DE69636343T2

DE69636343T2 - Verwendung von glu-trp dipeptiden zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von verschiedenen gefässneubildung-assozierten erkrankungen

Info

Publication number: DE69636343T2
Application number: DE69636343T
Authority: DE
Inventors: R. Lawrence Tacoma GREEN; W. John Woodinville BLASECKI
Original assignee: CYTRAN Ltd
Current assignee: CYTRAN Ltd
Priority date: 1995-10-03
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2016-10-03
Also published as: CA2233457C; IL123889A0; DE69636343D1; DK0869808T3; KR19990063958A; AU714846B2; CN1198673A; JPH11504943A; PL326149A1; CZ298345B6; EA001146B1; NO326298B1; ES2268710T3; EP0869808A1; SK42398A3; US5902790A; US20060094665A1; HUP9902105A2; AU7254096A; JP3679129B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Verwendung von Peptiden mit angiostatischen Eigenschaften und insbesondere auf die Verwendung von tryptophanhaltigen Dipeptiden mit angiostatischen Eigenschaften.
Neovaskularisierung, die Entstehung neuer Blutgefäße, wird früh in der Embryogenese und auch während der Wundheilung, Geweberemodellierung und wahrscheinlich im normalen Verlauf der Aufrechterhaltung des Gefäßsystems ausgelöst. Zu den Vorgängen, die an der Neovaskularisierung beteiligt sind, gehören wenigstens die Aktivierung von Endothelzellen und Pericyten; der Abbau der Basallamina; die Wanderung und Proliferation von Endothelzellen und Pericyten; die Bildung eines neuen Kapillargefäßlumens; das Auftreten von Pericyten um die neuen Gefäße herum; die Entwicklung einer neuen Basallamina; die Bildung von Kapillarschleifen; die Persistenz der Involution mit Differenzierung der neuen Gefäße; die Bildung eines Kapillarnetzwerks; und schließlich Organisation des Netzwerks zu größeren Mikrogefäßen.
Von bestimmten Cytokinen ist bekannt, dass sie die Neovaskularisierung herunterregulieren; dazu gehören Interleukin-12 (IL-12), transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Interferon-α (IFN-α) und Thrombocytenfaktor 4 (PF-4). Die Cytokintherapie hat sich jedoch in der klinischen Erfahrung aufgrund der Toxizität von bestimmten dieser Verbindungen als problematisch erwiesen.
Es gibt mehrere pathologische Zustände, bei denen die Angiogenese entweder eine Rolle spielt oder direkt an verschiedenen Folgeerscheinungen der Krankheit beteiligt ist. Dazu gehören zum Beispiel die Neovaskularisierung von Tumoren bei Krebs, die Entstehung von Hämangiomen, die Neovaskularisierung im Zusammenhang mit verschiedenen Leberkrankheiten, die angiogene Dysfunktion im Zusammenhang mit einem Hormonüberschuss, neovaskuläre Folgen von Diabetes, neovaskuläre Folgen von Bluthochdruck, die Neovaskularisierung nach der Genesung bei Schlaganfall, die Neovaskularisierung aufgrund von Kopftrauma, die Neovaskularisierung bei chronischer Leberinfektion, die Restenose nach Angioplastie und die Neovaskularisierung aufgrund von Wärme- oder Kältetrauma.
Während die Angiogenese zur Aufrechterhaltung eines gesunden Gefäßsystems unzweifelhaft erforderlich ist, würde die klinische Medizin die Verfügbarkeit einer nichttoxischen Behandlung begrüßen, um die Neovaskularisierung zeitweise herunterzuregulieren, d.h, einschließlich einer zeitweiligen Angiostase.
Es ist bekannt, dass L-Glu-L-Trp die Produktion von Immunzellen stimuliert und ihr Zahlenverhältnis bei Immunschwächezuständen normalisiert (siehe z.B. WO 89/06134, WO 92/17191 und WO 93/08815). Es hat sich hier jedoch gezeigt, dass das Dipeptid unabhängig von seiner Wirkung bei Immunschwächezuständen auch eine angiostatische Aktivität hat. Die Ergebnisse von in-vitro-Studien zeigten, dass geringe Konzentrationen von L-Glu-L-Trp-Dipeptid die Neovaskularisierung von Hühner-Chorioallantoismembranen während der Embryogenese hemmen. In Tierstudien hemmte L-Glu-L-Trp die Neovaskularisierung von Lewis-Lungentumoren, wenn es C57BL/6-Mäusen intradermal infiziert wurde, und hemmte das Wachstum von Sarkom 180 bei Swiss-Webster-Mäusen.
In einem Aspekt gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der antiangiogenes Glu-Trp-Dipeptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines pathologischen Zustands, der Neovaskularisierung beinhaltet, an.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirkstoff Aminosäureanaloga des antiangiogenen Glu-Trp-Dipeptids.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirkstoff R'-Glu-Trp-R'' einschließlich Aminosäureanaloga davon, wobei R' und/oder R'' unabhän gig aus pharmazeutisch annehmbaren Salzen des Dipeptids, Amiden, Imiden, Estern, Anhydriden, Ethern, Methyl- oder Ethylalkylestern, Alkyl-, Aryl- oder gemischten Alkyl/Aryl-Derivaten ausgewählt sind, wobei das Formelgewicht kleiner als etwa 5000 Dalton ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirkstoff eine cyclische Form des Dipeptids, lineare oder cyclische Polymere des Dipeptids mit nicht mehr als 20 Aminosäuren oder Peptide mit nicht mehr als 20 Aminosäuren, die wenigstens ein Dipeptid innerhalb ihrer Aminosäuresequenz enthalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren Glu und Trp des Wirkstoffs unabhängig L-Glu und/oder L-Trp.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirkstoff nicht mehr als 10 Aminosäuren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem TrpAnalogon um ein Pyrrolanalogon, bei dem der Stickstoff im Pyrrolring durch Kohlenstoff ersetzt ist, 5-Hydroxytryptamin oder 5-Hydroxyindolessigsäure.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Wirkstoff aus HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEW oder pEW ausgewählt.
Bei den pathologischen Zuständen, die eine Neovaskularisierung beinhalten, handelt es sich um Hämangiom, vaskularisierten malignen Tumor, vaskularisierten gutartigen Tumor, einen Tumor der Hirnhäute, einen intrazerebralen Tumor, ein Sarkom, z.B. Lewis-Sarkom, ein Osteosarkom, einen Weichgewebetumor, z.B. einen Tumor der Speiseröhre oder Luftröhre, die Neovaskularisierung nach der Genesung bei Schlaganfall, die Neovaskularisierung aufgrund von Kopftrauma, die Restenose nach Angioplastie, die Neovaskularisierung, die mit der substanzinduzierten Neovaskularisierung der Leber zusammenhängt, die angiogene Dysfunktion im Zusammenhang mit einem Hormonüberschuss, neovaskuläre Folgen von Diabetes oder neovaskuläre Folgen von Bluthochdruck.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament für die Verabreichung einer Dosis von etwa 0,5 μg pro kg Körpergewicht bis etwa 1 mg pro kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 1 μg/kg bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht an den Patienten bestimmt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament für die tägliche Verabreichung der Dosis über einen Zeitraum von 1 Tag bis etwa 30 Tagen bestimmt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament für die intramuskuläre oder intranasale Verabreichung bestimmt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament für die Verabreichung in Form einer injizierbaren Lösung bestimmt, die 0,001% bis 0,01% des Wirkstoffs, vorzugsweise L-Glu-L-Trp, enthält.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medikament eine Darreichungsform, die eine Tablette, ein Suppositorium, eine Kapsel, einen Augenfilm, ein Inhalationsmittel, ein Schleimhautspray, Nasentropfen, Augentropfen, eine Zahnpasta, eine Salbe oder eine Creme auf wasserlöslicher Basis umfasst, wobei die Darreichungsform gegebenenfalls im Wesentlichen aus 0,01 mg des Wirkstoffs besteht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medikament weiterhin einen vasoaktiven Wirkstoff, z.B. einen Inhibitor des angiotensinkonvertierenden Enzyms (ACE) oder einen Kaliumkanalöffner (PCO).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform leidet der Patient entweder unter einem Tumor, und das Medikament umfasst weiterhin ein Chemotherapeutikum, oder der Patient ist nicht immungeschwächt.
