DE69830251T2

DE69830251T2 - Langes pentraxin ptx3 enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69830251T2
Application number: DE69830251T
Authority: DE
Inventors: Barbara Bottazzi; Martino Introna; Alberto Mantovani; Annunciata Vecchi
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: CA2315277C; WO1999032516A2; EP1034185B1; IT1298487B1; ATE295853T1; AU1782999A; EP1034185A2; KR20010033297A; AU756974B2; NZ505063A; PT1034185E; ITRM970796A1; JP2002503642A; JP4173633B2; US8003109B2; ES2242309T3; CA2315277A1; US20080015153A1; WO1999032516A3; KR100560085B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend das lange Pentraxin PTX3 (PTX3) oder eines seiner funktionellen Derivate. Insbesondere betrifft die Erfindung die vorstehenden Zusammensetzungen für die Therapie von infektiösen und entzündlichen Erkrankungen oder Tumoren.
Die Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, enthaltend die vollständige cDNA-Sequenz, kodierend für PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate, rekombinante Wirtszellen, transfiziert mit solchen Expressionsvektoren und ein Verfahren zur Erzeugung von PTX3 oder einem seiner funktionellen Derivate. Weiterhin betrifft die Erfindung Gentherapieverfahren für die Behandlung von Tumoren, basierend auf der Verwendung der vorstehenden Expressionsvektoren.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt hatten wir die biologische Funktion von PTX3 nicht vollständig verstanden, einem Protein, das in verschiedenen Zellarten exprimiert wird, insbesondere nach Aussetzung gegenüber den Entzündungszytokinen Interleukin 1β (IL-1β) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) in mononukleären Phagozyten und Endothelzellen.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt gab es auch keine Beschreibung irgendeiner therapeutischen Verwendung von PTX3 oder seiner funktionellen Derivate.
PTX3 besteht aus zwei Strukturdomänen, einem N-terminalen Ende, das mit keinem bekannten Molekül in irgendeiner Beziehung steht und einem C-terminalen Ende, das den kurzen Pentraxinen ähnlich ist, wie z.B. dem C-reaktiven Protein (CRP). Ein substanzieller Ähnlichkeitsgrad wurde zwischen menschlichem PTX3 (hPTX3) und tierischen PTX3-Arten gefunden.
Das PTX3-Gen ist auch dem Chromosom 3 der Maus in einem ähnlichen Bereich zu der menschlichen 3q-Region (q24-28) in Übereinstimmung mit der dokumentierten Stellung von hPTX3 im 3q 25-Bereich lokalisiert. Weiterhin ist das Maus-PTX3 (mPTX3) (Introna M., Vidal Alles V., Castellano M., Picardi G., De Gioia L., Bottazzi B., Peri G., Breviario F., Salmona M., DeGregorio L., Dragani T.A., Srinivasan N., Blundell T.L., Hamilton T.A. und Mantovani A.: Cloning of mouse PTX3, a new member of the pentraxin gene family expressed at extrahepatic sites. Blood 87 (1996) 1862-1872) dem hPTX3 sehr ähnlich im Hinblick auf Organisation, Stellung und Sequenz (Breviario F., d'Aniello E.M., Golay J., Peri G., Bottazzi B., Bairoch A., Saccone S., Marzella R., Predazzi V., Rocchi M., Della Valle G., Dejana E., Mantovani A., Introna M.: Interleukin-1-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component. J. Biol. Chem. 267:22190, 1992).
Insbesondere beträgt der Identitätsgrad zwischen den Sequenzen 82 % zwischen dem menschlichen und Maus-Gen und erreicht 90 %, wenn konservative Substitutionen mit betrachtet werden.
Der hohe Ähnlichkeitsgrad zwischen hPTX3- und mPTX3-Sequenzen ist ein Zeichen eines hohen Grades einer Konservierung von Pentraxin während der Evolution (Pepys M.B., Baltz M.L.: Acute phase proteins with special reference to C-reactive protein and related proteins (pentraxins) and serum amyloid A protein. Adv. Immunol. 34:141, 1983).
