DE69302276T2

DE69302276T2 - Diagnostische Methode

Info

Publication number: DE69302276T2
Application number: DE69302276T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Matsumura; David Tarin
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1992-07-21
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2013-07-21
Also published as: EP0651822B1; US5830646A; EP0651822A1; JP2800850B2; CA2139410A1; WO1994002633A1; DE69302276D1; JPH08500731A; ATE136940T1

Description

Hintergrund

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Expression des CD44-Gens oder eines Teils des CD44-Gens, um Neoplasien zu untersuchen. Eine solche Untersuchung schließt ein, daß man Gewebe, eine Körperflüssigkeit oder eine andere Probe von einem Patienten entnimmt, um eine Diagnose durchzuführen, um eine Prognose abzugeben oder eine Therapie auszuwerten, die bereits durchgeführt wurde. Insbesondere liefert die Erfindung ein einfaches Verfahren, um eine Routineprüfung auf Neoplasien durchzuführen unter Verwendung von Proben einer Körperflüssigkeit oder anderer Proben, die nicht-invasiv erhalten werden können.
Der gewöhnliche Weg der Diagnose eines Tumors besteht derzeit darin, die Zellen oder dünne Gewebeschnitte unter einem Mikroskop anzuschauen, ein Verfahren, das oft sehr wirksam ist, aber einige wesentliche Beschränkungen aufweist. Bei einer kleinen Probe kann die Diagnose sehr schwierig sein und häufig ist eine große Anzahl von Zellen nicht erhältlich oder es ist nicht wünschenswert oder möglich, eine große Probe von dem Patienten zu erhalten. Bei 50 % der Fälle kann eine zuverlässige Diagnose nicht gegeben werden; es kann sein, daß es keinen positiven Hinweis auf ein Karzinom gibt, aber auch keine Sicherheit, daß der Patient tatsächlich frei von Karzinomen ist. Mehr invasive Untersuchungen sind dann erforderlich, um eine Diagnose zu erstellen.
Die Beurteilung der Prognose beruht auch auf dem Aussehen von Zellen, wenn sie unter einem Mikroskop betrachtet werden. Im allgemeinen bilden die Zellen, je bizarrer sie bei einem Primärtumor aussehen, umso wahrscheinlicher später Metastasen, aber der Zusammenhang ist keinesfalls absolut. Es wäre eindeutig ein Vorteil, wenn man genauer vorhersagen könnte, ob eine Metastasenbildung wahrscheinlich auftritt oder nicht, um zu beurteilen, was die effektivste Behandlung ist.
Das menschliche CD44-Gen kodiert eine Familie von variabel glykosylierten Zelloberflächen-Proteinen verschiedener Größen, deren zahlreiche Funktionen bis jetzt noch nicht vollständig untersucht sind, die aber Epitope haben, die von monoklonalen CD44-Antikörpern (maB) erkannt werden. Es ist bekannt, daß sie aus einem Standardteil bestehen, der in hämatopoetischen Zellen und vielen anderen Zellarten exprimiert wird und in den die Produkte zusätzlicher Exons in verschiedenen Kombinationen gespleißt werden können, um verschiedene Proteine herzustellen. Dies ist ein wohlbekannter Mechanismus bei Eukaryoten, um verschiedene oft funktionell nicht in Beziehung stehende Proteine aus dem gleichen Gen zu produzieren und ist bekannt als alternatives Spleißen.
Zwei häufige CD44-Isoformen wurden bis jetzt gereinigt und charakterisiert (Stamenkovic et al., 1989), nämlich i) eine Form mit 90 kD, die aus einem zentralen Kern mit 37 kD besteht, der stark glykosyliert ist und ii) eine Form mit 180 kD, bei der 135 zusätzliche Aminosäuren in die proximale Extramembran-Domäne insertiert sind und die noch stärker glykosyliert ist. Immunocytochemische und Immunofällungsuntersuchungen haben gezeigt, daß beide in vielen verschiedenen Zellen und Geweben weit verbreitet sind. Das erstere Protein ist bekannt als die hämatopoetische oder Standardform, die auf zirkulierenden Leukozyten, Knochenmarkszellen und zahlreichen anderen Zelltypen vorhanden ist. Die andere Form, bekannt als die epitheliale Variante, ist bei verschiedenen Epithelialzelltypen nachweisbar. Von beiden wird angenommen, daß sie als Rezeptoren dienen, die homotypische und heterotypische Haftinteraktionen vermitteln, Zellen miteinander verbinden oder mit benachbarten extrazellulären ein Gerüst bilden.
Vor einiger Zeit wurde gefunden, daß einige der CD44-Epitope, die von dem mab Hermes-3 erkannt werden, den peripheren Lymphknoten-Rezeptor bilden, der es zirkulierenden Lymphozyten ermöglicht, periphere Lymphknoten zu erkennen und hindurchzuwandern. Weitere mabs zu diesem Antigen wurden später erhältlich und Stamenkovic et al. (1989) verwendeten einen davon, um eine cDNA-Sequenz zu klonieren, die die Standardform des Moleküls kodiert, aus einer Expressionsbibliothek in COS-Zellen. Sie fanden außerdem durch Northern- Blotting, daß dieses Gen nicht nur von Lymphoidzellen, sondern auch von einer Vielzahl von Karzinomzellen und einer repräsentativen Probe fester Karzinome exprimiert wurde, worunter zwei Kolonkarzinome mehr als das normale Darmepithel zu exprimieren schienen.
Birch und Kollegen (1991) berichteten, daß Melanom-Zellklone, die die 80 bis 90 kD-Form des CD44-Antigens exprimierten, das von dem Hermes-3-Antikörper erkannt wurde, wesentlich stärker metastasenbildend waren in nackten Mäusen als Klone, die es schwach exprimierten. Sy et al. (1991) beschrieben einen mäßigen Anstieg der Metastasen-Fähigkeit von humanen Lymphomzellen bei nackten Mäusen, nachdem die Zellen mit dem Standard-CD44-Gen transfiziert waren, nicht aber nach Transfektion mit einem Konstrukt, das die Epithelialvariante kodierte. Gunther et al. (1991) erhielten Ergebnisse, die darauf hindeuteten, daß eine Variantenform des Lymphozyten- Homing-Rezeptors, der von einem neuen Antikörper erkannt wurde, der gegen das Ratten-CD44-Antigen gezüchtet worden war, erforderlich ist, für das metastatische Verhalten von Ratten-Pankreas-Adenokarzinomzellen. Unter Verwendung dieses Antikörpers klonierten sie eine cDNA-Sequenz, die der Variantenform des CD44 entsprach und fanden, daß sie vorher nicht entdeckte Exons enthielt. Die Transfektion eines nicht metastatischen Klons aus der gleichen Zellinie mit einem Konstrukt, das dazu vorgesehen war, daß es diese cDNA-Sequenz, die für das das metastatische Gegenstück einzig war, überexprimierte, schien ein metastatisches Verhalten zu induzieren (Gunther et al., 1991).
Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde es interessant zu wissen, ob andere kultivierte metastatische und nicht metastatische menschliche Tumorzellinien verschiedenen histogenetischen Ursprungs CD44-Produkte verschieden exprimierten. Die Expression von Genen in Zellen oder Geweben kann am effizientesten und empfindlichsten untersucht werden, indem eine cDNA aus der zellulären messenger-RNA hergestellt wird und die Interessierenden Regionen mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden, wobei spezifische Oligonucleotidprimer verwendet werden, die so ausgewählt werden, daß sie überwiegend mit Teilen der cDNA hybridisieren, die den Genprodukten entsprechen. Jedoch lieferten die nachfolgende Arbeit von Hofmann et al. (1991) und der vorliegenden Anmelder unter Verwendung dieser Annäherung Ergebnisse, die zeigten, daß die CD44-Expression nicht regelmäßig und zuverlässig mit der Metastasenbildungs-Fähigkeit oder sogar der Tumorbildungs- Fähigkeit dieser kultivierten Zellinien in nackten Mäusen korrelierte. Etwa zu dieser Zeit veröffentlichten drei getrennte Gruppen (Hofmann et al. 1991, Stamenkovic et al. 1991 und Jackson et al., 1992) Sequenzdaten über weitere Spleib- Varianten, von denen sie gefunden hatten, daß sie von diesem Gen in verschiedenen Humanzellinien exprimiert wurden.