Die vorliegende Erfindung erlaubt daher die Behandlung eines Patienten mit einem pathologischen Zustand, der die Neovaskularisierung beinhaltet, durch Verabreichung eines pharmazeutischen Präparats, das ein R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, an den Patienten in einer Menge, die eine Hemmung der Neovaskularisierung bewirkt.
Besondere pathologische Zustände, die eine Neovaskularisierung beinhalten und im Umfang der Erfindung liegen, bestehen aus Hämangiomen, vaskularisierten malignen und gutartigen Tumoren einschließlich Tumoren der Hirnhäute, intrazerebralen Tumoren, Sarkomen, Osteosarkomen, Weichgewebetumoren, wie solche der Speiseröhre und Luftröhre, substanzinduzierter Neovaskularisierung der Leber einschließlich einer solchen, die als Nebenwirkung der Einnahme von Medikamenten, Alkohol oder Drogen induziert wird, die angiogene Dysfunktion im Zusammenhang mit einem Hormonüberschuss, z.B. von Estrogen, neovaskuläre Folgen von Diabetes, wie zentrale seröse Chorioretinopathie, neovaskuläre Folgen von Bluthochdruck, die Neovaskularisierung nach der Genesung bei Schlaganfall, die Neovaskularisierung aufgrund von Kopftrauma, chronischer Leberinfektion (z.B. chronischer Hepatitis), die Restenose nach Angioplastie, die Neovaskularisierung aufgrund von Wärme- oder Kältetrauma, wie Verbrennungen oder Erfrierungen. Das Dipeptid zeigt diese Aktivität sowohl bei Patienten mit gesunden Immunsystemen, d.h. solchen, die nicht immungeschwächt sind, als auch bei Patienten, die immungeschwächt sind.
Diese und andere Aspekte der Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung hervor.
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Glu-Trp-Präparate bereit, die ein R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Der hier verwendete Ausdruck R'-Glu-Trp-R'' bezieht sich auf das Dipeptid L-Glu-L-Trp und Derivate oder Analoga davon.
Der hier verwendete Ausdruck "Derivat des R'-Glu-Trp-R''-Dipeptids" umfasst solche, bei denen das Dipeptid durch die kovalente Anbindung einer Strukturein heit an R' und/oder R'' derivatisiert ist. Dazu gehören zum Beispiel pharmazeutisch annehmbare Salze des Dipeptids, Amide, Imide, Ester, Anhydride, Ether, Methyl- oder Ethylalkylester, Alkyl-, Aryl- oder gemischte Alkyl/Aryl-Derivate, wobei das Formelgewicht kleiner als etwa 5000 Dalton oder kleiner als 1000 Dalton ist, multimere oder cyclische Versionen des Dipeptids und Peptide mit weniger als etwa 20 Aminosäuren oder weniger als etwa 10 Aminosäuren, die glu-trp in ihrer Aminosäuresequenz enthalten. Repräsentative Beispiele sind HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEW oder pEW.
Der hier verwendete Ausdruck "Analoga des R'-Glu-Trp-R''-Dipeptids" umfasst solche, bei denen L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ersetzt sind, wie L-Glu-D-Trp, D-Glu-L-Trp oder D-Glu-D-Trp, und Analoga von Tryptophan, wie 5-Hydroxytryptamin, 5-Hydroxyindolessigsäure und Pyrrolanaloga, bei denen der Stickstoff im Pyrrolring durch Kohlenstoff ersetzt ist.
L-Glu-L-Trp ist zur Zeit das am meisten bevorzugte R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid. L-Glu-L-Trp wird hier auch mit derselben Bedeutung als "EW" und "EW-Dipeptid" bezeichnet, wobei die Ein-Buchstaben-Konvention verwendet wird, bei der die zuerst genannte Aminosäure der Aminoterminus ist und die zuletzt genannte Aminosäure der Carboxyterminus ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Neovaskularisierung" bezieht sich auf die Erzeugung von neuen Blutgefäßen. Der Vorgang, durch den neue Blutgefäße gebildet werden, kann die Vorgänge Aktivierung von Endothelzellen und Pericyten, Abbau der Basallamina, Wanderung und Proliferation (d.h. Zellteilung) von Endothelzellen und Pericyten, Bildung eines neuen Kapillargefäßlumens, Auftreten von Pericyten um die neuen Gefäße herum, Entwicklung einer neuen Basallamina, Bildung von Kapillarschleifen, Persistenz der Involution und Differenzierung der neuen Gefäße sowie Bildung eines Kapillarnetzwerks und schließlich Organisation zu größeren Mikrogefäßen beinhalten. Wie der Ausdruck hier verwendet wird, wird der Vorgang der Proliferation von Endothelzellen, z.B. in einer Gefäßknospe, "Angiogenese" genannt und bezieht sich auf die Neovaskula risierung als Teilvorgang. Repräsentative klinische diagnostische Manifestierungen von Krankheiten wurden klassifiziert und in ein System gebracht (siehe z.B. International Classification of Diseases, ICD-9-CM, Washington DC, 1989). Zu den repräsentativen Laborkriterien einer Neovaskularisierung gehören (unter anderem) Daten, die z.B. in Angiogrammen gesammelt werden, CAT-Scans und Sonogramme sowie die visuelle Untersuchung durch endoskopische und/oder kapillaroskopische Verfahren.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Angiostase", "angiostatisch" und "Hemmung der Neovaskularisierung" bedeuten, dass die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Neovaskularisierung in einem Gewebe von einem Wert vor der Behandlung auf einen Wert nach der Behandlung abgenommen hat. Die Angiostase kann mit Hilfe der obigen Labor- oder klinischen Kriterien der Krankheitsaktivität bestimmt werden. Die Angiostase kann die Hemmung von einem oder mehreren Teilvorgängen beinhalten, die an der Neovaskularisierung beteiligt sind, z.B. Proliferation oder Wanderung von Endothelzellen oder Zellen der glatten Gefäßmuskulatur.
Der hier verwendete Ausdruck "pathologischer Zustand, der Neovaskularisierung beinhaltet", bezieht sich auf einen pathologischen Zustand, von dem die Neovaskularisierung oder deren Gefahr eine Komponente ist. Dazu gehören unter anderem Pathologien, bei denen die Neovaskularisierung die primäre Pathologie ist, wie Hämangiome, Pathologien, bei denen die Neovaskularisierung nicht die primäre Pathologie ist, aber dazu beiträgt, wie die Neovaskularisierung von Tumoren, und Pathologien, bei denen die Neovaskularisierung eine Folge der primären Krankheit ist, wie zentrale seröse Retinopathie bei Diabetes.
Der hier verwendete Ausdruck "Patient" bezieht sich auf einen Säuger einschließlich humaner und nichthumaner Primaten, Haustiere und Vieh, Pelztiere und dergleichen, z.B. Hunde, Katzen, Nager, Vögel, Pferde, Kühe, Schweine, Fische und dergleichen. Ausführungsformen der Erfindung umfassen therapeutische und prophylaktische Behandlungsverfahren zur Verwendung bei Patienten, die ihrer bedürfen.
Der hier verwendete Ausdruck "immungeschwächt" bezieht sich auf eine Person, die eine niedrigere als normale Zahl von einer oder mehreren Sorten Immunzellen, wie NK-Zellen, T4- oder T8-T-Lymphocyten, B-Lymphocyten oder Phagocyten, aufweist, gemessen anhand von klinischen diagnostischen Standardkriterien. Er umfasst auch Individuen mit einer reduzierten Funktion von Immunzellen, bestimmt durch Standardfunktionstests solcher Zellen, z.B. Produktion von Immunglobulinen, Chemotaxis, gemischte Leukocytenreaktion oder verzögerter Hypersensibilitätsassay. Immungeschwächte Individuen zeigen häufig ungewöhnliche oder unerwartete opportunistische Infektionen.
"Polypeptid" soll eine Reihenanordnung von Aminosäuren mit einer Länge von mehr als 16 bis zu vielen hundert Aminosäuren bedeuten, z.B. ein Protein.
Der hier verwendete Ausdruck "abnorm" bezieht sich auf Laborkriterien für Neovaskularisierung, die außerhalb des Bereichs von Werten liegen, die bei gesunden Individuen aufgezeichnet werden.
