DE69724768T2

DE69724768T2 - Oligonukleotid-analoge

Info

Publication number: DE69724768T2
Application number: DE69724768T
Authority: DE
Inventors: Anthony David Baxter; Stephen Paul Wilmslow COLLINGWOOD; Mark Edward Macclesfield DOUGLAS; Roger John Macclesfield TAYLOR
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2017-02-25
Also published as: BR9707918A; DE69724768D1; ZA971849B; CN1212701A; EP0885237B1; CA2247480A1; JP2000506849A; ATE249475T1; AU1886797A; WO1997032887A1; EP0885237A1; GB9604669D0; US6562960B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotidanaloga, ihre Herstellung und ihre Verwendung.
Oligonukleotide, die 3'-Methylenverknüpfungen umfassen, sind in der WO-A-95260972 offenbart.
Erfindungsgemäß können Oligonukleotidanaloga hergestellt werden, die gute Hybridisierungseigenschaften an Einzel- und Doppelstrangnukleinsäuren, RNase H-Aktivierungseigenschaften, eine gute hydrolytische Stabilität und eine gute Stabilität in Bezug auf ihre Spaltung durch Nukleasen aufweisen, so dass ihre Verwendung als Inhibitoren für die Genexpression, beispielsweise durch Antisense-Wechselwirkung erleichtert wird und als Pharmazeutika bei der Behandlung von Krankheiten wie Krebs und Viruserkrankungen wie beispielsweise Grippe, Herpes und HIV.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Oligonukleotidanalogon zur Verfügung, das 10 bis 200 natürliche und/oder synthetische Nukleosideinheiten aufweist, die durch Internukleosidverknüpfungen verknüpft sind, wobei mindestens eine der Internukleosidverknüpfungen die Formel
wobei die angegebene Methylengruppe mit einem 3'-Kohlenstoffatom eines Nukleosids verbunden ist, das angegebene Sauerstoffatom mit einem 5'-Kohlenstoffatom eines benachbarten Nukleosids verbunden ist, R¹ Wasserstoff oder eine Gruppe der Formeln R¹ _a, -NHR¹ _b oder -NR¹ _bR¹ _c ist, wobei R¹ _a eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl, C₂- bis C₁₀-Alkenyl, C₃- bis C₈-Cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-Aryl oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe ist und R¹ _b und R¹ _c unabhängig voneinander eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl, C₂- bis C₁₀-Alkenyl- C₃- bis C₈-Cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-Aryl oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe sind und X Sauerstoff oder Schwefel ist.
Die Anzahl der Nukleosideinheiten in dem Oligonukleotidanalogon kann variieren, beispielsweise von 15 bis 100, entsprechend der Art der Nukleinsäuresequenz an die das Oligonukleotidanalogon zielt. Vorzugsweise weist das Oligonukleotidanalogon 15 bis 40, insbesondere 15 bis 25 Nukleosideinheiten auf. Das Oligonukleotidanalogon kann noch mehr bevorzugt 15 bis 20 Nukleosideinheiten für bestimmte Targets aufweisen, 20 bis 25 Nukleosideinheiten für andere Targets, 18 bis 25 Nukleosideinheiten für weitere Targets und 18 bis 22 Nukleosideinheiten für noch weitere Targets.
In einem erfindungsgemäßen Oligonukleotidanalogon kann die Anzahl der Internukleosidverknüpfungen der Formel I gemäß den gewünschten Eigenschaften variieren. Beispielsweise kann für einige Zwecke eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ausreichend sein, während für andere Zwecke alle Internukleosidverknüpfungen gemäß der Formel I sein können und gleich oder verschieden sein können. Für die meisten Zwecke können bis zu 75%, beispielsweise bis zu 50%, insbesondere bis zu 25% der Internukleosidverknüpfungen der Formel I entsprechen.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung entsprechen wenigstens zwei aufeinanderfolgende Internukleosidverknüpfungen, beispielsweise zwei, drei, vier, fünf oder sechs aufeinanderfolgende Internukleosidverknüpfungen, die gleich oder verschieden sein können im Oligonukleotidanalogon der Formel I. Eine derartige Sequenz von aufeinanderfolgenden Internukleosidverknüpfungen kann an jedem Ende des Oligonukleotidanalogons vorhanden sein, üblicher ist jedoch eine derartige Sequenz aufeinanderfolgender Internukleosidverknüpfungen gemäß Formel I zwischen den Sequenzen von Nukleosiden, die andere Internukleosidverknüpfungen aufweisen. In anderen Ausführungsformen der Erfindung, die zwei oder mehr Internukleosidverknüpfungen gemäß Formel I aufweisen, können sich die Internukleosidverknüpfungen der Formel I mit anderen Internukleosidverknüpfungen abwechseln, beispielsweise entlang der gesamten Länge des Oligonukleotidanalogons oder in einem Bereich an einem oder beiden Enden des Oligonukleotidanalogons, oder in einem Bereich in der Mitte des Oligonukleotidanalogons.
In den Ausführungsformen der Erfindung, bei denen nicht alle der Internukleosidverknüpfungen der Formel I entsprechen, können die verbleibenden Internukleosid verknüpfungen natürliche Phosphodiesterverknüpfungen oder andere synthetische Substitute davon sein, beispielsweise Phosphorthioate, Phosphordithioate, Alkylphosphonate (-O-P(O)(R)O-), Phosphoramidate, kurzkettiges Alkyl, Cycloalkyl, kurzkettige Heteroatome, -NHCOCH₂-, -CH₂NHCO-, -CONHCH₂-, -CH₂CONH-, – CH₂NHO-, -CH₂N(CH₃)O-, -CH₂ON(CH₃)-, -CH₂N(CH₃)N(CH₃)- oder -ON(CH₃)CH₂-Verknüpfungen oder Kombinationen aus zwei oder mehr derartiger Verknüpfungen. Bevorzugt sind die verbleibenden Internukleosidverknüpfungen Phosphordiester, Phosphorthioat oder Phosphordithioatverknüpfungen oder eine Mischung aus zwei oder mehr dieser drei Typen, insbesondere Phosphordiester, Phosphorthioat oder eine Mischung aus Phosphordiester und Phosphorthioatverknüpfungen. In bestimmten besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die verbleibenden Internukleosidverknüpfungen Phosphorthioatverknüpfungen.
Vorzugsweise sind nicht mehr als 50% der Internukleosidverknüpfungen Phosphorthioatverknüpfungen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Oligonukleotid einen Bereich, der Phosphordiester und/oder Phosphorthioat und/oder Phosphordithioatinternukleosidverknüpfungen zwischen zwei Bereichen, die Internukleosidverknüpfungen gemäß der Formel I haben, aufweist, oder eine Mischung davon mit Phosphorthioat oder Phosphordiesterverbindungen, insbesondere einen Bereich, der Phosphorthioatverbindungen zwischen zwei Bereichen aufweist, die Internukleosidverknüpfungen gemäß Formel I oder eine Mischung davon mit Phosphorthioat oder Phosphordiesterverknüpfungen aufweisen.
In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen, umfasst das erfindungsgemäße Oligonukleotidanalogon einen Bereich mit wenigstens 6 Nukleosiden die über Phosphorthioatverknüpfungen zwischen zwei Bereichen, die Nukleoside aufweisen, die nur über Internukleosidverknüpfungen gemäß Formel I verknüpft sind.
In den erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloga können die Nukleosideinheiten natürliche oder synthetische Nukleoside sein, die eine Purin oder Pyrimidinbase wie beispielsweise Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil, oder ein Analogon dieser Basen wie beispielsweise 2-Aminoadenin, 6-Hydroxypurin, 5-Methylcytosin, 5- Propynylcytosin, 5-Fluorouracil, 5-Propynyluracil oder Dihydrouracil sind, und die an das 1'-Kohlenstoffatom eines Furanosezuckers gebunden sind. Es versteht sich für einen Fachmann von selbst, dass wenn die Oligonukleotide in Antisense-Anwendungen verwendet werden, die Sequenz der Nukleoside so gewählt ist, dass sie zu einer Target-RNA-Sequenz komplementär ist. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Oligonukleotidanalogon zu einem Bereich der mRNA für menschliche c-raf-Kinase komplementär sein, wobei in diesem Fall eine bevorzugte Sequenz 5'-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT-3' ist, beschrieben als Seq. ID Nr. 8 in der WO 95/32987 oder das erfindungsgemäße Oligonukleotidanalogon kann zu einem Bereich der mRNA für menschliches PKC-α komplementär sein, wobei in diesem Fall eine bevorzugte Sequenz 5'-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3' ist, beschrieben als Seq. ID Nr. 2 in der WO 95/02069.
Bei einigen erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloga ist mindestens ein Nukleosid an seiner 2'-Position modifiziert, beispielsweise um die Bindungsaffinität an ein gegebenes Target zu erhöhen und/oder um die Widerstandsfähigkeit gegenüber Nuklease zu erhöhen. Sämtliche Nukleoside können so modifiziert werden, oder bis zu 80%, beispielsweise bis zu 70%, bis zu 60%, bis zu 50%, bis zu 40%, bis zu 30%, bis zu 20% oder bis zu 10% der Nukleoside können so modifiziert werden. Beispiele von 2'-modifizierenden Atomen und Gruppen, d. h. Atome oder Gruppen, die an die 2'-Position eines Nukleosids anstelle eines Wasserstoffatoms oder einer Hydroxygruppe gebunden werden können, um eine Modifikation hervorzurufen, umfassen Halogenatome wie Fluor, Chlor und Bromatome, C₁ bis C₁₀ unsubstituierte oder substituierte Alkylgruppen wie Methyl, Trifluormethyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl oder Decyl; C₆- bis C₁₀-Arylgruppen wie Phenyl, Tolyl oder Xylyl; C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppen wie Benzyl; Amino, C₇- bis C₁₀-Alkylamino wie Methylamino, Ethylamino oder Octylamino; C₁- bis C₁₀-Alkylthio wie Methylthio, Ethylthio oder Octylthio; Azid; Nitrat; Nitrit; Cyanid; Cyanat; Methansulfonat; C₁- bis C₁₀-Aminoalkylamino; eine Gruppe der Formel -OR², wobei R² ein C₁ bis C₁₀ aliphatische Gruppe ist; substituiertes Silyl; eine RNA-Spaltungsgruppe; eine Cholesterylgruppe; ein Konjugat; eine Reportergruppe; ein Interkalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids; und eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids.
Bevorzugte Atome und Gruppen zur Modifikation der 2'-Stellung sind Halogenatome, insbesondere Fluor, und eine Gruppe der Formel -OR², wobei R² ein C₁ bis C₁₀liphatische Gruppe ist, die eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, Butyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Trifluormethyl, Ethoxyethyl, Methoxyethyl oder Butoxyethyl, oder eine C₂- bis C₆-Alkenylgruppe wie Vinyl, Allyl oder Methallyl ist. Insbesondere bevorzugte Atome und Gruppen zur Modifikation sind Fluor und Gruppen der Formel -OR², wobei R² eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist, bevorzugt C₁- bis C₄-Alkyl, C₁ bis C₄-Alkoxy-substituiertes C₁ bis C₄-Alkyl oder eine Gruppe der Formel -(CH₂CH₂O)-_nR³, wenn R³ Methyl oder Ethyl ist und n ist 2 bis 4. Insbesondere bevorzugte Gruppen der Formel -OR² sind diejenigen, bei denen R² Methyl, Ethyl, Methoxyethyl, Ethoxyethyl oder eine Gruppe der Formel -(CH₂CH₂O)-₃CH₃ ist.
Falls Nukleoside die an ihrer 2'-Position modifiziert sind vorhanden sind, kann ein erfindungsgemäßes Oligonukleotidanalogon beispielsweise mindestens zwei aufeinanderfolgende Nukleoside die an ihrer 2'-Position modifiziert sind aufweisen und die über Phosphordiesterinternukleosidverknüpfungen verknüpft sind und/oder es kann eine Internukleosidverknüpfung der Formel I zwischen einem an der 2'-Position unmodifizierten Nukleosid und einem 5'-Kohlenstoffatom eines an der 2'-Position modifizierten Nukleosides aufweisen.
Es versteht sich ebenfalls für einen Durchschnittsfachmann, dass die endständigen Nukleoside im Oligonukleotidanalogon freie 5'- und 3'-Hydroxygruppen aufweisen können oder dass eine oder beide dieser Hydroxygruppen durch eine modifizierende Gruppe ersetzt sind, beispielsweise eine Phosphat-, Thiol-, Alkylthio-, Thioalkyl-, Thiophosphat-, Aminoalkyl-, Acridinyl-, Cholestenl- oder Fluoresceinylgruppe.