Die Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, die sich durch Untersuchungen ergab, bei denen die Expression verschiedener Teile des CD44-Gens in frischen Gewebe- und Körperflüssigkeitsproben von Patienten mit Tumoren der Brust und des Kolons und ihrer Metastasen untersucht wurde. Die Ergebnisse zeigen scharfe und klare Unterschiede in der CD44-Expression zwischen Geweben aus i) metastatischen (malignen) Tumoren, ii) nicht metastatischen lokal invasiven Tumoren und gutartigen Tumoren und iii) normalem Gewebe. Die Unterscheidung zwischen den Gruppen i) und ii) ist wichtig für die Beurteilung der Therapie und die zwischen den Gruppen ii) und iii) ist wichtig für die frühe Diagnose und Untersuchung.
Die Erfindung liefert daher in einem Aspekt ein Verfahren zur Diagnose von Neoplasien, wobei das Verfahren umfaßt, daß man die Expression des CD44-Gens in einer Probe analysiert.
In einer speziellen Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe auf Produkte des CD44- Gens oder eines Teils davon, wobei das Verfahren umfaßt, daß man cDNA aus messenger-RNA (mRNA) in der Probe herstellt, Teile der komplementären DNA (cDNA), die dem CD44-Gen oder einem Teil davon entsprechen, amplifiziert und die amplifizierte cDNA nachweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die amplifizierte cDNA zur Diagnose von Neoplasien verwendet wird.
Die Diagnose von Neoplasien kann sich auf den anfänglichen Nachweis von neoplastischem Gewebe beziehen oder kann die Stufe sein, in der zwischen metastatischen und nicht metastatischen Tumoren unterschieden wird. Bezugnahmen auf den Ausdruck "Diagnose", wie er hier verwendet wird, sind entsprechend zu verstehen.
Das Verfahren ist besonders gut anwendbar für die Diagnose von festen Tumoren, insbesondere malignen Tumoren, z.B. Karzinomen. Die Probe, an der der Test durchgeführt wird, ist bevorzugt Körpergewebe oder Körperflüssigkeit und es sind nicht Zellen, die in vitro gezüchtet wurden. Die Probe kann ein kleines Stück Gewebe oder mit Feinnadelbiopsie (FNA) entnommene Zellen aus einem festen Tumor sein. Alternativ kann es eine Probe von Blut oder Urin oder einer anderen Körperflüssigkeit, ein Zervikalabstrich oder eine nicht invasiv erhaltene Probe, wie Sputum, Urin oder Stuhl sein.
Die cDNA kann durch Verwendung einer oder mehrerer markierter spezifischer Oligonucleotidsonden nachgewiesen werden, wobei die Sonden so ausgewählt werden, daß sie mit einem Teil der amplifizierten cDNA-Sequenz hybridisieren können.
Alternativ könnten markierte oligonucleotidprimer und/oder markierte Mononudeotide verwendet werden. Es gibt eine Anzahl von geeigneten nachweisbaren Markierungen, die angewendet werden können, einschließlich radioaktiven Markierungen.
Es wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, worin
Figuren 1 bis 5 Autoradiographien sind, die die Ergebnisse verschiedener unten berichteter Untersuchungen zeigen,
Figur 6 eine Karte des CD44-Gens ist, die Exons, Sonden und Primer zeigt. Die Numerierung der Exons entspricht der, die von G.R. Screaton et al. (1992) verwendet wurde,
Figur 7 die Nucleinsäuresequenz von Exon 6 (in Figur 6 gezeigt) ist, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz auch gezeigt ist und
Figur 8 ein Satz von Autoradiographien ist, die die Ergebnisse eines weiteren Experiments zeigen.
Figur 6 ist eine Karte des CD44-Gens, die die Exons 6 bis 14 zeigt. Das Basis- oder Standardprotein kann theoretisch modifiziert werden durch Insertion von Transkripten von irgendeinem, einigen oder allen diesen neuen Extra-Exons. Exon 6 war bis zum Prioritätstag der Patentanmeldung unbekannt und bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Exon 6 wird in Tumoren überexprimiert, nicht aber in normalen Geweben und ist in der Nähe der Exons 7 und 9 angeordnet. Die Sequenz von Exon 6 ist in Figur 7 angegeben. Sie enthält 129 Basenpaare und wird flankiert an der 5'-Seite von der Standard-CD44-Sequenz und auf der 3'-Seite gewöhnlich von Exon 7.
Im Gegensatz zu den Exons 9 bis 11 sind die Produkte von Exon 6 (dem neu sequenzierten Exon) kaum in Proben von normalem Gewebe nachweisbar. Dies deutet darauf hin, daß Exon 6 bei der Diagnose von Neoplasien von besonderem Wert ist.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung als neue Verbindungen die Nucleinsäuresequenz von Exon 6, wie in Figur 7 gezeigt, charakteristische Fragmente davon, Sequenzen, die degeneriert sind und/oder Allelvariationen darstellen, die homologen Nudeinsäuresequenzen und Sonden, Primer und andere Reagenzien, die mit den Sequenzen oder homologen Sequenzen hybridisieren können. Diese Verbindungen und Reagenzien sind alle für das oben beschriebene Verfahren geeignet.
Weitere Aspekte der Erfindung schließen ein:
- die Peptidsequenz, die dem Exon 6 entspricht und in Figur 7 gezeigt ist, die Allelvariationen und sekundäre Modifikationen davon, wie Phosphorylierungs- und Glykosylierungsprodukte und charakteristische Fragmente davon, z.B. solche Fragmente, die Epitope bilden, wenn das Polypeptid in vivo gefaltet wird.
- Antikörper gegen die Peptidsequenz, ihre Allelvariationen und sekundäre Modifikationen davon, wie die Phosphorylierungs- und Glykosylierungsprodukte und die charakteristischen Fragmente davon. Solche Antikörper können markiert sein, z.B. mit einem radioaktiven Nuclid oder mit einer tumoriziden Verbindung.
- Verwendung eines markierten Antikörpers für die in vitro- Diagnose.
- Verwendung eines solchen radioaktiv markierten Antikörpers für die radioaktive Abbildung oder in vivo-Diagnose.
- Verwendung der Antikörper, die gegebenenfalls mit tumoriziden Verbindungen oder in anderer Weise markiert sind, zur Therapie.
Die Peptidsequenz oder das Fragment können mit Standardtechniken synthetisiert werden&sub1; z.B. unter Verwendung eines Syntheseautomaten. Die Antikörper können hergestellt werden, indem das Peptid in antigener Form einem geeigneten Wirt verabreicht wird. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können mit Standardtechniken hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur immunologischen Diagnose von Neoplasien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Überexpression eines Exons, das in der Nähe der Exons 7 bis 9 des CD44-Gens angeordnet ist, bestimmt. Bevorzugt hat das Exon die Nudeinsäuresequenz, die in Figur 7 gezeigt ist.
Die chaotische Überexpression von mehrfach gespleißten Varianten des CD44-Gens in Tumoren deutet darauf hin, daß ein spezielles Exon von einer speziellen Gewebeprobe überexprimiert werden kann oder nicht (oder überhaupt exprimiert werden kann). Ein Immuntest unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Peptid, das von irgendeinem einzelnen Exon exprimiert wird, kann daher zu falschen Ergebnissen führen. Die Erfindung schließt daher die Verwendung einer Mischung von Antikörpern gegen zwei oder mehr und bevorzugt alle 9 CD44-Exons für die immunologische Diagnose von Neoplasien ein.

