makrophagen-Entzündungsprotein
(MIP-1-α);
Serumalbumin, wie z.B. menschliches Serumalbumin; Anti-Müller-Hormon;
Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; gonadotropinassoziiertes
Mäuse-Peptid;
mikrobielles Protein, wie z.B. Betalactamase; DNase; Inhibin; Activin;
Gefäßendothelwachstumsfaktor
(VEGF); Rezeptoren für
Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren;
einen neurotrophen Faktor, wie z.B. neurotrophen Knochenfaktor (BDNF),
Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder
einen Nervenwachstumsfaktor, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenaktivierungsfaktor (PDGF);
Fibroblastenwachstumsfaktor, wie z.B. aFGF und bFGF; epidermalen
Wachstumsfaktor (EGF); transformierenden Wachstumsfaktor (TGF),
wie z.B. TGF-α und
TGF-β; einschließlich TFG-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5; insulinähnlichen
Wachstumsfaktor I und II (IGF-I und IGF-II); Des(1-3)-IGF-1 (Hirn-IGF-1),
IGF-Bindeproteine; CD-Proteine, wie z.B. CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19;
Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immuntoxine; Knochen-Morphogenese-Protein
(BMP); ein Interferon, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren
(CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF
und G-CSF; Interleukine (IL), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase;
T-Zell-Rezeptoren;
Oberflächenmembranproteine;
Zerfall beschleunigender Faktor; virales Antigen, wie z.B. ein Teil
des AIDS-Envelopes; Transportproteine; homing-Rezeptoren; Adressine; Regulatorproteine;
Antikörper;
und Fragmente der oben angeführten
Polypeptide.
-
Das "erste Polypeptid" ist ein beliebiges
Polypeptid, das mit einem zweiten Polypeptid verbunden werden soll.
Das erste und das zweite Polypeptid kommen an einer "Schnittstelle" (unten definiert)
zusammen. Neben der Schnittstelle kann das erste Polypeptid eine
oder mehrere zusätzliche
Domänen
umfassen, wie z.B. "Bindedomänen" (z.B. eine variable
Antikörper-Domäne, Rezeptor-Bindedomäne, Liganden-Bindedomäne oder
enzymatische Domäne)
oder konstante Antikörper-Domänen (oder
Teile davon), einschließlich
CH2-, CH1- und CL-Domänen.
Normalerweise umfasst das erste Polypeptid zumindest eine Domäne, die
von einem Antikörper
stammt. Diese Domäne
ist am besten eine konstante Domäne,
wie z.B. die CH3-Domäne
eines Antikörpers,
und kann die Schnittstelle des ersten Polypeptids bilden. Beispiele
für erste
Polypeptide umfassen Antikörper-Schwerketten-Polypeptide,
Chimären,
die eine konstante Antikörper-Domäne mit einer
Bindedomäne eines
heterologen Polypeptids kombinieren (d.h. Immunadhäsine, siehe
Definition unten), Rezeptor-Polypeptide (insbesondere solche, die
Dimere mit einem anderen Rezeptor-Polypeptid bilden, wie z.B. Interleukin-8-Rezeptoren
(IL-8R) und Integrin-Heterodimere
(z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa)), Liganden-Polypeptide (z.B. Nervenwachstumsfaktor
(NGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und neurotropher Gehirnfaktor (BDNF) – siehe
Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269(45), 27833–27839 (1994), und Radziejewski
et al., Biochem. 32(48), 1350 (1993)) und Antikörper-Polypeptide mit variablen
Domänen
(z.B. Diabodies). Das bevorzugte erste Polypeptid ist eine Antikörper-Schwerkette,
die an eine konstante Domäne
eines Immunglobulins fusioniert ist, worin die konstante Domäne an der
Schnittstelle so geändert
wurde, dass sie eine präferentielle
Wechselwirkung mit einem zweiten Polypeptid der Erfindung fördert.
-
Das "zweite Polypeptid" ist ein beliebiges
Polypeptid, das mit dem ersten Polypeptid über eine "Schnittstelle" verbunden ist. Neben der Schnittstelle
kann das zweite Polypeptid zusätzliche
Domänen,
wie z.B. eine "Bindedomäne" (z.B. eine variable
Anti körper-Domäne, Rezeptor-Bindedomäne, Liganden-Bindedomäne oder
enzymatische Domäne)
oder konstante Antikörper-Domänen (oder
Teile davon), einschließlich CH2-, CH1- und CL-Domänen,
umfassen. Normalerweise umfasst das zweite Polypeptid zumindest
eine Domäne,
die von einem Antikörper
stammt. Diese Domäne
ist am besten eine konstante Region, wie z.B. die CH3-Domäne eines
Antikörpers,
und kann die Schnittstelle des zweiten Polypeptids bilden. Beispiele
für zweite Polypeptide
umfassen Antikörper-Schwerketten-Polypeptide,
Chimären,
die eine konstante Antikörper-Domäne mit einer
Bindedomäne
eines heterologen Polypeptids kombinieren (d.h. Immunadhäsine, siehe
Definition unten), Rezeptor-Polypeptide (insbesondere solche, die
Dimere mit einem anderen Rezeptor-Polypeptid bilden, wie z.B. Interleukin-8-Rezeptoren
(IL-8R) und Integrin-Heterodimere (z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa)),
Liganden-Polypeptide (z.B. Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3
(NT-3) und neurotropher Gehirnfaktor (BDNF) – siehe Arakawa et al., J.
Biol. Chem. 269(45), 27833–27839
(1994), und Radziejewski et al., Biochem. 32(48), 1350 (1993)) und
Antikörper-Polypeptide
mit variablen Domänen
(z.B. Diabodies). Das bevorzugte zweite Polypeptid ist eine Antikörper-Schwerkette,
die an eine konstante Domäne
eines Immunglobulins fusioniert ist, worin die konstante Domäne an der
Schnittstelle so geändert
wurde, dass sie eine präferentielle Wechselwirkung
mit einem ersten Polypeptid der Erfindung fördert.
-
Eine "Bindedomäne" umfasst eine beliebige
Region eines Polypeptids, die für
die selektive Bindung an ein Molekül von Interesse (z.B. Antigen,
Ligand, Rezeptor, Substrat oder Inhibitor) verantwortlich ist. Beispiele
für Bindedomänen umfassen
eine variable Antikörper-Domäne, eine
Rezeptor-Bindedomäne,
eine Liganden-Bindedomäne
und eine enzymatische Domäne.
In bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die Bindedomäne
eine schwere und eine leichte Immunglobulinkette. Gemäß den bispezifischen
Antikörpern
der Erfindung und dem Verfahren zu ihrer Herstellung ist die leichte
Kette für
jede Bindedomäne
des bispezifischen Antikörpers
eine gemeinsame leichte Kette, wodurch die Bildung von ungewünschten
Heteromultimeren verhindert wird, worin Fehlpaarungen von schweren
und leichten Ketten auftreten.
-
Der
Begriff "Antikörper" bezieht sich im
Zusammenhang der Erfindung auf ein Polypeptid, das eine oder mehrere
Domänen
enthält,
die an ein Epitop auf einem Antigen von Interesse binden, wobei
solche Domänen
von der variablen Region eines Antikörpers stammen oder Sequenzidentität damit
aufweisen. Beispiele für
Antikörper
umfassen Antikörper
voller Länge,
Antikörperfragmente,
Einketten-Moleküle,
bispezifische oder bifunktionelle Moleküle, Diabodies, chimäre Antikörper (z.B.
humanisierte und PRIMATIZEDTM Antikörper) und Immunadhäsine. "Antikörperfragmente" umfassen Fv-, Fv'-, Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmente.
-
"Humanisierte" Formen von nichtmenschlichen
Antikörpern
(z.B. von Nagetieren oder Primaten) sind spezifische chimäre Immunglobuline,
Immunglobulinketten oder Fragmente davon, die eine minimale Sequenz von
einem nichtmenschlichen Immunglobulin aufweisen. Größtenteils
sind humanisierte Antikörper
menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste von einer
komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) des Rezipienten durch Reste von einer CDR von einer
nichtmenschlichen Spezies (Donorantikörper) wie z.B. einer Maus,
einer Ratte, einem Kaninchen oder einem Primaten mit der gewünschten
Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt
sind. In manchen Fällen
werden die Fv-Gerüstregion-
(FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende
nichtmenschliche Reste ersetzt. Außerdem kann der humanisierte
Antikörper
Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in der importieren
CDR oder den importierten Gerüstsequenzen
vorkommen. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Antikörperleistung
weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen umfasst ein
humanisierter Antikörper
im Wesentlichen zumindest eine, typischerweise zwei, variable Domänen ganz,
worin alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen
Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen
von einer menschlichen Immunglobulin-Sequenz stammen. Der humanisierte
Antikörper umfasst
vorzugsweise außerdem
zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc),
typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin. Der humanisierte
Antikörper
umfasst auch einen PRIMATIZEDTM Antikörper, worin
die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper stammt,
der durch Immunisierung von Makaken mit dem Antigen von Interesse
hergestellt wird.
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Ein "multispezifischer
Antikörper" ist ein Molekül mit Bindespezifitäten für zumindest
zwei unterschiedliche Antigene. Obwohl solche Molekül normalerweise
nur an zwei Antigene binden (d.h. bispezifische Antikörper, bsAk),
umfasst der Begriff hierin auch Antikörper mit weiteren Spezifitäten, wie
z.B. trispezifische Antikörper.
Beispiele für
bsAk umfassen solche mit einem Arm, der gegen ein Tumorzellenantigen
gerichtet ist, und einem weiteren Arm, der gegen ein zytotoxisches
Trigger-Molekül
gerichtet ist, wie z.B. Anti-FcγRI/Anti-CD15, Anti-185HER2/FcγRIII
(CD16), Anti-CD3/Antimaligne-B-Zelle (1D10), Anti-CD3/Anti-p185HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Anti-Nierenzellkarzinom,
Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Anti-Kolonkarzinom), Anti-CD3/Anti-Melanozytenstimulations-Hormon-Analogon,
Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3,
Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, Anti-Nervenzellen-Adhäsionsmolekül (NCAM)/Anti-CD3, Anti-Folatbindeprotein
(FBP)/Anti-CD3, Anti-Pankarzinom-assoziiertes Antigen (AMOC)/Anti-CD3;
bsAk mit einem Arm, der spezifisch an ein Tumorantigen bindet, und
einem Arm, der an ein Toxin bindet, wie z.B. Anti-Saporin/Anti-Id-1,
Anti-CD22/Anti-Saporin, Anti-CD7/Anti-Saporin, Anti-CD38/Anti-Saporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette,
Anti-Interferon-α (IFN-α)/Anti-Hybridom-Idiotyp, Anti-CEA/Anti-Vinca-Alkaloid;
bsAk zur Überführung von
enzymaktivierten Prodrugs, wie z.B. Anti-CD30/Anti-alkalische-Phosphatase
(welches die Überführung eines
Mitomycin-Phosphat-Prodrugs in Mitomycin-Alkohol katalysiert); bsAk,
die als Fibrinolytika verwendet werden können, wie z.B. Anti-Fibrin/Anti-Gewebe-Plasminogenaktivator
(tPA), Anti-Fibrin/Anti-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA); bsAk zum
Targeting von Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren, wie z.B. Anti-LDL
(Lipoproteine niedriger Dichte)/Anti-Fc-Rezeptor (z.B. FcγRI, FcγRII oder FcγRIII); bsAk zur Verwendung in
der Therapie von infektiösen
Krankheiten, wie z.B. Anti-CD3/Anti-Herpex-simplex-Virus (HSV),
Anti-T-Zell-Rezeptor:CD3-Komplex/Anti-Influenza, Anti-FcγR/Anti-HIV;
bsAk zur Tumordetektion in vitro oder in vivo, wie z.B. Anti-CEA/Anti-EOTUBE,
Anti-CEA/Anti-DPTA, Anti-p185HER2/Anti-Hapten;
bsAk als Vakzineadjuvantien (siehe Fanger et al., w.o.); und bsAk
als diagnostische Werkzeuge, wie z.B. Anti-Kaninchen-IgG/Anti-Ferritin,
Anti-Meerrettichperoxidase (HRP)/Anti-Hormon, Anti-Somatostatin/Anti-Substanz-P, Anti-HRP/Anti-FITC,
Anti-CEA/Anti-β-Galactosidase
(siehe Nolan et al., w.o.). Beispiele für trispezifische Antikörper umfassen
Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37.
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Der
Begriff "Immunadhäsin" bezeichnet hierin
antikörperähnliche
Moleküle,
welche die "Bindedomäne" eines heterologen
Proteins (ein "Adhäsin", z.B. ein Rezeptor,
Ligand oder Enzym) mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulin-Domänen kombiniert.
Strukturell gesehen umfassen die Immunadhäsine eine Fusion der Adhäsin-Aminosäuresequenz
mit der gewünschten
Bindespezifität,
die eine andere ist als die Antigen-Erkennungs- und Bindestelle
(Antigen-Kombinierungsstelle) eines Antikörpers (d.h. "heterolog" ist), und einer
Immunglobulin-Konstantdomänensequenz.
Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz
im Immunadhäsin
kann von jedem beliebigen Immunglobulin erhalten werden, wie z.B.
IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Subtypen,
IgA, IgE, IgD oder IgM.
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Der
Begriff "Liganden-Bindedomäne" bezieht sich hierin
auf einen beliebigen nativen Zelloberflächenrezeptor oder eine beliebige
Region oder ein beliebiges Derivat davon, das zumindest eine qualitative
Liganden-Bindefähigkeit,
vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen
Rezeptors, beibehält.
In einer spezifischen Ausführungsform
stammt der Rezeptor von einem Zelloberflächenpolypeptid mit einer extrazellulären Domäne, die
homolog zu einem Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie ist. Andere typische
Rezeptoren, die zwar nicht Mitglieder der Immunglobulin-Supergenfamilie
sind, aber trotzdem in diese Definition eingeschlossen sind, sind
Rezeptoren für
Cytokine, insbesondere Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität (Rezeptortyrosinkinase),
Mitglieder der Hämatopoietin-
und Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor-Superfamilien und Zelladhäsionsmoleküle, z.B.
(E-, L- und P-) Selectine.
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Der
Begriff "Rezeptor-Bindedomäne" wird verwendet,
um beliebige native Liganden für
einen Rezeptor, einschließlich
Zelladhäsionsmoleküle, oder
eine beliebige Region oder ein beliebiges Derivat davon, das zumindest
eine qualitative Rezeptor-Bindefähigkeit,
vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen
Rezeptors, beibehält.
Diese Definition umfasst unter anderem Bindesequenzen von Liganden
für die
oben genannten Rezeptoren.
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Der
Begriff "multispezifisches
Immunadhäsin" bezeichnet hierin
Immunadhäsine
(wie sie hierin weiter oben definiert sind) mit zumindest zwei Bindespezifitäten (d.h.
eine Kombination aus zwei oder mehr Adhäsin-Bindedomänen). Multispezifische
Immunadhäsine
können
als Heterodimere, Heterotrimere oder Heterotetramere zusammengesetzt
werden, im Wesentlichen gemäß der Offenbarung
in WO 89/02922 (veröffentlicht am
6. April 1989),
EP 314.317 (veröffentlicht
am 3. Mai 1989) und US-Patent
Nr. 5.116.964, ausgegeben am 2. Mai 1992. Bevorzugte multispezifische
Immunadhäsine
sind bispezifisch. Beispiele für
bispezifische Immunadhäsine
umfassen CD4-IgG/TNF-Rezeptor-IgG und CD4-IgG/L-Selectin-IgG. Das
letztgenannte Molekül kombiniert
die Lymphknoten-Bindefunktion des Lymphozyten-homing-Rezeptors (LHR, L-Selectin)
und die HIV-Bindefunktion von CD4 und findet möglicherweise Anwendung bei
der Vorbeugung oder Behandlung von HIV-Infektionen und verwandten
Leiden oder in der Diagnostik.
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Eine "Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre (Ak/Ia-Chimäre)" umfasst ein Molekül, das zumindest
eine Bindedomäne
eines Antikörpers
(wie hierin definiert) mit zumindest einem Immunadhäsin (wie
in dieser Anmeldung definiert) kombiniert. Beispiele für Ak/Ia-Chimären sind
die bispezifischen CD4-IgG-Chimären,
die von Berg et al., w.o., und Chamow et al., w.o., beschrieben
wurden.
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Die "Schnittstelle" umfasst jene "Kontakt"-Aminosäurereste
(oder anderen Nicht-Aminosäuregruppen, wie
z.B. Kohlenhydratgruppen, NADH, Biotin, FAD oder Hämgruppen)
im ersten Polypeptid, die mit einem oder mehreren "Kontakt"-Aminosäureresten (oder anderen Nicht-Aminosäuregruppen)
an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids wechselwirken. Die
bevorzugte Schnittstelle ist eine Domäne ei nes Immunglobulins, wie z.B.
eine variable Domäne
oder eine konstante Domäne
(oder Regionen davon), aber dieser Begriff umfasst auch eine Schnittstelle
zwischen den Polypeptiden, die einen heteromultimeren Rezeptor bilden,
oder eine Schnittstelle zwischen zwei oder mehr Liganden, wie z.B.
NGF, NT-3 und BDNF. Die bevorzugte Schnittstelle umfasst die CH3-Domäne
eines Immunglobulins, die vorzugsweise von einem IgG-Antikörper, insbesondere von
einem menschlichen IgG1-Antikörper, stammt.
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Ein "ursprünglicher" Aminosäurerest
ist einer, der durch einen "Importrest" ersetzt ist, der
ein kleineres oder größeres Seitenkettenvolumen
aufweisen kann als der ursprüngliche
Rest. Der Importaminosäurerest kann
ein natürlich
vorkommender oder ein nicht natürlich
vorkommender Aminosäurerest
sein, ist aber vorzugsweise Ersteres. "Natürlich
vorkommende" Aminosäurereste
sind solche Reste, für
die der genetische Code kodiert und die in Tabelle 1 der PCT/US96/91598
zusammengefasst sind. "Nicht
natürlich
vorkommende" Aminosäurereste
sind Reste, für
die nicht der genetische Code kodiert, die aber zur kovalenten Bindung neben
einem oder mehreren Aminosäureresten
in der Polypeptidkette fähig
sind. Beispiele für
nicht natürlich vorkommende
Aminosäurereste
sind Norleucin, Ornithin, Norvalin, Homoserin und andere Aminosäurerestanaloga,
wie sie etwa in Ellman et al., Meth. Enzym. 202, 301–336 (1991),
beschrieben sind. Um solche nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste
herzustellen, können
die Verfahren gemäß Noren
et al., Science 244, 182 (1989), und Ellman et al., w.o., verwendet
werden. Kurz zusammengefasst umfasst dies die chemische Aktivierung
einer Suppressor-tRNA mit einem nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest,
gefolgt von einer In-vitro-Transkription und Translation der RNA.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Ersetzen von
zumindest einem ursprünglichen
Aminosäurerest,
wobei aber auch mehr als ein ursprünglicher Rest ersetzt werden
kann. Normalerweise umfassen nicht mehr als alle Reste an der Schnittstelle
des ersten oder zweiten Polypeptids ursprüngliche Aminosäurereste,
die ersetzt werden. Die bevorzugten ursprünglichen Reste zum Ersetzen
sind "vergraben". "Vergraben" bedeutet, dass der
Rest für
ein Lösungsmittel
im Wesentlichen unzugänglich
ist. Der bevorzugte Importrest ist nicht Cystein, um eine mögliche Oxidation
oder Fehlpaarung von Disulfidbindungen zu verhindern.
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Mit "ursprünglicher
Nucleinsäure" ist die Nucleinsäure gemeint,
die für
ein Polypeptid von Interesse kodiert und geändert werden kann, um innerhalb
der Multimerisations-Domäne für Aminosäuren zu
kodieren, deren Seitenketten an der Schnittstelle zwischen dem ersten
und zweiten Polypeptid wechselwirken und stabile Wechselwirkungen
zwischen den Polypeptiden fördern.
