DE69736122T2

DE69736122T2 - Verwendung eines prostatatumor auslösenden gens zum aufspüren von krebszellen

Info

Publication number: DE69736122T2
Application number: DE69736122T
Authority: DE
Inventors: B. Paul Scarsdale FISHER
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2017-09-06
Also published as: EP0951567B1; EP0951567A1; WO1998010098A1; EP0951567A4; DE69736122D1; ATE330028T1; AU4182697A

Description

Bei der vorliegenden Anmeldung handelt es sich um eine "Continuation-in-part"-Anmeldung der US Seriennummer 08/708,208, eingereicht am 06. September 1997, deren Inhalt durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Hintergrund der Erfindung
Die schnelle Expressionsklonierung und die differentielle RNA-Darstellung identifiziert ein Gen, das Prostatatumor-induzierende Gen1 (PTI-1), welches bei Prostatakrebs, im Gegensatz zu der normalen Prostata und der gutartigen Prostatahypertrophie, differentiell exprimiert wird. PTI-1 kodiert einen gekürzten und mutierten menschlichen Elongationsfaktor 1α (EF-1α) und seine 5'-untranslatierte Region (UTR) weist eine signifikante Homologie zu dem 23S-ribosomalen RNA-Gen von Mycoplasma hyopneumoniae auf. PCR mit menschlich genomischer DNA unter Verwendung von PTI-1-5'-UTR-spezifischen Primern legt nahe, dass diese Sequenz einen Teil des menschlichen Genoms darstellt. Des Weiteren amplifiziert RT-PCR, mit einem Primer, welcher spezifisch für die 5'-UTR-Region ist, und einem anderen Primer, welcher spezifisch für die EF-1α-Kodierungsregion ist, PTI-1-Transkripte von Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien und Blutproben von Patienten mit Prostatakarzinom. RT-PCR-Produkte der vorausgesagten Größe und Sequenz von PTI-1 werden in RNA aus Zelllinien der menschlichen Prostata, der Brust und von Dickdarmkarzinomen detektiert. Es wird mittels Southern Blotting und Sequenzanalysen gezeigt, dass dieses RT-PCR-Produkt die Verbindungssequenz zwischen der 5'-UTR- und der Kodierungsregion des PTI-1-Gens enthält. Des Weiteren zeigt die RT-PCR-Analyse an, dass das PTI-1-Gen ebenfalls in Blutproben exprimiert wird, welche von Patienten mit Prostatakarzinom genommen wurden. Auf der Basis von seriellen Verdünnungsexperimenten kann PTI-1 eine Prostatakarzinomzelle in 10⁶ Zellen detektieren, welche PTI-1 nicht exprimieren. In diesem Zusammenhang stellt PTI-1 den empfindlichsten Marker zur Detektion von menschlichem Prostatakrebs dar, welcher derzeit verfügbar ist. Diese Studie bestätigt die Authentizität des PTI-1-Gens und dokumentiert dessen potentielle klinische Nützlichkeit als ein empfindlicher und spezifischer Indikator für die Entwicklung von Prostatakrebs.
Adenokarzinom der Prostata ist die unter US-amerikanischen Männern derzeit am häufigsten auftretende Art von innerem Krebs und die zweithäufigste Ursache für mit Krebs in Verbindung gebrachte Sterbefälle.
Aktuelle Methodologien zur Früherkennung von Prostatakrebs, einschließlich der ärztlichen Untersuchung, welche den PSA³-Spiegel, Gewebebiopsien, Ultraschall- und Röntgenaufnahmen von Knochen überwachen, sind sowohl in ihrer Empfindlichkeit als auch ihrer Spezifität (1–3) eingeschränkt. Außerdem gestatten die gegenwärtigen Testmodalitäten keine Unterscheidung zwischen solchen Krebsarten, welche indolent bleiben, und solchen, welche sich als aggressiv und lebensbedrohlich herausstellen (1–4). Unter Verwendung von DNA-Transfektionsansätzen mit einer neuartigen Akzeptorenzelllinie, CREF-Trans 6 (5), und dem molekularen Ansatz der differentiellen RNA-Darstellung (6) wurde ein neuartiges, vermutlich den Prostatakarzinomtumor induzierendes Onkogen, PTI-1, identifiziert und aus einem menschlichen Prostatakarzinom kloniert, LNCaP, cDNA-Bibliothek (7). Unter Verwendung von RT-PCR-Ansätzen mit Primern, welche der 5'-UTR-Region von PTI-1 entsprechen, wird die Expression in 15 aus 16 Karzinomen der Prostata detektiert, nicht jedoch in normalem Prostata- oder BPH-Gewebe (7).
Wenngleich weiteres Testen mit einer größeren Anzahl an Patientenproben eindeutig vonnöten ist, legen diese bahnbrechenden Ergebnisse nahe, dass sich die PTI-1-Überwachung als vorteilhaft in der Prostatakrebsdiagnostik erweisen könnte.
WO-A-9621671 offenbart die Verwendung eines Primerpaars, welches eine Region innerhalb der 5'-UTR-PTI-1-Sequenz erkennt, zur Detektion von Krebszellen in vom Patienten erhaltenen Prostatakarzinomen unter Verwendung einer Reverstranskriptions-PCR (vgl. Seite 117, Zeilen 27–31).
Lin J et al., 1996, offenbart, dass die 5'-UTR von PTI-1 während der onkogenen Transformation transkriptionel aktiviert wird.
Die gesamte Länge der cDNA von PTI-1 beträgt 2.123 bp und sie kodiert einen gekürzten und mutierten menschlichen EF-1α (7) (1). Die Struktur der cDNA von PTI-1 ist darin einzigartig, dass ihre 5'-UTR eine signifikante Homologie (annähernd 85%) zu dem prokaryoten 23S-ribosomalen RNA-Gen aus Mycoplasma hyopneumoniae aufweist. Dieser Grad an Sequenzhomologie zwischen der 5'-UTR des PTI-1-Gens und dem prokaryoten 23S-ribosomalen RNA-Gen gibt Anlass zu der Befürchtung, dass eine Kontamination durch Bakterien in der LNCaP-Zellkultur, welche verwendet wurde, um die cDNA-Bibliothek herzustellen, und in nachfolgenden Klonierungsartefakten für die Identifizierung des PTI-1-Gens verantwortlich sein könnte. Es ist daher obligatorisch, die Authentizität des PTI-1-Gens zu bestätigen, bevor weiterführende Studien betrieben werden können, um eine jegliche in Frage kommende Rolle von PTI-1 bei der Entstehung und der Entwicklung von menschlichem Prostatakrebs zu beleuchten.
In der vorliegenden Studie wurde der Frage der Validität des PTI-1-Gens dadurch nachgegangen, dass man seine Präsenz im menschlichen Genom, Transkripte in Tumorzelllinien sowie die Präsenz in Blutproben von Patienten mit Prostatakrebs analysierte. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen definitiv, dass die Identifizierung des PTI-1-Gens wahrscheinlich nicht auf bakterielle Kontamination und/oder technische Artefakte zurückzuführen ist.
Darüber hinaus kann die PTI-1-Genexpression einen extrem empfindlichen Marker für die Entwicklung des Prostatakarzinoms bereitstellen, wie durch die Präsenz von Prostatakarzinomzellen im Blutkreislauf eines Patienten widergespiegelt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend die Detektion der Expression eines Prostatatumor-induzierenden Gens in der Probe, wobei eine positive Detektion der Expression die Präsenz von Krebszellen in der Probe anzeigt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-1. In einer gesonderten Ausführungsform handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-2. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-3.