Der hier verwendete Ausdruck "normalisiert" bezieht sich auf Änderungen der Labor- oder klinischen Kriterien für Neovaskularisierung, die nach einer Behandlung in den normalen Bereichs von Werten zurückkehren, die bei normalen gesunden Probanden aufgezeichnet werden. Ein Proband ohne vaskulären Defekt und ohne bekannte Defizienz in irgendeinem Koagulations-, Fibrinolyse- oder Gefäßsystem wird hier mit derselben Bedeutung als "normaler Proband" bezeichnet.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Modulator" und "modulierend" bedeuten das Mittel und Verfahren zur Senkung der Neovaskularisierung oder Angiogenese bei einem normalen Probanden oder bei einem geschwächten Probanden.
"R'-Glu-Trp-R''-Behandlung" soll ein Verfahren zur Verabreichung eines pharmazeutischen Präparats von R'-Glu-Trp-R'' an einen Patienten, der seiner bedarf, mit dem Ziel, eine Abnahme des Ausmaßes der Neovaskularisierung oder Angiogenese zu induzieren, bedeuten.
In einer zur Zeit bevorzugten Ausführungsform soll ein pharmazeutisches R'-Glu-Trp-R''-Präparat einem Krebspatienten in einer Menge und während einer Zeit verabreicht werden, die ausreichen, um ein oder mehrere klinische oder Laborkriterien der Neovaskularisierung oder Angiogenese zu reduzieren und dadurch eine Verbesserung des klinischen Zustands des so behandelten Patienten zu bewirken. Dadurch wird die Neovaskularisierung in dem Tumor reduziert, was die Blutzufuhr zu dem Tumor hemmt und dadurch das Wachstum des Tumors hemmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform soll dem Patienten eine Dosis von etwa 0,5 μg pro kg Körpergewicht bis etwa 1 mg pro kg Körpergewicht täglich über einen Zeitraum von 1 Tag bis etwa 30 Tagen verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen soll die betreffende Dosis entweder als einzelne tägliche intramuskuläre Dosis des pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats (intramuskulär) oder als einzelne tägliche intranasale Dosis des pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats (intranasal) verabreicht werden. Die betreffende Dosis wird vorzugsweise als sterile injizierbare, inhalierbare Lösung, Nasentropfen oder Schleimhautspraylösung formuliert, die etwa 0,001% bis etwa 0,01% des pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats enthält. Alternativ dazu kann die Zubereitung des pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats vorzugsweise in eine Dosiseinheit-Darreichungsform eingearbeitet werden, z.B. eine Tablette, ein Suppositorium, eine Kapsel, einen Augenfilm oder in eine Paste oder Salbe, z.B. eine Zahnpasta, eine Hautsalbe oder wasserlösliche Cremegrundlage. Eine am meisten bevorzugte Darreichungsform ist für die Darreichung von etwa 0,01 mg des pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats bestimmt.
Die Erfindung findet eine Vielzahl von prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen bei der Behandlung von pathophysiologischen Bedingungen bei Menschen und Haustieren. In bestimmten Ausführungsformen findet die Erfindung Verwendung während der in-vitro-Aufrechterhaltung von Endothelzellkulturen und Gefäßgeweben, wie es vor einer autologen oder allogenen Implantation vorkommen kann. Die Verwendungen beinhalten die Aufrechterhaltung von Endothelzellkulturen oder Gefäßgewebekulturen in vitro durch Kultivieren der Gewebe in einem Kulturmedium, das eine R'-Glu-Trp-R''-Verbindung umfasst. Die Verwendungen gemäß der Erfindung haben den Vorteil, Gefäßgewebe aufrechtzuerhalten und entzündliche Veränderungen zu reduzieren, die durch das Gewebetrauma ausgelöst werden, das während der operativen Entfernung und Lagerung in Gewebekultur auftritt.
Bei einem repräsentativen prophylaktischen Behandlungsplan sollen die betreffenden Zusammensetzungen, die in der Erfindung verwendet werden, einem Patienten verabreicht werden, der einer Neovaskularisierung unterliegt oder bei dem eine sonstige Gefahr besteht, dass er Neovaskularisierung entwickelt, z.B. bei der postoperativen Verwendung zur Verhinderung der Neovaskularisierung eines rezidivierenden Tumors oder seiner Metastasezellen. Der hier verwendete Ausdruck "prophylaktisch wirksame Dosis" soll eine Menge bedeuten, die ausreicht, um an einer Gewebestelle eine angiostatische Wirkung zu erzeugen, wobei die Menge vom Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten abhängt, im Allgemeinen jedoch in die Bereiche fällt, die hier für die therapeutische Verwendung beschrieben sind. Eine prophylaktische Verabreichung kann bei Patienten besonders wünschenswert sein, bei denen die Gefahr von Krankheitsfolgen besteht, die Neovaskularisierung oder Angiogenese als Komplikation beinhalten, zum Beispiel diabetische Retinopathie
Ausführungsformen der Erfindung umfassen therapeutische Behandlungspläne, bei denen ein pharmazeutisches R'-Glu-Trp-R''-Präparat allein oder in Kombination mit einem zweiten Pharmakon, d.h. als "Kombinationstherapie", verabreicht werden soll. Zu den repräsentativen Kombinationstherapien gehören solche, bei denen eine R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzung zusammen mit einem oder mehreren Antibiotika, entzündungshemmenden Mitteln oder chemotherapeutischen Verbindungen verabreicht wird. Die betreffenden Zusammensetzungen können entweder in Verbindung mit den zweiten Behandlungsmodalitäten oder getrennt, z.B. zu verschiedenen Zeitpunkten oder in verschiedenen Spritzen oder Tabletten, verabreicht werden. Häufig soll R'-Glu-Trp-R'' in einer Kombinationstherapie mit entzündungshemmenden Mitteln, Antihistaminika, chemotherapeutischen Mitteln und dergleichen verabreicht werden. Zu den beispielhaften Kombinati onsbehandlungen mit R'-Glu-Trp-R'' gehören zum Beispiel entzündungshemmende Mittel, die in der Technik wohlbekannt sind.
Beispielhafte Kombinationsbehandlungen mit R'-Glu-Trp-R'' können auch die Verabreichung eines vasoaktiven Wirkstoffs als zweiten Wirkstoff umfassen. Zu den repräsentativen vasoaktiven Wirkstoffen gehören Wirkstoffe aus der Klasse der Inhibitoren des angiotensinkonvertierenden Enzyms (ACE), Kaliumkanalöffner (PCO) und dergleichen.
Beispielhafte kombinierte Krebsbehandlungen mit R'-Glu-Trp-R'' umfassen die Verabreichung eines Chemotherapeutikums als zweiter Wirkstoff. Behandlungen mit R'-Glu-Trp-R'' können eine Senkung von unerwünschten Nebenwirkungen bewirken, die mit einer Corticosteroid-Therapie verbunden sind, z.B. Neovaskularisierung. Repräsentative Chemotherapeutika sind in der Technik wohlbekannt.
Der erfahrene Arzt wird den Zeitplan und die Dosierung so einstellen, dass sie zu den klinischen Symptomen der Patienten passen. Dieses Wissen wurde über Dekaden angehäuft und wird in der medizinischen Literatur sowie in medizinischen Texten beschrieben. Der Zeitplan für den Beginn der betreffenden Verfahren in einer Kombinations- oder Einzelwirkstofftherapie beruht auf der klinischen Einschätzung des Arztes.
Eine empirische Therapie ist eine Therapie, die dafür bestimmt ist, die häufigste oder wahrscheinlichste Ursache auf der Grundlage von historischen, demographischen und epidemiologischen Informationen zu behandeln. Die empirische Therapie kann häufig die Verwendung von mehreren Therapeutika beinhalten, die einen weiten Bereich von therapeutischen Möglichkeiten abdecken sollen. Wenn Labortestdaten verfügbar sind, kann die Wahl der Therapie eingestellt werden, so dass die Krankheit spezieller behandelt wird. Deshalb wird die Behandlung von klinischen Syndromen sehr häufig empirisch eingeleitet. Stattdessen muss ein neues therapeutisches Verfahren für ein bestimmtes klinisches Syndrom getestet werden.
