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CN118215674A - 新颖白细胞介素-7免疫缀合物 - Google Patents

新颖白细胞介素-7免疫缀合物 Download PDF

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CN118215674A CN202280068244.6A CN202280068244A CN118215674A CN 118215674 A CN118215674 A CN 118215674A CN 202280068244 A CN202280068244 A CN 202280068244A CN 118215674 A CN118215674 A CN 118215674A
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L·科达里迪克
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C·克莱因
J·科尔
L·劳纳
E·莫斯纳
V·尼科利尼
C·舒伦堡
P·乌玛尼亚
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Abstract

本发明总体涉及突变型白细胞介素‑7多肽、免疫缀合物，特别地涉及包含突变型白细胞介素‑7多肽和与PD‑1结合的抗体的免疫缀合物。此外，本发明涉及编码所述突变型白细胞介素‑7多肽或所述免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述突变型白细胞介素‑7多肽、免疫缀合物的方法；包含所述突变型白细胞介素‑7多肽的药物组合物、包含所述免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。

Description

新颖白细胞介素-7免疫缀合物
技术领域
本发明总体涉及突变型白细胞介素-7多肽、免疫缀合物，特别地涉及包含突变型白细胞介素-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物。此外，本发明涉及编码突变型白细胞介素-7多肽或免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产突变型白细胞介素-7多肽或免疫缀合物的方法；包含突变型白细胞介素-7多肽的药物组合物、包含免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。
背景技术
白细胞介素-7(IL-7)是一种主要由淋巴组织中的基质细胞分泌的细胞因子。其例如通过刺激多能造血干细胞分化为淋巴母细胞来参与淋巴细胞的成熟。IL-7对于T细胞的发育和存活以及成熟T细胞的稳态至关重要。缺乏IL-7会导致未成熟的免疫细胞停滞(LinJ.等人(2017),Anticancer Res.37(3):963-967)。
IL-7与IL-7受体结合，该受体由IL-7Rα链(IL-7Rα，CD127)以及共同的γ链(γc，CD132，IL-2Rγ)构成，该共同的γ链为白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21所共有(Rochman Y.等人,(2009)NatRev Immunol.9:480–490)。γc由大多数造血细胞表达，而IL-7Rα几乎只由淋巴系细胞表达(Mazzucchelli R.和Durum S.K.(2007)Nat RevImmunol.7(2):144-54)。IL-7Rα在T细胞从初始细胞分化为效应细胞的整个过程中都存在于T细胞表面上，而其在终末分化的T细胞上的表达减少，并且几乎不存在于调节性T细胞表面上。IL-7RαmRNA和蛋白质表达水平受IL-2负调节，因此IL-7Rα在表达IL-2Rα(CD25)的最近活化T细胞中下调(Xue H.H,等人2002,PNAS.99(21):13759-64)，这种机制确保IL-2介导的最近始发T细胞的快速克隆扩增，而IL-7的作用是平等地维持所有T细胞克隆。IL-7Rα最近也在新表征的CD8 T细胞(即TCF-1+PD-1+干细胞样CD8 T细胞)前体群上进行了描述，该前体群发现于对PD-1阻断有反应的癌症患者的肿瘤中(Hudson等人,2019,Immunity 51,1043-1058；Im等人,PNAS,第117卷,第8期,4292-4299；Siddiqui等人,2019,Immunity50,195–211；Held等人,Sci.,Transl.Med.11；eaay6863(2019)；Vodnala和Restifo,Nature,第576卷,19/26 2019年12月)。尽管至今还没有关于IL-7对干细胞样CD8 T细胞的效应的科学描述，但IL-7可用于扩增这一肿瘤反应性T细胞群，以增加对检查点抑制剂有反应的患者的数量。
IL-7、IL-7Rα和γc形成三元复合物，其通过JAK/STAT(Janus激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT))通路以及PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白激酶B(AKT))信号级联发信号，导致B细胞和T细胞的发育和稳态(Niu N.和QinX.(2013)CellMol Immunol.10(3):187-189，Jacobs等人,(2010),J Immunol.184(7):3461–3469)。
IL-7是一种25kDa 4螺旋束的单体蛋白。螺旋长度从13个氨基酸到22个氨基酸不等，这与其他结合白细胞介素的共同γ链(γc，CD132，IL-2Rγ)的螺旋长度相似。然而，IL-7在A螺旋中显示出独特的转角基序，此显示可稳定IL-7/IL-7Rα相互作用(McElroy,C.A.等人,(2009)Structure17:54-65)。虽然A螺旋与受体链IL-7Rα和γc二者相互作用，但C螺旋主要与IL-7Rα相互作用，而D螺旋与γc链相互作用(基于PDB:3DI2和PDB:2ERJ进行序列和结构比对)。WO 2020/127377 A1和WO2020/236655A1中已经描述了具有降低异质性和/或降低亲和力/效力的修饰的变体IL-7。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)是CD28受体家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是细胞表面受体并且在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Okazaki等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等人(2003)JImmunol 170:711-8)。PD-1的结构是单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变样细胞外结构域和细胞质结构域组成，该细胞质结构域含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。已经鉴定出了PD-1的两种配体PD-L1和PD-L2，该两种配体已显示在与PD-1结合后使T细胞活化下调(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等人(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是与PD-1结合，而不与其他CD28家族成员结合的B7同源物。PD-1的一种配体PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(Dong等人(2002)Nat.Med 8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少，从而允许癌细胞的免疫逃避(Dong等人(2003)J.MoI.Med.81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，该效应是累加的(Iwai等人(2002)Proc.Nat 7.Acad.ScL USA 99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
与PD-1结合的抗体描述于例如WO 2017/055443 A1中。
发明内容
本发明提供了一种新方法，该方法经由突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的缀合，将针对免疫疗法具有有利特性的突变型形式的IL-7直接靶向至诸如细胞毒性T淋巴细胞之类的免疫效应细胞而非肿瘤细胞。这导致IL-7突变体顺式递送至表达PD-1的免疫亚群，尤其是肿瘤反应性T细胞，例如CD8+PD1+TCF+T细胞亚群和其后代。
本发明中使用的IL-7突变体已经被设计用于克服与细胞因子免疫疗法相关的问题，特别是由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受，以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制。除了如上所述避免肿瘤从肿瘤靶向逃逸之外，将IL-7突变体靶向至免疫效应细胞还可以进一步增加肿瘤特异性CTL相对于免疫抑制Treg细胞的优先活化，这是由于Treg上的PD-1和IL-7Rα表达水平比CTL低。通过使用与PD-1结合的抗体，由PD-1与其配体PD-L1相互作用诱导的T细胞活性抑制可以另外经逆转，从而进一步增强免疫反应。
在一个方面，本发明提供了一种突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽，其包含在根据SEQ ID NO:28的人IL-7的位置G85处的氨基酸取代，其中与包含SEQ ID NO:28的白细胞介素-7多肽相比，该氨基酸取代降低该突变型白细胞介素-7多肽对IL-7Rα的结合亲和力。在一个方面，突变型白细胞介素-7多肽包含氨基酸取代G85E。在进一步的方面，突变型白细胞介素-7多肽进一步包含在位置K81处的氨基酸取代。在另一方面，突变型白细胞介素-7多肽包含氨基酸取代K81E。
在一个方面，突变型白细胞介素-7多肽进一步包含在选自由T93和S118组成的组的位置中的至少一个氨基酸取代，其中与不具有所述氨基酸取代的突变型白细胞介素-7多肽相比，所述氨基酸取代降低该突变型白细胞介素-7多肽的糖基化。在一个方面，所述氨基酸取代选自T93A和S118A的组。在另一个方面，突变型白细胞介素-7多肽包含氨基酸取代T93A和S118A。
在又一个方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含：(i)如本文所述的突变型IL-7多肽和(ii)抗体。在一个方面，所述抗体与PD-1结合。在一个方面，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3和在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个方面，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，免疫缀合物包含不超过一种突变型IL-7多肽。
在另一个方面，抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一个方面，Fc结构域为IgG类，特别是IgG1亚类Fc结构域。在进一步的方面，Fc结构域为人Fc结构域。
在一个方面，抗体为IgG类，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一个方面，该Fc结构域包含促进该Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。在一个方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。在另一个方面，在Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；并且在Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在又进一步的方面，在Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，突变型IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处，任选地通过接头肽与Fc结构域的亚基中的一个亚基，特别是Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。在一个方面，接头肽具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在另一个方面，Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低与Fc受体、特别是Fcγ受体的结合，且/或降低效应子功能、特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)组成的组的一个或多个位置处。在一个方面，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与选自由SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ IDNO:39和SEQ ID NO:40组成的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，免疫缀合物基本上由通过接头序列接合的突变型IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。在另一个方面，免疫缀合物基本上由通过SEQ ID NO:19的接头接合的突变型IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
在一个方面，提供了一种或多种经分离的多核苷酸，该一种或多种经分离的多核苷酸编码本发明的突变型IL-7多肽或本发明的免疫缀合物。在一个方面，本发明提供了一种或多种载体，特别是表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸。在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的多核苷酸或载体。
在一个方面，提供了一种生产突变型IL-7多肽或包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物的方法，该方法包括：(a)在适合于表达本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物的条件下培养宿主细胞，以及任选地(b)回收该突变型IL-7多肽或该免疫缀合物。在一个方面，本发明提供了一种突变型IL-7多肽或包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其是通过所述方法生产的。
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物以及药用载体。
在一个方面，本发明提供了用作药物的本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物。