In einer Ausführungsform erfolgt die Expression mittels Messung des Spiegels von PTI-mRNA. Die mRNA wird durch Reverstranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von wenigstens einem Paar von geeigneten Primern gemessen. Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass geeignete Paare von Primern ausgewählt werden können, wenn erst einmal die Sequenz des Prostatatumor-induzierenden Gens bestimmt ist.
In einer Ausführungsform ist wenigstens einer der Primer zu entweder der 5-Prime- oder der 3-Prime nicht translatierten Region komplementär. In einer weiteren Ausführungsform sind die Primer komplementär zu der 5-Prime nicht translatierten Region. In noch einer weiteren Ausführungsform ist einer der Primer komplementär zu der 5-Prime nicht translatierten Region und der andere Primer ist komplementär zu der Kodierungsregion. In einer anderen Ausführungsform sind die Primer zu der 3-Prime nicht translatierten Region komplementär. In einer gesonderten Ausführungsform ist einer der Primer komplementär zu der 3-Prime nicht translatierten Region und der andere Primer ist komplementär zu der Kodierungsregion.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das obige Verfahren bereit, wobei die Expression durch die Messung des PTI-Proteinspiegels erfolgt. Der PTI-Proteinspiegel wird in den folgenden Schritten gemessen: a) in Kontakt bringen der Probe mit Antikörper, welcher in der Lage ist, unter Bedingungen, welche die Bildung von Komplexen zwischen dem PTI-1-Protein und dem Antikörper gestatten, PTI-1-Protein spezifisch zu erkennen; und b) Messung des gebildeten Komplexes und damit Messung des in den Krebszellen exprimierten PTI-1-Proteinspiegels.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Struktur des PTI-1-Gens und der Primer und Sondensequenzen, welche für die Analyse verwendet wurden. (A) Schematische Darstellung der PTI-1-cDNA-Struktur. Die 5'- und 3'-UTR werden durch dünne Linien dargestellt, die Kodierungsregion wird durch ein schraffiertes Kästchen dargestellt. Die dicke Linie stellt die brückenspezifische Sonde (BSP) dar, welche dazu verwendet wird, die Verbindungsregion zwischen der 5'-UTR und der Kodierungsregion zu analysieren. Die Pfeilspitzen zeigen die Positionen der PCR- und der RT-PCR-Primer an. (B) Sequenzen der PCR- und RT-PCR-Primern und der Sonde, welche in der Southern-Blotting-Analyse verwendet werden.
2: Die 5'-UTR-Sequenz des PTI-1-Gens ist im menschlichen Genom vorhanden. Ein μg von genomischer DNA aus dem menschlichen Kleinhirn wird mit den Primerpaaren UU und UL amplifiziert (siehe 1). Ein spezifisches PCR-Produkt mit der erwarteten Größe von 424 bp wird erzeugt, welches nicht von Behandlung mit RNAse A beeinflusst wird. Dieses Produkt wird nicht im Anschluss an das Entfernen von einem oder beiden der Primer, der DNA-Templates oder der Taq-Polymerase erzeugt. MW, der Marker für das molekulare Gewicht, ist eine DNA-Leiter mit 100 bp (GibcoBRL).
3: PTI-1-Genexpression in menschlichen Tumorzelllinien.
(A) Ein spezifisches RT-PCR-Produkt der erwarteten Größe wird durch die Primerpaare BU und BL (siehe 1) in Gesamt-RNA aus menschlichen Prostata-, Brust- und Dickdarmkarzinomzellen erzeugt. Dieses Produkt ist in CREF-Trans-6-Zellen, jedoch in CREF-Trans-6:4-NMT-Zellen (Nacktmaustumor-abgeleitete CREF-Trans-6-Zellen, transfiziert mit LNCaP-DNA) nicht vorhanden. (B) Dieses RT-PCR-Produkt hybridisiert mit einer Oligonukleotidsonde (BSP) unter Anwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen. Die BSP besteht aus 10 nt auf jeder Seite des Verbindungspunkts zwischen der 5'-UTR und der Kodierungsregion des PTI-1-Gens (siehe 1). (C) Das gleiche Expressionsmuster wird detektiert, wenn die 5'-UTR-spezifischen Primerpaare UU und UL verwendet werden (siehe 1).
4: Empfindlichkeit von PTI-1 bei der Detektion von Prostatakarzinomzellen in verdünnten Zellkulturproben und in Blutproben von Patienten. (A) Mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel von PCR-Produkten, welche unter Verwendung von PSA (14) und PTI-1-5'-UTR(7)-spezifischen Primer in mit CREF-Trans-6-Zellen verdünnten LNCaP-Zellen erzeugt wurden. (B) RT-PCR-Analyse der PTI-1-Expression in Blutproben von normalen Männern, normalen Frauen und Prostatakrebspatienten in Krankheitsstadium D. Die mittels PCR amplifizierten Produkte, welche unter Verwendung eines PTI-1-5'-UTR-Primerpaares (7) erzeugt wurden, wurden auf Nylonmembranen aufgetragen und mit einem ³²P-markierten DNA-Fragment von PTI-1 sondiert. Spezifische Proben wurden ebenfalls mittels RT-PCR auf Expression von entweder PSA oder PSM analysiert. N = normal; M = männlich; F = weiblich; DU-145, menschliche Prostatakarzinomzelllinie; N. T. = nicht getestet; + = Expression; – = keine Expression; obere Nummer = Patientencode; D2 und D3 = Patienten mit Krankheitsstadium D.
5: RT-PCR von GAPDH; Proben werden gemäß der Beschreibung in der zweiten Versuchsserie behandelt. Sowohl GAPDH als auch die Brückenregion-RT-PCR umfassten einen Amplifikationsdurchgang. Es waren zwei Amplifikationsdurchgänge (30 Zyklen pro Durchgang) erforderlich, um mit den 5'-UTR-Primern ein Signal zu erreichen.
6: RT-PCR der Brückenregion (BU und BL)
7: RT-PCR von 5'-UTR
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Krebszellen in einer Probe, umfassend die Detektion der Expression eines Prostatatumor-induzierenden Gens in der Probe, wobei eine positive Detektion der Expression die Präsenz von Krebszellen in der Probe anzeigt. In einer Ausführungsform sind die Krebszellen Karzinomzellen. Die Krebszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, Dickdarmkrebszellen und Lungenkrebszellen.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Blutprobe. In einer gesonderten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Spermaprobe.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-1. In einer gesonderten Ausführungsform handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-2. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-3. PTI-1, PTI-2 und PTI-3 sind beschrieben in der ebenfalls anhängigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/371,377, eingereicht am 11. Januar 1995, und der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US96/00307, eingereicht im Januar 1996.
In einer Ausführungsform erfolgt die Expression mittels Messung des Spiegels von PTI-mRNA. Die mRNA wird durch Reverstranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von wenigstens einem Paar von geeigneten Primern gemessen. Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass geeignete Paare von Primern ausgewählt werden können, wenn erst einmal die Sequenz des Prostatatumor-induzierenden Gens bestimmt ist.