Auf dem Gebiet der Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe werden in präklinischen Studien einer Therapie die Wirkungen der Therapie auf nicht nur einen Zustand, sondern auf mehrere interessierende Mittel oder Zustände bewertet. Die Ergebnisse der verschiedenen (zuweilen mehrdeutigen) Studien werden hinsichtlich des Nutzens und der Risiken der bestimmten Therapie vor dem Hintergrund des medizinischen Wissens über die Risiken, die mit einer bestimmten Krankheit verbunden sind, abgewägt.
Häufig werden nicht alle Patienten mit einem Syndrom durch eine einzige Therapie geheilt, sondern stattdessen kann es eine Teilmenge von Patienten geben, bei denen die Therapie ein positives und günstiges Ergebnis hat. Beispiele für klinische Syndrome, bei denen Teilmengen von Patienten günstige Ergebnisse der betreffenden Therapien der Erfindung zeigen können, sind in den folgenden Absätzen offenbart.
Die in der Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für die parenterale, topische, subkutane, intramuskuläre, intrathekale, orale, intranasale, intraperitoneale oder lokale Verabreichung (z.B. auf die Haut in einer Creme) oder prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung bestimmt. Vorzugsweise sollen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung parenteral, intramuskulär oder intranasal verabreicht werden. Die betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen haben hier den Vorteil, dass sie die gewünschten Wirkungen bei sehr niedrigen Dosierungsmengen und ohne Toxizität ausüben. Der Zweck einer Therapie in einem akuten Fall kann also darin bestehen, die Konzentration an R'-Glu-Trp-R'' in einem Gewebe schnell zu erhöhen, zum Beispiel durch intravenöse Bolusinjektion oder Infusion. Alternativ dazu kann es in anderen Fällen wünschenswert sein, R'-Glu-Trp-R'' über einen längeren Zeitraum hinweg zu verabreichen.
Die betreffenden Zusammensetzungen, die R'-Glu-Trp-R'' enthalten, können in einer Weise zubereitet werden, die eine Resorption in den Blutstrom ermöglicht. Die vorliegenden Zusammensetzungen sind Gefäßmodulatoren, die Veränderungen auf dem zellulären Niveau induzieren, welche anschließend Veränderungen in zellulären Prozessen bewirken, die nicht mehr von der Anwesenheit der Zusammensetzung abhängen. Es wurde beobachtet, dass die Wirkungen des Peptids lange Zeit, d.h. Wochen bis Monate, anhalten können, obwohl das Peptid ziemlich schnell zerfällt, z.B. innerhalb von 5 Minuten. Obwohl die betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Verbindungen bei den niedrigen Konzentrationen, in denen sie gewöhnlich eingesetzt werden, selbst wasserlöslich sind, werden sie vorzugsweise in Form ihrer sauren und alkalischen Salze verwendet, die mit pharmazeutisch annehmbaren Mitteln gebildet werden, z.B. Essig-, Zitronen-, Malein-, Bernsteinsäure, Natrium, Kalium, Ammonium oder Zink. Frei lösliche Salze der betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen können auch in Salze mit geringer Löslichkeit in Körperflüssigkeiten umgewandelt werden, zum Beispiel durch Modifikation mit einem in Wasser schwerlöslichen pharmazeutisch annehmbaren Salz, wie Gerb- oder Palmitinsäure, oder durch Einschluss in eine Zubereitung mit zeitlich gesteuerter Freisetzung mit kovalenter Kopplung an einen größeren Träger oder Einschluss in eine Kapsel mit zeitlich gesteuerter Freisetzung und dergleichen.
Die betreffenden pharmazeutischen R'-Gfu-Trp-R''-Präparate können als freie Peptide oder in Form von wasserlöslichen pharmazeutisch annehmbaren Salzen, wie Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Zinksalzen, verwendet werden. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die betreffenden Dipeptide auch mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden können, die der Zusammensetzung unabhängig eine Aktivität verleihen. Pharmazeutisch annehmbare Salze können zweckmäßigerweise nach herkömmlichen Verfahren aus einem R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid (oder seinem Agonisten) hergestellt werden. Solche Salze können also zum Beispiel hergestellt werden, indem man R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid mit einer wässrigen Lösung des gewünschten pharmazeutisch annehmbaren Metallhydroxids oder einer anderen Metallbase behandelt und die resultierende Lösung zur Trockne verdampft, vorzugsweise unter reduziertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre. Alternativ dazu kann eine Lösung von R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid mit einem Alkoxid des gewünschten Metalls gemischt und die Lösung anschließend zur Trockne eingedampft werden. Die pharmazeutisch annehmbaren Hydroxide, Basen und Alkoxide umfassen solche mit Kationen für diesen Zweck einschließ lich (unter anderem) Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium und Magnesium. Weitere repräsentative pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Hydrogensulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat und dergleichen.
Für die parenterale Verabreichung stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate bereit, die eine Lösung von R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid oder polymeren, multimeren oder cyclischen Formen oder einem Derivat davon in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, umfassen. Es kann eine Vielzahl von wässrigen Trägern verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen, einschließlich Proteinen und/oder Glycoproteinen für eine erhöhte Stabilität, wie Albumin, Lipoprotein, Globulin und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können mit herkömmlichen, wohlbekannten Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, wie es erforderlich ist, um physiologische Bedingungen anzunähern, wie pH-Regulatoren und Puffermittel, Tonizitätsregulatoren und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw. Es kann wünschenswert sein, R'-Glu-Trp-R''-Dipeptide, Analoga, Derivate, Agonisten und dergleichen zu stabilisieren, um ihre Lagerbeständigkeit und pharmakokinetische Halbwertszeit zu erhöhen. Die Lagerbeständigkeit wird durch Zugabe von Arzneimittelhilfsstoffen verbessert, wie: a) hydrophobe Mittel (z.B. Glycerin); b) Zucker (z.B. Saccharose, Mannose, Sorbit, Rhamnose, Xylose); c) komplexe Kohlenhydrate (z.B. Lactose); und/oder d) bakteriostatische Mittel. Die pharmakokinetische Halbwertszeit von Peptiden wird durch Kopplung an Trägerpeptide, Polypeptide und Kohlenhydrate durch chemische Derivatisierung (z.B. durch Kopplung von Seitenketten- oder N- oder C-terminalen Resten) oder chemische Veränderung der Aminosäure zu einer anderen Aminosäure (wie oben) modifi ziert. Die pharmakokinetische Halbwertszeit und die Pharmakodynamik können auch modifiziert werden durch: a) Einkapselung (z.B. in Liposomen); b) Steuern des Hydratationsgrads (z.B. durch Steuern des Ausmaßes und der Art der Glycosylierung des Peptids); und c) Steuern der elektrostatischen Ladung und der Hydrophobie des Peptids.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen, die das R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid enthalten, können in einem verträglichen Pharmakon verabreicht werden, das für die parenterale Verabreichung (z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär) geeignet ist. Die Präparate können herkömmlichen pharmazeutischen Arbeitsschritten, wie Sterilisation, unterzogen werden und können Adjuvantien, wie Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Netzmittel und dergleichen, enthalten.
Die R'-Glu-Trp-R''-Dipeptidzusammensetzungen sind typischerweise bei einer Dosis von etwa 0,5 μg/kg bis etwa 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 1 μg/kg bis etwa 50 μg/kg, biologisch aktiv. Die Konzentration der R'-Glu-Trp-R''-Dipeptide in pharmazeutischen Zusammensetzungen kann variieren, d.h. von etwa 0,001% bis zu 15 oder 20 Gew.-%, und wird im Einklang mit den besonderen Bedürfnissen der Behandlung und der Art der Verabreichung an einen Patienten in erster Linie anhand der Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. ausgewählt. Bei intramuskulärer Verwendung als Injektionslösung beträgt die zur Hemmung der Neovaskularisierung wirksame Menge des Wirkstoffs zum Beispiel etwa 0,001 bis 0,01 Gew.-% R'-Glu-Trp-R''. Bei der Zubereitung in Form einer Tablette, Kapsel oder eines Suppositoriums ist der Wirkstoff vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 mg R'-Glu-Trp-R'' pro Tablette, Suppositorium oder Kapsel vorhanden. Der pharmazeutisch annehmbare Träger für diese Injektionsform kann jedes pharmazeutisch annehmbare Lösungsmittel sein, wie 0,9%iges wässriges Natriumchlorid, destilliertes Wasser, Novocain-Lösung, Ringer-Lösung, Glucoselösung und dergleichen. In einer solchen Form kann die Kapsel, das Suppositorium oder die Tablette auch andere herkömmliche Arzneimittelhilfsstoffe und Träger, wie Füllstoffe, Stärke, Glucose usw., enthalten. In topischen Präparaten sind die R'-Glu-Trp-R''-Dipeptide im Allgemeinen in Emollienten auf Harnstoffbasis, Salben auf Petroleumbasis und dergleichen in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 10 000 ppm, vorzugsweise etwa 1 bis 1000 ppm und am meisten bevorzugt etwa 10 bis 100 ppm, enthalten. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung von parenteral, oral und topisch verabreichbaren Verbindungen sind dem Fachmann bekannt oder werden ihm einfallen und sind im Einzelnen zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Science, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).