Detaillierte Beschreibung

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Amplifizierung der cDNA durchgeführt, indem die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird. Für die PCR können Primer ausgewählt werden, indem die bekannte Information über die Sequenz der menschlichen CD44-cDNA verwendet wird. Primer können verwendet werden, die cDNA amplifizieren, die irgendeinem Teil des CD44-Gens, das exprimiert werden kann, entspricht. Dies kann den Standardteil mit oder ohne die insertierten Exons einschließen oder sie kann Teil oder der gesamte Teil eines oder mehrerer Exons sein. Im letzteren Fall gäbe es weniger Verschwendung von Reagenzien und es würde ein besseres Signal erzeugt und eine Sonde für die Standardsequenz würde nicht verwendet werden müssen.
Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung der Straightforward-PCR begrenzt. Ein System ineinandergeschachtelter Primer kann z.B. verwendet werden. Andere geeignete Amplifizierungsmethoden, die auf diesem Gebiet bekannt sind, können auch angewendet werden.
Bei einem weiteren Verfahren der Erfindung wird die amplifizierte cDNA durch Elektrophorese abgetrennt. Das Blotten und die Autoradiographie können dann an der abgetrennten cDNA durchgeführt werden. Die Autoradiographie beinhaltet, daß man elektrophoretisch getrennte amplifizierte Produkte, die durch Blotten auf einer Nylonmembran immobilisiert wurden, mit einer radioaktiv markierten spezifischen oligonucleotidsonde, die mit ³²P oder einer anderen geeigneten Markierung markiert ist, sondiert, wobei die Sonde so ausgewählt ist, daß sie mit einem Teil der amplifizierten cDNA-Sequenz hybridisieren kann. Die Nachweisstufe betrifft dann, daß man die markierte, abgetrennte cDNA einem Röntgenfilm aussetzt.
In den Beispielen, die folgen, wurde gefunden, daß die Expression des Human-CD44-Gens bei verschiedenen festen Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe durchgehend und unterscheidbar erhöht war. Maligne (d.h. bereits metastatische) Tumoren unterschieden sich von lokal invasiven und gutartigen in dem Muster und der Größe der Veränderungen, die gesehen wurden. Die Untersuchung wurde an Proben von 46 Tumoren durchgeführt, von denen 44 lokal invasiv oder metastatisch waren und 2 gutartig waren. Die Analyse der CD44- Expression wurde durchgeführt unter Verwendung von PCR um die cDNA, die durch reverse Transkription von RNA, die aus frischen chirurgischen Biopsieproben extrahiert worden war, hergestellt worden war, zu amplifizieren. Durch Auswahl der oligonucleotidprimer, die spezifisch mit bestimmten Teilen des CD44-Gens hybridisieren, ist es möglich, Teile des Gens zu amplifizieren, die, aufgrund dieser Ergebnisse, von diagnostischem und prognostischem Interesse sind.
Die starke hier gefundene Verbindung zwischen der veränderten CD44-Expression und den Neoplasien muß nicht bedeuten, daß irgendeines der einzelnen Exons des Gens nur von Neoplasien oder bei Fortschreiten bis zu einer metastatischen Bösartigkeit exprimiert wird. Hinweise, die in vielen Laboratorien in den letzten Jahren gefunden wurden (siehe Knudson 1985, Tarin 1991, Hayle et al. 1992 bezüglich Übersichten) deuten darauf hin, daß diese pathologischen Prozesse wahrscheinlich die Folge einer gestörten Regulation von Genen sind, die normale zelluläre Aktivitäten, wie die Zellvermehrung und Wanderung kodieren. Daher ist es unwahrscheinlich, daß irgendein Gen oder Teil eines Gens die einzige Funktion hat, Neoplasien oder Metastasen zu programmieren.
Das Auffinden von Transkripten von Exon 10/11 in normalen Geweben in der vorliegenden Untersuchung deutet darauf hin, daß dieses Exon nicht ausschließlich mit metastatischer Aktivität verbunden ist, obwohl es einen bedeutenden Anstieg in der Anzahl und Signalintensität von Banden gibt, die mit der radioaktiv markierten Sonde E4 hybridisieren bei den PCR- Produkten von Tumoren, die zur Metastasenbildung fähig sind. Es wird daher angenommen, daß andere unterstützende Ereignisse erforderlich sind für die CD44-Exon 10/11-Expression, um zu einem metastatischen Verhalten zu führen. Nichtsdestotrotz verspricht die Beobachtung, daß Transkripte von diesem Exon bei Proben aus metastatischen Tumoren überexprimiert wurden, ein sehr nützlicher Indikator für die Vorhersage zu sein.
Es wird nicht angenommen, daß bei weiteren Forschungen die natürlichen (nicht mutierten) Produkte irgendeines einzelnen Exons einzig in Tumorzellen und nicht in den normalen entsprechenden Zellen gefunden werden. Statt dessen ist es wahrscheinlich, daß ein anormales Muster der Genaktivität, das aus einer Überexpression und unpassenden Kombination von Produkten eines Gens besteht, wie z.B. hier für den CD44-Ort berichtet, eine Rolle bei der Bösartigkeit spielen könnte. Diese Veränderungen können selbst für die maligne Umwandlung erforderlich sein oder die Folge anderer genetischer Störungen sein, die eine solche Umwandlung verursachen. Auch so kann ein Beobachter, ohne daß er dieses Problem löst, unter Verwendung dieser Techniken Informationen erhalten, die wichtig sind, um eine Probe der neoplastischen oder nicht neoplastischen Kategorie zuzuordnen.