In einer Ausführungsform ist wenigstens einer der Primer zu entweder der 5-Prime- oder der 3-Prime nicht translatierten Region komplementär. In einer weiteren Ausführungsform sind die Primer komplementär zu der 5-Prime nicht translatierten Region. In noch einer weiteren Ausführungsform ist einer der Primer komplementär zu der 5-Prime nicht translatierten Region und der andere Primer ist komplementär zu der Kodierungsregion. In einer anderen Ausführungsform sind die Primer zu der 3-Prime nicht translatierten Region komplementär. In einer gesonderten Ausführungsform ist einer der Primer komplementär zu der 3-Prime nicht translatierten Region und der andere Primer ist komplementär zu der Kodierungsregion.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das zuvor genannte Verfahren bereit, wobei mindestens einer der Primer ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: 5' GAGTCTGAATAGGGCGACTT 3', 5' AGTCAGTACAGCTAGATGCC 3', 5' ACCCGAGAGGGGAGTGAAATA 3', 5' TGCCGCCATTCCACATTCAGT 3', 5' ATGGGGGTAGAGCACTGAATG 3', 5' AACACCAGCAGCAACAATCAG 3' und 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3'. Da die vollständige Sequenz von einigen Prostatatumor-induzierenden Genen bereits bekannt ist, können leicht andere geeignete Primer ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das obige Verfahren bereit, wobei die Expression durch die Messung des PTI-Proteinspiegels erfolgt. Der PTI-Proteinspiegel wird in den folgenden Schritten gemessen: a) in Kontakt bringen der Probe mit Antikörper, welcher in der Lage ist, unter Bedingungen, welche die Bildung von Komplexen zwischen dem PTI-1-Protein und dem Antikörper gestatten, PTI-1-Protein spezifisch zu erkennen; und b) Messung des gebildeten Komplexes und damit Messung des in den Krebszellen exprimierten PTI-1-Proteinspiegels.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend die Schritte: a) Isolieren von mRNA aus der Probe; b) in Kontakt bringen der isolierten mRNA aus Schritt a) mit einer spezifischen Sonde, welche dazu in der Lage ist, ein Prostatatumor-induzierendes Gen unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen der mRNA und der Sonde gestatten, zu erkennen; und c) Detektion des gebildeten Komplexes, wobei eine positive Detektion des Komplexes die Präsenz von Krebszellen in der Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung bereit, ob ein Subjekt an metastatischem bzw. an Prostatakrebs in einem späten Stadium leidet, umfassend die Schritte: a) Erhalten einer geeigneten Probe von dem Subjekt; und b) Detektion der Expression eines Prostatatumor-induzierenden Gens in der Probe, wobei eine positive Detektion der Expression anzeigt, dass ein Subjekt an metastatischem bzw. an Prostatakrebs in einem späten Stadium leidet. Die geeignete Probe schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine Blut-, Urin- und Spermaprobe. Die geeignete Probe wird Prostatakrebszellen enthalten, so dass die Expression von Prostatatumor-induzierendem Gen detektiert werden kann.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Prostatatumor-induzierenden Gen um PTI-1, PTI-2 oder PTI-3.
In einer speziellen Ausführungsform des oben genannten Verfahrens erfolgt die Expression durch Messung des Spiegels von PTI-1-mRNA. In einer weiteren Ausführungsform wird die mRNA durch Reverstranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von wenigstens einem Paar von geeigneten Primern gemessen. In noch einer weiteren Ausführungsform ist wenigstens einer der Primer ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus 5' GAGTCTGAATAGGGCGACTT 3', 5' AGTCAGTACAGCTAGATGCC 3', 5' ACCCGAGAGGGGAGTGAAATA 3', 5' TGCCGCCATTCCACATTCAGT 3', 5' ATGGGGGTAGAGCACTGAATG 3', 5' AACACCAGCAGCAACAATCAG 3' und 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3'.
Anhand der nachfolgenden experimentellen Details wird die vorliegende Erfindung besser verstanden werden. Es wird jedoch für den Fachmann leicht zu erkennen sein, dass die diskutierten spezifischen Verfahren und Ergebnisse lediglich zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, welche in den angehängten Ansprüchen umfassender beschrieben ist.
Experimentelle Details
Materialien und Methoden
Zelllinien. Diese Studie beinhaltete die folgenden menschlichen Zelllinien: Prostatakarzinom (LNCaP, DU-145), Brustkarzinom (T47D) und Dickdarmkarzinom (SW480). Zusätzliche studierte Zelltypen schließen ein: CREF-Trans-6-Zellen und Nacktmaustumor-abgeleitete CREF-Trans-6-Zellen, transfiziert mit LNCaP-DNA (CREF-Trans-6:4-NMT) (5). Die Zellen wuchsen in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM), ergänzt mit 5% (Nagerzellen) oder 10% (menschliche Zellen) fetalem Kälberserum bei 37°C in einem mit 95% Luft und 5% CO₂ befeuchteten Inkubator. Alle verwendeten Zelllinien wurden auf Kontamination durch Mycoplasma untersucht unter Verwendung des GenProbe Mycoplasma-Testkits (Gaithersberg, MD), und wurden als frei von Mycoplasma befunden.
Extraktion von genomischer DNA und PCR. Menschliche/s Gehirn und Nieren wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu Pulver zermahlen und mit 100 μg/ml Proteinase K bei 50°C über Nacht verdaut, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung (7, 8). Oligonukleotide wurden synthetisiert zur PCR-Amplifikation entsprechend nt 147 bis 167 UU (5'-UTR Upper) und nt 550 bis 570 UL (5'-UTR Lower) von PTI-1 (GenBank, Zugangsnummer L41490). Das Primerpaar UU und UL wird ein Produkt mit 424 bp erzeugen. PCR wurde durchgeführt in einem Volumen von 50 μl, mit 1 μg genomischer DNA aus Gehirn oder Niere, 0,5 μM eines jeden Primers (UU und UL), 400 μM dNTPs, 2 mM Mg⁺⁺ und einer Einheit von Taq-DNA-Polymerase (GibcoBRL). Es wurden vierzig Amplifikationszyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 1 min bei 95°C, 1 min bei 55°C und 1 min bei 72°C auf einem programmierbaren Thermocycler (MJ Research). Es wurde die "Hot start"-PCR-Technik angewandt. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% Agarosegel mittels Ethidiumbromidfärbung analysiert.