Solche Änderungen
können
ohne Einschränkung stabile
Wechselwirkungen, wie z.B. Protuberanz-in-Hohlraum-Wechselwirkungen,
nicht natürlich
vorkommende Disulfidbindungen, Leucin-Zipper, hydrophobe Wechselwirkungen
und hydrophile Wechselwirkungen, erzeugen. Vorzugsweise ist eine Änderung
gewählt,
die eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem
zweiten Polypeptid von Interesse fördert und Wechselwirkungen,
die zu ungewünschter
Heteromer-Paarung oder zur Bildung von Homomeren führen, effektiv
ausschließt.
Die ursprüngliche
oder Ausgangs-Nucleinsäure
kann eine natürlich
vorkommende Nucleinsäure
sein oder eine Nucleinsäure
umfassen, die vorher einer Änderung
unterzogen wurde (z.B. ein humanisiertes Antikörper-Fragment). Mit "Änderung" der Nucleinsäure ist
gemeint, dass die ursprüngliche
Nucleinsäure
gentechnisch verändert
oder mutiert wird, indem zumindest ein Codon, das für einen
Aminosäurerest
von Interesse kodiert, insertiert, deletiert oder ersetzt wird.
Normalerweise wird ein Codon, das für einen ursprünglichen
Rest kodiert, durch ein Codon ersetzt, das für einen Importrest kodiert.
Verfahren zur gentechnischen Modifikation einer DNA auf diese Weise
wurden in M.J. McPherson, Hrsg., Mutagenesis: A Practical Approach,
IRL Press, Oxford, GB (1991), zusammengefasst und umfassen beispielsweise
ortsgerichtete Mutagenese, Kassettenmutagenese und Polymerasekettenreaktions-
(PCR-) Mutagenese.
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Die
Protuberanz, der Hohlraum oder das freie Thiol (wie z.B. ein Cysteinrest
zur Bildung einer Disulfidbindung) kann auf synthetische Weise,
z.B. durch Rekombinationsverfahren, In-vitro-Peptidsynthese, die oben
beschriebenen Verfahren zur Einführung
nicht natürlich
vorkommender Aminosäurereste,
durch enzymatische oder chemische Kupplung von Peptiden oder eine
Kombination dieser Verfahren, in die Schnittstelle des ersten oder
zweiten Polypeptids "eingeführt" werden. Demgemäß ist die
Protuberanz, der Hohlraum oder das freie Thiol, die "eingeführt" werden, "nicht natürlich vorkommend" oder "nicht nativ", was bedeutet, dass
sie in der Natur oder im ursprünglichen
Polypeptid (z.B. einem humanisierten monoklonalen Antikörper) nicht
vorkommen.
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Vorzugsweise
weist der Importaminosäurerest
zur Bildung der Protuberanz eine relativ kleine Anzahl an "Rotameren" (z.B. etwa 3–6) auf.
Ein "Rotamer" ist eine energetisch
vorteilhafte Konformation einer Aminosäure-Seitenkette. Die Anzahl
an Rotameren in verschiedenen Aminosäureresten ist in Ponders und
Richards, J. Mol. Biol. 193, 775–791 (1987), zusammengefasst.
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Ein "isoliertes" Heteromultimer ist
ein Heteromultimer, das identifiziert und von einer Komponente seiner
natürlichen
Zellkulturumgebung abgetrennt und/oder aus dieser gewonnen wurde.
Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien,
welche die diagnostische oder therapeutische Verwendung des Heteromultimers
beeinträchtigen
würden,
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nichtproteinische Gelöststoffe
umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird das Heteromultimer (1) zu mehr als 95 Gew.-% des Proteins,
bestimmt durch das Lowry-Verfahren, insbesondere mehr als 99 Gew.-%,
(2) in einem Grad, der ausreicht, um mithilfe eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers
zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz
zu erhalten, oder (3) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen
und unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis
zur Homogenität
gereinigt.
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Die
Heteromultimere der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen
im Wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt. Die Begriffe "im Wesentlichen homogen", "im Wesentlichen homogene
Form" und "im Wesentlichen bis
zur Homogenität" bedeuten, dass das
Produkt im Wesentlichen frei von Nebenprodukten ist, die auf ungewünschte Polypeptidkombinationen
(z.B. Homomultimere) zurückzuführen sind.
In Bezug auf die Reinheit bedeutet im Wesentlichen homogen, dass
die Menge an Nebenprodukten nicht über 10 %, vorzugsweise unter
5 %, noch bevorzugter unter 1 %, insbesondere unter 0,5 %, liegt,
worin die Prozentsätze
auf das Gewicht bezogen sind.
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Der
Begriff "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden
Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die
Kontrollsequenzen, die für
Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor,
gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstelle
und möglicherweise
andere, bisher noch unzureichend untersuchte Sequenzen. Eukaryotische
Zellen verwenden bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale
und Enhancer.
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Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine
funktionelle Beziehung mit einer andere Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise
ist DNA für
eine Präsequenz
oder einen sekretorischen Leader operabel an DNA für ein Polypeptid
gebunden, wenn sie als Präprotein
exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptid teilnimmt;
ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz
gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder
eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz
gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation
vereinfacht. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen
zusammenhängend
sind und, im Falle des sekretorischen Leaders, zusammenhängend sind
und in der Lesephase vorliegen. Enhancer müssen jedoch nicht benachbart
sein. Die Bindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen
erreicht. Wenn keine solchen Stellen vorhanden sind, werden synthetische
Oligonucleotid-Adapter oder -Linker gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet.
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II. Herstellung des Heteromultimers
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1. Herstellung des Ausgangsmaterials
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Im
ersten Schritt werden das erste und zweite Polypeptid (und weitere
Polypeptide, welche das Heteromultimer bilden) ausgewählt. Normalerweise
muss die Nucleinsäure,
die für
diese Polypeptide kodiert, isoliert werden, sodass sie geändert werden
kann, um für
die Protuberanz oder den Hohlraum oder beides zu kodieren, wie sie
hierin definiert sind. Die Mutationen können jedoch unter Verwendung
von syntheti schen Mitteln eingeführt
werden, z.B. unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts. Für den Fall,
dass es sich beim Importrest um einen nicht natürlich vorkommenden Rest handelt,
kann auch das Verfahren nach Noren et al., w.o., verwendet werden,
um Polypeptid mit solchen Substitutionen herzustellen. Außerdem kann
ein Teil des Heteromultimers geeigneterweise rekombinant in einer
Zellkultur hergestellt werden, und ein oder mehrere andere Teile
des Moleküls
werden durch die oben genannten Verfahren hergestellt.
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Verfahren
zur Isolation von Antikörpern
und zur Herstellung von Immunadhäsinen
folgen. Es gilt jedoch anzumerken, dass das Heteromultimer unter
Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren
aus anderen Polypeptiden hergestellt werden oder diese inkorporieren
kann. Beispielsweise kann Nucleinsäure, die für ein Polypeptid von Interesse
(z.B. einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Enzym) kodiert, aus
einer cDNA-Bibliothek isoliert werden, die aus Gewebe hergestellt
wurde, von dem angenommen wird, dass es die Polypeptid-mRNA aufweist
und sie in detektierbarem Ausmaß exprimiert.
Bibliotheken werden mit Sonden (wie z.B. Antikörpern oder Oligonucleotiden
aus etwa 20–80
Basen) gescreent, die darauf ausgerichtet sind, Gene von Interesse
oder das Protein, für
das sie kodieren, zu identifizieren. Das Screenen der cDNA- oder
genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung
von Standardverfahren durchgeführt
werden, die in den Kapiteln 10–12
von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben sind.
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(I) Antikörper-Herstellung
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Für die Herstellung
von Antikörpern
wurden verschiedene Verfahren beschrieben, wozu das herkömmliche
Hybridom-Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, Rekombinationsverfahren
zur Herstellung von Antikörpern
(einschließlich
chimärer
Antikörper,
z.B. humanisierter Antikörper),
Antikörper-Produktion
in transgenen Tieren und die vor kurzem erst beschriebene Phagendisplay-Technologie
zur Herstellung von "vollkommen
menschlichen" Antikörpern gehören. Diese
Verfahren werden nachstehend kurz erläutert.
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Polyklonale
Antikörper
für das
Antigen von Interesse können
im Allgemeinen durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale
(ip) Injektionen des Antigens und eines Adjuvans in Tieren hervorgerufen
werden. Es mag von Nutzen sein, das Antigen (oder ein Fragment,
das die gewünschte
Aminosäuresequenz
enthält)
an ein Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen
ist, zu konjugieren, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor,
und zwar unter Verwendung eines bifunktionellen oder Derivatisierungsmittels,
beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation
durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd,
Bernsteinsäureanhydrid,
SOCl2 oder RIN=C=NR,
worin R und RI unterschiedliche Alkylgruppen
sind. Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate
immunisiert, indem 1 mg 1 μg
Konjugat (für
Kaninchen bzw. Mäuse)
mit 3 Volumina Komplettem Freundschem Adjuvans kombiniert werden
und die Lösung
an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden
die Tiere durch subkutane Injektion an mehreren Stellen von 1/5
bis 1/10 der ursprünglichen
Menge Konjugat in Kompletten Freundschem Adjuvans geboostet. 7 bis
14 Tage später
wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Antikörpertiter
untersucht. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer nicht mehr
steigt. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat vom gleichen
Antigen geboostet, aber an ein anderes Protein und/oder durch ein
anderes Vernetzungsmittel konjugiert. Konjugate können auch
als Proteinfusionen in rekombinanten Zellkulturen hergestellt werden. Außerdem werden
Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet, um die Immunantwort
zu verstärken.
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Monoklonale
Antikörper
werden unter Verwendung des zum ersten Mal von Kohler und Milstein,
Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridom-Verfahrens aus einer
Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten oder können durch
DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567)
hergestellt werden. Beim Hybridom-Verfahren wird eine Maus oder
ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie oben
beschrieben immunisiert, um Lymphozyten zu erhalten, die Antikörper produzieren
oder produzieren können,
welche spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ
dazu können
Lymphozyten in vitro immunisiert werden. In diesem Fall werden Lymphozyten
zuerst unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B.
Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle
zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
59–103,
Academic Press (1986)). Die so erzeugten Hybridomzellen werden in
einem geeigneten Kulturmedium ausgesät und gezüchtet, das vorzugsweise eine
oder mehrere Substanzen enthält,
welche das Wachstum oder Überleben
der unfusionierten, parentalen Myelomzellen hemmen. Wenn den parentalen
Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
(HGRPT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome
typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, welche
das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern. Bevorzugte
Myelomzellen sind solche, die effizient fusionieren, eine stabile
und starke Antikörper-Expression
durch die gewählten
Antikörper-produzierenden
Zellen unterstützen
und gegenüber
einem Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind. Davon sind bevorzugte
Myelomzelllinien Mäuse-Myelomzelllinien,
wie z.B. jene von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren stammende, die vom
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien,
USA, erhältlich
sind, und SP-2-Zellen,
die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
USA, erhältlich
sind. Menschliche Myelomzelllinien und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien
wurden ebenfalls für
die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern verwendet
(Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); und Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel
Dekker, Inc., New York (1987)). Siehe auch Boerner et al., J. Immunol.
147(1), 86–95
(1991), und WO 91117769, veröffentlicht
am 28. November 1991, über
Verfahren zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern. Das
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die
Produktion von monoklonalen Antikörpern untersucht, die gegen
das Antigen von Interesse gerichtet sind. Vorzugsweise wird die
Bindespezifität
von monoklonalen Antikörpern,
die durch Hybridomzellen erzeugt werden, durch Immunfällung oder
durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. einen Radioimmuntest
(RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Die Bindeaffinität
des monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse nach Munson und
Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden. Nachdem die
Hybridomzellen, die Antikörper
mit der gewünschten
Spezifität,
Affinität
und/oder Aktivität
produzieren, identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, 59–104, Academic Press (1986).
Geeignete Kulturmedien für
diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Außerdem können die
Hybridomzellen in vivo in Form von Aszites-Tumoren in einem Tier
gezüchtet
werden. Die durch diese Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper werden
durch herkömmliche
Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose,
Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder
Affinitätschromatographie,
auf geeignete Weise vom Kulturmedium, von der Aszites-Flüssigkeit
oder vom Serum getrennt.
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Alternativ
dazu ist es nun möglich,
transgene Tiere (z.B. Mäuse)
herzustellen, die bei einer Immunisierung fähig sind, in Abwesenheit einer
endogenen Immunglobulinproduktion eine volles Repertoire an menschlichen
Antikörpern
herzustellen. So wurde beispielsweise beschrieben, dass die homozygote
Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-
(JH-) Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen zur
vollständigen
Hemmung der endogenen Antikörperproduktion
führt.
Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Gen-Anordnung
in solche keimbahnmutierten Mäuse
führt bei
Antigen-Provokation zur Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe
z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993);
Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); D.M. Fishwild
et al., Nat. Biotech. 14, 845–851
(1996); und M.J. Mendez, Nat. Genetics 15, 146–156 (1997).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
können
Antikörper
oder Antikörperfragmente
aus Antikörper-Phagenbibliotheken
isoliert werden, die unter Verwendung des Verfahrens nach McCafferty
et al., Nature 348, 552–554
(1990), hergestellt wurden, wobei das Antigen von Interesse verwendet
wird, um einen geeigneten Antikörper
oder ein geeignetes Antikörperfragment
zu selektieren. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al.,
J. Mol. Biol. 222, 581–597
(1991), beschreiben die Isolie rung von Mäuse- bzw. menschlichen Antikörpern unter
Verwendung von Phagenbibliotheken. Spätere Publikationen beschreiben
die Produktion von menschlichen Antikörpern mit hoher Affinität (nM-Bereich)
durch Ketten-Shuffling (Mark et al., Bio/Technol. 10, 779–783 (1992))
sowie die kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion
von sehr großen
Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993);
A.D. Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245–3260 (1994); und Vaughan et
al., w.o. (1996)). Diese Verfahren stellen somit mögliche Alternativen
zu herkömmlichen
Hybridom-Verfahren mit monoklonalen Antikörpern dar, um "monoklonale" Antikörper (insbesondere
menschliche Antikörper)
zu isolieren, die zur vorliegenden Erfindung gehören.
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DNA,
die für
die Antikörper
der Erfindung kodiert, kann leicht unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren
isoliert und sequenziert werden (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden,
die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für schwere
und leichte Ketten von Mäuseantikörpern kodieren).
Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte DNA-Quelle.
Nach der Isolation kann die DNA in Expressionsvektoren platziert
werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Affen-COS-Zellen, Ovarialzellen
des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, die sonst
kein Immunglobulin-Protein produzieren, transfiziert werden, um
die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten
Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch modifiziert werden,
beispielsweise indem die für
menschliche konstante Schwerketten- und Leichtketten-Domänen kodierende
Sequenz anstelle der homologen Mäusesequenzen
eingefügt
wird. Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984). Auf
diese Weise werden "chimäre" Antikörper hergestellt, welche
die Bindespezifität
eines hierin definierten monoklonalen Anti-Antigen-Antikörpers aufweisen.
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Verfahren
zur Humanisierung von nichtmenschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der
Erfindung allgemein bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter
Antikörper
einen oder mehrere Aminosäurereste auf,
die aus einer nichtmenschlichen Quelle stammen. Die Humanisierung
kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
nach Winter und Mitarbeiter durchgeführt werden (Jones et al., Nature
321, 522–525 (1986);
Riechmann et al., Nature 322, 323–327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science 239, 1534–1536
(1988)), indem Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden
Sequenzen eines menschlichen Antikörpers eingefügt werden.
Demgemäß sind solche "humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly,
w.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche
variable Domäne
durch die entsprechende Sequenz von einer nichtmenschlichen Spezies
substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche
Antikörper,
in denen einige CDR-Reste, und möglicherweise
einige FR-Reste, durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt
sind. Wichtig ist, dass diese Antikörper so humanisiert werden,
dass die hohe Affinität
für das
Antigen und andere vorteilhafte biologische Eigenschaften erhalten
bleiben. Um dies zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem
bevorzugten Verfahren durch ein Verfahren hergestellt, bei dem parentale
Sequenzen und verschiedene konzeptuelle humanisierte Produkte unter Verwendung
von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten
Sequenz analysiert werden. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle
sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Computer-Programme,
welche wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen
von ausgewählten
Kandidaten-Immunglobulinsequenzen illustrieren und anzeigen, sind
verfügbar.
Durch Ansicht dieser Anzeigen kann die wahrscheinliche Rolle der
Reste bei der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz analysiert
werden, d.h. die Analyse von Resten wird möglich, welche die Fähigkeit
des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, an sein Antigen zu binden.
Auf diese Weise können
FR-Reste von der Consensus- und Importsequenz ausgewählt und
kombiniert werden, sodass die gewünschten Antikörper-Eigenschaften,
wie z.B. erhöhte
Affinität
für das/die
Target-Antigen(e),
erreicht werden. Für
weitere Details siehe WO 92/22653, veröffentlicht am 23. Dezember
1992.
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(ii) Immunadhäsin-Herstellung
-
Immunglobuline
(Ig) und bestimmte Varianten davon sind bekannt, und viele wurden
in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt. Siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4.745.055;
EP 256.654 ;
Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982);
EP 120.694 ;
EP 125.023 ; Morrison, J. Immun. 123,
793 (1979); Köhler
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980); Raso et al.,
Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2,
239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984);
EP 255.694 ;
EP 266.663 und WO 88/03559. Neu geordnete
Immunglobulin-Ketten sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4.44.878; WO 88/03565; und
EP 68.763 und darin zitierte Literatur.
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Chimären, die
aus Adhäsin-Bindedomänen-Sequenzen
konstruiert sind, die an eine geeignete Sequenz einer konstanten
Immunglobulin-Domäne
gebunden sind (Immunadhäsine),
sind ebenfalls auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In der Literatur
genannte Immunadhäsine
umfassen Fusionen von T-Zell-Rezeptor (Gascoigne et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 2936–2940
(1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et
al., Nature 339, 68–70
(1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); und
Byrn et al., Nature 344, 667–670
(1990)); L-Selectin (homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell Biol.
110, 2221–2229
(1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo
et al., Cell 61, 1303–1313 (1990));
CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991));
CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic
et al., Cell 66, 1133–1144
(1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88, 10535–10539
(1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); und
Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); und IgE-Rezeptor α (Ridgway
und Gorman, J. Cell. Biol., Bd. 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
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Das
einfachste und direkteste Immunadhäsin-Design kombiniert die Bindedomäne(n) des
Adhäsins (z.B.
die extrazelluläre
Domäne
(ECD) eines Rezeptors) mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette.
Normalerweise wird, wenn die Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung
hergestellt werden, Nucleinsäure,
die für
die Bindedomäne
des Adhäsins
kodiert, C-terminal an Nucleinsäure
fusioniert, die für
den N-Terminus einer Sequenz einer konstanten Immunglobulin-Domäne kodiert,
aber auch N-terminale Fusionen sind möglich.
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Typischerweise
behält
in solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionelle
aktive Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen der
konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen werden
auch am C-Terminus des Fc-Abschnitts
einer konstanten Domäne
oder direkt N-terminal zu CH1 der Schwerkette
oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen. Die
genaue Stelle, an der die Fusion stattfindet, ist nicht entscheidend;
mögliche
Stelle sind bekannt und können
so ausgewählt
werden, dass die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindeeigenschaften
des Ia optimiert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Adhäsin-Sequenz
an den N-Terminus der Fc-Domäne eines
Immunglobulins G1 (IgG) fusioniert. Es ist
möglich,
die gesamte konstante Schwerketten-Region an die Adhäsin-Sequenz
zu fusionieren. Noch bevorzugter werden jedoch eine Sequenz, die
in der Gelenk-Region gleich stromauf von der Papain-Spaltstelle
beginnt, welche IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wobei
der erste Rest der konstanten Schwerketten-Region bei 114 festgesetzt
wird), oder analoge Stellen von anderen Immunglobulinen bei der
Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform
wird die Adhäsin-Aminosäuresequenz
an (a) die Gelenk-Region und CH2 und CH3 oder (b) die CH1-,
Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen einer
IgG1-, IgG2- oder
IgG3-Schwerkette fusioniert. Die genaue
Stelle, an der die Fusion stattfindet, ist nicht entscheidend, und
die optimale Stelle kann durch herkömmliches Experimentieren bestimmt werden.