Beispiele

Verfahren

Frische Gewebeproben, Durchmesser 0,5 bis 1 cm, wurden erhalten von chirurgischen Resektionsproben, die bei der Therapie von 34 Patienten mit Brusttumoren und Kolontumoren entfernt wurden. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff innerhalb 10 Minuten nach der Ankunft in dem Aufnahmebereich für pathologische Proben schockgefroren und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gehalten. Teile von Lymphknoten-Metastasen und Metastasen aus dem Blut wurden auch gesammelt, falls vorhanden, in dem zur Diagnose entnommenen Gewebe. Normales Brustgewebe, normale Darmschleimhaut, normale Lymphknoten, die dem Tumor in der Brust benachbart waren, und normale Leber wurden auch von den chirurgisch entnommenen Proben gesammelt und von anderen Proben, die unter nicht neoplastischen Bedingungen entfernt wurden. Normale periphere Blutleukozyten wurden von 10 Freiwilligen und Knochenmark von 3 Freiwilligen erhalten. Die histologischen Merkmale der Tumoren und ihre klinischen Stadien waren wie in Tabelle 1 beschrieben.
Die Extraktion der gesamten zellulären RNA aus Gewebeproben wurde durchgeführt mit dem von Chomizynski und Sacchi (1987) beschriebenen Verfahren. Die Extraktion von flüssigen Proben erfolgte durch Verwendung des von Invitrogen vermarkteten Microfasttrack-Kits. Die cDNA-Synthese und nachfolgende Amplifizierung mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt unter Verwendung des Superscript -Präamplifizierungssystem (BRL Life Technologies Inc., Middlesex, UK) mit den mit dem Kit gelieferten Puffern und Reagenzien. Kurz gesagt betrifft dies eine erste Stufe mit der Synthese der cDNA des ersten Strangs mit reverser Transkriptase unter Verwendung der Proben-RNA als Matrize und von zugegebenen Nucleotidtriphosphaten. Für die nachfolgende PCR wurde jede Probe mit Öl überschichtet und 5 Minuten auf 94ºC erhitzt, um die Nudeinsäure zu denaturieren; 30 PCR-Zyklen wurden dann mit den folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 94ºC eine Minute, 55ºC eine Minute, 72ºC zwei Minuten. Negative Kontrollen, bei denen keine Matrizen-cDNA in der Reaktionsmischung war, wurden routinemäßig mit jeder charge mitlaufen gelassen. Die Primer- und Sondensequenzen, die entworfen wurden, unter Verwendung der Information der publizierten Sequenz für Human-CD44-cDNA (Hofmann et al., 1991, Stamenkovic et al., 1991, Jackson et al., 1991) (Figur 6) waren wie folgt:
P1 ist mit dem Ursprung 324 Basenpaare stromaufwärts von der Insertionsstelle in dem Standard-CD44-Molekül angeordnet (zwischen den Nudeotiden 782 und 783 in der Sequenz, die von Stamenkovic et al., 1989 veröffentlicht wurde) und P4 ist 158 Basenpaare stromabwärts dieser Stelle angeordnet. Diese Primer erzeugen ein PCR-Fragment mit 482 Basenpaaren, wenn eine Probe das Standard-CD44 exprimiert (sogenanntes hämopoetisches CD44), 878 bp für die epitheliale Form von CD44 und mehrere andere Banden, wenn eine Probe alternativ gespleißte Transkripte enthält. 10 µl jedes PCR-Produktes wurden elektrophoretisch auf einem 1,2 % Agarosegel aufgetrennt und auf Hybond N&spplus;- (Amersham UK, Little Chalfont, UK)-Nylonmembranen zur Hybridisierung mit der oligonucleotidsonde E4 (= 5'TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3'), siehe Figur 6, überführt. Das Blotten und die Autoradiographie wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit des Nachweises und der Auftrennung zu verbessern. Die Sonde wurde radioaktiv markiert mit y³²P-ATP in Gegenwart von Polynucleotid-Kinase. Nach einer Vorhybridisierung wurde die Hybridisierung in 10 % Dextran, 6 x MET, 5 x Denhardt-Lösung, 0,5 % NP40 und 100 µg/ml Lachsspermien- DNA bei 42ºC über Nacht durchgeführt. Der Filter wurde dann zweimal mit 2 x SSC, 1 x SSC und 0,5 % SSC mit 0,1 % SDS bei 42ºC nacheinander jeweils 15 Minuten gewaschen. Die Filter wurden 2 bis 16 Stunden lang einem Kodak Röntgenfilm ausgesetzt. Danach wurden die Filter in 0,5 % SDS gekocht, um die Sonde herauszuziehen und wieder hybridisiert mit einer anderen radioaktiv markierten Sonde, nämlich P2 (=5'CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC), die konstruiert wurde, um mit dem Standardteil von CD44 (Figur 6) zu hybridisieren. Die für die Hybridisierung verwendeten Bedingungen, das Waschen und die Autoradiographie waren so wie oben.
Die Kalibrierung der Empfindlichkeit der Methode zum Nachweis einer kleinen Anzahl von Zellen wurde wie folgt durchgeführt: alle peripheren Blutleukozyten (PBL) wurden aus 20 ml Vollblut durch Lyse der gepackten roten Blutkörperchen durch Zugabe von Ammoniumchloridpuffer (1 ml gepackte Zellen zu 50 ml Lysepuffer) und anschließende Zentrifugation 15 Minuten später gereinigt. Das weiße Zellpellet wurde in 4 Röhrchen aufgeteilt, die mit 0 µl, 1 µl, 10 µl bzw. 100 µl einer Suspension von HT29 Kolonkarzinomzellen (5000 Zellen pro ml) geimpft wurden. Die gesamte RNA wurde dann extrahiert und jedes Röhrchen lieferte ungefähr 20 µg. Die cDNA-Synthese wurde durchgeführt, wie oben beschrieben, an Aliquots mit 4 µg der aus jedem Röhrchen erhaltenen RNA, was 0, 1, 10 bzw. 100 Tumorzellen pro Probe bedeutet. Die PCR wurde an diesen Proben durchgeführt und an positiven (nur Tumorzellen) und negativen (keine DNA) Kontrollen durchgeführt unter Verwendung der Primer Dl und D5, die so konstruiert wurden, daß sie spezifisch mit den Exons 7 und 14 in Figur 6 hybridisierten. Aus vorherigen Studien war bekannt, daß HT29-Zellen beide Exons und weitere Exons exprimieren in einem Muster, das leicht von PBL unterscheidbar ist und die Oligonucleotidprimer D1 und D5 wurden ausgewählt, da es erwünscht war, die Empfindlichkeit zu erhöhen, indem das zu amplifizierende Segment verkürzt wurde. Es wurde auch überlegt, daß die Verwendung dieser Primer das Problem umgehen würde, die Primer P1 und P4 für diesen speziellen Zweck zu verwenden, da die Mehrzahl auf gebraucht würde durch Hybridisierung mit dern Standardteil des Gens. Die PCR-Zyklusparameter, das Blotten, das Sondieren und die Waschbedingungen waren wie oben beschrieben. Die für das Sondieren verwendete Oligonucleotid- Sequenz war ein mit ³²P markiertes E4.

Allgemeiner Überblick über die Ergebnisse

Da die Primer (P1 und P4) über die Spleißprodukt-Insertionsstelle amplifizieren ist es klar, daß der dazwischenliegende Teil des Standardmoleküls amplifiziert wird, zusätzlich zu irgendwelchen alternativ gespleißten Varianten, die Transkripte von zusätzlichen Exondomänen enthalten. Daher ist die Gesamtanzahl von Produkten, die möglicherweise mit einer Sonde (z.B. P2) für die Standardform nachgewiesen werden könnten, wenn alle möglichen Kombinationen der Sequenzen in Betracht gezogen werden, die an diesem Ort identifiziert werden, groß. Unter Verwendung der Sonde E4 könnten 16 dieser Kombinationen, nämlich die, die E4-Transkripte von Exon 11 enthalten, möglicherweise als Banden mit verschiedenem Molekulargewicht sichtbar gemacht werden, nach Auftrennung durch Elektrophorese. In der Praxis wurde der gesamte Bereich der möglichen Kombinationen nicht in diesen Ergebnissen nachgewiesen, aber mehrere (bis zu 9) alternative Spleiß-Varianten wurden in neoplastischen Geweben gesehen, die mit jeder Sonde hybridisierten. Normales Gewebe aus der Brust, dem Kolon und den Lymphknoten exprimierte einige E4-haltige Transkripte (Figuren 1 und 3) zusätzlich zu dem Standardmolekül (Figuren 2 und 4), aber periphere Blutleukozyten (Figur 5) und Leber (Figur 4) exprimierten nachweisbar nur das letztere bei dieser Kombination von Sonden und Primern. Die Details sind unten angegeben:

Beispiel 1

Brustgewebeproben

Die bei der Untersuchung von Brustgewebeproben erhaltenen Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. Metastatische Tumorablagerungen und die entsprechenden Primärtumore von allen Fällen überexprimierten mehrere alternativ gespleißte Produkte, die Transkripte von Exon 11 (Figur 1a) enthielten. Mindestens 8 getrennte Banden wurden häufig zusammen mit einem übereinstimmenden Dublett bei 1500 bp und 1650 bp, das bei allen Tumoren vorhanden war, gesehen. Normales Brustgewebe und normale Lymphknoten erzeugten zwei Banden (1150 bp und 860 bp) mit dieser Sonde. Das oben erwähnte Dublett wurde bei keiner normalen Probe gesehen.
Die Unterschiede zwischen der Anzahl und Größe der Banden und der Intensität des Signals der gebundenen Sonde, zwischen Geweben der normalen und der bösartigen Kategorie waren bei allen untersuchten Proben offensichtlich. Bei gelegentlichen Proben war es notwendig, den Filter dem Röntgenfilm länger auszusetzen, um die Unterschiede zu sehen, aber diese Erkenntnis wurde in jedem untersuchten Fall bestätigt.
Proben von lokal invasiven Tumoren ohne klinischen Hinweis auf eine Metastasenbildung und von zwei Fibroadenomas überexprimierten Spleißprodukte auch, die Transkripte von Exon 10/11 enthielten, verglichen mit normalem Gewebe, aber das Ausmaß war leicht von den Ergebnissen zu unterscheiden, die mit malignen Tumoren und deren Metastasen erhalten wurden. Die Unterscheidung der Muster, die bei normalen Geweben zu sehen sind, war auch leicht (Figur 1b). Jedoch ergab eine einzige Probe ein ähnliches Ergebnis wie die malignen Tumoren (Bahn 14) (siehe unten). Die zwei Fibroadenoma zeigten Bandenmuster, die ähnlich denen waren von nicht metastatischen Karzinomen und die Probe bei einem Fall einer zystischen Erkrankung der Brust ähnelte dem Muster für normales nicht neoplastisches Brustgewebe. Dies ist der erste Fall einer definitiven Diagnose durch diese Methode. Das Gewebestück wurde von dem diensthabenden Pathologen geliefert als Teil von einem gutartigen Tumor, nämlich einem Fibroadenom, nach seinem makroskopischen Aussehen bei der ersten Untersuchung mit dem unbewaffneten Auge. Es wurde dann als tatsächlich nicht neoplastisch gekennzeichnet nach der PCR-Amplifizierung der cDNA und die anschließende mikroskopische Untersuchung des Gewebes bestätigte dies.
Um zu bestätigen, daß die Unterschiede, die mit der Probe E4 zu sehen waren, richtig sind und keine technischen Artefakte, sind in Figur 2 die Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden, als der gleiche Filter mit Sonde P2 hybridisiert wurde. Dies zeigt, daß i) alle untersuchten Gewebe die Standardform des Gens exprimierten, ii) andere Exon-Spleißprodukte, die keine Transkripte von Exon 10/11 enthielten, bei Tumoren und Metastasen vorhanden waren und iii) daß die oben beschriebenen Unterschiede nicht auf einer ungleichmäßigen Beladung der Spuren bei den verschiedenen Platten und Bahnen dieser zusammengesetzten Filter beruhen, sondern auf dem alternativen Spleißen. Alle Bedingungen bei diesem Experiment waren gleich, wie bei der Hybridisierung mit E4, außer der Kontaktzeit des Filters mit dem Röntgenfilm (10 Stunden Kontakt bei Figur 1 gegenüber 1,5 Stunden bei Figur 3).

Beispiel 2

Kolonproben

Die Erkenntnisse bei dem Kolonkarzinom waren identisch mit denen beim Brustkarzinom. So zeigten in allen Fällen die Darmkarzinomgewebe eine höhere Anzahl intensiver markierter Banden mit höherem Molekulargewicht mit der Sonde E4 (Figur 3) als normale Darmschleimhaut und andere normale Gewebe. Wie bei den Brustkarzinomen zeigte die Hybridisierung mit Sonde P2 keine Unterschiede im Expressionsgrad der Standardform des Moleküls (Figur 4).

Beispiel 3

Kalibrierung der Empfindlichkeit der Methode

Die Untersuchung von Autoradiogrammen von PCR-Produkten von peripheren Blutleukozyten, die mit einer bekannten Anzahl von HT29 Kolonkarzinomzellen geimpft waren, zeigte die Gegenwart zusätzlicher Banden, die charakteristisch für Tumorzellen sind, bis zu einem Gehalt von 10 Tumorzellen in einer Probe von 10&sup7; Leukozyten. Es wird angenommen, daß es durch feines Einstellen der Bedingungen des Tests möglich ist, eine einzelne Tumorzelle in 10 ml Blut nachzuweisen.
In den oben beschriebenen Reihen zeigten alle Proben von neoplastischem Gewebe eine Überexpression von alternativ gespleißten Produkten des CD44-Gens und keine der Proben von nicht-neoplastischem Gewebe tat dies. Daher gab es eine vollständige Übereinstimmung zwischen normalem oder neoplastischem Ursprung einer Probe und Muster der CD44-Expression. In einem Fall wurde gefunden, daß ein Tumor, der bei einem Patienten entfernt worden war (Patient B16, Bahn 14 in Figur 1A) ohne einen aktuellen klinischen Hinweis auf Metastasenbildung, ein Expressionsmuster hatte, das auf eine metastatische Fähigkeit hinwies. Derzeit ist es nicht möglich festzustellen, ob dies ein falsch positives Ergebnis oder ein Hinweis auf eine bevorstehende Metastasenbildung ist. Dieser Patient ist derzeit unter Beobachtung in der Nachklinikphase.

Beispiel 4

Es wurden Oligonucleotidprimer entworfen und synthetisiert nach unseren derzeitigen Erkenntnissen, wie folgt:
für die Exons (Hofmann 1991). E1 und E2 sind auf Exon 6.
Frische Gewebeproben mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 cm wurden von chirurgischen Resektionsproben oder durch Autopsie erhalten. Alle bei dieser Arbeit verwendeten Proben wurden von dem Geweberest erhalten, der zurückblieb, nachdem diagnostische Proben entnommen worden waren und ansonsten verworfen worden wäre. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff innerhalb von 10 Minuten nach Ankunft im pathologischen Probenaufnahmebereich schockgefroren und bis zur Verwendung in Stickstoff gefroren gehalten. cDNA wurde synthetisiert mit viraler reverser Transkriptase unter Verwendung von 5 µg der gesamten zellulären RNA als Matrize und anschließend durch PCR mit Primer P1 und Primer P4. Die PCR-Amplifizierung, Elektrophorese und Hybridisierung wurden unter Standardbedingungen durchgeführt.
Als die PCR-Produkte mit radioaktiv markiertem E2 oder E4 hybridisiert wurden, überexprimierten alle Proben von Karzinomen mehrere Spleißvarianten, aber das Bandenmuster, das mit jeder Sonde zu sehen war, war verschieden. So ist die Oligonucleotidsonde für Exon 6-Produkte sehr wirksam zur Unterscheidung von neoplastischen von nicht-neoplastischen Proben, aber nicht wesentlich empfindlicher als E4, zumindest bei Proben von festem Gewebe, ist aber möglicherweise geeignet, um dasn Ursprungsorgan einer streuenden metastatischen Zelle oder einer festgesetzten Metastasenbildung nachzuweisen. Anschließend wurden dieselben Filter abgezogen und hybridisiert mit der P2-Sonde, um zu zeigen, daß alle Proben, einschließlich den normalen Geweben, den Standardteil von CD44 erzeugten. Dies bestätigte, daß die Unterschiede, die zwischen den mit normalen Proben und mit Tumorproben erhaltenen Ergebnissen beobachtet wurden, die mit E2 und E4 sondiert wurden, nicht auf einer ungleichmäßigen Beladung mit PCR-Produkten beruhten. Die zusammengefaßten Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt, was zeigt, daß diese Veränderungen bei einem großen Bereich von üblichen Krebsarten zu sehen sind. Tabelle 3 Gewebeart Anzahl der Patienten/Freiwilligen Erhöhte Anzahl von Spleißvarianten neoplastisch Brustkrebs Kolonkrebs Blasenkrebs Magenkrebs Schilddrüsenkrebs Fibroadenom Prostatakrebs nicht neoplastisch normale Brust zystische Erkrankung der Brust normaler Kolon Morbus Crohn ulzerative Colitis Appendicitis normale Blase PBL Knochenmark
Es wurden auch maligne Tumoren von Knochenmuskeln untersucht und bei Osteosarkomen ein ähnliches Muster gefunden mit einer beträchtlichen Überexpression mehrfach gespleißter Varianten.