在一个方面，本发明提供了用于治疗疾病的本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物。在一个方面，所述疾病为癌症。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物用于制造供治疗疾病的药物的用途。在一个方面，所述疾病为癌症。
在一个方面，本发明提供了一种治疗个体的疾病的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含呈药用形式的本发明的突变型IL-7多肽或本发明的免疫缀合物。在一个方面，所述疾病为癌症。
在一个方面，本发明提供一种刺激个体的免疫系统的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的组合物，该组合物包含药用形式的本发明的突变型IL-7多肽或免疫缀合物。
附图说明
图1：IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个异二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的突变型IL-7多肽。
图2：PD1-IL7变体的N-糖基化谱(从Fc和IL7部分释放的N-聚糖)。实线迹线来自在稳定转化的CHO细胞中表达的变体，并且虚线迹线来自在瞬时转染的CHO细胞中表达的变体。PD1-IL7 VAR21在稳定转化的(A)和瞬时转染的(D)CHO细胞中完全地糖基化表达。PD1-IL7VAR21在稳定转化的(B)和瞬时转染的(E)CHO细胞中部分地糖基化表达。PD1-IL7VAR18/VAR21在稳定转化的(C)和瞬时转染的(F)CHO细胞中部分地糖基化表达。
图3A和图3B：用完全和部分糖基化的PD1-IL7 VAR21(图3A)以及完全和部分糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21(图3B)处理后，在共培养的PD1预阻断和PD1+CD4 T细胞中的IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描绘为暴露后12min后在共培养的PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中的STAT5-P T细胞的频率。对于完全和部分糖基化的PD1-IL7 VAR21，汇集了具有不同表达系统(瞬时和稳定表达)的两个不同生产批次的数据(平均值±SEM)。
图4：第一次和第二次皮下施用完全糖基化的PD1-IL7 VAR21、完全糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21和PD1-IL7wt后4小时和72小时后，人源化小鼠的血清中可检测到的呈药物浓度的暴露量。
图5A和图5B：与完全糖基化的PD1-IL7 VAR21相比，用参考分子5-8(图5A)和参考分子9-10(图5B)处理后在共培养的PD1预阻断和PD1+CD4 T细胞中的IL-7R信号转导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描绘为暴露后12min后在共培养的PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中的STAT5-P频率。3个供体的平均值±SEM。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是该最终构建体具有所需特征，例如减少的与IL-7Rα和/或IL-2Rγ的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。末端缺失的实例是全长人IL-7的位置1中的残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-7多肽的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替换。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，该解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
IL-7与IL-7受体结合，该受体由IL-7Rα链(在本文中也称为IL-7Ralpha、IL-7Rα、IL7Rα、IL-7a、IL7Ra或CD127)以及共同的γ链(在本文中也称为γc、CD132、IL-2Rgamma、IL-2Rg、IL2Rg、IL-2Rγ或IL2Rγ)构成，该共同的γ链为白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21所共有(Rochman Y.等人,(2009)Nat Rev Immunol.9:480–490)。
突变型或野生型IL-7多肽对IL-7受体的亲和力可以根据WO2012/107417中叙述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)之类的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人，NatureBiotechnol 18,1197-1202(2000))。可替代地，可以使用已知表达一种或另一种此类形式的受体的细胞系来评估IL-7突变体对IL-7受体的结合亲和力。下文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-7”或“IL-7”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL7，该脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-7以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-7。该术语还涵盖天然存在的IL-7变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-7的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:28中。
如本文所用的术语“IL-7突变体”或“突变型IL-7多肽”旨在涵盖各种形式的IL-7分子的任何突变形式，包括全长IL-7、截短形式的IL-7，以及IL-7与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-7使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-7分子。例如，全长人IL-7是指具有根据SEQ ID NO:28的多肽序列的分子。各种形式的IL-7突变体表征为具有至少一种影响IL-7与IL7Rα和/或IL2Rγ相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-7突变体在本文中可称为突变型IL-7肽序列、突变型IL-7多肽、突变型IL-7蛋白质、突变型IL-7类似物或IL-7变体。
本文中关于SEQ ID NO:28所示的序列进行了对各种形式的IL-7的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如，位置15处从缬氨酸到丙氨酸的突变可以表示为15A、A15、A15、V15A或Val15Ala。
如本文所用的“人IL-7分子”是指一种包含氨基酸序列的IL-7分子，该氨基酸序列与如SEQ ID NO:28所示的人IL-7氨基酸序列至少约90％、至少约91％，至少约有92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％，或至少约96％相同。特别地，序列同一性为至少约95％，更特别地至少约96％。在特定实施例中，人IL-7分子是全长IL-7分子。
如本文所用，“野生型”形式的IL-7是IL-7的一种形式，该野生型形式与突变型IL-7多肽在其他方面相同，不同之处在于野生型形式在突变型IL-7多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如，如果IL-7突变体是全长IL-7(即IL-7未与任何其他分子融合或缀合)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-7。如果IL-7突变体是IL-7与IL-7下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-7突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-7。此外，如果IL-7突变体是IL-7的截短形式(IL-7的非截短部分内的突变或修饰的序列)，则该IL-7突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-7。出于比较各种形式的IL-7突变体与相应的野生型形式的IL-7的IL-7受体结合亲和力、IL-7受体结合或生物活性的目的，术语野生型涵盖如下形式的IL-7，该形式包含与天然存在的天然IL-7相比不影响IL-7受体结合的一个或多个氨基酸突变。在根据本发明的某些实施例中，与突变型IL-7多肽相比较的野生型IL-7多肽包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指能够抑制其他T细胞的应答(称为外周耐受)的特殊类型的CD4+T细胞。Treg细胞表征为升高表达的IL-2受体(CD25)的α亚基、低表达或不存在IL-7Rα(CD127)和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，并且在诱导和维持对抗原(包括由肿瘤表达的抗原)的外周自身耐受性中起关键作用。如本文所用，术语“效应细胞”是指存活和/或稳态受IL-7影响的淋巴细胞群。效应细胞包括记忆CD4+和CD8+细胞以及最近始发的T细胞，包括肿瘤反应性干细胞样T细胞。
如本文所用，术语“PD1”、“人PD1”、“PD-1”或“人PD-1”(也称为程序性细胞死亡蛋白1，或程序性死亡1)是指人蛋白质PD1(SEQ ID NO:21，没有信号序列的蛋白质)/(SEQ IDNO:22，具有信号序列的蛋白质)。还参见UniProt登录号Q15116(第156版)。如本文所用，“与PD-1结合”、“与PD-1特异性地结合”、“结合至PD-1”的抗体或“抗PD-1抗体”是指一种抗体，该抗体能够以足够的亲和力结合PD-1，尤其是在细胞表面上表达的PD-1多肽，使得该抗体可用作靶向PD-1的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，抗PD-1抗体与不相关的非PD-1蛋白质的结合程度小于所测量的该抗体与PD-1的结合的约10％，例如通过放射性免疫测定(radioimmunoassay，RIA)或流式细胞术(flowcytometry，FACS)或通过使用生物传感器系统(诸如系统)进行表面等离子体共振测定法测定。在某些实施例中，结合至PD-1的抗体与人PD-1结合的结合亲和力的KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。在一个实施例中，使用人PD-1的细胞外结构域(Extracellular domain，ECD)(PD-1-ECD，参见SEQ ID NO:27)作为抗原，以表面等离振子共振测定法测定结合亲和力的KD值。
“特异性结合”意指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗体结合特定抗原(例如PD-1)的能力可以通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，该其他技术为例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析的)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。在一个实施例中，抗体与无关蛋白质的结合程度为该抗体与抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR所测量的。包含在本文所述的免疫缀合物中的抗体与PD-1特异性结合。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，该表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“经分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出经分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或实质上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列一致的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性％的值。FASTA程序包由以下撰写：W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for BiologicalSequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effectiveprotein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36，并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
术语“多核苷酸”是指经分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“经分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为经分离的。经分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。经分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子含有在通常含有多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。经分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括通过合成生产的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