RNA-Isolierung aus kultivierten Zellen und RT-PCR. Zytoplasmische Gesamt-RNA wurde aus logarithmisch wachsenden Zellkulturen isoliert wie zuvor beschrieben (9, 10). Ein μg aus verschiedenen Tumorzelllinien extrahierte Gesamt-RNA wurde mit 150 ng von willkürlichen Primern und 200 Einheiten von Superscript II-RNAseH^–-Reverstranskriptase (GibcoBRL) in der Anwesenheit von 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 500 mM dNTPs revers in cDNA transkribiert. Das Reaktionsgemisch (20 μl) wurde bei 42°C für 90 min inkubiert und durch Erhitzen bei 70°C für 15 min terminiert. Für die RT-PCR-Amplifikation wurden Oligonukleotide synthetisiert, welche nt 537 bis 557 BU (Bridge Upper) und nt 768 bis 788 BL (Bridge Lower) des PTI-1-Gens (GenBank, Zugangsnr. L41490) entsprachen. Das Primerpaar BU und BL werden ein Produkt von 252 bp erzeugen. PCR mit 2 μl des Reverstranskriptions-Reaktionsgemischs erwies sich dem genomischen DNA-Protokoll als ähnlich, mit einigen Modifikationen. Im ersten Durchgang der PCR wurden fünfzehn Amplifikationszyklen mit Primer BU (0,5 μM) allein durchgeführt und dann wurde Primer BL (0,5 μM) für weitere 40 Amplifikationszyklen hinzugegeben. PCR-Direktsequenzierung (New England Biolabs) wurde mit [γ-³²P] ATP-markierten Primern gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
Southern-Blotting-Analyse von RT-PCR-Produkten von PTI-1-Gen-Transkripten. Für die Southern-Blotting-Analyse wurde Oligonukleotide mit der BSP (Bridge Specific Probe), 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3', synthetisiert. Zehn pmol des BSP-Oligonukleotids wurden mit 5 μl [γ-³²P] ATP (10 mCi/ml) und 20 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (GibcoBRL) bei 37°C für 60 min in der Anwesenheit von 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 100 mM KCl und 1 mM β-Mercaptoethanol inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 70°C für 10 min terminiert und markierte Oligonukleotidsonde wurde mittels Ethanolfällung aufgereinigt. Durch das Primerpaar BU und BL amplifizierte RT-PCR-Produkte wurden gemäß standardmäßiger Kapillar-Blotting-Protokolle auf eine Nylonmembran (Hybond Film, Amersham) übertragen. Nach Fixierung bei 80°C für 2 Stunden wurde die Membran bei 56°C über Nacht in der Anwesenheit von 1% SDS, 1 M NaCl und 100 μg/ml sonifizierter Lachsspermien-DNA inkubiert. Die Hybridisierung erfolgte am nächsten Tag durch Inkubation mit 1% SDS, 1 M NaCl und markierter Sonde bei 56°C über Nacht. Die Membran wurde zweimal mit 100 ml 2 × SSC bei Raumtemperatur für jeweils 5 min gewaschen, einmal mit 200 ml 2 × SSC, 1% SDS bei 56°C für 30 min und einmal mit 200 ml 0,1% SSC bei Raumtemperatur. Das Blot wurde mit Kodak X-OMAT-Film für 30 min bei Raumtemperatur belichtet.
Bestimmung der PCR-Empfindlichkeit. RNA wurde aus LNCaP-Zellen und aus Gemischen von LNCaP- und CREF-Trans-6-Zellen im Bereich zwischen 1:1.000 und 1:100.000.000, wie zuvor beschrieben (9, 10) isoliert. PCR wurde unter Verwendung von PTI-1 5'-UTR-spezifischen Primern (5'-GAGTCTGAATAGGGCGACTT-3' und 5'-AGTCAGTACAGCTAGATGCC-3') (7) und PSA-spezifischen Primern (5'-TACCCACTGCATCAGGAACA-3' und 5'-CCTTGAAGCACACCATTACA-3') (14) durchgeführt. Die CREF-Trans-6-Zelllinie wurde ausgewählt, um LNCaP-Zellen zu verdünnen, da diese Zelllinie PTI-1 oder PSA (7, 8) nicht exprimiert.
Blutproben von Patienten, RNA-Aufarbeitung und PCR. Die in dieser Studie verwendeten Blutproben wurden von Patienten des Columbia Presbyterian Hospital und des Mount Sinai Medical Center erhalten. Die Proben wurden mit der ausdrücklichen Zustimmung eines jeden Patienten unter Einhaltung von Protokollen genommen, welche von den internen Kontrollausschüssen beider Institute genehmigt worden waren. Die Probenanalyse schloss Blutproben von 9 Patienten mit Krankheitsstadium D (3 mit D2 und 6 mit D3), 12 Patienten mit lokalisiertem Krebs der Prostata, 3 gesunden Männern und 3 gesunden Frauen ein. In mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelten Sammelgefäßen wurde venöses Blut (5 cc) gesammelt, auf Eis gelegt und innerhalb von 3 Stunden nach der Phlebotomie (11) aufgearbeitet. Die Proben wurden in einem gleich großen Volumen von PBS verdünnt und auf 8 cc Ficoll-Plaque geschichtet. Die Proben wurden bei 400facher Schwerkraft für 30 min zentrifugiert und die Speckhautzellen wurden gewonnen. Die Zellen wurden vor der RNA-Extraktion in PBS gewaschen. Die RNA wurde unter Anwendung einer modifizierten Guanidiniumthiocyanat/Phenol/Chloroform-Extraktionstechnik, welche sich des Rnazol B-Reagens bedient, extrahiert wie zuvor bereits beschrieben (11, 14). Ausgewählte Proben wurden mittels PCR unter Verwendung der zuvor beschriebenen Techniken und Primer (7, 10, 14) hinsichtlich PSA- und PSM-Expression getestet. Die PTI-1-Expression wurde unter Verwendung des gleichen 5'-UTR-Primerpaares, welches auch für die Bestimmung der PCR-Empfindlichkeit verwendet wurde (7), ausgewertet. Positive und negative PTI-1-Expression wurde ebenfalls in einer Teilmenge von Proben unter Verwendung von PCR mit den Primerpaaren UU und UL sowie BU und BL bestätigt.
Experimentelle Ergebnisse
Die 5'-UTR-Sequenz des PTI-1-Gens ist im menschlichen Genom vorhanden. Wenn PTI-1 wirklich ein ätiologisches Agens bei menschlichem Prostatakrebs ist, dann muss/müssen dieses Gen oder dazu verwandte DNA-Sequenzen ein Bestandteil des menschlichen genetischen Materials sein. Die Demonstration, dass die 5'-UTR von PTI-1, welche einen bemerkenswert hohen Grad an Homologie zu prokaryoten ribosomalen RNA-Sequenzen aufweist, in der Tat im menschlichen Genom vorhanden ist, wurde zur Priorität für zukünftige mechanistische Studien des PTI-1-Gens erklärt. Darüber hinaus wird diese Information benötigt, vor dem und ungeachtet des Mechanismus, durch welchen eine Aktivierung dieser Sequenz während der Krebsentwicklung erfolgt.
Wie in 2 gezeigt ist, erzeugte das Primerpaar UU und UL (welche Sequenzen in der 5'-UTR von PTI-1 repräsentieren) ein spezifisches PCR-Produkt der erwarteten Größe (424 bp) aus genomischer DNA aus dem menschlichen Gehirn. Die Größe des PCR-Produkts aus genomischer DNA (2, Spuren 1 und 2) ist die gleiche wie die Größe der cDNA aus PTI-1, was nahe legt, dass es sich um eine Region ohne Introns handelt. Es ist gut dokumentiert, dass sowohl prokaryote als auch eukaryote ribosomale RNA-Gene keine Introns aufweisen und die hierin angeführten Ergebnisse sind im Einklang mit dieser Folgerung (12). RNase-Verdau des Templates beeinflusste die Detektion dieses Produkts nicht. Die Amplifikation dieses Produkts erforderte auch die gleichzeitige Präsenz aller nachfolgenden Bestandteile in dem PCR-Reaktionsgemisch. Taq-Polymerase, beide Primer und die Template-DNAs (2). Ähnliche experimentelle Ergebnisse treten auf, wenn genomische DNA aus der menschlichen Niere für genomische DNA aus dem Gehirn substituiert wird (Daten nicht gezeigt).
Wenngleich die vorliegenden Studien die Möglichkeit der Präsenz einer winzig kleinen Menge an bakterieller DNA in den Präparaten aus genomischer DNA, was zu falschen positiven Ergebnissen führen würde, nicht definitiv ausschließen können, so wird doch anerkannt, dass die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch Mycoplasma in Gewebeproben weniger groß ist als in Zellkulturen (13). Die Möglichkeit, dass eine Kontamination durch Mycoplasma in den experimentellen Reagenzien gegeben ist, ist angesichts des Empfindlichkeitsgrads, welcher derzeit zur Detektion von PTI-1 in experimentellen DNA-Proben angewendet wird, nicht wahrscheinlich. Diese Ergebnisse unterstützen die Folgerung, dass es sich bei der 5'-UTR-Sequenz des PTI-1-Gens in der Tat um einen normalem Bestandteil des menschlichen Genoms handelt.