Beispiel 5

Diagnose von Krebs durch PCR-Test von in der Klinik gesammelten Urinproben

Ungefähr 50 ml natürlich abgegangener Urin wurden von jeder Person erhalten und, so schnell wie möglich, in das Labor transportiert. Proben von 90 Patienten wurden untersucht: 44 von Patienten mit einem mit Biopsie nachgewiesenen Blasenkrebs, 46 von Patienten mit einer nicht neoplastischen Entzündung der Blase (Cystitis) und von normalen Freiwilligen. 1 ml jeder Urinprobe wurde nach sorgfältigem Vermischen entnommen und für die zytologische Untersuchung beiseite gestellt. Weitere 1 ml Urin wurden untersucht durch Anfärben mit Fluorescein-diacetat-Ethidiumbromid, um die Lebensfähigkeit der Zellen in der Probe festzustellen. Der Rest des Urins wurde mit 2000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert und das Zeilpellet wurde bis zur Verwendung bei -70ºC aufbewahrt. Die Extraktion der mRNA wurde mit Oligo-dT-Cellulosetabletten (Invitrogen) durchgeführt. Die cDNA wurde mit AMV reverser Transkriptase (Invitrogen) synthetisiert. Die vervollständigte cDNA-Lösung wurde in zwei Röhrchen gleich aufgeteilt, wobei eines für eine PCR mit E1 und E5 war, um das jeweilige cDNA-Transkript zu amplifizieren, von dem gefunden worden war, daß es von diagnostischem Wert ist, und das andere für eine PCR mit P1 und P4, um die Standardform von CD44 zu amplifizieren, mit oder ohne alle Spleißvarianten, als innere Kontrolle.
35 Zyklen PCR wurden dann durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren: 1 Minute 95ºC, 1 Minute 55 ºC, 2 Minuten 72ºC. Ein "Heißstart"-Verfahren wurde für alle Proben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt.
Gleiche Volumina von PCR-Produkten wurden auf jede Bahn eines 1,2 % Agarosegeis geladen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Wenn die Zellen in dem Urin alle Exons von Exon 6 bis Exon 14 exprimieren sollten, wurde vorhergesagt, daß bei dem entsprechenden PCR-Protokoll unter Verwendung der Primer E1 und E4 eine 735 bp Bande erzeugt werden sollte. Es gibt keine Bande in Spuren, die cDNA von normalem Urin enthalten oder den von Patienten mit nicht neoplastischer Cystitis (Bahnen 1 bis 8), aber es ist eine klare 735 Bande zu sehen bei allen Urinproben von Patienten mit Blasenkrebs (Bahnen 9 bis 16), wenn die PCR mit den Primern E1 und E5 durchgeführt wurde (obere Platte).
Eine Bande mit 482 bp, die die Standardform von CD44 repräsentiert, wurde praktisch gleich in allen Fällen erhalten, wenn die PCR mit P1 und P4 durchgeführt wurde (untere Platten). Dies zeigt, daß die diagnostisch wesentlichen Unterschiede zwischen Urin von Patienten mit Blasenkrebs und dern von Kontrollen nicht durch ungleichmäßige Beladung der Spuren verursacht wurden, sondern durch das alternative Spleißen des CD44-Gens. Bahnen 1 bis 4: normaler Urin. Bahnen 5 bis 8: Cystitisurin. Bahnen 9 bis 16: von Patienten 1 bis 8 mit Blasenkrebs.
Bei den Gesamtergebnissen war diese Bande mit 735 bp vollständig abwesend bei 7 von 7 normalen Urinproben und bei 9 von 9 durch Cystitis beeinflußten Urinproben; das ist 0 % falsch positiv. Auch zeigten 14 von 19 (74 %) Urinproben von Patienten mit Blasenkrebs ein positives Ergebnis (d.h. 26 % falsch negativ). Bei den falsch negativen Proben gab es einen Mangel an lebensfähigen Krebszellen, was durch die Anf ärbung mit Fluorescein-d-Acetat-Ethidiumbromid gezeigt wurde.

