DE69534676T2

DE69534676T2 - Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen

Info

Publication number: DE69534676T2
Application number: DE69534676T
Authority: DE
Inventors: Alan D. Habberfield
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-02-08
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-02-09
Also published as: IL112583A0; DK0726778T3; GR3036625T3; ES2251924T3; DK1090645T3; HK1036214A1; ES2159630T3; ATE311908T1; EP1090645A2; US20020099001A1; EP0726778B1; EP1090645B1; DE69521880T2; ATE203415T1; DE69534676D1; US20030185795A1; EP1090645A3; EP0726778A1; AU1916295A; PT726778E

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen und Verfahren für die orale Verabreichung chemisch modifizierter Proteine. (Der Begriff "Protein" wird hier austauschbar mit dem Begriff "Polypeptid" verwendet, es sei denn, es ist anders bemerkt.) Ferner betrifft die Erfindung neue Zusammensetzungen und Verfahren für die orale Verabreichung pegylierter Proteine. Es sind neue Zusammensetzungen und Verfahren für die orale Verabreichung von chemisch modifiziertem Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) und in einem weiteren Aspekt insbesondere die orale Verabreichung von pegyliertem G-CSF offenbart, die nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und Verfahren zur oralen Verabreichung von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon und in einem weiteren Aspekt die orale Verabreichung von pegyliertem Konsensus-Interferon. Auch sind Verfahren zur Behandlung unter Verwendung solcher Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen offenbart.
Hintergrund
Gegenwärtig ist eine Injektion die typische Verabreichungsart eines biologisch aktiven Proteins an den Blutkreislauf. Eine Injektion ist jedoch in vielen Fällen unerwünscht. Der Empfänger kann sich unwohl fühlen oder Schmerzen erleiden und müsste möglicherweise für die Injektion eine Fachperson aufsuchen. Aufgrund dieser und anderer Gründe können sich beim Einsatz einer Injektion als Verabreichungsart Probleme bei der Bereitwilligkeit des Patienten ergeben. Eine Alternative zu einer Injektion ist die orale Verabreichung biologisch aktiver Proteine.
Eine orale Verabreichung war jedoch aus einer Vielzahl von Gründen problematisch. Ein Hauptproblem ist der Abbau des biologisch aktiven Proteins im Darm. Die Verwendung von Protease-Inhibitoren wurde angeregt. Es gab auch verschiedene pharmazeutische Zubereitungen oraler Dosierungsformen für verschiedene Proteine, die das Protein vor einem Abbau schützen; vgl. z.B. die EP 0 459 795 mit dem Titel "Oral dosage form of biologically active proteins" (vgl. auch US-Seriennr. 07/994,076; mit dem Titel "Oral Dosage Form of Biologically Active Proteins") hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Die US-PS 4,925,673 (Steiner et alo.) mit dem Titel "Delivery Systems for Pharmacological Agents Encapsulated with Proteinoids" beschreibt die orale Verabreichung von Insulin, Heparin und Physostigmin, das in bestimmten Mikrosphären mit einem vorherrschenden Durchmesser von weniger als etwa 10 Mikron eingekapselt ist. Diese Proteinoide bestehen aus einem sauren Protein, das laut Beschreibung in Gegenwart von Magenenzymen und -säure stabil ist, jedoch den eingekapselten Wirkstoff im nahezu neutralen Blut freisetzt. Die Verwendung dieser Mikrosphäre für eine orale Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers wurde ebenfalls beschrieben.
Andere Arbeitsgruppen versuchten die orale Aufnahme von therapeutischen Wirkstoffen durch deren Einbau in Polystyrol-Latex-Nanopartikel und -Mikropartikel zu steigern. So wird das Arzneimittel nicht nur vor der feindlichen Umgebung geschützt, sondern diese Partikel auch sodann von dem enteralen System in dem systemischen Kreislauf durch die Peyer Plaques aufgenommen; vgl. Jani et al., J. Pharm. Pharmacol. 42:821–826, 1990, und Jani et al., Intl. J. Pharm. 86:239–246, 1992.
Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens für den Schutz und die gesteigerte Aufnahme des Peptids oder Proteins wurden Mikroemulsionen für die orale Verabreichung von therapeutischen Wirkstoffen wie Insulin, Calcitonin und Somatotropin oder Wachstumsfaktoren beschrieben; vgl. PCT-Veröffentlichung WO 90/03164. Ferner wurde die orale Verabreichung von therapeutischen Wirkstoffen unter Verwendung von Liposomen untersucht; vgl. Aramaki et al., Pharm. Res. 10:1228–1231, 1993. Die Liposomen bestanden aus Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Cholesterin oder Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Cholesterin, die im Darm stabil waren und durch die Peyer Plaques im unteren Ileum aufgenommen zu werden schienen. Derzeit werden trotz der vorstehend genannten Berichte orale Dosierungsformen biologisch aktiver Proteine nicht weit verbreitet klinisch verwendet.