“编码[例如本发明的免疫缀合物]的经分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链和/或IL-7多肽(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指通过重组或合成产生的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”是指用于将与其可操作地缔合的特定基因引入细胞中并且指导该特定基因在细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。表达载体在细胞内之后，就通过细胞转录和/或翻译机制生产由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，该表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全相同，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的免疫缀合物的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，该可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明的供使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“经分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离出的抗体，即不在其天然环境中的抗体。不需要特定的纯化水平。例如，可以从抗体的天然或自然环境中取出经分离的抗体。在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或者部分或基本上纯化的天然或重组抗体也被认为是出于本发明的目的而分离的。如此，分离出本发明的免疫缀合物。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法确定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2，双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology ofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基并且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文所述。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteinsof ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式是那些抗体，其中相对于原始抗体，恒定区已经经额外的修饰或改变以产生根据本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C末端的一个或多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后裂解。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包含本发明的免疫缀合物群体。该免疫缀合物群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子。该免疫缀合物群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的该免疫缀合物具有经切割的变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，该免疫缀合物包含这样的重链，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，该免疫缀合物包含这样的重链，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，这种组合物包含免疫缀合物群体，该免疫缀合物群体由以下分子构成：包含这样的重链的分子，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基；包含这样的重链的分子，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)；以及包含这样的重链的分子，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中该修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
当关于抗体使用时，术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，该等生物活性随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)，以及B细胞激活。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO2012/130831)。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
“降低的结合”，例如降低的与Fc受体或CD25的结合，是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR所测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包含至少一种IL-7分子和至少一种抗体的多肽分子。IL-7分子可以通过各种相互作用和以如本文所述的各种构型与抗体连接。在特定实施例中，IL-7分子通过肽接头与抗体融合。根据本发明的特定免疫缀合物基本上由通过一个或多个(一种或多种)接头序列接合的一个(一种)IL-7分子和一个(一种)抗体组成。
“融合”是指组分(例如抗体和IL-7分子)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
如本文所用，关于Fc结构域亚基等的术语“第一”和“第二”用于方便当存在多于一个类型的部分时进行区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予免疫缀合物特定次序或取向。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式使得包含在其中的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
实施例的具体描述
突变型IL-7多肽
根据本发明的IL-7变体具有用于免疫疗法的有利特性。
根据本发明的突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含至少一个氨基酸突变，该至少一个氨基酸突变降低突变型IL-7多肽对IL-7受体的α-亚基和/或IL-2Rγ亚基的亲和力。
对IL-7Rα和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力的人IL-7(hIL-7)的突变体可以例如通过氨基酸位置81或85或其组合处的氨基酸取代产生(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:28进行编号)。示例性氨基酸取代包括K81E和G85E。在一个实施例中，根据本发明的突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含在根据SEQ ID NO:28的人IL-7的位置G85处的氨基酸取代。在一个实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸取代G85E。在另一实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含在根据SEQ ID NO:28的人IL-7的位置K81和G85处的氨基酸取代。在一个实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含根据SEQID NO:28的氨基酸取代K81E和G85E。
根据本发明的突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽可以包含至少一个提高多肽同质性的氨基酸突变，该至少一个突变优选在氨基酸位置93和118或其组合中的一者处。示例性氨基酸取代包括T93A和S118A。在一个实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽进一步包含氨基酸取代T93A和S118A。在一个实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含氨基酸取代G85E、T93A和S118A。在一个实施例中，突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽包含氨基酸取代K81E、G85E、T93A和S118A。
在本发明的一些实施例中，突变型白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变型白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变型白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变型白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。本发明的具体IL-7突变体包含选自以下的组的氨基酸突变：根据SEQ ID NO:28的人IL-7的K81E、G85E、T93A和S118A。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ INNO:30的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQID NO:31的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。这些突变体展现与野生型形式的IL-7突变体相比，对白细胞介素7受体的亲和力显著降低。
与在PD1-IL-7免疫缀合物中时主要以反式(在细胞邻近处)递送的野生型IL-7相比，如本文公开的IL-7突变体的其他特征包括对IL-7Rα的亲和力降低，以允许PD-1介导的在表达PD-1的CD4 T细胞上顺式(在同一细胞上)递送IL-7。
在某些实施例中，所述氨基酸突变使突变型IL-7多肽与IL-Rα和/或IL-2Rγ的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。
降低IL-7对IL-7Rα和/或IL-2Rγ的亲和力与消除IL-7的N-糖基化的组合产生了具有改善性质的IL-7蛋白质。例如，当突变IL-7多肽在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时，消除N-糖基化位点导致更均质的产物。IL-7的N-糖基化位点的消除可以通过在对应于人IL-7的残基72、93或118的位置处的氨基酸突变来实现。
因此，在某些实施例中，突变型IL-7多肽包含另外的氨基酸突变，该另外的氨基酸突变消除了在与人IL-7的残基93或118对应的位置处的IL-7的N-糖基化位点。在一个实施例中，消除与人IL-7的残基93或118对应的位置处的IL-7的N-糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T93A。在另一具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代S118A。在另一具体实施例中，突变型IL-7多肽包含氨基酸取代T93A和S118A。在某些实施例中，突变型IL-7多肽基本上是全长IL-7分子。在某些实施例中，突变型IL-7多肽是人IL-7分子。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:28的IL-7多肽相比，突变型IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:28序列，该至少一个氨基酸突变降低突变型IL-7多肽对IL-7Rα的亲和力。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:28的IL-7多肽相比，突变型IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:28序列，该至少一个氨基酸突变降低突变型IL-7多肽对IL-7Rα或IL-2Rγ的亲和力。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQID NO:28的IL-7多肽相比，突变型IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:28序列，该至少一个氨基酸突变降低突变型IL-7多肽对IL-7Rα和IL-2Rγ的亲和力。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:28的IL-7多肽相比，突变型IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:28序列，该至少一个氨基酸突变降低突变型IL-7多肽对IL-7Rα和/或IL-2Rγ的亲和力。
在一个具体实施例中，突变型IL-7多肽仍可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种：T淋巴细胞的增殖、始发T淋巴细胞的效应子功能、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、通过活化T细胞或NK细胞进行的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如SEQ ID NO:28的人IL-7序列)相比，突变型IL-7多肽包含不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个，或不超过5个氨基酸突变。在一个特定实施例中，与相应的野生型IL-7序列(例如如SEQ ID NO:28所示的人IL-7氨基酸序列)相比，突变型IL-7多肽包含不超过5个氨基酸突变。
免疫缀合物
如本文所述的免疫缀合物包含IL分子和抗体。此类免疫缀合物通过直接靶向IL-7(例如进入肿瘤微环境)而显著增加IL-7疗法的功效。根据本发明，包含在免疫缀合物中的抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白，或其具有生物学功能(诸如抗原特异性结合亲和力)的部分或变体。
免疫缀合物治疗的一般益处是显而易见的。例如，包含在免疫缀合物中的抗体识别肿瘤特异性表位并导致免疫缀合物分子靶向肿瘤部位。因此，可以将高浓度的IL-7递送到肿瘤微环境中，从而使用比未缀合的IL-7所需的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文提及的多种免疫效应细胞的活化和增殖。然而，IL-7免疫缀合物的该特征可能再次加重IL-7分子的潜在副作用：由于IL-7免疫缀合物在血流中的循环半衰期相对于未缀合的IL-7显著延长，因此IL-7或融合蛋白分子的其他部分活化通常存在于脉管系统中的组分的可能性增加。同样的问题适用于含有与另一部分(诸如Fc或白蛋白)融合的IL-7的其他融合蛋白，会导致循环中IL-7的半衰期延长。因此，包含如本文所述的突变型IL-7多肽的免疫缀合物与IL-7的野生型形式相比具有降低的毒性是特别有利的。
如上所述，将IL-7直接靶向免疫效应细胞而不是肿瘤细胞可为对IL-7免疫疗法有利。
