DE69628838T2

DE69628838T2 - Chemokin bindendes protein und verfahren zu seiner verwendung

Info

Publication number: DE69628838T2
Application number: DE69628838T
Authority: DE
Inventors: Grant Mcfadden; Alexandra Lucas
Original assignee: John P Robarts Research Institute
Current assignee: Viron Therapeutics Inc
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2016-04-20
Also published as: US5834419A; PT840615E; DE69628838D1; WO1996033730A2; DK0840615T3; ES2202452T3; JP2007332145A; JP4077876B2; AU6237996A; WO1996033730A3; JPH11504036A; CA2218499A1; EP0840615B1; ATE243526T1; EP0840615A2; AU718049B2; CA2218499C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft grundsätzlich den Bereich der Immunologie und im speziellen ein chemokinbindendes Protein, das von mehreren Pockenviren codiert wird, sowie Verfahren zu seiner Verwendung.
2. Beschreibung des angrenzenden Fachgebiets
Es wird zunehmend deutlich, dass Viren, die in Zellen höherentwickelter Vertebraten leben, sich so entwickeln mussten, dass sie dem Immunsystem ihres Wirtes entgehen (Gooding, L., Cell, 91: 5–7, 1992; Marrack, P. und Kappler, J., Cell, 76: 323–332, 1994; Smith, G., Trends in Micro., 82: 80–88, 1994). Tatsächlich hängt das Überleben eines Virus von dessen Strategien ab, den Myriaden von Wirtsreaktionen auf einen fremden Eindringling zu entkommen, sie zu unterdrücken, zu neutralisieren oder ihnen auf andere Art auszuweichen. Der Selektionsdruck, der von den effektiven Waffen des Immunsystems ausgeht, kann eindeutig ein machtvolles Element des Evolutionsdruckes sein und alle eukaryotischen Viren, die es heutzutage gibt, enthalten Prägungen oder Erinnerungen von ihren Kämpfen mit dem Immunsystem, entweder als codierte Proteine oder an ihren bestimmten biologischen Überlebensstrategien erkennbar.
Die größeren DNA-Viren (z. B. die Adenoviren, Herpesviren, Iridoviren und Pockenviren) codieren spezifisch Proteine, die das Virus davor schützen, vom Immunsystem des infizierten Wirtes erkannt und/oder entfernt zu werden. Solche "subversiven" viralen Proteine liefern nun Informationen, die die Funktionen des Immunsystems betreffen und es ist wahrscheinlich, dass in Zukunft noch viele neue Mitglieder dieser wachsenden Familie entdeckt und identifiziert werden.
In den achtziger Jahren wurde zur Beschreibung Virus-codierter Proteine, die von infizierten Zellen abgesondert werden und extrazelluläre Signalmoleküle wie Cytokine oder andere abgesonderte Regulatoren, die wichtig für das Immunrepertoire des Wirtes sind, nachahmen, der Begriff "Virokine" vorgeschlagen (Kotwal, G. und Moss, B., Nature, 335: 176–178, 1988). Später, in den neunziger Jahren, wurde der Begriff "Viroceptor" eingeführt, um die Beobachtung zu umschreiben, dass einige Virus-codierte Proteine wichtige zelluläre Rezeptoren nachahmen und so funktionieren, dass sie Cytokine des Wirtes von ihren normalen Rezeptoren wegleiten und dadurch den Regelkreis des Immunsystems in seinen frühesten Stadien unterbrechen (Upton, et al., Virology, 184: 370, 1991; Schreiber und McFadden, Virology, 204: 692–705, 1994).
Neueste Studien mit einem bestimmten Pockenvirus, dem Myxomavirus, haben gezeigt, dass das Virus das Immunsystem mit einer Vielzahl von Strategien stört (McFadden und Graham, Seminars in Virology, 5: 421–429, 1994). Das Myxomavirus löst bei Zuchtkaninchen die Myxomatose, eine virulente systemische Infektionskrankheit, aus. Erstmals im vergangenen Jahrhundert beschrieben, war Myxoma das erste pathogene Virus, das für ein Labortier entdeckt wurde und das erste virale Mittel, das man jemals absichtlich zum ausdrücklichen Zweck einer Schädlingsausrottung in die Umwelt eingebracht hat. Seit seiner Entlassung in die wilden australischen und europäischen Kaninchenpopulationen vor mehr als 40 Jahren waren beide Wildrassen, die des Kaninchens und die des Virus, einem gegenseitigen evolutionären und selektiven Druck ausgesetzt, der in ein enzootisches Gleichgewicht in den beimpften Gebieten mündete (Fenner, F. und Ratcliffe, F. N., "Myxomatosis", Cambridge University Press, London, 1965).
Myxoma teilt viele biologische Merkmale mit anderen Pockenviren, vor allem den cytoplasmatischen Replikationsort und ein großes doppelsträngiges DNA-Genom (160 Kilobasen). Verschiedene Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Myxoma, wie alle Pockenviren, mehrere Genprodukte codiert, deren Funktion die Ausbreitung und Fortpflanzung des Virus in einer Vielzahl von Wirtsgeweben ist. Einige dieser viralen Proteine wirken spezifisch gegen oder verhindern die Entwicklung der Entzündungsreaktion des Wirtes und der erworbenen zellulären Immunität, und Pockenviren sind generell eine reiche Quelle derartiger immunmodulierender Proteine (Turner, P. C., und Moyer, R. W., Cur. Top. Microbiol. Imm., 163: 125–152, 1990; Bullen, R. M. L., und Palumbo, G. J., Micro. Dev., 55: 80–122, 1991; Smith, G. L., J., Gen. Virol., 94: 1725–1740, 1993; McFadden, G., (Ed.), "Viroceptors, virokines and related immune modulators encoded by DNA viruses", R. G. Landes Co., Austin Texas, 1995).
Beispiele für solche immunmodulierenden Genprodukte sind der Myxoma-Wachstumsfaktor (MGF), der benachbarte Zellen in einer parakrinartigen Weise via den zellulären epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor stimuliert (Upton, et al., J. Virol., 61: 1271–1275, 1987; Opgenorth, et al., Virol., 186: 185–191, 1992; Opgenorth, et al., Virol., 192: 701–708, 1992; Opgenorth, et al., J. Virol., 66: 4720-4731, 1992); Serp 1, ein abgesondertes Glykoprotein mit Serinprotease-Inhibitionsaktivität, das die Entwicklung einer frühen Entzündungsreaktion verhindert (Upton, et al., Virol., 179: 628–631, 1990; Lomas, et al., JBC, 268: 516-521, 1993; Macen, et al., Virol., 195: 348–363, 1993); T2, ein abgesondertes virales Homolog der zellulären Tumor-Nekrose-Faktor-(TNF)Rezeptor-Superfamilie, das an den Kaninchen-TNF bindet und ihn blockiert (Smith, et al., BBRC, 176: 335–342, 1991; Schreiber, M. und McFadden, G., supra, 1994; Upton, et al., supra, 1991); T7, ein abgesondertes virales Homolog des zellulären Interferon-γ-Rezeptors, der an den Interferon-γ-Rezeptor des Kaninchens bindet und ihn blockiert (Upton, et al., Science, 258: 1369, 1992; Upton und McFadden, Methods in Molecular Genetics, 4: 383, 1994; Mossman, et al., In: "Viroceptors, virokines and related immune modulators" S. 41–54 Ed. McFadden, R. G. Landers, Co.,1995); und M11 L, ein Oberflächenrezeptor-ähnliches Protein, das die Entzündungsreaktion durch einen unbekannten Mechanismus stört (Opgenorth, et al., supra; Graham, et al., Virol. 191: 112–124, 1992).
Immunmodulierende Proteine umfassen auch chemotaktische Cytokine, die man "Chemokine" nennt. Chemokine sind Immunliganden mit geringem Molekulargewicht und chemischer Anziehungskraft für Leukozyten, vor allem für Neutrophile, Basophile, Monozyten und T-Zellen. Es gibt zwei Hauptklassen von Chemokinen, die beide vier konservierte Cysteinreste enthalten, die Disulfidbrücken in der Tertiärstruktur der Proteine bilden. Die α-Klasse wird als C-X-C bezeichnet (wobei X für eine beliebige Aminosäure steht), sie umfaßt IL-8, CTAP-III, gro/MGSA und ENA-78; die β-Klasse, die als C-C bezeichnet wird, umfaßt MCP-1, MIP-1 α und β und reguliert, wenn sie aktiviert ist, normales Texprimiertes und abgesondertes Protein (RANTES). Die Bezeichnungen der Klassen beziehen sich darauf, ob ein dazwischenliegender Rest die ersten zwei Cysteine im Muster spaltet. Im allgemeinen sind die meisten C-X-C-Chemokine chemisch anziehend für Neutrophile, nicht jedoch für Monozyten, während C-C-Chemokine Monozyten anzuziehen scheinen, nicht jedoch Neutrophile. Kürzlich wurde im Rahmen der Entdeckung eines neuen Proteins, dem Lymphotactin, eine dritte Gruppe von Chemokinen, die "C"-Gruppe, bestimmt (Keiner, et al., Science, 266: 1395–1933, 1994). Man nimmt an, dass die Chemokinfamilie bei der Infiltration von Entzündungsherden durch Lymphozyten und Monozyten von entscheidender Bedeutung ist.
