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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Einkapselung von Zellen in Agarose
und Kollagen, gefolgt von Beschichten mit Agarose, therapeutische
Verfahren, welche die Zellmaterialien verwenden, und die Herstellung
davon.
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Hintergrund und Stand der
Technik
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Die
Einkapselung von verschiedenen biologischen Materialien in biologisch
kompatiblen Materialien ist eine Technik, die während einiger Zeit verwendet
worden ist, wenn auch mit beschränktem
Erfolg. Beispiele für
den Stand der Technik sind
US
Patent Nr. 5,227,298 (Weber et al.);
5,053,332 (Cook et al.);
4,997,443 (Watthall et al.);
4,971,83 (Larsson et al.);
4,902,295 (Watthall et al.);
4,798,786 (Tice et al.);
4,673,566 (Goosen et al.);
4,647,536 (Mosbach et al.);
4,409,331 ();
4,392,909 (Lim);
4,352,883 (Lim) und
4,663,286 (Tsang et al.). Ebenfalls
von Interesse ist die parallele Anmeldung Nr.
08/483,738 von Jain et al, eingereicht
am 7. Juni 1995. Jain et al., diskutiert in gewisser Ausführlichkeit
das Einkapseln von sekretorischen Zellen in verschiedenen biokompatiblen
Materialien. Wie darin diskutiert, sind sekretorische Zellen Zellen,
die biologische Produkte sezernieren. Im Allgemeinen besitzen sekretorische
Zellen mindestens manche Eigenschaften von endokrinen Zellen, und
können
im Allgemeinen als äquivalent
zu Zellen, die endokriner Natur sind, behandelt werden. Die ebenfalls
anhängige
Anmeldung diskutiert z. B. die Einkapselung von Insulin-produzierenden
Zellen, bevorzugt in der Form von Inseln, in Agarose-Kollagen-Kügelchen, die auch mit Agarose
beschichtet sind. Die resultierenden Produkte sind nützlich bei
der Behandlung von Zuständen,
bei denen ein Lebewesen eine Insulin-Therapie benötigt, wie etwa Diabetes.
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Die
Anmeldung von Jain et al. diskutiert etwas detailliert die früheren Ansätze, die
in der Technik in Transplantationstherapie unternommen worden sind.
Diese werden ebenso hierin zusammengefasst.
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Es
sind fünf
Hauptansätze
bekannt, um das transplantierte Gewebe von der Immunreaktion des
Wirts zu schützen.
Alle beinhalten Versuche, das transplantierte Gewebe vom Immunsystem
des Wirts zu isolieren. Die bisher verwendeten Immunisolationstechniken
umfassen: extravaskuläre
Diffusionskammern, intravaskuläre
Diffusionskammern, intravaskuläre
Ultrafiltrationskammern, Mikroeinkapselung und Makroeinkapselung. Alle
diese Techniken haben jedoch aufgrund eines oder mehrerer der nachstehenden
Probleme versagt: einer fibrotischen Reaktion des Wirts gegen das
implantierte Material, Instabilität des implantierten Materials,
begrenzte Diffusion von Nährstoffen über semi-permeable
Membranen, Permeabilität
von sekretfördernden
Mitteln und Produkt, und Dauer der Diffusionsverzögerung über semipermeable
Membranbarrieren.
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Beispielsweise
wurde 1978 von Lim ein Mikroeinkapselungsverfahren zum Einschließen von
lebenden Zellen, Geweben und anderen labilen Membranen innerhalb
einer semi-permeablen Membran entwickelt (Lim, Research report to
Damon Corporation (1978)). Lim verwendete Mikrokapseln aus Alginat
und poly-L-Lysin zur Einkapselung von Langerhans'schen Inseln. 1980 wurde die erste erfolgreiche
in vivo Anwendung dieser neuen Technik in der Diabetesforschung
veröffentlicht
(Lim et al., Science 210: 908 (1980)). Die Implantation dieser mikroeingekapselten
Langerhans'schen
Inseln führte
dazu, dass in diabetischen Tieren ein normaler Blutglucosegehalt
lange aufrechterhalten wurde. Andere Forscher, die diese Experimente
wiederholten, fanden jedoch heraus, dass Alginat eine Gewebereaktion
hervorrief und konnten die Ergebnisse von Lim et al. nicht reproduzieren
(Lamberti et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101
(1984); Dupuy et al., J. Biomed.
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Material
and Res. 22: 1061 (1988); Weber et al., Transplantation 49: 396
(1990); und Doon-shiong et al., Transplantation Proceedings 22:
754 (1990)). Es wird nunmehr angenommen, dass die Wasserlöslichkeit dieser
Polymere für
die begrenzte Stabilität
und Biokompatibilität
dieser Mikrokapseln in vivo verantwortlich ist (Dupuy et al., oben, Weber
et al., oben, Doon-shiong, oben, und Smidsrod, Faraday Discussion
of Chemical Society 57: 263 (1974)).
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Vor
kurzem verwendeten Iwata et al. (Iwata et al., Jour. Biomedical
Material and Res. 26: 967 (1992)) Agarose zur Mikroeinkapselung
von allogenen pankreatischen Inseln und fanden heraus, dass sie
als ein Medium zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden könnte. In
ihrer Untersuchung wurden 1500–2000 Inseln
einzeln in 5 % Agarose mikroeingekapselt und in Streptozotocininduzierte
diabetische Mäuse
implantiert. Das Implantat überlebte
einen langen Zeitraum, und die Empfänger hielten einen normalen
Blutglucosegehalt auf unbestimmte Zeit.