Intramuskuläre und intranasale Verabreichungswege sind für die Verabreichung der betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen bevorzugt. Eine bevorzugte Dosierung der betreffenden Zusammensetzung für die intramuskuläre Verabreichung ist etwa 50 μg bis 100 μg R'-Glu-Trp-R" pro Dosis für Erwachsene (für eine Gesamtbehandlungstherapie mit 300 μg bis 1000 μg, für Säuglinge bis zum Alter von 1 Jahr etwa 10 μg pro Dosis, für Kleinkinder im Alter von 1 bis 3 Jahren etwa 10 μg bis 20 μg pro Dosis, für Kinder im Alter von 4 bis 6 Jahren etwa 20 μg bis 30 μg pro Dosis, für Kinder im Alter von 7 bis 14 Jahren etwa 50 μg pro Dosis. Alle obigen Dosen sind je nach den Bedürfnissen des Patienten für eine Behandlung von 3 bis 10 Tagen geeignet. Die Behandlung kann nach Bedarf wiederholt werden, gewöhnlich innerhalb von 1 bis 6 Monaten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform soll eine Behandlungsdosis von etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg eines pharmazeutischen R'-Glu-Trp-R''-Präparats einem Patienten täglich über einen Zeitraum von etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen, aber gegebenenfalls nach Ermessen des behandelnden Arztes bis zu etwa 30 Tage lang, verabreicht werden. In einem bevorzugten Verlauf der Therapie soll R'-Glu-Trp-R" täglich intramuskulär in einer Dosis von 1–100 μg/kg während 5–7 Tagen verabreicht werden, gefolgt von einer Pause von 1–6 Monaten, bevor derselbe Injektionsplan wiederholt wird.
Die R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzung kann allein verabreicht oder mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern zubereitet werden, entweder in einer einzigen oder in mehreren Dosen. Zu den geeigneten pharmazeutischen Trägern gehören inerte feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässrige Lösungen und verschiedene nichttoxische organische Lösungsmittel. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden hergestellt, indem man ein R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und gegebenenfalls einem Antibiotikum kombiniert. Dann können die betreffenden Kombinationstherapeutika leicht in einer Vielzahl von Darreichungsformen, wie Tabletten, Pastillen, Sirupen, injizierbaren Lösungen und dergleichen verabreicht werden. Kombinationstherapeutika können auch ein R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid, z.B. L-Glu-L-Trp, in derselben Darreichungsform enthalten. Pharmazeutische Träger können, falls gewünscht, zusätzliche Bestandteile, wie Aromen, Bindemittel, Arzneimittelhilfsstoffe und dergleichen, enthalten.
Für Zwecke der oralen Verabreichung können also Tabletten, die verschiedene Arzneimittelhilfsstoffe, wie Natriumcitrat, Calciumcarbonat und Calciumphosphat enthalten, zusammen mit verschiedenen Sprengmitteln, wie Stärke, und vorzugsweise Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure und bestimmte komplexe Silicate zusammen mit Bindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Gummi arabicum, eingesetzt werden. Zusätzlich sind häufig auch Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk für Tablettierzwecke geeignet. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in Salz- und hartgefüllten Gelatinekapseln eingesetzt werden. Zu den bevorzugten Materialien für diesen Zweck gehören Lactose oder Milchzucker und hochmolekulare Polyethylenglycole. Wenn wässrige Suspensionen von Elixieren für die orale Verabreichung gewünscht werden, können die wesentlichen R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid-Wirkstoffe darin mit verschiedenen Süßungs- oder Aromastoffen, Färbemitteln oder Farbstoffen und gegebenenfalls Emulgier- oder Suspendiermitteln zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglycol, Glycerin und Kombinationen davon kombiniert werden.
Für die parenterale Verabreichung können Lösungen von R'-Glu-Trp-R'' in Sesam- oder Erdnussöl oder in wässrigem Polypropylenglycol sowie sterile wässrige Kochsalzlösungen der entsprechenden wasserlöslichen, pharmazeutisch annehmbaren Metallsalze, die oben beschrieben sind, eingesetzt werden. Eine solche wässrige Lösung sollte zweckmäßigerweise gepuffert sein, falls notwendig, und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit ausreichend Salzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind insbesondere für die intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Injektion geeignet. Die eingesetzten sterilen wässrigen Medien sind alle durch Standardtechniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, leicht erhältlich. Außerdem ist es möglich, die oben genannten Verbindungen topisch (z.B. durch einen gesetzten Katheter) zu verabreichen, wobei man eine geeignete Lösung verwendet, die für den jeweiligen Zweck geeignet ist.
Eine Menge, die ausreicht, um bei mehr als 50% der so behandelten Patienten ein therapeutisches Ergebnis zu erzielen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die Behandlung von akuten Zuständen erfolgt im Allgemeinen über etwa 3–10 Tage. Die Behandlung von chronischen Zuständen oder prophylaktische Behandlungen haben denselben Verlauf, können aber nach bis zu etwa 1–6 Monaten oder länger wiederholt werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Zusammensetzungen täglich mit Unterbrechungen über Zeiträume von etwa 2 bis etwa 20 Tagen, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 14 Tagen, besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa 10 Tagen zu verabreichen, was nach etwa 15 Tagen, vorzugsweise etwa 20 Tagen oder bis zu etwa 1 bis 6 Monaten oder mehr wiederholt wird.
Der Verabreichungsweg für eine R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzung wird von der Krankheit und der Stelle, wo eine Behandlung erforderlich ist, bestimmt. Für eine topische Applikation kann es wünschenswert sein, die R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzung an der lokalen Stelle zu applizieren (z.B. durch Stechen einer Nadel in das Gewebe an dieser Stelle oder durch Platzieren einer imprägnierten Bandage z.B. an einer Tumorstelle nach der operativen Entfernung, während es bei anderen Krankheiten wünschenswert sein kann, die R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen systemisch zu verabreichen. Bei anderen Indikationen können die R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen und dergleichen auch durch intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale und intradermale Injektion sowie durch intrabronchiale Instillation (z.B. mit einem Vernebler), transdermale Abgabe (z.B. mit einem lipidlöslichen Träger in einem Hautpflaster) oder gastrointestinale Abgabe (z.B. mit einer Kapsel oder Tablette) verabreicht werden.
Im Allgemeinen werden die Säureadditionssalze der betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzung, z.B. L-Glu-L-Lys-Zusammensetzungen, mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren den betreffenden R'-Glu-Trp-R''-Zusammensetzungen selbst biologisch äquivalent sein.