Höchstwahrscheinlich wird man noch mehr immunmodulierende virale Gene entdecken. Diese und verwandte Genprodukte liefern nicht nur nützliche Werkzeuge, um die verschiedenen Waffen der antiviralen Abwehrmechanismen des Wirtes herauszufinden, sondern sie ermöglichen auch neue Untersuchungen zur Identifikation neuartiger Elemente des zellulären Immunrepertoires und neuer Klassen von Arzneistoffen, um Entzündung und Dysregulation des Immunsystems zu unterdrücken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen zufällig entdeckten, neuen, löslichen, virusspezifischen Inhibitor für eine Cytokin-Klasse, die an der Chemotaxis der Leukozyten beteiligt ist und in ihrer Gesamtheit als "Chemokine" bezeichnet wird. Das Protein der Erfindung ist ein Typ I "chemokinbindendes Protein" (CBP-I) und ein Genprodukt des T7-Gens des Myxomavirus, von dem man bereits nachgewiesen hatte, dass es das Homolog des Interferon-γ-(IFN-γ)-Rezeptors codiert. In starkem Gegensatz zur extremen Spezifität des T7-Genproduktes für den Liganden des Kaninchens (IFN-γ), bindet das CBP-I vorliegender Erfindung jedoch sehr gut an Chemokine der Maus und des Menschen. Das CBP-I und verwandte Homologe, die von anderen Pockenviren codiert werden, sind anwendbar zur Behandlung einer Vielzahl von Entzündungserkrankungen, bei denen ein exzessiver Leukozyteneinstrom mit dem pathogenen Prozess einhergeht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1A zeigt eine SDS-PAGE von I¹²⁵-markiertem IL-8, RANTES und MIP-1β nach Exposition mit pockenviral-sekretierten Proteinen. 1B zeigt eine SDS-PAGE von I¹²⁵-MIP-1β in Myxoma- oder Ectromelia-Viren infizierten Zellen.
2 zeigt eine SDS-PAGE von I¹²⁵-markiertem RANTES, als Ligand für Myxoma-sekretierte Proteine und Verdrängung mit nichtmarkiertem RANTES, MIP-1β, MIP-1α, IL-8 und MCP-1.
3A und 3B zeigt eine SDS-PAGE von I¹²⁵-markiertem MIP-1 β, als Ligand für sekretierte Proteine des Pockenvirus und Verdrängung mit nichtmarkiertem MIP-1β,IFN-γ, MCAF, MIP-1α, RANTES und IL-8. 3A zeigt Myxoma, Vaccinia und SFV. 3B zeigt Myxoma, Kuhpocken, Kaninchenpocken, Ectromelia und SFV.
4 zeigt eine SDS-PAGE von I¹²⁵-markiertem IL-8, als Ligand für sekretierte Proteine von Myxoma und Verdrängung mit nichtmarkiertem MIP-1 β, IFN-γ, MCAF und MIP-1 α.
5 zeigt einen Westernblot, der T7-Protein zeigt, nachdem es mit verschiedenen Cytokinen (IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IFNα und IFN-γ) in Wechselwirkung getreten ist.
6 zeigt einen Westernblot, der T7-Protein zeigt, nachdem es mit verschiedenen Chemokinen (RANTES, MCP-1, MCP-3, IL-8, PF4, IP-10, NAP-2, MGSA und Lymphotactin) in Wechselwirkung getreten ist.
7 zeigt eine SDS-PAGE sämtlicher Proteine von Myxoma-infizierten BGMK-Zellen, halbgereinigten Proteinen nach Mono-Q-Fraktionierung und gereinigten CBP-1(T7)-Proteinen nach Superdex-75-Gelfiltration.
8 zeigt Bindung von menschlichem RANTES-Chemokin an gereinigtes/teilweise gereinigtes CBP-1. Die Silberfärbung zeigt einen kreuz verbundenen Komplex (CBP-I+Rantes) von ungefähr 47 kDa, wenn entweder gereinigtes oder teilweise gereinigtes CBP-I mit Rantes inkubiert wurde (Bahnen 2 und 4); ohne RANTES wurde kein durch Gelmobilität bewegter Komplex beobachtet (Bahnen 1 und 3).
9 zeigt die Bindung von menschlichem RANTES-Chemokin an teilweise gereinigtes CBP-I. Die Silberfärbung bringt einen kreuz-verbundenen Komplex (CBP-I+Rantes) von ungefähr 47kDa zum Vorschein, wenn CBP-I mit biotiniliertem Rantes (Bahnen 2–6) inkubiert wird und diese Bindung kann mit abnehmenden Mengen des nicht-markierten Chemokinliganden austitriert werden.
10A zeigt die Belags-Dicke/-Tiefe (mm) eines atherosklerotischen Belages in einer arteriellen Verletzung im Rattenmodell 1 Monat nach CBP-1(T7)-Behandlung.
10B und 10C zeigen die Belagsfläche (mm²) eines atherosklerotischen Belages in einer arteriellen Verletzung im Rattenmodell 1 Monat nach CBP-1(T7)-Behandlung.
11 zeigt die Belagsdicke (mm²) eines atherosklerotischen Belages in einer arteriellen Verletzung im Kaninchenmodell 1 Monat nach CBP-1(T7)-Behandlung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ergebnisse vorliegender Erfindung liefern eine wichtige neue Quelle antiimmuner Proteine, die das Potential zur Behandlung einer großen Auswahl immunpathologischer Beschwerden haben, die während einer Entzündung und als Immunantwort auf Beschädigung, Infektion und verschiedene Krankheitszustände einhergehen mit dem Umleiten von Lymphozyten und Monozyten aus dem Kreislauf hin zu den Geweben.
Das exemplarische Typ 1 chemokinbindende Protein (CBP-I) vorliegender Erfindung ist das von Myxoma-Virus-infizierten Zellen hauptsächlich abgesonderte Protein und wird vom offenen M-T7-Lesebereich codiert (Upton, et al., Science, 258: 1369, 1992; und GenBank Zugang Nr.: M81919; SEQ ID Nr.: 1 und SEQ 1D Nr.: 2). Dieses Protein hat signifikante Sequenzähnlichkeit mit den Interferon-gamma (IFN-γ)-Rezeptoren des Menschen und der Maus. Des weiteren bindet das Myxoma-M-T7-Protein spezifisch an IFN-γ des Kaninchens, nicht jedoch an IFN-γ der Maus oder des Menschen (Mossman, et al., J. Biol. Chem., 270: 3031–3038, 1995).
Der Begriff "chemokinbindendes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das an eines oder mehrere Chemokine bindet und sie hemmt. Ein "Chemokin" ist eine Cytokinklasse, die verantwortlich ist für die Chemotaxis der Leukozyten. Die α-Klasse der Chemokine wird mit C-X-C bezeichnet (wobei X für eine beliebige Aminosäure steht) und enthält Interleukin-8 (IL-8), bindegewebsaktivierendes Protein III (CTAP-III), Melanozytenwachstum-stimulierende Aktivität (MGSA) gro/MGSA, IFNγ-induzierbares Protein (IP-10), Neutrophile-aktivierendes Peptid 2 (NAP2), β-Thromboglobulin und aus dem Epithel stammende, Neutrophile-anlockende-78 (ENA-78); die β-Klasse, bezeichnet als C-C, enthält T-Zellen-aktivierendes Gen-3 (TCA-3), Monozyten-chemotaktische Proteine (MCP-1, 2 und 3), Makrophagenentzündungsproteine (MIP-1 α und β) und während der Aktivierung regulierbares, normales T-exprimiertes und abgesondertes Protein – (RANTES).
Andere Chemokine können mit den im Fachgebiet üblichen Methoden ermittelt werden. Zum Beispiel kann man ein Molekül mit der Boyden-Kammer testen, das das bevorzugte Versuchssystem für Mikrochemotaxis für in vitro-Untersuchung chemisch anziehender Substanzen ist. Man macht in einen Plexiglasblock eine Reihe von Vertiefungen, wobei jede Vertiefung aus zwei Kammern besteht, einer unteren und einer oberen, die voneinander durch einige poröse Filterarten, wie zum Beispiel Nitrozellulose und Polycarbonat, getrennt werden. Die zu untersuchenden Zellen, zum Beispiel einkernige Zellen des peripheren Blutes (PBMC), werden in die obere Kammer jeder Vertiefung und die Testsubstanz, z. B., die chemisch anziehende Substanz, wird in die untere Kammer hinzugefügt. Falls nun die Zellen in der oberen Kammer von der Substanz in der unteren Kammer angezogen werden, werden sie entlang des theoretischen Konzentrationsgradienten, der für die Lösung gilt, wandern, durch die Poren des Filters gelangen und sich an seiner Unterseite anlagern.