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Ihr
Verfahren weist jedoch eine Anzahl von Nachteilen auf. Es ist beschwerlich
und ungenau. Beispielsweise bleiben viele Kügelchen partiell beschichtet,
und mehrere hundert Kügelchen
aus leerer Agarose werden gebildet. Somit ist zusätzliche
Zeit erforderlich, um eingekapselte Inseln von leeren Kügelchen
abzutrennen. Darüber
hinaus sammeln sich die meisten der implantierten Mikrokügelchen
in der Beckenhöhle,
und es ist eine große
Anzahl von Inseln in vollständig
beschichteten individuellen Kügelchen
erforderlich, um einen normalen Blutglucosegehalt zu erreichen.
Darüber
hinaus sind die transplantierten Kügelchen schwierig wiederzugewinnen,
tendieren dazu, zerbrechlich zu sein, und setzen nach geringfügiger Beschädigung leicht
Inseln frei.
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Ein
Makroeinkapselungsverfahren ist ebenfalls getestet worden. Makrokapseln
aus verschiedenen unterschiedlichen Materialien, wie etwa poly-2-Hydroxyethylmethacrylat,
Polyvinylchlorid-c-acrylsäure
und Celluloseacetat wurden für
die Immunisolation von Langerhans'schen Inseln hergestellt (Siehe Altman
et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman et al., Transplantation:
American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984); Ronel
et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp
et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865–871 (1983)).
In all diesen Untersuchungen wurde nur eine vorübergehende Normalisierung des
Blutglucosegehalts erreicht.
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Archer
et al., Journal of Surgical Research 28: 77 (1980), verwendeten
Acrylsäurecopolymer-Hohlfasern
um vorübergehend
die Abstoßung
von Insel-Xenotransplantaten
zu verhindern. Sie berichteten, dass dispergierte neonatale Pankreastransplantate
aus Maus in Hohlfasern nach Transplantation in diabetische Hamster
lange Zeit überlebten.
Vor kurzem bestätigten
Lacy et al., Science 254: 1782–1784
(1991), deren Ergebnisse, fanden aber heraus, dass der normale Blutglucosegehalt
eine vorübergehende
Phase ist. Sie fanden heraus, dass wenn die Inseln in die Faser
injiziert werden, sie innerhalb der Hohlfaser aggregieren, mit resultierender
Nekrose im Zentralbereich der Inselmassen. Die zentrale Nekrose
schloss eine längere
Lebensdauer des Transplantats aus. Zur Lösung dieses Problems verwendeten
sie Alginat um die Inseln in der Faser zu dispergieren. Dieses Experiment
wurde jedoch nicht umfassend wiederholt. Daher ist die Funktion
der Membran als ein Transplantationsmedium für Inseln in Menschen fraglich.
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Es
bestand somit ein Bedarf, die Transplantation von sekretorischen
Zellen zu erreichen, und insbesondere das Überleben von Allotransplantaten
und Xenotransplantaten von pankreatischen Inseln ohne die Verwendung
von chronisch immunsupprimierenden Mitteln.
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In
den oben diskutierten Arbeiten von Jain et al. berichteten die Erfinder,
dass die Einkapselung von sekretorischen Zellen in einem hydrophilen
Gelmaterial zu einem funktionellen, nicht-immunogenen Material führt, das
in Tiere transplantiert werden kann und lange Zeiträume aufbewahrt
werden kann. Die Einkapselung der sekretorischen Zellen stellte
eine wirksamere und besser beherrschbare Technik für die Transplantation von
sekretorischen Zellen bereit. Die Einkapselungstechnik wurde beschrieben
als geeignet zur Einkapselung von anderen biologischen Materialien,
wie etwa Enzymen, Mikroorganismen, trophischen Mitteln, umfassend rekombinant
produzierten trophischen Mitteln, cytotoxischen Mitteln und chemotherapeutischen
Mitteln. Es wurde diskutiert, dass die eingekapselten biologischen
Mittel zur Behandlung von Zuständen
geeignet sind, welche bekanntermaßen auf das biologische Mittel
ansprechen.
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Die
Anmeldung diskutiert nicht in irgendeiner Weise den Einbau von Zellen,
die biologische Materialien produzieren, welche diffundieren können, wobei
die letzteren in einem therapeutischen Kontext nützlich sind. Es wird hierin
ein Unterschied gemacht zwischen sekretorischen Zellen, und Zellen,
die biologische Materialien produzieren, welche diffundieren können. Die
ersteren beziehen sich, gemäß den Beispielen
in der Anmeldung von Jain, im Allgemeinen auf Produkte wie etwa
Hormone, Zellsignalsubstanzen, etc., die im Allgemeinen als biologische "Botenstoffe" erachtet werden.
Im Gegensatz dazu bezeichnen biologische Materialien, die diffundieren
können,
Materialien wie etwa MHC-präsentierte
Peptide, Zellexpressionsregulatoren, wie etwa Suppressoren, Promotoren,
Induktoren und so weiter. Dieser Unterschied wird auf dem Gebiet
der Onkologie erkannt werden, z. B. mittels der nachfolgenden Diskussion.