因此，本发明提供了如先前所述的突变型IL-7多肽以及与PD-1结合的抗体。在一个实施例中，突变型IL-7多肽和抗体形成融合蛋白，即突变型IL-7多肽与抗体共享肽键。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一个具体实施例中，突变型IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过接头肽进行融合。在一些实施例中，抗体为全长抗体。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个此类实施例中，突变型IL-7多肽与免疫球蛋白重链中的一个重链共享氨基末端肽键。在某些实施例中，抗体是抗体片段。在一些实施例中，抗体是Fab分子或scFv分子。在一个实施例中，抗体是Fab分子。在另一个实施例中，抗体是scFv分子。免疫缀合物还可包含多于一个(一种)抗体。当免疫缀合物中包含多于一个抗体，例如第一抗体和第二抗体时，各抗体可以独立地选自各种形式的抗体和抗体片段。例如，第一抗体可以是Fab分子，并且第二抗体可以是scFv分子。在一个具体实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是scFv分子，或者所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者与PD-1结合。
免疫缀合物形式
示例性的免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2011/020783中，该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗体。因此，在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物包含如本文所述的突变型IL-7多肽，以及至少第一抗体和第二抗体。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体独立地选自由以下项组成的组：Fv分子，特别是scFv分子；以及Fab分子。在一个具体实施例中，所述突变型IL-7多肽与所述第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗体与i)突变型IL-7多肽或ii)第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个特定实施例中，免疫缀合物基本上由通过一个或多个接头序列接合的突变型IL-7多肽以及第一抗体和第二抗体(特别是Fab分子)组成。这种形式具有以下优点：它们以高亲和力与靶抗原(PD-1)结合，但仅提供与IL-7受体的单体结合，从而避免将免疫缀合物靶向至在除了靶位点以外的其他位置处的携带IL-7受体的免疫细胞。在一个特定实施例中，突变型IL-7多肽与第一抗体，特别是第一Fab分子共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与突变型IL-7多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与第一突变型IL-7多肽共享氨基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享羧基末端肽。在一个特定实施例中，突变型IL-7多肽与第一重链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二重链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，突变型IL-7多肽与第一轻链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二轻链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键与突变型IL-7多肽接合，并且还通过氨基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键与突变型IL-7多肽接合，并且还通过羧基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在一个实施例中，突变型IL-7多肽与第一Fab重链或轻链共享羧基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一Fab重链或轻链与突变型IL-7多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在其他实施例中，第一Fab重链或轻链与突变型IL-7多肽共享氨基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物包含与一个或多个scFv分子共享氨基末端肽键，并且还与一个或多个scFv分子共享羧基末端肽键的突变型IL-7多肽。
然而，根据本发明的免疫缀合物的特别合适的形式包括免疫球蛋白分子作为抗体。此类免疫缀合物形式描述于WO 2012/146628中，该专利全文以引用方式并入本文。
因此，在一个特定实施例中，免疫缀合物包含如本文所述的突变型IL-7多肽和与PD-1结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别是IgG1分子。在一个实施例中，免疫缀合物包含不超过一种突变型IL-7多肽。在一个实施例中，免疫球蛋白分子是人。在一个实施例中，免疫球蛋白分子包含人恒定区，例如人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白包含人Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，突变型IL-7多肽与免疫球蛋白分子共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物基本上由以下组成：通过一个或多个接头序列接合的突变型IL-7多肽和免疫球蛋白分子、特别是IgG分子，更特别是IgG1分子。在一个具体实施例中，突变型IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过接头肽进行融合。
突变型IL-7多肽可以直接或通过接头肽与抗体融合，该接头肽包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)。接头肽是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n接头肽。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，接头肽的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在进一步的实施例中为10至50个氨基酸。在一个特定实施例中，接头肽的长度为15个氨基酸。在一个实施例中，接头肽为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在进一步的实施例中，x＝4并且n＝3，在进一步的实施例中，x＝4，n＝2并且m＝4。在特定实施例中，接头肽为(G4S)2G4(SEQ ID NO:19)。在一个实施例中，接头肽具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列(或由其组成)。替代的接头肽包含根据SEQID NO:20的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变型IL-7分子和与PD-1结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子，其中突变型IL-7分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:19所示的接头肽与免疫球蛋白重链中的一者的羧基末端氨基酸融合。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变型IL-7分子和与PD-1结合的抗体，其中该抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域，并且突变型IL-7分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:19所示的接头肽与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
PD-1抗体
包含在本发明的免疫缀合物中的抗体与PD-1，特别是人PD-1结合，并且能够将突变型IL-7多肽引导至表达PD-1的靶位点，特别是表达PD-1的T细胞，例如与肿瘤相关的T细胞。
可用于本发明的免疫缀合物中的合适的PD-1抗体描述于WO2017/055443A1中，该专利的全部内容以引用方式并入本文。
本发明的免疫缀合物可以包含可以与相同或不同抗原结合的两个或更多个(两种或更多种)抗体。然而，在特定实施例中，这些抗体中的每一者都与PD-1结合。在一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体是单特异性的。在一个特定实施例中，免疫缀合物包含单一的单特异性抗体，特别是单特异性免疫球蛋白分子。
抗体可以是保持与PD-1，特别是人PD-1特异性结合的任何类型的抗体或其片段。抗体片段包括但不限于Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子。然而，在特定实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白，特别是IgG类、更特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一些实施例中，抗体包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的FR-H3、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、和在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包括：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、以及含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包含重链可变区(VH)，其包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该抗体包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQID NO:14的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一个实施例中，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ IDNO:26(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，抗体包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区可以包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
Fc结构域
在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的免疫缀合物包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，该结构域包含S228位的氨基酸取代(Kabat EU索引编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列在SEQ ID NO:23中给出。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的免疫缀合物包含突变型IL-7多肽，特别是单个(不超过一个)突变型IL-7多肽，该突变型IL-7多肽与Fc结构域的该两个亚基中的一个或另一个亚基融合，由此该Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高免疫缀合物的产率和纯度，因此将有利的是在抗体的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰，该修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定实施例中，在包含在该免疫缀合物中的抗体的Fc结构域的该第一亚基的该CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在该第一亚基的该CH3结构域内产生突起，该突起可定位在该第二亚基的该CH3结构域内的空腔中，并且在该Fc结构域的该第二亚基的该CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在该第二亚基的该CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的该CH3结构域内的该突起可定位在该空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)的CH3结构域中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)的CH3结构域中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施例中，在Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替换或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替换(特别地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换(根据Kabat的EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些实施例中，Fc结构域的第二亚基另外包含氨基酸取代H435R和Y436F(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定实施例中，突变型IL-7多肽与Fc结构域的第一亚基(包含“突出物”修饰)融合(任选地，通过接头肽进行融合)。不希望受理论束缚，突变型IL-7多肽与Fc结构域的含有突出物的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个突变型IL-7多肽的免疫缀合物的产生(两个含有突出物的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中，替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的一个优选实施例是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述抗体在包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，更优选D399K和E356K)。在另一实施例中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸取代(所有根据KabatEU索引编号)。