Ursache dafür könnten die technischen Probleme sein, die bei der Verabreichung eines therapeutischen Proteins an den systemischen Kreislauf durch einen oralen Verabreichungsweg auftreten. Zusammengefasst ist das Verdauungssystem per Definition schädlich für irgendein aufgenommenes Protein. Der Gastrointestinaltrakt ist ein Organ, das sich für einen physikalischen und chemischen Abbau der aufgenommenen Nahrung entwickelt hat und für ihre Aufnahme in den Körper und für die Ausscheidung von Abfallstoffen verantwortlich ist. Aufgenommene Nahrung wird unmittelbar im Magen abgebaut durch die Kombination eines niedrigen pH-Werts, typischerweise 1–3 (Dotevall, G. et al., Acta Med. Scand. 170:59, 1961) und der starken peristaltischen Kontraktionen, die die Nährstoffe im Magen halten, während die Nahrung weiter physikalisch abgebaut wird. Zusätzlich wird die Protease Pepsin in das Magenlumen aus den Magenhauptzellen sekretiert. Das Ergebnis dieser außergewöhnlich feindlichen Umgebung ist, dass die Nahrung gegebenenfalls in den Dünndarm, insbesondere das Duodenum durch den Pylorus als kleine Partikel von ~1 mm oder weniger freigesetzt wird (Mayer, E.A. et al., Gastroenterology 87:1264–1271, 1984). Der pH-Wert des Mageninhalts, der in das Duodenum eintritt, erhöht sich rasch auf pH 5–7 durch das Hydrogencarbonat im Gallen- und Pankreassekret. Zusätzlich werden die Endoproteasen Trypsin, Chymotrypsin und Elastase in das Lumen des Duodenums zusammen mit vielen Enzymen für die Spaltung von Polysacchariden und Lipiden freigesetzt. Die Produkte dieser Proteasen sind im allgemeinen kleine Peptide und diese werden wiederum zu Aminosäuren vor einer Resorption durch Exopeptidasen im Bürstensaum der Enterozyten, die den Darm säumen, hydrolysiert (vgl. für eine Zusammenfassung Kenny, A.J. und Fulcher, LS. in: Brush Border Membranes, herausgegeben von R. Porter und G.M. Collins, Seiten 12–33, 1983, und Tobey, N. et al., Gastroenterology 88:913–926, 1985). Eine Proteolyse und ein allgemeiner Abbau der Nahrung findet im ganzen Dünndarm statt, d.h. im Duodenum, Jejunum und Ileum, genauso wie die Aufnahme der Abbauprodukte. Die Funktionen des Dickdarms, der aus dem Caecum und dem Colon besteht, sind das Ausschleusen von Wasser und Elektrolyten aus dem Lumen in den Körper und die Lagerung und mögliche Ausscheidung von Abfallstoffen.
Die Verdauungsprodukte werden im allgemeinen durch aktive Aufnahmeprozesse für Aminosäuren und Monosaccharide resorbiert, während andere, insbesondere Lipide, durch einen eher passiven Diffusionsprozess in die Enterozyten resorbiert werden, die den Darm auskleiden. Aktive Aufnahmeprozesse sind auch für manche Vitamine und andere größere, jedoch essentielle Nährstoffe, die nicht passiv resorbiert werden können, bekannt. Jedoch sind die Enterozyten, die das Lumen des Darms abgrenzen, für die meisten großen Moleküle eine nicht-penetrierbare Barriere, die nicht überquert werden kann.
Im ganzen Darm resorbieren die Enterozyten, die das Intestinum auskleiden, Verdauungsprodukte. Von großen Molekülen, wie denjenigen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 bis 1000 Dalton ist nicht bekannt, dass sie passiv durch das Intestinum resorbiert werden.
Somit rät der Stand der Technik davon ab, die Größe eines biologisch aktiven Proteins für eine orale Verabreichung zu erhöhen. Zum Beispiel vermutet man, dass Polyethylenglykol alleine den Intestinaltrakt bei nur geringer oder keiner Resorption passiert (Ma et al., Gastroenterology 98:39–46, 1990; Sundquist et al., Gut 21:208–214, 1980).
Ein solches biologisch aktives Protein, das der Gegenstand der nachstehenden Beispiele ist, ist der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor, "G-CSF". G-CSF verstärkt die Bildung bestimmter Bakterien-bekämpfender weißer Blutzellen, die neutrophile Granulozyten oder "Neutrophile" genannt werden, aus Knochenmarkszellen. Nach einer Freisetzung in den Blutkreislaus ermöglichen die neutrophilen Granulozyten dem menschlichen Immunsystem eine Abwehr einer bakteriellen Infektion. G-CSF induziert die rasche Vermehrung und Freisetzung neutrophiler Granulozyten in den Blutkreislauf.
Menschliches G-CSF kann aus mehreren Quellen erhalten und gereinigt werden. Natürliches menschliches G-CSF (nhG-CSF) kann aus den Überständen kultivierter menschlicher Tumorzelllinien isoliert werden. Die rekombinante Herstellung von G-CSF stellte ausreichende Mengen von G-CSF mit gewünschter therapeutischer Qualität bereit (die rekombinante Produktion wird in der US-PS 4,810,643 (Souza, hier unter Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben). Rekombinantes menschliches G-CSF (rhG-CSF) wurde erfolgreich zur Wiederherstellung der Immunfunktion nach einer Chemotherapie und Bestrahlungstherapie und bei chronischen Erkrankungen wie schwerer chronischer Neutropenie eingesetzt. Momentan wird rekombinantes menschliches G-CSF (Freiname: Filgrastim) in den Vereinigten Staaten unter dem Handelsnamen Neupogen^® verkauft und wird durch Injektion oder Infusion verabreicht.
Proteine können vor einer Proteolyse durch Binden chemischer Reste geschützt werden. Eine solche Bindung kann den physikalischen Kontakt des proteolytischen Enzyms mit dem Protein-Rückgrat selbst wirksam blockieren und somit einen Abbau verhindern. Polyethylenglykol ist ein derartiger chemischer Rest, von dem gezeigt wurde, dass er vor einer Proteolyse schützt (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137–139, 1991).
Man fand heraus, dass die chemische Modifizierung biologisch aktiver Proteine zusätzlich zu einem Schutz vor einer proteolytischen Spaltung weitere Vorteile unter bestimmten Voraussetzungen bietet wie eine Erhöhung der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und eine Verringerung der Immunogenizität; vgl. US-PS 4,179,337, Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979; vgl. Übersichtsartikel von Abuchowski et al., in "Enzymes as Drugs" (J.S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg., Seiten 367–383, 1981). Francis, Focus on Growth Factors 3:4–10 (Mai 1992) (veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK) ist ein Übersichtsartikel, der Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt; vgl. auch beispielsweise die EP 0 401 384 mit dem Titel "Chemically modified Granulocyte Colony Stimulating Factor", die Materialien und Verfahren zur Herstellung von G-CSF beschreibt, an das Polyethylenglykol-Moleküle gebunden sind. Das Binden von Polyethylenglykol erhöht die Stabilität von G-CSF bei einem physiologischen pH-Wert im Vergleich zu nicht-pegyliertem G-CSF (ein derartig modifiziertes G-CSF wird hier als "pegyliertes G-CSF" oder "PEG-G-CSF" bezeichnet). Das pegylierte Protein ist auch im Hinblick auf Salze stabilisiert. Die vorteilhaften Wirkungen der Pegylierung auf die Stabilisierung von Enzymen in organischen Lösungsmitteln wurde auch beschrieben; vgl. Inada, Y. et al., Tibtech 190–194, 1986. Das Letztere kann eine praktische Bedeutung bei der Formulierung der G-CSF-Moleküle in Tabletten haben.