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Für bispezifische
Immunadhäsine
werden die Immunadhäsine
als Multimere, genauer gesagt als Heterodimere oder Heterotetramere,
angeordnet. Im Allgemeinen weisen die so angeordneten Immunglobuline bekannte
Einheitsstrukturen auf. Eine grundlegende Vierketten-Struktureinheit
ist die Form, in der IgG, IgD und IgE vorkommen. Eine Vierketten-Einheit
wird in den Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt;
IgM kommt im Allgemeinen als Pentamer aus vier Grundeinheiten vor,
die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin,
und gelegentlich IgG-Globulin, können
ebenfalls in Multimerform im Serum vorkommen. Im Falle eines Multimers
können
die vier Einheiten gleich oder unterschiedlich sein.
-
Nachstehend
sind verschiedene Beispiele für
angeordnete Immunadhäsine
angeführt,
die innerhalb des Schutzumfangs hierin liegen:
- (a)
ACL-ACL;
- (b) ACH-[ACH,
ACL-ACH, ACL-VHCH oder
VLCL-ACH];
- (c) ACL-ACH-[ACL-ACH, ACL-VHCH,
VLCL-ACH oder
VLCL-VHCH];
- (d) ACL-VHCH-[ACH oder ACL-VHCH oder
VLCL-ACH];
- (e) VLCL-ACH-[ACL-VHCH oder VLCL-ACH]; und
- (f) [A-Y]n-[VLCL-VHCH]2,
worin
die A für
gleiche oder unterschiedliche Adhäsin-Aminosäuresequenzen stehen;
VL eine variable Domäne einer Immunglobulin-Leichtkette
ist;
VH eine variable Domäne einer
Immunglobulin-Schwerkette ist;
CL eine
konstante Domäne
einer Immunglobulin-Leichtkette ist;
CH eine
konstante Domäne
einer Immunglobulin-Schwerkette ist;
n eine ganze Zahl größer als
1 ist;
Y den Rest eines kovalenten Vernetzungsmittels bezeichnet.
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Um
die Erläuterungen
kurz zu halten, zeigen die oben genannten Strukturen lediglich Schlüsselmerkmale;
es sind weder verbindende (J-) oder andere Domänen der Immunglobuline noch
Disulfidbindungen dargestellt. Wenn solche Domänen jedoch für die Bindeaktivität erforderlich
sind, sind sie so zu konstruieren, dass sie an den üblichen
Stellen vorhanden sind, die sie in den Immunglobulin-Molekülen einnehmen.
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Alternativ
dazu können
die Adhäsin-Sequenzen
zwischen Schwerketten- und Leichtketten-Sequenzen eines Immunglobulins
insertiert werden, sodass ein Immunglobulin mit einer chimären Schwerketten
erhalten wird. In dieser Ausführungsform
werden die Adhäsin-Sequenzen
an jedem Arm eines Immunglobulins an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette
fusioniert, entweder zwischen der Gelenk- und der CH2-Domäne oder
zwischen der CH2- und der CH3-Domäne. Ähnliche
Konstrukte wurden von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991),
beschrieben.
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Eine
Immunglobulin-Leichtkette kann entweder kovalent an ein Adhäsin-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid
gebunden oder direkt an das Adhä sin
fusioniert vorliegen. Im ersten Fall wird DNA, die für eine Immunglobulin-Leichtkette kodiert,
typischerweise mit der DNA coexprimiert, die für das Adhäsin-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionsprotein
kodiert. Bei der Sekretion werden die Hybrid-Schwerkette und die Leichtkette
kovalent verbunden, um eine immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen,
die zwei durch Disulfid verbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare
umfasst. Verfahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet
sind, sind beispielsweise im US-Patent 4.816.567 offenbart, das
am 28. März
1989 ausgegeben wurde.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stammen die Immunglobulin-Sequenzen, die zur Herstellung der Immunadhäsine der
vorliegenden Erfindung verwendet werden, von einer konstanten Domäne einer IgG-Immunglobulin-Schwerkette.
Bei menschlichen Immunadhäsinen
ist die Verwendung von menschlichen IgG1-
und IgG3-Immunglobulin-Sequenzen
bevorzugt. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von IgG ist, dass IgG-Immunadhäsine effizient
auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert
die Reinigung von IgG3 Protein G, ein deutlich
weniger vielseitiges Medium. Aber auch andere strukturelle und funktionelle
Eigenschaften von Immunglobulinen sollten bedacht werden, wenn der
Ig-Fusionspartner für eine bestimmte
Immunadhäsin-Konstruktion
gewählt
wird. Das IgG3-Gelenk ist beispielsweise
länger
und flexibler, sodass es längere "Adhäsin"-Domänen
aufnehmen kann, die sich nicht richtig falten oder funktionieren,
wenn sie an IgG fusioniert sind. Eine weitere Überlegung wäre die Wertigkeit; IgG-Immunadhäsine sind zweiwertige
Homodimere, während
Ig-Subtypen, wie IgA und IgM, dimere bzw. pentamere Strukturen aus
der grundlegenden Ig-Homodimereinheit bilden können. Für Immunadhäsine, die auf eine In-vivo-Anwendung ausgerichtet
sind, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen,
die in der Fc-Region spezifiziert werden, von Bedeutung. Obwohl
IgG, IgG und IgG alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen,
ist ihre relative Wirksamkeit in Bezug auf die Aktivierung des Komplementsystems
unterschiedlich. IgG4 aktiviert kein Komplement,
und IgG ist deutlich schwächer
bei der Komplementaktivierung als IgG. Außerdem bindet IgG2,
anders als IgG, nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen
oder Neutrophilen. Während
IgG optimal zu Komplementak tivierung ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit
nur etwa ein Drittel der von anderen IgG-Isotypen. Eine weitere
wichtige Überlegung
in Bezug auf Immunadhäsine,
die als Therapeutika an Menschen eingesetzt werden sollen, ist die
Anzahl an allotypischen Varianten des jeweiligen Isotyps. Im Allgemeinen
sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen
bevorzugt. IgG weist beispielsweise nur vier serologisch definierte
allotypische Stellen auf, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region
liegen; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht immunogen. Im Gegensatz
dazu gibt es in IgG3 12 serologisch definierte
Allotypen, die alle in der Fc-Region
liegen; nur drei von diesen Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen
Allotyp auf, der nicht immunogen ist. Somit ist die potenzielle
Immunogenität
von γ3-Immunadhäsin größer als
die von γ1-Immunadhäsin.
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Immunadhäsine werden
am besten hergestellt, indem die cDNA-Sequenz, die für den Adhäsin-Abschnitt
kodiert, im Leseraster an eine Ig-cDNA-Sequenz fusioniert wird.
Eine Fusion an genomische Ig-Fragmente kann aber ebenfalls verwendet
werden (siehe z.B. Gascoigne et al., w.o.; Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990);
und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Die letztere
Fusionsart erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen für die Expression.
cDNA, die für
konstante IgG-Schwerketten-Regionen kodiert, kann ausgehend von
veröffentlichten
Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die von der Milz
oder Lymphozyten des peripheren Bluts stammen, und zwar durch Hybridisierungs-
oder durch Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren. Die cDNA,
die für
das "Adhäsin" und die Ig-Teile des Immunadhäsins kodiert,
wird tandemartig in einen Plasmidvektor insertiert, der eine effiziente
Expression in den gewählten
Wirtszellen steuert.
-
2. Herstellung
einer Protuberanz und/oder eines Hohlraums
-
In
einem ersten Schritt bei der Auswahl von ursprünglichen Resten zur Bildung
der Protuberanz und/oder des Hohlraums wird die dreidimensionale
Struktur des Heteromultimers unter Verwendung von Verfahren erhalten,
die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, wie z.B.
Röntgenkristallstrukturanalyse
oder NMR.
-
Ausgehend
von der dreidimensionalen Struktur können Fachleute auf dem Gebiet
der Erfindung die Schnittstellen-Reste identifizieren.
-
Die
bevorzugte Schnittstelle ist die CH3-Domäne einer
konstanten Immunglobulin-Domäne. Die Schnittstellen-Reste
der CH3-Domänen von IgG, IgA, IgD, IgE
und IgM wurden identifiziert (siehe z.B. PCT/US96/01598) und umfassen
jene, die optimal durch Importreste ersetzt werden können; wie
beispielsweise die Schnittstellen-Reste verschiedener IgG-Subtypen und "vergrabene" Reste. Die Basis
zur Herstellung der CH3-Schnittstelle ist,
dass die Röntgenkristallstrukturanalyse
gezeigt hat, dass die intermolekulare Assoziation zwischen menschlichen
IgG1-Schwerketten in der Fc-Region extensive
Protein/Protein-Wechselwirkungen zwischen CH3-Domänen umfasst,
während
die glykosylierten CH2-Domänen über ihr
Kohlenhydrat wechselwirken (Deisenhofer, Biochem. 20, 2361–2370 (1981)).
Außerdem
gibt es zwei Disulfidbindungen zwischen Schwerketten, die während einer
Antikörper-Expression
in Säugetieren
effizient gebildet werden, solange die Schwerkette nicht trunkiert
wird, um die CH2- und CH3-Domäne zu entfernen
(King et al., Biochem. J. 281, 317 (1992)). Somit scheint eine Schwerkettenzusammenstellung
die Bildung einer Disulfidbindung zu fördern, und nicht umgekehrt.
Zusammen gesehen führten
diese strukturellen und funktionellen Daten zur Hypothese, dass eine
Antikörper-Schwerketten-Assoziation durch
die CH3-Domänen gesteuert wird. Außerdem wurde
angenommen, dass die Schnittstelle zwischen CH3-Domänen vielleicht
so ausgebildet werden kann, dass die Bildung von Heteromultimeren
mit unterschiedlichen Schwerketten gefördert und die Zusammenstellung
von entsprechenden Homomultimeren verhindert werden kann. Die hierin
beschriebenen Experimente zeigten, dass es möglich war, unter Verwendung
dieses Ansatzes die Bildung von Heteromultimeren gegenüber von
Homomultimeren zu fördern.
Somit ist es möglich,
eine Polypeptid-Fusion zu erzeugen, die ein Polypeptid von Interesse
und die CH3-Domäne eines Antikörper umfasst,
um ein erstes oder zweites Polypeptid zu bilden. Die bevorzugte
CH3-Domäne
stammt von einem IgG-Antikörper,
wie z.B. menschlichen IgG1.
-
Jene
Schnittstellen-Reste, die möglicherweise
Kandidaten zur Bildung der Protuberanz oder des Hohlraums darstellen,
werden identifiziert. Vorzugsweise werden "vergrabene" Reste ausgewählt, die ersetzt werden sollen.
Um zu bestimmen, ob ein Rest vergraben ist, kann das Oberflächen-Zugänglichkeitsprogramm
von Lee et al., J. Mol. Biol. 55, 379–400 (1971), verwendet werden,
um die Lösungsmittelzugänglichkeit
(LZ) von Resten in der Schnittstelle zu bestimmen. Dann kann die
LZ für
die Reste des ersten und zweiten Polypeptids separat berechnet werden,
nachdem das andere Polypeptid entfernt wurde. Der Unterschied in
der LZ der Reste zwischen den Monomer- und den Dimer-Formen der
Schnittstelle kann dann mithilfe der folgenden Gleichung berechnet
werden: LZ (Dimer) – LZ
(Monomer). Dies ergibt eine Liste von Resten, die bei der Bildung des
Dimers LZ verlieren. Die LZ der einzelnen Reste im Dimer wird mit
der theoretischen LZ der gleichen Aminosäure im Tripeptid Gly-X-Gly
verglichen, worin X die Aminosäure
von Interesse ist (Rose et al., Science 229, 834–838 (1985)). Reste, die (a)
im Dimer im Vergleich zum Monomer LZ verloren hatten und (b) eine
LZ von weniger als 26 % der des entsprechenden Tripeptids aufwiesen,
werden als Schnittstellen-Reste betrachtet. Zwei Kategorien können unterschieden
werden: solche, die im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid eine
LZ < 10 % aufweisen
(d.h. "vergraben"), und solche, die
im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid 25 % > LZ > 10 % aufweisen (d.h. "teilweise vergraben") (siehe Tabelle
1). TABELLE
1
- ✝ Nummerierung
der Reste wie in der IgG-Kristallstruktur (Deisenhofer, Biochemistry
20, 2361–2370
(1981)).
-
Die
Wirkung des Ersetzens von Resten auf die Polypeptid-Kettenstruktur
kann unter Verwendung eines graphischen Molekülmodellierungsprogramms, wie
z.B. des Programms InsigtTM (Biosym Technologies), untersucht
werden. Mithilfe des Programms können
beispielsweise jene vergrabenen Reste der Schnittstelle des ersten
Polypeptids, die ein kleineres Seitenkettenvolumen aufweisen, durch
Reste ersetzt werden, die ein größeres Seitenkettenvolumen
aufweisen (d.h. eine Protuberanz). Dann werden die Reste in der
Schnittstelle des zweiten Polypeptids, die in der Nähe der Pro tuberanz
liegen, untersucht, um einen zur Bildung des Hohlraums geeigneten
Rest zu finden. Normalerweise weist dieser Rest ein großes Seitenkettenvolumen
auf und wird durch einen Rest mit einem kleineren Seitenkettenvolumen
ersetzt. In bestimmten Ausführungsformen zeigt
die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der Schnittstelle
eine Protuberanz mit geeigneter Position und Größe an der Schnittstelle des
ersten Polypeptids oder einen Hohlraum an der Schnittstelle des
zweiten Polypeptids auf. In diesen Fällen muss nur eine einzige
Mutante modelliert werden, d.h. eine mit einer synthetisch eingeführten Protuberanz
oder einem solchen Hohlraum.
-
In
Bezug auf die Auswahl möglicher
ursprünglicher
Reste zum Ersetzen, wobei das erste und zweite Polypeptid jeweils
eine CH3-Domäne umfassen, umfasst die CH3/CH3-Schnittstelle
von menschlichen IgG1 sechzehn Reste auf
jeder Domäne,
die auf vier antiparallelen β-Strängen positioniert
sind und 1090 Å2 von jeder Fläche vergräbt (Deisenhofer, w.o., und
Miller, J. Mol. Biol. 216, 965 (1990)). Mutationen sind vorzugsweise auf
Reste gerichtet, die auf zwei zentralen antiparallelen β-Strängen liegen.
Das Ziel besteht darin, das Risiko zu minimieren, dass die erzeugten
Protuberanzen durch Eindringen in das umliegende Lösungsmittel
aufgenommen werden und nicht in Kompensationshohlräumen in
der Partner-CH3-Domäne untergebracht werden.
-
Sobald
die bevorzugten ursprünglichen
Reste/Import-Reste durch Molekülmodellierung
identifiziert sind, werden die Aminosäure-Ersetzungen mithilfe von
auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren in das
Polypeptid eingeführt.
Normalerweise wird die DNA, die für das Polypeptid kodiert, mithilfe der
in Mutagenesis: A Practical Approach, w.o., beschriebenen Verfahren
gentechnisch verändert.
-
Oligonucleotid-vermittelte
Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutionsvarianten
der DNA, die für
das erste oder zweite Polypeptid kodiert. Dieses Verfahren ist auf
dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und wurde von Adelman
et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Kurz gesagt wird die DNA
des ersten oder zweiten Polypeptids geändert, indem ein Oligonucleotid,
das für
die ge wünschte Mutation
kodiert, an eine DNA-Matrize hybridisiert wird, worin die Matrize
die einsträngige
Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das/der die ungeänderte oder
native DNA-Sequenz eines Heteromultimers enthält. Nach der Hybridisierung
wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten zweiten komplementären Strang
der Matrize zu synthetisieren, der so den Oligonucleotid-Primer
umfasst und für
die gewählte Änderung
in der Heteromultimer-DNA kodiert.
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Kassettenmutagenese
kann gemäß der Beschreibung
von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), durchgeführt werden, wobei eine Region
der DNA von Interesse durch ein synthetisches Mutantenfragment ersetzt wird,
das durch Anellierung von komplementären Oligonucleotiden gebildet
wurde. PCR-Mutagenese ist auch zur Herstellung von Varianten der
DNA des ersten oder zweiten Polypeptids geeignet. Während sich
die nachstehenden Erläuterungen
auf DNA beziehen, versteht sich, dass das Verfahren auch auf RNA
anwendbar ist. Das PCR-Verfahren betrifft im Allgemeinen das folgende
Verfahren (siehe Ehrlich, Science 252, 1643–1650 (1991), Kapitel von R.
Higuchi, S. 61–70).
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Diese
Erfindung umfasst neben den Protuberanzen- oder Hohlraummutationen
außerdem
Aminosäuresequenz-Varianten
des Heteromultimers, die durch Einführung von geeigneten Nucleotidänderungen
in die Heteromultimer-DNA oder durch Synthese des gewünschten
Heteromultimer-Polypeptids hergestellt werden können. Solche Varianten umfassen
beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von
Resten innerhalb der Aminosäuresequenzen
des ersten und zweiten Polypeptids, die das Heteromultimer bilden. Jede
beliebige Kombination aus Deletion, Insertion und Substitution kann
zur Herstellung des Endkonstrukts verwendet werden, solange das
Endkonstrukt die gewünschten
Antigen-Bindeeigenschaften aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationale
Prozesse des Heteromultimers verändern,
wie beispielsweise die Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen.
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Ein
zweckdienliches Verfahren zur Identifikation von bestimmten Resten
oder Regionen der Heteromultimer-Polypeptide, die bevorzugte Stellen
für eine
Mutagenese darstellen, wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und wurde
von Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989), beschrieben.
Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert
(beispielsweise geladene Reste, wie z.B. arg, asp, his, lys und
glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere
Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit
dem umliegenden wässrigen
Umfeld in oder außerhalb
der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit
gegenüber
den Substitutionen aufweisen, werden dann durch Einführung weiterer
oder anderer Varianten an den oder anstelle der Substitutionsstellen
verfeinert. Während
die Stelle zur Einführung
einer Aminosäuresequenz-Variation
also vorgegeben ist, muss die Art der Mutation selbst nicht vorbestimmt
sein.
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Normalerweise
umfassen die Mutationen konservative Aminosäure-Ersetzungen in nichtfunktionellen Regionen
des Heteromultimers. Beispiele für
Mutationen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
-
-
Kovalente
Modifikationen der Heteromultimer-Polypeptide liegen ebenfalls innerhalb
des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Kovalente Modifikationen
des Heteromultimers können
durch Umsetzung von gewünschten
Aminosäureresten
des Heteromultimers oder von Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungs mittel,
das mit ausgewählten
Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten reagieren kann,
in das Molekül
eingeführt
werden. Eine weitere Art einer kovalenten Modifikation des Heteromultimer-Polypeptids,
die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt,
umfasst eine Änderung des
nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Änderung
ist gemeint, dass eine oder mehrere Kohlenhydratgruppierungen, die
im ursprünglichen
Heteromultimer vorkommen, deletiert werden und/oder eine oder mehrere
Glykosylierungsstellen, die nicht im ursprünglichen Heteromultimer vorkommen,
hinzugefügt werden.
Die Addition von Glykosylierungsstellen zum Heteromultimer-Polypeptid
wird am besten erreicht, indem die Aminosäuresequenz so verändert wird,
dass sie eine oder mehrere N-gebundene Glykosylierungsstellen aufweist.
Die Änderung
kann auch durch die Addition von oder Substitution von einem oder
mehreren Serin- oder Threonin-Resten zur ursprünglichen Heteromultimer-Sequenz
erfolgen (für
O-gebundene Glykosylierungsstellen). Zur Vereinfachung wird die
Heteromultimer-Aminosäuresequenz
vorzugsweise durch Änderungen
auf DNA-Ebene verändert,
insbesondere durch Mutation der DNA, die für das Heteromultimer-Polypeptid
kodiert, an vorbestimmten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die
in die gewünschten
Aminosäuren
translatieren. Ein weiteres Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen
auf dem Heteromultimer-Polypeptid ist eine chemische oder enzymatische
Kupplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind
in WO 87/05330, veröffentlicht
am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev.
Biochem., S. 259–306
(1981), beschrieben. Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen,
die auf dem Heteromultimer vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch
erfolgen.