In Verknüpfungen der Formel I, können R¹ _a, R¹ _b oder R¹ _c als eine substituierte Alkyl-Alkenyl-, Cyclalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe, beispielsweise durch Hydroxy, C₁- bis C₄-Alkoxy, Halogen (vorzugsweise Chlor oder Fluor), Cyano, tris-(C₁-C₁₅-Hydrocarbyl)silyl oder durch eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe substituiert sein.
In einer Verknüpfung der Formel I, bei der R¹ R¹ _a ist und R¹ _a als C₁- bis C₁₀-Alkyl definiert ist, kann dieses beispielsweise sein Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Nonyl oder Decyl, bevorzugt ein C₁- bis C₄-Alkyl; R¹ _a, das als C₂- bis C₁₀-Alkenyl definiert ist, kann Vinyl, Allyl, Methallyl, 1-Propenyl, Isopropenyl, 2-Butenyl, 1-Butenyl, Isobutenyl, Pentenyl, Hexenyl, Octenyl oder Decenyl, bevorzugt ein C₂- bis C₅-Alkenyl; R¹ _a, das als C₃- bis C₆-Cycloalkyl definiert ist, kann beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Methylcyclopentyl, Cyclohexyl, Methylcyclohexyl, Dimethylcyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl sein, bevorzugt ein C₅- bis C₈-Cycloalkyl; R¹ _a, das als C₆- bis C₁₀-Aryl definiert ist, kann beispielsweise Phenyl, o-Tolyl, m-Tolyl, p-Tolyl, o-Xylyl, m-Xylyl, p-Xylyl oder Naphthyl sein, vorzugsweise C₆- bis C₈-Aryl; R¹ _a, das als C₇- bis C₁₃-Aralkyl definiert ist, kann beispielsweise Benzyl, 4-Methylbenzyl, 2-Phenylethyl, 2-Phenylpropyl, 3-Phenylpropyl oder Diphenylmethyl sein, vorzugsweise C₇- bis C₉-Aralkyl. R¹, das definiert als -NHR¹ _b kann C₁- bis C₁₀-Alkylamino sein, beispielsweise Methylamino, Ethylamino, Ispropylamino, Butylamino, Pentylamino, Hexylamino, Octylamino oder Decylamino, vorzugsweise C₁- bis C₄-Alkylamino; C₂- bis C₁₀-Alkenylamino, beispielsweise Allylamino, Methallylamino, 1-Propenylamino, Isopropenylamino, Isobutenylamino, Hexenylamino, Octenylamino oder Decenylamino, vorzugsweise C₃- bis C₅-Alkenylamino; C₃- bis C₈-Cycloalkylamino, beispielsweise Cyclopropylamino, Cyclobutylamino, Cyclopentylamino, Cyclohexylamino, Cycloheptylamino, Cyclooctylamino oder Dimethylcyclohexylamino, vorzugsweise C₅- bis C₈-Cycloalkylamino; C₈- bis C₁₀-Arylamino, beispielsweise Phenylamino, ortho-, meta- oder para-Tolylamino, ortho-, meta- oder para-Xylylamino oder Naphthylamino, vorzugsweise C₆- bis C₈-Arylamino; C₇- bis C₁₃-Aralkylamino, beispielsweise Benzylamino, 4-Methylbenzylamino, 2-Phenylethylamino, 3-Phenylpropylamino oder Diphenylmethylamino, vorzugsweise C₇ bis C₉-Aralkylamino. R¹, das als -NR¹ _bR¹ _c definiert, kann di(C₁- bis C₁₀-Alkyl)amino sein, beispielsweise Dimethylamino, Diethylamino, Methylethylamino, Diisopropylamino, Dibutylamino oder Dioctylamino, vorzugsweise di(C₁- bis C₄-Alkyl)amino; N,N-di(C₂-C₁₀-Alkenyl)amino, beispielsweise Diallylamino, Dimethallylamino, Allymethallylamino, Dipropenylamino, Dibutenylamino, Dipentenylamino, Dihexenylamino, Dioctenylamino oder Didecenylamino, vorzugsweise di(C₃-C₅-Alkenyl)amino; N,N-di(C₃-C₈-Cycloalkylamino, beispielsweise Dicyclopropylamino, Cyclopropylcyclopentylamino, Dicyclobutylamino, Dicyclopentylamino, Dicyclohexylamino, Dicycloheptylamino oder Dicyclooctylamino, vorzugsweise N,N-di(C₅-C₈- Cycloalkyl)amino; N-C₃-C₈-Cycloalkyl-N-C₁-C₁₀-Alkylamino, beispielsweise N-Cyclopentyl-N-Methylamino, N-Cyclopentyl-N-Ethylamino, N-Cyclohexyl-N-Methylamino, N-Cyclohexyl-N-Ethylamino, vorzugsweise N-(C₅-C₈-Cycloalkyl)-N-C₁-C₄-Alkylamino; N-C₆-C₁₀-Aryl-N-C₁-C₁₀-Alkylamino, vorzugsweise N-C₆-C₈-Aryl-C₁-C₄-Alkylamino, beispielsweise N-Phenyl-N-Methylamino, N-Tolyl-N-Methylamino oder N-Phenyl-N-Ethylamino; N,N-di(C₇-C₁₃-Aralkyl)amino, beispielsweise Dibenzylamin, di(4-Methylbenzyl)amin, di(Phenylethyl)amino oder di(Phenylpropyl)amino, vorzugsweise N,N-di(C₇-C₉-Aralkyl)amino; oder N-C₇-C₁₃-Aralkyl-N-C₇-C₁₀-Alkylamino, vorzugsweise N-C₇-C₉-Aralkyl-N-C₁-C₄-Alkylamino, beispielsweise N-Benzyl-N-Methylamino oder N-Benzyl-N-Ethylamino. Jede der vorstehenden Gruppen können wie vorliegend beschrieben unsubstituiert oder substituiert sein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist R¹ Wasserstoff, Hydroxy, eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₄-Alkyl- oder Phenylgruppe.
Sofern das Phosphoratom in Formel I ein chirales Zentrum ist, können Unterschiede bei der Hybridisierung und bei den Nukleaseresistenzeigenschaften und außerdem in der biologischen Wirksamkeit in Abhängigkeit von der Stereochemie am Phosphor beobachtet werden.
Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotidanalogon kann durch die Formel V-L-(V-L)-_n-V dargestellt werden, worin n eine Zahl von 8 bis 198 ist, und jedes V unabhängig voneinander ein Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleosids, wobei jeder der n + 2-Reste V der gleiche ist oder verschieden vom benachbarten Rest V ist, und jedes L eine Internukleosidverknüpfung ist, wobei jede der n + 1-Verknüpfungen L gleich ist oder verschieden ist von der benachbarten Verknüpfung L und wobei wenigstens ein L der Formel I entspricht.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotidanalogons mit mindestens einer Internukleosidverknüpfung der Formel I zur Verfügung, beispielsweise eine Oligonukleotid, das 2 bis 200 Nukleosideinheiten hat, wie beispielsweise ein Oligonukleotidanalogon wie es vorstehend beschrieben wurde, umfassend (i) das Durchführen einer Kupplungsreaktion oder aufeinanderfolgenden Kupplungsreaktionen zwischen (A) einem natürlichen oder synthetischen Nukle osid oder Oligonukleotid mit einer 5'-Hydroxylgruppe und (B) einem natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Dinukleotid, das an seiner 3'-Position eine Gruppe aufweist, die reaktiv mit der 5'-Hydroxylgruppe ist, bis ein Oligonukleotid mit der gewünschten Zahl der Nukleoside erhalten wird, wobei in mindestens einer der Kopplungsreaktionen (B) ein Nukleosid der Formel (II),
wobei B¹ ein Nukleosidbasenradikal ist, R⁴ eine Hydroxyschutzgruppe ist, R⁵ Wasserstoff, Hydroxy oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist, M⁺ ein Metall oder unsubstituiertes oder substituiertes Ammoniumion oder ein Kation einer heterocyclischen Base wie Pyrrolidin, Piperidin, N-Ethylpiperidin, N,N¹-Dimethylpiperzin, Morpholin oder 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) und X Sauerstoff oder Schwefel ist und mit (A) in der Anwesenheit eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids oder Anhydrids umgesetzt wird, zur Bildung eines Oligonukleotidanalogons mit einer Phosphinatinternukleosidverknüpfung der Formel
wobei X Sauerstoff oder Schwefel ist, und (ii) (a) das Umsetzen der Posphinatverknüpfung mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY, wobei R¹ _a wie vorstehend definiert ist und Y ein Abgangsatom oder eine Abgangsgruppe ist oder (b) das Oxidieren und Umsetzen der Phosphinatverknüpfung mit einem Amin der Formel R¹ _bNH₂ oder R¹ _bR¹ _cNH, wobei R¹ _a, R¹ _b und R¹ _c wie vorstehend definiert sind, umfasst.
Das vorstehend definierte Verfahren kann in Lösung oder an einem festen Träger durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung bekannter Verfahren für die Synthese von Oligonukleotiden. Das durch dieses Verfahren erhaltene Oligonukleotidanalogon kann weiter umgesetzt werden, um die Schutzgruppe R⁴ durch Wasserstoff zu ersetzen, oder, wenn R⁴ sich an einem endständigen Nukleosid im Oligonukleotidanalogon befindet, durch eine 5'-modifizierende Gruppe, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
Erfindungsgemäße Oligonukleotidanaloga können durch Festphasensynthese hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von H-Phosphonaten, Phosphortriester oder Phosphoramiditverfahren, oder einer Mischung aus zwei oder mehr davon, beispielsweise unter automatischer Verwendung von kommerziell erhältlichen Nukleinsäuresyntheseautomaten. Ein festphasensynthetisches Verfahren kann das Durchführen von aufeinanderfolgenden Kupplungsreaktionen umfassen (i) wie sie vorstehend beschrieben wurde, und Schritt (ii) wie vorstehend beschrieben, mit den Nukleosiden oder Oligonukleotid (A) das an dem festen Träger gebunden ist, anschließend (iii) Entfernen des Oligonukleotids vom festen Träger und Entfernen der Schutzgruppen, um ein Oligonukleotid mit einer endständigen freien 5'-Hydroxylgruppe zu ergeben und (iv) ggf. das Umsetzen der freien 5'-Hydroxylgruppe, um an der terminalen 5'-Position eine modifizierende Gruppe einzuführen.
In dem Nukleosid der Formel II, kann B¹ eine Purin- oder Pyrimidinbase oder ein Analoga davon sein, wie es vorstehend beschrieben wurde. Verbindungen, bei den B¹ einen natürliche Nukleosidbase ist, bevorzugt eine Pyrimidinbase, insbesondere Thymin, sind bevorzugt. R⁴ kann jede Hydroxylschutzgruppe sein, die in der Lage ist, die 5'-Hydroxylgruppe gegen eine unerwünschte Reaktion zu schützen. Derartige Gruppen sind gut bekannt und umfassen C₁ bis C₁₀ aliphatische, beispielsweise Alkylgruppen; C₃ bis C₈ cycloaliphatische, beispielsweise Cycloalkylgruppen; C₆ bis C₁₀ aromatische, beispielsweise Arylgruppen; C₇ bis C₄₀ araliphatische, beispielsweise Aralkyl oder C₁ bis C₄ Alkoxy-substituierte Aralkylgruppen; Gruppen der Formeln – COR⁶ oder -SO₂R⁶, wobei R⁶ eine C₁ bis C₁₀ aliphatische Gruppe ist, eine C₃ bis C₈ cycloaliphatische Gruppe, eine C₆ bis C₁₀ aromatische Gruppe oder eine C₇ bis C₄₀ araliphatische Gruppe; und tris(C₁-C₁₅-Hydrocarbyl)silyl-Gruppen. Bevorzugt ist R⁴ eine 5'-Schutzgruppe, die üblicherweise bei der Synthese von Oligonukleotiden verwendet wird, insbesondere eine Methoxytrityl, Dimethoxytrityl oder tris-tert-Butyltritylgruppe. R⁵ als eine 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe kann so ein Atom oder eine Gruppe sein, wie sie vorstehend beschrieben wurden; bevorzugt ist R⁵ Wasserstoff. M⁺ kann beispielsweise ein Alkalimetallion sein oder bevorzugt ein unsubstituiertes Ammoniumion, ein mono, di oder tri C₁- bis C₁₀-Alkyl- oder Hydroxylalkylammoniumion oder ein Kation einer heterocyclischen Base wie Pyrrolidin, Piperidin, N-Ethylpiperidin, N,N-Dimethylpiperazin, Morpholin oder DBU. Ein insbesondere bevorzugtes M⁺ ist ein Triethylammoniumion.
Bevorzugte Stereoisomere von Nukleosiden der Formel II sind diejenigen der Formel
wobei B¹, R⁴, R⁵, X und M⁺ wie vorstehend definiert sind.
Nukleoside der Formel II können hergestellt werden, durch a) das Umsetzen einer Verbindung der Formel
wobei B¹ und R⁴ wie vorstehend definiert sind, R⁵ _a Wasserstoff, Fluor oder -OR² ist, wobei R² wie vorstehend definiert ist und L ist ein Abgangsatom oder -gruppe, bevorzugt ein Jodatom, mit Ethyl(1,1-Diethoxyethyl)phosphinat in Gegenwart einer Base wie Kalium bis-(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (THF) bei –80°C bis 40°C um eine Verbindung der Formel
zu ergeben, wobei B¹ und R⁵ _a wie vorstehend definiert sind, b) das Reagieren der Verbindung der Formel IV mit Trimethylsilylchlorid in Chloroform, das 1% Ethanol enthält, unter Argon bei Raumtemperatur, um die Ketalschutzgruppe am Phosphor durch Wasserstoff zu ersetzen, c) das Umsetzen des Produkts aus b) mit Aceton in Gegenwart von Titan-(IV)-isopropoxid in trockenem THF bei Raumtemperatur um eine Verbindung der Formel
zu ergeben