Es wurde auch die Modifizierung von G-CSF und seinen Analoga beschrieben. Die EP 09 473 268 , "Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer", beschreibt die Verwendung verschiedener G-CSF-Moleküle und Derivate, die kovalent mit einem wasserlöslichen Partikel-Polymer wie Polyethylenglykol konjugiert sind. Natürlich erhöht sich die Größe des biologisch aktiven Moleküls bei einer Bindung von weiteren chemischen Resten.
Die US-Seriennr. 08/321,510 (hier unter Bezugnahme eingeschlossen) beschreibt N-terminal chemisch modifizierte Proteinzusammensetzungen und Verfahren, einschließlich der Modifizierung von G-CSF und der chemischen Modifizierung eines anderen Proteins, Konsensus-Interferon.
Wie nachstehend detaillierter beschrieben, zeigte chemisch modifiziertes Konsensus-Interferon biologische Aktivität wie eine anti-virale Aktivität. Eine orale Dosierungsform von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon, der Gegenstand eines weiteren nachstehend beschriebenen Arbeitsbeispiels, wäre auch erwünscht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die orale Verabreichung eines chemisch modifizierten Proteins und die Verabreichung des Proteins an den Blutkreislauf, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen. Wichtig ist und unerwartet war, dass chemisch modifizierte biologisch aktive Proteine im Intestinum (mit oder ohne zusätzliche Formulierung) überleben können und die Auskleidung des Intestinums zum Blutkreislauf passieren. Unerwarteterweise überlebte pegyliertes G-CSF nicht nur, sondern rief auch messbare biologische Wirkungen hervor.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen dies. In einem Säugersystem wird pegyliertes G-CSF direkt an das Intestinum verabreicht. Die getesteten Tiere zeigten übereinstimmend höhere Gesamtzahlen an weißen Blutkörperchen als Tiere, die mit nicht-pegyliertem G-CSF oder dem Träger behandelt wurden. Obwohl die genauen Mechanismen nicht bekannt sind, deuten die ersten Beobachtungen darauf hin, dass die chemische Modifizierung eine Proteolyse des Proteins verhindert und die Beseitigung des Proteins aus dem systemischen Kreislauf verlangsamt. Der Mechanismus, durch den die Auskleidung des Intestinums die Aufnahme des pegylierten G-CSF in den Blutkreislauf ermöglicht, ist jedoch unbekannt.
Allgemein kann das G-CSF einer Form entsprechen, die aus Säugerorganismen isoliert wurde oder alternativ ein Produkt einer chemischen Synthese oder der Expression von exogenen DNA-Sequenzen in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt ist, wobei die DNA-Sequenzen durch genomische oder cDNA-Klonierung oder durch DNA-Synthese erhalten wurden. Geeignete prokaryontische Wirte umfassen verschiedene Bakterien (z.B. E. coli). Geeignete eukaryontische Wirte umfassen Hefe (z.B. S. cerervisiae) und Säugerzellen (z.B. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, Affenzellen). In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt kann das G-CSF-Expressionsprodukt mit Kohlenhydraten aus Säugern oder anderen Eukaryonten glykosyliert sein oder es kann nicht-glykosyliert sein. Das G-CSF-Expressionsprodukt kann auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest (an der Position –1) umfassen. Die Erfindung sieht die Verwendung einer jeden und aller dieser G-CSF-Formen vor, obwohl rekombinantes G-CSF, insbesondere G-CSF, das von E. coli abgeleitet ist, bevorzugt ist, da es unter anderem die größte kommerzielle Praktikabilität aufweist.
Bestimmte G-CSF-Analoga wurden auch als biologisch funktionell beschrieben und diese können auch chemisch modifiziert werden. Dabei werden z.B. ein oder mehrere Polyethylenglykol-Moleküle gebunden. Beispiele von G-CSF-Analoga, von denen eine biologische Aktivität beschrieben wurde, sind in der EP 0 473 268 und in der EP 0 272 423 beschrieben, obwohl die Aktivität eines jeden beschriebenen Analogons nicht gezeigt ist.
Die vorgesehene chemische Modifikation ist die Bindung wenigstens eines Restes an das G-CSF-Molekül selbst, wobei der Rest (a) die Hemmung der Proteolyse und (b) die Aufnahme aus dem Intestinum in den Blutkreislauf ermöglicht. Ebenfalls erwünscht ist die Erhöhung der Gesamtstabilität des Proteins und die Erhöhung der Zirkulationszeit im Körper. Beispiele solcher Reste umfassen: Polyethylenglykol, Copolymere aus Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin; vgl. Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, in: "Enzymes as Drugs", Hocenberg und Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY, 1981, Seiten 367–383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4:185–189, 1982. Andere verwendbare Polymere sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-trioxocan.
Der bevorzugte chemische Rest ist Polyethylenglykol. Die bevorzugten Polyethylenglykol-Moleküle sind diejenigen, die die Halbwertszeit des Proteins in vivo erhöhen, typischerweise die PEG-Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen ungefähr 500 und ungefähr 50 000. Der Begriff "etwa" wird verwendet, um das ungefähre durchschnittliche Molekulargewicht einer Polyethylenglykol-Zubereitung wiederzugeben, wobei dem Rechnung getragen wird, dass manche Moleküle in der Zubereitung mehr und manche weniger wiegen. Das in den nachstehenden Arbeitsbeispielen verwendete PEG besaß ein Molekulargewicht von etwa 6000.