Polypeptide, die vermutlich Mitglieder der Chemokinfamilie sind, können jetzt mit Hilfe des CBP-I der Erfindung durchgemustert werden. Daher liefert die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Durchmustern und Identifizieren neuartiger Chemokine umfassend das Inkontaktbringen von freiem oder Matrixgebundenem CBP-I der Erfindung mit einer Zusammensetzung, die vermutlich eines oder mehrere Chemokine enthält und den Nachweis der Bindung von CBP-I an die Zusammensetzung. Nachweisverfahren der Bindung von CBP-I an die Zusammensetzung (Chemokine) sind dem Fachmann bekannt und schließen die in den BEISPIELEN beschriebenen ein.
Falls gewünscht, kann man verschiedene Markierungen als Mittel zum Nachweis der Bindung von CBP-I an ein Chemokin verwenden. Chemokine oder das CBP-I können direkt oder indirekt nachweisbar markiert werden, zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszenten Verbindung, einer chemolumineszenten Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym. Der Durchschnittsfachmann wird noch andere passende Markierungen kennen oder in der Lage sein, solche mit Routineversuchen herauszufinden.
In einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung eines entzündungshemmenden Typ I-Chemokin-bindenden Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer immunpathologischen Erkrankung in einem Individuum, wobei das entzündungshemmende Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Molekulargewicht von 30–40 kDa aufweist, abhängig vom Glykosylierungsgrad, der mittels reduzierter SDS-PAGE ermittelt wurde, dass es eine Aminosäuresequenzhomologie mit dem Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog hat und dass es die biologische Funktion des Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomologs hat. Der Begriff "entzündungshemmend" bezieht sich auf die Reduzierung oder Unterdrückung einer Entzündungsreaktion.
Die glykosylierte und sezernierte Form des exemplarischen CBP-1 der Erfindung hat ein Molekulargewicht von etwa 38 kDa, was unter reduzierenden Bedingungen an einer SDS-PAGE ermittelt wurde. Zusätzlich hat das Protein eine Homologie mit dem Myxoma-T7-IFN-γ-Rezeptorhomolog. Der Begriff "Homologie" bezieht sich auf den Grad der Identität zwischen dem CBP-1 und dem viralen IFN-γ-Rezeptor auf Aminosäureebene. Bevorzugterweise hat das CBP-1 zwischen 50–95% Aminosäuresequenzhomologie mit dem Myxoma-T7-IFN-γ-Rezeptor. Die Homologie-Anforderung ist nicht zwingend, das CBP-I muss jedoch die biologische Funktion des Myxoma-T7-IFN-γ-Rezeptors beibehalten. Mit anderen Worten, die Homolgie ist ausreichend, solange das CBP-I an Chemokine bindet und sie hemmt.
Die Erfindung schließt ein funktionelles Polypeptid, das CBP-1, und funktionelle Fragmente davon ein. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "funktionelles Polypeptid" auf ein Polypeptid, das eine biologische Funktion oder Aktivität besitzt, die mittels definiertem zweckmäßigen Versuch ermittelt wird und verbunden ist mit einer bestimmten biologischen, morphologischen oder phänotypischen Antwort. Funktionelle Fragmente des CBP-I-Polypeptids umfassen Fragmente des CBP-1, so lange die Aktivität des CBP-1 bestehen bleibt (z. B. Bindung an Chemokine). Kleinere Peptide, die die biologische Aktivität des CBP-I enthalten, gehören zur Erfindung. Solche Peptide können mit Methoden, die dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt sind, einschließlich der Methoden der hier beschriebenen BEISPIELE, auf ihre Bindung an Chemokine hin überprüft werden. Die biologische Funktion kann variieren von einem Polypeptidfragment, das so klein ist wie ein Epitop an das ein Antikörpermolekül binden kann, bis hin zu einem großen Polypeptid, das in der Lage ist, an der charakteristischen Induktion oder Programmierung phänotypischen Veränderungen innerhalb einer Zelle mitzuwirken. Ein "funktionelles Polynucleotid" bedeutet ein Polynucleotid, das ein funktionelles Polypeptid, wie es hier beschrieben wird, codiert.
Kleinere Modifikationen der Hauptaminosäuresequenz des CBP-I können zu Proteinen führen, die, verglichen mit dem hier beschriebenen CBP-I-Polypeptid, im wesentlichen die gleiche Aktivität haben. Derartige Modifikationen können beabsichtigt sein, wie bei einer Genort-Mutagenese oder sie sind spontan. Sämtliche durch diese Modifikationen produzierten Polypeptide sind hier eingeschlossen, so lange die Aktivität des CBP-1 erhalten bleibt. Des weiteren kann die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren ebenso zu einer Modifikation der Struktur des daraus resultierenden Moleküls führen, ohne seine Aktivität signifikant zu ändern. Dies kann zur Entwicklung eines Moleküls mit geringerer Aktivität führen, das breiter anwendbar ist. So ist es zum Beispiel möglich, Aminosäuren am Amino- oder Carboxyl-Ende zu entfernen, die für die CBP-I-Aktivität nicht benötigt werden.
Das CBP-I-Polypeptid der Erfindung schließt auch konservative Variationen der Polypeptidsequenz ein. Der Begriff "konservative Variation" wie er hier benutzt wird, bedeutet den Ersatz eines Aminosäurerestes durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen beinhalten den Ersatz eines hydrophoben Restes wie etwa Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, oder den Ersatz eines polaren Restes, wie etwa den Ersatz von Arginin für Lysin, Glutamin- für Asparagin-Säure, oder Glutamin für Asparagin, usw. Der Begriff "konservative Variation" beinhaltet auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht-substituierten ursprünglichen Aminosäure, vorausgesetzt, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid angezogen werden, auch mit dem nicht-substituierten Polypeptid immunoreagieren.
Beispiele für virale Quellen des CBP-1, das im Verfahren vorliegender Erfindung verwendet wird, sind das Myxomavirus, Kuhpocken-, Shope-Fibromavirus, Ectromelia-, Kaninchenpocken- und andere Säuger-Pockenviren, so lange das CBP-I die biologische Funktion eines entzündungshemmenden Proteins hat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es abhängig vom Glykosilierungsgrad ein Molekulargewicht von 30–40 kDa aufweist, dass es eine Homologie mit dem Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog hat und dass es die biologische Funktion des Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog hat.
Eine immumpathologische Erkrankung, die mit dem Arzneimittel der Erfindung behandelt wird, kann verbunden sein mit der Produktion von Chemokinen und daraus folgender Akkumulation reaktiver Leukozyten in den betroffenen Geweben. Der Begriff "immunpathologische Erkrankung" bezieht sich auf jede Krankheit, die allgemein die Immunantwort oder die Immunität einschließt. "Therapeutisch wirksam" bezieht sich hier auf die Menge an CBP-I, die ausreichend ist, um die Ursache der immumpathologischen Erkrankung zu verringern. "Verringern" bezieht sich auf eine Verminderung des schädigenden Effektes der Erkrankung beim therapierten Patienten. Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist der Mensch, es ist jedoch vorstellbar, dass jedes Tier mit einer immumpathologischen Erkrankung mit dem Verfahren der Erfindung behandelt werden kann, zum Beispiel eine SCID-Maus, der menschliches Knochenmark transplantiert wurde (humanisierte SCID). Beispiele für immumpathologische Erkrankungen, die mit dem Verfahren der Erfindung behandelt werden können, sind die erworbene Immunschwäche-Erkrankung (AIDS), das toxische Schocksyndrom, Allotransplantat-Abstoßungsreaktion, artherosklerotisches Plaque-Wachstum, Ultraviolett- und Röntgenreaktionen, sowie Erkrankungen, die während der Immunreaktion und der Akutphase-Reaktion einhergehen mit einer Aktivierung von T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen und anderen Entzündungs-Leukozyten, sowie Erkrankungen, die bei fortgeschrittener Krebserkrankung auftreten, wie etwa die Tumornekrosefaktor-vermittelte Cachexie.
Die Erfindung liefert ein Arzneimittel zur Behandlung oder Linderung einer immunpathologischen Erkrankung, einschließlich Endotoxämie oder septischem Schock (Sepsis) oder einem oder mehreren Sepsis-Symptomen, umfassend die Anwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von CBP-I bei einem Individuum mit Sepsis-Symptomen oder mit dem Risiko einer Sepsis-Entwicklung. Der Begriff "Linderung" bezieht sich auf eine Abnahme oder eine Verringerung der Symptome der behandelten Erkrankung.