Die bevorzugten therapeutischen Zusammensetzungen, Inokula, Wege und Dosierungen werden selbstverständlich mit der klinischen Indikation variieren. Für die intramuskuläre Injektion wird das Inokulum typischerweise aus einem getrockneten Peptid (oder Peptidkonjugat) hergestellt, indem man das Peptid in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, wie Wasser, Salzlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung, suspendiert. Eine gewisse Variation der Dosierung wird je nach dem Zustand des behandelten Patienten notwendigerweise stattfinden, und der Arzt wird auf jeden Fall die geeignete Dosis für den individuellen Patienten bestimmen. Die wirksame Menge Peptid pro Dosiseinheit hängt unter anderem vom Körpergewicht, der Physiologie und dem gewählten Impfplan ab. Eine Dosiseinheit des Peptids bezieht sich auf das Gewicht des Peptids ohne das Gewicht des Trägers (wenn ein Träger verwendet wird). Eine effektive Behandlung wird erreicht, wenn sich die Konzentration des R'-Glu-Trp-R''-Dipeptids, z.B. L-Glu-L-Trp, an einer Gewebestelle in der Mikroumgebung der Zellen einer Konzentration von 10^–5 M bis 10^–9 M annähert. Erfahrene Praxisärzte können klinische und Laborkriterien (siehe oben) verwenden, um die Reaktion des Patienten auf die betreffende Therapie zu überwachen und die Dosierung entsprechend einzustellen. Da die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von R'-Glu-Trp-R''-Dipeptiden, Agonisten, Antagonisten und dergleichen bei verschiedenen Patienten variiert, besteht ein am meisten bevorzugtes Verfahren zum Erreichen einer therapeutischen Konzentration in einem Gewebe darin, die Dosis allmählich zu steigern und die klinischen und Laborkriterien (siehe oben) zu überwachen. Die Anfangsdosis für einen solchen Therapieplan mit sich steigernder Dosis hängt vom Verabreichungsweg ab: Für die intravenöse Verabreichung wird ein R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid mit einem ungefähren Molekular gewicht von 200 bis 400 Dalton, einer Anfangsdosis von ungefähr 0,5 μg/kg Körpergewicht verabreicht, und die Dosis wird für jedes Intervall des Plans mit sich steigernder Dosis in 10fachen Erhöhungen der Konzentration gesteigert.
Wenn er in Form einer Tablette, Kapsel oder eines Suppositoriums angeboten wird, ist der Wirkstoff vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 mg pro Tablette, Suppositorium oder Kapsel vorhanden. Wenn der Wirkstoff in einer solchen Form angeboten wird, kann die Kapsel, das Suppositorium oder die Tablette auch andere herkömmliche Arzneimittelhilfsstoffe und Träger, wie Füllstoffe, Stärke, Glucose usw., enthalten.
Zweckmäßigerweise wird das betreffende R'-Glu-Trp-R''-Dipeptid nach einer von mehreren automatisierten Techniken, die jetzt üblicherweise verfügbar sind, synthetisiert. Allgemein gesagt, beinhalten diese Techniken die schrittweise erfolgende Synthese durch sukzessive Additionen von Aminosäuren unter Bildung zunehmend größerer Moleküle. Die Aminosäuren werden durch Kondensation zwischen der Carboxygruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure unter Bildung einer Peptidbindung miteinander verknüpft. Um diese Reaktionen zu steuern, ist es notwendig, die Aminogruppe einer Aminosäure und die Carboxygruppe der anderen zu blockieren. Die Blockierungsgruppen sollten so gewählt werden, dass sie leicht wieder entfernt werden können, ohne die Peptide zu beeinträchtigen, d.h. durch Racemisierung oder durch Hydrolyse der gebildeten Peptidbindungen. Aminosäuren mit Carboxygruppen (z.B. Asp, Glu) oder Hydroxygruppen (z.B. Ser, Homoserin und Tyrosin) erfordern ebenfalls eine Blockierung vor der Kondensation.
Für die Synthese von Peptiden gibt es eine Vielzahl von Verfahren, wobei die Festphasensynthese gewöhnlich bevorzugt ist. Bei diesem Verfahren wird eine Aminosäure an ein Harzteilchen gebunden, und das Peptid wird schrittweise durch sukzessive Additionen von geschützten Aminosäuren an die wachsende Kette erzeugt. Modifikationen der von Merrifield beschriebenen Technik werden häufig verwendet. In einem beispielhaften automatisierten Festphasenverfahren werden Peptide synthetisiert, indem man die carboxyterminale Aminosäure auf einen organischen Linker (z.B. PAM, 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl) lädt, der kovalent an ein unlösliches Polystyrolharz gebunden ist, das mit Divinylbenzol vernetzt ist. Blockierung mit t-Boc wird verwendet, um die terminale Aminogruppe zu schützen, und Hydroxy- und Carboxygruppen werden gewöhnlich mit O-Benzylgruppen blockiert. Die Synthese erfolgt in einem automatischen Peptidsynthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, z.B. Modell 430-A). Nach der Synthese kann das Produkt von dem Harz entfernt werden, und die Blockierungsgruppen können mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure oder Trifluormethylsulfonsäure gemäß etablierten Verfahren (Bergot, B.J. und S.N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987) entfernt werden. Bei einer Routinesynthese können 0,5 mmol Peptid-Harz produziert werden. Die Ausbeute nach der Spaltung und Reinigung beträgt ungefähr 60 bis 70%. Zum Beispiel wird ein amino- und seitenkettengeschütztes Derivat eines aktivierten Esters von Glx mit seitengruppengeschütztem Trp umgesetzt, das an seinem C-Terminus an die feste Phase gebunden ist. Nach der Beseitigung der alpha-Amino-Schutzgruppe kann das Peptid von der festen Phase abgespalten werden, oder eine weitere Aminosäure kann in ähnlicher Weise addiert werden. Weitere Aminosäuren werden nacheinander addiert. Die Peptide werden durch hochgradig saure Spaltung abgespalten, bei der typischerweise auch Schutzgruppen entfernt werden.
Dann können die Peptide isoliert und lyophilisiert und für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden. Geeignete Techniken der Peptidsynthese werden im Einzelnen beschrieben bei Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Company, 1984; und Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983).
Die Reinigung der Produktpeptide erfolgt zum Beispiel durch Kristallisieren des Peptids aus einem organischen Lösungsmittel, wie Methylbutylether, und anschließendes Auflösen in destilliertem Wasser sowie Dialyse (wenn Molekulargewicht von mehr als etwa 500), Dünnschichtchromatographie, Gelchromatographie, Lyophilisierung oder Umkehr-HPLC (z.B. unter Verwendung einer C18-Säule mit 0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril als Lösungsmittel), wenn das Molekulargewicht kleiner als 500 ist. Gereinigtes Peptid wird lyophilisiert und bis zur Verwendung im trockenen Zustand aufbewahrt. Ein repräsentatives pharmazeutisches R'-Glu-Trp-R''-Präparat ist das gereinigte Dipeptid L-Glu-L-Trp, das ein weißes Pulver umfasst (wenn lyophilisiert; ansonsten ist es kristallin), das in Wasser und DMF löslich und in Chloroform und Ether unlöslich ist. [α22_D = +12,6; C = 0,5 H₂O. R_f = 0,65 (Butanol:Essigsäure:Wasser = 3:1:1). UV (275 ± 5 nm, max). NMR (500 MHz): 0,001 mol/l der Peptidlösung, Trp (3,17; 3,37; 4,57; 7,16; 7,24; 7,71; 7,49); Glu (1,90; 1,96; 2,21; 3,72).
Typischerweise wird ein amino- und seitenkettengeschütztes Derivat eines aktivierten Esters von Glutaminsäure mit geschütztem L-Tryptophan umgesetzt. Nach der Beseitigung der Schutzgruppen und herkömmlicher Reinigung, wie durch Dünnschicht- oder GL-Chromatographie, kann das Peptid gereinigt werden, wie etwa durch Lyophilisierung, Gelreinigung und dergleichen.
Ohne uns auf irgendeinen bestimmten Wirkungsmechanismus festlegen zu wollen, haften wir es für möglich, dass die betreffenden tryptophanhaltigen Peptide reversibel mit spezifischen zellulären EW-Rezeptoren auf Endothelzellen assoziieren können, wobei ein solcher Rezeptor als die ubiquitäre "CD2"-Zell-oberflächendeterminante definiert ist, die auch auf Lymphocyten, Endothelzellen und bestimmten Epithelzellen vorhanden ist. Es wird für möglich gehalten, dass die Bindung von EW-Dipeptid an CD2 (und andere EW-Rezeptoren) eine Konformationsänderung im Rezeptor auslöst, die vielleicht eine Hochregulierung von Adenylat-Cyclase und erhöhtes intrazelluläres cAMP einleitet. Es wird zur Zeit für möglich gehalten, dass L-Glu-L-Trp seine Wirkungen durch Herunterregulieren von zellulären Mechanismen ausübt, durch die Entzündungsmediatoren, wie TNF-α und IL-1, die Aktivierung und Proliferation von Endothelzellen und Pericyten auslösen. Die Aktivierung führt zu Änderungen in der Zelloberflächenexpression von Adhesinen, die an der Bindung von Entzündungszellen bei Vasculitis beteiligt sind, während die Proliferation an der Neovaskularisierung beteiligt ist. Die Herunterregulierung von Endotheleffekten, die von Entzündungsmediatoren induziert werden, durch L-Glu-L-Trp kann die Dephosphorylierung von einer oder mehreren zellulären Tyrosin-Kinasen beinhalten. Es gilt als wahrscheinlich, dass diese Herunterregulierung zu Änderungen in der Synthese oder Zelloberflächenexpression von endothelialen Adhesinen, Selectinen und/oder Integrinen, z.B. ELAM, VCAM und dergleichen, führen kann. Die letzteren zellulären Veränderungen, die durch tryptophanhaltige Dipeptide induziert werden, können zu einer reduzierten Fähigkeit von Entzündungszellen (z.B. Lymphocyten, Neutrophile und/oder Monocyten) führen, sich an Stellen von Vasculitis zu lokalisieren.