CRP ist ein Marker für eine immunentzündliche und infektiöse Erkrankung. Nach einem Trauma löst eine Läsion oder Infektion eines Gewebes in dem betroffenen Subjekt eine komplexe Reihe von Reaktionen aus, die auf die Verhinderung eines Ausdehnens des Schadens, die Zerstörung des infizierenden Organismus und eine Aktivierung des Reparaturprozesses zur Wiederherstellung der normalen Funktion abzielen. Dieser Prozess bildet die sogenannte Akutphasenreaktion und der Hauptmarker, der zur Zeit für die Akutphasenreaktion verwendet wird, ist CRP. In normalem menschlichem Serum liegt er tatsächlich in Konzentrationen von weniger als 10 μg/ml vor, kann jedoch um das mehr als 1.000fache in Reaktion auf ein Trauma oder eine Entzündung ansteigen. (Koj A.: "Acute phase reactants" in "Structure and Function of Plasma Proteins". Allison A., Herausgeber Plenum Press, New York, 1974, Seiten 73-131).
Frühere therapeutische Verwendungen von CRP sind bereits bekannt. Das US-Patent 4,857,314 vom 15.08.1989 offenbart z.B. die Verwendung von CRP in Kombination mit TNF für die Behandlung von Tumoren.
Die internationale Patentanmeldung PCT/US94/02181 vom 24.02.1994 offenbart Mutanten von CRP, die für die Herstellung diagnostischer Kits für die Bestimmung von Immunkomplexen in biologischen Flüssigkeiten und für die Behandlung viraler und mikrobieller Erkrankungen, Tumoren und endotoxischem Schock nützlich sind.
Die internationale Patentanmeldung PCT/US94/09729 vom 26.08.1994 offenbart auch Mutanten von CRP, die für die Herstellung diagnostischer Kits und für die Behandlung von viralen und mikrobiellen Erkrankungen und Tumoren nützlich sind.
Die Fähigkeit von PTX3 zur Erkennung und spezifischen Bindung an Liganden, die auch von kurzen Pentraxinen erkannt werden, wurde in vitro unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem PTX3 überprüft. Kurze Pentraxine, wie z.B. CRP und SAP (Serum-Amyloid-P-Komponente) sind durch ihre Fähigkeit zur Erkennung und Bindung an ein breites Spektrum von Liganden in calciumabhängiger Weise gekennzeichnet, einschließlich Phosphocholin, Phosphoethanolamin, vielen Zuckern, von denen der am besten charakterisierte ein Agarosederivat ist, das reich an Pyruvat-[methyl-4-6-O-(1-carboxyethyliden)-β-D-galactopyranosid] oder MOβDG ist, Komplementfragmenten und Proteinen der extrazellulären Matrix, insbesondere Fibronektin und Typ-IV-Collagen. Anders als die kurzen Pentraxine kann PTX3 nicht an entweder Calcium (bewertet durch induktiv gekoppelte Plasma/Atom-Emissions-Spektroskopie) oder Phosphocholin an Phosphoethanolamin oder MOβDG binden. Außerdem kann PTX3 nicht an extrazelluläre Matrixproteine, wie z.B. Fibronektin oder Typ-IV-Collagen binden. Andererseits ist PTX3 in der Lage, das C1q-Komplementfragment zu binden, das ebenfalls von den kurzen Pentraxinen erkannt wird (Tabelle 1). Es sollte jedoch betont werden, dass während CRP und SAP zur Bindung von C1q vernetzt sein müssen, PTX3 dieses Komplementfragment in der natürlich auftretenden Form erkennen und binden kann.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass das lange Pentraxin PTX3 oder seine funktionellen Derivate nützliche therapeutische Mittel sind, insbesondere für die Therapie von infektiösen oder entzündlichen Erkrankungen oder Tumoren.
Unter "langem Pentraxin PTX3" wird jedes lange Pentraxin PTX3 verstanden, d.h. unabhängig davon, ob es von natürlichem (menschlichen oder tierischem) oder synthetischem Ursprung ist. Menschliches langes Pentraxin PTX3 (siehe Sequenz 1 und 5) ist die bevorzugte Form.