Die Polyethylenglykol-Moleküle (oder andere chemische Reste) sollten an das Protein unter Berücksichtigung von Wirkungen auf funktionelle oder antigene Domänen gebunden werden. Das Bindungsverfahren für die Polyethylenglykol-Moleküle kann verschieden sein und es gibt eine Reihe verfügbarer Verfahren; vgl. die EP 0 401 384 , hier unter Bezugnahme eingeschlossen, (es wird PEG an G-CSF gekoppelt), vgl. auch Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028–1035, 1992 (es wird die Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid beschrieben). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe kovalent gebunden werden wie eine freie Amino- oder Carboxylgruppe. Reaktive Gruppen sind diejenigen, an die ein aktiviertes Polyethylenglykol-Molekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und die N-terminalen Aminosäurereste umfassen. Die Aminosäurereste mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest umfassen. Sulfhydrylgruppen können auch als reaktive Gruppe für ein Binden des Polyethylenglykol-Moleküls oder der Polyethylenglykol-Moleküle eingesetzt werden. Für therapeutische Zwecke ist Binden an eine Aminogruppe bevorzugt wie das Binden an den N-Terminus oder an eine Lysingruppe. Ein Binden an Reste, die für eine G-CSF-Rezeptor-Bindung wichtig sind, sollte vermieden werden. Ein Binden an Reste, die in den externen Schleifen, die alpha-Helices verbinden, oder am N-Terminus liegen, ist bevorzugt; vgl. Osslund et al., PNAS-USA 90:5167–5171, 1993 (es wird die dreidimensionale Konformation von rekombinantem menschlichen G-CSF beschrieben), hier unter Bezugnahme eingeschlossen.
Die Anzahl der so gebundenen Polyethylenglykol-Moleküle kann verschieden sein und der Fachmann wird in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion festzustellen. Wie nachstehend genauer beschrieben, ist das hier bevorzugte pegylierte G-CSF vorherrschend mit PEG 6000 di-tri-tetra-pegyliert, d.h. eine Population von G-CSF-Molekülen mit 2, 3 oder 4 gebundenen PEG 6000-Molekülen, wobei eine geringe Zahl von Molekülen mehr oder weniger gebundene Polyethylenglykol-Moleküle aufweist.
Für eine Verwendung sind hier orale feste Dosierungsformen vorgesehen, die allgemein in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), in Kapitel 89 beschrieben sind, hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Feste Dosierungsformen umfassen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Lutschpastillen, Kachets oder Streukügelchen. Eine liposomale oder proteinoide Einkapselung kann auch für die Formulierung der erfindungsgemäßen Zu sammensetzungen eingesetzt werden (wie z.B. Protein-Mikrosphären, die in der US-PS 4,925,673 beschrieben sind). Eine liposomale Einkapselung kann verwendet werden und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (vgl. z.B. US-PS 5,013,556). Eine Beschreibung möglicher fester Dosierungsformen für das Arzneimittel findet sich in Marshall, K. in: Modern Pharmaceutics, herausgegeben von G.S. Banker und C.T. Rhodes, Kapitel 10, 1979, hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Im allgemeinen wird die Formulierung das chemisch modifizierte Protein und inerte Bestandteile umfassen, die einen Schutz vor dem Milieu im Magen bieten und eine Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Intestinum erlauben.
Eine bevorzugte Zusammensetzung ist mit einem anionischen Lipid assoziiertes PEG-G-CSF. Wie genauer in dem nachstehenden Beispiel 6 beschrieben, zeigte das mit einem anionischen Lipid assoziierte PEG-G-CSF verstärkte biologische Wirkungen bei einer Verabreichung an den Darm. Vorzugsweise wird Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG) als anionisches Lipid verwendet, es können jedoch andere anionische Lipide verwendet werden. Die für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendbaren Lipid-Vesikel sind negativ-geladene Liposomen, die mit PEG-G-CSF interagieren können. Spezifische Lipide, die für eine Verwendung vorgesehen sind, umfassen: Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Phosphatidylglycerin aus Eiern, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Phosphatidylethanolamin aus Eiern, Dioleoylphosphatidsäure (DOPA), Dimyristoylphosphatidsäure (DMPA), Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS), Dimyristoylphosphatidylserin (DMPS), Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), Phosphatidylserin aus Eiern, Lysophosphatidylglycerin, Lysophosphatidylethanolamin und Lysophosphatidylserin. In Abhängigkeit von dem spezifischen verwendeten Lipid kann die Menge des Lipids verschieden sein und kann in verschiedenen Kombinationen eingesetzt werden. Weitere Materialien und Verfahren, die die Verwendung von anionischen Lipiden betreffen, sind in der US-Seriennr. 08/132,413 mit dem Titel "Stahle Proteins: Phospholipid Compositions and Methods", hier unter Bezugnahme eingeschlossen, und in Collins et al. mit dem Titel "Enhanced stability of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) after insertion into lipid membranes", J. Biochem. (in Review) beschrieben, die unter Bezugnahme auch eingeschlossen ist.
Der bevorzugte Freisetzungsort ist das Duodenum, wie nachstehend gezeigt. Obwohl eine Freisetzung im Duodenum für eine optimale biologische Wirkung bei ei ner bestimmten Dosis bevorzugt ist, führt eine Freisetzung im ganzen Darm zu einer Aufnahme des PEG-G-CSF, wie nachstehend gezeigt wird. Der Fachmann verfügt über Formulierungen, die sich im Magen nicht auflösen, jedoch das Material im Duodenum oder anderswo im Intestinum freisetzen.
Um eine vollständige Resistenz im Magen sicherzustellen, ist ein Überzug, der wenigstens bis pH 5,0 undurchlässig ist, notwendig. Beispiele der gewöhnlicheren inerten Bestandteile, die als enterische Beschichtungen verwendet werden, sind Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Celluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.
Eine Beschichtung oder ein Gemisch aus Beschichtungen kann auch auf Tabletten eingesetzt werden, die nicht für einen Schutz gegenüber dem Magen vorgesehen sind. Dies kann Zuckerbeschichtungen oder Beschichtungen umfassen, die ein Verschlucken der Tablette erleichtern. Kapseln können aus einer harten Schale (wie Gelatine) für eine Verabreichung trockener Arzneimittel, d.h. eines Pulvers, bestehen. Für eine flüssige Form kann eine Weichgelatine-Schale eingesetzt werden. Das Schalenmaterial von Kapseln könnte dicke Stärke oder ein anderes essbares Papier sein. Im Fall von Pillen, Lutschpastillen, gepressten Tabletten oder Tablettenpulvern können Feuchtpressverfahren eingesetzt werden.
Das Arzneimittel kann in die Formulierung als feine Mikropartikel in Form von Körnchen oder Kügelchen einer Partikelgröße von etwa 1 mm einverleibt werden. Die Formulierung des Materials für eine Verabreichung als Kapsel könnte auch als Pulver, leicht komprimierte Klumpen oder sogar als Tabletten vorliegen. Das Arzneimittel könnte durch Zusammendrücken hergestellt werden.