d) das Umsetzen der Verbindung mit Formel V mit Tetra-n-butylammoniumfluorid und Essigsäure in THF bei Raumtemperatur um die tert-Butyldiphenylsilyl-Schutzgruppe zu entfernen,
e) das Umsetzen der entstehenden 5'-Hydroxy enthaltenden Verbindung mit einer Verbindung der Formel R⁴Y, wobei R⁴ wie vorstehend definiert ist und Y ein Halogen ist, in Gegenwart einer organischen Base um eine Verbindung der Formel
zu ergeben, worin B¹, R⁴ und R⁵ _a wie vorstehend definiert sind,
f) das Umsetzen der Verbindung der Formel VI mit einem Alkalimetallmethoxid in trockenem Methanol oder mit DBU in Wasser, bei Raumtemperatur um die Ethylgruppe zu entfernen und die -C(CH₃)₂OH-Gruppe durch Wasserstoff zu ersetzen,
g) falls gewünscht, das Behandeln des Produkts mit Ammoniak oder einem Amin um das entsprechende unsubstituierte oder substituierte Ammoniumsalz zu bilden, und
h) sofern gewünscht, das Sulfurisieren des Produkts um ein Nukleosid der Formel II zu ergeben, bei dem X Schwefel ist, beispielsweise durch Umsetzen mit Pivaloylchlorid, gefolgt von einer Behandlung mit (CH₃)₃Si-S-Si(CH₃)₃ unter Verwendung des Verfahrens wie es in J. Org. Chem. 1995, 50, 8241 beschrieben ist.