-
Eine
weitere Art einer kovalenten Modifikation eines Heteromultimers
umfasst die Bindung des Heteromultimer-Polypeptids an eines von
verschiedenen nichtproteinischen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol,
Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf die in den
US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192
oder 4.179.337 beschriebene Weise.
-
Da
es oft schwierig ist, die Eigenschaften einer Heteromultimer-Variante
vorherzusagen, muss die gewonnene Variante natürlich gescreent werden, um
die optimale Variante auszuwählen.
-
3. Expression
eines Heteromultimers mit gemeinsamen Leichtketten
-
Nach
der Mutation der DNA und der Selektion der gemeinsamen Leichtkette,
wie es hierin offenbart ist, wird die DNA, die für die Moleküle kodiert, unter Verwendung
von Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein
bekannt sind, exprimiert. Das ausgewählte Expressionssystem wird
häufig
einen Säugetier-Expressionsvektor
und einen Wirt umfassen, sodass das Heteromultimer passend glykosyliert wird
(z.B. im Falle von Heteromultimeren, die glykosylierte Antikörper-Domänen umfassen).
Die Moleküle
können
aber auch in nachstehend erläuterten
prokaryotischen Expressionssystemen produziert werden. Normalerweise
wird die Wirtszelle mit DNA transformiert, die für das erste Polypeptid, das
zweite Polypeptid, das Polypeptid mit der gemeinsamen Leichtkette
und andere Polypeptide, die zur Bildung des Heteromultimers erforderlich
sind, kodiert, und zwar auf einem einzelnen Vektor oder auf unabhängigen Vektoren.
Es ist aber auch möglich,
das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid und Polypeptid mit der
gemeinsamen Leichtkette (die Heteromultimer-Komponenten) in unabhängigen Expressionssystemen
zu exprimieren und die exprimierten Polypeptid in vitro aneinander
zu kuppeln.
-
Die
Nucleinsäure(n)
(z.B. cDNA oder genomische DNA), die für das Heteromultimer und die
gemeinsame Leichtkette kodiert/kodieren, wird/werden für eine weitere
Klonierung (Amplifizierung der DNA) oder für eine Expression in einen
replizierbaren Vektor insertiert. Zahlreiche Vektoren stehen zur
Verfügung.
Die Vektor-Komponenten
umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
eines oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt,
ein oder mehrere Markergene, ein Verstärkerelement, einen Promotor
und eine Transkriptionsterminationssequenz.
-
Die
Polypeptide der Heteromultimer-Komponenten können als Fusionspolypeptide
mit einer Signalsequenz oder als anderes Polypeptid mit einer spezifischen
Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids hergestellt
werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des
Vektors sein, oder sie kann Teil der DNA sein, die in den Vektor
insertiert wird. Die ausgewählte
heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle
erkannt und bearbeitet (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten)
wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen kann die Signalsequenz durch
eine prokaryotische Signalsequenz ersetzt werden, die beispielsweise
aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist. Bei Hefeexpression kann die native Signalsequenz durch beispielsweise
den Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces-
und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader,
Letzteres im US-Patent Nr. 5.010.182, ausgegeben am 23. April 1991,
beschrieben) oder Säurephosphatase-Leader,
den C.-albicans-Glucoamylase-Leader (
EP
362.179 einer, veröffentlicht
am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht
am 15. November 1990, beschriebene Signal ersetzt werden. Bei Säugetierzellen-Expression
ist die native Signalsequenz (z.B. die Antikörper- oder Adhäsin-Präsequenz,
die normalerweise die Sekretion dieser Moleküle aus menschlichen Zellen
in vivo steuert) zufrieden stellend, obwohl auch andere Säugetier-Signalsequenzen sowie
virale sekretorische Leader, wie beispielsweise das Herpex-simplex-gD-Signal,
verwendet werden können.
Die DNA für
solch eine Vorläuferregion
ist im Leseraster an DNA ligiert, die für die Polypeptide kodiert,
welche das Heteromultimer bilden.
-
Sowohl
Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die den Vektor dazu befähigt,
sich in einer oder in mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren.
Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine solche,
die den Vektor dazu befähigt,
sich unabhängig
von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und Replikationsstartpunkte
oder autonom replizierende Sequenzen umfasst. Solche Sequenzen sind
für eine
Reihe von Bakterien, für
Hefe und für
Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pBR322 ist
für die
meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet,
und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV
oder BPV) sind zur Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen geeignet. Im
Allgemeinen ist für
Säugetier-Expressionsvektoren
die Replikationsstartpunkt-Komponente
nicht erforderlich (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur
verwendet, weil er den frühen
Promotor enthält).
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das
auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen
Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,
verleihen, (b) auxotrophe Mängel
ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die
im Komplex-Medium nicht vorhanden sind, z.B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase
für Bacilli
kodiert. Ein Beispiel für
ein Selektionsschema basiert auf der Verwendung eines Arzneimittels
zum Stoppen des Wachstums einer Wirtszelle. Diese Zellen, die erfolgreich
mit einem heterologen Gen transformiert werden, produzieren ein
Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht und somit den Selektionsvorgang überlebt.
Beispiele für
solch eine dominante Selektion sind die Verwendung der Arzneimittel
Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)),
Mycophenolsäure
(Mulligan et al., Science 298, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden
et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413
(1985)). Die drei oben angeführten
Beispiele nutzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um
Resistenz gegenüber
dem geeigneten Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt
(Mycophenolsäure)
bzw. Hygromycin zu verleihen.
-
Ein
weiteres Beispiel für
geeignete selektierbare Marker für
Säugetierzellen
sind solche, die eine Identifikation von Zellen ermöglichen,
welche die Heteromultimer-Nucleinsäure aufnehmen
können,
wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzellen-Transformanten
werden Selektionsdruck ausgesetzt, sodass nur die Transformanten
auf einzigartige Weise so angepasst werden, dass sie überleben,
weil sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird
ausgeübt,
indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei
denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium sukzessive
geändert
wird, was zu einer Amplifikati on von sowohl dem Selektionsgen als
auch der DNA führt,
die für
ein Heteromultimer kodiert. Erhöhte
Mengen eines Heteromultimers werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
Weitere Beispiele für
amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise
Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindesaminase, Ornithindecarboxylase
usw.
-
Beispielsweise
werden zuerst Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert
wurden, durch Kultivierung aller Transformanten in einem Kulturmedium
identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten
von DHFR, enthält.
Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR eingesetzt wird, ist
die Ovarialzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO-Zelllinie),
die keine DHFR-Aktivität
aufweist und gemäß Urlaub
und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), hergestellt
und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Methotrexatwerten
ausgesetzt. Dies führt
zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer
Kopien anderer DNA, welche die Expressionsvektoren umfasst, wie z.B.
der DNA, die für
die Komponenten des Heteromultimers kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren
kann an jedem beliebigen sonstigen geeigneten Wirt eingesetzt werden,
z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, trotz der Gegenwart von endogenem DHFR,
wenn beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen verwendet wird, das äußerst resistent
gegen Mtx ist (
EP 117.060 ).
-
Alternativ
dazu können
Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogenes DHFR enthalten),
die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert werden,
die für
Heteromultimere, ein Wildtyp-DHFR-Protein und einen anderen selektierbaren
Marker, wie z.B. Aminoglykosid-3'-phosphotransferase (APH),
kodieren, durch Zellwachstum in einem Medium selektiert werden,
das ein Selektionsmittel für
den selektierbaren Marker, wie beispielsweise ein Aminoglykosidantibiotikum,
z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. Siehe US-Patent Nr. 4,965.199.
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Ein
geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen,
das im Hefe-Plasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature
282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et
al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1- Gen stellt einen Selektionsmarker für einen
mutierten Stamm von Hefe bereit, der in Tryptophan nicht wachsen
kann, wie z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Die Gegenwart der trp1-Läsion
im Hefe-Wirtszell-Genom stellt dann ein effektives Umfeld zur Detektion
einer Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan
bereit. Auf ähnliche
Weise werden Leu2-defiziente Hefe-Stämme (ATCC 20.622 oder 38.626)
durch bekannte Plasmide komplementiert, die das Leu2-Gen tragen.
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Außerdem können Vektoren
vom ringförmigen
1,6-μm-Plasmid
pKD1 zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden.
Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Vor kurzem wurde über ein
Expressionssystem zur großtechnischen
Herstellung von rekombinantem Kälber-Chymosin
für K.
lactis berichtet. Van der Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile
Mehrkopien-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem
menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden ebenfalls
offenbart (Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)).
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Expressions-
und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor,
der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel mit der Heteromultimer-Nucleinsäure verbunden
ist. Viele Promotoren, die von verschiedenen möglichen Wirtszellen erkannt
werden, sind bekannt. Diese Promotoren sind operabel mit für ein Heteromultimer
kodierender DNA verbunden, indem der Promotor durch Restriktionsenzymverdauung aus
der Quellen-DNA entfernt wird und die isolierte Promotorsequenz
in den Vektor insertiert wird.
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Promotoren,
die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen β-Lactamase- und
Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978);
und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase,
ein Tryptophan- (trp-) Promotor-System (Goeddel, Nucleic Acids Res.
8, 4057 (1980), und
EP 36.776 )
und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Aber auch andere
bekannte bakterielle Promotoren sind geeignet. Diese Nucleotidsequenzen
wurden veröffentlicht,
sodass Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie operabel an DNA
binden können,
die für
das Heteromultimer kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)),
und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptern zur Bereitstellung
erforderlicher Restriktionsstellen. Promotoren zur Verwendung in
bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-)
Sequenz, die operabel an DNA gebunden ist, die für ein Heteromultimer kodiert.
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Promotorsequenzen
für Eukaryoten
sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche
Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle liegt,
an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz 70
bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstartpunkt vieler Gene ist
eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nucleotid sein kann.
Am 3'-Ende der meisten
eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal
für die
Addition des Poly(A)-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann.
Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische
Expressionsvektoren insertiert.
-
Beispiele
für geeignete
Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren
für 3-Phosphoglyceratkinase
(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme
(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry
17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatgehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase
und Glucokinase.
-
Weitere
Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen
Vorteil darstellen, dass die Transkription durch Wachstumsbedingungen
kontrolliert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom
C, Säurephosphatase,
degradative Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel zusammenhängen, Metallothionein,
Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und
Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und
Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression sind in Hitzeman et
al.,
EP 73.657A ,
genauer beschrieben. Hefe-Enhancer können ebenfalls gut mit Hefepromotoren
eingesetzt werden.
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Die
Heteromultimer-Transkription durch Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise
durch Promotoren, die von den Genomen von Viren, wie z.B. dem Polyoma-Virus,
dem Vogelpocken-Virus (
UK 2.211.504 ,
veröffentlicht
am 5. Juli 1989), einem Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), dem
Rinder-Papillomavirus, dem Vogel-Sarkomvirus,
dem Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, dem Hepatitis-B-Virus und
insbesondere dem Simian-Virus 40 (SV40), erhalten wurden, heterologe
Säugetier-Promotoren, wie z.B.
dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, oder Hitzeschockpromotoren
gesteuert.
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Die
frühen
und späten
Promotoren des SV40-Virus werden am besten als SV40-Restriktionsfragment erhalten,
das auch den SV40-Virus-Replikationsstartpunkt enthält. Fiers
et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209,
1422–1427
(1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981).
Der unmittelbare frühe
Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus wird am besten als HindIII-E-Restriktionsfragment
erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zur
Expression von DNA in Säugetierwirten
unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent
Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im
US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature
295, 503–508
(1982), über
die Expression von cDNA, die für
ein Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature
297, 598–601
(1982), über
die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA
in Mäusezellen
unter Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors vom Herpes-simplex-Virus;
Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), über die
Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuse- und
Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
6777–6781
(1982), über
die Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen,
Hühnerembryo fibroblasten,
Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter
Verwendung der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus als
Promotor.
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Die
Transkription von DNA, die für
die Heteromultimerkomponenten kodiert, durch höhere Eukaryoten wird häufig durch
die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer
sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108
(1983)) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et
al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz
selbst gefunden (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)).
Viele Enhancer-Sequenzen
von Säugetiergenen
sind nun bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise
wird ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus verwendet.
Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts
(bp 100–270),
den Enhancer des frühen
Promotors des Zytomegalie-Virus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite
des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch
Yaniv, Nature 297, 17–18
(1982), über
die Verstärkung
von Elementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der
Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' zur für das Heteromultimer kodierenden
Sequenz in den Vektor gespleißt
werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
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Expressionsvektoren,
die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilzen, Insekten, Pflanzen,
Tieren, Menschen oder kernhaltigen Zellen von anderen vielzelligen
Organismen) verwendet werden, enthalten außerdem Sequenzen, die zur Termination
der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche
Sequenzen sind normalerweise von 5'-, manchmal auch von 3'-, untranslatierten
Regionen von eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA verfügbar. Diese
Regionen enthalten Nucleotid-Sequenzen, die als polyadenylierte
Fragmente im untranslatierten Teil der mRNA transkribiert sind,
die für
das Heteromultimer kodiert.
-
Die
Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der
oben angeführten
Komponenten enthalten, erfolgt durch herkömmliche Ligationsverfahren.
Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten
und wieder in die erwünschte
Form ligiert, um die erforderlichen Plasmide herzustellen.
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Für die Analyse
zur Bestätigung
der korrekten Sequenzen in den hergestellten Plasmiden werden die Ligationsgemische
verwendet, um den E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) und erfolgreiche
Transformanten, die, wenn angemessen, durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz
ausgewählt
wurden, zu transformieren. Plasmide von den Transformanten werden
hergestellt, durch Restriktionsendonucleasenverdauung analysiert und/oder
durch das Verfahren nach Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309
(1981), oder das Verfahren nach Maxam et al., Methods in Enzymology
65, 499 (1980), sequenziert.
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Insbesondere
nützlich
bei der Umsetzung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die
eine vorübergehende
Expression von für
ein Heteromultimer kodierender DNA in Säugetierzellen ermöglichen.
Im Allgemeinen umfasst eine vorübergehende
Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur effizienten
Replikation in einer Wirtszelle fähig ist, sodass die Wirtszelle
viele Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum eine
große
Zahl eines gewünschten
Polypeptids synthetisiert, für
das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., w.o., S. 16.17–16.22.
Systeme zur vorübergehenden
Expression, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle
umfassen, ermöglichen
leicht eine positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte
DNA kodiert, sowie das rasche Screenen von Heteromultimeren mit
gewünschten
Bindespezifitäten/-affinitäten oder
den gewünschten
Gelwanderungseigenschaften in Bezug auf Heteromultimere oder Homomultimere,
denen die nicht natürlichen
Disulfidbindungen fehlen, die gemäß der vorliegenden Erfindung
gebildet werden.
-
Weitere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Synthese des Heteromultimers
in einer rekombinanten Wirbeltier-Zellkultur angepasst werden können, sind
in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al.,
Nature 281, 40–46
(1979);
EP 117.060 ; und
EP 117.058 beschrieben. Ein
insbesondere geeignetes Plasmid für Säugetierzellkultur-Expression
des Heteromultimers ist pRK5 (
EP
307.247 ) oder pSVI6B (PCT Veröff.-Nr. WO 91108291, veröffentlicht
am 13. Juni 1991).
-
Die
Wahl der Wirtszelllinie zur Expression des Heteromultimers hängt hauptsächlich vom
Expressionsvektor ab. Eine weitere Überlegung betrifft die Proteinmenge,
die erforderlich ist. Milligramm-Mengen können häufig durch vorübergehende
Transfektionen hergestellt werden. Die Adenovirus-EIA-transformierte
menschliche 293-Embryo-Nierenzelllinie
kann beispielsweise mit auf pRK5 basierenden Vektoren durch eine
Modifikation des Calciumphosphat-Verfahrens vorübergehend transfiziert werden,
um eine effiziente Heteromultimer-Expression zu ermöglichen.
Auf CDM8 basierende Vektoren können
verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren zu transfizieren (Aruffo
et al., Cell 61, 1303–1313
(1990); und Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347–353 (1990)).
Wenn größere Proteinmengen
erwünscht
sind, kann das Immunadhäsin
nach einer stabilen Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert
werden. Ein auf pRK5 basierender Vektor kann beispielsweise in Gegenwart
eines weiteren Plasmids, das für
Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert und Resistenz gegenüber G418
verleiht, in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen)
eingeführt
werden. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in einer Kultur ausgewählt werden.
Diese Klone werden in Gegenwart von steigenden Mengen DHFR-Inhibitor-Methotrexat
gezüchtet,
und jene Klone, in denen die Zahl an Genkopien, die für das DHFR
und Heteromultimer-Sequenzen kodiert, coamplifiziert wird, werden
ausgewählt.
Wenn das Immunadhäsin
eine hydrophobe Leader-Sequenz am N-Terminus enthält, ist
die Wahrscheinlichkeit hoch, dass es durch die transfizierten Zellen
bearbeitet und sekretiert wird. Die Expression von Immunadhäsinen mit
komplexeren Strukturen kann eventuell speziell passende Wirtszellen
erfordern. Komponenten, wie etwa eine leichte Kette oder eine J-Kette,
können
beispielsweise durch bestimmte Myleom- oder Hybridom-Wirtszellen
bereitgestellt werden (Gascoigne et al., w.o.; und Martin et al.,
J. Virol. 67, 3561–3568
(1993)).
-
Weitere
zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin geeignete Wirtszellen
sind Prokaryoten-, Hefe- oder andere oben beschriebene höhere Eukaryotenzellen.
Zu diesem Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien wie gramnegative
oder grampositive Organismen, wie beispielsweise Enterobakterien,
wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B.
Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie beispielsweise
B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart
in DD 266.710, veröffentlicht
am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces.
Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446),
obwohl auch andere Stämme,
wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC
27.325), geeignet sind. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung
und nicht der Einschränkung. Der
Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt,
weil es sich um einen herkömmlichen Wirtsstamm
für Fermentationen
von rekombinanten DNA-Produkten handelt. Vorzugsweise sekretiert
die Wirtszelle minimale Mengen von proteolytischen Enzymen. Der
Stamm W3110 kann beispielsweise so modifiziert werden, dass eine
genetische Mutation in den Genen stattfindet, die für Proteine
kodieren, wobei Beispiele für
solche Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 27C7 umfassen. Der gesamte
Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr
3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169
ompTΔ degP41kan'. Der Stamm 27C7
wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection
unter der ATCC-Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu auch ein E.-coli-Stamm
verwendet werden, der mutierte periplasmatische Protease aufweist,
wie sie im US-Patent Nr. 4.946.783 offenbart ist, das am 7. August
1990 veröffentlicht
wurde. Alternativ dazu können
die Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen,
eingesetzt werden.
-
Neben
Prokaryoten können
auch eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Fadenpilze oder
Hefe, als Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren verwendet werden,
die für
ein Heteromultimer kodieren. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche
Backhefe, ist der am meisten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus.
Aber eine ganze Reihe von anderen Genera, Spezies und Stäm men ist
allgemein erhältlich
und hierin einsetzbar, wie beispielsweise Schizosaccharomyces pombe
(Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981);
EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1995);
Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.493.529; Fleer et al., w.o.),
wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,
J. Bacteriol. 737 (1983)); K. fragilis (ATCC 12. 424), K. bulgaricus
(ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500),
K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., w.o.), K. thermotolerans
und K. marxianus; Yarrowia (
EP
402.226 ); Pichia pastoris (
EP
183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida;
Trichoderma reesia (
EP 244.234 );
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979));
Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis (
EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990);
und Fadenpilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium
(WO 91/00357, veröffentlicht
am 10. Jänner
1991), und Aspergillus-Wirte, wie beispielsweise A. nidulans (Ballance
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al.,
Gene 26, 205–221
(1983); Yelton et al., Proc. Natl: Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984))
und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4; 475–479 (1985)).
-
Zur
Expression von glykosylierten Heteromultimeren geeignete Wirtszellen
stammen von vielzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zu
komplexen Verarbeitungs- und
Glykosylierungsaktivitäten
fähig.
Im Prinzip kann jede höhere
eukaryotische Zellkultur verwendet werden, egal ob sie von einer
Wirbeltier- oder einer Wirbellosenkultur stammt. Beispiele für Zellen
von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche
Baculovirus-Stämme
und -Varianten sowie entsprechende zugelassene Insekten-Wirtszellen
von Wirten, wie beispielsweise Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes
aegypti (Stechmücke),
Aedes albopictus (Stechmücke),
Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, wurden identifiziert.
Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988);
Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Bd.
8, S. 277–279,
Plenum Publishing (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985).
Verschiedene virale Stämme
zur Transfektion sind allgemein erhältlich, wie beispielsweise
die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm
von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als Virus gemäß vorliegender
Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen.
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Pflanzenzellkulturen
von Baumwolle, Mais, Kartoffeln, Sojabohnen, Petunien, Tomaten und
Tabak können
als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen
durch Inkubation mit verschiedenen Stämmen der Bakterie Agrobacterium
tumefaciens transfiziert, die vorher verändert wurde, sodass sie die Heteromultimer-DNA enthält. Während der
Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für ein Heteromultimer
kodierende DNA zum Pflanzenzellwirt transferiert, sodass dieser
transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die Heteromultimer-DNA
exprimiert. Außerdem
sind Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen
kompatibel sind, wie beispielsweise der Nopalin-Synthase-Promotor
und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl.
Gen. 1, 561 (1982). Außerdem
sind DNA-Segmente, die aus der stromauf vom T-DNA-780-Gen gelegenen
Region isoliert wurden, zur Aktivierung oder' Erhöhung
der Transkription von durch Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinante
DNA enthaltendem Pflanzengewebe fähig.
EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
-
Die
bevorzugten Wirte sind Wirbeltierzellen, und die Vermehrung von
Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren
zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press,
Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)). Beispiele für nützliche Säugetier-Zelllinien sind die
mit SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651), die
menschliche embryonale Nierenlinien (293 oder 293-Zellen, die zur
Züchtung
in einer Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J.
Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL
10); Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters/-DHFR (CHO, Urlaub
und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4,
Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251
(1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der Grünen Meerkatze
(VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA,
ATCC CCL2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratte-Leberzellen
(BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL
75); menschliche Leberzellen (HEP G2, HB 8065); Mäuse-Mammatumor (MMT
060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad.
Sci. 383, 44–68
(1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie
(Hep G2).
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Wirtszellen
werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren
dieser Erfindung transfiziert und in einem herkömmliche Nährmedium kultiviert, das zur
Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation
der für
die gewünschten
Sequenzen kodierenden Gene modifiziert wurde. Je nach verwendeter
Wirtszelle wird die Transfektion nach Standardverfahren durchgeführt, die
für die jeweilige
Zelle geeignet sind. Im Allgemeinen werden für Prokaryoten oder andere Zellen,
die starke Zell-Wand-Barrieren aufweisen, eine Calciumbehandlung
unter Verwendung von Calciumchlorid, wie sie in Abschnitt 1.82 in
Sambrook et al., w.o., beschrieben ist, oder Elektroporation verwendet.
Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird verwendet, um
bestimmte Pflanzenzellen zu transfizieren, wie in Shaw et al., Gene 23,
315 (1983), und in der WO 89105859, veröffentlicht am 29. Juni 1989,
beschrieben ist. Außerdem
können Pflanzen
mithilfe einer Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie sie
in der WO 91/00368, veröffentlicht am
10. Jänner
1991, beschrieben ist.
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Für Säugetierzellen
ohne solche Zellwände
ist das Calciumphosphat-Fällungsverfahren
nach Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine
Aspekte der Transformation von Säugetierzell-Wirtssystemen
wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August
1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise
gemäß dem Verfahren
nach Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Aber auch
andere Verfahren zur Einführung
von DNA in Zellen wie z.B. durch nukleäre Mikroinjektion, Elektroporation,
bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen,
z.B. Polybren, Polyornithin usw., können eingesetzt werden. Zu
verschiedenen Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al.,
Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology
185, 527–537
(1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
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Prokaryotische
Zellen, die zur Herstellung des Heteromultimer-Polypeptids dieser
Erfindung verwendet werden, werden in einem geeigneten Medium kultiviert,
wie es in Sambrook et al., w.o., allgemein erläutert ist.
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Die
Säugetier-Wirtszellen,
die zur Herstellung des Heteromultimers dieser Erfindung verwendet
werden, können
in verschiedenen Medium kultiviert werden. Im Handel erhältliche
Medien, wie z.B. Ham's
F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640
(Sigma) und Dulbecco's
Modified Eagle's Medium
((DMEM), Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet.
Außerdem
kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes
und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patent Nr. 4.767.704;
4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195;
US Patent Re. 30.985, oder US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen
Medien als Kulturmedium für
die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann je nach
Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B.
Insulin, Transferrin oder einem Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen
(wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern
(wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin),
Antibiotika (wie z.B. dem Arzneimittel GentamycinTM),
Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die normalerweise
in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und
Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle
ergänzt
werden. Andere notwendige Ergänzungen
können
in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kultivierungsbedingungen,
wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen jenen, die
vorher bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet
wurden, und sind für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
-
Allgemeine
Erläuterungen
zu den Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktischen Verfahren
zur Maximierung der Produktivität
von Säugetier-Zellkulturen
finden sich in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach,
M. Butler, Hrsg., IRL Press (1991).
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Die
Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird,
umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines
Wirtstieres befinden.
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4. Gewinnung
des Heteromultimers
-
Das
Heteromultimer wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus
dem Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus einem Wirtszelllysat
gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne Sekretionssignale erzeugt
wird. Wenn das Heteromultimer membrangebunden ist, kann es unter
Verwendung einer geeigneten Detergenslösung (z.B. Triton X-100) von
der Membran gelöst
werden.
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Wenn
das Heteromultimer in einer rekombinanten Zelle nichtmenschlichen
Ursprungs produziert wird, ist es vollkommen frei von Proteinen
oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig,
das Heteromultimer von rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden
zu reinigen, um Präparate
zu erhalten, die in Bezug auf das Heteromultimer im Wesentlichen
homogen sind. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder
Lysat normalerweise zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen.
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Heterodimere
mit konstanten Antikörper-Domänen werden
am besten durch Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese,
Dialyse oder Affinitätschromatographie
gereinigt, wobei Affinitätschromatographie
das bevorzugte Reinigungsverfahren ist. Wenn das Heteromultimer
eine CH3-Domäne umfasst, kann das Bakerbond-ABXTM-Harz (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
zur Reinigung eingesetzt werden. Andere Verfahren zur Proteinreinigung,
wie z.B. Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC,
Chromatographie auf Silica, Chromatographie auf Heparin-Sepharose,
Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie
z.B. einer Polyasparaginsäure-Säule), Chromatofokussierung,
SDS-PAGE und Ammoniumsulfatfällung,
stehen je nach Polypeptid, das gewonnen werden soll, ebenfalls zur
Verfügung.
Ob Protein A als Affinitätsligand
geeignet ist, hängt
von der Spezies und vom Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die
in der Chimäre
verwendet wird. Protein A kann zur Reinigung von Immunadhäsin verwendet
werden, das auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten
basiert (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)).
Protein G wird für
alle Mäuse-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss
et al., EMBO J. 5, 1567–1575
(1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden wird, ist
meistens Agarose, aber auch andere Matrizes sind verfügbar. Mechanisch
stabile Matrizes, wie z.B. Glas mit definierter Porengröße oder
Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen
höhere
Strömungsgeschwindigkeiten
und kürzere
Bearbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Die
Bedingungen zur Bindung eines Immunadhäsins an die Protein-A- oder
Protein-G-Affinitätssäule werden
vollständig
von den Eigenschaften der Fc-Domäne
bestimmt; d.h. von ihrer Spezis und ihrem Isotyp. Im Allgemeinen
findet, wenn der geeignete Ligand gewählt wird, eine effiziente Bindung
direkt aus dem unkonditionierten Kulturfluid statt. Ein unterscheidendes
Merkmal von Immunadhäsinen
ist, dass die Bindungskapazität
für Protein
A bei menschlichen γ1-Molekülen etwas
geringer ist als an einen Antikörper
desselben Fc-Typs. Gebundenes Immunadhäsin kann entweder in einem
Puffer mit saurem pH (3,0 oder darüber) oder neutralem pH, der
ein leicht chaotropes Salz enthält,
effizient eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann
zu Bildung eines Heterodimers führen,
das > 95 % rein ist.
-
5. Verwendungsmöglichkeiten
für einen
heteromultimeren Antikörper
mit gemeinsamen Leichtketten
-
Verschiedenste
therapeutische Anwendungsmöglichkeiten
für das
Heteromultimer werden erwogen. Beispielsweise kann das Heteromultimer
für eine
umgeleitete Zytotoxizität
(z.B. zur Abtötung
von Tumorzellen), als Vakzine-Adjuvans, zur Anlieferung von thrombolytischen
Wirkstoffen zu Gerinnseln, zur Überführung von
enzymaktivierten Prodrugs an einer Zielstelle (z.B. einem Tumor),
zur Behandlung von Infektionserkrankungen, zum Targeting von Immunkomplexen
zu Zelloberflächenrezeptoren
oder zur Anlieferung von Immuntoxinen zu Tumorzellen verwendet werden.
Tumorgefäße-Targeting
wurde beispielsweise durch Targeting eines Modell-Endothelantigens,
eines Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexes, mit einem Antikörper-Ricin-Immuntoxin
erreicht (F.J. Burrows und P.E. Thorpe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90, 8996–9000
(1993)). Eine deutlich höhere
Wirksamkeit wurde durch die Kombination des Anti-Endothel-Immuntoxins
mit einem zweiten Immuntoxin erreicht, das gegen die Tumorzellen
selbst gerichtet war (F.J. Burrows und P.E. Thorpe, w.o. (1993)).
Vor kurzem wurde ein Gewebefaktor erfolgreich auf Tumorgefäße gerichtet,
indem ein bispezifischer Antikörper
verwendet wurde, der eine lokale Thrombose auslöste, die in einer signifikanten
Anti-Tumor-Wirksamkeit resultierte (X. Huang et al., Science 275,
547–550
(1997)). Außerdem
wurde bispezifische Diabodies erfolgreich zur Steuerung von zytotoxischen
T-Zellen verwendet, um Target-Brust-Tumorzellen
und B-Zell-Lymphomzellen in vitro abzutöten (Z. Zhu et al., Bio/Technology
14, 192–196
(1996); und P. Holliger et al., Protein Engin. 9, 299–305 (1996)).
-
Therapeutische
Formulierungen des Heteromultimers werden für die Lagerung vorbereitet,
indem das Heteromultimer mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen
physiologisch annehmbaren Trägern,
Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt werden (Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Aufl., A. Osol, Hrsg. (1980)), und zwar in Form eines
gefriergetrockneten Kuchens oder einer wässrigen Lösung. Annehmbare Träger, Exzipienten
oder Stabilisatoren sind in den eingesetzten Konzentrationen nicht
toxisch für
den Rezipienten und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und
andere organische Säuren;
Antioxidantien, einschließlich
Ascorbinsäure;
Polypeptid mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste);
Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile
Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin,
Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere
Kohlenhydrate, einschließlich
Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole,
wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium;
und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol
(PEG).
-
Das
Heteromultimer kann auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch
Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation (z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln
bzw. Poly[methylmethacrylat]mikrokapseln) hergestellt werden, in
kolloidalen Arzneimittelverabreichungssystemen (z.B. Liposomen,
Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln)
oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Verfahren sind
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, w.o., offenbart.
-
Das
Heteromultimer, das zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden soll,
muss steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile
Filtrationsmembranen erreicht werden, und zwar vor oder nach dem
Gefriertrocknen und der Wiederherstellung. Das Heteromultimer wird
normalerweise in gefriergetrockneter Form oder in Lösung gelagert.
-
Therapeutische
Heteromultimer-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen
Behälter
mit einer sterilen Zugangsöffnung
gegeben, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder in eine Phiole
mit einem Stöpsel,
der mithilfe einer Nadel für
subkutane Injektionen durchstochen werden kann.
-
Das
Heteromultimer wird auf herkömmlichem
Wege verabreicht, beispielsweise durch Injektion oder Infusion auf
intravenösem,
intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem
oder intraläsionalem
Weg, oder durch Depotsysteme, wie sie nachstehend beschrieben sind.
Das Heteromultimer wird kontinuierlich durch Infusion oder durch
Bolusinjektion verabreicht.
-
Geeignete
Beispiele für
Depotpräparate
umfassen halbdurchlässige
Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten,
wobei die Matrizes in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln,
vorliegen. Beispiele für
Depotmatrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat),
wie sie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981),
und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105
(1982), beschrieben wurden, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide
(US-Patent Nr. 3.773.919,
EP 58.481 ),
Copolymere aus L-Glutaminsäure
und γ-Ethyl-L-glutamat
(Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares
Ethylenvinylacetat (Langer et al., w.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure- Copolymere, wie z.B.
Lupron Depot
TM (injizierbare Mikrokugeln
aus einem Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (
EP 133.998 ).
-
Während Polymere,
wie beispielsweise Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die
Freisetzung von Molekülen über 100
Tage lang ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele Proteine über einen kürzeren Zeitraum frei. Wenn
eingekapselte Proteine längere
Zeit im Körper
bleiben, können
sie denaturieren oder aggregieren, da sie Feuchtigkeit bei 37°C ausgesetzt
werden, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und zu
möglichen
Veränderungen
der Immunogenität
führt.
Je nach beteiligtem Mechanismus können zweckmäßige Strategien zur Proteinstabilisierung
entworfen werden. Wenn sich beispielsweise der Aggregationsmechanismus
als Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiodisulfid-Austausch
herausstellt, kann eine Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten,
Gefriertrocknung aus sauren Lösungen, Steuerung
des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung von geeigneten Additiven und
Entwicklung von spezifischen Polymermatrix-Zusammensetzungen erreicht werden.
-
Depot-Heteromultimer-Zusammensetzungen
umfassen außerdem
liposomal eingeschlossenes Heteromultimer. Liposome, die ein Heteromultimer
enthalten, werden durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt:
DE 3.218.121 ; Epstein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980);
EP 52.322 ;
EP
36.676 ;
EP 88.046 ;
EP 143.949 ;
EP 142.641 ; japanische Patentanmeldung
83–118008;
US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und
EP 102.324 . Normalerweise sind die
Liposome vom kleinen (etwa 200–800
Angström)
einschichtigen Typ, worin der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin
ist, wobei der gewählte
Anteil je nach optimaler Heteromultimer-Therapie angepasst wird.
-
Eine
effektive Menge Heteromultimer, die therapeutisch eingesetzt werden
kann, hängt
beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg
und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß muss der Therapeut die Dosierung
titrie ren und den Verabreichungsweg so modifizieren, dass er die
optimale therapeutische Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis
kann von etwa 1 μg/kg
bis zu 10 mg/kg oder mehr betragen, je nachdem, wie die oben genannten
Faktoren aussehen. Typischerweise verabreicht der Arzt das Heteromultimer
solange, bis eine Dosis erreicht ist, die den gewünschten
Effekt ergibt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mithilfe
herkömmlicher
Tests überwacht
werden.
-
Die
hierin beschriebenen Heteromultimere können auch in Enzymimmuntests
verwendet werden. Um dies zu erreichen, kann ein Arm des Heteromultimers
so aufgebaut sein, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym
bindet, sodass die Bindung keine Enzymhemmung verursacht, und der
andere Arm des Heteromultimers kann so aufgebaut sein, dass er an
die immobilisierende Matrix bindet; um eine hohe Enzymdichte an
der gewünschten
Stelle sicherzustellen. Beispiele für solche diagnostischen Heteromultimere
umfassen jene mit einer Spezifität
für IgG
sowie Ferritin und solche, die beispielsweise Bindespezifitäten für Meerrettichperoxidase
(HRP) sowie ein Hormon aufweisen.
-
Die
Heteromultimere können
zur Verwendung in Zwei-Stellen-Immuntests bestimmt sein. Beispielsweise
werden zwei bispezifische Heteromultimere hergestellt, die an zwei
separate Epitope auf dem Analyt-Protein binden – ein Heteromultimer bindet
den Komplex an eine unlösliche
Matrix, das andere bindet ein Indikatorenzym.
-
Heteromultimere
können
auch zur In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnose von verschiedenen
Krankheiten, wie z.B. Krebs, verwendet werden. Um diese diagnostische
Verwendung zu vereinfachen, kann ein Arm des Heteromultimers so
aufgebaut sein, dass er an ein tumorassoziiertes Antigen bindet,
und der andere Arm kann einen detektierbaren Marker (z.B. einen
Chelatbildner, der ein Radionuclid bindet) binden. Ein Heteromultimer
mit Spezifitäten
für das
tumorassoziierte Antigen CEA sowie ein zweiwertiges Hapten können beispielsweise
zur Abbildung von kolorektalen und Thyroid-Karzinomen eingesetzt
werden. Andere nichtspezifische diagnostische Verwendungen des Heteromultimers
sind für
Fachleute offensichtlich.
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Bei
diagnostischen Anwendungen wird typischerweise zumindest ein Arm
des Heteromultimers direkt oder indirekt mit einer detektierbaren
Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann jede beliebige sein,
die zur direkten oder indirekten Erzeugung eines detektierbaren
Signals fähig
ist. Die detektierbare Gruppierung kann beispielsweise ein Radioisotop,
wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende
Verbindung, wie z.B. Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin;
oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder
Meerrettichperoxidase (HRP), sein.
-
Jedes
auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur separaten Konjugation
des Heteromultimers an die detektierbare Gruppierung kann verwendet
werden, einschließlich
der von Hunter et al., Nature 144, 495 (1962); David et al., Biochemistry
13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 129 (1981);
und Nygren, J. Histochem. and Cythochem. 30, 407 (1982), beschriebenen
Verfahren.
-
Die
Heteromultimere der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren
eingesetzt werden, wie beispielsweise in kompetitiven Bindungstests,
direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunfällungstests.
Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC
Press, Inc. (1987).
-
Kompetitive
Bindungstests basieren auf der Fähigkeit
eines markierten Standards, mit dem Analyten der zu prüfenden Probe
um die Bindung mit einer begrenzten Menge Heteromultimer zu konkurrieren.
Die Analytenmenge in der Probe ist umgekehrt proportional zur Menge
des Standards, der an das Heteromultimer gebunden wird. Um die Bestimmung
der Menge des Standards, der gebunden wird, zu vereinfachen, sind
die Heteromultimere im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz
nicht gelöst,
sodass der Standard und der Analyt, die an die Heteromultimere gebunden
werden, leicht von dem Standard und vom Analyten getrennt werden können, die
ungebunden bleiben.
-
Die
Heteromultimere sind vor allem für
Sandwich-Tests geeignet, welche die Verwendung von zwei Molekülen umfassen,
die jeweils zur Bindung unterschiedlicher immunogener Abschnitte
oder Epitope der zur detektierenden Probe fähig sind. In einem Sandwich-Test
ist der Analyt der zu prüfenden
Probe durch einen ersten Arm des Heteromultimers gebunden, das auf
einem festen Träger
immobilisiert ist, wonach der zweite Arm des Heteromultimers an
den Analyten bindet, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex
gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Arm
des Heteromultimers kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung
markiert werden (direkter Sandwich-Test) oder unter Verwendung eines
Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen
werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter
Sandwich-Test). Eine Art des Sandwich-Tests ist beispielsweise ein
ELISA-Test, bei dem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
-
Nachstehend
sind Beispiele für
spezifische Ausführungsformen
zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung angeführt. Die Beispiele dienen lediglich
der Veranschaulichung und keineswegs der Einschränkung des Schutzumfangs der
vorliegenden Erfindung.
-
Alle
Veröffentlichungen,
Patente und Patentanmeldungen, die hierin vor- und nachstehend zitiert
sind, sind durch Verweis in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.
-
BEISPIELE
-
Eine
Strategie zur Herstellung von Fc-hältigen bsAk wird präsentiert
(1C). In dieser Strategie stellten die Erfinder
durch Gentechnik die CH3-Domäne von Antikörper-Schwerketten her,
sodass sie heterodimerisierten, aber nicht homodimerisierten. Dies
wurde erreicht, indem zwischen einzelnen Ketten Disulfidbindungen
in der CH3-Domäne
gebildet wurden, und zwar zusammen mit sterisch komplementären Mutationen,
die durch rationales Design (Ridgway et al., w.o. (1996)) und Phagendisplay-Selektion, wie sie
hierin beschrieben ist, erhalten wurden. Die Verwendung einer einzelnen
Leichtkette für
beide Antigen-Bindespezifitäten
umgeht das Problem von Leichtketten-Fehlpaarungen (1A–1C).