Detektion von zwischen der 5'-UTR- und der EF-1α-Kodierungsregion des PTI-1-Gens in Gesamt-RNA aus Tumorzelllinien lokalisierten Verbindungssequenzen. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass, selbst wenn in den studierten Zellkulturen eine Kontamination durch Mycoplasma oder verwandtes bakterielles Material vorliegen sollte, diese Kontamination alleine sicherlich nicht die aneinander angrenzende Präsenz von sowohl prokaryoten ribosomalen RNA-Sequenzen als auch menschlichen EF-1α-Sequenzen auf dem gleichen RNA-Molekül erklären könnte. Folglich ist es, sollte gezeigt werden können, dass ein solcher Verbindungspunkt in Gesamt-RNA existiert, unwahrscheinlich, dass die Identifizierung des PTI-1-Gens aufgrund eines experimentellen Artefakts erfolgte.
Wie in 3 gezeigt (Tafel A), erzeugt das Primerpaar BU (bestehend aus Sequenzen innerhalb der 5'-UTR von PTI-1) und BL (bestehend aus Sequenzen innerhalb der EF-1α-Region von PTI-1) ein RT-PCR-Produkt der erwarteten Größe (252 bp) in Gesamt-RNA aus CREF-Trans-6:4-NMT- (Nacktmaustumor-abgeleitete CREF-Trans-6-Klonzellen, transfiziert mit LNCaP-HMW-DNA), T47D- (menschliches Brustkarzinom), SW480- (menschliches Dickdarmkarzinom) sowie LNCaP- und DU-145- (menschliche Prostatakarzinom) -Zellen. Dieses PCR-Produkt wurde in aus CREF-Trans-6-Zellen extrahierter RNA nicht detektiert.
Dieses Expressionsmuster ist identisch mit dem, von welchem zuvor unter Verwendung von Northern-Blotting-Analyse und Sondierung mit einer PTI-1-5'-UTR-spezifischen Sonde (7) berichtet wurde. Wie in Tafel B gezeigt, hybridisiert dieses PCR-Produkt ebenfalls mit einer PTI-1-cDNA-spezifischen Oligonukleotid-BSP. Die BSP besteht aus 20 Nukleotiden, wobei 10 Nukleotide auf jeder Seite des Verbindungspunkts zwischen der 5'-UTR und der Kodierungsregion der PTI-1-cDNA liegen (1). Die in höchstem Maße stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen (siehe Materialien und Methoden), welche bei der Southern-Blotting-Analyse verwendet wurden, zeigen, dass dieses PCR-Produkt die PTI-1-cDNA-Sequenzen enthält, und zwar genau die Sequenz, welche den Verbindungspunkt zwischen der 5'-UTR und der Kodierungsregion des PTI-1-Gens umgibt. Diese Folgerung wurde weiter unterstützt mittels der direkten Sequenzierung eines der PCR-Produkte, welche aus der tumorabgeleiteten CREF-Trans-6:4-NMT-Zelllinie (Daten nicht gezeigt) erhalten wurde, was dokumentiert, dass es sowohl aus prokaryoten ribosomal-ähnlichen RNA-Sequenzen als auch aus menschlichen EF-1α-Sequenzen besteht. Diese Sequenzen waren die gleichen wie die zuvor für das PTI-1-Gen veröffentlichten (7).
Ebenfalls war es wichtig, die Möglichkeit auszuschließen, dass das PTI-1-Plasmid eine Quelle von möglicherweise Kontamination verursachenden Ergebnissen, also Artefakten, sein könnte. Das PTI-1-Gen wurde anfangs als eine 1,8 Kb-Insertion aus einer LNCaP-cDNA-Bibliothek identifiziert. Im Anschluss daran wurden mittels des RACE-Verfahrens die übrigen 215 bp am 5'-Ende erhalten (7). Da die fehlende Region von PTI-1 in der 5'-UTR lokalisiert wurde, wurde nie eine PTI-1-cDNA mit vollständiger Länge erzeugt. Daher konnten jegliche PCR- oder RT-PCR-Produkte, welche mit aus den Regionen der ersten 215 bp und der verbleibenden 415 bp der 5'-UTR von PTI-1 konstruierten Primern hergestellt wurden, nicht von einem Plasmid-Template abgeleitet sein, sondern konnten nur aus RNA oder genomischer RNA stammen. Wie in 3 gezeigt (Tafel C), gestattete das Primerpaar UU (lokalisiert in der ersten 215 bp-Region, welche in dem PTI-1-cDNA-Klon fehlt) und UL (konstruiert innerhalb der 5'-UTR von PTI-1, welche in dem PTI-1-cDNA-Klon vorhanden ist) die Amplifikation der 5'-UTR-Sequenzen von PTI-1 aus der gleichen Gesamt-RNA von Tumorzelllinien, welche für die Brückenregion positiv waren. Darüber hinaus ist das Expressionsmuster dieser Sequenz identisch mit dem der Verbindungssequenzen des PTI-1-Gens (3A und B).
Diese Ergebnisse dokumentieren, dass es sich bei dem PTI-1-Gen um ein authentisches menschliches Onkogen handelt, welches in spezifischen menschlichen Tumorzelllinien exprimiert wird, welche von in geeigneter Weise transfizierten CREF-Trans-6- (CREF-Trans-6:4-NMT-) sowie Prostata- und weiteren menschlichen Karzinomen abgeleitet werden.
Expression des PTI-1-Gens in Blutproben von Prostatakarzinompatienten. Um die Empfindlichkeit von PTI-1 als einem Gen-basierten Marker zur Detektion von Prostatakarzinomzellen zu bestimmen, wurden PTI-1 exprimierende LNCaP-Zellen seriell mit nicht PTI-1 exprimierenden CREF-Trans-6-Zellen verdünnt, Gesamt-RNA wurde isoliert und Proben wurden mittels RT-PCR hinsichtlich der PTI-1-Expression verglichen (4A). Unter Verwendung von Primern, welche in der einzigartigen 5'-UTR-Region von PTI-1 konstruiert wurden, wurde ein positives PTI-1-spezifisches amplifiziertes Fragment (280 bp) detektiert, als eine LNCaP-Zelle in 10⁸ CREF-Trans-6-Zellen verdünnt wurde. Im Gegensatz dazu wurde, wenn die PSA entsprechenden Primersequenzen zur Amplifikation verwendet wurden, ein schwächeres Signal (entsprechend einem Fragment von 486 bp) erhalten, welches eine in 10⁶ CREF-Trans-6-Zellen verdünnte LNCaP-Zelle repräsentierte. Die Effizienz der PSM-Detektion (14) in seriell verdünnten Zellen unter Verwendung eines einzelnen Paars von PSM-spezfischen Primern (welche ein Fragment von 647 bp erzeugen) war sogar noch weniger empfindlich als PSA, welches eine in 10⁵ CREF-Trans-6-Zellen (Daten nicht gezeigt) verdünnte Prostatakarzinomzelle detektierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass RT-PCR von PTI-1 gegenwärtig die empfindlichste verfügbare Detektionsmethode für menschliche Prostatakarzinomzellen ist und die Empfindlichkeit von PSA und PSM deutlich übersteigt.