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Umfassende
Studien in der Krebsforschung haben Arbeiten mit heterogenen Zellextrakten
und verschiedenen zellulären
Komponenten umfasst. Über
die Verwendung von monoklonalen Antikörpern hat die Technik relevante,
mit Krebs assoziierte Antigene identifiziert, z. B. GM2, TF, STn,
MUC-1, und verschiedene davon abgeleitete Epitope. Die derzeitige
Theorie postuliert, dass Epitope, die von diesen verschiedenen Tumormarkern
abgeleitet sind, nicht-kovalent mit MHC-Molekülen komplexieren, wodurch von
spezifischen cytolytischen T-Zellen ein Agrotyp gebildet wird. Dieser
Mechanismus ist den verschiedenen Mechanismen, die an der biologischen
Reaktion gegen virale Infektionen beteiligt sind, nicht unähnlich.
Siehe diesbezüglich
Van der Bruggen et al., Science 254: 1643–1647 (1991); Boon et al.,
5,405,940 , und Boon et al.,
5,342,774 .
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Zusätzliche
Forschung, parallel zu den Arbeiten über die Identifizierung der
so genannten Krebsepitope, hat sich auf die Regulation der Krebsproliferation
konzentriert, wie etwa über
Suppression oder allgemeiner Biomodulation. Siehe z. B. Mitchell,
J. Clin. Pharmacol. 32: 2–9
(1992); Maclean et al., Can. J. Oncol. 4: 249–254 (1994). Das Ziel, das
alle diese verschiedenen Ansätze
gegen Krebs eint, ist die Modifizierung der Immunreaktion des Wirts,
um so eine gewisse Verbesserung des Zustands des Patienten hervorzubringen.
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Der
Schlüssel
zu all diesen Ansätzen
ist die Aktivität
von einem oder mehreren biologischen Produkten, die diffundieren
können,
und die mit anderen Materialien zusammenwirken um die Immunreaktion
zu modulieren. Beispielsweise offenbaren Boon et al. und van der
Bruggen et al. kleine Peptidmoleküle. Mitchell diskutiert größere Moleküle, die
z. B. als Suppressoren wirken.
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Ein
Problem mit allen therapeutischen Ansätzen, welche diese Materialien
verwenden, ist deren Ablieferung in einer sicheren, wirksamen Form.
Dies wird nicht leicht erreicht. Es wurde nunmehr überraschenderweise
festgestellt, dass die Techniken von Jain et al., die bei der Entwicklung
von Therapien für
Zustände, welche
Produkte von sekretorischen Zellen benötigen, so nützlich waren, nunmehr in anderen
Gebieten verwendet werden können.
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Wie
dies erreicht wird, ist der Gegenstand der Erfindung, deren ausführliche
Beschreibung folgt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGS
FORMEN
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel, und diejenigen die folgen, verwenden RENCA Zellen. Diese
sind spontane Nierenadenokarzinomzellen aus BALB/C-Mäusen, die
weithin verfügbar
sind und sowohl in vitro als auch in vivo in Kultur gehalten wurden.
Siehe Franco et al., Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181–193 (1994).
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Proben
von gefrorenen RENCA Zellen wurden bei 37°C aufgetaut und danach in Gewebekulturkolben gegeben,
die Dulbecco's Modified
Medium (D-MEM) enthielten, das mit 10 % Rinderserum, Penicillin
(100 u/ml) und Streptomycin (50 μg/ml)
ergänzt
worden war, wobei erhalten wird, was nachstehend hierin als "Komplettmedium" bezeichnet wird.
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Zellen
wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen und danach mit Trypsin
behandelt, gefolgt von Waschen mit Hank's Balanced Salt Solution und danach
mit dem oben angegebenen Komplettmedium.
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Um
zu bestimmen, ob die RENCA Zellen effizient Tumoren produzieren
wurden zwei BALB/C-Mäusen 106 dieser Zellen intraperitoneal injiziert.
Die Mäuse
wurden über
einen Zeitraum von 3–4
Wochen beobachtet. Vom klinischen Standpunkt her erschienen sie
während
der ersten zwei Wochen gesund und sie zeigten normale Aktivität. Danach
wurden die klinischen Manifestationen von Krebs offensichtlich.
Eine Maus starb nach 23 Tagen und die zweite nach 25 Tagen. Nach
dem Tod wurden die Mäuse
untersucht, und es wurden zahlreiche Tumoren verschiedener Größen festgestellt.
Manche der Tumoren zeigten auch Blutungen.
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Eine
Probe eines Tumors, die aus einer der Mäuse entnommen worden war, wurde
für spätere histologische
Untersuchung in 10 % Formalin fixiert.
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Beispiel 2
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Nachdem
gezeigt worden war, dass die RENCA Zellen in vivo wuchsen, wurden
Studien ausgeführt um
zu bestimmen, ob diese Zellen in erfindungsgemäßen Kügelchen wachsen.
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RENCA
Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, wie vorstehend
beschrieben, mit Trypsin behandelt und gewaschen, ebenfalls wie
vorstehend beschrieben. Danach wurden Proben von zwischen 60.000
und 90.000 Zellen hergestellt. Die Zellen wurden danach bei 750
UpM zentrifugiert und Fluid wurde entfernt. Die Zellen wurden danach
in Lösungen
von 1 % unvollständig
entwickeltem Kollagen suspendiert, in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei
einem pH-Wert von 6,5.