Antikörper
mit der gleichen Leichtkette konnten leicht durch Panning einer
sehr großen
menschlichen scFc-Bibliothek isoliert werden (T.J. Vaughan et al., w.o.
(1996)).
-
Beispiel 1: Bildung von
Protuberanz-in-Hohlraum-Heteromultimer-Immunadhäsinen
-
Die
CH3-Schnittstelle zwischen den humanisierten
Anti-CD3/CD4-IgG-Chimären,
die von Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994), früher beschrieben
wurde, wurde gentechnisch hergestellt, um den Prozentsatz an Heteromultimeren
zu maximieren, die gewonnen werden konnten. Protuberanz-in-Hohlraum-Wildtyp-CH3-Varianten wurden aufgrund ihrer Fähigkeit
verglichen, die Bildung einer humanisierten Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre (Ak/Ia)
Anti-CD3/CD4-IgG zu steuern.
-
Somit
wurden durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von fehlgepaarten
Oligonucleotiden in der CH3-Domäne der schweren
Kette des humanisierten Anti-CD3-Antikörpers und in CD4-IgG Mutationen
erzeugt (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987), und P.
Carter, in Mutagenesis: A Practial Approach, S. 1–25, M.J.
McPherson, Hrsg., IRL Press Oxford, GB (1991)) und durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung verifiziert
(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)). Siehe
Tabelle 3.
-
-
Der
Rest T366 befindet sich in Wasserstoff-Bindedistanz von Rest Y407
auf der Partner-CH3-Domäne. Tatsächlich besteht der wichtigste
intermolekulare Kontakt vom Rest T366 zum Rest Y407 und umgekehrt.
Ein Protuberanz-in-Hohlraum-Paar wurde geschaffen, indem diese Reste
mit den reziproken Mutationen von T366Y in einer CH3-Domäne und Y407T
in der Partnerdomäne
invertiert wurden, wodurch das Seitenkettenvolumen an der Schnittstelle
beibehalten wurde. Mutationen werden durch den Wildtyp-Rest gefolgt
von der Position gemäß dem Kabat-Nummerierungssystem
(Kabat et al., w.o. (1991)) bezeichnet, worauf der Ersatzrest als
Einbuchstabencode folgt. Multiple Mutationen werden durch Auflistung
einzelner Komponentenmutationen bezeichnet, getrennt durch einen
Doppelpunkt.
-
Phagemiden,
die für
Anti-CD3-Leicht- (L-) und -Schwer- (-H-) Ketten-Varianten kodieren
(Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992), und Rodrigues et
al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7, 45 (1992)) wurden zusammen mit einem
für eine
CD4-IgG-Variante
kodierenden Phagemid (Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)) wie oben beschrieben
(Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994)) in menschliche embryonale
Nierenzellen, 293S, contransfiziert. Die Gesamtmenge an transfizierter
Phagemid- DNA wurde
fixiert, während
das Verhältnis
zwischen unterschiedlichen DNAs variiert wurde, um die Ausbeute
der Ak/Ia-Chimäre
zu maximieren. Das Verhältnis
(bezogen auf die Masse) von Ia:Schwerkette:Leichtketten-Input-DNA
(insgesamt 15 μg)
wurde wie folgt variiert: 8:1:3, 7:1:3, 6:1:3, 5:1:3, 4:1:3, 3:1:3,
1:0:0, 0:1:3.
-
Die
Produkte wurden vor der Analyse durch SDS-Page unter Verwendung
eines Staphylokokkus-Protein-A (ProSep A, BioProcessing Ltd., GB)
affinitätsgereinigt,
gefolgt von einer Scanning-LASER-Densitometrie. Überschüssige Leicht- oder Schwerketten-DNA
wurde verwendet, um eine Einschränkung
der Leichtkette zu vermeiden. Die Identität der Produkte wurde durch
Elektroblotten auf eine PVDF-Membran verifiziert (Matsudaira, J.
Biol. Chem. 262, 10035 (1987)), gefolgt von einer aminoterminalen
Sequenzierung.
-
Eine
Cotransfektion von Phagemiden für
eine Leichtkette zusammen mit jenen für eine Schwerkette und Ia,
die Wildtyp-CH3 inkorporierte, resultierte
wie erwartet in einem Gemisch aus einer Ak/Ia-Chimäre, IgG und
Ia-Homodimerprodukten (Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994)).
Je größer der
Anteil der Input-DNA, die für
eine Antikörper-Schwer-
und -Leichtkette oder Ia kodiert, desto größer der Anteil entsprechender
Homodimere, der gewonnen wird. In Input-DNA-Verhältnis von 6:1:3 zwischen Ia:H:L
ergab 54,5 % Ak/Ia-Chimäre
mit ähnlichen
Anteil eines Ia-Homodimers (22,5 %) und IgG (23,0 %). Diese Verhältnisse
stimmen gut mit jenen überein,
die aufgrund der äquimolaren
Expression der einzelnen Ketten, gefolgt von einer zufälligen Sortierung
von Schwerketten erwartet wurden, und zwar ohne Beeinflussung durch
das Analyseverfahren: 50 % Ak/Ia-Chimäre, 25 % Ia-Homodimer und 25
% IgG.
-
Im
Gegensatz zu Ketten, die Wildtyp-CH3 enthalten,
wurden Ak/Ia-Chimären
in Ausbeuten von bis zu 92 % von Cotransfektionen gewonnen, worin
die Anti-CD3-Schwerkette
und das CD4-IgG-Ia die Y407T-Hohlraum- bzw. die T366Y-Protuberanzmutationen
enthielten. Ähnliche
Ausbeuten an Antikörper/Immunadhäsin-Chimären wurden
erhalten, wenn diese reziproken Mutationen mit der Protuberanz auf
der Schwerkette und dem Hohlraum im Ia eingebaut wur den. In beiden
Fällen
war in der Kette, welche die Protuberanz, nicht aber den Hohlraum
enthielt, ein Monomer vorhanden. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie
zu beziehen, glauben die Erfinder, dass die T366Y-Protuberanz für die Homodimerbildung
störender
ist als der Y407T-Hohlraum. Der Anteil eines Ak/Ia-Hybrids wurde
durch die Steigerung der Größe von sowohl
Protuberanz als auch Hohlraum (Ak T366W, Ia Y407A) nicht wesentlich
verändert.
Eine zweites Protuberanz-Hohlraum-Paar (Ak F405A, Ia T394W) ergab bis
zu 71 % Ak/Ia-Chimären,
wobei ein kleiner Anteil Ia-Input-DNA verwendet wurde, um die unerwartete
Neigung der Ia-T394W-Protuberanz-Variante,
zu homodimerisieren, auszugleichen. Eine Kombination der beiden
unabhängigen
Protuberanz-in-Hohlraum-Mutantenpaare (Ak T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T)
verbesserte die Ausbeute des Ak/Ia-Hybrids im Vergleich zu dem Paar
Ak T366Y und Ia Y407T nicht.
-
Der
Anteil einer Ak/Ia-Chimäre,
die mit dem T366Y- und Y407T-Mutantenpaar erhalten wurde, war im getesteten
Bereich praktisch unabhängig
von der Menge Input-DNA.
Außerdem
konnten die kontaminierenden Spezies leicht durch Ionenaustauschchromatographie
(0–300
mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) auf einer Mono-S-HR-5/5-Säule (Pharmacia,
Piscataway, NJ, USA) aus der Ak/Ia-Chimäre entfernt werden. Das lässt vermuten,
dass unter Verwendung von stabilen Zelllinien die Herstellung von
größeren Mengen
Ak/Ia-Chimären
möglich
ist, worin die relativen Expressionswerte von Ak und Ia nicht so
leicht manipuliert werden können wie
in den vorübergehenden
Expressionsystemen.
-
Es
wird vermutet, dass die identifizierten Protuberanz-in-Hohlraum-Mutationen
die Anwendungsmöglichkeiten
von Fc-hältigen
bsAk erweitern, indem die Komplexität des Produktgemischs, das
aus zehn möglichen
Hauptspezies erhalten wird (Suresh et al., Methods Enzymol. 121,
210 (1990)), auf vier oder weniger reduziert wird (1A–1B).
Es ist zu erwarten, dass das T366Y- und Y407T-Mutantenpaar zur Herstellung von
Heteromultimeren nützlich
ist, die keine menschlichen IgG-Isotypen aufweisen (wie z.B. IgG2, IgG3 oder IgG4), das T366 und Y407 vollständig konserviert
sind und andere Reste an der CH3-Domänen-Schnittstelle von
IgG1 stark konserviert sind.
-
Beispiel 2: Herstellung
von nicht natürlich
vorkommenden Disulfidbindungen in heteromultimeren Immunadhäsinen
-
A. Design von CH3-Zwischenketten-Disulfidbindungen
-
Drei
Kriterien wurden verwendet, um Paare von Resten zur gentechnischen
Herstellung einer Disulfidbindung zwischen Partner-CH3-Domänen zu identifizieren:
i) Der Cα-Abstand
ist vorzugsweise ähnlich
wie der in natürlichen
Disulfidbindungen (5,0 bis 6,8 A) (N. Srinivasan et al., Int. J.
Peptides Protein Res. 36, 147–155
(1990)). Abstände
von bis zu 7,6 Å waren
erlaubt, um eine Hauptkettenbewegung zu ermöglichen und die Unsicherheit
der Atomlage in der Kristallstruktur mit geringer Auflösung einzubeziehen
(Deisenhofer, Biochemistry 20, 2361–2370 (1981)). ii) Die Cα-Atome sollten
auf unterschiedlichen Resten auf den beiden CH3-Domänen sein.
iii) Die Reste sind so positioniert, dass sie eine Disulfidbindung
erlauben (N. Srinivasan et al., w.o. (1990)).
-
B. Modellierung von Disulfidbindungen
-
Disulfidbindungen
wurden wie für
humAb4D5-Fv (Rodrigues et al., Cancer Res. 55, 63–70 (1995))
unter Verwendung von Insight II 95.0 (Biosym/MSI) in menschlichem
IgG1-Fc modelliert (Deisenhofer, w.o.).
-
C. Konstruktion von CH3-Varianten
-
Mutationen
wurden durch ortsgerichtete Mutagenese in die CH3-Domäne einer
humanisierten Anti-CD3-Schwerkette oder ein CD4-IgG eingeführt (Kunkel
et al., Methods Enzymol. 154, 367–382 (1987)), wobei die folgenden
synthetischen Oligonucleotid verwendet wurden:
Y349C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGCAGGGTGCACACCTGTGG
3' (SEQ.-ID NR:
1)
S354C, 5' CTCTTCCCGACATGGGGGCAG
3' (SEQ.-ID NR:
2)
E356C, 5' GGTCATCTCACACCGGGATGG
3' (SEQ.-ID NR:
3)
E357C, 5' CTTGGTCATACATTCACGGGATGG
3' (SEQ.-ID NR:
4)
L351C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGACAGGTGTACAC
3' (SEQ.-ID NR:
5)
D399C, 5' GCCGTCGGAACACAGCACGGG
3' (SEQ.-ID NR:
6)
K392C, 5' CTGGGAGTCTAGAACGGGAGGCGTGGTACAGTAGTTGTT
3' (SEQ.-ID NR:
7)
T394C, 5' GTCGGAGTCTAGAACGGGAGGACAGGTCTTGTA
3' (SEQ.-ID NR:
8)
V397C, 5' GTCGGAGTCTAGACAGGGAGG
3' (SEQ.-ID NR:
9)
D399S, 5' GCCGTCGGAGCTCAGCACGGG
3' (SEQ.-ID NR:
10)
K392S, 5' GGGAGGCGTGGTGCTGTAGTTGTT
3' (SEQ.-ID NR:
11)
C231S:C234S 5' GTTCAGGTGCTGGGCTCGGTGGGCTTGTGTGAGTTTTG
3' (SEQ.-ID NR:
12)
-
Mutationen
werden durch den Aminosäurerest
und eine Zahl (Eu-Nummerierungsschema
nach Kabat et al., w.o. (1991)), gefolgt von der Ersatzaminosäure bezeichnet.
Multiple Mutationen werden durch die einzelnen Mutationen, getrennt
durch einen Doppelpunkt bezeichnet. Mutanten wurden durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung
unter Verwendung von Sequenase Version 2.0 (United States Biochemicals,
Cleveland, OH, USA) verifiziert (Sauger et al., w.o. (1977)).
-
D. Zwischenketten-Disulfid
fördert
die Heterodimerbildung
-
Sechs
Molekülpaare,
die Zwischenketten-Disulfidbindungen in der CH3-Domäne aufwiesen
("Disulfid-CH3-Varianten"; v1-v6, Tabelle 4) wurden mit Elternmolekülen in Bezug
auf ihre Fähigkeit
verglichen, die Bildung eines Ak/Ia-Hybrids, Anti-CD3/CD4-IgG, zu steuern (Chamow
et al., w.o. (1994)). Plasmide, die für CD4-IgG- und Anti-CD3-Schwerkettenvarianten
kodierten, wurden in 293S-Zellen cotransfiziert, und zwar zusammen
mit einem Überschuss
an Plasmid, das für
die Anti-CD3-Leichtkette kodierte. Die Heterodimer-Ausbeute wurde
durch Transfektion mit verschiedenen Ia:H-Kette:L-Ketten-DNA-Verhältnissen
optimiert. Die Ak/Ia-Heterodimer-, IgG- und Ia-Homodimer-Produkte
wurden unter Verwendung von Staphylokokken-Protein-A affinitätsgereinigt
und durch SDS-PAGE und Laser-Scanning-Densitometrie quantifiziert
(Ridgway et al., w.o. (1996)).
-
Jedes
Disulfid-CH3-Paar ergab drei Hauptspezies, ähnlich den
Elternmolekülen.
Ein Ak/Ia-Heteromdimer von Disulfid-CH3-Varianten
wurden jedoch in seiner elektrophoretischen Mobilität verschoben,
in Übereinstimmung
mit der Bildung eines Zwischen ketten-Disulfids in der CH3-Domäne. Weitere
Beweise für
die Bildung einer Disulfidbindung wurde durch die Zwischenketten-Disulfide
im Gelenk bereitgestellt. Kovalent gebundene Ak/Ia-Hybride wurden
durch SDS-Page für
Disulfid-CH3-Varianten nachgewiesen, nicht
jedoch für
Moleküle
mit Wildtyp-CH3-Domänen, worin die Gelenk-Cysteine zu Serin
mutiert waren. Disulfid-CH3-Varianten wurden
hergestellt und als Y349C/S354'C,
Y349C/E356'C, Y349C/E357'C, L351C/E354'C, T394C/E397'C und D399C/K392C
bezeichnet. Nur eine Variante (D399C/K392'C) führte
zu einer wesentlichen Erhöhung
der Ausbeute an Ak/Ia-Hybriden im Vergleich zum Wildtyp (76 % bzw.
52 %), wie durch eine SDS-PAGE-Analyse der Varianten bestimmt wurde.
Mutationen werden durch den Aminosäurerest und eine Zahl (Eu-Nummerierungsschema
nach Kabat et al., w.o. (1991)), gefolgt von der Ersatzaminosäure bezeichnet.
Mutationen in der ersten und zweiten Kopien von CH3
kommen vor bzw. nach dem Schrägstrich.
Reste in der zweiten Kopie von CH3 werden
mit einem Strich (')
gekennzeichnet. Diese Verbesserung reflektiert anscheinend eher
die Disulfidbindungsbildung, und nicht den Ersatz der Reste K392
und D399, da die Mutationen K392S/D399'S beide eine ähnliche Ak/Ia-Ausbeute und
eine ähnliche
elektrophoretische Ak/Ia-Mobilität
in Bezug auf den Wildtyp ergaben. Homodimere wanderten ähnliche
wie jene mit Wildtyp-Fc-Domänen,
was die präferenzielle,
gentechnisch erzeugte Zwischenketten-Disulfidbindungsbildung in
der CH3-Domäne von Heterodimeren belegt.
Alle Disulfid-CH3-Varianten wurden in 293S-Zellen
im etwa gleichen Ausmaß exprimiert
wie die Elternmoleküle.
-
E. Disulfide kombiniert
mit Protuberanz-in-Hohlraum-Herstellung erhöht die Heterodimer-Ausbeute
auf 95 %
-
Das
beste Disulfidpaar erhöhte
den Prozentsatz des Heterodimers auf 76 %, und die Protuberanz-in-Hohlraum-Strategie
erhöhte
den Prozentsatz des Heterodimers aus 87 % (Tabelle 4; siehe auch
Ridgway et al., w.o. (1996)). Diese beiden Strategien basieren auf
unterschiedlichen Prinzipien, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung
eines Heterodimers zu erhöhen.
Deshalb kombinierten die Erfinder die beiden Strategien und erwarteten
eine weitere Erhöhung
der Heterodimer-Ausbeute. Zwei der modellierten Disulfide, die L351C
oder T392C enthielten, könnten
möglicherweise Disulfid-gebundene
Homodimere sowie Disulfid-gebundene Heterodimere bilden (L351C/S354'C und T394C/V397'C), wodurch ihre
Nützlichkeit
gesteigert wird. Die restlichen vier Disulfidpaare wurden in ein
phagenselektiertes Heterodimer (Varianten v9-v16) eingebaut und
auf die Heterodimer-Ausbeute untersucht (Tabelle 4). Ausbeuten von
etwa 95 % Heterodimer wurden erhalten. Wiederum wies das Heterodimer
eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung
im Vergleich zum Wildtyp und v8-Varianten auf.
-
TABELLE
4 Ausbeute
an Heterodimeren von C
H3-Varianten
-
Beispiel 3: Strukturgeleitete
Phagendisplay-Selektion für
komplementäre
Mutationen, die eine Protein-Protein-Wechselwirkung in Heteromultimeren
fördern
-
Die
folgende Strategie ist für
die Auswahl von komplementären
Mutationen in Polypeptiden nützlich, die
an einer Schnittfläche über eine
Multimerisations-Domäne
wechselwirken. Die Strategie wird nachstehend in ihrer Anwendung
zur Auswahl von komplementären
Protuberanz-in-Hohlraum-Mutationen erläutert. Das Beispiel dient jedoch
nicht der Einschränkung,
und die Strategie kann auch zur Auswahl von Mutationen verwendet
werden, die zur Bildung von nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen,
Leucin-Zipper-Motiven, hydrophoben Wechselwirkungen, hydrophilen
Wechselwirkungen und dergleichen geeignet sind.
-
A. Phagendisplay-Selektion
-
Eine
Phagendisplay-Strategie zur Auswahl von stabilen CH3-Heterodimeren
wurde entwickelt und ist in 2 schematisch
dargestellt. Die Auswahl basiert auf der Verwendung einer Protuberanz-Mutante,
T366W (Ridgway et al., w.o. (1996)), die an ein Peptid-Flag fusioniert
ist (gD-Peptid-Flag, beispielsweise, L.A. Lasky und D.J. Dowbenko,
DNA 3, 23–29
(1984); und P.W. Bergman et al., Science 227, 1490–1492 (1985))
und mit einer zweiten Kopie von CH3 coexprimiert
wird, die an ein M13-Gen-III-Protein
fusioniert ist. Eine Bibliothek von Hohlraum-Mutanten wurde in dieser
zweiten Kopie von CH3 geschaffen, und zwar
durch Randomisierung der Reste, die der Protuberanz auf der ersten
CH3-Domäne
am nächsten
lagen. Stabile Phagendisplay-CH3-Heterodimere
wurden dann unter Verwendung eines Anti-Flag-Ak eingefangen.
-
Eine
CH3-Phagendisplay-Bibliothek aus 1,1 × 105 unabhängigen
Klonen wurde durch Ersatz eines Segments des natürlichen CH3-Gens
mit einem PCR-Fragment erzeugt. Das Fragment wurde durch PCR-Amplifikation
unter Verwendung von degenerierten Primern erhalten, um die Positionen
366, 368 und 407 unter Verwendung von Standardverfahren zu randomisieren.