Farb- und Geschmacksstoffe können auch zugesetzt werden.
Mit einem inerten Material kann man das Arzneimittel verdünnen oder sein Volumen erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannit, α-Laktose, wasserfreie Laktose, Cellulose, Sucrose, modifizierte Dextrane und Stärke umfassen. Bestimmte anorganische Salze könnten auch als Füllstoffe verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Manche käuflich erhältlichen Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Sprengmittel können in die Formulierung des Arzneimittels in einer festen Dosierungsform einverleibt werden. Als Sprengmittel verwendete Materialien umfassen in nicht begrenzender Weise Stärke, einschließlich des käuflich verfügbaren Sprengmittels, das auf Stärke basiert, Explotab. Natrium-Stärke-Glykolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopektin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, saure Carboxymethylcellulose, Naturschwamm und Bentonit können auch verwendet werden. Eine weitere Form der Sprengmittel sind die unlöslichen kationischen Austauschharze. Pulverisierte Harze können als Sprengmittel und Bindestoffe verwendet werden und können z.B. Agar, Karaya oder Tragakanth umfassen. Alginsäure und seine Natriumsalze sind auch als Sprengmittel verwendbar.
Bindemittel können verwendet werden, um den therapeutischen Wirkstoff für die Bildung einer harten Tablette zusammenzuhalten, und umfassen Materialien aus Naturprodukten wie Gummi arabicum, Tragakanth, Stärke und Gelatine. Andere umfassen Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen für die Granulierung des Arzneimittels eingesetzt werden.
Ein Schmiermittel kann in der Formulierung des Arzneimittels enthalten sein, um ein Steckenbleiben während der Formulierung zu vermeiden. Schmierstoffe können als Schicht zwischen dem Arzneimittel und der Wand der Form eingesetzt werden und können in nicht begrenzender Weise Stearinsäure, einschließlich seiner Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, Gemüseöle und Wachse umfassen. Lösliche Schmierstoffe können auch verwendet werden wie Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol verschiedener Molekulargewichte, Carbowax 4000 und 6000.
Gleitmittel, die die Flusseigenschaften des Arzneimittels während der Formulierung verbessern könnten, könnten hinzugegeben werden, auch um eine Umlagerung während des Fressens zu unterstützen. Die Gleitmittel können Stärke, Talkum, pyrogene Kieselerde und hydriertes Siliciumaluminat umfassen.
Um eine Auflösung des Arzneimittels in der wässrigen Umgebung zu unterstützen, kann ein Tensid als Befeuchtungsmittel hinzugefügt werden. Tenside können anionische Detergenzien wie Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat umfassen. Kationische Detergenzien können verwendet werden und können Benzalkoniumchlorid oder Benzethomiumchlorid umfassen. Die möglichen nicht-ionischen Detergenzien, die in der Formulierung als Tenside enthalten sein können, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethylenhydrogeniertes Castoröl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Sucrose-Fettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese Tenside können in der Formulierung des PEG-G-CSF entweder alleine oder als Gemisch in verschiedenen Verhältnissen vorkommen.
Zusätze, die möglicherweise eine Aufnahme des Cytokins verstärken, sind z.B. die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Eine Formulierung für eine gesteuerte Freisetzung kann erwünscht sein. Das Arzneimittel könnte in einer inerten Matrix eingebaut sein, die eine Freisetzung durch Diffusion oder Aussickern erlaubt, d.h. Gummistoffe. Langsam zerfallende Matrizes können auch in die Formulierung einverleibt werden. Eine weitere Form einer gesteuerten Freisetzung dieses Arzneimittels erfolgt durch ein Verfahren, das auf dem Oros-therapeutischen System (Alza Corp.) basiert, d.h. das Arzneimittel ist in einer semi-permeablen Membran eingeschlossen, die ein Einbringen von Wasser und ein Herausdrücken des Arzneimittels durch eine einzelne kleine Öffnung aufgrund osmotischer Wirkungen ermöglicht. Manche enterische Beschichtungen weisen auch die Wirkung einer verzögerten Freisetzung auf.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung eingesetzt werden. Diese umfassen eine Vielzahl von Zuckern, die in einem Dragierkessel aufgebracht werden könnten. Das Arzneimittel könnte auch in einer filmbeschichteten Tablette verabreicht werden und die dafür verwendeten Materialien bestehen aus zwei Gruppen. Die ersten sind die nicht-enterischen Materialien und umfassen Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxy-Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Natriumcarboxy-Methylcellulose, Providon und Polyethylenglykole. Die zweite Gruppe besteht aus den bereits beschriebenen enterischen Materialien, die gewöhnlich Ester von Phthalsäure sind.
Ein Gemisch von Materialien könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Eine Filmbeschichtung kann in einem Dragierkessel oder in einem Fließbett oder durch Pressbeschichtung erfolgen.
Die bevorzugte Formulierung für eine orale Verabreichung von G-CSF ist rekombinantes menschliches G-CSF (hergestellt in einem bakteriellen Wirt aufgrund der kommerziellen Praktikabilität), wie Neupogen^®, das von Amgen Inc., Thousand Oaks, Kalifornien 91320–1789 verfügbar ist, wobei dieses G-CSF wie nachstehend genauer beschrieben di-tri-tetra-pegyliert und formuliert ist, um das pegylierte G-CSF an den Dünndarm zu verabreichen. Wie nachstehend gezeigt, ist der Dünndarm, insbesondere das Duodenum, der bevorzugte Ort für eine Freisetzung des pegylierten G-CSF aus inerten Materialien.
Auch hier vorgesehen sind Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten oralen Dosierungsformen und Verfahren zur Behandlung eines Säugers, der einer solchen Behandlung bedarf, durch die orale Verabreichung einer oralen Formulierung eines chemisch modifizierten Proteins. Bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung einer oralen Dosierungsformulierung von G-CSF, umfassend: (a) chemische Modifizierung des G-CSF und (b) Formulierung des so chemisch modifizierten G-CSF mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine orale Verabreichung.