Die Verbindungen der Formeln IV, V oder VI können zur Einführung oder zur Einführung eines verschiedenen modifizierenden Atoms oder Gruppe R⁵ an der 2'-Position umgesetzt werden unter Verwendung beispielsweise eines üblichen Verfahrens zur Einführung eines derartigen 2'-modifizierenden Atoms oder Gruppe in ein Nukleosid.
Verbindungen der Formel III können durch Reduktion eines Aldehyds der Formel
hergestellt werden, wobei B¹ und R⁵ _a wie vorstehend definiert sind, hergestellt gemäß des in der WO 92/20823 beschriebenen Verfahrens, zum entsprechenden Alkohol durch Reaktion mit NaBH₄ in trockenem Ethanol bei Raumtemperatur und das Umsetzen des Alkohols mit Methyltriphenoxyphosphoniumiodid in Gegenwart von 2,6-Lutidin in trockenem Dimethylformamid bei 0°C bis 30°C.
Ethyl(1,1-Diethoxyethyl)phosphinat kann wie in der EP 0 307 362 beschrieben hergestellt werden.
In einem typischen Festphasensyntheseverfahren wird ein natürliches oder synthetisches Nukleosid, das eine geschützte 5'-Hydroxylgruppe aufweist, kovalent über die 3'-Position an einen inerten Siliziumdioxid basierten Träger verknüpft, wie beispielsweise Glas mit kontrollierten Poren (CPG), das lange Ketten aus Alkylaminogruppen enthält, unter Verwendung eines Linkers wie Succinsäureanhydrid um ein 3'-endständiges Nukleosid zu ergeben, das an dem festen Träger gebunden ist. Der feste Träger kann ebenfalls Gruppen enthalten, die als 3'-endständige modifizierende Gruppen für die gewünschten Oligonukleotide fungieren. Die Schutzgruppe, beispielsweise eine Dimethoxytritylgruppe an der 5'-Hydroxystellung des gebundenen endständigen Nukleosids wird anschließend entfernt, um eine freie 5'-Hydroxygruppe zu ergeben. Da endständige Nukleosid ist anschließend mit einem natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Dinukleotid (B) gekoppelt, das eine geschützte, beispielsweise Dimethoxytrityl geschützte, 5'-Hydroxylgruppe aufweist und an der 3'-Stellung eine Gruppe, die reaktiv mit, oder aktivierbar damit sie reaktiv ist, mit der 5'-freien Hydroxylgruppe am endständigen Nukleosid um ein dimeres Oligonukleotid zu ergeben (oder, wenn (B) ein Dinukleotid ist, ein trimeres Oligonukleotid), das an den festen Träger gebunden ist. Nachdem die 5'-Schutzgruppe an dem gebundenen Oli gonukleotid entfernt wurde, wird der Reaktionszyklus mit einem natürlichen oder synthetischen 5'-geschützten Nukleosid oder Dinukleotid (B), das eine 3'-reaktive Gruppe aufweist, wiederholt, bis ein Oligonukleotid synthetisiert wurde, das die gewünschte Anzahl von Nukleosiden aufweist.
Zur Bildung von Internukleosidverknüpfungen, die von denen in Formel I verschieden sind, wird die reaktive Gruppe oder die Gruppe, die aktiviert werden kann, damit sie reaktiv ist, an der 3'-Stellung des Nukleosids oder Dinukleotids (B) gemäß der üblichen Oligonukleotidsyntheseverfahren zur Oligonukleotidsynthese ausgewählt und kann beispielsweise eine H-Phosphonatgruppe, eine Phosphoramiditgruppe oder eine Phosphordiestergruppe sein. Die Kupplungsreaktion und, sofern nötig, die nachfolgende Oxidation, Sulfurisierung oder eine andere Behandlung, um diese Internukleosidverknüpfungen zu bilden, beispielsweise Phosphotrriester, Phosphorthioat oder Phosphordithioatverknüpfungen kann unter Verwendung üblicher Verfahren durchgeführt werden.
Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotidanalogon, wird wenigstens eine Kupplungsreaktionen durchgeführt unter Verwendung von (B) als Nukleosid der Formel II, das anschließend mit dem Nukleosid oder Oligonukleotid (A) umgesetzt wird, das bei Festphasensynthese am festen Träger gebunden ist, in Gegenwart eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids oder Anhydrids, beispielsweise Pivaloylchlorid, Adamantoylchlorid, 2,4,6-Trüsopropylbenzolsulfonylchlorid, Diphenylphosphanchlorid, bis-(2-oxo-3-Oxazolidinyl)phosphanchlorid, 2-Chloro-2-oxo-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaphosphinan oder bis(Pentafluorophenyl)anhydrid. Vorzugsweise wird die Umsetzung in Gegenwart einer heterocyclischen Base durchgeführt, die ein tertiäres Stickstoffatom im Ring aufweist oder einem Oxid einer derartigen Base, beispielsweise Pyridin, Chinolin, N-Methylimidazol oder Pyridin-N-Oxid und insbesondere einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril. Die Kupplungsreaktion kann bei Raumtemperatur oder bei leicht erhöhten Temperaturen durchgeführt werden, beispielsweise bis zu 50°C.
Die Phosphinatinternukleosidverknüpfung der Formel IA, die durch eine Kupplungsreaktion gebildet wurde unter Verwendung von (B) als Nukleosid gemäß Formel II, kann oxidiert oder sulfurisiert werden, bevor die nächste Kopplungsreaktion durchge führt wird oder vorzugsweise nachdem ein Oligonukleotidanalogon mit der gewünschten Anzahl von Nukleosiden synthetisiert wurde, wenn sie zusammen mit einem oder weiteren Phosphinatinternukleosidverknüpfungen oxidiert oder sulfurisiert werden kann, die durch andere Kopplungsreaktion unter Verwendung eines Nukleosids der Formel II oder Phosphitverknüpfungen, die durch Kopplungsreaktion unter Verwendung eines 3'-N-Phosphonat-substituierten Nukleosids gebildet wurden. Die Oxidation (ii)(a) kann durch Behandlung Jod und Wasser durchgeführt werden, oder mit tert-Butylhydroperoxid, beispielsweise unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren zur Oxidation von Phosphitinternukleosidverknüpfungen. Die Sulfurisation (ii)(b) kann durch Behandlung mit Schwefel in Gegenwart eines tertiären Amins in einem organischen Lösungsmittel, üblicherweise Kohlenstoffdisulfid durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von bekannten Verfahren.
Die Reaktion (ii)(c) der Phosphinatinternukleosidverknüpfung der Formel IA mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY, wobei R¹ _a und Y wie vorstehend definiert sind, und Y vorzugsweise ein Halogenatom oder Trifluormethansulfonatgruppe ist, und wobei R¹ _a ein Alkyl, Cycloalkyl oder Aralkyl ist, kann unter Verwendung bekannter Alkylierungsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Umsetzen der Phosphinatverknüpfung der Formel IA mit R¹ _aY, wobei Y Halogen ist, in Gegenwart einer starken Base wie beispielsweise Natriumhydrid. Wo R¹ _aY ein Alkenyl oder Arylhalid oder Triflat ist, kann die Reaktion zwischen der Phosphinatverknüpfung und R¹ _aY durchgeführt werden unter Verwendung bekannter Verfahren, beispielsweise in Gegenwart eines Palladiumkatalysators wie beispielsweise Pd(PPh₃)₄ und einem tertiären Amin, beispielsweise wie es von Y. Xu et al., Tetrahedron Lett., 30, 949 (1989) oder K. S. Petrakis et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 2831 (1987) beschrieben ist.
Die Oxidationsreaktion (ii)(d) der Phosphinatinternukleosidverknüpfung der Formel IA kann vor der nächsten Kupplungsreaktion durchgeführt werden oder nachdem ein Oligonukleotid mit der gewünschten Anzahl von Nukleosiden synthetisiert wurde, und zwar mit einem Amin mit der Formel R¹ _bNH₂ oder R¹ _bR¹ _cNH, wobei R¹ _b und R¹ _c wie vorstehend definiert sind und Kohlenstofftetrachlorid oder Bromtrichlormethan oder Jod, um ein erfindungsgemäßes Oligonukleotidanalogon zu ergeben, bei dem R¹ -NHR¹ _b oder -NR¹ _bR¹ _c ist. Die Reaktion kann unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen und Verfahren für Atherthon-Todd-Reaktionen durchgeführt werden.
Für den Durchschnittsfachmann ist es offensichtlich, dass bei der Umsetzung der Phosphinatverknüpfung der Formel IA zum Ersatz des Wasserstoffatoms, das am Phosphor gebunden ist durch eine Gruppe R¹, die reaktive Substituenten wie Amino aufweist, der Substituent während der Reaktion zur Einführung von R¹ geschützt werden sollten, sofern er bei den Reaktionsbedingungen dieser Reaktion reaktiv ist und nachfolgend entschützt wird.
Wenn ein Oligonukleotidanalogon, das die gewünschte Anzahl von Nukleosiden auf einem festen Träger synthetisiert wurde, wird es von dem festen Träger abgelöst, beispielsweise unter Verwendung üblicher Methoden wie Behandlung mit konzentriertem wässrigen Ammoniak, wobei diese Behandlung ebenfalls eine Schutzgruppe entfernt, die an einem exocyclischen Stickstoffatom bei einem oder mehreren der Nukleosiden, die zur Verwendung bei der Synthese des Oligonukleotids verwendet wurden, vorhanden sind, und zwar vor oder nach der Behandlung zur Entfernung der Hydroxyschutzgruppen, wie Dimethoxytritylgruppen, das ebenfalls unter Verwendung üblicher Methoden durchgeführt werden kann, beispielsweise durch Behandlung mit einer wässrigen organischen Säure wie Trifluoressigsäure.
Vor oder nach dem Ablösen des Oligonukleotids von dem festen Träger kann das endständige 5'-Hydroxyl, das bei der Entschützung entstanden ist, umgesetzt werden, um eine 5'-endständige modifizierende Gruppe einzuführen, wie eine Phosphatgruppe oder andere 5'-modifizierende Gruppen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, beispielsweise unter Verwendung der Verfahren wie sie von Beaucage und lyer beschrieben wurden, Tetrahedron 49, 1925–63 (1993).
In einer Modifizierung des vorstehend beschriebenen Syntheseverfahrens, kann das Nukleosid der Formel II durch ein Dinukleotid der Formel
ersetzt werden, wobei B¹, R¹, R⁴ und R⁵ wie vorstehend definiert sind, B² ist ein Nukleosidbasenradikal ist, das ein Radikal einer natürlichen oder synthetischen Nukleosidbase wie sie vorstehend für B¹ beschrieben wurden, R⁶ ist Wasserstoff, Hydroxyl oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe wie vorstehend für R⁵ definiert und R¹ ist eine Gruppe die mit einer 5'-Hydroxylgruppe reagiert oder aktivierbar ist, damit sie mit ihr reagiert.
In dieser Modifikation, kann die R⁷O-Gruppe im Dinukleotid der Formel VIII eine H-Phosphonatgruppe sein, wobei in diesem Fall das Dinukleotid der Formel VIII mit dem Nukleosid oder Oligonukleotid (A) umgesetzt werden kann, das bei der Festphasensynthese an dem festen Träger befestigt wird, in Gegenwart eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids, beispielsweise unter Verwendung von üblichen Verfahren für die Oligonukleotidsynthese unter Verwendung von 3'-H-Phosphonaten, um eine Phosphitinternukleosidverknüpfung zu bilden, die anschließend oxidiert, sulfurisiert oder mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY umgesetzt werden kann oder eine der anderen Reaktionen (ii)(a) bis (ii)(e) wie sie vorstehend für die Phosphinatinternukleosidverknüpfung der Formel IA, die durch Reaktion des Nukleosids der Formel II mit (A) entstanden wurde, unterzogen werden.
Bei dieser Modifikation kann die Gruppe R¹O im Dinukleotid der Formel VIII alternativ eine Phosphoramiditgruppe sein, wobei in diesem Fall das Dinukleotid der Formel VIII mit dem Nukleosid oder Oligonukleotid (A) umgesetzt werden kann, beispielsweise unter Verwendung von üblichen Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung von 3'-Phosphoramiditen.
In einer anderen alternativen Ausführungsform dieser Modifikation, ist die Gruppe R¹O im Dinukleotid der Formel VIII eine Phosphordiestergruppe, wobei in diesem Fall das Dinukleotid der Formel VIII mit dem Nukleosid oder Oligonukleotid (A) umgesetzt werden kann, beispielsweise unter Verwendung von üblichen Verfahren für die Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung von 3'-Phosphodiestern.
Dinukleotide der Formel VIII können hergestellt werden durch Umsetzung eines Nukleosids der Formel II mit einem Nukleosid der Formel
wobei B² und R⁶ wie vorstehend definiert sind und R⁸ eine Hydroxyschutzgruppe ist, in Gegenwart eines dehydrierenden Kupplungsreagens, beispielsweise einem Carbodiimid oder einem sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids oder Anhydrids um ein Dinukleotid der Formel
zu ergeben und optional nach dem Unterwerfen der Internukleosidverknüpfung in Formel X zu jeder der Reaktionen (ii)(a) bis (ii)(b) wie sie vorstehend beschrieben wurden, zur Umwandlung R⁸O-Gruppe in eine R⁷O-Gruppe.
Die Hydroxyschutzgruppe R⁸ kann ausgewählt werden aus Gruppen wie sie vorstehend für R⁴ spezifiziert wurden. Vorzugsweise ist R⁸ eine 3'-Schutzgruppe wie sie üblicherweise in der Nukleosidchemie verwendet wird, insbesondere eine tert-Butyldiphenylsilylgruppe.
Nukleoside der Formel IX sind 3'-geschützte natürliche oder synthetische Nukleoside die Wasserstoff, Hydroxy oder ein 2'-modifizierendes Atom der Gruppe an ihrer 2'-Stellung aufweisen. Derartige Nukleoside sind bekannt oder können über bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die Reaktion zwischen dem Nukleosid der Formel II und dem Nukleosid der Formel IX in Gegenwart eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids wird vorzugsweise in Gegenwart einer heterocyclischen Base oder eines ihrer Oxide durchgeführt und in Gegenwart eines organischen Lösungsmittel wie es vorstehend für die Reaktion des Nukleosids der Formel II mit dem Nukleosid oder dem Oligonukleotid (A) beschrieben wurde.