Ein geeignetes Verfahren zur Erzeugung substanzieller Mengen von langem Pentraxin PTX3 oder einem seiner funktionellen Derivate besteht aus der Herstellung von Expressionsvektoren (z.B. Plasmiden), die die vollständige cDNA-Sequenz, die für PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate kodiert, enthält und die Verwendung derselben für die Transfektion eukaryotischer Zellen in Kultur (z.B. chinesische Hamster-Ovarzellen, CHO). Nach Klonierung der rekombinanten Wirtszellen, die so transfiziert wurden, wird der Zellklon selektiert, der in der Lage ist, die höchsten Niveaus an PTX3 zu erzeugen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die oben erwähnten Expressionsvektoren, die die cDNA-Sequenz enthalten, die für langes Pentraxin PTX3 kodiert, ebenfalls in Gentherapieverfahren für die Behandlung von Tumorzuständen verwendet.
Ein erstes Gentherapieverfahren besteht aus:

a) Entnahme von Proben von Zellen von einem Patienten, der an einem Tumor leidet;
b) Transfizieren dieser Zellen mit einem Expressionsvektor, der die vollständige cDNA-Sequenz enthält, die für langes Pentraxin PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate kodiert und
c) Inokulieren des Tumorpatienten mit diesen transfizierten Zellen.

Ein zweites Gentherapieverfahren für die Behandlung von Tumoren besteht aus:

a) Herstellung eines Expressionsvektors von viralem Ursprung (wie z.B. von einem Adenovirus oder Retrovirus), enthaltend die vollständige cDNA-Sequenz, kodierend für langes Pentraxin PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate und
b) Injizieren des von dem Tumor betroffenen Patienten mit dem so erhaltenen Expressionsvektor.

Obwohl der Wirkungsmechanismus von PTX3 oder seinen funktionellen Derivaten noch definitiv erhellt werden muss, ist ihre Anti-Krebs-Aktivität in jedem Fall nicht einem direkten zytolytischen oder zytostatischen Effekt auf die Tumorzellen zuzuschreiben, sondern rührt vermutlich von Mechanismen her, die von dem Wirt vermittelt werden und mit der Fähigkeit zur Attraktion von Leukozyten in Beziehung stehen, die von diesen Verbindungen ausgeübt wird, wie unten beschrieben werden wird.
Es folgt nun eine Beschreibung der experimentellen Verfahren und Ergebnisse, die die unterwartete Aktivität der hier beschriebenen Verbindungen gemäß der Erfindung demonstrieren.
Erzeugung von rekombinantem PTX3: Ein Fragment, enthaltend die vollständige cDNA-Sequenz von menschlichem PTX3 (Sequenz 2 und 6) wurde in die BamH1-Stelle des Expressionsvektors pSG5 (1) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) subkloniert und in CHO-Zellen unter Verwendung des präzipitierten Calciumverfahrens transfiziert. Ein Klon, selektiert in G418, der große Mengen PTX3 erzeugen kann, wurde als Quelle verwendet, aus der das Protein durch Chromatographie mittels eines Ionenaustauschers und einer Gelfiltration gereinigt wurde.
Bindung von PTX3 an C1q: Die Bindung von PTX3 an C1q wurde in einem ELISA-System bewertet. Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit 250 bis 500 ng C1q pro Vertiefung (eine Nacht bei 4°C) bedeckt und dann mit PBS mit Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ gewaschen, enthaltend 0,05 % Tween 20 (PBS). Die Vertiefungen wurden dann mit 5 % Milch in PBS blockiert (2 Stunden bei Raumtemperatur) und darauffolgend mit variablen Konzentrationen von PTX3 inkubiert (30 Minuten bei 37°C). Nach einer weiteren Reihe von Waschungen wurde die Platte mit einem Ratten-monoklonalen-Antikörper zu PTX3 (1 Stunde bei Raumtemperatur) inkubiert und dann mit dem zweiten Antikörper, einem Peroxidase-konjugierten Ratten-anti-IgG-Antikörper (1 Stunde bei Raumtemperatur). Nach einem Waschen wurde Chromogen zugefügt und die Absorption wurde bei 405 nm unter Verwendung einer automatischen Platten-Ablesevorrichtung abgelesen. In einer Anzahl von Experimenten wurden die Vertiefungen mit PTX3 bedeckt und die C1q-Bindung wurde unter Verwendung eines Anti-C1q-Antikörpers bewertet.