-
Nach
2 bis 5 Selektionsdurchgängen
betrug der Anteil aus Klonen voller Länge 90 %, 60 %, 50 % bzw. 10
%, wie durch eine Agarosegelelektrophorese einsträngiger DNA
gezeigt wurde. Phagemide, die Klone voller Länge enthielten, wurden nach
5 Selektionsdurchgängen
gelgereinigt. Zweitausend Transformanten wurden nach einer Retransformierung
von XL1-BLUETM-Zellen (Strategene) erhalten.
-
Durchschnittlich > 106 Kopien
jedes Klons wurden pro Panning-Durchgang verwendet. So war die Wahrscheinlichkeit
groß,
dass zahlreiche Kopien jedes Klons in der Bibliothek zur Selektion
zur Verfügung standen,
obwohl einige Deletionsmutanten während des Pannings auftraten.
-
Nach
7 Panning-Durchgängen
näherte
sich die CH3-Mutante einer Consensus-Aminosäuresequenz an
den randomisierten Resten. Praktisch alle Klone wiesen Serin oder
Threonin am Rest 366 auf, was auf eine sehr starke Präferenz für β-Hydroxyl an dieser
Stelle hinweist. Eine starke Präferenz
für hydrophobe
Reste wurde bei den Resten 368 und 407 beobachtet, wobei Valin und
Alanin vorherrschten. Sechs unterschiedliche Aminosäurekombinationen
wurden zumindest zweimal gefunden, einschließlich der Dreichfachmutante T366S:L368A:Y407V,
die elf Mal gefunden wurde. Keine dieser Phagenselektanden wies
die gleiche Sequenz auf wie ein schon früher hergestelltes Heterodimer,
T366W/Y407'A (J.B.B.
Ridgway et al., w.o. (1996)). Die Phagenselektanden können weniger
dicht gepackt sein als das Wildtyp-CH3-Homodimer,
wie durch eine Reduktion im gesamten Seitenkettenvolumen der Domänen-Schnittstellen-Reste
um 40–80 Å3 gezeigt wurde.
-
CH3-Varianten, für die das Expressionsplasmid
pAK19 kodiert (Carter et al. (1992)), wurden in den E.-coli-Stamm
33B6 eingeführt,
exprimiert und von E. coli sekretiert, das in einem Fermenter mit
hoher Zelldichte gezüchtet
worden war. Die durch DEAE-Sepharose-FF-, ABx- und Resource-S-Chromatographie
gereinigte T366S:L368A:Y407V-Mutante ergab nach einer SDS-PAGE eine
einzelne Hauptbande. Andere CH3-Varianten
wurden mit ähnlicher
Reinheit erhalten. Die Molekularmasse von Wildtyp-CH3
und T366S:L368A:Y407V-, T366W- und Y407A- Varianten, bestimmt durch hochauflösende Elektrospray-Massenspektrometrie,
war wie erwartet.
-
B. Stabilität von phagenselektierten
Heterodimeren
-
Die
Stabilität
von CH3-Heterodimeren wurde zuerst durch
Titrieren eines entsprechenden Phagen mit Guanidinhydrochlorid beurteilt,
gefolgt von einer Verdünnung
und Quantifizierung von restlichem Heterodimer durch enzymgekoppelte
Immunadsorptionsbestimmung (ELISA). Der Guanidinhydrochlorid-Denaturierungstest
mit CH3-Phage stellt ein Mittel zum raschen
Screenen von Selektanden dar.
-
Ein
Phage wurden nach 7 Selektionsdurchgängen aus einzelnen Klonen hergestellt,
und auch aus dem Kontrollvektor pRA1. Kurz gesagt wurden Phagemiden
in XL1-BLUETM verwendet, um 25 ml LB-Kulturlösung, die
50 μg/ml
Carbenicillin und 10 μg/ml
Tetracyclin enthielt, in Gegenwart von 109 pfu/ml
M13K07 zu inokulieren, und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (6.000 g, 10 min,
4°C) pelletiert.
Der Phage wurde aus dem Überstand
durch Fällung
mit 5 ml 20 % (Gew./Vol.) PEG, 2,5 M NaCl, gefolgt von einer Zentrifugation
(12.000 g, 10 min, 4°C)
gewonnen und in 1 ml PBS resuspendiert. 180 μl 0–6 M Guanidinhydrochlorid in
PBS wurden zu 20 μl
Phagenpräparat
zugesetzt und 5,0 min lang bei etwa 25°C inkubiert. Aliquoten (20 μl) jeder
Phagenprobe wurden dann 10fach mit Wasser verdünnt. Die Gegenwart eines CH3-Heterodimers wurde durch ELISA unter Verwendung
von 5B6-beschichteten Platten bestimmt, und der Phage wurde mit
einem polyklonalen Anti-M13-Ak detektiert, der an Meerrettichperoxidase
konjugiert war, und zwar unter Verwendung von o-Phenylendiamin als
Substrat. Die Reaktion wurden durch den Zusatz von 50 μl 2,5 M H2SO4 gequencht, und
das Absorptionsvermögen
wurde bei 492 nm gemessen. Die Absorptionsdaten wurden über die
Guanidinhydrochlorid-Konzentration während des Schmelzens geplottet
und durch die nichtlineare Methode der kleinsten Quadrate unter
Verwendung von Kaleidagraph 3.0.5 (Synergy Software) in ein 4-Parameter-Modell
eingepasst.
-
Das
am häufigsten
gefundene Heterodimer, T366W/T366'S:L368'A:Y407'V weist eine ähnliche Stabilität auf wie
andere phagenselektierte Heterodimere. Dieses phagenselektierte
Heterodimer ist deutlich stabiler als das entworfene Heterodimer
T366W/Y407'A, aber
weniger stabil als Wildtyp-CH3. Alle CH3-Varianten, sowohl einzeln als auch in
Kombination, stellten sich in einer Größenausschlusschromatographie
unter den Bedingungen, unter denen die gleichen Molekül durch
Kalorimetrie untersucht wurden (1,75 mg/ml, in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS)), als Dimere heraus. Die einzige Ausnahme war die T366S:L368A:Y407V-Mutante alleine,
die eine etwas kürzere
Rückhaltezeit
als CH3-Dimere aufwies.
-
Ein
1:1-Gemisch aus den Mutanten T366W, Protuberanz, und T366S:L368A:y407V,
Hohlraum, schmilzt mit einer einzigen Übergang bei 69,4°C, was im
Einklang mit dem Untereinheitenaustausch und der Bildung eines stabilen
Heterodimers steht. Im Gegensatz dazu ist das T366W-Protuberanz-Homodimer
viel weniger stabil als das T366W/T366'S:L368'A:Y407'V-Protuberanz-in-Hohlraum-Heterodimer
(ΔTm = –15,0°C). Die T366S:L368A:Y407V-Hohlraummutante
alleine neigt dazu, beim Erhitzen zu aggregieren, und durchläuft keinen
glatten Schmelzübergang.
-
Die
entworfene Hohlraum-Mutante Y407A schmilzt bei 58,8°C und 65,4°C, in Abwesenheit
bzw. Gegenwart der T366W-Protuberanz-Mutante. Das steht im Einklang
mit dem Untereinheitenaustausch und der Bildung eines T366W/Y407'A-Heterodimers, das stabiler ist als T366W-
(ΔTm = 11,0°C)
oder Y407A- (ΔTm = 6,6°C)
Homodimere. Das phagenselektierte Heterodimer T366W/T366'S:L368'A:Y407'V ist stabiler als
das entworfene Heterodimer T366W/Y407'A (ΔTm = 4,0°C),
aber weniger stabil als das Wildtyp-CH3-Homodimer (ΔTm = –11,0°C).
-
C. Multimerisation eines
phagenselektierten Antikörper-Immunadhäsins (Ak/Ia)
in vivo
-
Phagenselektierte
und entworfene CH3-Mutanten wurden in Bezug
auf ihre Fähigkeit
verglichen, die Bildung eines Ak/Ia-Hybrids, Anti-CD3/CD4-IgG, in
vivo zu steuern (Chamow et al., w.o. (1994)). Dies wurde durch Coexpression
von humanisierten Anti-CD3-Leicht- (L-) und -Schwerketten zusammen
mit CD4-IgG erreicht. Die Bildung von Heterodimeren und Homodimeren
wurde durch Protein-A-Reinigung, gefolgt von einer SDS-PAGE und
Laser-Scanning-Densitometrie beurteilt (Ridgway et al., w.o. (1996)).
Vergleichbare Ausbeuten des Ak/Ia-Hybrids wurden durch Cotransfektionen
erhalten, bei denen die Anti-CD3-Schwerkette die entworfene Protuberanz-Mutation,
T366W, enthielt und das Ia entweder die phagenselektierten Mutationen, T366S:L368A:Y407V,
oder entworfene Hohlraum-Mutationen, Y407A, enthielt (3).
-
Phagenselektierte
und entworfene CH3-Mutanten wurden dann
auf ihre Neigung beurteilt, Homodimere zu bilden. Die Protuberanzen-Mutation,
T366W, ist anscheinend sehr nachteilig für die Homodimerisierung, da
eine Cotransfektion von entsprechenden Antikörper-Schwer- und -Leichtketten
zu einem Überschuss
an HL-Monomeren (können
IgG ohne Disulfidbindung umfassen) im Vergleich zu IgG führt. Im
Gegensatz dazu befinden sich im gleichen Antikörper mit Wildtyp-CH3-Domänen IgG,
aber keine HL-Monomere. Die Hohlraum-Mutationen T366S:L368A:Y407V
wirken sich etwas negativ auf die Homodimerisierung aus, da eine Transfektion
des entsprechenden Phagemids zu einem Gemisch aus hauptsächlich Ia-Dimeren
mit einigen Ia-Monomeren führt.
Die Hohlraum-Mutation Y407A wirkt sich nur minimal nachteilig auf
die Homodimerisierung aus, wie durch die Gegenwart von Ia-Dimeren,
aber keiner Ia-Monomere nach der Transfektion des entsprechenden
Phagemids nachgewiesen wurde.
-
Die
hierin beschriebene Phagendisplay-Selektionsstrategie ermöglicht eine
Selektion zur Bevorzugung von CH3-Mutanten,
die stabile Heterodimere bilden, und zur Ausschließung von
Mutanten, die stabile Homodimere bilden. Die Gegenselektion zur Ausschließung von
Homodimeren findet statt, weil "freie" CH3-Mutanten
mit der Flag-CH3-Knobmutante um die Bindung an ein verfügbares CH3-Mutanten-Gen-III-Fusionsprotein konkurrieren. Die freien
CH3-Mutanten entstehen als Ergebnis der
Amber-Mutation zwischen dem natürlichen
CH3-Gen und einem M13-Gen III. In einem
Amber-Suppressor-Wirt, wie z.B. XL1-Blue, werden sowohl das CH3-Gen-III-Fusionsprotein als auch entsprechendes
freies CH3 sekretiert.
-
Guanidinhydrochlorid-Denaturierung
stellte sich als nützliches
Werkzeug zum Vorscreenen der Stabilität von CH3-Heterodimeren
auf einem Phagen heraus. Ein Phage behält Infektiosität für E. coli
auch bei, nachdem er 5 M Guanidinhydrochlorid ausgesetzt wurde (Figini
et al., J. Mol. Biol. 239, 68–78
(1994)). Somit kann Guanidin auch zur Steigerung der Stringenz der
Mutantenselektion nützlich
sein.
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Rationales
Design und Screenen von Phagendisplay-Bibliotheken sind komplementäre Ansätze zur Ummodellierung
einer Domänen-Schnittstelle
eines Homodimers, um eine Heterodimerisierung zu fördern. Im Falle
von CH3-Domänen identifizierten entworfene
Mutanten Domänen-Schnittstellen-Reste,
die zur Förderung
der Heterodimerisierung eingesetzt werden konnten. Phagendisplay
wurde dann verwendet, um Permutationen aus 3 Resten zu suchen, die
sich neben einer fixierten Protuberanz befanden, und zwar für Kombinationen,
die am effizientesten Heterodimere bildeten. Phagenselektanden sind
nützlich
zur Förderung
eines weiteren rationalen Redesigns der Domänen-Schnittstelle, während die
hierin beschriebene Phagen-Selektionsstrategie
ihre Nützlichkeit
bei der Ummodellierung von Protein-Protein-Schnittflächen zeigt.
-
Beispiel 4: Herstellung
und Anordnung von heteromultimeren Antikörpern oder Antikörper/Immunadhäsinen mit
gemeinsamen Leichtketten
-
Das
folgende Beispiel demonstriert die Herstellung eines heteromultimeren
bispezifischen Antikörpers mit
einer gemeinsamen Leichtkette gemäß der Erfindung und die Fähigkeit
dieses Antikörper,
seine Target-Antigene zu binden.
-
A. Identifikation von
Antikörpern
mit der gleichen Leichtkette: Vergleich von Antikörper-Bibliotheken
gegen elf Antigene
-
Eine
große
menschliche Einketten-Fv- (scFv-) Antikörper-Bibltiothek (Vaughan et
al., w.o. (1996)) wurde einem Panning für Antikörper unterzogen, die für elf Antigene
spezifisch waren, einschließlich
AxI (Human-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), GCSFR (Human-Granulozyten-Koloniestimulationsfaktor-ECD),
IgE (Mäuse-IgE),
IgE-R (Human-IgE-Rezeptor-α-Kette),
MPL (Human-Thrombopoietin-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), MusK (Human-muskelspezifische-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), NpoR (Human-Orphan-Rezeptor-NpoR-ECD),
Rse (Human-Rezeptor-Tyrosinkinase,
Rse, ECD), HER3 (Human-Rezeptor-Tyrosinkinasen-HER3/c-erbB3ECD), Ob-R (Human-Leptin-Rezeptor-ECD)
und VEGF (menschlicher Gefäßendothel-Wachstumsfaktor),
worin ECD für
die extrazelluläre
Domäne
steht. Die Nucleotid-Sequenz-Daten für scFv-Fragmente von Populationen
von Antikörpern,
die gegen jedes Antigen gebildet wurden, wurde translatiert, um
entsprechende Proteinsequenzen abzuleiten. Die VL-Sequenzen
wurden dann mithilfe des Programms "align" mit dem Algorithmus nach Feng und Doolittle
(1985, 1987, 1990) verglichen, um die prozentuelle Identität zwischen
allen paarweisen Kombinationen von Ketten zu berechnen (D.F. Feng
und R.F. Doolittle, J. Mol. Evol. 21, 112–123 (1985); D.F. Feng und
R.F. Doolittle, J. Mol. Evol. 25, 351–360 (1987); und D.F. Feng und
R.F. Doolittle, Methods Enzymol. 183, 375–387 (1990)). Die prozentuellen
Sequenzidentitätsergebnisse der
paarweisen Leichtketten-Aminosäure-Sequenzvergleiche
wurden im Matrixformat angeordnet (siehe Anhang).
-
Bei
den meisten paarweisen Vergleichen wurde zumindest eine gemeinsame
Leichtketten-Sequenz gefunden. Tabelle 5 zeigt einen Vergleich zwischen
den VL-Ketten, der die Häufigkeiten von scFv zeigt,
die identische Leichtketten (100 % Identität) aufweisen, wie durch eine
Anordnung von 117 VL-Aminosäuresequenzen
bestimmt wurde. Der Eintrag 4/9 (HER3 × Ob-R, in einem schwarzen
Kasten hervorgehoben) bedeutet beispielsweise, dass 4 HER3 bindende
Klone gefunden wurden, die ihre VL-Sequenz
mit einem oder mehreren Anti-Ob-R-Klonen teilten, während 9
den Ob- R-Teil bindende
Klone ihre VL-Sequenz mit einem oder mehreren
Anti-HER3-Klonen teilten. Die Einträge auf der Diagonalen stellen
die Anzahl an Antikörperklonen innerhalb
einer Population dar, die eine VL-Sequenz
mit einem oder mehreren Klonen in der Population teilen. Eine Untersuchung
der MPL-Klone zeigte beispielsweise 5 Klone auf, die ihre VL-Sequenz mit einem oder mehreren MPL-Klonen
teilten. In den Fällen,
in denen keine gemeinsame Leichtkettensequenz vorhanden war, wie
beispielsweise bei (IgE × AxI)
oder (NpoR × IgE-R),
war die Anzahl an Fragmenten, die für zumindest eine gemeinsame
Spezifität
verglichen wurden, sehr gering (5 oder weniger). Angesichts der
Anzahl an gefundenen gemeinsamen Leichtketten ist es wahrscheinlich,
dass bei jedem VL-Vergleich gemeinsame Leichtketten
gefunden werden können,
wenn eine ausreichende Zahl an Klonen verglichen wird.
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Die
Aminosäuresequenzen
von Leichtketten wurden untersucht, um die Positionen von Unterschieden der
Aminosäurereste
zu bestimmen, wenn die Sequenzidentität in Bezug auf eine gewählte gemeinsame Leichtkette
98 % und 99 % betrug. 4 zeigt einen Vergleich der
VL-Sequenzen von acht verschiedenen Antikörpern mit
Spezifitäten
für AxI
(Klon AxI.78), Rse (Klone Rse.23, Rse.04, Rse.20 und Rse.15), IgER
(Klon IgER.MAT2C1G11), Ob-R (Klone obr.4) und VEGF (Klone vegf.5).
Die Position der antigenbindenden CDR-Reste gemäß einer Sequenzdefinition (G.A.
Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (Chothia
und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen
bzw. # hervorgehoben. Leichtketten-Reste, die sich von der AxI.78-Sequenz
unterscheiden, sind doppelt unterstrichen. Von den 9 verglichenen
Leichtketten waren 6 identisch. Die Leichtketten von Rse.04 und
obr.4 (etwa 99 % Sequenzidentität)
unterscheiden sich durch einen Rest außerhalb der antigenbindenden
CDRs. Die Leichtkette von Rse.20 (etwa 98 % Sequenzidentität) unterschiedet
sich durch zwei Reste außerhalb
der antigenbindenden CDRs. Die Aminosäurerest-Änderungen können sich leicht oder gar nicht
auf die Antigenbindung auswirken. Somit macht die Sequenzähnlichkeit
dieser Leichtketten sie zu Kandidaten für die gemeinsame Leichtkette
der vorliegenden Erfindung. Alternativ dazu können gemäß der Erfindung solche Leichtketten
mit 98–99
% Sequenzidentität
mit der Leichtkette eines voraussichtlichen gepaarten scFv (AxI.78,
beispielsweise) durch die gepaarte Leichtkette ersetzt werden und
die Bindespezifität
beibehalten.
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B. Identifikation von
Antikörpern
mit der gleichen Leichtkette und Herstellung eines bispezifischen
Antikörpers mit
dieser Leichtkette: Anti-Ob-R/Anti-HER3
-
ScFv-Fragmente,
die einen menschlichen Leptin-Rezeptor (Ob-R) oder die extrazelluläre Domäne des HER3/c-erbB3-Genprodukts
(HER3) banden, wurden durch drei Panning-Durchgänge unter Verwendung einer
großen
menschlichen scFv-Phagen-Bibliothek
erhalten (Vaughan et al., w.o. (1996)). Leptin-Rezeptor-IgG und
HER3-IgG (10 μg
in 1 ml PBS) wurden verwendet, um separate Immunotubes (Nunc; Maxisorp) über Nacht
bei 4°C
zu beschichten. Dann wurde Panning und Phagenrettung durchgeführt, wie
sie von Vaughan et al, w.o. (1996), beschrieben wurden, und zwar
mit den folgenden Modifikationen. Ein humanisierter Antikörper, huMAb5D5-8
(P. Carter et al., PNAS USA 89, 4285–4289 (1992)), oder humanisiertes
Anti-IgE (L. Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993))
in einer Konzentration von 1 mg/ml wurde bei jedem Panning-Schritt inkludiert,
um einen Fc-bindenden Phagen zu absorbieren. Außerdem wurde auch Panning in
Lösung
(R.E. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)) verwendet, um
einen scFv-bindenden Leptin-Rezeptor zu identifizieren. Der Leptin-Rezeptor
wurde durch ortsspezifische Proteolyse vom Leptin-Rezeptor-IgG mit
der gentechnisch hergestellten Protease, Genenase (P. Carter et
al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989)),
gefolgt von Protein-A-Sepharose-Chromatographie, vom Fc getrennt.