Die Umwandlung der Gruppe R⁸O- in eine Gruppe R⁷O-, wobei R⁸ und R⁷ wie vorstehend definiert sind, kann durchgeführt werden unter Verwendung üblicher Verfahren zur Umwandlung einer geschützten 3'-Hydroxylgruppe in eine Gruppe, die mit einer 5'-Hydroxylgruppe reagiert oder aktiviert werden kann, damit sie damit reagiert, wie beispielsweise einem N-Phosphonat, einem Phosphoramidite oder einer Phosphordiestergruppe. Beispielsweise kann die Schutzgruppe R⁸ entfernt werden, um eine 3'-Hydroxylgruppe zu erzeugen, die anschließend mit einem aliphatischen bis(N,N-Dialkyl)phosphoramidit umgesetzt werden kann wie beispielsweise 2-Cyanoethyl-bis-(N,N-diisopropyl)phosphordiamidit, um eine 3'-Phosphoramiditgruppe zu bilden.
Dinukleotide der Formeln VIII, wobei eines oder jedes der R⁵ und R⁶ ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe wie vorstehend definiert ist, insbesondere eine Gruppe der Formel -OR² wie vorstehend definiert, sind neu. Dinukleotide der Formel X sind neu. Daher stellt die Erfindung auch neue Dinukleotide der Formel
zur Verfügung, wobei B¹, B², R¹, R⁴ wie vorstehend definiert sind, R⁵ und R⁶ sind wie vorstehend definiert mit der Ausnahme, dass, wenn R¹ von Wasserstoff verschieden ist, dann wenigstens eines von R⁵ und R⁶ ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe wie vorstehend definiert ist, und R⁹ ist R⁷ oder R⁸ wie vorstehend definiert, insbesondere diejenigen, bei denen R⁵ Wasserstoff oder Hydroxy ist und R⁶ ist ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe wie vorstehend definiert, insbesondere eine Gruppe der Formel -OR² wie vorstehend definiert.
Dinukleotide der Formel VIII, wobei R¹ C₁₀- bis C₁₀-Alkoxy ist, können ebenfalls hergestellt werden, indem ein Nukleosid der Formel
umgesetzt wird, wobei B¹, R⁴ und R⁵ wie vorstehend definiert sind, mit einem Nukleosid der Formel IX in Gegenwart eines tertiären Amins wie beispielsweise Dimethylaminopyridin und einem dehydrierenden Wirkstoff wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), um ein Dinukleotid der Formel X zu ergeben, welches anschließend wie vorstehend definiert behandelt wird, um ein Dinukleotid der Formel VIII zu ergeben. Die Reaktion zwischen den Nukleosiden der Formeln XII und IX kann in einem Lösungsmittel wie THF bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Nukleoside der Formel XII können hergestellt werden, indem Nukleoside der Formel II (Salzformen von Säuren der Formel XII) mit Säuren behandelt werden unter Verwendung von üblichen Verfahren.
Oligonukleotide, die wenigstens eine Diesterinternukleosidverknüpfung aufweisen, beispielsweise ein Oligonukleotid, das 2 bis 200 Nukleosideinheiten hat, wie beispielsweise ein Oligonukleotidanalogon wie vorstehend beschrieben, können ebenfalls hergestellt werden, indem ein Nukleosid, das geschützte 5'-Hydroxygruppen und, an der 3'-Stellung, eine Gruppe der Formel
aufweist, wobei R¹ _a wie vorstehend definiert ist, R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander ein unsubstituiertes oder substituiertes C₁- bis C₁₀-Alkyl, C₂- bis C₁₀-Alkenyl, C₄- bis C₁₀-Cycloalkylalkyl, C₆- bis C₁₀-Aryl oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe ist, oder R¹⁰ ist diese Gruppe und R¹¹ ist Wasserstoff, oder R¹⁰ und R¹¹ bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an die sie gebunden sind, einen fünf- bis dreizehngliedrigen heterocyclischen Ring, einer Nukleosidkopplungsreaktion mit natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Oligonukleotid, das eine freie 5'-Hydroxygruppe aufweist, unterzogen wird, um ein Oligonukleotidprecusor zu bilden, der eine Internukleosidverknüpfung der Formel
aufweist, wobei R¹ _a wie vorstehend definiert ist und das Umwandeln des Precursors in ein Oligonukleotid, das eine Internukleosidverbindung der Formel
aufweist, wobei R¹ _a wie vorstehend definiert ist und X Sauerstoff oder Schwefel ist, indem der Precursor oxidiert wird, um das Oligonukleotid zu ergeben, das eine Internukleosidverknüpfung der Formel XV aufweist, wobei X Sauerstoff ist oder in dem der Precursor Sauerstoff sulfurisiert wird, um ein Oligonukleotid zu ergeben, das eine Internukleosidverknüpfung der Formel XV aufweist, wobei X Schwefel ist.
Die Reaktion zur Bildung des Precursors, der eine Verknüpfung der Formel XIV aufweist, kann in Gegenwart einer Amin-protonierenden Kupplungskatalysator (Aktivator) durchgeführt werden, wie beispielsweise Tetrazol oder 5-(4-Nitrophenyl)tetrazol. Die Reaktion kann bei –20 bis 50°C durchgeführt werden, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Die Oxidation oder Sulfurisation des entstehenden Precursors kann mittels Methoden durchgeführt werden, die für die Oxidation oder Sulfurisation von Phosphitinternukleosidverknüpfungen verwendet werden. So kann die Oxidation durchgeführt werden über eine Behandlung mit Jod und Wasser, oder mit einem Hydroperoxid wie tert-Butylhydroperoxid, beispielsweise unter Verwendung von Reaktionsbedingungen und Verfahren, die für die Oxidation von Phosphitinternukleosidverknüpfungen in der Synthese von Oligonukleotiden bekannt sind. Die Sulfurisation kann durchgeführt werden, durch eine Behandlung mit Schwefel in Gegenwart eines tertiären Amins in einem organischen Lösungsmittel, für gewöhnlich Kohlenstoftdisulfid, durch Behandlung mit [3H]1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxid (Beaucage-Reagens) oder durch Behandlung mit Tetraethylthiuram, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die für die Sulfurisierung von Phosphitinternukleosidverknüpfungen bekannt sind.
Nukleoside die eine geschützte 5'-Hydroxygruppe und an der 3'-Stellung eine Gruppe der Formel XIII aufweisen, können durch Umsetzung eines Nukleosids, das eine geschützte 5'-Hydroxygruppe und an der 3'-Stellung eine Gruppe der Formel
erhalten werden, wobei R¹ _a wie vorstehend definiert ist und Z ist ein Halogen, mit einer Verbindung der Formel
wobei R¹⁰ und R¹¹ wie vorstehend definiert sind. Die Reaktion kann in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, beispielsweise in einem halogenierten Kohlenwasserstoff wie Chloroform, in Gegenwart einer tertiären Stickstoffbase wie Pyridin und bei einer Temperatur von –78°C bis 50°C, vorzugsweise von –30°C bis 25°C.
Nukleoside die eine geschützte 5'-Hydroxygruppe und an der 3'-Stellung eine Gruppe der Formel XVI aufweisen, können durch nicht-oxidative Halogenierung eines Nukleosids, das eine geschützte 5'-Hydroxygruppe und an der 3'-Stellung eine Gruppe der Formel
aufweist, hergestellt werden.
Die nicht-oxidative Halogenierung kann durch Umsetzung mit einem nicht-oxidierenden Halogenierungsmittel, beispielsweise einem Halophosphoran wie Triphenyldichlorphosphoran oder Dichlor-tris(2,4,6-tribromophenoxy)phosphoran durchgeführt werden in Gegenwart einer Base, vorzugsweise einer tertiären Stickstoffbase wie Pyridin, in einem organischen Lösungsmittel, das Pyridin sein kann, aber vorzugsweise ein Halogenkohlenwasserstoff wie Chloroform ist, und bei einer Temperatur von –20°C bis 60°C, vorzugsweise von 0°C bis 50°C.
Nukleoside die eine geschützte 5'-Hydroxygruppe und an ihrer 3'-Stellung eine Gruppe der Formel XVIII aufweisen, können wie in der WO 96/08503 beschrieben hergestellt werden.
Wenn das Oligonukleotid, das eine Verknüpfung der Formel XV aufweist, auf einem festen Träger gebildet wird, kann es behandelt werden, um die 5'-Schutzgruppe zu entfernen und das resultierende 5'-Hydroxy-endständige Oligonukleotid kann aufeinanderfolgenden Kopplungszyklen unterzogen werden, mit einem natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Oligonukleotid, das eine geschützte 5'-Hydroxylgruppe und an seiner 3'-Stellung eine Gruppe, die mit der freien 5'-Hydroxygruppe an dem entschützten Oligonukleotid, das an dem festen Träger befestigt ist, reagiert, oder aktiviert werden kann, um damit zu reagieren, bis ein Oligonukleotid der gewünschten Länge erhalten wird. Daher kann das Oligonukleotid, das eine Verknüpfung der Formel XV aufweist mit einem Nukleosid oder Oligonukleotid gekoppelt werden, das ein 3'-Phosphoramidit, H-Phosphonat, eine Phosphordiestergruppe oder eine 3'-Gruppe der Formel XIII aufweist und eine geschützte 5'-Hydroxylgruppe, um ein kettenverlängertes Oligonukleotid zu erhalten, das selber wiederum weiter kettenverlängert werden kann, über weitere derartige alternative Reaktionen, bis ein Oligonukleotid der gewünschten Länge erhalten wird. Sobald ein Nukleosid oder ein Oligonukleotid, das ein 3'-Phosphoramidit, H-Phosphonat oder eine Phosphordiestergruppe aufweist, verwendet wird, kann die Kopplungsreaktion durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren die der Synthese von Oligonukleotiden bekannt sind. Sobald ein Nukleosid, das eine 3'-Gruppe der Formel XIII aufweist verwendet wird, kann die Kopplungsreaktion wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden. Daher ist, wenn ein 3'-Phosphoramidit oder eine 3'-Gruppe der Formel XIII verwendet wird, um fasst der Kopplungszyklus eine Oxidation oder Sulfurisation während jedoch, wenn ein 3'-H-Phosphonat verwendet wird, die Oxidation oder die Sulfurisation nach der vollständigen Kettenverlängerung durchgeführt und wenn ein 3'-Phosphodiester verwendet wird, ist keine Oxidation erforderlich.
Die Oligonukleotidanaloga der Erfindung können in der Therapie verwendet werden, beispielsweise bei der Behandlung eines Menschen oder anderen Säugetieren, die an einer Krankheit leiden, die über ein Protein moduliert wird, oder bei der Behandlung von Viruserkrankungen wie Grippe, Herpes und HIV. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die als aktiven Wirkstoff ein erfindungsgemäßes Oligonukleotidanaloga umfasst. Die optimalen Dosierungen und die Behandlungszeiträume können von einem Durchschnittsfachmann einfach bestimmt werden. Wenn die Dosis an Säugetiere von ungefähr 70 kg Gewicht verabreicht werden, kann die Dosis beispielsweise 0,01 bis 1000 mg pro Tag sein. Es wird im allgemeinen bevorzugt sein, therapeutische Wirkstoffe gemäß der Erfindung intern zu verabreichen, beispielsweise oral, über Inhalation, intravenös oder intramuskulär. Andere Verabreichungsverfahren, wie transdermale, topische oder interläsionale Verfahren oder durch Einschluss in Zäpfchen können ebenfalls nützlich sein. Die Verwendung im Zusammenhang mit pharmakologisch akzeptablen Trägerstoffen ist für einige therapeutische Behandlungen bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloga haben eine überraschend hohe Stabilität in Bezug auf ihren Abbau durch Nukleasen. Ein sehr gutes Pairing mit komplementären Nukleinsäuresträngen, insbesondere des RNA-Typs wird ebenfalls beobachtet. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloga sind deshalb besonders geeignet für die Antisense-Technologie, d. h. für die Inhibierung der Expression von unerwünschten Proteinprodukten aufgrund der Bindung an geeignete komplementäre Nukleotidsequenzen in den Nukleinsäuren (siehe z. B. EP 0 266 099 , WO 87/07300 und WO 89/08146). Sie können zur Behandlung von Infektionen und Krankheiten verwendet werden, beispielsweise indem sie die Expression von bioaktiven Proteinen im Nukleinsäurestadium (beispielsweise Onkogene) blockieren. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloga sind ebenfalls als Diagnostika geeignet und können als Gensonden zur Detektion viraler Infektionen oder von genetisch be dingten Krankheiten durch selektive Wechselwirkung am Einzel- oder Doppelstrangnukleinsäurestadium verwendet werden. Insbesondere können sie aufgrund ihrer erhöhten Stabilität gegenüber Nukleasen für die diagnostische Verwendung nicht nur in vitro sondern ebenso in vivo (beispielsweise in Gewebeproben, Blutplasma und Blutserum) verwendet werden. Die Verwendungsmöglichkeiten dieser Art sind beispielsweise in der WO 91/06556 beschrieben.
Die neuen Dinukleotide der Formel XI können als Medikamente verwendet werden, beispielsweise als antivirale Wirkstoffe.
Die pharmakologisch aktiven erfindungsgemäßen Oligonukleotidanaloge und Dinukleotide können in Form von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen verwendet werden oder als Infusionslösungen. Lösungen dieser Art sind vorzugsweise isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen, es ist möglich, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise im Fall von gefriergetrockneten Präparationen, die die aktive Substanz alleine oder zusammen mit einem Träger enthalten, beispielsweise Mannitol. Die pharmazeutischen Präparationen können sterilisiert werden und/oder enthalten Exzipienten, beispielsweise Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Befeuchten und/oder Emulsifikatoren, Solubilisatoren, Salze zur Regulierung des osmotischen Druck und/oder Puffer. Die pharmazeutischen Präparationen, die, falls gewünscht, weitere pharmakologisch aktive Substanzen wie beispielsweise Antibiotika enthalten können, werden in der an sich bekannten Weise hergestellt, beispielsweise über herkömmliche Lösungs- oder Gefriertrocknungsverfahren und enthalten ungefähr 0,1% bis 90%, insbesondere von ungefähr 0,5% bis ungefähr 30 %, beispielsweise 1% bis 5% an aktiven Substanzen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Die Verbindungen, die in den Beispielen verwendet werden und deren Vorläufer werden wie folgt hergestellt. Sämtliche ³¹P-Daten dieser Verbindungen und derjenigen der Beispiele sind ¹H entkoppelt.