Biotinyliertes Protein wurde verwendet, um die C1q-Bindungsaffinität zu bestimmen. PTX3 wurde gemäß Standardverfahren unter Verwendung von aktiviertem Biotin, modifiziert durch Zugabe eines "Spacerarms" (SPA – Societá Prodotti Antibiotici) biotinyliert.
Die 2(A) und 2(B) zeigen die C1q-Bindungs- und Bindungs-Affinitäts-Ergebnisse. Diese Ergebnisse zeigen den sehr substanziellen Grad einer C1q-Bindung und Bindungs-Affinität von PTX3.
Leukozyten-Attraktion: Die Leukozyten-Attraktion, induziert durch PTX3, wurde in vivo in einem subkutanen Taschensystem untersucht. Die subkutane Tasche wurde bei dem Versuchstier durch zwei subkutane Injektionen von 5 ml Luft in den Rücken des Tiers mit einem dazwischenliegenden Intervall von drei Tagen induziert. Am Tag 6 wurde 1 μg PTX3 in 0,5 % Carboxymethylcellulose in die Tasche verabreicht. Nach 4 Stunden wurden die Tiere anästhesiert und die Tasche wurde mit 1 ml Salzlösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde gewonnen und einer Gesamtzählung und einer Differenzialzählung der vorliegenden Zellen unterzogen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 3 dargestellt und zeigen die substanzielle Leukozyten-Attraktionsfähigkeit von PTX3 bei normalen Tieren, während 4 die Ergebnisse zeigt, die bei genetisch modifizierten Tieren erhalten wurden, ohne C1q, worin die Leukozyten-Attraktion deutlich niedriger liegt.
Anti-Krebs-Aktivität: Eine Zellinie von murinem Mastozytom P815 wurde durch Elektroporation mit dem Expressionsvektor pSG5 co-transfiziert, der die cDNA von menschlichem PTX3 oder ihr Antisinnstück enthielt und dem Vektor pSV2, der die transfizierten Zellen mit einer Neomycinresistenz versieht. Nach einer Selektion mit Neomycin mit 0,5 mg/ml wurden die Zellen durch begrenzende Verdünnung kloniert.
Um die Erzeugung von PTX3 zu bewerten, wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in 200 μl RPMI + 3 % FCS für 24 Stunden kultiviert und der Überstand wurde durch ELISA getestet. Die erhaltenen Klone erzeugten Proteinniveaus im Bereich von 1 bis 35 ng/ml, während die Klone, die das Antisinnprodukt enthielten, keine messbaren Niveaus PTX3 erzeugten. Die betrachteten Klone zeigten dieselbe Wachstumsrate in vivo.
Männlichen DBA/2N CrlBR-Mäusen mit einem Alter von 8 bis 10 Wochen wurden subkutan 1 × 10⁵ Zellen P815 PTX3-produzierende Klone oder Klone, die das Antisinngen enthielten, injiziert. Die Mäuse wurden dreimal täglich im Hinblick auf das Auftreten von Tumoren und einmal täglich im Hinblick auf ihr Überleben überwacht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt und zeigen die Wirksamkeit von PTX3 bei diesem experimentellen Modell einer Gentherapie und eine vollständige Zurückweisung des Tumors nach der Aufnahme der inokulierten Tumorzellen.
Diese Ergebnisse sind statistisch signifikant mit p < 0,01 (Fisher-Test), sowohl im Vergleich zu Kontrollen als auch zu der mit dem Antisinngen behandelten Gruppe.