Medizinische Verwendungen in einem Säuger bezüglich eines Zustands, der sich durch eine Verringerung der hämatopoetischen Funktion auszeichnet, umfassend die orale Verabreichung von chemisch modifiziertem G-CSF, die eine pharmazeutisch verträgliche orale Formulierung umfassen kann, sind offenbart.
Formulierungen, die für bestimmte Indikationen spezifisch sind, können andere Stoffe umfassen, die nicht inert sind, wie Antibiotika (z.B. Ceftriaxon) für die begleitende Behandlung einer Infektion. Andere nicht-inerte Stoffe umfassen Chemotherapeutika.
Zustände, die durch die orale Verabreichung von chemisch modifiziertem G-CSF (oder Analoga) gelindert oder moduliert werden, sind typischerweise diejenigen, die sich durch eine verminderte hämatopoetische Funktion oder Funktion des Immunsystems und insbesondere durch eine verringerte Anzahl an Neutrophilen auszeichnen. Solche Zustände können im Verlauf anderer Therapieformen für andere Zwecke ausgelöst werden wie Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie. Solche Zu stände können aus Infektionserkrankungen wie einer bakteriellen, viralen, durch Pilz ausgelösten oder anderen infektiösen Erkrankungen resultieren. Zum Beispiel resultiert Sepsis aus einer bakteriellen Infektion. Ein solcher Zustand kann auch erblich bedingt sein oder durch die Umgebung hervorgerufen werden wie schwere chronische Neutropenie oder Leukämien. Das Alter kann auch eine Rolle spielen, da in der Geriartrie Patienten eine verringerte Neutrophilen-Zahl oder eine verringerte Mobilisierung der Neutrophilen aufweisen können. Manche dieser Zustände sind in Filgrastim (r-met Hu G-CSF) in Clinical Practice, Morstyn, G. und T.M. Dexter, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., N.Y., N.Y. (1993), Seite 351ff dargestellt. Andere, weniger gut untersuchte Zustände, die durch eine orale Verabreichung gelindert oder moduliert werden können, umfassen die Senkung von Lipiden (oder Cholesterin) im Blutkreislauf und bestimmte kardiovaskuläre Zustände, da G-CSF die Herstellung von Plasminogen-Aktivatoren induzieren kann. Die Wirkweise von G-CSF (oder Analoga) ist in diesem Zusammenhang momentan wenig bekannt.
Die Verabreichung kann in Kombination mit anderen Stoffen wie Antibiotika, anderen hämatopoetischen Faktoren wie Interleukinen (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 und IL-12), frühzeitig wirkenden Faktoren wie Stammzellenfaktor oder FLT3-L, Erythropoetin, GM-CSF, IGFs (wie I und II), M-CSF, Interferonen (wie in nicht begrenzender Weise alpha, beta, gamma und Konsensus), LIF und CSF-1 erfolgen. Der Fachmann weiß, wann eine Therapie die gemeinsame Verabreichung eines Mitglieds der vorstehend genannten Gruppe entweder zugleich oder in einer Folge erfordern wird. Die gleichzeitige Verabreichung kann über einen anderen Weg (z.B. durch Injektion oder Infusion) oder oral, nasal oder pulmonär erfolgen.
Mit der Durchführung weiterer Untersuchungen wird Information bezüglich geeigneter Dosismengen für die Behandlung verschiedener Zustände bei verschiedenen Patienten erhalten und der Fachmann wird bei der Abwägung der therapeutischen Umstände, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustands des Empfängers in der Lage sein, eine richtige Dosierung festzustellen. Im allgemeinen wird die Dosis zwischen 0,01 μg/kg Körpergewicht (wobei das Gewicht von G-CSF alleine ohne chemische Modifikation gerechnet ist) bis 100 μg/kg (basierend auf dem gleichen) betragen.
Konsensus-Interferon ist ein weiteres Protein, das in den vorliegenden Arbeitsbeispielen verwendet wurde. Unten ist die intraduodenale Verabreichung von che misch modifiziertem Konsensus-Interferon gezeigt. Dieses wurde ebenfalls in dem Blutstrom vom Darm aufgenommen. Daher betreffen andere Aspekte der vorliegenden Erfindung Zubereitungen zur oralen Verabreichung von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon.
Wie hier verwendet, bezeichnet humanes Leukozyten-Konsensus-Interferon, das hier als "Konsensus-Interferon" oder "IFN-con" bezeichnet wird, ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, das hauptsächlich Aminosäurereste einschließt, die allen natürlich vorkommenden humanen Leukozyten-Interferon-Subtypsequenzen gemeinsam sind, und das mindestens eine Aminosäure an einer oder mehreren Positionen einschließt, wo keine gemeinsame Aminosäure für alle Subtypen vorhanden ist, die hauptsächlich an dieser Position vorkommt, und das in keinem Fall einen Aminosäurerest einschließt, der nicht in dieser Position in mindestens einem natürlich vorkommenden Subtypen vorhanden ist. IFN-con umfasst die Aminosäuresequenzen, die als IFN-con₁, IFN-con₂ und IFN-con₃ bezeichnet werden, die in den U.S.-PSen 4,695,623 und 4,897,471 offenbart sind, deren Inhalt hier unter Bezugnahme vollständig eingeschlossen ist. DNA-Sequenzen, die für IFN-con kodieren, können wie in den oben beschriebenen Patenten oder durch andere Standardverfahren synthetisiert werden. IFN-con-Polypeptide sind bevorzugt Produkte der Expression von hergestellten DNA-Sequenzen, die in bakterielle Wirte, insbesondere E. coli, transformiert oder transfiziert werden. Das bedeutet, dass IFN-con rekombinantes IFN-con ist. IFN-con wird vorzugsweise in E. coli hergestellt und kann durch für den Fachmann bekannte Verfahren aufgereinigt werden, die allgemein von Klein et al., J. Chromatog. 454: 205–215 (1988) für IFN-con₁ beschrieben sind. Gereinigtes IFN-con kann ein Gemisch von Isoformen umfassen, z.B. gereinigtes IFN-con₁ umfasst ein Gemisch aus Methionyl-IFN-con₁, Des-Methionyl-IFN-con₁ und Des-Methionyl-IFN-con₁ mit einem blockierten N-Terminus (Klein et al., Arc. Biochem. Biophys. 