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Eine
Lösung
von 1 % Agarose mit niedriger Viskosität wurde in Minimalessentialmedium
(MEM, minimal essential Medium) hergestellt, bei 60°C gehalten
und danach wurden 100 μl
davon zu der oben beschriebenen Suspension von RENCA Zellen und
unvollständig
entwickeltem Kollagen zugegeben. Die Materialien wurden danach unverzüglich als
ein einziger großer
Tropfen in steriles Mineralöl
bei Raumtemperatur transferiert. Das Gemisch bildete ein einziges,
glattes semi-festes Kügelchen.
Dieses Verfahren wurde wiederholt um eine Anzahl von Kügelchen
herzustellen.
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Nach
einer Minute wurden die Kügelchen
in Komplettmedium, wie oben beschrieben, bei 37°C transferiert. Die Kügelchen
wurden danach dreimal in Minimalessentialmedium, das die oben aufgelisteten
Antibiotika enthielt, gewaschen. Die Kügelchen wurden danach über Nacht
bei 37°C
in einer angefeuchteten Atmosphäre
aus Luft und 5 % CO2 inkubiert. Nach der
Inkubation wurden die nunmehr festen Kügelchen zu einem sterilen Löffel transferiert,
der 1 ml 5 % Agarose in Minimalessentiaimedium enthielt. Die Kügelchen
wurden 2–3
Mal in der Lösung
gerollt um sie gleichförmig
mit Agarose zu beschichten. Bevor die Agarose fest wurde, wurden
die Kügelchen
in Mineralöl
transferiert um eine glatte Außenoberfläche zu erhalten.
Nach 60 Sekunden wurden die Kügelchen
fünfmal
mit Komplettmedium bei 37°C
gewaschen um das Öl
zu entfernen. Es folgt Inkubation über Nacht (37°C, angefeuchtete
Atmosphäre
aus Luft, 5 % CO2).Diese RENCA-enthaltenden
Kügelchen
wurden in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
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Beispiel 3
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Vor
einer Durchführung
von in vivo Untersuchungen war es notwendig, zu bestimmen, ob die
RENCA Zellen in den Kügelchen,
hergestellt in der oben beschriebenen Weise, wachsen würden.
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Dazu
wurden Kügelchen,
hergestellt wie in Beispiel 2 diskutiert, in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium
während
eines Zeitraums von drei Wochen unter den aufgelisteten Bedingungen
inkubiert. Drei von den Kügelchen
wurden danach in kleine Stücke
geschnitten und in Standardkulturkolben kultiviert, bei direktem
Kontakt sowohl mit dem Kolben als auch mit dem Kulturmedium.
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Beobachtung
dieser Kulturen zeigte, dass die Zellen wuchsen und Standard-RENCA-Kolonien bildeten.
Dies zeigte, dass die Zellen in den Kügelchen lebensfähig geblieben
waren.
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Beispiel 4
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Danach
wurden in vivo Experimente ausgeführt. In diesen Experimenten
wurden die Kügelchen
sieben Tage bei 37°C
inkubiert. Danach empfingen Mäuse
Kügelchentransplantate.
Dazu wurde bei vier Mäusen jeweils
ein Mittenlinieneinschnitt gemacht, der intraperitoneal ausgeführt wurde.
Drei Kügelchen,
von denen jedes 60.000 RENCA Zellen enthielt, wurden transplantiert.
Die Einschnitte wurden danach verschlossen (zweilagiger Verschluss),
unter Verwendung eines absorbierbaren Nähmaterials. Die vier Mäuse (BALB/C)
waren normale männliche
Mäuse,
die zwischen 24–26
Gramm wogen und gesund zu sein schienen. Es wurden zwei Sätze Kontrollen
durchgeführt.
Beim ersten Satz empfingen zwei Mäuse drei Kügelchen, die keine RENCA Zellen
enthielten, und beim zweiten waren zwei Mäuse völlig unbehandelt.
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Drei
Wochen nach der Implantation empfingen alle Mäuse intraperitoneale Injektionen
von 106 RENCA Zellen. Achtzehn Tage später starb
eine Kontrollmaus. Alle restlichen Mäuse wurden geopfert und untersucht.
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Kontrollmäuse zeigten
zahlreiche Tumoren, während
die Mäuse,
welche die Implantate von in Kügelchen
eingekapselten Zellen empfangen hatten, über die gesamte Bauchhöhle hinweg
nur zufällige
Knoten zeigten.
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Diese
ermutigenden Ergebnisse legten die Planung der Experimente, welche
im nachfolgenden Beispiel angegeben sind, nahe.
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Beispiel 5
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In
diesen Experimenten wurde etablierter Krebs simuliert, indem RENCA
Zellen unter jeweils eine Nierenkapsel von sechs BALB/C Mäusen injiziert
wurden. Fünfzehn
Tage später
wurden die Mäuse
in zwei Gruppen eingeteilt. Die drei Mäuse in der ersten Gruppe empfingen
jeweils drei Kügelchen,
wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Die zweite Gruppe (die Kontrollgruppe)
empfing Kügelchen,
die keine RENCA Zellen enthielten.
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Nach
4–5 Tagen
erschienen Mäuse,
die RENCA Zellen-enthaltende Implantate empfangen hatten lethargisch
und ihr Fell war stachelig geworden, während die Kontrollgruppe energisch
blieb, ohne eine Veränderung
des Zustandes des Fells.