Die hier verwendeten Symbole für Aminosäuren stehen im Einklang mit den IUPAC-IUB-Empfehlungen, die in Arch. Biochem. Biopchem. 115: 1–12, 1966, veröffentlicht sind, mit den folgenden Ein-Buchstaben-Symbolen für die Aminosäuren: L, Leu, Leucin; V, Val, Valin; Y, Tyr, Tyrosin; D, Asp, Asparaginsäure; W, Trp, Tryptophan; P, Pro, Prolin; I, Ileu, Isoleucin; G, Gly, Glycin; M, Met, Methionin; E, Glu, Glutaminsäure; T, Thr, Threonin; K, Lys, Lysin; N, Asn, Asparagin; R, Arg, Arginin; Q, Gln, Glutamin; A, Ala, Alanin; C, Cys, Cystein; S, Ser, Serin; F, Phe, Phenylalanin; H, His, Histidin; C, Cys, Cystein; 5, Ser, Serin.
Beispiel 1
Fehlende Mutagenität und Toxizität von L-Glu-L-Trp:
Pharmakokinetik und Bioverteilung
Vorschrift A
Studien zur akuten Toxizität
Zusammenfassung: Wenn L-Glu-L-Trp intramuskulär in Dosen injiziert wurde, die etwa dem 10000fachen einer therapeutischen Dosis entsprachen, war es bei Mäusen, Meerschweinchen, Hühnern und Hunden nicht toxisch, was durch Überwachung des Allgemeinzustands, Verhaltens, der Bewegungen, Herz- und Atemphysiologie und der groben Pathologie bestimmt wurde.
Vorschrift B
Studien zur chronischen Toxizität
Zusammenfassung: Wenn L-Glu-L-Trp täglich als einzelne intramuskuläre oder intravenöse Dosis über einen Zeitraum von 28 Tagen injiziert wurde, zeigte es keine nachteiligen Wirkungen, was durch Überwachung des Verhaltens, der Futteraufnahme, des Körpergewichts, des Fellzustands, der Schleimhäute, der Zahl der roten und weißen Blutkörperchen, Herz- und Atemphysiologie, Leber- und Nierenfunktion und der groben Pathologie bestimmt wurde. Die Nierenfunktion wurde durch Bewertung der Diurese nach Wasserbelastung bestimmt; für bestimmte andere Experimente wurden Hunde und Ratten nach 10, 20, 30 bzw. 60 Tagen getötet und untersucht.
Vorschrift C
Pharmakokinetik und Bioverteilung: GLP-Studie
Mit ¹⁴C radioaktiv markiertes L-Glu-L-Trp (110 μg/kg) wurde Sprague-Dawley-Ratten intranasal verabreicht. Zu verschiedenen Zeitpunkten, nach 0,5, 2, 8 oder 24 Stunden, wurden Blut- und Gewebeproben genommen, und die Menge des intakten L-Glu-L-Trp wurde durch HPLC bestimmt. Zu den Gewebeproben gehörten gepackte rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, Leber, Niere, Herz, Lunge, Milz, Thymus, Hirn, Muskel, Haut, Fett, Auge, Eierstöcke, Hoden, submandibuläre Lymphknoten und der Magen-Darm-Trakt samt Inhalt. Intranasal verabreichtes ¹⁴C-L-Glu-L-Trp wurde schnell resorbiert, mit einem Plasma-C_max von 0,349 μg·äq.·h/g ¹⁴C. Nach 30 Minuten wurde im Blut bis zu einer Empfindlichkeit im Bereich von 5–101 ng/ml keine intakte Verbindung nachgewiesen, was eine Bluthalbwertszeit von weniger als 30 Minuten vermuten lässt. Als Gewebeeliminierungshalbwertszeit wurden 18,7 h bestimmt.
Beispiel 2
Inhibitorische Wirkungen von L-Glu-L-Trp auf die Angiogenese in Chorioallantoismembran(CAM)-Assays
Kurz gesagt, acht Tage alte Hühnerembryonen wurden aus Eiern entnommen und in sterile Petri-Schalen gelegt. Einzelne Filterpapierscheiben wurden mit 7,5 μl verschiedener Stammlösungen von L-Glu-L-Trp in sterilem 0,14 M NaCl gesättigt, wobei endgültige Testkonzentrationen von 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100, 500 bzw. 1000 μg pro Scheibe erreicht wurden. Die Scheiben wurden an der Luft getrocknet und dann umgekehrt auf die Oberfläche der jeweiligen Embryonen gelegt. Die Vaskularisierung der Embryonen wurde nach 48 Stunden Inkubation bewertet, wobei man die Einstufungsskala verwendete, die unten in Tabelle 1 zusammengefasst ist.
Tabelle 1 Bewertung der Vaskularisierung von Hühnerembryonen: CAM-Assay
In diesem Experiment diente Kochsalzlösung als negative Kontrolle, und 10 μg Heparin pro Scheibe dienten als positive Kontrolle. Das Pentapeptid Tyr-Ala-Glu-Glu-Lys (TAEEK) diente als Spezifitätskontrolle (d.h. auf mögliche unspezifische Wirkungen von Peptiden auf die Neovaskularisierung bei den getesteten Konzentrationen). 912-Testscheiben und eine entsprechende Anzahl von verschie denen Embryonen wurden für jede Testkonzentration zusammen mit (jeweils) 82 positiven und negativen Kontrollembryonen eingesetzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 2 Ergebnisse des Hühner-Embryo-CAM-Assays

* Mittelwert ± St.Abw. = Mittelwert ± Standardabweichung, n = 10 für Test und n = 80 für Salzlösung und Heparin

Die Ergebnisse zeigen eine 30-88%ige Abnahme der Vaskularisierung bei Embryonen, die mit 10 ng-1000 μg L-Glu-L-Trp in Kochsalzlösung behandelt wurden. Der Grad der Hemmung, der mit Dosen von 10–1000 μg erreicht wurde, näherte sich dem von Heparin (10 μg) an. Obwohl bei höheren Dosen (d.h. 100–1000 μg) einige mutmaßliche unspezifische Wirkungen des Kontroll-Pentapeptids TAEEK auf die Vaskularisierung der Embryonen beobachtet wurden, war die Wirkung nicht so ausgeprägt wie diejenige, die mit L-Glu-L-Trp erreicht wird, und die mutmaßliche unspezifische Wirkung wurde bei niedrigeren Dosen nicht beobachtet. Zusammengenommen lassen diese Ergebnisse eine Wirkung von L-Glu-L-Trp auf den Vorgang der Gefäßbildung in embryonalen Hühnergeweben vermuten.
Beispiel 3
Hemmung der Neovaskularisierung von Lewis-Karzinom
Wenn Lewis-Lungenkarzinomzellen (5 × 10⁷) intradermal (0,1 ml) in beide Flanken von C57BL/6-Mäusen injiziert werden (Tag 0), produzieren sie innerhalb von 7 Tagen sichtbare, hochgradig vaskularisierte Tumorknötchen. Durch Herausschneiden des Tumors kann der Grad der Tumorvaskularisierung mikroskopisch bestimmt werden, indem man die Zahl der großen Gefäße bestimmt, die von der Tumormasse ausstrahlen. Eine unabhängige Studie wurde (wie folgt) bei einer von der GLP zugelassenen Vertragsforschungsorganisation durchgeführt.