Ein Patient, der Symptome einer immumpathologischen Erkrankung aufweist, kann zusätzlich zur Behandlung mit dem Arzneimittel, das das CBP-I enthält, mit einem Antibiotikum oder einem antiviralen Mittel behandelt werden. Typische Antibiotika sind Aminoglykoside, wie etwa Gentamycin oder ein Beta-Lactam, wie etwa Penicillin, oder Cephalosporin. Deshalb schließt ein durch die Erfindung bereitgestelltes therapeutisches Verfahren die Einnahme einer therapeutisch wirksamen Menge eines Arzneimittels, das CBP-I enthält, bei im wesentlichen gleichzeitiger Einnahme einer bakteriziden Menge eines antibiotischen Mittels oder einer ausreichenden Menge eines antiviralen Mittels, ein.
Der hier verwendete Begriff "bakterizide Menge", bezieht sich auf eine Menge, die ausreicht, um im Blut des Patienten, der behandelt wird, eine bakterienabtötende Konzentration zu erreichen. Die bakterizide Konzentration eines Antibiotikums, die man zur Behandlung eines Menschen im allgemeinen als sicher anerkennt, ist im Fachgebiet gut bekannt, und variiert, wie man im Fachgebiet weiß, mit dem spezifischen Antibiotikum und dem Typ der bakteriellen Infektion, die behandelt wird. Vorzugsweise geschieht die Einnahme eines Arzneimittels, das CBP-I enthält, innerhalb von ungefähr 48 Stunden, noch besser innerhalb von ungefähr 2–8 Stunden und am besten im wesentlichen gleichzeitig mit der Einnahme des Antibiotikums.
Die Einnahme eines Arzneimittels, das CBP-I enthält, kann auch zur Linderung einer Postreperfusionsverletzung verwendet werden. Bei der Behandlung einer arteriellen Thrombose ist die Auslösung einer Repertusion durch Blutgerinnsel auflösende Mittel, wie etwa dem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA), häufig verbunden mit einer Gewebsschädigung. Man nimmt an, dass ein derartiger Gewebeschaden zumindest teilweise durch Leukozyten vermittelt wird, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, polymorphkernige Leukozyten (PMN). Deshalb würde die Einnahme eines Arzneimittels, das CBP-I enthält, die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten oder PMN und Endothel blockieren und dabei eine Postreperfusionsverletzung vermindern oder verhindern. Die Einnahme des Arzneimittels ist auch nützlich zur Prävention eines Neubeginns und von wiederholtem artherosklerotischem Plaque-Wachstum nach einer arteriellen Verletzung. Man nimmt an, dass Restenose und neues Wachstum von Plaques durch die lokale Entzündungsreaktion an der inneren Schicht der Arterienwand verschlimmert wird.
Das Arzneimittel der Erfindung ist auch nützlich zur Behandlung einer Entzündung aufgrund von allergischen – oder Autoimmunerkrankungen. Beispiele für allergische Erkrankungen sind allergische Rhinitis, Asthma, atopische Dermatitis und Lebensmittelallergien. Beispiele für Autoimmunerkrankungen, bei denen das Immunsystem wirtseigenes Gewebe angreift, sind unter anderem der Typ 1 Insulinabhängige Diabetes mellitus, entzündliche Darmerkrankung, Dermatitis, Meningitis, thrombotisch-thrombozytopenische Purpura, Sjögren's Syndrom, Enzephalitis, Uveitis, Leukozytenadhäsionsmangel, rheumatoide und andere Formen einer immunbedingten Arthritis, rheumatisches Fieber, Reiter's Syndrom, psoriatische Arthritis, progressive systemische Sklerose, primäre biliäre Zirrhose, Pemphigus, Pemphigoid, nekrotisierende Vaskulitis, Myastenia gravis, multiple Sklerose, Lupus erythematodes, Polymyositis, Sarkoidose, Granulomatose, Vaskulitis, perniziöse Anämie, ZNS-Entzündung, Antigen-Antikörper-Komplex vermittelte Erkrankungen, autoimmunbedingte hämolytische Anämie, Hashimoto's Thyreoiditis, Morbus Basedow, habituelle spontane Aborte, Reynard's Syndrom, Glomerulonephritis, Dermatomyositis, chronische aktive Hepatitis, Zöliakie, autoimmunbedingte Komplikationen bei AIDS, atrophische Gastritis, Spondylitis ankylosans und Addison-Krankheit.
Das Arzneimittel ist auch verwendbar zur Behandlung gutartiger oder immunologisch bedingter zellvermehrender Krankheiten wie etwa Psoriasis, Pemphigus vulgaris, akutes respiratorisches Insuffizienz-Syndrom (ARDS), ischämische Herzerkrankung, Artherosklerose, Postdialysesyndrom, Leukämie, erworbenes Immunschwächesyndrom, septischer Schock und andere Formen einer akuten Entzündung, sowie Lipid-Histiozytose. Grundsätzlich wird jede Krankheit, die ätiologisch verknüpft ist mit dem entzündlichen Prozess und mit einer durch die Chemokinproduktion (z. B., Induktion einer IL-8-, MIP-1α- oder β-Expression) ausgelösten zellulären Infiltration, als möglicherweise behandelbar eingestuft.
Das Arzneimittel der Erfindung ist auch verwendbar zur Behandlung mikrobieller Infektionen. Viele Mikroben, wie Bakterien, Rickettsien, verschiedene Parasiten und Viren, binden an das vaskuläre Endothel und an Leukozyten, und lösen eine Entzündungsreaktion aus, die zum Beispiel zur Interleukinproduktion führt. Somit kann das CBP-I, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird, einem Patienten gegeben werden, um eine mit derartigen Infektionen verbundene Entzündung zu verhindern.
Der Dosierungsrahmen für die Einnahme des Arzneimittels, das CBP-I enthält, ist somit groß genug, um den erwünschten Effekt bei dem die Symptome der Immunantwort in einem gewissen Grad unterdrückt werden, zu produzieren. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, dass es zu ungünstigen Nebenwirkungen, wie etwa unerwünschten Kreuzreaktionen, anaphylaktischen Reaktionen usw. kommt. Im allgemeinen variiert die Dosierung je nach Alter, Beschwerden, Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit des Patienten und kann vom Fachmann bestimmt werden. Die Dosierung kann vom individuellen Arzt im Falle von Kontraindikationen eingestellt werden. Die Dosierung kann variieren von etwa 10pg bis 100 μg pro Dosierung, von einer oder mehreren Einnahmedosen täglich und für einen oder mehrere Tage.
Das Arzneimittel, das CBP-I enthält, kann auf jede passende Art eingenommen werden, einschließlich parenteraler, subkutaner, intrapulmonaler, intraarterieller, intrarektaler, intramuskulärer und intranasaler Einnahme. Parenterale Infusionen umfassen intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle oder intraperitoneale Einnahme. Das Arzneimittel kann zum Beispiel auch transdermal in Form eines den Wirkstoff langsam abgebenden subkutanen Implantates oder oral in Kapselform, als Pulver oder als Granula eingenommen werden. Das Arzneimittel kann auch inhaliert werden. So wäre zum Beispiel bei einer therapeutischen Anwendung zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung der Lungen ein lungengängiges Aerosol die bevorzugte Einnahmeart.
Pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen zur parenteralen Einnahme umfassen sterile, wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösemittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie etwa Olivenöl und injizierbare organische Ester wie etwa Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich physiologischer Kochsalzlösung und gepufferter Medien. Parenterale Vehikel sind Natriumchloridlösung, Ringer's Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, mit Milchzucker versetzte Ringerlösung oder nicht-flüchtige Öle. Der aktive therapeutische Bestandteil wird oft gemischt mit Excipienten, die pharmazeutisch verträglich und mit dem aktiven Bestandteil kompatibel sind. Passende Excipienten sind Wasser, Salz, Dextrose, Glycerol und Ethanol oder Kombinationen davon. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nahrungsergänzungsmittel sowie Elektrolytergänzer, wie etwa diejenigen auf Basis von Ringer's Dextrose und ähnliche. Konservierungsmittel und andere Zusätze, wie zum Beispiel antimikrobielle, antioxidierende und chelierende Mittel, inerte Gase und ähnliche, können auch hinzugefügt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Proteins der Erfindung zur Herstellung eines Medikamentes oder Arzneimittels, das zur Therapie einer unerwünschten Immunantwort/Entzündungsreaktion verwendet werden kann, wobei die Immunantwort zur Produktion von Chemokinen führt, die an das CBP-I vorliegender Erfindung binden.
Die Erfindung liefert ein Arzneimittel umfassend mindestens eine Dosis einer immuntherapeutisch wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Proteins, das je nach Glykosylierungsgrad ein Molekulargewicht von 30–40 kDa, eine Aminosäuresequenzhomologie mit dem Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog und die biologische Funktion des Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomologs hat, in einem pharmakologischen Träger.