Verbindung A
Zu einer Lösung eines Aldehyds der Formel XIII, wobei R² Wasserstoff ist, B¹ ist I-Thyminyl und R¹ ist tert-Butyldiphenylsilyl, hergestellt wie es in der WO 92/20823 beschrieben wurde (11,2 g, 23 mmol) wird in trockenem Ethanol (120 ml) bei Raumtemperatur portionsweise während 5 Minuten NaBH₄ zugegeben (865 mg, 23 mmol). Nach 1 Stunde wird die Reaktionsmischung mit Wasser gequencht, mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt und mit Wasser (2 × 50 ml) gewaschen. Nach Rückextraktion der wässrigen Phase werden die kombinierten organischen Phasen getrocknet (MgSO₄) und einkonzentriert, um Verbindung A als weißen Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 9,10 (1H, s, NH) 7,65 (4H, d, Ar4 × CH ortho), 7,40 (7H, m, Ar 4 × CH meta, 2 × CH para + H6) 6,13 (1H, t, H1') 4,00 (1H, dd, H5'), 3,93 (1H, m, H4') 3,82 (1H, dd, H5'), 3,62 (2H, m, CH₂OH) 2,60 (1H, m, H3'), 2,32 (1H, m, H2'), 2,12 (1H, m, H2') 1,62 (3H, s, T-CH₃) und 1,10 (9H, s, 'Bu) ppm.
Verbindung B
Zu einer Lösung von Verbindung A (9 g, 18,1 mmol) in trockenem DMF (100 ml) bei 0–5°C werden 2,6-Lutidin (4,25 ml, 36,5 mmol) zugegeben, gefolgt von Methyltriphenoxyphosphoniumjodid (9,45 g, 20,9 mmol). Die entstehende Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 1 Stunde wird die Mischung verdünnt (200 ml Ethylacetat) und mit 0,1 N NaS₂O₃ (2 × 20 ml), 0,5 N Salzsäure (2 × 20 ml) und Wasser (2 × 20 ml) gewaschen. Trocknung, Einkonzentrieren und Reinigung über Flashsilicasäulenchromatographie (Elutionsgradient Chloroform: Ethylacetat 20 : 1– 7 : 1) ergibt Verbindung B als weißen Feststoff.
¹H NMR (CDCl₂, 400 MHz) δ 10,2 (1H, s, NH) 7,66 (4H, d 4 × CH ortho), 7,40 (7H, m, 4 × CH meta, 2 × CH para + H6) 6,19 (1H, t, H1') 4,02 (1H, dd, H5'), 3,82 (1H, m, H4') 3,78 (1H, dd, HS'), 3,17 (1H, dd, CH₂I) 3,10 (1H, dd, CH₂I), 2,68 (1H, m, H3'), 2,30 (1H, m, H2') 2,23 (1H, m, H2') 1,66 (3H, s, CH₃-T), 1,10 (9H, s, tBu) ppm.
Verbindung C
Zu einer Lösung von Ethyl (1,1-Diethoxyethyl)phosphinat (5,51 g, 26,2 mmol) in trockenem THF (170 ml) wird unter Argon bei –78°C eine Lösung von Kaliumbis(trimethylsilyl)amid (34,6 ml, 0,75 M Lösung in Toluol) tropfenweise über 5 Minuten zugegeben. Die entstehende Lösung wird bei –78°C für 1 Stunde gerührt. Eine Lösung von Verbindung B ( 5,0 g, 8,25 mmol) in trockenem THF (20 ml) wird anschließend tropfenweise über 5 Minuten zugegeben. Rühren wird bei –78°C für 1 Stunde fortgesetzt, bevor während 2 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt wird. Anschließend wird gesättigtes wässriges Ammoniumchlorid (50 ml) zugegeben und die gesamte Mischung mit Ethylacetat (500 ml) extrahiert. Die organische Phase wird mit gesättigtem Ammoniumchlorid (2 × 50 ml) und Wasser (2 × 50 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und einkonzentriert. Reinigung erfolgt über Flashsilicasäulenchromatographie (Eluent Ethylacetat: Ethanol 30 : 1) und ergibt Verbindung C als eine 1 : 1-Mischung von Diastereoisomeren, die an Phosphor Epimere sind.
Verbindung D
Trimethylsilylchlorid (4,44 ml, 35 mmol) wird tropfenweise (2 Minuten) bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von Verbindung C (2,4 g, 3,5 mmol) in Chloroform (25 ml) zugegeben, die Ethanol (1%) enthält, die Zugabe erfolgt unter Argon. Nach Stehenlassen bei –20°C für 60 Stunden wird ein weiterer Teil von Trimethylsilylchlorid (2,22 ml, 17,5 mmol) zugegeben zusammen mit Ethanol (200 μl) und die entstehende Lösung wird bei Raumtemperatur für 7 Stunden gerührt. Einkonzentration und Koverdampfung mit Chloroform (50 ml) ergibt einen weißen Feststoff, der über Flashsilicasäulenchromatographie (Eluent Chloroform: Ethanol 13 : 1) erfolgt, um Verbindung D als weißen Feststoff zu ergeben, der als eine 1 : 1-Mischung von Diastereoisomeren isoliert wurde.
Verbindung E
Zu einer Lösung von Verbindung D (1,2 g, 2,1 mmol) in trockenem THF (30 ml) enthaltend Aceton (3,2 ml) wird Titan(IV)isopropoxid (738 μl, 2,48 mmol) zugegeben. Nach 15 Minuten ergibt Einkonzentration und Passage über eine kurze Säule von Siliziumdioxid (Eluent Ethylacetat: Ethanol 4 : 1) (500 ml) Verbindung E, die als Mischung von 2 Diastereoisomeren isoliert wurde.
³¹P NMR ¹H entkoppelt (CDCl₃, 162 MHz) δ 55,0, 54,7 ppm. Gefunden: C 57,7, H 7,05, N 4,05% C₃₂H₄₅N₂O₇PSi·2H₂O erforderlich C 57,8, N 7,4, N 4,2%.
Verbindung F
Zu einer Lösung von Verbindung E (1,02 g, 1,62 mmol) und Essigsäure (92 μl, 16,1 mmol) in THF (10 ml) wird eine Lösung von Teta-n-butylammoniumfluorid (1,63 ml, 1,0 Molar) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wird die Mischung konzentriert und mit Chloroform (50 ml) koverdampft. Reinigung erfolgt über Flashsilicasäulenchromatographie (Eluent Chloroform: Ethanol 9 : 1) und ergibt Verbindung F, die als Mischung zweier Diastereoisomere isoliert wurde.
Gefunden: C 45,55, H 6,85, N 6,4% C₁₆H₂₇N₂O₇P·1 2/3 H₂O erfordert C 45,7, H 7,25, N 6,6%
³¹P NMR¹H entkoppelt (CDCl₃, 162 MHz) δ 56,7, 56,5 ppm.l
Verbindung G
Zu einer Lösung von Verbindung F (550 mg, 1,41 mmol) in Pyridin (10 ml) wird Dimethoxytritylchlorid (958 mg, 2,83 mmol) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für. 20 Stunden, ergibt Einkonzentration und Reinigung über Flashsilicasäulenchromatographie (Eluent Chloroform, Methanol, Triethylamin 100 : 5 : 1) Verbindung G, die als Mischung von 2 Diastereoisomeren isoliert wurde.
³¹P NMR¹H entkoppelt (CDCl₃, 162 MHz) δ 54,9, 54,7 ppm.
Verbindung N
Zu einer Lösung von Verbindung G (0,85 g, 1,22 mmol) in trockenem Methanol (10 ml) wird Natriummethoxid (1,54 ml, 4,4 N Lösung in Methanol) zugegeben. Rühren für 16 Stunden bei Raumtemperatur, Einkonzentration und Reinigung über Flashsilicasäulenchromatographie (Gradient Elution – Chloroform, Methanol, Triethylamin 100 : 20 : 1–100 : 35 : 1) gefolgt von weiterer Reinigung durch das Durchleiten einer Lösung des Produkts in wässrigem 0,5% Triethylamin durch eine Dowex 50W-X2 Ionenaustauschersäule (Triethylaminform) ergibt nach Einkonzentration Verbindung H.
³¹P NMR¹H entkoppelt (CD₃OD, 162 MHz) δ 23,7 ppm.
Verbindung J
Verbindung J wird wie in Beispiel 98 der WO 96/08503 beschrieben hergestellt.
In den Formeln der Verbindungen K bis M, bedeutet T 1-Thyminyl und DMTr ist Dimethoxytrityl.
Verbindung K
Zu einer Lösung von Verbindung N (500 mg, 0,71 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (189 mg, 0,92 mmol) in trockenem THF (5,4 ml) unter Argon bei Raumtemperatur wird 3-Hydroxypropionitril (58 μl, 0,85 mmol) zugegeben. Die entstehende Lösung wird bei 55°C für 2 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Mischung filtriert und mit Ethylacetat (20 ml) verdünnt und mit Wasser und konzentrierter Kochsalzlösung gewaschen, und über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und einkonzentriert. Das entstehende Produkt wird in Dichlormethan (5 ml) aufgenommen und filtriert und einkonzentriert, wobei dieses Verfahren so oft wiederholt wird wie es nötig ist, um Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, um Verbindung K zu ergeben, die als Mischung von Phosphordiastereoisomeren isoliert wird.
³¹P NMR (¹H entkoppelt) (CDCl₃, 162 MHz) δ 37,4, 37,3 ppm.
Verbindungen L und M
Zu einer Lösung von sorgfältig getrockneter Verbindung K (71 mg, 220 μmol) in Deuterochloroform (0,5 ml) enthaltend Pyridin (80 μl, 1 mmol) wird Dichlortriphenylphosphoran (113 mg, 350 μmol) zugegeben. Die entstehende Mischung wird ge schüttelt, um das Phosphoran zu lösen und anschließend bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Fortschritt der Reaktion wird über ³¹P nmr verfolgt. Das Produkt ist Verbindung L. Nach 16 Stunden wird weiteres Dichlortriphenylphosphoran (28 mg, 87 μmol) zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden zeigt das ³¹P NMR, dass die Reaktion zu 95% vollständig war. Insgesamt werden 56 μl (0,67 mmol) Pyrrolidin in Portionen zur rohen Reaktionsmischung bei –30°C zugegeben. Die entstehende Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmt und anschließend mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, zweimal mit entionisiertem Wasser (2 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und einkonzentriert. Reinigung erfolgt über Flashsilicasäulenchromatographie und ergibt Verbindung M.
Beispiele 1 bis 13
In den folgenden Beispielen werden Verbindung H und Verbindung J als Monomere bei der Synthese von Oligonukleotidanaloga verwendet. Nicht modifiziertes 5'-Dimethoxytrityl substituierte Nukleosid H-Phosphonate werden ebenso verwendet wie kommerziell erhältliche Diethylammoniumsalze und wie folgt abgekürzt:
Tp = Thymidin-H-Phosphonat
Cp = N⁴-Benzoyldeoxycytidin-N-Phosphonat
Ap = N⁶-Benzoyldeoxyadenosin-H-Phosphonat
Gp = N²-Isobutyryldeoxyguanosin-H-Phosphonat.
Die Oligonukleotidsynthesen werden manuell in Polypropylenspritzen mit kommerziell erhältlichen Nukleosiden (Tp, Cp oder Ap) durchgeführt, die mit langkettigen Alkylaminen derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren enthalten. Der erste Rest der am 3'-Ende der folgenden Beispiele gezeigt ist, resultiert von diesem kommerziellen Material. Die Synthesen werden auf einer 0,2 μmol Basis in 3'- zur 5'-Richtung durchgeführt.
Die Oligonukleotide der folgenden Beispiele fallen nicht in den Umfang der beanspruchten Erfindung. Diese Beispiele sind angegeben, um die Synthese von Oligonukleotiden, die gemäß Anspruch 1 modifiziert wurden, zu erleichtern.
Beispiel 1: Oligonukleotidanaloga 1
^5'TTT T^*TC TCT CTC TCT^3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy darstellt und alle anderen Verknüpfungen Phosphordiesterverknüpfungen sind.
Der Träger (6,8 mg) wird mit Dichlormethan gewaschen und die 5'-Schutzgruppe wird durch Behandlung mit Dichloressigsäure entfernt und der Träger wird wieder gewaschen, um ihn für die Kopplung zu präparieren. Sobald die Kopplung mit einem nichtmodifizierten Nukleosid H-Phosphonat erfolgt, wird der Träger mit einer Lösung des 5'-geschützten Nukleosids N-Phosphonat (30 mM für Thymidin; 20 mM für Cytidin) in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl für Thymidin, 300 μl für Cytidin) in Gegenwart von Pivaloylchlorid (182 mM) und ebenfalls in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) für 1 Minute behandelt.
Um das erforderliche Oligonukleotidanaloga zu erhalten, wird der normalen H-Phosphonat DNA-Synthese gefolgt mit der Ausnahme, dass das Monomerverbindung N für einen nichtmodifizierte Nukleosid H-Phosphonat ersetzt wird, wenn die T^*-Position in der Synthese erreicht wird und es werden die modifizierten Kopplungs- und Oxidationsbedingungen wie sie nachfolgend beschrieben sind, verwendet.
Wenn das Monomer ein 3'-Methylenphosphinat der Formel II ist, wird der Träger anschließend mit einer Lösung von Verbindung N (60 mM) in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) in Gegenwart von Pivaloylchlorid (121 mM) in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) für 30 Minuten pro Behandlung behandelt, das ist 2 × 30 Minuten. Weitere Waschschritte werden durchgeführt und der Zyklus wird mit der Entfernung der 5'-Schutzgruppe und der Kopplung eines frischen Monomers, also entweder Verbindung N oder eines 3'-N-Phosphonats durchgeführt, an der freien 5'-Hydroxylgruppe der wachsenden Oligonukleotidkette.
Diese Schritte werden wiederholt, bis der 15-mer Vorläufer für das Oligonukleotidanaloga 1 in voller Länge hergestellt wurde.
Die Schritte des synthetischen Zyklus können wie nachstehend angegeben zusammengefasst werden:
7. Die Schritte 1–6 werden mit den geeigneten Monomeren wiederholt bis der Oligonukleotidvorläufer des Oligonukleotidanalogon 1 vollständig ist. Nachdem der Endzyklus der Monomerzugabe durchgeführt wurde, wird das auf dem Träger befestigte Oligomer mit Jod (0,2 M) in Pyridin-Wasser (8 : 2 ^v/_v) über 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt, optional gefolgt von Weiterbehandlung mit Jod (0,2 M), Pyridin-Triethylamin-Wasser (6 : 1 : 1 ^v/_v) über 1 Stunde bei Raumtemperatur. Diese Behandlung oxidiert die Internukleosidverknüpfungen. Der Träger wird anschließend mit Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v) gewaschen um Jodspuren zu entfernen, gefolgt von einer Behandlung mit Diethylether. Der Träger wird anschließend luftgetrocknet und in ein Plastikröhrchen überführt zur Behandlung mit wässriger Ammoniaklösung (30%) über Nacht bei 55°C. Dies entfernt das Oligonukleotidanalogon vom Träger und spal tet die Basenschutzgruppen während es die 5'-O-Dimethoxytritylgruppe intakt belässt. Nach dieser Behandlung wird die Oligonukleotidanalogalösung einer 5'-O-Dimethoxytritylentfernung unterzogen auf einer Oligonukleotidreinigungskartusche entsprechend Standardverfahren (Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, Applied Biosystems, 1992). Das Oligonukleotidanalogon wird anschließend über Polyacrylamidgelelektrophorese entsprechend Standardverfahren gereinigt. MALDI-TOF Massenspektroskopieanalyse des Oligonukleotidanalogon 1:

Berechnete Masse: 4424,3 Da

Gefunden: 4423,8 Da
Beispiel 2: Oligonukleotidanalogon 2
^5'TTT TT^*C TCT CTC TCT^3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Schwefel ist und R¹ Hydroxy. Alle weiteren Internukleosidverknüpfung sind Phosphorthioate. Die Festphasensynthese des vorstehenden Oligonukleotids wird durchgeführt unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 wie vorstehend angegeben bis zum Endzyklus der Monomerzugabe. Die Behandlung des Oligomers mit Jod, wie es in Beispiel 1 verwendet wird, wird durch eine Sulfurisationsreaktion ersetzt. Daher wird nach dem Entkopplungsschritt der auf dem Träger fixierte Vorläufer zu Oligonukleotidanalogon 2 mit einer Lösung von Schwefel (5% ^w/_v) in Kohlenstoffdisulfid-Pyridin-Triethylamin (10 : 10 : 1 ^v/_v; 2 ml) für 1 – 18 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, gefolgt von dem Verfahren von A. Audrus und G. Zon, Nucleic Acids Research Symposium Series No. 20, 1988, 121. Nach Vervollständigung der Inkubationszeit wird der Träger mit Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v) und mit Diethylether gewaschen und anschließend luftgetrocknet. Das Oligonukleotidanalogon wird vom Träger entfernt und die Schutzgruppen werden wie in Beispiel 1 beschrieben entfernt. MALDI-TOF (negativer Modus) Massenspektroskopieanalyse von Oligonukleotidanalogon 2:

Berechnete Masse: 4649,3 Da

Gefunden: 4642,8 Da
Beispiel 3: Oligonukleotidanaloqon 3
^5'TTT T^*T^MEC TCT CTC TCT^3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weitere Internukleosidverknüpfungen sind Phosphodiester. T^Me ist ein Thymidinrest, der eine α-Methoxygruppe an der 2'-Stellung aufweist anstelle eines Wasserstoffatoms. Festphasensynthese des vorstehenden Oligonukleotids wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, soweit wie Nukleosidrest 11. Hier wird der trägerfixierte Precursor zu Oligonukleotidanalogon 3 mit einer Lösung von 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-methylthymidin H-Phosphonat (30 mM) in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) in Gegenwart von Pivaloylchlorid (182 mM) ebenfalls in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) für 1 Minute behandelt. Der Rest der Synthese wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. MALDI-TOF (negativer Modus) Massenspektroskopieanalyse von Oligonukleotidanalogon 3:

Berechnete Masse: 4454,4 Da

Gefunden: 4448,6 Da
Beispiel 4: Oligonukleotidanalogon 4
⁵TTT T^*T^MEC TCT CTC TCT^3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Schwefel ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Internukleosidverknüpfungen sind Phosphorthioate. T^Me ist ein Thymidinrest, der eine α-Methoxygruppe an der 2'-Stellung aufweist anstelle eines Wasserstoffatoms. Die Festphasensynthese wird wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt und die Sulfurisierung und nachfolgende Aufarbeitung und das Deblockieren werden wie in Beispiel 2 oben beschrieben durchgeführt. MALDI-TOF (negativer Modus) Massenspektroskopieanalyse von Oligonukleotidanalogon 4:

Berechnete Masse: 4679,3 Da

Gefunden: 4664,1 Da
Beispiel 5: Oligonukleotidanalogon 5
5'TTT^* TT3 'wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Internukleosidverknüpfungen sind Phosphodiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt, außer dass Verbindung N und Verbindung Tp als einzige Nukleosidmonomere verwendet werden. MALDI-TOF Massenspektroskopieanalyse:

Berechnete Masse: 1457,1 Da

Gefunden: 1457,7 Da
Beispiel 6: Oligonukleotidanalogon 6
5'TTT TT^*C TCT CTC TCT3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Internukleosidverknüpfungen sind Phosphordiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 7: Oligonukleotidanalogon 7
5'T^*T^*T^*T^*T^*C TCT CTC TCT3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphodiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt, aber unter Einführen von fünf Nukleosidresten aus Verbindung H.
Beispiel 8: Oligonukleotidanalogon 8
5'CGA CTA TGC ATTTTC3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Internukleosidverknüpfungen sind Phosphordiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt, aber unter Einführen von zwei Nukleosidresten aus Verbindung H. Wenn die Sequenz die Verwendung eines A oder G Nukleosids erfordert, wird der Kopplungsschritt des Verfahrens aus Beispiel 1 wie folgt modifiziert:

i) 30 mM Ap oder 30 mM Gp in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl von Ap oder Gp) wird mit Pivaloylchlorid (182 mM) in Pyridin-Acetonitril (1 : 1 ^v/_v; 200 μl) behandelt und für 1 Minute zur Reaktion gebracht.

MALDI-TOF Massenspektroskopieanalyse von Oligonukleotidanalogon 8:

Berechnete Masse: 4514,1 Da

Gefunden: 4517,3 Da
Beispiel 9: Oligonukleotidanalogon 9
5'GCG T^*T^*T T^*T^*T^* T^*T^*T^* T^*GC G3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphordiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens der Beispiele 1 und 8 hergestellt, aber unter Einführen von zehn Nukleosidresten aus Verbindung H.
Beispiel 10: Oligonukleotidanalogon 10
5'TTT TT C TCT CTC TCT3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphodiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt, außer dass, wenn C⁺-Rest eingeführt wird, die Monomerverbindung J als direkten Ersatz für die Verbindung H verwendet wird.
Beispiel 11: Oligonukleotidanalogon 11
5'TTT TTT TTT TTT TTT T^*T^*T^*T3' wobei eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Sauerstoff ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphordiesterverknüpfungen.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 1 hergestellt, aber unter Einführen von drei Nukleosidresten aus Verbindung H.
Beispiel 12: Oligonukleotidanalogon 12
5'T^*T^*C T^*C^*G CCC GCT CC^*T^* C^*C^*T^* C^*C3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Schwefel ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphorthioate.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 2 hergestellt. G-Reste werden wie in Beispiel 8 beschrieben eingeführt und C^*-Reste werden wie in Beispiel 10 beschrieben eingeführt.
Beispiel 13: Oligonukleotidanalogon 13
5'T^*T^*C^* T^*C^*G CTG GTG AGT^* T^*T^*C^* A3' wobei ^* eine Internukleosidverknüpfung der Formel I ist, wobei X Schwefel ist und R¹ Hydroxy ist. Alle weiteren Verknüpfungen sind Phosphorthioate.
Dieses Oligonukleotid wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 12 hergestellt. A-Reste werden wie in Beispiel 8 beschrieben eingeführt.
Beispiel 14
Das Oligonukleotidanalogon 1, das die Sequenz 5' TTT tTC TCT CTC TCT 3' enthält, wobei t eine Nukleosideinheit darstellt, die von Verbindung M abgeleitet ist, wird über Festphasenphosphoramiditoligonukleotidsynthese hergestellt, wie sie in "Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach", Herausgeber F. Eckstein, IRL Press 1991 beschrieben wurde, außer dass Verbindung M anstelle des üblichen 3'-Phosphoramidit substituierten Nukleosid an geeigneter Stelle während der Synthese verwendet wird, so dass ein Oligonukleotidprecursor gebildet wird, der eine Internukleosidverknüpfung der Formel XIV aufweist, wobei R¹ _a -OCH₂CH₂CN ist und anschließend zu einem Oligonukleotid oxidiert wird, das eine Internukleosidverknüpfung der Formel XV aufweist, wobei R¹ _a -OCH₂CH₂CN ist und X Sauerstoff ist im Stan dardoxidationsschritt, wobei dieses Oligonukleotid weiter gekoppelt wird, um das Oligonukleotidanalogon 1 zu ergeben.