在又一实施例中，替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予免疫缀合物有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致免疫缀合物不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，该细胞因子释放与IL-7多肽和免疫缀合物的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。因此，在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)基本上不与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的抗体相比，包含工程化的Fc结构域的抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含所述非工程化形式的所述Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的包含在本发明的免疫缀合物中的抗体可表现出这种亲和力的大于约80％并且甚至大于约90％。在某些实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种的降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的抗体)诱导的ADCC的小于20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，该Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，该进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在特定实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变型Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据KabatEU索引编号)。在另一个实施例中，IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat的EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327处的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变型Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域，或包含Fc结构域的抗体的效应子功能，可以通过本领域已知的方法来测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J ExpMed 166,1351-1361(1987)中。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含该Fc结构域的抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO2013/120929)。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽是包含氨基酸取代G85E(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:28编号)的人IL-7分子；并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽是包含氨基酸取代K81E和G85E(相对于人IL-7序列SEQ IDNO:28编号)的人IL-7分子；并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽是包含氨基酸取代G85E、T93A和S118A(相对于人IL-7序列SEQID NO:28进行编号)的人IL-7分子；并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽是包含氨基酸取代K81E、G85E、T93A和S118A(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:28进行编号)的人IL-7分子；并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中该突变型IL-7多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，并且其中该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在根据本发明上述方面中任一方面的一个实施例中，抗体是IgG类免疫球蛋白，该IgG类免疫球蛋白包含包括第一亚基和第二亚基的人IgG1 Fc结构域，
其中在该Fc结构域的该第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在该Fc结构域的该第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)，并且其中进一步地，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。在此实施例中，突变型IL-7多肽可以在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:19所示的接头肽与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:37的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:38的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:39的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:40的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的免疫缀合物或其片段的经分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明免疫缀合物的多核苷酸可以表达为编码完整免疫缀合物的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗体的轻链部分可以由来自包含抗体的重链部分和突变型IL-7多肽的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫缀合物。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和突变型IL-7多肽的免疫缀合物部分可以由来自包含该两个Fc结构域亚基中的另一个亚基的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，经分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整免疫缀合物。在其他实施例中，经分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的免疫缀合物中的多肽。
在一个实施例中，本发明的经分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的重链(例如免疫球蛋白重链)和突变型IL-7多肽。在另一个实施例中，本发明的经分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的轻链。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可用本领域中熟知的遗传或化学方法通过缺失、取代、插入或修饰来制备可用于本发明中的突变型IL-7多肽。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。天然人IL-7的序列示出于SEQ IDNO:28中。取代或插入可涉及天然和非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，诸如添加糖基化位点或碳水化合物附接等。
本发明的免疫缀合物可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码免疫缀合物(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有免疫缀合物(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至该表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的DNA模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，该附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N末端融合的信号肽，该信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产该多肽的分泌或“成熟”形式。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记免疫缀合物的DNA可包含在免疫缀合物(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明免疫缀合物的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织内所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。表达与抗体的重链或轻链融合的突变型IL-7多肽的细胞可以经工程化以便也表达该抗体链中的另一条抗体链，使得表达的突变型IL-7融合产物是具有重链或轻链两者的抗体。
在一个实施例中，提供了生产根据本发明的免疫缀合物的方法，其中该方法包括在适于表达免疫缀合物的条件下培养包含一种或多种编码如本文所提供的免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收免疫缀合物。
在本发明的免疫缀合物中，突变型IL-7多肽可以与抗体基因融合，或者可以与抗体化学缀合。IL-7多肽与抗体的基因融合可经设计以使得IL-7序列直接与多肽融合或通过接头序列间接与多肽融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。本文描述了特定的接头肽。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。另外，IL-7融合蛋白也可以使用本领域熟知的多肽合成方法(例如Merrifield固相合成)来化学合成。突变型IL-7多肽可以使用熟知的化学缀合方法与其他分子(例如抗体)化学缀合。双官能交联剂(诸如本领域熟知的同官能和异官能交联剂)可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于与IL-7偶联的分子的性质，并且可以由本领域技术人员容易地鉴定。可替代地或另外，突变型IL-7和/或其预期缀合的分子可以化学衍生化，使得突变型IL-7和/或其预期缀合的分子两者可以在单独的反应中缀合，这也是本领域中熟知的。
本发明的免疫缀合物包含抗体。生产抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold SpringHarbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。免疫缀合物、抗体及其生产方法也详细描述于例如PCT公开号WO 2011/020783、WO 2012/107417和WO2012/146628中，这些PCT公开各自以引用方式整体并入本文。
任何动物物种的抗体均可以用于本发明的免疫缀合物中。可用于本发明的非限制性抗体可以是鼠、灵长类或人源的。如果免疫缀合物旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，该各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，该架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，该转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，该全部或部分人免疫球蛋白基因座替换内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，以及描述技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
如本文所述，还可以通过从人抗体文库中分离来产生人抗体。
可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离可用于本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，HumanPress,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编辑，HumanPress,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全部集合通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从该噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review ofImmunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods in MolecularBiology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
可能需要对本发明的免疫缀合物进行进一步的化学修饰。例如，通过与基本上直链的聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))缀合，可以改善免疫原性和短半衰期的问题(参见例如WO 87/00056)。
如本文所述制备的免疫缀合物可通过本领域已知的技术纯化，该技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，可以使用特异性结合突变型IL-7多肽的抗体。对于本发明免疫缀合物的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。例如，基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫缀合物。免疫缀合物的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，该各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
组合物、配方和施用途径