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Zehn
Tage nach Implantation (25 Tage nach Injektion von RENCA Zellen)
wurden die Kontrollmäuse jedoch
träge und
wiesen aufgeblähte
Bäuche
auf. Eine der drei Kontrollmäuse
starb am Tag vierzehn nach Transplantation der Kügelchen. Es folgte Opferung
der Mäuse.
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Die
Körperhöhlen der
Kontrollmäuse
zeigten reichliche Blutungen, mit zahlreichen Tumoren über den Ernährungskanal,
die Leber, den Magen und die Lungen. Die gesamte Bauchhöhle war
aufgrund von üppigem Tumorwachstum
nicht mehr wahrzunehmen. Die Mäuse,
die Kügelchen
mit eingekapselten RENCA Zellen empfangen hatten, zeigten jedoch
keine Blutungen und nur ein paar Knoten auf den Ernährungskrebsgeschwüren. Ein
Vergleich der Test- und Kontrollgruppen zeigte, dass sich in der
Testgruppe Knoten nicht weiterentwickelt hatten.
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Beispiel 6
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Das
Wachstum von frei angeimpften RENCA Zellen wird inhibiert, wenn
sie zusammen mit eingekapselten RENCA Zellen inkubiert werden. Es
wurde ein weiterer Satz an Experimenten ausgeführt, um zu bestimmen, ob diese
Wirkung mit anderen Zellen beobachtet werden kann.
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Eine
Adenokarzinomzeillinie, d. h. MMT (mouse mammary tumor) wurde von
der American Type Culture Collection erhalten. Eingekapselte MMT
Zellen wurden, wie oben beschrieben, mit MMT Zellen hergestellt,
wobei Kügelchen
mit 120.000 oder 240.000 Zellen pro Kügelchen produziert wurden.
Nach der Herstellung der Kügelchen
wurden sie verwendet um zu bestimmen, ob sie Proliferation von RENCA
Zellen in vitro inhibieren würden.
In genaueren Worten wurden zwei Petrischalen mit sechs Vertiefungen
vorbereitet, mittels Animpfen mit 1 × 104 RENCA
Zellen pro Vertiefung in 4 ml Medium. In jeder Schale dienten drei
Vertiefungen als Kontrolle und drei als Test. Eine der drei Kontrollvertiefungen
in jeder Schale empfing ein Kügelchen.
Jede der anderen Vertiefungen empfing entweder zwei oder drei leere
Kügelchen.
Die zweite Vertiefung wurde ähnlich
behandelt, wobei die Vertiefungen ein, zwei oder drei Kügelchen,
die 120.000 oder 240.000 MMT Zellen enthielten, empfingen. Die Vertiefungen
wurden eine Woche bei 37°C
inkubiert, wonach RENCA Zellen mit Trypsin behandelt, gewaschen
und unter Verwendung einer Zählkammer
ausgezählt
wurden.
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Die
Ergebnisse sind wie folgt:
| Schale #1
(LEERE MAKROKÜGELCHEN)
# an Zellen, die nach einer Woche wiedergewonnen wurden | Schale #2
(MAKROKÜGELCHEN
MIT MMT ZELLEN) # an Zellen, die nach einer Woche wiedergewonnen
wurden |
| Vertiefung
# | Kontrolle | Leer | 120.000
MMT Zellen | 240.000
MMT Zellen |
| 1 | 2,4 × 105 | 2,8 × 105 | 1,4 × 105 | 1 × 105 |
| 2 | 2,0 × 105 | 3,5 × 105 | 1,2 × 105 | 7 × 104 |
| 3 | 4,4 × 105 | 2,5 × 105 | 1,25 × 105 | 9 × 104 |
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Beispiel 7
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Den
Ergebnissen von Beispiel 6 folgend wurden die gleichen Experimente
durchgeführt,
unter Verwendung von 1 × 10
4 MMT Zellen anstelle von RENCA Zellen. Das
Experiment wurde genau gleich wie Beispiel 6 durchgeführt. Die
Ergebnisse sind nachstehend angegeben.
| Vertiefung
# | Kontrolle | leere
Makrokügelchen | (1)
MMT Makrokügelchen | (2)
MMT Makrokügelchen |
| 1 | 3,1 × 106 | 2,8 × 106 | 1,6 × 106 | 1,3 × 106 |
| 2 | 3,3 × 106 | 2,6 × 106 | 1,0 × 106 | 1,1 × 106 |
| 3 | 3,0 × 106 | 2,8 × 106 | 6,0 × 105 | 5,0 × 105 |
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Diese
Ergebnisse ermutigten zu einem in vivo Experiment. Dieses wird in
Beispiel 8 erläutert.
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Beispiel 8
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RENCA
Zellen, wie in den vorstehenden Beispielen verwendet, sind Nierenkrebszellen.
Um die allgemeine Wirksamkeit der Erfindung vollständiger zu
zeigen, wurden Arbeiten unter Verwendung eines unterschiedlichen
Typs von Krebszellen ausgeführt.
In genaueren Worten wurden Adenokarzinomzellen verwendet.
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Eine
Maus-Brusttumor-Zeillinie (MMT) wurde von der American Type Culture
Collection erhalten. Unter Verwendung der oben angegebenen Protokolle
wurden Implantate hergestellt, die 120.000 Zellen pro Kügelchen
und 240.000 Zellen pro Kügelchen
enthielten.