Die ausgezeichnete Empfindlichkeit von PTI-1 bei der Detektion von Prostatakrebszellen in verdünnten Proben (4A) deutete darauf hin, dass sich die Überwachung von PTI-1-Transkripten auch als ein direkter Screeningtest zur Detektion von Prostatakarzinomzellen im Blutkreislauf eines Prostatakrebspatienten als nützlich erweisen könnte. Um festzustellen, ob diese Annahme korrekt war, wurde unter Verwendung von Primern, welche für die 5'-UTR von PTI-1 spezifisch waren, mit aus Blutproben isolierter RNA, welche für die PSA- und/oder PSM-Expression als positiv oder negativ bestätigt worden waren, eine RT-PCR durchgeführt (4B). PTI-1 war dazu in der Lage, Karzinomzellen in Proben, welche für sowohl PSA und PSM als positiv befunden worden waren, ebenso wie in Proben, welche nur für einen dieser beiden Marker als positiv befunden worden waren, zu detektieren. Im Gegensatz dazu waren 6 als negativ bestätigte Proben von freiwilligen Frauen und Männer sowie 4 Patienten mit Prostatakrebs, der sich noch nicht über den Rand der Prostatadrüse hinaus ausgebreitet hatte (ebenso als negativ für PSA und/oder PSM befunden) negativ für die PTI-1-Expression (insgesamt 18 Proben: 8 von 8 bestätigt positiven, 10 von 10 bestätigt negativen) (4B und unveröffentlichte Daten).
Ein zweiter Test von PTI-1 beinhaltete eine zweifache Kontrollstudie unter Verwendung von 9 willkürlichen aus Blutproben isolierten RNAs. Diese Proben wurden mittels RT-PCR unter Verwendung von PSA-spezifischen Primern (11) bzw. dem Primerpaar UU und UL (innerhalb der 5'-UTR von PTI-1) für PSA- und PTI-1-Expression analysiert. Von diesen 9 Proben wurden zwei als positiv für PTI-1-Transkripte befunden. Diese beiden Proben waren ebenfalls positiv für PTI-1, wenn das Primerpaar BU und BL verwendet wurde. Ein Patient, der als an metastatischem Prostatakrebs erkrankt bestätigt war, war positiv für die PTI-1-Expression, aber negativ für die PSA-Expression. Von dem anderen PTI-1-positiven Patient wurde jedoch aus pathologischer Sicht vorausgesetzt, dass er an lokalisiertem Krebs in der Prostatadrüse litt, und die Blutprobe dieses Patienten war ebenfalls negativ für RT-PCR von PSA. Unter den verbleibenden 7 Patienten wurde von 7 bestätigt, dass sie an nicht metastatischem Prostatakrebs litten und sie waren alle negativ für PTI-1-Expression, wohingegen für PSA-Expression 5 von 7 negativ und 2 positiv waren. Der einzige Patient, bei dem aufgrund sehr hoher Serum-PSA-Proteinwerte metastatischer Prostatakrebs vermutet wurde, erwies sich bei der RT-PCR negativ für sowohl PTI-1- als auch PSA-Expression.
Zusammen betrachtet deuten die oben beschriebenen Studien an, dass 9 von 10 (90% Empfindlichkeit) Prostatakrebspatienten mit bestätigter metastatischer Krankheit positiv für die PTI-1-Expression durch RT-PCR waren, wohingegen nur 4 von 9 (44% Empfindlichkeit) Blutproben der gleichen Patienten mit metastatischer Krankheit PSA exprimierten. Darüber hinaus war nur einer von 13 Patienten (~8% potentiell fälschlicherweise positiv) ohne erkennbare Anzeichen von sich über die Prostatadrüse hinaus ausbreitenden Prostatakarzinom positiv für PTI-1, wohingegen 2 von 10 Patienten (20% potentiell fälschlicherweise positiv) in der gleichen Gruppe positiv für PSA waren. Wenngleich es weiterer Studien mit einer größeren Anzahl von Patientenproben bedarf, einschließlich Patienten mit und ohne bestätigten metastatischen Prostatakrebs, liefern die vorliegenden Studien zwingende Beweise, welche nahe legen, dass sich RT-PCR von PTI-1 als nützlich erweisen könnte als eine empfindliche Methodologie zur Überwachung von extraprostatischen Krankheiten in Patienten vor der Operation, zur Feststellung des Ausbreitungsgrads des Prostatakrebses und zur Auswertung der Reaktion eines Patienten auf Chemotherapie und Bestrahlungstherapie.
Experimentelle Diskussion
Die Fähigkeit, die Aggressivität von menschlichem Prostatakrebs akkurat überwachen zu können, ist eine Priorität bei der Bestimmung der geeigneten Mittel zum therapeutischen Eingreifen in den Verlauf dieser Krankheit. Jüngste Studien dokumentieren, dass die Identifizierung von im Blutkreislauf mitgetragenen PSA exprimierenden Zellen mittels RT-PCR sowohl in Patienten mit lokalisiertem als auch mit metastatischem Prostatakrebs erreicht werden kann und dass diese Detektion einen verlässlichen Marker zur Voraussagung der lokalen Invasion eines Prostatatumors noch vor chirurgischen Eingriffen darstellt (11, 14, 15). PSA, ein Glykoprotein mit 34 kDa, ist eine mit der Prostata assoziierte Serinprotease mit prädominanter Expression durch Epithelzellen der Prostata, die Zellen, welche am häufigsten mit der prostatischen Onkogenese in Verbindung gebracht werden (16, 17). Kürzlich veränderten Assays, welche zur Überwachung dieses Proteins im Blut verwendet wurden, den Umgang mit Prostatakrebspatienten dadurch, dass sie die Früherkennung von Prostatatumoren gestatteten und dass sie ein wirksameres Mittel zur Verfolgung des Fortschreitens dieser Krankheit bereitstellten. Die Spezifität von PSA für Prostatazellen gestattete die Entwicklung eines auf RT-PCR basierenden Assays, das dazu in der Lage ist, sogar eine einzige PSA synthetisierende Zelle in 10⁶ nicht PSA exprimierenden Blutzellen zu detektieren (11, 14, 15). Eine weitere Verbesserung der PSA-Assays beinhaltet die Addition von Digoxigenin-modifizierten Nukleotiden zu der PCR-Reaktion (9, 13). Ein aus solchen Elektrophoresereaktionsprodukten angefertigtes Southern Blot kann dann mittels empfindlicher Immunfärbungstechniken analysiert werden, welche die Detektion des spezifischen PSA-abgeleiteten cDNA-Produkts immens verbessern. Wurde dieses verbessern Assay früher auf periphere Blutproben aus Prostatakrebspatienten mit bestätigten Metastasen angewandt, so war es positiv für die Mehrheit (77,7%) der Patienten in dieser Kategorie, welche untersucht wurden (9, 13). PTI-1 wird in der normalen Prostata oder in BPH nicht exprimiert, doch die PTI-1-Expression ist offensichtlich in sowohl PSA-positiven hormonsensitiven Zellen, LNCaP-Zellen und PSA-negativen hormonrefraktiven Zellen, DU-145 als auch in menschlichen Prostatakarzinomzellen (7). Bei der Detektion von Prostatakrebszellen zeigt die aktuelle Studie einen ≥ 100fachen Anstieg der Empfindlichkeit von RT-PCR von PTI-1 im Gegensatz zu PSA und PSM. Darüber hinaus führte die PTI-1-RT-PCR zu einer 90%igen Empfindlichkeit bei der Detektion von Patienten mit metastatischem Prostatakrebs im Gegensatz zu einer 44%igen Empfindlichkeit mit den gleichen Patientenproben unter Verwendung von RT-PCR mit PSA. In diesem Zusammenhang kann ein auf RT-PCR basierendes Assay unter Verwendung von PTI-1 die Detektion von Prostatakrebszellen im Kreislauf gestatten, welche unter Verwendung von RT-PCR mit PSA oder PSM nicht detektiert werden würden. Außerdem eliminiert die Spezifität von PCTA-1 für Prostatakarzinom im Gegensatz zur normalen Prostata oder zu BPH die Möglichkeit der Erzeugung von fälschlicherweise positiven Ergebnissen, welche unter Verwendung von RT-PCR von PSA oder PSM auftreten könnten.