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的免疫缀合物的药物组合物，该药物组合物例如用于任何以下治疗方法。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及药用载体。在另一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的免疫缀合物的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的免疫缀合物，以及(b)用至少一种药用载体配制该免疫缀合物，由此配制免疫缀合物制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用载体中的治疗有效量的免疫缀合物。短语“药物或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容，含有免疫缀合物和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990所例示，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，此类类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，该载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些组合物。对于注射，本发明的免疫缀合物可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，免疫缀合物可以是粉末形式，以用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)重构。通过根据需要将本发明的免疫缀合物以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，该真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外地，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质呈例如膜或微胶囊的成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，免疫缀合物还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，免疫缀合物可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明免疫缀合物的药物组合物可通过常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，这些载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
免疫缀合物可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的任何突变型IL-7多肽和免疫缀合物可用于治疗方法。本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物可特别用于治疗对宿主免疫系统的刺激是有益的疾病状态，特别是需要增强的细胞免疫应答的病状。这些疾病状态可包括宿主免疫应答不足或缺乏的疾病状态。可以施用本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物的疾病状态包含例如细胞免疫应答应是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物可以本身或以任何合适的药物组合物形式施用。
在一个方面，提供了用作药物的本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物。在其他方面，提供了用于治疗疾病的本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物。在某些实施例中，提供了用于治疗方法的本发明的突变型IL-7多肽和免疫缀合物。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的免疫缀合物，以用于治疗有需要的个体的疾病。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的突变型IL-7多肽，以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供突变型IL-7和免疫缀合物以用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向个体施用治疗有效量的免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在其他实施例中，本发明提供免疫缀合物以用于刺激免疫系统。在某些实施例中，本发明提供突变型IL-7和/或免疫缀合物以用于刺激个体的免疫系统的方法中，该方法包括向个体施用有效量的免疫缀合物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了本发明的突变型IL-7和/或免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，该药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在一个实施例中，该药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有该疾病的个体施用治疗有效量的该药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一实施例中，该药物用于刺激免疫系统。在另一实施例中，该药物用于刺激个体的免疫系统的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该药物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了治疗个体疾病的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的突变型IL-7和/或免疫缀合物。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，该组合物包含药用形式的本发明的突变型IL-7和/或免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一方面，本发明提供了刺激个体的免疫系统的方法，该方法包括向该个体施用有效量的突变型IL-7和/或免疫缀合物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病，特别是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的免疫缀合物治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌和膀胱癌。技术人员容易认识到，在许多情况下，免疫缀合物可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的免疫缀合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的免疫缀合物施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的免疫缀合物施用于个体以治疗疾病。
为预防或治疗疾病，本发明的免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、分子的类型(例如包含或不包含Fc结构域)、疾病的严重程度和病程、免疫缀合物是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对免疫缀合物的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
免疫缀合物适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的免疫缀合物可以是用于施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独的施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。免疫缀合物的一个示例性剂量应在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的免疫缀合物)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的免疫缀合物将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的免疫缀合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
可以单独地调节剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况下，免疫缀合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的免疫缀合物将通常在不会引起实质毒性的情况下提供治疗益处。免疫缀合物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，该治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的免疫缀合物是优选的。在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，该多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人，1975，在：ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的免疫缀合物治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
包含如本文所述的突变型IL-7多肽的免疫缀合物的最大治疗剂量可以相对于用于包含野生型IL-7的免疫缀合物的最大治疗剂量增长。
其他药剂和治疗
根据本发明的免疫缀合物可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用免疫缀合物的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。免疫缀合物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且该容器可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的免疫缀合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有组合物，其中该组合物包含本发明的免疫缀合物；以及(b)第二容器，该第二容器中含有组合物，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施例中的制品可以进一步包括包装插页，该包装插页指示这些组合物可以用于治疗特定病症。替代性地或另外地，该制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
氨基酸序列
关于IL-7的氨基酸序列
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
根据本发明的免疫缀合物的示例性形式如图1中的示意图所示。IgG-IL7免疫缀合物包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、异二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的突变型IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50的氨基酸序列的多肽构成。
针对示例性形式所提供的序列涉及具有IL-7野生型序列的免疫缀合物。然而，如本文公开的任何突变型IL-7多肽可以以所述形式而非野生型IL-7并入。
实例1
实例1.1PD1-IL7v融合蛋白的生产和分析
如表1中的抗体IL7变体(IL7v)融合构建体生产于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：单体含量测定(通过分析尺寸排阻色谱法)和主峰百分比(通过以下非还原毛细管SDS电泳测定：CE-SDS)。
表1：所测PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列
在CHO细胞中产生IgG样蛋白质。使用摇瓶培养物或使用补料分批发酵工艺来产生本文描述的一些抗体IL7融合构建体。通过在成分确定的无血清培养基中瞬时转染ExpiCHO-STM细胞来进行摇瓶培养重组生产。为了生产抗体IL7变体融合构建体，将细胞与含有各别免疫球蛋白重链和轻链的质粒共转染。对于转染，使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(gibco)。在转染后10-12天收获细胞培养上清液。对于补料分批发酵，使用专有的载体系统，用于在悬浮适应的CHO K1细胞中稳定表达蛋白质。在自动化微型生物反应器中，使用罗氏公司(Roche)专有的化学成分确定的细胞培养基和补料，在补料分批发酵过程期间通过转染细胞池表达蛋白质。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获上清液。
IgG样蛋白质的纯化。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：PBS pH 7.4；洗脱缓冲液：100mM乙酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15；产品编号：UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析。根据Pace等人,Protein Science,1995,4,2411-1423，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数通过测量280nm处的吸光度来确定纯化的蛋白质的浓度。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在25运行缓冲液(200mM KH2PO4、250mM KCl pH 6.2)中平衡的分析尺寸排阻柱(BioSuite High Resolution)通过HPLC色谱法进行聚集含量的确定。
表2：通过分析尺寸排阻色谱法(SEC)测定单体产物峰，并且通过非还原CE-SDS测定主产物峰。
结果。PD1-IL7变体构建体通过蛋白A和尺寸排阻色谱法纯化。纯化材料的质量分析揭示，通过分析尺寸排阻色谱法分析所测量，单体含量高于85％(表2)。通过非还原毛细管电泳测得，主产物峰>70％(表2)。总之，所有PD1-IL7变体都以高质量形式生产。
实例1.2其他PD1-IL7v融合蛋白(参考分子5、7和8)的生产和分析
如表3中所述的抗体IL7变体融合构建体生产于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：单体含量测定(通过分析尺寸排阻色谱法)和主峰百分比(通过以下非还原毛细管SDS电泳测定：CE-SDS)。参考分子5、7和8包含如WO 2020/127377A1中所公开的IL7部分。它们与本文公开的其他融合构建体具有相同的形式，即包含一个与PD-1抗体的N末端融合的IL7部分(图1)。
表3：所测PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列
克隆。使用常规(非基于PCR的)克隆技术将相应的cDNA克隆到evitria的载体系统中。Evitria载体质粒是基因合成的。基于阴离子交换色谱法，在低内毒素条件下制备质粒DNA。DNA浓度是通过测量260nm波长处的吸收来确定的。通过桑格测序验证序列的正确性(每个质粒进行两次测序反应)。