276: 531–537 (1990)). Alternativ kann IFN-con eine spezifische, isolierte Isoform umfassen. Isoformen von IFN-con werden voneinander durch Techniken wie isoelektrische Fokussierung aufgetrennt, die für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die orale Verabreichung von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon. Der Konsensus-Interferonrest kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus IFN-con₁, IFN-con₂, und IFN-cons. Die chemische Modifizierung besteht in der Verwendung eines hier beschriebenen Polymers, das (i) eine Resistenz gegenüber einer Proteolyse des Konsensus- Interferonrests verleiht und (ii) eine Aufnahme von Konsensus-Interferon in den Blutstrom aus dem Darm ermöglicht, wie PEG (oder andere wie oben beschriebene Polymere unter Bezug auf chemisch modifiziertes G-CSF). Beispiel 7 zeigt hier ein chemisch modifiziertes IFN-con₁, das aus einem IFN-con₁-Rest besteht, das an einem oder mehreren Polyethylenglycolresten (PEG 6000 wurde verwendet) gebunden ist. Wie unten gezeigt, besitzen die höher pegylierten Derivate nicht nur eine höhere Zirkulationszeit, sondern auch eine höhere Bioverfügbarkeit. Daher ist eine bevorzugte Form der vorliegenden Erfindung ein pegyliertes Konsensus-Interferon in einer pharmazeutisch verträglichen oralen Dosierungsformulierung. Bevorzugt sind solche orale Dosierungsformulierungen, die eine Population von chemisch modifizierten Konsensus-Interferonmolekülen als Wirkstoff enthalten, worin eine Mehrzahl der chemisch modifizierten Konsensus-Interferonmoleküle solche sind, an denen ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Polyermermoleküle, die eine Proteaseresistenz und Aufnahme in den Blutstrom aus dem Darm ermöglichen, wie die vorstehend beschriebenen, einschließlich Polyethylenglycolmoleküle, gebunden sind. Daher hatte in dem Arbeitsbeispiel unten eine Population von chemisch modifizierten Konsensus-Interferonmolekülen, bei denen nahezu alle Mitglieder mindestens drei Polyethylenglycolmoleküle enthielten, mehr als eine doppelt so hohe Bioverfügbarkeit als eine Population, bei der mehr als die Hälfte der Moleküle weniger als zwei Polyethylenglycolreste enthielten.
Als weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden solche orale Dosierungsformulierungen angesehen, die eine Population von chemisch modifizierten Konsensus-Interferonmolekülen als Wirkstoff enthalten (vorzugsweise IFN-con₁-Moleküle), worin eine Mehrzahl der chemisch modifizierten Konsensus-Interferonmoleküle (wie IFN-con₁-Moleküle) solche sind, an denen ein oder mehrere Polyethylenglycolmoleküle gebunden sind.
Die orale Dosierungsformulierung ist vorzugsweise eine, die eine Abgabe des intakten Wirkstoffes an den Dünndarm ermöglicht, so wie die oben für PEG-G-CSF beschriebenen Formulierungen. Die oben geführte Diskussion hinsichtlich allgemeiner Formulierungen, Dosierungen und einer potentiellen Co-Verabreichung mit anderen Zusammensetzungen trifft auch für die Herstellung und Verwendung der vorliegenden oralen Dosierungsformen von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon zu.
Im allgemeinen sind Zustände, die durch Verabreichung des erfindungsgemäßen Polymer/Konsensus-Interferons verbessert oder verändert werden können, solche, bei denen Konsensus-Interferon eingesetzt werden kann, und diese umfassen Zellproliferationsstörungen, virale Infektionen und Autoimmunkrankheiten, wie multiple Sklerose (McManus Balmer, DICP, The Annals of Pharmacotherapy 24: 761–767 (1990) (Clinical use of biologic response modifiers in cancer treatment: an overview. Part I: The Interferons)). Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Zellproliferationsstörungen unter Verwendung von Konsensus-Interferon sind beschrieben in PCT WO 92/06707, veröffentlicht am 30. April 1992. Zum Beispiel kann Hepatitis (wie A, B, C, D, E) bei Verwendung der erfindungsgemäßen pegylierten Konsensus-Interferonmoleküle behandelbar sein. Das Arbeitsbeispiel unten zeigt, dass chemisch modifiziertes Konsensus-Interferon in-vivo in den Blutstrom über den Darm eintritt.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Durchführung der Erfindung.
Beispiel 1 stellt die Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen G-CSF und die Pegylierung davon detailliert dar.
Beispiel 2 beschreibt einen in vitro-Nachweis, dass ein chemisch modifiziertes Protein (pegyliertes G-CSF) gegen Proteolyse durch Trypsin, das im Intestinum auftritt, widerstandsfähig ist.
Beispiel 3 beschreibt das in vivo-Modell, das für die orale Verabreichung eines chemisch modifizierten Proteins eingesetzt wurde. In Ratten wurde pegyliertes G-CSF direkt an das Duodenum verabreicht, entweder durch eine Infusionspumpe oder durch eine Bolusverabreichung. Man ließ die Tiere sich erholen und Blut wurde nach verschiedenen Zeiträumen entnommen, um zwei Parameter zu bestimmen, die Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen und die Serummengen von G-CSF (mittels Antikörpernachweis). Die intraduodenale Bioäquivalenz im Vergleich zur intravenösen Injektion wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass (1) die Tiere, denen pegyliertes G-CSF so verabreicht wurde, eine erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen gegenüber den Kontrollen (nicht-pegyliertes G-CSF oder nur Träger) aufwiesen und (2) die Tiere, denen pegyliertes G-CSF verabreicht wurde, erhöhte Serummengen an G-CSF gegenüber den Kontrollen (nicht-pegyliertes G-CSF oder nur Träger) aufwiesen. Dies zeigt, dass das pegylierte, biologisch aktive G-CSF nicht nur bei den Bedingungen im Duodenum überlebte, sondern auch die Abgrenzung des Intes tinums durchtrat und Mengen in den Blutkreislauf gelangten, die für die Stimulierung einer therapeutischen Reaktion ausreichend sind.