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Das
verwendete Versuchsmodell war das Mausmodell, oben. Zweiundzwanzig
Mäuse wurden
in Gruppen von 4, 9 und 9 eingeteilt. Die erste Gruppe, d. h. die
Kontrollen, wurden weiter in drei Gruppen von zwei, eins und eins
eingeteilt. Die erste Untergruppe empfing Implantate aus einem Kügelchen,
das keine Zellen enthielt. Eine Maus empfing zwei leere Kügelchen
und eine empfing drei leere Kügelchen.
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In
der Versuchsgruppe A (9 Tiere) enthielten die Kügelchen 120.000 Zellen, während in
Gruppe B die Kügelchen
240.000 Zellen enthielten. Innerhalb der Gruppen "A" und "B" gab
es je drei Untergruppen, von denen jede drei Mäuse enthielt. Die Untergruppen
empfingen ein, zwei oder drei Kügelchen
mit MMT Zellen.
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Einundzwanzig
Tage nach der Implantation empfingen alle Tiere Injektionen von
40.000 RENCA Zellen. Unmittelbar nach der Injektion waren die Mäuse lethargisch,
mit stacheligem Haar. Dies hielt etwa fünf Tage an, wonach normales
Verhalten beobachtet wurde.
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Nach
zwanzig Tagen wiesen Kontrollmäuse
aufgeblähte
Bäuche
und extrem stacheliges Haar auf. Eine Kontrollmaus starb 25 Tage
nach der Injektion, während
die restlichen Kontrollmäuse
als im Endstadium befindlich erschienen. Alle Mäuse wurden geopfert und die
Tumorentwicklung wurde beobachtet. Diese Beobachtungen sind nachstehend
aufgezeichnet:
| ANZAHL
MAKROKÜGELCHEN
IN DEN MÄUSEN | KONTROLLE | VERSUCHS-GRUPPE A | VERSUCHS-GRUPPE B |
| 1 | ++++ | - | -- |
| 1 | ++++ | -- | -- |
| 1 | | + | ++ |
| | | | |
| 2 | ++++ | -- | -- |
| 2 | | -- | -- |
| 2 | | ++ | ++ |
| | | | |
| 3 | ++++ | -- | -- |
| 3 | | -- | -- |
| 3 | | -- | +++ |
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass von achtzehn getesteten Mäusen dreizehn
keine Erkrankung zeigten. Von den Mäusen in Gruppe (A) wies eine
Maus ein paar Knoten auf und eine andere Maus wies ein paar Tumoren
auf. Eine Maus, die zwei Kügelchen
empfangen hatte, wies ein paar Tumoren auf. In Gruppe B wiesen eine
Maus, die ein Kügelchen
empfangen hatte, und eine Maus, die zwei Kügelchen empfangen hatte, ein
paar Tumoren auf, die mit Därmen
verheddert waren. Eine der Mäuse,
die drei Kügelchen
empfangen hatte, hatte einen großen festen Tumor entwickelt
und war anscheinend sehr krank.
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Nichtsdestoweniger
zeigten die Ergebnisse insgesamt, dass die eingekapselten Maus-Brustkrebszellen
die Tumorbildung inhibierten.
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Beispiel 9
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Wie
oben nahe gelegt, führt
die Praxis der Erfindung zur Produktion irgendeines Materials oder
Faktors, das bzw. der die Tumorzellproliferation inhibiert und/oder
verhindert. Dies wurde in dem nachfolgenden Experiment weiter untersucht.
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Zusätzliche
Kügelchen
wurden hergestellt wie oben in Beispiel 2 beschrieben, außer dass
unvollständig
entwickeltes Kollagen nicht aufgenommen wurde. Diese Kügelchen
sind daher Agarose/Agarose-Kügelchen.
RENCA Zellen, wie oben beschrieben, wurden in diese Kügelchen
eingebaut, wiederum wie oben beschrieben.
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Zwei
Sätze von
drei Platten mit je sechs Vertiefungen wurden danach als Kontrolle
und Versuchsgruppen verwendet. In der Kontrollgruppe wurden die
Vertiefungen mit 4 ml RPMI Komplettmedium (10 % fötales Kälberserum
und 11 ml/l Penicillin) gefüllt.
Jede Kontrollgruppe wurde danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
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In
der Versuchsgruppe war das RPMI Komplettmedium konditioniert, durch
Zugabe von Material, weiches erhalten worden war durch Inkubation
von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden Kügelchen (120.000 Zellen pro
Kügelchen)
in einer 35 × 100
mm Petrischale, enthaltend 50 ml RPMI Komplettmedium. Nach fünftägiger Inkubation
wurde Medium von diesen Schalen gesammelt, und 4 ml davon wurden
in jede Testvertiefung gegeben. Diese Vertiefungen wurden danach
mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
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Alle
Platten (sowohl Kontrollen als auch Versuche) wurden fünf Tage
bei 37°C
inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurden die Zellen mit Trypsin
behandelt, gewaschen und unter Verwendung einer Zählkammer
ausgezählt.