Die Erfindung liefert pharmazeutische Zubereitungen und Arzneimittel, die das CBP-I der Erfindung enthalten für vorstehend beschriebene Verwendungen. Die Form hängt von der Einnahmeart ab. So können zum Beispiel Injektionszubereitungen in Form einer Ampulle geliefert werden, wovon jede eine Dosiseinheit enthält oder in Form eines Behälters mit mehreren Dosen.
CBP-I kann in die therapeutische Zubereitung als neutralisierte pharmazeutisch verträgliche Salzformen formuliert werden. Diese umfassen die Säureadditionsalze, die mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie etwa Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure usw. gebildet werden. Zu den Salzen gehören auch diejenigen, die aus anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium- oder Eisenhydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain usw. gebildet werden.
Man erreicht eine kontrollierte Freisetzung, indem man passende Makromoleküle auswählt, zum Beispiel Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidin, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Protaminsulfat oder Lactid/Glykolid Copolymere. Die Freisetzungsrate des CBP-1 ist durch Verändern der Konzentration des Makromoleküls kontrollierbar.
Ein anderes Verfahren zur Kontrolle der Wirkdauer umfasst das Einbinden von CBP-I in Teile einer polymeren Substanz wie etwa Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polylactid/Glykolid-Copolymeren oder Ethylenvinylacetat-Copolymeren. Alternativ ist es möglich, das CBP-I in Mikrokapseln einzubauen, die zum Beispiel durch Coacervations-Techniken oder durch Grenzflächen-Polymerisation, zum Beispiel mittels Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrolat)-Mikrokapseln oder in einem kolloidalen System zur Freisetzung des Arzneistoffes, hergestellt wurden. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrospheren, Perlen und Systeme auf Lipidbasis, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposomen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, ohne sie jedoch zu begrenzen. Obgleich sie üblicherweise angewendet werden, kann der Fachmann alternativ andere Verfahren verwenden.
BEISPIEL 1
MATERIALIEN UND METHODEN
Rattenmodell der durch eine Verletzung ausgelösten Artherosklerose
Neun Sprague-Dawley-Ratten erhielten eine durch Ballon-Angioplastie ausgelöste Verletzung der linken iliofemuralen Arterie. Ein 1,5mm USCI Angioplastie-Ballonkatheter wurde rückläufig in die Arterie geschoben via Schnitt und Arteriotomie unter Pentobarbitol-Vollnarkose (6,5mg pro 100g Gewicht durch i. m. lnjektion, Somnotrol, MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario). 500pg CBP-1 (6 Ratten) oder Salzlösung (5 Ratten) wurde mittels intra-arterieller Injektion des CBP-I oder der Kontrolllösung in das distale Lumen des Angioplastie-Ballonkatheters oberhalb der durch den Ballon verletzten Stelle, gegeben. Dann wurde der Ballon für 1,0 Minuten auf einen Druck von 8 Bar aufgepumpt. Nach der Angioplastie wurde der Ballon entleert und entfernt und die Arteriotomie-Stelle unter örtlicher Applikation von n-Butylcyanoacrylatmonomer (Nexaband, Veterinary Products Laboratories, Phoenix, Arizona) verschlossen. Jede Ratte wurde bei rattenüblicher Diät gehalten und über 4 Wochen postoperativ beobachtet. Anschließend wurden die Ratten mit 2,0 ml Euthanyl pro kg getötet und die Aorta wurde zur histologischen Untersuchung entnommen.
Kaninchenmodell der durch eine Verletzung ausgelösten Artherosklerose Sieben mit Cholesterin gefütterte White-New-Zealand-Kaninchen erhielten eine Ballon-Angioplastie der distalen abdominalen Aorta. Alle Kaninchen (White New Zealand-Stamm) wurden an 4 Tagen/Woche mit einer Diät mit 2% Cholesterin in 10% Erdnußöl gefüttert, beginnend 2 Wochen vor der Verletzung durch den Ballon. Ein 3–3.5mm Angioplastie-Ballonkatheter (≥ 1 : 1 Verhältnis des Ballondurchmessers zum Aortadurchmesser) wurde via Femoralarterie unter Anästhesie (40 mg/kg Ketalean, 8 mg/kg Xylazen und 0,5 mg/kg Azepromazin durch i. m. lnjektion) eingeführt. Der Ballon wurde in der distalen Aorta mit einem Druck von 8 Bar aufgepumpt und rückläufig zur distalen Thorax-Aaorta geschoben. Der Ballon wurde bei jedem Kaninchen unter fluoroskopischer Kontrolle 3mal vor- und zurückgeschoben, um die endotheliale Denudierung sicherzustellen. Kontrastangiogramme wurden vor dem und nach dem durch die Ballon-Angioplastie verursachten Trauma aufgezeichnet, sowie 4 Wochen danach. Sofort nach dem femoralen Zugang wurde Heparin (400 Einheiten) gegeben, um das Risiko einer katheterbedingten Thrombose zu verringern.
Gereinigtes CBP-1 -(T7)-Protein, 500pg pro Probe, wurde sofort nach der durch den Ballon verursachten Verletzung in die distale abdominale Aorta der 4 Kaninchen injiziert. Parallel dazu wurde eine Infusion mit Salzlösung bei 3 Kaninchen lokal in die distale abdominale Aorta injiziert. Jedes Infusat mit einem Total-Volumen von 10 ml gelöst in steriler 0,9% Salzlösung wurde sofort nach der durch den Ballon verursachten Verletzung via Wolinsky-Katheter verabreicht. Sämtliche Infusionen erfolgten via 3,25mm Wolinsky-Ballon (aufgepumpt auf einen Enddruck von 6 ± 1 Bar für 2 Minuten) in die abdominale Aorta proximal zur iliakalen Bifurkation. Der Wolinsky-Ballon wurde unter fluoroskopischer Kontrolle direkt oberhalb der iliakalen Bifurkation angebracht, so dass sich der Ballon regelmäßig zwischen 0,5–2,5cm oberhalb der Bifurkation befand und als primärer Infusionsort galt. Stromaufwärts gelegene sekundäre Stellen wurden in der Region oberhalb 2,5cm proximal zur iliakalen Bifurkation definiert. Bei allen Experimenten wurden die Infusionen sofort nach der durch den Ballon verusachten Verletzung via Wolinsky-Katheter mit einem Total-Volumen gelöst in steriler 0,9% Kochsalzlösung durchgeführt. Sämtliche Infusionen erfolgten via 3,25 mm Wolinsky-Ballon (aufgepumpt auf einen Enddruck von 6±1 Bar für 2 Minuten) in die abdominale Aorta proximal zur iliakalen Bifurkation.
CBP-I-Protein-Isolation und Reinigung
Das Myxoma T-7-Protein (CBP-I) wurde isoliert und gereingt wie im BEISPIEL 4 beschrieben.
Histologische und morphometrische Analyse
Die histologische Analyse wurde an der ersten Stelle der Wolinsky-Infusion in der distalen abdominalen Aorta (Kaninchen) oder in den oberen iliofemuralen arteriellen Verzweigungen (Ratte) durchgeführt, die den ersten Infusionsort, wie er durch die ursprüngliche Position des Perfusionsballons definiert ist, repräsentieren. Bei den Kaninchen wurden die inneren Kontrollbereiche von einem stromabwärts gelegenen, nicht-infusionierten Bereich nahe der iliakalen Bifurkation (0,5cm oberhalt) der Bifurkation bis 0,5cm unterhalb der Bifurkation) und einem stromaufwärts gelegenen, nicht-infusionierten Bereich (die obere Aorta, 2,5cm–3,5cm oberhalb der iliakalen Bifurkation) entnommen. Das Gebiet von 1,5–2,5cm oberhalb der iliakalen Bifurkation wurde je nach Ballonplazierung als Grenzzone mit möglicherweise variablen Infusionsdosen betrachtet und daher nicht in die Analyse einbezogen. Bei den Flatten wurden die ersten Ballonstellen sowohl für T-7-behandelte als auch für Kochsalzlösung-infundierte Ratten zur histologischen Beurteilung verwendet. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung der mit Formalin fixierten Proben wurde wie bereits beschrieben, durchgeführt. Kurz gesagt wurde jede Probe, wie bereits beschrieben, in 10% (v/v) Natriumphosphat gepuffertem Formalin fixiert, bearbeitet, imprägniert, in Paraffin eingebettet und mit dem Mikrotom in 5 μm Schnitte geschnitten. Schnitte jeder Probe (mindestens 2 Schnitte pro Probe) wurden dann mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und mit dem Lichtmikroskop untersucht.