Wichtige Fragen, welche experimentell angesprochen werden, schließen die Frage nach der Beschaffenheit der 5'-UTR-Region von PTI-1, welche Homologie zu bakterieller ribosomaler 23S-RNA aufweist, sowie nach der Echtheit des PTI-1-Gens ein (7). Das PTI-1-Gen wurde kloniert aus einer LNCap-menschlichen-Prostatakrebs-cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Fragments von 214 bp, welches mittels differentiellen RNA-Displays in LNCaP-DNA-transfizierten tumorabgeleiteten CREF-Trans-6-Zellen detektiert wurde (7). Sequenzanalysen bestätigen, dass die 214 bp-Sequenz mit Homologie zu prokaryoter ribosomaler RNA innerhalb der 5'-UTR des PTI-1-Gens liegt (7). Wenngleich alle in der Originalstudie verwendeten Zelllinien unter Verwendung des GenProbe Mycoplasmatestkits getestet wurden und als frei von Kontamination durch Mycoplasma befunden wurden, so ist es dennoch möglich, dass die PTI-1-Gene aus einem Klonierungsartefakt entstanden sind, welches von einem in den CREF-Trans-6:4-NMT- oder LNCaP-Zelllinien vorhandenen geringen Spiegel an undetektierter bakterieller Kontamination erzeugt wurde. Derzeit existieren mehrere Beweisführungen, welche gegen diese Möglichkeit argumentieren und die Authentizität des PTI-1-Gens validieren. Unter Verwendung von auf PCR basierenden Ansätzen mit aus dem menschlichen Gehirn und der menschlichen Niere isolierter DNA wird die Anwesenheit der homologen prokaryoten ribosomalen RNA-Sequenzen im menschlichen Genom durch diese Studie dokumentiert. Unter Verwendung einer auf RT-PCR basierenden Strategie mit Primern, welche der 5'-UTR- und der EF-1α-Kodierungsregion von PTI-1 entsprechen, wird eine geeignete Verbindungssequenz aus Gesamt-RNA aus CREF-Trans-6:4-NMT-Zellen, verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien und Blutproben von Patienten mit bestätigtem metastatischen Prostatakrebs amplifiziert. Selbst wenn die Gewebeproben und Zelllinien Mycoplasma oder verwandtes bakterielles Kontaminationsmaterial aufwiesen, so wären diese unerwarteten Organismen alleine nicht dazu in der Lage, die einzigartige Verbindungssequenz in einer Population von zytoplasmischer Gesamt-RNA zu erzeugen. Die Fähigkeit, eine solche Verbindungssequenz in Gesamt-RNA aus spezifischen Krebszellen zu detektieren, liefert einen zwingenden Beweis für die Authentizität des PTI-1-Gens und dessen kodierter Information.
Die vorliegende Studie wirft eine Reihe wichtiger Probleme auf, welche einer Lösung bedürfen, damit die Rolle von PTI-1 in der Ätiologie und der Entwicklung von menschlichem Krebs definiert werden kann. Die Dokumentation der Präsenz der 5'-UTR-Mycoplasma-Homologieregion im menschlichen Genom zwingt einen dazu, den potentiellen Ursprung solcher prokaryoter Gensequenzen im eukaryoten Genom zu untersuchen. Wenngleich kein Mechanismus bereitgestellt wird, so legt eine neue Studie eine potentielle Beziehung zwischen anhaltender chronischer Infektion mit Mycoplasmen und der malignen Transformation nahe (18). Im Gegensatz zu Retroviren und DNA-Tumorviren, welche dazu in der Lage sind, ihr genetisches Material in das Wirtsgenom einzubauen, gibt es derzeit keine Beweise, welche anzeigen, dass Mycoplasma-Gensequenzen dazu in der Lage sind, sich als Teil ihres Infektionszyklus in das menschliche Genom zu integrieren. Es ist jedoch möglich, dass Mycoplasma, oder noch wahrscheinlicher einer seiner Vorläufer, sein genetisches Material willkürlich in das Genom eines Menschen oder eines seiner Vorfahren einbauen könnte. Diese Integration kann durch einen Mechanismus erfolgen, welcher dem Mechanismus ähnlich ist, mit welchem sich fremde Gensequenzen in das Genom von transgenen Tieren integrieren. Über die Präsenz von Sequenzen, welche in höchstem Maße homolog zu prokaryoten Genen im menschlichen Genom sind, wurde bereits berichtet, wenngleich die Funktionen dieser Sequenzen nicht bekannt sind (19). Es ist sehr verlockend zu spekulieren, dass, basierend auf dem hohen Grad der Homologie zwischen der 5'-UTR von PTI-1 und Mycoplasma-Gensequenzen, ein solches Ereignis in der jüngeren Evolution stattfand und so das PTI-1-Gen erzeugte.
Zusätzliche wichtige Fragestellungen betreffen den Mechanismus, mit dem die PTI-1-Expression in menschlichen Tumorzellen aktiviert wird, und die Rolle von PTI-1 bei der Vermittlung des Krebsphänotyps. Differentielle Expression von PTI-1 in Krebszellen kann durch Aktivierung der Transkription durch einen stromaufwärts gelegenen Promotor aus dem EF-1α- oder einem anderen Targetgen erfolgen, was zur Transkription der 5'-UTR- und der EF-1α-Region von PTI-1 führt. Alternativ dazu könnte die Genaktivierung von einer Neuordnung des Genoms herrühren, einschließlich der Gendeletion, -inversion und -translokation, welche in manchen Krebsarten durchaus häufige Vorgänge darstellen (20, 21). Eine Entschlüsselung der genomischen Struktur, einschließlich der Promotorregion, von PTI-1 ist erforderlich, um diese Frage zu durchleuchten und die molekulare Basis für die differentielle Expression von PTI-1 in der menschlichen Prostata, und zusätzlich bei Krebserkrankungen im Gegensatz zu normalen Zellen, zu definieren. Weiterführende Studien sind außerdem erforderlich, um die funktionelle Relevanz der PTI-1-Expression bei der Bestimmung des Krebsphänotyps zu bestimmen. Wenn gezeigt werden kann, dass die PTI-1-Expression kausal mit der Entstehung oder dem Fortschreiten von Krebs verknüpft ist, dann könnte dieses Gen als ein potentielles Target zur Inhibierung des neoplastischen Prozesses dienen.