Die Zellen jeder Vertiefung in den Schalen wurden nach der Trypsinbehandlung
gepoolt und ausgezählt,
das Ergebnis war wie folgt.
| VERTIEFUNG
# | (ZELLEN)
KONTROLLE | (ZELLEN)
KONDITIONIERT |
| 1 | 7 × 105 | 3 × 105 |
| 2 | 8 × 105 | 2,5 × 105 |
| 3 | 7 × 105 | 3,4 × 105 |
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Zellen, wenn sie in z. B. den Kügelchen
der Erfindung restringiert sind, irgendeinen Faktor produzieren,
der zu einer Suppression der Tumorzellproliferation führt. Dieser
Restriktionsinhibitionsfaktor wird von den Zellen aufgrund ihres
Einschlusses in dem Kügelchen
produziert und unterscheidet sich von anderen Materialien, wie etwa
einem Kontaktinhibitionsfaktor, welche produziert werden, wenn Zellen
einander kontaktieren.
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Beispiel 10
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Das
oben angegebene Experiment zeigte, dass das Wachstum von RENCA Zellen
in konditioniertem Medium etwa die Hälfte des Wachstums der Zellen
in Kontrollmedium betrug. Die hierin angegebenen Experimente untersuchten,
ob der wachstumsinhibierende Faktor nach Einfrieren des konditionierten
Mediums aktiv bleiben würde.
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Konditioniertes
RENCA Medium wurde hergestellt durch fünftägige Inkubation von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden
Kügelchen.
Die Inkubation erfolgte in 35 × 100
mm Petrischalen mit 50 ml RPMI Komplettmedium bei 37°C. Nach der
Inkubation wurde das Medium gesammelt und bei –20°C aufbewahrt. Konditioniertes
Medium wurde hergestellt durch Inkubation von immunisolierten Zellen,
die MMT (mouse mammary tumor) Zellen enthielten. Die Kügelchen
enthielten 240.000 Zellen pro Kügelchen,
alle anderen Bedingungen waren gleich.
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Eingefrorenes
Medium wurde bei 37°C
aufgetaut und danach in den nachfolgenden Tests verwendet. Drei
Schalen mit sechs Vertiefungen wurden für jede Behandlung verwendet,
d. h. (1) RPMI Kontrollmedium, (2) eingefrorenes konditioniertes
RENCA Medium, und (3) eingefrorenes konditioniertes MMT Medium.
Insgesamt wurden 4 ml Medium in jede Vertiefung pipettiert. Alle
Vertiefungen wurden danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft und
fünf Tage
bei 37°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurden zwei Probenschalen von jeder Vertiefung
genommen, mit Trypsin behandelt, gepoolt und in einer Zählkammer
ausgezählt.
Nach acht Tagen wurden die restlichen drei Schalen jeder Vertiefung
auf die gleiche Weise getestet.
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Die
Ergebnisse folgen:
| SCHALE
5 TAGE ALT | KONTROLL-MEDIUM | EINGEFRORENES KONDITIONIERTES RENCA
MEDIUM | EINGEFRORENES KONDITIONIERTES MMT
MEDIUM |
| 1 | 6 × 105 | 5 × 105 | 8 × 104 |
| 2 | 6,8 × 105 | 4,2 × 105 | 8,5 × 104 |
| 8
TAGE ALT | | | |
| 3 | 2,8 × 106 | 2 × 106 | 8 × 104 |
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Wenn
diese Ergebnisse mit denen von Beispiel 6, oben, verglichen werden,
wird erkannt werden, dass während
eingefrorenes/aufgetautes konditioniertes RENCA Medium das Wachstum
nicht im gleichen Ausmaß inhibierte
wie nichteingefrorenes Medium (vergleiche die Beispiel 6 und 7),
es nichtsdestoweniger das Wachstum inhibierte. Eingefrorenes konditioniertes
Medium unterVerwendung von MMT Zellen inhibierte das Wachstum sogar
stärker
als nichteingefrorenes konditioniertes MMT Medium. Diese Ergebnisse
zeigen, dass von achtzehn getesteten Mäusen dreizehn keine Erkrankung
zeigten. Von den Mäusen
in Gruppe (A) wies eine Maus ein paar Knoten auf und eine andere
Maus wies ein paar Tumoren auf.
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Das
Vorstehende beschreibt die Herstellung von implantierbaren Kügelchen,
welche einen oder mehrere Typen von Zellen enthalten, welche ein
biologisches Produkt erzeugen, das diffundieren kann, wie dieser Ausdruck
hierin definiert ist. Das biologische Produkt, das diffundieren
kann, ist eines, welches eine Wirkung auf das Lebewesen hat, in
welches das Kügelchen
implantiert wird. Bevorzugt ist diese Wirkung eine Immunmodulation,
wie etwa die Stimulation einer Immunreaktion oder die Suppression
einer Reaktion. Im Falle von Krebs kann das biologische Produkt,
das diffundieren kann, beispielsweise ein Peptid sein, das mit MHC-Molekülen auf
Krebszellen in einem Lebewesen komplexiert, wodurch eine CTL-Reaktion
dagegen hervorgerufen wird, die wiederum zu einer Verringerung der
Tumorbelastung in dem Lebewesen führt. Das Produkt, das diffundieren
kann, kann auch ein Suppressor von Tumorwachstum sein. In Verbindung
mit dieser Form einer Therapie ist es möglich, wenn auch nicht notwendigerweise
bevorzugt, die implantierten Kügelchen
in einem oder in der Nähe
eines identifizierten Tumors zu positionieren.