Kochsalzlösung wurde als negative Kontrolle verwendet, und Cytoxan wurde als positive Kontrolle verwendet. Die positive Kontrolle Cytoxan (200 mg/kg) wurde erst am Tag 2 verabreicht. Testbehandlungen mit L-Glu-L-Trp wurden täglich intramuskulär beginnend am Tag 1 nach der Tumorinjektion und über 5 Tage fortlaufend (d.h. bis zum Tag 6) verabreicht. L-Glu-L-Trp wurde in Dosen von 125, 250, 500, 1000 und 2000 μg/kg/Dosis verabreicht. Die negative Kontrolle, Salzlösung, wurde intraperitoneal nach demselben Plan der täglichen Verabreichung über 5 Tage verabreicht. Bei jeder Dosis des Tests oder Kontrollmittels wurden zehn Mäuse (20 Tumoren) bewertet. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Tabelle 3 Hemmung der Lewis-Lungentumor-Neovaskularisierung

* multipler paarweise durchgeführter Vergleich nach Student-Newman-Keuls; statistisch unterschiedlich gegenüber Gruppe 1 auf dem Niveau p < 0,05.

Die Ergebnisse zeigen eine eindeutige, statistisch signifikante Hemmung der Neovaskularisierung als Ergebnis von Behandlungen mit entweder Cytoxan oder L-Glu-L-Trp. Niedrige Dosen von L-Glu-L-Trp waren effektiver in Bezug auf die Hemmung der Angiogenese (Gruppen 4–7) als höhere Dosen (Gruppe 3). Das inverse Dosis-Wirkungs-Profil, d.h. mit geringerer Aktivität bei höheren Dosen, steht im Einklang mit dem früher beobachteten Verhalten anderer biologischer Reaktionsmodifikatoren in diesem Assay (z.B. IFN-α oder IL-12).
Alle Behandlungen wurden gut vertragen, und es wurden kein Gewichtsverlust oder Todesfälle aufgezeichnet.
Beispiel 4
Anti-Tumor-Aktivität von L-Glu-L-Trp: Sarkom 180
Zum Tumorwachstum ist Neovaskularisierung erforderlich. Die Anti-Tumor-Aktivität von L-Glu-L-Trp wurde in einer unabhängigen Vertragsforschungsorganisation bewertet. Sarkom-180-Tumoren (ATCC CCL-8 CCRF S-180 II) wurden induziert, indem man 2 × 10⁶ Zellen/0,1 ml intramuskulär in jede Hinterflanke von Swiss-Webster-Mäusen injizierte. Die Gruppen bestanden aus 10 Tieren (20 Tumoren). L-Glu-L-Trp wurde in einer einzigen 0,1-ml-Dosis von entweder 10 μg/kg, 75 μg/kg, 250 μg/kg oder 1000 μg/kg verabreicht. Die Tumorgröße wurde bewertet, indem man die betroffenen Gliedmaßen operativ entfernte und wog und das Gewicht mit dem Gewicht von normalen (nicht tumorbefallenen) Kontrollgliedmaßen verglich. Der erste prophylaktische Wirkstoffplan (PDR-1) bestand aus 5 aufeinanderfolgenden täglichen intraperitonealen Injektionen, die am Tag –5 begannen und am Tag –1 endeten. Der zweite prophylaktische Wirkstoffplan (PDR-2) bestand aus 5 aufeinanderfolgenden täglichen intramuskulären Injektionen in die linke Hinterflanke (Tumorstelle), die am Tag –5 begannen und am Tag –1 endeten. Sarkom-180-Zellen wurden am Tag 0 intramuskulär injiziert. 0,1 ml Kochsalzlösung dienten als negative Kontrolle. Tabelle 4 Wirkung von L-Glu-L-Trp-Behandlungen auf die Sarkom-180-Tumorgröße

(a) mittleres Tumorgewicht = (mittleres Beingewicht behandelt – mittleres Beingewicht normale Kontrolle);
(b)Hemmung = (Tumorgewicht behandelt – Tumorgewicht Kontrolle) × 100%

Die in Tabelle 5 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass prophylaktische Behandlungen mit L-Glu-L-Trp intraperitoneal oder intramuskulär mit Dosen von 250 μg/kg und 1000 μg/kg das anschließende intramuskuläre Tumorwachstum hemmten. Interessanterweise erschien es möglich, systemische Inhibitoreffekte durch Behandlungen hervorzurufen, die an einer lokalen intramuskulären Stelle verabreicht wurden, da die in die linke Flanke verabreichten intramuskulären Behandlungen das anschließende Tumorwachstum in der rechten Flanke hemmten (d.h. Gruppen 8 und 9). Die Ergebnisse stehen mit der Hemmung der Neovaskularisierung im Einklang, die oben in den Beispielen 2 und 3 beobachtet wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Mittel zur Hemmung der Neovaskularisierung bereit. Während spezielle Beispiele angegeben wurden, ist die obige Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend.

Claims

Verwendung eines aktiven Mittels, umfassend ein antiangiogenes Glu-Trp-Dipeptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines pathologischen Zustands, der Neovaskularisierung beinhaltet, wobei der pathologische Zustand ausgewählt ist unter Neovaskularisierung von Tumoren, Hämangiomen, Neovaskularisierung nach der Genesung bei cerebrovaskulärem Unfall, Neovaskularisierung aufgrund von Kopftrauma, Restenose nach Angioplastie, Neovaskularisierung, die mit Leberkrankheiten assoziiert ist, Substanzinduzierter Neovaskularisierung der Leber, angiogener Dysfunktion, die im Zusammenhang mit einem Hormonüberschuss steht, neovaskulären Folgekrankheiten von Diabetes, neovaskulären Folgekrankheiten der Hypertension oder Neovaskularisierung aufgrund von Hitze- oder Kältetraumata.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aktive Mittel Aminosäureanaloga des antiangiogenen Glu-Trp-Dipeptids umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das aktive Mittel R'-Glu-Trp-R'' einschließlich Aminosäureanaloga davon umfasst, wobei R' und/oder R'' unabhängig voneinander ausgewählt sind unter pharmazeutisch verträglichen Salzen des Dipeptids, Amiden, Imiden, Estern, Anhydriden, Ethern, Methyl- oder Ethylalkylestern, Alkyl-, Aryl- oder Alkyl-/Aryl-Mischderivaten, wobei das Molekulargewicht weniger als etwa 5000 Dalton beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das aktive Mittel eine zyklische Form des Dipeptids, lineare oder zyklische Polymere des Dipeptids mit nicht mehr als 20 Aminosäuren oder Peptide mit nicht mehr als 20 Aminosäuren einschließlich wenigstens eines Dipeptids in ihrer Aminosäuresequenz umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Glu- und Trp-Aminosäuren des aktiven Mittels unabhängig voneinander L-Glu und/oder L-Trp sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aktive Mittel nicht mehr als 10 Aminosäuren umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das Analogon von Trp ein Pyrrol-Analogon, bei dem der Stickstoff im Pyrrol-Ring durch Kohlenstoff ersetzt ist, 5-Hydroxytryptamin oder 5-Hydroxyindolessigsäure ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aktive Mittel ausgewählt ist unter HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEW oder pEW.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Verabreichung an ein Individuum in einer Dosis von etwa 0,5 μg pro 1 Kilogramm Körpergewicht bis etwa 1 mg pro 1 Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise etwa 1 μg/kg bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht, vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Verabreichung in der Tagesdosis über einen Zeitraum von 1 Tag bis etwa 30 Tage vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur intramuskulären öder intranasalen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Medikament zur Verabreichung in Form einer injizierbaren Lösung vorgesehen ist, die 0,001 % bis 0,01 % des aktiven Mittels, vorzugsweise L-Glu-L-Trp, umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Medikament in einer Einheitsdosisform vorliegt, die eine Tablette, ein Zäpfchen, eine Kapsel, eine Augenfolie, ein Inhalierungsmittel, ein Mukosa-Spray, Nasentropfen, Augentropfen, eine Zahnpasta, eine Salbe oder eine Creme auf wasserlöslicher Basis umfasst; wobei gegebenenfalls die Einheitsdosisform im wesentlichen 0,01 mg des aktiven Mittels umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zusätzlich ein vasoaktives Arzneimittel umfasst, z. B. einen Inhibitor für Angiotensin umwandelndes Enzym (ACE) oder eine Kaliumkanal öffnende Substanz (PCO).
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Individuum entweder an einem Tumor leidet und das Medikament weiterhin ein chemotherapeutisches Mittel umfasst, oder das Individuum nicht immunkompromittiert ist.