Schwartzman-Reaktion
Weibliche White-New-Zealand-Kaninchen mit 3kg Gewicht bekamen eine Lipopolysaccharid (LPS) -Injektion des E, coli Serotyps 0111: B4 (Sigma) und CBP-1 (T7)-Protein, das mittels Säulenchromatographie homogenisiert worden war. Acht intradermale Injektionen (jede mit 0,1 ml) von jeweils 50–100μg LPS mit und ohne 0,1–1,0 μg CBP-1 wurden in den Kaninchenrücken appliziert; 4 Injektionsstellen an jeder Seite, etwa 2,5cm voneinander getrennt. 24 Stunden später wurden dem Kaninchen 100 μg LPS intravenös in die kleine Ohrvene verabreicht. Etwa 4–6 Stunden nach der intravenösen Injektion entwickelte sich eine nekrotische Entzündung an den Stellen der intradermalen Injektion. Sobald die Entzündung sichtbar war, wurde das Kaninchen mit einer letalen Euthanolinjektion getötet. Größe und Rötungsgrad der krankhaften Veränderungen wurden bewertet und Gewebeproben gesammelt.
BEISPIEL 2
CYTOKINBINDUNG AN EIN NEUARTIGES VIRALES PROTEIN
Erst vor kurzem hat man eine Vielzahl menschlicher Cytokine mit ¹²⁵I radioaktiv markiert, sie den abgesonderten Proteinen aus BGMK-Kontrollzellen oder Pockenvirus-infizierten BGMK-Zellen exponiert, sie vernetzt und dann mittels SDS-PAGE auf neuartige Cytokin/Protein-Komplexe hin untersucht.
Überraschenderweise enthüllte der Vernetzungs-Test eindeutig ein neuartiges virusspezifisches Protein, das an jedes der drei menschlichen Chemokine gebunden hat, das getestet wurde: IL-8, RANTES und MIP-1β (1). 1A zeigt Gel-Mobility-Shift-Assays mit iodierten Liganden und Gewebekulturüberständen. Gewebekulturüberstände (Sups) wurden folgendermaßen hergestellt: BGMK (Babynierenzellen der grünen Meerkatze) wurden mit Myxoma (MYX), mit dem Vacciniavirus (VV) oder mit dem Shope-Fibroma-Virus (SFV) mit dreifacher Infektionsrate (MOI) infiziert. Um frühe Sups zu erhalten, wurde die infizierte einzellige Schicht dreimal mit phophatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit serumfreiem Medium wieder aufgefüllt, das 4 Stunden p. i. (E) eingesammelt wurde. Späte Sups wurden durch dreimaliges Waschen der einzelligen Schicht mit PBS hergestellt und 4 Stunden p. i. mit serumfreiem Medium wieder aufgefüllt; diese Sups wurden dann 18 Stunden p. i. (L) eingesammelt. Pseudo-Sups wurden genauso hergestellt, aber ohne Virus. Die Sups wurden mittels Amicon-Konzentraten ungefähr 15-fach konzentriert. Die menschlichen Chemokine IL-8, RANTES und MIP-1 β wurden gemäß der Herstellerprotokolle unter Anwendung von iodperlen (Pierce) mit ¹²⁵I markiert.
Die Gel-Mobility-Shift-Assays wurden folgendermaßen ausgeführt: 5 μl des iodierten Liganden wurde gemischt mit 10 μl SUP und für 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Dann wurden 2 μl des chemischen Vernetzungsmittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodümid (EDC) (200mM in 100mM Kaliumphosphat, pH 7,5) für 15 Minuten hinzugefügt, gefolgt von weiteren 2 μl für 15 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl Tris-HCl (1,OM, pH 7,5) gequencht. Die entstandene Mischung wurde mittels SDS-PAGE und Autoradiografie analysiert. Die Pfeile zeigen die gewanderten Komplexe an.
1B zeigt das gleiche Experiment wie 1A, jedoch wurde iodiertes MIP-1β mit Pseudo-Sups, MYX-Sups oder Ectromelia-Sups (ECT) zur Reaktion gebracht.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit dem Shope-Fibroma-Virus (SFV) oder mit Myxoma (MYX) infizierte Zellen ein neuartiges Protein absonderten, das eine vernetzte Species (durch einen Pfeil markiert) von etwa 50kDa bildete, was darauf schließen ließ, dass die unbekannte Species, die mit den 12kDa-Liganden gebunden hat, etwa 38kDa aufwies. Bedeutenderweise wurde der neuartige Komplex nicht in Überständen von Kontrollzellen, die scheininfiziert worden waren oder von Zellen, die mit dem Vaccinia-Virus (VV) oder einem Pockenvirus einer anderen Art (Orthopockenvirus) als das SFV oder Myxoma (Leporipockenvirus) infiziert worden waren, gefunden.
2 zeigt Gel-Mobility-Shift-Assays mit ¹²⁵I-RANTES und Konkurrenten. iodiertes RANTES wurde gemischt mit dem 0, 1, 10 und 100-fachem molarem Überschuß eines nicht-markierten menschlichen RANTES, MIP-1β, MIP-1α, IL-8 oder MCAF. Diese Mischung wurde dann mit Pseudo- oder frühen Myxoma-Sups wie in 1A beschrieben in Reaktion gebracht und mittels SDS-PAGE und Autoradiografie analysiert. Die Abbildung zeigt Selbst-Verdrängung mit RANTES sowie Kreuz-Verdrängung mit MIP-1β, MIP-1α, IL-8 und MCAF. Die Pfeile zeigen auf die gewanderten Komplexe.
In 3A wurde iodiertes MIP-1β gemischt mit dem 0, 1, 10 und 100-fachen molaren Überschuß eines nicht-markierten menschlichen MIP-1β, IFN-γ, MCAF, MIP-1α, RANTES oder IL-8. Die Mischung wurde dann mit Pseudo-Sups oder frühen Myxoma-Sups wie in 1A beschrieben in Verbindung gebracht und mittels SDS-PAGE und Autoradiografie analysiert. Die Abbildung zeigt Selbst-Verdrängung mit MIP-1β sowie Kreuz-Verdrängung mit IFN-γ, MCAF, MIP-1α, RANTES und IL-8. Die Pfeile zeigen auf die gewanderten Komplexe.
In 3B wurde iodiertes MIP-1β mit Pseudo-, MYX-, Kuhpockenvirus- (CPV), Kaninchenpockenvirus- (RPV), ECT-, SFV- oder VV-Sups gemischt unter Anwendung von SDS-PAGE und Autoradiografie. Die Pfeile zeigen die gewanderten Komplexe und den freien Liganden.
In 4 wurde iodiertes IL-8 gemischt mit dem 0, 1, 10 und 100-fachen molaren Überschuß eines nicht-markierten menschlichen MIP-1β, MIP-1 a, MCAF oder IFN-γ. Diese Mischung wurde dann in Reaktion gebracht mit Pseudo- oder frühen Myxoma-Sups wie in 1A beschrieben und mittels SDS-PAGE und Autoradiografie analysiert. Die Abbildung zeigt Selbst-Verdrängung mit IL-8 sowie Kreuz-Verdrängung mit MIP-1α, MCAF und IFN-γ. Die Pfeile zeigen auf die gewanderten Komplexe.
Wie in 2 gezeigt, war es mit ¹²⁵I-markiertem RANTES als Ligand möglich, die Bindung mit einer Vielzahl von kalten Chemokin-Konkurrenten einschließlich RANTES, MIP-1β, MIP-1α, und MCP-1 herzustellen, nicht jedoch mit IL-8. In ähnlicher Weise wurde mit ¹²⁵I-MIP-1β als dem markierten Liganden eine Verdrängung mit nicht-markiertem MIP-1β, MCAF, MIP-1α und RANTES beobachtet, nicht jedoch mit IL-8 oder menschlichem IFN-γ (3). Bei Verwendung von markiertem IL-8 als Ligand, wurde jedoch eine Verdrängung mit kaltem IL-8 sowie mit MIP-1α, MIP-1β und MCAF beobachtet, aber nicht mit IFN-γ (4).
Es ist interessant, dass die C-X-C- und die C-C-Chemokine dieses seltsame Muster von Kreuz-Verdrängung haben, aber möglicherweise hängt das mit den verschiedenen Affinitätskonstanten dieser unterschiedlichen menschlichen Chemokine mit dem viralen Protein zusammen. Das offensichtlich weite Spektrum von Chemokin-Bindung an eine virale 38kDa Protein-Species läßt vermuten, dass dieses Protein ein allgemeiner Inhibitor vieler menschlicher Chemokine sein könnte und dadurch die Chemotaxis einer großen Vielzahl von Leukozyten verhindert.
In 5 wurde das T7-Protein (CBP-1) (siehe auch Beispiel 3) gereinigt, mit den genannten Cytokinen gemischt, verknüpft und mit SDS-PAGE analysiert; gefolgt von einem Westernblot mit anti-T7-Antikörpern. Von den getesteten Cytokinen bildete nur menschliches IL-8 und Kaninchen-IFN-γ hochmolekulare Komplexe mit T7, was auf die Spezifität dieser Bindung hinweist.