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"Biologisches Produkt,
das diffundieren kann",
wie hierin verwendet, bezeichnet Materialien wie etwa Proteine,
Glycoproteine, Lipoproteine, Kohlehydrate, Lipide, Glycolipide und
Peptide. In genaueren Worten, sind Materialien wie etwa Antikörper, Cytokine,
Hormone, Enzyme und so weiter beispielhaft, aber keinesfalls der
einzige Typ an aufgenommenen Materialien. Ausgeschlossen sind die
gut bekannten "Endprodukte" von zellulären Vorgängen, wie
etwa CO2 und H2O.
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Wie
die Experimente zeigen, können
die implantierbaren Kügelchen
auch prophylaktisch verwendet werden. Es ist gut bekannt, dass zumindest
ein Teil der Population der Krebspatienten für ein erneutes Auftreten des
Zustandes anfällig
ist. Die hierin beschriebenen Experimente zeigen, dass die Implantate
das Auftreten oder das erneute Auftreten von Krebs verhindern können, über die
biologische Wirkung, welche das Produkt, das diffundieren kann,
auf das System des Lebewesens ausübt.
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Die
Diskussion der Erfindung hat sich auf in vivo Ansätze konzentriert.
Es muss jedoch auch verstanden werden, dass es viele in vitro Ansätze für die Erfindung
gibt, von denen manche nachstehend hierin diskutiert werden. Beispielsweise
ist es gut bekannt, dass viele Zellen, welche erwünschte Produkte
produzieren, bei Kultivierung in vitro die Gegenwart von Nährzellen
benötigen.
Mit derartigen Nährzellen
gibt es immer wieder Probleme. Sie können schneller wachsen als
die erwünschten
Zellen, was de facto zu einer "Strangulierung" der interessierenden
Materialien führt.
Weiterhin kann es ein Problem geben mit verschiedenen toxischen
Produkten, die von den Lagen von Nährzellen produziert werden.
Die implantierbaren Kügelchen
der Erfindung wirken praktisch als zelluläre Inkubatoren, wobei sie die
eingebauten Zellen schützen,
während
sie ermöglichen,
dass die Produkte, die diffundieren können, sich in ein Kulturmedium
hinein bewegen, wo sie z. B. gesammelt werden können.
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Wie
oben angegeben, erfordert die Zubereitung der implantierbaren Kügelchen
zunächst
das Suspendieren der Zellen in Lösung,
bevorzugt in einer wässrigen
Lösung
von Kollagen. Bevorzugt ist das Kollagen unvollständig entwickeltes
Kollagen, in einer Lösung
von etwa 0,5 bis etwa 2 %. In Abhängigkeit des Typs der verwendeten
Zellen wird die Anzahl an Zellen in der Lösung zu einem gegebenen Zeitpunkt,
und somit die Anzahl an Zellen in einem Kügelchen, variieren. Bevorzugt
werden von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen pro Kügelchen
verwendet, stärker
bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000. Am meisten bevorzugt
werden etwa 40.000 bis etwa 60.000 Zellen verwendet.
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Nach
dem Suspendieren der Zellen in der Kollagenlösung wird eine Agaroselösung zugegeben.
Bevorzugt liegt diese Agaroselösung
in einem Bereich von etwa 0,5 % bis etwa 5 %, bevorzugt um 1 %.
Bei tropfenweiser Zugabe dieses Gemisches auf oder in inerte Materialien
wie etwa TEFLON® oder
Mineralöl
bildet sich ein Kügelchen.
Dieses Kügelchen
ist semi-fest. Das semi-feste Kügelchen
wird danach in ein steriles Medium transferiert, bevorzugt eines,
das Antibiotika enthält,
gewaschen, und zur Polymerisation von Kollagen inkubiert. Die Polymerisation
von Kollagen ist ein gut untersuchtes Phänomen, und die Bedingungen,
unter denen sie stattfindet, brauchen hierin nicht genau dargelegt
werden.
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Nach
dem Festwerden des Kügelchens
wird es danach mit Agarose beschichtet, bevorzugt indem es in einer
Agaroselösung
gerollt wird. Eine bevorzugte Weise, um dies zu bewirken ist ein
einfacher, mit TEFLON®-beschichteter Löffel, der
eine Agaroselösung,
bevorzugt 5 % bis 10 %, enthält.
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Die
vorstehende Diskussion bezüglich
biologischer Produkte, die diffundieren können, sollte nicht als eingeschränkt auf
Wildtypmaterialien ausgelegt werden. Man kann beispielsweise genauso
einfach transformierte oder transfizierte Wirtszellen einbauen,
wie etwa eukaryontische Zellen (z. B. 293 Zellen, CHO Zellen, COS
Zellen) oder auch prokaryontische Zellen (z. B. E. coli), die behandelt
wurden um heterogenes Protein zu produzieren, oder modifiziert wurden, über z. B.
homologe Rekombination, um erhöhte
Mengen von gewünschten
biologischen Produkten zu produzieren. Andere Materialien, wie etwa
Hybridome, können
ebenfalls verwendet werden, wobei das biologische Produkt, das diffundieren
kann, ein monoklonaler Antikörper
ist. Andere Merkmale und Aspekte der Erfindung werden für den Fachmann
klar sein und müssen
hier nicht aufgezählt
werden.