Zweite Serie von Experimenten
Unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls wurden Blutproben hinsichtlich der Präsenz von PTI-1 gescreent (Sun et al., Cancer Research 57: 18–23, 1997). Kurz zusammengefasst: Gesamt-RNA wurde mit 150 ng willkürlicher Primer und 200 U Superscript II RNAase H' (Life Technologies) in der Anwesenheit von 50 mM Tris-HCL pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 500 μM Desoxynukleotidtriphosphaten revers in cDNA transkribiert. Das Reaktionsgemisch (20 μl) wurde bei 42°C für 90 Minuten inkubiert und durch Erhitzen bei 70°C für 15 Minuten terminiert. Oligonukleotide wurden zur RT-PCR-Amplifikation gemäß der Sequenz des PTI-1-Gens (GenBank, Zugangsnr. L41490) synthetisiert. Es wurden die folgenden Primerpaare verwendet:
Primer UU (5'UTR Upper) 5' ACCCGAGAGGGGAGTGAAATA 3'
Primer UL (5'UTR Lower) 5' TGCCGCCATTCCACATTCAGT 3'
Primer BU (Bridge Upper) 5' ATGGGGGTAGAGCACTGAATG 3'
Primer BL (Bridge Lower) 5' AACACCAGCAGCAACAATCAG 3'
Oligonukleotid BSP (Bridge Specific Probe) 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3'
Experimentelle Ergebnisse:
Alle mRNAs wurden hinsichtlich des Abbaus durch Elektrophorese (nicht gezeigt) und der Präsenz des Housekeeping-Gens, GAPDH, mittels RT-PCR gescreent (1). Die Amplifikation mit den Primern BU und BL ist in 2 gezeigt. Wie zu erkennen ist, waren eine große Anzahl von Blut-RNAs positiv hinsichtlich der Brückenregion. Eine Probe aus einem Individuum mit keinerlei Anzeichen einer Krebserkrankung wies ein sehr schwaches Band auf. Dieses Gel wurde geblottet und im Anschluss mit einem 20-mer-brückenspezifischen Primer (BSP) sondiert. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, waren 14 aus 33 Proben positiv.
TABELLE 1. Hinsichtlich der Brücken- (BU und BL) und der brückenspezifischen (BSP) Primer positive Blutproben
Die normale Blutprobe (# 33) war negativ für die BSP. Zusätzliches Screening der Blutproben erfolgte unter Verwendung der 5'-UTR-Primer UU und UL. Es waren zwei Amplifikationsdurchgänge erforderlich, um die Banden sichtbar zu machen. Wie zu erkennen ist, wiesen 4 von 33 Proben ein Band in der geeigneten bp-Region auf (3). Zwei zusätzliche Proben wiesen jeweils ein Band geringfügig oberhalb bzw. geringfügig unterhalb des erwarteten Molekulargewichts auf. Die normale Blutprobe war hinsichtlich der 5'-UTR negativ.
Experimentelle Diskussion
Die Ergebnisse dieser Experimente bestätigen den zuvor erwähnten Nutzen von PTI-1 als ein Mittel zur Diagnose für Prostatakrebs im Spätstadium. Alle der positiven Proben (unter Verwendung von BSP und der 5'-UTR) waren zuvor als an Erkrankung im Spätstadium oder metastatischer Erkrankung leidend diagnostiziert worden. Interessanterweise waren zwei Banden zu erkennen, welche die 5'-UTR-Primer verwendeten, welche von dem erwarteten Molekulargewicht für PTI-1 abwichen. Da dieses Gen ein Mitglied einer großen Familie von verwandten Sequenzen ist, ist es möglich, dass andere PTI-Gene von diagnostischem Nutzen zur Krebserkennung sein können.
Referenzen

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Claims

Ein Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer Urin- oder Spermaprobe, umfassend (a) Herstellen von RNA aus der Probe; (b) Inkontaktbringen der RNA aus (a) mit einer spezifischen Sonde, die unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen der RNA und der Sonde erlauben, in der Lage ist, ein Prostata-Tumor-induzierendes Gen-1 zu erkennen und (c) Durchführen einer reversen Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die die Herstellung von Kopien von Prostata-Tumor-induzierender Gen-1 Nukleinsäure erlauben, und (d) Bestimmen, ob eine nachweisbare Menge an Prostata-Tumor-induzierender Gen-1-Nukleinsäure in (c) hergestellt wurde, wobei eine nachweisbare Menge an Prostata-Tumor-induzierender Gen-1-Nukleinsäure den positiven Nachweis einer Expression darstellt und der positive Nachweis der Expression das Vorhandensein von Krebszellen in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die spezifische Sonde in (b) wenigstens ein Paar an geeigneten Primeren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem wenigstens einer der Primeren entweder komplementär zu der 5'- oder 3'-untranslatierten Region des Prostata-Tumor-induzierenden Gens-1 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem wenigstens einer der Primeren komplementär zu der 5'-untranslatierten Region und der andere Primer komplementär zu der kodierenden Region des Prostata-Tumor-induzierenden Gens-1 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem wenigstens einer der Primeren komplementär zu der 3'-untranslatierten Region und der andere Primer komplementär zu der kodierenden Region des Prostata-Tumor-induzierenden Gens-1 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem wenigstens einer der Primeren aus der Gruppe bestehend aus 5' GAGTCTGAATAGGGCGACTT 3' (SEQ ID Nr. 6), 5' AGTCAGTACAGCTAGATGCC 3' (SEQ ID Nr. 7), 5' ACCCGAGAGGGGAGTGAAATA 3' (SEQ ID Nr. 1), 5' TGCCGCCATTCCACATTCAGT 3' (SEQ ID Nr. 2), 5' ATGGGGGTAGAGCACTGAATG 3' (SEQ ID Nr. 3), 5' AACACCAGCAGCAACAATCAG 3' (SEQ ID Nr. 4) und 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3' (SEQ ID Nr. 5) ausgewählt ist.
Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer Urin- oder Samenprobe, umfassend (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der in der Lage ist, Prostata-Tumor-induzierendes Gen-1 Protein unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen Prostata-Tumor-induzierendem Gen-1-Protein und dem Antikörper erlauben, spezifisch zu erkennen, (b) Bestimmen, ob eine nachweisbare Menge an Antikörper:Prostata-Tumorinduzierendem Gen-1-Protein-Komplex in (a) gebildet wurde; wobei eine nachweisbare Menge an Antikörper:Prostata-Tumor-induzierendem Gen-1-Protein den positiven Nachweis von Krebszellen in der Probe darstellt.
Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer Urin- oder Samenprobe, umfassend die Schritte a) Isolierung von mRNA aus der Probe, b) Inkontaktbringen der isolierten mRNA aus Schritt a) mit einer spezifischen Sonde, die unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen der mRNA und der Sonde erlauben, in der Lage ist, ein Prostata-Tumor-induzierendes Gen zu erkennen und c) Nachweis des gebildeten Komplexes, wobei ein positiver Nachweis das Vorhandensein von Krebszeilen in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der positive Nachweis einer Expression anzeigt, dass die Person metastatischen oder Prostatakrebs in einem späten Stadium hat.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Komplex in (c) Prostata-Tumor-induzierende Gen-1-mRNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die spezifische Sonde in (c) wenigstens ein Paar an geeigneten Primeren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem wenigstens einer der Primeren aus der Gruppe bestehend aus 5' GAGTCTGAATAGGGCGACTT 3' (SEQ ID Nr. 6), 5' AGTCAGTACAGCTAGATGCC 3' (SEQ ID Nr. 7), 5' ACCCGAGAGGGGAGTGAAATA 3' (SEQ ID Nr. 1), 5' TGCCGCCATTCCACATTCAGT 3' (SEQ ID Nr. 2), 5' ATGGGGGTAGAGCACTGAATG 3' (SEQ ID Nr. 3), 5' AACACCAGCAGCAACAATCAG 3' (SEQ ID Nr. 4) und 5' AAATTAAGCTATGCAGTCGG 3' (SEQ ID Nr. 5) ausgewählt ist.