In 6 wurde ein Spektrum repräsentativer Chemokine der drei Hauptklassen (CXC, CC und C) hinsichtlich einer Bindung an das T7-Protein (CBP-I) getestet, wie in 5 beschrieben. Sämtliche getesteten Chemokine haben das T7-Protein gleich gut gebunden.
BEISPIEL 3
REINIGUNG VON CBP-I
Zur Reinigung von CBP-I wurden von Myxoma-infizierten Zellen abgesonderte Proteine konzentriert und dann erst mittels Mono-Q-Chromatografie und dann mit Größenfiltrationschromatografie fraktioniert. 7 zeigt die Reinigung von CBP-1 bis zur Homogenität aus Überständen der Myxoma-Virus infizierten Zellen. Kurz gesagt wurden Überstände von eine Nacht lang mit dem Myxoma-Virus-infizierten Babynierenzellen der grünen Meerkatze (BGMK) geerntet, bei 10.000 RPM 1 Stunde lang zentrifugiert und mit einer gerührten Ultrafiltrationszelle (Amicon) 10-fach konzentriert. Virus-freie konzentrierte Myxoma-Überstände (Sups) wurden in 20mM bis-Tris pH 6,0 (Sigma) dialysiert und vor der Reinigung bei 4°C aufbewahrt (Reihe 1). CBP-1 wurde aus Myxoma-Überständen mit einer 2-stufigen Reinigungsprozedur mittels Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) bis zur Homogenität gereinigt.
Kurz gesagt wurden 5mls Myxoma-Überstände auf eine Mono-Q-HR 5/5 (Pharmacia) Anionen-Austauschersäule geladen, die zuvor mit einem Startpuffer (20 mM bis-Tris pH 6,0) von geringer lonenstärke ins Gleichgewicht gebracht worden waren. Die Proteine wurden aus der Säule durch stufenweises Steigern des Elutionspuffers (1 M NaCl 20mM bis-Tris pH 6,0) auf 500mM NaCl eluiert. Proteinfraktionen wurden gesammelt, mit SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silberfärbung analysiert. Die Analyse der Proteine, die zwischen 150–200mM NaCl (Fraktionen 21–27) eluiert worden waren, erbrachte eine auffällige Bande von ungefähr 37.000 MW (CBP-I) und ein unbekanntes, kontaminierendes Protein mit ähnlicher Größe wie das Rinderserumalbumin (Reihe 2). Anschließend wurden gepoolte MonoQ-Fraktionen #21–27 auf eine HiLoad 16/60 Superdex 75 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) geladen und mit 20mM bis-Tris pH 6,0 bei einer Flußrate von 0,5 ml/min eluiert. Es wurden Fraktionen vom Ägivalent von 2 Säulenbettvolumina gesammelt, mit SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung analysiert. Die Fraktionen #26–31 aus dem Superdex 75 Durchflußvolumen brachten eine einzige Proteinspecies mit etwa 37 kDa entsprechend dem gereinigten CBP-I (Reihe 3) hervor.
Das endgültige CBP-1-Produkt (7) war ein glykosyliertes Protein von 38 kDa, das mit einer kleineren Komponente (35 kDa) zusammen gereinigt wurde, die eine weniger glykosylierte CBP-1-Variante zu sein schien.
1 μg des gereinigten oder teilweise gereinigten CBP-1 wurde für 2 Stunden mit oder ohne 1 μg des rekombinanten menschlichen RANTES bei Zimmertemperatur (RT) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proteine durch Zugabe von EDC (Sigma) zu 40mM (Endkonzentration) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur kreuz-verknüpft und durch Zugabe von 1/10 Volumen 1 M Tris (pH7,5) gequencht. Zu den Mischungen wurde SDS-loading-Puffer hinzugefügt, die Proben wurden für 3 Minuten gekocht, einer SDS-PAGE unterworfen und durch Silberfärbung überprüft. Die Silberfärbung brachte einen kreuz-verknüpften Komplex (CBP-I + RANTES) von ungefähr 47kDa hervor, wenn entweder gereinigtes oder teilweise gereinigtes CBP-I mit RANTES (Reihen 2 und 4) inkubiert worden war, in Abwesenheit von RANTES (Reihen 1 und 3) konnte jedoch kein durch Gelmobilität bewegter Komplex beobachtet werden.
Wenn man das teilweise gereinigte (z. B., MonoQ allein) oder vollständig gereinigte CBP-I in Standard-Kreuz-Verknüpfungs-Assays mit menschlichem RANTES getestet hat, wurde – falls die Bindungsaktivität eine Eigenschaft von CBP-I allein (8 und 9) war – wie erwartet, der geeignete gewanderte 1 : 1 Komplex der CBP-I/Chemokine festgestellt. 9 zeigt die Bindung von menschlichem Rantes-Chemokin an teilweise gereinigtes CBP-1. 1 μg des teilweise gereinigten CBP-1 wurde mit (Reihe 1) oder ohne (Reihe 2–6) zunehmenden Mengen des rekombinanten menschlichen Rantes für 2 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proteine 30 Minuten lang durch Zugabe von EDC (Sigma) zu 40mM (Endkonzentration) bei RT verknüpft und durch Zugabe von 1/10 Volumen 1 M Tris (pH 7,5) gequencht. Zu den Mischungen wurde SDS-loading-Puffer hinzugefügt, die Proben wurden 3 Minuten gekocht, einer SDS-PAGE unterworfen und mittels Silberfärbung überprüft. Die Silberfärbung offenbarte einen kreuz-verknüpften Komplex (CBP-I + RANTES) von ungefähr 47kDa bei Inkubation von CBP-I mit Rantes (Reihen 2–6) und diese Bindung kann durch abnehmende Mengen des Chemokin-Liganden austitriert, werden. Eine einzelne, kontaminierende Bande von ungefähr 66kDa die auftaucht, ist ein unbekanntes Protein, das während der MonoQ-Chromatografie zusammen mit CBP-I fraktioniert, das aber durch Superdex 75 Chromatografie entfernt wird.
BEISPIEL 4
ANALYSE DER WIRKSAMKEIT VON CBP-I (T-7) ALS ANTI-RESTENOSE-PROTEIN WIE SIE BEI DER DURCH BALLON-ANGIOPLASTIE VERURSACHTEN VERLETZUNG DER FEMURALEN ARTERIEN VON RATTEN GEZEIGT WURDE
Man hat Entzündung assoziiert mit einer beschleunigten atherosklerotischen Belagsentwicklung in der arteriellen Wand. Es gibt eine hohe Rate wiederkehrender Beläge, die sog. Restenose, nach der Anwendung von Ballon-Angioplastie und anderen verwandten Angioplastie-Vorrichtungen, die man zur Öffnung von verstopften Arterien entwickelt hat. Es wurde auch von beschleunigtem atherosklerotischem Belagswachstum berichtet unter Bedingungen, die zu arteriellen Verletzungen führen, wie Virusinfektionen, Vaskulitis, Homocysteinurie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Hyperlipidorie, Rauchen und durch einen Immunkomplex erzeugte Störungen. Die größeren DNA-Viren haben mit den entzündungshemmenden Proteinen Mechanismen entwickelt, die es dem Virus ermöglichen, sich im Wirt bei abnehmender Hemmung durch dessen Immun- und Entzündungsabwehrmechanismen zu vermehren. Diese Beispiele demonstrieren die Verwendung viraler Proteine als potentielle entzündungshemmende Mittel zur Behandlung oder Prävention immunbedingter Störungen. CBP-I R-7) wurde als ein potentielles therapeutisches Mittel zur Prävention des Belagswachstums nach einer Angioplastie getestet. CBP-1 soll als Interferon-Gamma-Rezeptorhomolog und als Chemokin-Inhibitor wirken. CBP-1 wurde in 2 Tiermodellen (Ratte und Kaninchen) zur verletzungsbedingten Atherosklerose getestet und die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der Belagsbildung 4 Wochen nach der Infusion.
Nach der CBP-I-Infusion kam es im Vergleich zur Kochsalzlösungs-Infusion zu einer signifikanten Abnahme des Belagswachstums (10A–C). Im Rattenmodell wurde 4 Wochen nach der CBP-I-Infusion (p < 0,0003) eine mittlere Belagsfläche von 0,005 ± 0,002 mm² (10B, C) und eine mittlere Belagsdicke von 8,33 ± 4,01 μm (10A ) ermittelt. 4 Wochen nach der Infusion mit Kochsalzlösung (p < 0,0001) betrug die Belagsfläche 0,036 ± 0,006 mm² und die Belagsdicke 62 ± 7,35 μm. Dies stellt eine. 7-fache Abnahme der Belagsfläche und der Belagsdicke bei der CBP-I-Infusion dar. Die Abnahme der Belagsentwicklung wurde 4 Wochen nach nur einer einzigen CBP-I-Infusion direkt vor der ballonbedingten Verletzung beobachtet. Die sichtbaren Verletzungen bestanden vorwiegend aus zellulären proliferativen Veränderungen der glatten Muskeln, die charakteristisch für das Verletzungsmodell der Rattenarterien (10) waren.