Beispiel 6

Stuhl von 12 Patienten wurde untersucht mit den hier beschriebenen Techniken. Von den Proben von 9 Patienten mit Kolorektal-Karzinom, ergaben 5 positive Ergebnisse. Von den Proben von 3 normalen Patienten ergaben alle 3 negative Ergebnisse. Diese Zahlen, die von Proben erhalten wurden, die voll sind mit Bakterien, die keiner Vorbehandlung unterzogen wurden, bekräftigen die Annahme, daß ein durchführbarer diagnostischer Test ohne Schwierigkeiten entwickelt werden könnte.
Nach den weiteren Erfahrungen der Erfinder beim Nachweis von Tumorzellen mit dieser Methode würden die folgenden Beobachtungen nützlich sein für andere, die das diagnostische Potential untersuchen. Die Hauptüberlegungen, die man anstellen muß, sind, daß die zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kritisch von der Qualität der aus der Probe erhaltenen mRNA und von der Sorgfalt, mit der die Techniken durchgeführt werden, abhängen. Das Haupterfordernis ist es, falsch negative Ergebnisse auszuschließen, indem sichergestellt wird, daß eine mRNA mit hoher Qualität routinemäßig erhalten wird und durch Verwendung interner Standards bei jeder Reaktion, um die PCR-Amplifizierungsstufe zu überwachen. Falsch positive Ergebnisse sind, vorausgesetzt sie sind nicht zu häufig, kein schwerwiegendes Problem, da sie durch wiederholte Tests an gleichen oder weiteren Proben erkannt werden können und durch Bezugnahme auf andere klinische Daten.
Die Erfinder haben Verfahren erforscht, die notwendig sind, um die Routine-RT-PCR-Detektion einer anormalen CD44-Gen- Aktivität in kleinen klinischen Proben, die Tumorzellen enthalten, sicherzustellen. Wenn eine Gewebeprobe in Aliquots aufgeteilt wird, wovon die Hälfte in flüssigem Stickstoff sofort eingefroren wird und der Rest bei Umgebungstemperatur belassen wird, kann man zeigen, wie die Fähigkeit, CD44- Spleißvarianten nachzuweisen, mit der Zeit abfällt und mit der Art der Behandlung der Probe. Frische Proben, die der mRNA-Extraktion innerhalb einer halben Stunde nach dem Herausschneiden unterworfen werden, liefern die zuverlässigsten Ergebnisse und es gibt eine stufenweise Abnahme der Qualität über die nächsten Stunden, wenn das frische Gewebe bei Umgebungstemperatur belassen wird. Wenn die Probe zuerst schockgefroren wird, sind die erhaltenen Ergebnisse befriedigend, wenn die RNA sofort nach dem Auftauen extrahiert wird, fallen aber sehr schnell ab, beginnend innerhalb von 15 Minuten, wobei die größeren variierenden Transkripte zuerst verlorengehen und schließlich sogar die Standardform. Es wurde auch gefunden, daß dann, wenn die schockgefrorenen Zell- und Gewebeproben bei -70ºC aufbewahrt werden, die Ergebnisse nach 4 Wochen abfallen, sogar wenn die mRNA sofort nach dem Auftauen extrahiert wird. Es scheint daher, daß der Abbau der RNA durch Ribonudeasen, die aus den Zellen freigesetzt werden, die während des Frierens zerreißen, weiterläuft, sogar bei dieser Temperatur, wenn auch mit langsamerer Geschwindigkeit. Wie man erwarten würde, erhält man auch, wenn die Probe, die für die RNA-Extraktion entnommen wird, aus einem Nekrosebereich oder Fibrosebereich stammt, nicht die typischen Ergebnisse, die mit lebensfähigem Tumorgewebe zu sehen sind. Daher sind sowohl Sorgfalt bei der Probenauswahl als auch bei der Probenverarbeitung notwendig zur Erzeugung zuverlässiger Daten.
Ausgehend hiervon ist es bevorzugt, daß eine frische Probe nicht länger als 24 Stunden aufbewahrt werden sollte, bevor sie entweder eingefroren wird oder behandelt wird, um die mRNA zu extrahieren und daß eine aufgetaute Probe nicht mehr als 2 Stunden aufbewahrt werden sollte, bevor sie behandelt wird, um die mRNA zu extrahieren.
Das hier beschriebene Diagnoseverfahren kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden, möglicherweise in wenigen Stunden und kann automatisiert werden. Die Verwendung der Methode hat gezeigt, daß bei verschiedenen Gewebeproben eine große Vielzahl von Krebsarten nachgewiesen wird und auch an Blut- und Urinproben. Sie wird daher als geeignete praktische Methode zur Untersuchung und Diagnose von Krebs angeboten. Im Prinzip könnte sie auch eine breite allgemeine Anwendbarkeit für Programme zum Krebsnachweis und zur Prevention haben und daher von Wert für die Epidemiologie und die Gesundheitsfürsorge sein. Die richtige Anwendung der Empfindlichkeit, Spezifität und Einfachheit sollte nicht nur zu einer anfänglichen Krebsdiagnose beitragen, sondern auch zur Auswertung des Ausmaßes der Krankheit im Körper, zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung und zu einem frühen Nachweis von wiederkehrenden Tumoren.
Legende der Figuren:
Bezeichnung: N = normal, T = primärer Tumor, M = Metastase.

Figur 1

Autoradiogramm von PCR-Produkten aus Brustgewebeproben, die mit E4 sondiert wurden (10 Stunden Kontakt des Röntgenfilms mit dem Probenfilter). Platte A: bösartige primäre Brustkarzinome mit deren Metastasen. Spuren 1, 2 und 3: Patient B1; Spuren 4, 5 und 6: Patient B2; Spuren 7, 8 und 9: Patient B3; Spuren 10 und 11: Patient B4; Spuren 12 und 13: Patient B5. Es ist zu sehen, daß verglichen mit normalem Brustgewebe, primäre Brustkarzinome und deren metastatische Ablagerungen mehrere Spleißvarianten überexprimieren. Es ist auf das Dublett (Pfeile) bei 1500 bp und 1650 bp hinzuweisen, das am besten in Spur 5 zu sehen ist. Dies ist bei allen Tumoren und Metastasen vorhanden, ist aber in anderen Spuren bei dieser Kontaktzeit verschleiert. Es ist nicht nachweisbar bei irgendwelchen normalen Proben, sogar bei viel längeren Kontaktzeiten (23 Stunden). Platte B: Brustkarzinome mit keinem klinischen Hinweis auf Metastasen. Die Spuren 14 bis 20 sind von den Patienten B15 bi B21. Die Tumoren überexprimieren alle verschiedene Varianten, zeigen aber weniger Banden und die Signalintensität ist geringer, außer bei Spur 16 (Patient B17) - siehe Text. Das Dublett 1500/1650 bp (Pfeil) ist leicht erkennbar in den Spuren 15, 16 und 18 bei dieser Kontaktdauer und wurde bei allen anderen tumorhaltigen Spuren nach längerer Kontaktzeit nachweisbar. Die Darstellung zeigt jedoch nur die kürzere Kontaktzeit, um das Verschleiern der Spuren, die stärkere Signale haben, zu vermeiden. Platte C: Fibroadenoma (FA) und fibrozystische Erkrankung der Brust (Zyst). Spuren 21 und 22, die gutartige Tumorproben enthalten (Proben B22 und 23) exprimieren mehr als die nicht neoplastische Probe (fibrozystische Erkrankung) in Spur 23 (Probe B24).

Figur 2

Autoradiogramm von PCR-Produkten von Brustgewebeproben, sondiert mit Sonde P2 (1,5 Stunden Kontakt des Röntgenfilms mit dem Probenfilter). Dieses Ergebnis wurde erhalten, indem der gleiche Filter, wie der, der in Figur 1 verwendet wurde, wieder sondiert wurde, nachdem die vorherige Sonde abgezogen worden war. Hier ist zu sehen, daß 1) die in Figur 1 beobachteten Unterschiede nicht auf einer ungleichmäßigen Beladung der Spuren beruhen, ii) daß die Expression der Standardform des Moleküls quantitativ größer ist, als die irgendeiner der Varianten, iii) die Standardform bei allen untersuchten Geweben exprimiert wird und iv) weitere Varianten, die nicht Exon 3 Transkripte enthalten, auch vorhanden sind und in Tumoren überexprimiert werden. Das Dublett 1500/1650 bp kann bei den Tumoren auf Platte A erkannt werden, erfordert aber längeren Kontakt, um auf den Platten B und C nachweisbar zu sein.

Figur 3

Autoradiogramm von PCR-Produkten von Kolongewebeproben, die mit E4 sondiert wurden (10 Stunden Kontakt des photographischen Films mit dem Probenfilter). Spuren 1, 2 und 3: Patient C1; Spuren 4, 5 und 6: Patient C2; Spuren 7, 8 und 9: Patent C3; Spuren 10 und 11: Patient C4; Spuren 12 und 13: Patient C5; Spur 14: normale Leberprobe. Das Bild zeigt die gleichen Merkmale, wie in der Legende zu Figur 1 beschrieben und daß die Erkenntnisse auf Karzinome des Darms Anwendung finden. Das Dublett 1500/1650 bp (Pfeil) ist leicht erkennbar bei mehreren Tumorspuren (2 und 8 bis 12) und das schwache Signal in der entsprechenden Position in den Spuren 3, 5, 6 und 13 wurde bei längerem Kontakt stärker. Jedoch erscheint keines in der Nachbarschaft der Spuren 1, 4, 7 oder 14 (normales Gewebe).