Der Leptin-Rezeptor wurde biotinyliert und im ersten, zweiten und
dritten Panning-Durchgang in einer Konzentration von 100 nM, 25
nM bzw. 5 nM verwendet. Ein phagenbindendes biotinyliertes Antigen
wurde unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen
Kugeln (Dynabeads, Dynal, Oslo, Norwegen) eingefangen.
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Klone
aus dem Panning-Durchgang 2 und 3 wurden jeweils durch Phagen- und
scFv-ELISA gescreent, wobei das entsprechende Antigen und auch ein
Kontroll-Immunadhäsin oder
-Antikörper
verwendet wurden. Die Diversität
der Antigenpositiven Klone wurde durch PCR-Amplifikation des scFv-Inserts
unter Verwendung der Primer, von fdtetseq und PUC-Reverse (Vaughan
et al., w.o. (1996)) und durch Verdauung mit BstNI (Marks et al.,
w.o. (1991)) analysiert. Ein bis fünf Klone pro Bst-NI-Fingerprint wurden
dann unter Verwendung von fluoreszierenden Didesoxy- Kettenterminatoren
(Applied Biosystems) zyklisch sequenziert, wobei PCR-Schwerbindungs- und
myc-seq-10-Primer verwendet wurden (Vaughan et al., w.o. (1996)).
Die Proben wurden mithilfe eines Automated DNA Sequencer von Applied
Biosystems analysiert, und die Sequenzen wurden mithilfe von SegEd
analysiert. Es gilt auch anzumerken, dass die Guanidinhydrochlorid-Antikörper-Denaturierungs- und In-vitro-Ketten-Shuffling-Verfahren
nach Figini zusammen mit einer Phagendisplay-Selektion ein nützliches
Verfahren zur Selektion von Antikörpern mit der gleichen Leichtkette
ist (M. Figini et al., w.o. (1994)).
-
Unter
Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurden elf unterschiedliche
Anti-HER3-Klone und 18 Anti-Ob-R-Klone erhalten (11 vom Panning
unter Verwendung eines beschichteten Antigens und 7 vom Panning
mit einem biotinylierten Antigen). Die Klone wurde durch Standardverfahren
sequenziert, um die Sequenzen der Leichtketten in Zusammenhang mit
den einzelnen Bindedomänen
zu bestimmen (5). Die Sequenzen sind die
VH- und die gemeinsamen VL-Sequenzen
des Anti-Ob-R-Klons
26 und des Anti-HER3-Klons 18, die zur Herstellung eines bispezifischen
Antikörpers
verwendet wurden (siehe unten). Die Reste sind gemäß E.A. Kabat
et al., w.o. (1991), nummeriert. Die Position der antigenbindenden
CDR-Reste gemäß der Sequenzdefinition
(Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (C. Chothia
und A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen
bzw. Strichen darüber
hervorgehoben. Identität
zwischen Resten in den VH-Sequenzen ist durch
* markiert.
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Die
Sequenzen der Leichtketten wurden für multiple Anti-HER3-Klone
in Bezug auf multiple Anti-Ob-R-Klone verglichen (8 und
Tabelle 5). Es zeigte sich, dass vier von elf Anti-HER3-Klonen mit
einem oder mehreren Anti-Ob-R-Rezeptor-Klonen identische VL aufweisen. Umgekehrt weisen neun von achtzehn Anti-Ob-R-Klonen
die gleiche VL auf wie eines der Anti-HER3-Klone
(siehe Tabelle 5, schwarzer Kasten).
-
-
Die
Konstruktion von Anti-Ob-R/Anti-HER3, einem bispezifischen Antikörper mit
einer gemeinsamen Leichtkette, wurde wie folgt durchgeführt. Ein
erstes und zweites Polypeptid mit geändertem CH3
mit den komplementären
Protuberanzen und Hohlräumen
sowie den nicht natürlich
vorkommenden Disulfidbindungen zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid
wurden bei der Konstruktion einer Fc-hältigen bispezifischen Antikörpers verwendet.
Die VL eines Anti-Ob-R-Klons Nr. 26 und
eines Anti-HER3-Klons
Nr. 18, wobei die beiden Klone die gleiche Leichtkette aufweisen,
sowie die Schwerketten von jedem Antikörper wurden verwendet, um den
bispezifischen Antikörper
gemäß den hierin
offenbarten Verfahren herzustellen.
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Dieser
Antikörper
wies eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung im scheinbaren
Molekulargewicht im Vergleich zu einem bispezifischen Antikörper auf,
der sich nur dadurch unterschied, dass ihm Änderungen zur Bildung von nichtnatürlichen
Disulfidbindungen fehlten. Ein 8-%-SDS-PAGE-Gel mit heterodimeren Antikörper-Varianten mit und
ohne nicht natürlich
vorkommenden Disulfidbindungen zeigte eine Mobilitätsverschiebung
von einem scheinbaren MG von etwa 230 für ein Wildtyp-Heterodimer zu einem
scheinbaren MG von etwa 200 für
eine Heterodimer mit einer nichtnatürlichen Disulfidbindung auf.
Die MG-Verschiebung reichte aus, um den Prozentsatz jeder Variante
zu bestimmen, die erfolgreich die nichtnatürliche Disulfidbindung bildete.
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Die
Bindespezifität
des bispezifischen Antikörpers
für sowohl
Ob-R als auch HER3 wird durch herkömmliche ELISA-Verfahren getestet,
wie etwa das folgende Verfahren. Ob-R-Bindung wird in einem ELISA-Test
nachgewiesen, bei dem Ob-R als Ob-R-Ig-Fusionsprotein vorhanden ist. Das
Ob-R-Ig-Fusionsprotein wird auf ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte
aufgetragen, und der bispezifische Antikörper wird hinzugefügt.
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Der
Well wird mehrere Male gewaschen, um nichtspezifische Bindung an
Ob-R-Ig zu eliminieren. Als zweite Komponente im gleichen Test wird
ein biotinyliertes HER3-Ig-Fusionsprotein
zugesetzt und mithilfe eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplexes detektiert,
der an das biotinylierte HER3-Ig-Fusionsprotein band. Die Bindung
wird durch die Entstehung einer Farbänderung beim Zusatz von Wasserstoffperoxid
und einem TMB-Peroxidase-Substrat detektiert (Kirkegaard und Perry
Laboratories, Gaithersburg, MD, USA).
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Unter
den eben beschriebenen Bedingungen zeigt sich die Bindung eines
bispezifischen Antikörpers an
sowohl Ob-R-Ig als auch HER3-Ig als detektierbare Markierung, die
aufgrund der Bildung eines Komplexes, der immobilisiertes Ob-R-Ig/einen
bispezifischen Antikörper/HER3-Ig-Biotin/detektierbar
markiertes Streptavidin umfasst, auf der Oberfläche des Mikrotiter-Wells immobilisiert
ist. Antikörper,
die Ob-R-Ig, nicht
aber HER3-Ig binden, bilden den oben genannten Komplex nicht, was
zu einem negativen Ergebnis führt.
Auf ähnliche
Weise binden Antikörper,
die HER3-Ig, nicht aber Ob-R-Ig binden, den oben genannten Komplex
nicht und führen
ebenfalls zu einem negativen Ergebnis. Im Gegensatz dazu bildet
der bispezifische Antikörper,
von dem erwartet wird, dass er an sowohl Ob-R-Ig als auch HER3-Ig
bindet, den Komplex und führt
zu einem positiven Ergebnis in dem Test, was zeigt, dass der bispezifische
Antikörper
mit einer gemeinsamen Leichtkette sowohl HER3 als auch Ob-R bindet.
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Die
Expression und Reinigung des bispezifischen Anti-(Ob-R/HER3)-Antikörpers wurde
wie folgt durchgeführt.
Menschliche embryonale Nieren-293S-Zellen wurden mit drei Plasmid-DNAs
transfiziert, die jeweils unabhängig
voneinander für
eine Anti-Ob-R-Schwerkette,
eine Anti-HER3-Schwerkette oder die Leichtkette des Klons 26 oder
18, die in allen Antikörpern
gleich war, kodierten, wie oben beschrieben ist. Bei jeder Transfektion
betrug das Verhältnis
zwischen für
eine schwere Kette kodierender DNA und für eine leichte Kette kodierender
DNA 1:3, sodass die leichte Kette nicht auf die Anordnung eines
bispezifischen Anti-Ob-R/Anti-HER3-Antikörpers beschränkt ist.
Beide Schwerketten wurden in einem 1:1-Verhältnis zueinander transfiziert.
12 μg Gesamtplasmid-DNA
wurden dann in 293S-Zellen cotransfiziert, und zwar mithilfe von
Calciumphosphat-Fällung
(C. Gorman, DNA Cloning, Bd. II, S. 143, D.M. Glover, Hrsg., IRL
Press, Oxford (1985)). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, bevor
Wachstumsmedium zugesetzt wurde, das die Proteinexpression fördern sollte.
Fc-hältige
Proteine wurden unter Verwendung eines immobilisierten Pro teins
A (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) von Zellüberständen gereinigt und in PBS pufferausgetauscht.
Iodacetamid wurde zu einer Endkonzentration von 50 mM zu den Proteinpräparaten
zugesetzt, um ein erneutes Shuffling der Disulfidbindungen zu verhindern.
-
Als
weiteres Beispiel wurde wie folgt eine Expression und Reinigung
eines Anti-(CD3/CD4)-Antikörper/Immunadhäsins durchgeführt. Menschliche
embryonale Nieren-293S-Zellen wurden mit drei Plasmid-DNAs transfiziert,
wobei die Plasmide unabhängig
voneinander für
eine Anti-CD3-Leichtkette, eine Anti-CD3-IgG1-Schwerkette oder
ein Anti-CD4-IgG1-Immunadhäsin kodierten.
Bei jeder Transfektion betrug das Verhältnis zwischen für eine leichte
Kette kodierender DNA und für
eine schwere Kette kodierender DNA 3:1, sodass die leichte Kette
nicht auf die Anordnung von Anti-CD3-IgG beschränkt ist. Außerdem wurde, da das Immunadhäsin schlecht
exprimiert wurde, im Vergleich zum für eine Schwerkette kodierenden
Plasmid ein Überschuss
an für
Immunadhäsin
kodierendem Plasmid zugesetzt. Die getesteten Verhältnisse
reichten von 3:1:3 bis 8:1:3 für
Immunadhäsin:Schwerkette:Leichtketten-Phagemide.
Insgesamt wurden dann 10 μg
Plasmid-DNA in 293S-Zellen
cotransfiziert, und zwar mithilfe von Calciumphosphat-Fällung (C.
Gorman, w.o. (1985)), wobei die Zellen vor der Transfektion mit
PBS gewaschen wurden. Fc-hältige
Proteine wurden unter Verwendung eines immobilisierten Proteins
A (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) von Zellüberständen gereinigt und in PBS pufferausgetauscht.
Iodacetamid wurde zu einer Endkonzentration von 50 mM zu den Proteinpräparaten
zugesetzt, um erneutes Shuffling der Disulfidbindungen zu verhindern.
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In
jedem der oben genannten Präparate
wurden Proteinproben auf 8 % Polyacrylamid-Gelen (Novex) elektrophoresiert
und durch Färbung
mit Serva-Blau visualisiert. Die Gele wurden entfärbt, was
einen matten Hintergrund bei dem Versuch ergab, geringe Verunreinigungen
zu visualisieren und quantifizieren. Getrocknete Gele wurde mithilfe
des Scanning-Densitometers (GS-670, BioRad) gescannt, und Proteinprodukte
wurden mit der Software Molecular Analyst quantifiziert.
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Hierin
wurden nichtnatürliche
(gentechnisch hergestellte) Disulfidbindungen offenbart, die in
die CH3-Domäne eingeführt wurden, um die Heterodimerbildung
zu fördern.
Ein Paar von Polypeptiden, K392C/D399'C, förderte
die Heterodimerbildung, indem es bis zu 76 % Heterodimere bildete
(Tabelle 4, Variante v6). Wenn die Gegenwart einer Zwischenketten-Disulfidbindung
mit der Protuberanz-in-Hohlraum-Technik
kombiniert wurde, wurden ungefähr
95 % Heterodimere erhalten (Tabelle 4, Varianten v11, v12 und v16). Somit
erhöht
das Verfahren der Erfindung zur Steigerung spezifischer Protein/Protein-Wechselwirkung
zwischen einem ersten und zweiten Polypeptid eines bispezifischen
Antikörpers
die Ausbeute am gewünschten Heteromultimer
und minimiert die Bildung von ungewünschten Heteromultimeren oder
Homomultimeren.
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Ferner
ermöglicht
das Verfahren zur Charakterisierung der Produkt-Heteromultimere
durch elektrophoretische Mobilitätsanalyse
die Bestimmung der relativen Menge an gewünschten Heteromultimeren im
Vergleich zu ungewünschten
Produkten.
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Die
Selektion einer gemeinsamen Leichtkette, wie sie hierin beschrieben
ist, erhöht
die Ausbeute des gewünschten
Heteromultimers, indem die Möglichkeit
ausgeschlossen wird, dass es zu Fehlpaarungen zwischen variablen
Schwerketten und Leichtketten eines multispezifischen Antikörpers kommt.
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C. Identifikation von
Antikörpern
mit der gleichen Leichtkette und Konstruktion eines bispezifischen
Antikörpers mit
dieser Leichtkette: Anti-MpI/Anti-HER3
-
Die
Identifikation, Konstruktion und Expression eines weiteren bispezifischen
Antikörpers
gemäß der Erfindung
wird hierin demonstriert. Die in Teil A und B dieses Beispiels beschriebenen
Verfahren wurden auch zur Herstellung des bispezifischen Anti-MpI/Anti-HER3-Antikörpers verwendet.
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Unter
Verwendung der in Abschnitt A dieses Beispiels (Vergleich von Antikörper-Bibliotheken gegen elf
Antigene) beschriebenen Verfahren wurden die VH-
und VL-Aminosäuresequenzen
des Anti-HER3-scFv mit 23 scFv verglichen, die an den menschlichen
Thrombopoietin-Rezeptor c-MpI binden. Fünf der elf Anti-HER3-Klone
wiesen die gleiche VL-Aminosäuresequenz
auf wie ein oder mehrere MpI-bindende Klone. Umgekehrt wiesen sieben
von dreiundzwanzig Anti-MpI-scFv die gleiche VL auf
wie einer der Anti-HER3-Klone (siehe Tabelle 5, weißer Kasten).
Im Gegensatz dazu waren die VH-Aminosäuresequenzen
viel unterschiedlicher, wobei der Identitätsgrad zwischen einem beliebigen
Anti-MpI- und Anti-HER3-Klon bei 40 bis 99 % lag.
-
Das
Anti-MpI-scFv 12B5 (Genbank-Zugangsnummer AF048775; Seq.-ID Nr.
27) und der Anti-HER3-scFv-Klon H6 (Genbank-Zugangsnummer AF048774;
Seq.-ID Nr. 28) nutzen identische VL-Sequenzen
und stark unterschiedliche VH-Sequenzen.
Diese scFv-Fragmente wurden verwendet, um den bispezifischen Anti-MpI/Anti-HER3-IgG-Antikörper herzustellen,
der aufgrund der gemeinsamen Leichtkette sowie aufgrund der Verwendung
von Knob-in-Loch-Mutationen (hierin beschrieben) und einer gentechnisch
hergestellten Disulfidbindung zwischen den CH3-Domänen zu einer
effizienten Heterodimerisierung fähig war. Antikörper mit
der gleichen L-Kette wurden gewählt,
um das Problem der Paarung von L-Ketten mit nicht verwandten H-Ketten
zu umgehen. Zwei natürlich
vorkommende Gelenk-Region-Disulfidbindungen waren ebenfalls vorhanden.
Die gemeinsame L-Kette wurde mit den beiden H-Ketten cotransfiziert,
welche die CH3-Mutationen der Variante v11
enthielten. Die IgG-Produkte
wurden durch Protein-A-Affinitätschromatographie
gereinigt und durch SDS-PAGE unter Verwendung von Standardverfahren
analysiert.
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Das
Präparat
des bispezifischen IgG-Antikörpers
(BsIgG) ergab eine einzelne Hauptbande, die größere Mobilität aufwies
als IgG mit Wildtyp-CH3-Domänen. Diese
Steigerung der elektrophoretischen Mobilität stand im Einklang mit der
Bildung der gentechnisch hergestellten Disulfidbindung im BsIgG,
wodurch eine kompaktere Proteinspezies gebildet wurde.
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Die
Fähigkeit
des gentechnisch hergestellten Anti-MpI/Anti-HER3-BsIgG-Antikörpers, sowohl
MpI- als auch HER3-ECD-Antigene zu binden, wurde wie folgt mithilfe
eines ELISA bestimmt. Unter Verwendung von PBS-Puffer in allen Schritten
wurden ein zelne Wells einer 96-Well-Platte (Maxisorp, Nunc) über Nacht
mit 5 μg/ml
HER3-IgG oder MpI-IgG beschichtet, gewaschen und dann 1 h lang mit
0,5 % (Gew./Vol.) BSA blockiert. Die primären Antikörper waren Anti-MpI × Anti-HER3
BsIgG mit den Mutationen Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:S354'C und das entsprechende
parentale Anti-MpI- oder Anti-HER3-IgG mit mutierten Fc-Regionen.
Die primären
Antikörper
(1 μg/ml)
wurden einzeln 2 h lang bei 23°C
mit biotinyliertem HER3-IgG und einer 1:5000-Verdünnung eines
Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Boehringer Mannheim)
inkubiert und dann zu den Wells zugesetzt und eine weitere Stunde
bei 23°C
inkubiert. Peroxidaseaktivität
wurde laut den Anweisungen des Verkäufers (Kirkegaard und Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, USA) mit TMB-Reagenzien detektiert.
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Wie
erwartet band das Anti-MpI/Anti-HER3-BsIgG effizient und gleichzeitig
an MpI- und HER3-ECD-Antigene
einzeln als auch ein beide Antigene gleichzeitig. Im Gegensatz dazu
banden das parentale Anti-MpI und das parentale Anti-HER3-IgG nur
an ihr entsprechendes verwandtes Antigen (6).
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D. Antikörper, die
eine gentechnisch hergestellte Fc-Region enthalten sind zu einer
effizienten Antikörper-abhängigen zellvermittelten
Zytotoxizität
fähig
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Um
zu zeigen, dass die gentechnisch hergestellte Fc-Region (CH3-Mutationen, w.o.), die bei der Herstellung
der als Beispiele angeführten
bispezifischen Antikörper
der Erfindung verwendet wurde, zu einer effizienten Antikörper-abhängigen zellvermittelten
Zytotoxizität
(ADCC) fähig
ist, wurde der folgende Versuch durchgeführt.
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Die
CH3-Mutationen behielten die Fähigkeit
bei, eine effiziente Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)
beizubehalten, wie durch das Verfahren nach G.D. Lewis et al (G.D.
Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 255–263 (1993))
nachgewiesen wurde. Kurz gesagt wurden Zytotoxizitätstests
mit 51Cr-markierten
SK-BR-3- und HBL-100-Target-Zellen (ATCC-Zugangsnummern HTB-30 bzw.
45509) und menschlichen Lymphozyten des peripheren Bluts als Effektor- Zellen durchgeführt. Anders
als bei Lewis et al. wurden die Lymphozyten jedoch nicht mit IL-2
aktiviert.
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Die
CH3-Mutationen S354:T366W und Y349:T366S:L368A:Y407V
wurden separat in die H-Kette des humanisierten Anti-HER2-Antikörpers, huMAbDS-5,
hergestellt von Carter et al., eingeführt (P. Carter et al., PNAS
USA 89, 4285–4289
(1992)). Antikörper,
die umgeformte und Wildtyp-Fc-Regionen enthalten, wiesen eine ähnliche
Wirksamkeit in ADCC auf wie die HER2-überexprimierende Brustkrebs-Zelllinie
SK-BR-3 (7). Sowohl umgeformte als auch
Wildtyp-Antikörper
wiesen im. Vergleich zur normalen Brust-Epithel-Zelllinie geringe
Toxizität
auf. Die Wirkungen in der H-Kette sind unabhängig von den Bindedomänen, was
vermuten lässt,
dass diese BsIgGs in Antikörper-abhängiger zellvermittelter
Zytotoxizität
funktionieren.
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