Auch beim Kaninchenmodell gab es im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen eine signifikante Abnahme bei der Belagsfläche und -Dicke. 4 Wochen nach der CBP-I-Infusion lag der Mittelwert der Belagsdicke bei 30 ± 21,6 μm und bei 600 ± 200 μm nach der Kochsalzlösungs-Infusion (p < 0,02). In diesem Fall entsprach der beobachtete Belag dem üblicherweise bei Cholesterin-gefütterten Kaninchenmodellen (11) zu beobachtenden Belag aus Zellen mit fibrösem und fettigem Schaum.
Untersuchung der Anwendung eines viralen entzündungshemmenden Proteins in 2 Modellen einer verletzungsbedingten Atherosklerose (Kaninchen und Ratte). Bei beiden Modellen war bei der histologischen Analyse eine signifikante Abnahme der darauffolgenden Belagsbildung erkennbar. In jedem Fall wurde sofort nach der ballonbedingten Verletzung nur eine einzige Infusion des Proteins gegeben.
BEISPIEL 5
SCHWARTZMAN-REAKTION
Ein klassisches Beispiel für eine nekrotisierende Entzündung ist die Schwartzman-Reaktion, bei der ein Lipopolysaccharid (LPS) zuerst unter die Kaninchenhaut injiziert wird und dann, 24 Stunden später, wird das gleiche LPS in einer zweiten intravenösen Dosis gegeben. Binnen Stunden nach der zweiten LPS-Injektion, lösen infiltrierende Makrophagen eine reproduzierbare nekrotisierende Antwort an der ersten Injektionsstelle aus, die hochgradig reproduzierbar und leicht quantifizierbar ist. Die Fähigkeit von CBP-I, den Einstrom und die Aktivierung der Makrophagen an der ersten Injektionsstelle zu hemmen, wurde untersucht.
LPS wurde mit oder ohne gereinigtem T7-Protein intradermal am Rücken eines Kaninchens injiziert und 24 Stunden später wurde eine intravenöse LPS-Injektion verabreicht. An den Stellen der intradermalen Injektion kommt es schnell zu einer Entzündung und die Tiere wurden eingeschläfert und Daten gesammelt.
TABELLE 1 Schwartzman-Reaktion bei Kaninchen
Die Verletzungen wurden wie folgt bewertet: 1–10 mm Durchmesser, geringfügig gerötet, nicht erhaben (+); 1–10 mm Durchmesser, rot, 1–2 mm erhaben (++); 10-15 mm Durchmesser, intensiv gerötet, 2–3 mm erhaben (+++); mehr als 15 mm Durchmesser, intensiv rot mit einem dunklen hämorraghischen Zentrum, 2–3 mm erhaben (++++).
Die LPS (100μg) bedingten Verletzungen waren hämorraghisch und geschwollen, während die mit LPS(100 μg) plus CBP-1 (T7)-Protein behandelte Haut leicht gerötet und erhaben war. Wurde eine Dosis von 50 μg LPS verwendet, verhinderte 1 μg CBP-I sämtliche sichtbaren Zeichen der Schwartzman-Reaktion vollständig. CBP-I allein intradermal injiziert, mit anschließender intravenöser LPS-Injektion, löste keine Entzündung aus. Rinderserumalbumin (1,0 μg) injiziert mit 100μg LPS, mit anschließender intravenöser LPS-Injektion, konnte eine Entzündung nicht verhindern. Diese Experimente (n = 2) zeigen, dass gereinigtes CBP-I-Protein das Kaninchen vor der lokalisierten Schwartzman-Reaktion schützen kann.
Nachdem gezeigt werden konnte, dass T7 sowohl IFN-γ als auch Chemokine wie IL-8 und RANTES bindet, ist die Beteiligung dieser Cytokine an der Schwartzman-Reaktion von Interesse. Die Schwartzman-Reaktion beteiligt auf komplexe Art die Cytokine IL-12, IFN-γ, TNFα (Ozmen et al., J. Exp. Med., 180: 907–915, 1994) und IL-8 (Harada, et al., Int. Immunol., 5: 681–690, 1993). So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass neutralisierende Antikörper für IFN-γ (Billiau et al., Euro. J. Immunol., 17: 1851–1854, 1987; Heremans, J. Immunol., 138: 4175–4179, 1987) oder IL-8 (Harada et al., supra.) die Schwartzman-Reaktion blockieren oder hemmen. Somit könnte der inhibierende Effekt von CBP-I auf die Schwartzman-Reaktion beim Kaninchen auf seiner Fähigkeit beruhen, IFN-γ oder Chemokine oder beide zu binden. Da CBP-I artspezifisch an IFN-γ, nicht jedoch an Chemokine bindet, werden diese Experimente mit Ratten wiederholt, um zwischen der IFN-γ- und der Chemokin-Bindungsaktivität von T7 in diesem Entzündungsmodell zu unterscheiden.
ZUSAMMENFASSUNG:
Das geklonte und sequenzierte Myxoma CBP-I-Gen ist kein sezerniertes Homolog der bekannten Chemokin-Rezeptoren, die alle sieben membrandurchspannende Domänen haben (und als "Serpentine" bezeichnet werden) und in zahlreichen neueren Veröffentlichungen beschrieben werden (Kelvin, D. J., et al., J. Leukocyte Biol., 54: 604–612, 1993; Murphy, P. M., Ann. Rev. Imm., 12: 593–633, 1994; Horuk, R., Imm. Today., 15: 169–174, 1994; und Horuk, R., Trends in Pharm. Sci., 15: 159–165, 1994). Obgleich einige DNA-Viren tatsächlich Homologe dieser Serpentinen-Rezeptoren codieren (Ahuja, S. K., et al., Imm. Today, 15: 281–287, 1994), einschließlich mindestens eines Genkandidaten in einem Pockenvirus (Massung, R. F., et al., Virology, 197: 511–528, 1994), ist das CBP-1 der vorliegenden Erfindung kein Mitglied dieser besonderen Rezeptortamilie. Somit repräsentiert CBP-1 eine neue Klasse entzündungshemmender Proteine, das vermutlich wirkt, indem es ein Spektrum von Chemokinen in behandelten Geweben moduliert.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die derzeit bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, sollte es klar sein, dass verschiedene Modifikationen möglich sein können, ohne von der Erfindung abzuweichen.
Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Patentansprüche begrenzt.

Claims

Verwendung eines entzündungshemmenden Typ I-Chemokin-bindenden Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass es: ein Molekulargewicht von 30–40 kDa aufweist; eine Aminosäuresequenzhomologie mit dem Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog aufweist; und die biologische Funktion des Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomologs aufweist (SEQ 1D Nr. 1 und 2), für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln einer immunpathologischen Erkrankung in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die immunpathologische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus mikrobieller Infektion, bösärtigem Geschwür und Metastasierung, Asthma, koronare Restenose, Autoimmunkrankheiten, Zirrhose, Endotoxämie, Atherosklerose und Reperfusionsverletzung.
Arzneimittel, umfassend mindestens eine Dosis einer immuntherapeutisch wirksamen Menge eines entzündungshemmenden Typ I-Chemokin-bindenden Proteins, das ein Molekulargewicht von 30–40 kDa, eine Aminosäuresequenzhomologie mit dem Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomolog und die biologische Funktion des Myxoma-T7-Interferon-γ-Rezeptorhomologs aufweist, in einem pharmakologischen Träger.
Mittel nach Anspruch 3, wobei das entzündungshemmende Protein ein Typ I-Chemokin-bindendes Protein ist.
Mittel nach Anspruch 4, wobei das Chemokin ein α-Klasse- oder ein β-Klasse-Chemokin ist.
Mittel nach Anspruch 5, wobei das Chemokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CTAP-III, gro/MGSA, ENA-78, MCP-1, Interleukin-8, RANTES, MIP-1α und MIP-1β.
Verfahren zum Durchmustern und Identifizieren von Polypeptiden, von denen angenommen wird, dass sie Mitglieder der Chemokinfamilie sind, die das CBP-I (Typ I-Chemokin-bindendes Protein) verwenden, umfassend: (a) Inkontaktbringen von freiem oder Matrix-gebundenem CBP-1 mit einer Zusammensetzung, von der angenommen wird, dass sie ein oder mehrere Chemokin(e) enthält, und (b) Nachweis der Bindung von CBP-1 an die Zusammensetzung.