Figur 4

Autoradiogramm von PCR-Produkten von Kolongewebeproben, die mit P2 sondiert wurden (1,5 Stunden Kontakt des photographischen Films mit dem Probenfilter). Dies bestätigt die gleichmäßige Beladung der Spuren und daß andere Punkte, die in Figur 2 dargestellt sind, auf Kolonkarzinome Anwendung finden. Es ist anzumerken, daß normale Leber die Standardform von CD44 exprimiert.

Figur 5

Autoradiogramm von PCR-Produkten von normalen peripheren Blutleukozyten, PBL (von 3 verschiedenen Personen) und anderen normalen Geweben, die mit E4 sondiert wurden (Platte A; 8 Stunden Kontakt des photographischen Films) und P2 (Platte B; 5 Stunden Kontakt mit photographischem Film). Spur 6 enthält PCR-Produkte von einem Brustkrebs (Patient B1) als positive Kontrolle. Mit dieser Kombination von Primern und Sonden kann gesehen werden, daß Leukozyten die Standardform des CD44- Moleküls exprimieren, aber keine nachweisbaren Spleißvarianten. Die Proben in den Spuren 4 und 5 waren von einzelnen Patienten ohne klinischen Hinweis auf Neoplasien, wie folgt: Spur 4, Brustgewebe, das bei einer Autopsie aus dem Körper einer Frau erhalten wurde, die an einer bakteriellen Endocarditis starb; Spur 5, Kolon, der wegen einer Darmverschlingung reseziert wurde. Tabelle 1 Patient Alter Krankheit Tumorgröße Metastasen Histologie (Grad) Klinischer Zustand Brust-CA Fibroadenom zystisch Kolon-CA Lymphknoten keine Patient Alter Krankheit Tumorgröße Metastasen Histologie (Grad) Klinischer Zustand Kolon-CA Schilddrüsen-CA Lymphknoten Leber keine IDC: infiltrierendes Carcinoma ductale ILC: infiltrierendes Carcinoma lobulare Well diff. Adeno: gut differenziertes Adenokarzinom Mod diff. Adeno: mäßig differenziertes Adenokarzinom Buchstaben in eckigen Klammern in der Spalte "klinischer Zustand" beziehen sich auf das Bewertungsschema von Dukes für Kolonkarzinome

Literaturstellen

1. Stamenkopvic, M. Amiot, J.M. Pesando, B. Seed A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell 1989; 56: 1057-062.
2. M. Birch, D. Mitchell, I.R. Hart, Isolation and characterisation of human melanoma cell variants expressing high and low leveis of CD44. Cancer Res.
3. U. Gunthert, M. Hofmann, W. Rudy, S. Reber, M. Zoller, Haußmann, S. Matzku, A. Wenzel, H. Ponta, P. Herrlich, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat karzinoma cells. Cell 1991; 65: 13-24.
4. M.S. Sy, Y-J Guo, I. Stamenkovic. Distinct effects of two CD44 isoforms on tumor growth in vivo J. Exp. Med. 1991; 174: 859-866.
S. M. Hofmann, W. Rudy, M. Zoller, C. Tolg, H. Ponta, P. Herrlich, U. Gunthert. CD44 splice variants confer metastatic behaviour in rats: Homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res. 1991; 51: 5292-5297.
6. I. Stamenkovic, A. Aruffo, M. Amiot, B. Seed. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells. EMBO J. 1991; 10: 343-348.
7. D.G. Jackson, J. Buckley, J.I. Bell. Multiple variants of the human lymphocyte homing receptor CD44 generated by insertions at a single site in the extracellular domain. J. Biol. Chem. 1992; 267: 4732-4739.
8. P. Chomzynski, N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyantat-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 1987; 162: 156.
9. A.G. Knudson. Hereditary cancer, oncogenes and antioncogenes. Cancer Res. 1985; 45: 1437-43.
10. D. Tarin, Tumour metastasis. In: Oxford Textbook of Pathology 1992; (eds: J O'DMcGee, N. A. Wright, P. G. Isaacson). Oxford University Press, Oxford. Seiten 607 bis 633.
11. A.J. Hayle, D.L. Darling, A.R&sub6; Taylor, D. Tarin. Transfection of metastatic capability with total genomic DNA from metastatic tumour cell lines. Differentation, 1993, in press.
12. G.R. Screaton, M.V. Bell, D.G. Jackson, F.B. Cornelis, U. Gerth und J.I. Bell, Genomic Structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 889, Seiten 12160-4, Dezember 1992, Immunology.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose von Neoplasien, wobei das Verfahren die Analyse der Expression des CD44-Gens in einer Probe umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe auf Produkte des CD44-Gens oder Teile davon getestet wird mit einem Verfahren, das umfaßt, daß man komplementäre DNA (cDNA) aus messenger-RNA (mRNA) in der Probe herstellt, Teile der cDNA entsprechend dem CD44-Gen oder einem Teil davon amplifiziert und die amplifizierte cDNA nachweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Probe aus einem Gewebe stammt, das ein fester Tumor sein kann oder aus Blut oder einer anderen Körperflüssigkeit stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Probe nicht invasiv erhalten wurde.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin ein markierter spezifischer Oligonucleotidprimer oder eine markierte spezifische Oligonucleotidsonde zum Nachweis der cDNA verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin die Amplifizierung durchgeführt wird unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin die amplifizierte cDNA durch Elektrophorese vor dem Nachweis abgetrennt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Blotten und die Autoradiographie durchgeführt werden an der abgetrennten cDNA.

9. Das Exon von CD44, das in Tumoren überexprimiert wird, aber nicht in normalem Gewebe und in der Nähe der Exons 7 bis 9 angeordnet ist.

10. Exon von CD44 mit der in Figur 7 gezeigten Nudeinsäuresequenz, charakteristische Fragmente davon, Sequenzen, die degeneriert sind und/oder Allelvariationen darstellen, homologe Nudeinsäuresequenzen und Sonden, Primer oder andere Reagenzien, die mit den Sequenzen oder homologen Sequenzen hybridisieren können.

11. Verwendung der Verbindungen und Reagenzien, die in Anspruch 9 oder Anspruch 10 beansprucht werden, in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

12. Peptid entsprechend dem CD44-Exon von Anspruch 10, dessen Sequenz in Figur 7 gezeigt ist, die Allelvariationen und Phosphorylierungs- und Glykosylierungsprodukte davon und charakteristische Fragmente davon.

13. Antikörper gegem das Peptid, seine Allelvariationen, die Glykosylierungsprodukte und charakteristische Fragmente von Anspruch 12 und Fragmente davon.

14. Antikörper nach Anspruch 13, die markiert sind.

15. Radioaktiv markierte Antikörper nach Anspruch 14 zur Verwendung in einem Verfahren zur radioaktiven Abbildung oder zur in vivo-Diagnose.

16. Antikörper nach Anspruch 14, die mit tumoriziden Verbindungen markiert sind zur Verwendung in einem Verfahren zur Therapie.

17. Verfahren zur immunologischen Diagnose von Neoplasien, dadurch gekennzeichnet, daß die Überexpression eines Exons bestimmt wird, das in der Nähe der Exons 7 bis 9 des CD44-Gens angeordnet ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Exon die in Figur 7 gezeigte Nucleinsäuresequenz hat.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, worin eine Mischung von Antikörpern einschließlich einem Antikörper gegen Exon 6 verwendet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Antikörper ausgewählt werden aus Antikörpern gegen die Exons 6 bis 14.