Im Licht dieser Ergebnisse wird klar, dass die oben berichtete Anti-Krebs-Aktivität eng mit der Leukozyten-Attraktion in Beziehung steht, die bei der Maus als Ergebnis einer Erkennung von C1q durch PTX3 auftritt. Bei genetisch modifizierten Mäusen tritt keine solche Leukozyten-Attraktion auf. Die Fähigkeit zur Leukozyten-Attraktion auf der Basis der Anti-Krebs-Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung zeigt, dass diese Verbindungen auch eine nützliche Anwendung bei der Behandlung von Erkrankungen haben können, die durch Pathogene, wie Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren ausgelöst werden.
Tabelle 1 Pentraxin-Bindungsfähigkeit an verschiedene Liganden
Tabelle 2 In-vivo-Anti-Krebs-Aktivität von PTX3
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
2: PTX3-Bindung an C1q. Panel A zeigt die Bindung des Überstands der Kultur, enthaltend PTX3 (Sinn) und des gereinigten Proteins an C1q und C1s, immobilisiert auf der Platte. Die Bindung wird durch die optische Dichte (O.D.) bei 405 nm bewertet. Panel B zeigt die Sättigungskurve, erhalten mit dem biotinylierten Protein. Die kinetischen Parameter wurden unter Verwendung des nicht-linearen Anpassuags- (fitting) Statistikverfahrens berechnet.
3: PTX3-induzierte Leukozyten-Attraktion: 1 μg PTX3 wird in eine subkutane Tasche injiziert, die auf dem Rücken von CD 1-Mäusen durch Inokulation von 5 ml Luft induziert wurde.
4: Die PTX3-induzierte Leukozyten-Attraktion bei normalen Tieren und genetisch modifizierten Tieren ohne C1q. PTX3 wird in eine subkutan auf dem Rücken von Tieren induzierte Taschen injiziert.
SEQ ID NO 1: Aminosäuresequenz von menschlichem PITX3. Die unterstrichenen Aminosäuren bilden das Peptidsignal. Reifes hPTX3 besteht aus 364 Aminosäuren.
SEQ ID NO 2: Nukleotidsequenz des Fragments von cDNA von menschlichem PTX3. Großbuchstaben bezeichnen Nukleotide, die für das Protein kodieren, während Kleinbuchstaben Regionen am 3'- und 5'-Ende, die nicht translatiert werden, bezeichnen, die jedoch in dem Konstrukt vorliegen.
SEQUENZPROTOROLL

Claims

Oral, parenteral, transdermal oder subkutan verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als aktiven Bestandteil die Aminosäuresequenz des langen Pentraxin PTX3 und ein pharmakologisch akzeptables Exzipienz zur Verwendung als therapeutisches Mittel.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Sequenz des langen Pentraxin PTX3 die Sequenz von natürlich auftretendem PTX3 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin die Sequenz des langen PTX3 die Sequenz von menschlichem PTX3 ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 für die Behandlung infektiöser Erkrankungen oder Tumoren.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 für die Behandlung von Erkrankungen, die durch Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren ausgelöst werden.
Verwendung von Zellen von einem Patienten, der an Krebs leidet, wobei solche Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, enthaltend die vollständige cDNA-Sequenz, die für langes Pentraxin PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate kodiert, für die Herstellung eines Medikaments für die Gentherapie des Tumors bei dem Patienten.
Verwendung eines Expressionsvektors von viralem Ursprung, enthaltend die vollständige cDNA-Sequenz, kodierend für das lange Pentraxin PTX3 oder eines seiner funktionellen Derivate für die Herstellung eines Medikaments für die Gentherapie von Tumorzuständen.
Verwendung gemäß Anspruch 7, worin der Expressionsvektor von viralem Ursprung ein Adenovirus oder Retrovirus ist.
Verwendung des langen Pentraxin PTX3 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von infektiösen oder Tumorerkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das lange Pentraxin PTX3 das menschliche Pentraxin mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen, die durch Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren ausgelöst werden.