在CHO细胞中产生IgG样蛋白质。本文所述的抗体IL7融合构建体由Evitria使用其专有的载体系统利用常规的(非基于PCR的)克隆技术并且使用悬浮适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮培养中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获上清液。
IgG样蛋白质的纯化。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从经过滤的细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15；产品编号：UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析。根据Pace等人,Protein Science,1995,4,2411-1423，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数通过测量280nm处的吸光度来确定纯化的蛋白质的浓度。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(PerkinElmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mMKCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SWXL或UP-SW3000,Tosoh Bioscience)在25℃通过HPLC色谱进行聚集含量的确定。
表4：通过分析型尺寸排阻色谱法(SEC)确定单体产物峰、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)副产物。
表5：通过非还原CE-SDS测定的主产物峰。
PD1-IL7变体 ID 主峰(％)
参考分子5 P1AF9647-027 99.11
参考分子7 P1AF9649-012 91.7
参考分子8 P1AF9650-004 94.54
结果。纯化的PD1-IL7变体构建体通过ProteinA和尺寸排阻色谱法纯化。在CE-SDS分析之前，用PNGaseF对参考分子7进行去糖基化，以获得均质峰。纯化材料的质量分析揭示，通过分析型尺寸排阻色谱法分析，单体含量超过94％(表4)，并通过非还原毛细管电泳，主产物峰在91％与99％之间(表5)。总之，所有PD1-IL7变体都以高质量形式生产。
实例1.3其他PD1-IL7v融合蛋白(PD1-IL7wt，参考分子6、9和10)的生产和分析
如表6中所述的抗体IL7变体融合构建体生产于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：单体含量测定(通过分析尺寸排阻色谱法)和主峰百分比(通过以下非还原毛细管SDS电泳测定：CE-SDS)。参考分子6包含如WO2020/127377A1中所公开的IL7部分。参考分子9和10包含如WO2020/236655A1中所公开的IL7部分。它们与本文公开的其他融合构建体具有相同的形式，即包含一个与PD-1抗体融合的IL7部分(图1)。
表6：测试的PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列。
克隆。所有基因的表达都受人CMV启动子的控制。
在CHO K1细胞中产生IgG样蛋白质。本文所述的抗体由WuXiBiologics使用其专有载体系统利用常规(非基于PCR的)克隆技术并使用悬浮适应的CHO K1细胞制备。对于生产，WuXi Biologics使用市售的化学确定的培养基，并在以下条件下在转染后培养细胞：36.5C+6％二氧化碳。
通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获上清液，并且通过标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
滴度确定(PA-HPLC)。在具有UV检测器的Agilent HPLC系统上，通过蛋白A–HPLC对上清液中的含Fc构建体进行定量。将上清液注入POROS20A(Applied Biosystems)。对280nm处的洗脱峰面积进行积分，并通过使用校准曲线利用在同一运行中分析的标准物转换为浓度。
IgG样蛋白质的纯化。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，通过蛋白A-亲和色谱法从细胞培养物上清液中纯化含Fc的蛋白质。洗脱之后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15；产品编号：UFC903096)浓缩蛋白质，并通过尺寸排阻色谱法(Pure&HiLoad 26/600Superdex 200；均来自Cytiva，以前称为GEHealthcare)在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析。根据Pace等人,Protein Science,1995,4,2411-1423，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数通过测量280nm处的吸光度来确定纯化的蛋白质的浓度(Little Lunatic，以前称为Dropsense16；Unchained labs)。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用分析型尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL)在25℃下通过HPLC色谱法确定聚集体含量。
表7：通过分析型尺寸排阻色谱法(SEC)确定单体产物峰、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)副产物。
表8：通过非还原CE-SDS测定的主产物峰。
结果。纯化的PD1-IL7变体构建体通过蛋白A和尺寸排阻色谱法纯化。在CE-SDS分析之前，用PNGaseF对参考分子9进行去糖基化，以获得均质峰。纯化材料的质量分析揭示，通过分析尺寸排阻色谱法分析，单体含量高于93％(表7)，并通过非还原毛细管电泳测得，主产物峰在95％与99％之间(表8)。总之，所有PD1-IL7变体都以高质量形式生产。
实例1.4通过对释放的寡糖进行2-AB-标记以及HILIC色谱法分析N-聚糖模式
表9：分析设置
表10：分析样品中与PD1抗体Fc部分和IL7部分连接的N聚糖
将200μg的每个样品填充到离心装置10K中。通过3次离心直至几乎干燥并每次重新填充350μL，来将缓冲液更换为消化缓冲液(10mM甲酸铵pH 8.6)。最终离心步骤后，加入48μL消化缓冲液、2μL N-糖苷酶F(PNGase F，不含甘油，Roche，目录号11 365185 001)和20μL胰蛋白酶溶液(于重悬缓冲液中为1,0mg/mL，Prozyme V511B)并在NanoSep单元中于37℃孵育16-18小时(过夜)。通过流通离心将从Fc部分和IL7部分释放的N-连接的寡糖从NanoSep单元收集到1.5mLEppendorf螺帽管中。根据供应商的说明，使用Signal 2-AB-plus标记试剂盒(Prozyme GKK-804)对释放的N-聚糖进行2-AB标记(注意：反应必须在暗处进行)。为了清洁2-Ab标记的N-聚糖，通过在Glyko清洁台上施加真空(将未使用的孔用密封塞条堵塞)用1mL水之后用1mL 96％(v/v)乙腈进行平衡来制备HyperSep-96二醇小柱。将2-AB标记的N-聚糖样品与1mL 96％(v/v)乙腈混合，并装载到经平衡的HyperSep-96二醇小柱上，并施加极低真空。用3×0.75mL 96％(v/v)乙腈洗涤小柱，并将样品从HyperSep-96二醇小柱转移至2ml离心装置中。加入100μL 20％(v/v)乙腈/水并使得渗透约2-3分钟。通过流通离心(5000rcf下约2min)(或在Glyko清洁台上通过真空)洗脱聚糖，并用96％乙腈(v/v)按1:1稀释用于色谱分析。将10μL的每个寡糖样品装载到HILIC-BEH聚糖柱上，应用如下色谱参数进行分离：
柱温：60℃
洗脱液系统：洗脱液A：100mM甲酸铵，pH 4.5
洗脱液B：100％乙腈缓冲液A
自动进样器温度：10℃
检测(Dionex-UPLC)：荧光(λex＝330nm；λem＝420nm)
灵敏度：6
数据收集速率：5.00Hz
响应时间：2
梯度：
时间[min] 流速[ml/min] 洗脱液A[％] 洗脱液B[％]
0 0.5 25 75
50 0.5 46 54
51 0.25 100 0
55 0.25 100 0
56 0.25 25 75
56.1 0.5 25 75
65 0.5 25 75
结果。PD1-IL7变体生成为含有所有天然N-糖基化序列子(N70、N91和N116)的完全糖基化版本(完全糖基化的PD1-IL7-VAR21[P1AG3724])和仅含有一个天然N-糖基化序列子N70并且具有突变的序列子N91和N116的部分糖基化版本(部分糖基化的PD1-IL7-VAR21[P1AG3725]和部分糖基化的PD1-IL7-VAR18/VAR21[P1AG3727])。PD1-IL7-VAR21的两个版本在IL7的氨基酸序列中表现出相同的G85E突变，但在氨基酸序列中可能被N连接的二醇结构占据的N-糖基化位点的数量不同。使用以附加型载体瞬时转染的CHO细胞或通过稳定整合的表达载体转化的CHO细胞，在表达系统中鉴定出另一潜在变量。这两个变量都可能对糖基化模式产生影响(图2)。糖基化的总体程度受IL-7部分中可用的N-糖基化位点的数量的影响。相较于具有突变的N-糖基化位点的变体(部分糖基化；图2，A-C)，以所有N-糖基化位点完全糖基化的PD1-IL7 VAR21显示出更强烈的复杂唾液酸化聚糖信号。N-糖结构的类型可能受到表达模式的影响。在稳定转染的CHO细胞中表达的PD1-IL7批次在IL7部分处显示出大量复杂的唾液酸化双、三、四和五触角N-聚糖，而来自瞬时表达的批次可能仅具有极少的复杂唾液酸化结构，但主要是中性聚糖，或甚至没有聚糖连接到IL7(图2A-C与E-F)。因此，指示“完全糖基化”或“部分糖基化”并不一定反映分子的有效糖基化状态，而是用于描述N-糖基化序列子的存在情况。糖基化的程度和/或类型似乎并不影响IL7与IL7受体的结合特性，如实例2和实例3中所示。
实例2
实例2.1PD1-IL7变体对人IL7受体的亲和力确定
表11：SPR运行参数
SPR实验在Biacore 8K上以HBS-EP+1mg/ml BSA作为运行缓冲液进行。抗P329G Fc特异性抗体(Roche internal)通过胺偶联直接固定在C1芯片(Cytiva)上。PD1-IL7构建体在5nM下被捕获140s。使一式三份(对于P1AG3727-083为一式两份)的来自2.34至300nM人IL7Ra-IL2Rg-Fc异二聚体的2倍连续稀释系列以30μl/min通过配体240秒，以记录缔合相。监测解离相持续800s，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。在每个循环后使用两次10mM甘氨酸pH 2注射60sec，使芯片表面再生。通过减去在参考流动池(仅含有固定的抗P329G Fc特异性IgG)上获得的响应来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biacore评估软件(Cytiva)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。
分析以下PD1-IL7变体与IL7受体的结合(表12)。
表12：被分析与IL7受体结合的样品的描述。
PD1-IL7变体 ID 浓度[g/l]
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.4
PD1-IL7-VAR21(完全糖基化) P1AG3724-183 1.25
PD1-IL7-VAR21(部分糖基化) P1AG3725-153 2.14
PD1-IL7-VAR18/VAR21(部分糖基化) P1AG3727-083 1.14
参考分子5 P1AF9647-027 0.76
参考分子6 P1AF9648-033 2.5
参考分子7 P1AF9649-012 1.35
参考分子8 P1AF9650-004 3.81
参考分子9 P1AG8273-001 2.5
参考分子10 P1AG8275-001 2.3
样品名称分析物 TAPIR ID 浓度[g/l]
人IL7Rα-IL2Rγ-Fc生物素 P1AF4984-007 1.43
结果。比较PD1-IL7变体和参考分子与人IL7受体的结合(表13)。PD1-IL7变体对IL7受体的亲和力是使用与人Fc融合的IL7受体α链和共同IL2受体γ链的胞外结构域的重组异二聚体确定的。
表13：PD1-IL7变体与人IL7受体的结合：在25℃下通过表面等离子共振确定的亲和力常数。一式三份(对于P1AG3727-083为一式两份)的平均值，括号内为标准差。
完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7-VAR21以10-20nM之间的亲和力与人IL7受体结合，而部分糖基化的PD1-IL7-VAR18/VAR21则以约120nM的亲和力(其低6至12倍)结合。参考分子5、8和9对人IL7受体具有较高的亲和力(约0.6至0.9nM)，并且参考分子6和10与完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7-VAR21接近，亲和力分别为10nM和5nM。参考分子7在这些条件下几乎不结合并且被认为是无活性的。
结论.在完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7-VAR21和部分糖基化的PD1-IL7-VAR18/VAR21中引入IL7中的突变导致与人IL7受体的亲和力降低，部分糖基化的PD1-IL7-VAR18/VAR21的亲和力范围比PD1-IL7-VAR21构建体低6至12倍。
实例2.2PD1-IL7变体对人IL7受体的亲和力确定
通过SPR进行的亲和力测量在不同日期重复多次，并且对于每次测量，所测量的KD值在一定范围内变化。表14是不同测量值的概述。所有测量均使用与上述设置相同的设定进行，仅芯片是可变的(始终为C1型芯片)。
表14：来自不同表达系统的PD1-IL7变体与人IL7受体的结合。分析：日期、重复次数和芯片标识符。如果n>1：括号内为平均值和标准差。IL7糖基化：Fc部分和/或IL-7部分处的复杂唾液酸化N-糖基化的含量：++高含量，+中等含量，o低含量。
结果。如以上实例1.4中所述，糖基化的总体程度受到IL-7部分中可用的N-糖基化位点的数量以及表达模式产生的糖结构的类型的影响。
尽管糖基化存在差异，但完全糖基化的PD1-IL7-VAR21和部分糖基化的PD1-IL7-VAR21二者都显示出与IL7R在同一数量级上始终相当的亲和力(表14)。KD值从4.7nM到23.7nM不等，平均值为15nM，并且与野生型IL7相比(KD平均值为0.5nM)，亲和力降低。糖基化的程度和/或类型并不影响IL7与IL7受体的结合特性。
实例3