Claims

Oligonukleotidanalogon mit 10 bis 200 natürlichen und/oder synthetischen Nukleosideinheiten, verknüpft durch Internukleosidverknüpfungen, wobei mindestens eine der Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweist,
wobei die angegebene Methylengruppe mit einem 3'-Kohlenstoffatom eines Nukleosids verbunden ist, das angegebene Sauerstoffatom mit einem 5'-Kohlenstoffatom eines benachbarten Nukleosids verbunden ist, R¹Wasserstoff oder eine Gruppe der Formeln R¹ _a, -NHR¹ _b oder -NR¹ _bR_c ist, wobei R¹ _a eine C₁- bis C₁₀-Alkyl-, C₂- bis C₁₀-Alkenyl-, C₃- bis C₈-Cycloalkyl-, C₆- bis C₁₀-Aryl- oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe ist und R¹ _b und R¹ _c unabhängig voneinander eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl-, C₂- bis C₁₀-Alkenyl-, C₃- bis C₈-Cycloalkyl-, C₆- bis C₁₀-Aryl- oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe sind und X Sauerstoff oder Schwefel ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 1, welches 15 bis 40 Nukleosideinheiten aufweist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 1 oder 2, welches 15 bis 25 Nukleosideinheiten aufweist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 1, 2 oder 3, in welchem alle Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweisen.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 1, 2 oder 3, in welchem bis zu 75 der Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweisen.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 5, in welchem bis zu 50% der Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweisen.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 6, in welchem bis zu 25% der Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweisen.
Oligonukleotidanalogon nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem mindestens zwei aufeinanderfolgende Internukleosidverknüpfungen die Formel (I) aufweisen.
Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 7, in welchem sich die Internukleosidverknüpfungen der Formel (I) mit anderen Internukleosidverknüpfungen abwechseln.
Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 9, in welchem die verbleibenden Internukleosidverknüpfungen Phosphordiester-, Phosphorthioat- oder Phosphordithoatverknüpfungen oder eine Mischung aus zweien oder mehreren davon sind.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 10, in welchem die verbleibenden Internukleosidverknüpfungen Phosphorthioatverknüpfungen sind.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 10 oder 11, welches einen Bereich mit Phosphordiester- und/oder Phosphorthioat- und/oder Phosphordithioat-Internukleosidverknüpfungen zwischen zwei Bereichen mit Internukleosidverknüpfungen der Formel (I) oder einer Mischung davon mit Phosphorthioat- oder Phosphordiesterverknüpfungen aufweist.
Oligonukleotidanalogon nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem mindestens ein Nukleosid an dessen 2'-Position modifiziert ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 13, in welchem mindestens ein Nukleosid ein Halogenatom oder eine Gruppe der Formel -OR² an der 2'-Position aufweist, wobei R² eine aliphatische C₁- bis C₁₀-Gruppe ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 14, in welchem mindestens ein Nukleosid eine Gruppe der Formel -OR² an der 2'-Position aufweist, wobei R² eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 14, in welchem R² eine C₁- bis C₄-Alkyl-, C₁- bis C₄-Alkoxy-substituierte C₁- bis C₄-Alkylgruppe oder eine Gruppe der Formel -(CH₂CH₂O)R³ ist, wobei R³ eine Methyl- oder Ethylgruppe und n 2 bis 4 ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 16, in welchem R² eine Methyl-, Ethyl-, Methoxyethyl-, Ethoxyethylgruppe oder eine Gruppe der Formel -(CH₂CH₂O)₃CH₃ ist.
Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 13 bis 17, in welchem mindestens zwei aufeinanderfolgende Nukleoside an der 2'-Position modifiziert sind und durch Phosphordiester-Internukleosidverknüpfungen verknüpft sind und/oder eine Bindung der Formel (I) zwischen einem an der 2'-Position unmodifizierten Nukleosid und einem 5'-Kohlenstoffatom eines an der 2'-Position modifizierten Nukleosides vorliegt.
Oligonukleotidanalogon nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem R¹ _a, R¹ _b oder R¹ als Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe unsubstituiert oder mit Hydroxy-, C₁- bis C₄-Alkoxy, Halogen-, Cyano-, tri(C₁-C₁₅-Hydrocarbyl)silyl- oder primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen substituiert vorliegen.
Oligonukleotidanalogon nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem R¹ Wasserstoff, eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₄-Alkyl- oder eine Phenylgruppe ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 20, in welchem R¹ Wasserstoff ist.
Oligonukleotidanalogon nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches komplementär zu einem Bereich der mRNA der humanen c-raf Kinase ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 22, in welchem die Nukleosidsequenz 5'-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT-3' ist.
Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 21, welches komplementär zu einem Bereich der mRNA für humane PKC-α ist.
Oligonukleotidanalogon nach Anspruch 24, in welchem die Nukleosidsequenz 5'-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3' ist.
Verfahren zum Herstellen eines Oligonukleotidanalogons mit mindestens einer Internukleosidverknüpfung der Formel (I),
wobei R¹ und X wie in Anspruch 1 definiert sind, welches (i) das Durchführen einer Kopplungsreaktion oder aufeinanderfolgenden Kopplungsreaktionen zwischen (A) einem natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Oligonukleotid mit einer 5'-Hydroxylgruppe und (B) einem natürlichen oder synthetischen Nukleosid oder Dinukleotid, welches an seiner 3'-Position eine Gruppe aufweist, die reaktiv mit der 5'- Hydroxylgruppe ist, bis ein Oligonukleotid mit der gewünschten Zahl der Nukleoside erhalten wird, wobei in mindestens einer der Kopplungsreaktionen (B) ein Nukleosid der Formel (II) ist,
wobei B¹ ein Nukleosidbasenrest, R⁴ eine Hydroxyschutzgruppe, R⁵ Wasserstoff, Hydroxy oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist, M⁺ ein Metall oder unsubstituiertes oder substituiertes Ammoniumion oder ein Kation einer heterozyklischen Base ist und X Sauerstoff oder Schwefel ist, und mit (A) in der Anwesenheit eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids oder -anhydrids umgesetzt wird, um ein Oligonukleotidanalogon mit einer Phosphinat-Internukleosidverknüpfung der Formel (IA) zu bilden,
wobei X Sauerstoff oder Schwefel ist, und (ii) (a) das Umsetzen der Phosphinatverknüpfung mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY, wobei R¹ _a wie in Anspruch 1 definiert ist und Y ein Abgangsatom oder -gruppe ist, oder (b) das Oxidieren und Umsetzen der Phosphinatverknüpfung mit einem Amin der Formel R¹ _bNH₂ oder R¹ _bR¹ _cNH, wobei R¹ _b und R¹ _c wie in Anspruch 1 definiert sind, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 26, in welchem das Oligonukleotidanalogon weiter umgesetzt wird, um die Schutzgruppe R⁴ durch Wasserstoff oder, wo R⁴ an einem terminalen Nukleosid in dem Oligonukleotidanalogon vorliegt, durch eine 5'-modifizierende Gruppe zu ersetzen.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, welches das Durchführen der wie in Anspruch 26 spezifizierten Schritte (i) und (ii) mit dem Nukleosid oder Oligonukleotid (A), das an einen festen Träger gebunden ist, dann (iii) das Ablösen des Oligonukleotids von dem festen Träger und Entfernen der Schutzgruppen, um ein Oligonukleotid mit einer terminalen freien 5'-Hydroxylgruppe zu ergeben, und (iv) gegebenenfalls das Umsetzen der freien 5'-Hydroxylgruppe, um an der terminalen 5'-Position eine modifizierende Gruppe einzuführen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 26, 27 oder 28, in welchem in der Formel (II) B¹ eine Pyrimidinbase ist, R⁴ eine Methoxytrityl-, Dimethoxytrityl- oder tris-tert-Butyltritylgruppe ist, R⁵ Wasserstoff ist und M⁺ eine unsubstituierte Ammonium-, mono-, di- oder tri-C₁ bis C₁₀-Alkyl- oder Hydroxyalkyl-Ammoniumiongruppe oder ein Kation einer heterozyklischen Base ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, in welchem das Nukleosid der Formel (II) ein Stereoisomer der Formel (IIA) ist,
wobei B¹, R⁴, R⁵, X und M⁺ wie in Anspruch 26 definiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, in welchem die Kopplungsreaktion des Nukleosides der Formel (II) mit (A) in Gegenwart eines sterisch gehinderten organischen Säurehalogenids in Gegenwart einer heterozyklischen Base mit einem tertiären Stickstoffatom in dem Ring oder eines Oxids davon durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, in welchem die Reaktion (ii) (a) der Phosphinat-Internukleosidverknüpfung der Formel (IA) mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY, wobei R¹ _a eine Alkyl,- Cycloalkyl- oder Aralkylgruppe wie in Anspruch 1 definiert ist, und Y ein Halogen ist, in Gegenwart einer starken Base durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, in welchem die Reaktion (ii) (a) der Phosphinat-Internukleosidverknüpfung der Formel (IA) mit einer Verbindung der Formel R¹ _aY, wobei R¹ _aY eine Alkenyl- oder Arylhalogenidoder Triflatgruppe ist, in Gegenwart eines Palladiumkatalysators durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, in welchem die Oxidationsreaktion (ii)(b) der Phosphinat-Internukleosidverknüpfung der Formel (IA) mit einem Amin der Formel R¹ _bNH₂ oder R¹ _bR¹ _cNH, wobei R¹ _b und R_c wie in Anspruch 1 definiert sind, und einem Tetrachlorkohlenstoff oder Bromtrichlormethan oder Jod bewirkt wird, um ein erfindungsgemäßes Oligonukleotidanalogon zu ergeben, in welchem R¹ -NHR¹ _b bzw. -NR¹ _bR¹ _c ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, in welchem, wenn ein Oligonukleotidanalogon mit der gewünschten Zahl der Nukleoside auf einem festen Träger synthetisiert worden ist, es von dem festen Träger durch Behandlung mit konzentriertem wässrigen Ammoniak vor oder nach der Behandlung zur Entfernung der Hydroxyschutzgruppen abgelöst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, in welchem die Hydroxyschutzgruppen durch Behandlung mit einer wässrigen organischen Säure entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 36, in welchem die Nukleoside der Formel (II) durch ein Nukleotid der Formel (VIII) ersetzt werden,
wobei B¹, R¹, R⁴ und R⁵ wie in Anspruch 26 definiert sind, B² ein Nukleosidbasenrest, R⁶ Wasserstoff, eine Hydroxy- oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist, und R⁷ eine Gruppe ist, welche reaktiv oder aktivierbar, um reaktiv zu sein mit einer 5'-Hydroxylgruppe in einem Nukleosid ist.
Verfahren nach Anspruch 37, in welchem R⁷O in der Formel (VIII) eine H-Phosphonatgruppe, eine Phosphoramiditgruppe oder eine Phosphordiestergruppe ist.
Dinukleotid der Formel (XI),
wobei B¹ ein Nukleosidbasenrest ist, B² ein Nukleosidbasenrest ist, R¹ Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel R¹ _a, -NHR¹ _b oder -NR¹ _bR¹ _c ist, wobei R¹ _a eine C₁- bis C₁₀-Alkyl-, C₂- bis C₁₀-Alkenyl-, C₃- bis C₈-Cycloalkyl-, C₆- bis C₁₀-Aryl- oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe ist, und R¹ _b und R¹ _c unabhängig voneinander eine unsubstituierte oder substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl-, C₂- bis C₁₀-Alkenyl-, C₃- bis C₈-Cycloalkyl-, C₆- bis C₁₀-Aryl- oder C₇- bis C₁₃-Aralkylgruppe sind, R⁴ eine Hydroxyschutzgruppe ist, R⁵ ein Wasserstoff, eine Hydroxygruppe oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist, R⁶ Wasserstoff, eine Hydroxygruppe oder ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist und R⁹ eine Gruppe ist, welche reaktiv oder aktivierbar, um reaktiv zu sein mit einer 5'-Hydroxylgruppe in einem Nukleosid oder einer Hydroxyschutzgruppe ist, mit der Maßgabe, daß, wo R¹ anders als Wasserstoff ist, mindestens eines von R⁵ und R⁶ ein 2'-modifizierendes Atom oder Gruppe ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als wirksamen Bestandteil ein Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 25 oder ein Dinukleotid nach Anspruch 39.
Oligonukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 25 oder ein Dinukleotid nach Anspruch 39 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Oligonukleotidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 25 oder eines Dinukleotids nach Anspruch 39 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Virus oder einer Erkrankung, die durch eine Protein moduliert wird.