实例3.1用增加剂量的PD1-IL7变体处理后激活的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在以下实验中，在顺式靶向和STAT5-P效力信号传导测定方面比较了完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7分子，以评估糖基化模式是否影响突变型IL-7通过IL-7受体在PD-1+和PD-1-T细胞上的信号传导强度。为此目的，在将如先前所述分离、激活和共培养的PD1+和PD1-(经抗PD1预处理的)CD4 T细胞暴露于浓度增加的糖基化和部分糖基化的PD1-IL7VAR21或部分糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21后，在这些细胞上测量IL7R信号传导。为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并在存在1μg/ml板结合抗CD3(过夜预包被，克隆物OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆物CD28.2，#302923，BioLegend)抗体的情况下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收获细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。然后，将细胞分成两组，其中一组与饱和浓度的抗PD1抗体(内部分子，10μg/ml)在RT一起孵育30min。在进行几个洗涤步骤以去除过量未结合的抗PD-1抗体之后，将经抗PD1预处理和未经处理的细胞(50μl，4*106个细胞/ml)接种至V底板，随后在37℃用增加浓度的PD1-IL7变体(50μl，1:10稀释级，最高浓度为66nM)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体一起孵育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow固定缓冲液I(100μl,557870,BD)。然后将细胞在37℃再孵育30min，然后在80℃用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)透化过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆物，562076，BD)在4℃将磷酸化形式的STAT-5染色30min。这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BDBioscience)获得的。使用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并使用GraphPad Prism标绘。
图3A和图3B以及表15中的数据显示了PD1-IL7wt、完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7 VAR21以及部分糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21在PD-1+和PD-1预阻断的CD4 T细胞上的效力差异。在PD1+CD4 T细胞上测量的效力反映了IL-7的PD1依赖性和独立递送的组合。相反，在PD1预阻断的CD4 T细胞上的效力测量代表了IL-7的PD1独立性递送，因为所有PD1结合位点都被占据以阻止PD-1结合。
表15：来自健康供体的PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞上所选突变体的剂量响应STAT-5磷酸化效力的EC50、顺式活性和降低倍数。
表15中每个PD1-IL7变体的IL-7的PD1依赖性和独立性递送之间的顺式活性关系通过将PD-1预阻断细胞的EC50除以PD1+T细胞的EC50来计算。当细胞表达相同水平的IL-7Ra/共同γ链时，这提供了每种PD1-IL7构建体的IL-7的PD1依赖性递送强度的测量。
PD1-IL7wt充当对照，以显示天然IL-7和独立于PD-1的IL-7向PD-1-T细胞递送的效力。此外，在表15中，PD1-IL7变体与PD1-IL7wt之间的EC50倍数降低通过将PD1-IL7变体的EC50除以PD1-IL7wt的EC50来计算。这表明由于对IL-7Ra的亲和力降低，PD1-IL7 VAR18/VAR21的效力丧失。
PD1-IL7 VAR21的糖基化模式并不影响其在PD-1+T细胞上的活性，部分糖基化的变体仍与完全糖基化的变体一样有效，同时显示出高顺式活性，在PD-1-T细胞上的活性降低77-100倍，与之相比，PD1-IL7wt的活性降低2.79倍(图3A和表15)。对于完全糖基化和部分糖基化的PD1-IL7 VAR21构建体的数据，汇集了两个不同样品批次的数据。一批使用稳定表达系统(P1AG3724-183和P1AG3725-153)生产，而另一批则使用瞬时表达系统(P1AG3724-083和P1AG3725-083)生产。如以上实例1.4中所述，不同批次显示出不同的糖基化水平。批次之间的低标准差进一步表明糖基化模式并不影响IL7活性。
相较于PD1-IL7wt和PD1-IL7 VAR21，部分糖基化的PD1-IL7VAR18/VAR21虽然效力较差且最大活性降低，但在PD-1-T细胞上几乎失活，表明利用PD-1的强顺式介导的递送(图3B和表15)。如体内研究所证明，这对于减少IL-7组分并因此减少PD1-IL7 VAR18/VAR21的外周汇集(peripheral sink)而言是有益的。用PD1-IL7wt、完全糖基化的PD1-IL7 VAR21或完全糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21对非荷瘤人源化小鼠进行皮下处理两次，并同样在第一次处理和第二次处理后的4小时和72小时后采血，以测量小鼠血清中的药物暴露。完全糖基化的PD1-IL7wt和PD1-IL7 VAR21在处理后的最初几个小时内迅速从血清中清除，而完全糖基化的PD1-IL7 VAR18/VAR21在72小时后仍可在血清中检测到，并在第二次给药后累积(图4)。进一步降低IL-7对IL-7R的亲和力可能会带来额外的益处，如更宽的治疗窗以及能够通过给药克服由于抗药物抗体造成的暴露损失。
实例3.2用增加剂量的参考分子与PD1-IL7VAR21相比处理后激活的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在此实验中，将PD1-IL7参考分子5-10(通过将IL-7变体与用于PD1-IL7 VAR21的相同阻断性PD1结合剂融合而产生)的顺式靶向和STAT-5P信号传导效力与完全糖基化的PD1-IL7 VAR21进行比较。为此，在将细胞暴露于浓度增加的免疫靶向细胞因子后，在如先前所述分离、激活和共培养的PD1+和PD1-(抗PD1预处理的)CD4 T细胞上测量IL7R信号传导。
尽管参考分子5和参考分子9的效力比完全糖基化的PD1-IL7 VAR21强9.4倍和7.3倍，但这两种参考分子也显示出在PD-1-T细胞上的活性，仅比在PD-1+细胞上的活性低2倍和2.5倍，表明独立于PD-1的IL-7变体递送类似于实例3.2中已针对PD1-IL7wt观察到的情况。当与PD-1+T细胞相比时，仅参考分子6和参考分子10显示出在PD-1-T细胞上的活性分别降低32倍和20倍，从而支持了PD-1介导的IL-7R激动作用的顺式递送，然而完全糖基化的PD1-IL7 VAR21显示出降低39倍的活性(表16、图5)。此外，参考分子10的效力比完全糖基化的PD1-IL7 VAR21低2.2倍。
表16：来自健康供体的PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞上所选突变体的剂量响应STAT-5磷酸化效力的EC50、顺式活性和降低倍数。
***
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实例相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。

Claims (44)

1.一种突变型白细胞介素-7(IL-7)多肽，其包含在根据SEQ ID NO:28的人IL-7的位置G85处的氨基酸取代，其中与包含SEQ ID NO:28的白细胞介素-7多肽相比，所述氨基酸取代降低所述突变型白细胞介素-7多肽对IL-7Rα的结合亲和力。
2.根据权利要求1所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述氨基酸取代为G85E。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述突变型白细胞介素-7多肽进一步包含在位置K81处的氨基酸取代。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述突变型白细胞介素-7多肽包含氨基酸取代K81E。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述突变型白细胞介素-7多肽进一步包含在选自T93和S118的组的位置中的至少一个氨基酸取代，其中与不具有所述氨基酸取代的突变型白细胞介素-7多肽相比，所述氨基酸取代降低所述突变型白细胞介素-7多肽的糖基化。
6.根据权利要求5所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述氨基酸取代选自由T93A和S118A组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的突变型白细胞介素-7多肽，其中所述突变型白细胞介素-7多肽包含所述氨基酸取代T93A和S118A。
8.一种免疫缀合物，其包含：(i)根据权利要求1至7中任一项所述的突变型IL-7多肽，和(ii)抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述抗体与PD-1结合。
10.根据权利要求8或9所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3和在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含不超过一个突变型IL-7多肽。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
15.根据权利要求14所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域为IgG类，特别是IgG1亚类Fc结构域。
16.根据权利要求14或15所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域为人Fc结构域。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体为IgG类，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
21.根据权利要求20所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的免疫缀合物，其中所述突变型IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处，任选地通过接头肽与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基，特别是所述Fc结构域的所述第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
23.根据权利要求22所述的免疫缀合物，其中所述接头肽具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
25.根据权利要求24所述的免疫缀合物，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)的组的一个或多个位置处。
26.根据权利要求14至25中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
27.根据权利要求8至26中任一项所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQID NO:33的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:34的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与选自由SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40组成的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
28.根据权利要求8至27中任一项所述的免疫缀合物，其基本上由通过接头序列接合的突变型IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
29.根据权利要求8至28中任一项所述的免疫缀合物，其基本上由通过SEQ ID NO:19的接头接合的突变型IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
30.一种或多种经分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29中任一项所述的免疫缀合物。
31.一种或多种载体，特别是表达载体，所述载体包含根据权利要求30所述的多核苷酸。
32.一种宿主细胞，其包含根据权利要求30所述的多核苷酸或根据权利要求31所述的载体。
33.一种生产突变型IL-7多肽或包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物的方法，所述方法包括(a)在适合于表达所述突变型IL-7多肽或所述免疫缀合物的条件下培养根据权利要求32所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述突变型IL-7多肽或所述免疫缀合物。
34.一种突变型IL-7多肽或包含突变型IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其通过根据权利要求33所述的方法生产。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7或34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物以及药用载体。
36.根据权利要求1至7或34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物，其用作药物。
37.根据权利要求1至7或34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物，其用于治疗疾病。
38.根据权利要求37所述的用于治疗疾病的突变型IL-7多肽或免疫缀合物，其中所述疾病为癌症。
39.根据权利要求1至7或34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述疾病为癌症。
41.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据权利要求1至7或34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病为癌症。
43.一种刺激个体的免疫系统的方法，其包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据权利要求1至7和34中任一项所述的突变型IL-7多肽或根据权利要求8至29或34中任一项所述的免疫缀合物。
44.如前所述的本发明。
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