Beispiel 4 zeigt zusätzliche Daten für Serummengen von G-CSF, wobei iodiertes PEG-G-CSF verwendet wurde, das eine höhere Sensitivität als ein Nachweis mit Antikörpern ermöglicht. Unter Einsatz des sensitiveren Tests sind die Serummengen des Proteins im Fließgleichgewicht über den Zeitraum einer intraduodenalen Infusion gezeigt.
Beispiel 5 beschreibt ein in vivo-Protokoll für die Bestimmung der optimalen Stelle im Darm für die Freisetzung des biologisch aktiven pegylierten G-CSF. Diese Information ist für die Bestimmung der genauen oralen Dosierungsformulierung aufschlussreich, die der Fachmann für die Freisetzung an diesem Zielort herstellen kann. Im allgemeinen wurden in einem Rattenmodell Teile des Darms physikalisch durch operatives Abbinden und Einschneiden der Abschnitte (am Duodenum, Jejunum, Ileum oder Kolon) isoliert. Pegyliertes G-CSF wurde in den isolierten Abschn itt des Intestinums verabreicht und Blutproben wurden in Bezug auf Serummengen von rhG-CSF durch ELISA überwacht. Obwohl nachweisbare Mengen von PEG-G-CSF im Serum aus allen Teilen des Darms auftraten, zeigen die Ergebnisse, dass eine Verabreichung von PEG-G-CSF an das Duodenum und das Ileum optimal ist (höchste Serummengen).
Beispiel 6 zeigt, dass mit einem Lipidträger assoziiertes PEG-G-CSF die therapeutische Reaktion verstärkt, die von an das Duodenum verabreichtem G-CSF hervorgerufen wird. PEG-G-CSF wurde mit Hilfe eines anionischen Lipids formuliert und intraduodenal verabreicht. Die Ergebnisse zeigen eine größere Zahl an weißen Blutkörperchen im Vergleich zu PEG-G-CSF alleine.
Beispiel 7 zeigt die Herstellung und Charakterisierung von pegyliertem Konsensus-Interferon.
Beispiel 8 zeigt die Proteolyse von unmodifiziertem Konsensus-Interferon bei Verwendung von Enzymen, die im Dünndarm vorgefunden werden, was zeigt, dass nicht-modifizertes Protein leicht proteolysiert wird, nachdem es den Magen erreicht.
Beispiel 9 zeigt die enterale Abgabe von Konsensus-Interferon. Wie bei pegyliertem G-CSF geht pegyliertes Konsensus-Interferon durch die Darmauskleidung hindurch und wird in Serum vorgefunden.
Die unten beschriebenen Beispiele dienen zum Zwecke der Veranschaulichung und sollen so verstanden werden, dass Variationen und Modifikationen für den Fachmann ersichtlich sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Gastrointestinaltrakt eines Nagers und stellt das in vivo-Modell einer intraduodenalen Verabreichung, das hier eingesetzt wurde, in einem Diagramm dar.
2 zeigt die Widerstandsfähigkeit von pegyliertem G-CSF gegenüber Proteolyse durch Trypsin in einem in vitro-Test.
3 zeigt die Gesamtreaktion weißer Blutkörperchen gegenüber PEG-G-CSF, das durch eine Infusion in das Duodenum verabreicht wurde, im Vergleich zu PEG-G-CSF, das i.v. verabreicht wurde, und nicht-pegyliertem rhG-CSF und Träger, die durch Infusion in das Duodenum verabreicht wurden.
4 zeigt die Serummengen von rhG-CSF nach intravenöser und intraduodenaler Verabreichung durch Infusion von PEG-G-CSF.
5 zeigt die Gesamtreaktion weißer Blutkörperchen gegenüber PEG-G-CSF, das durch einen intraduodenalen und intravenösen Bolus verabreicht wurde, und gegenüber nicht-pegyliertem G-CSF, das durch einen intraduodenalen Bolus alleine verabreicht wurde.
6 zeigt die rhG-CSF-Mengen im Serum in Reaktion auf eine Verabreichung durch einen intraduodenalen und intravenösen Bolus von PEG-G-CSF. Ebenfalls gezeigt ist die rhG-CSF-Menge im Serum in Reaktion auf eine Verabreichung durch einen intraduodenalen Bolus von nicht-pegyliertem rhG-CSF.
7(a) zeigt einen Vergleich von Serummengen an ¹²⁵I-markiertem PEG-G-CSF bei einer intravenösen und intraduodenalen Infusion durch eine Pumpe. 7(b) zeigt einen Vergleich des AUC (Fläche unter der Kurve) für jede Ratte nach einer intravenösen und intraduodenalen Verabreichung von ¹²⁵I-PEG-G-CSF.
8(a) und (b) zeigen Serummengen von rhG-CSF nach einer Verabreichung von PEG-G-CSF an verschiedene Abschnitte des Rattendarms.
9 ist ein Säulendiagramm, das den durchschnittlichen Netto-AUC der Serummengen von rhG-CSF nach einer Verabreichung von PEG-G-CSF an verschiedene Abschnitte des Rattendarms zeigt.
10(a) ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von DOPG auf die gesamte WBK-Reaktion zu einer intraduodenalen Infusion von rhG-CSF zeigt. 10(b) ist eine grafische Darstellung, die diese Reaktion bei Verwendung von PEG-G-CSF zeigt.
11 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von DOPG auf die Serummengen von PEG-G-CSF nach einer intraduodenalen Infusion durch eine Pumpe zeigt.
12 ist eine grafische Darstellung, die die Proteolyse von nicht-modifiziertem Konsensus-Interferon durch Trypsin und Chymotrypsin zeigt.
13 ist eine grafische Darstellung, die die Plasmaspiegel von nichtmodifiziertem Konsensus-Interferon zeigt, was durch Antikörperdetektion nach einer intravenösen Verabreichung oder intraduodenalen Verabreichung bestimmt wurde.
14 ist eine grafische Darstellung, die die Plasmaspiegel von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon zeigt, worin mehr als 50% des Konsensus-Interferons mit einem 1:1-Verhältnis von PEG:Proteinresten modifiziert ist, was anhand der Antikörperdetektion nach intravenöser oder intraduodenaler Verabreichung bestimmt wurde.
15 ist eine grafische Darstellung, die die Plasmaspiegel von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon zeigt, worin alle Moleküle drei oder mehr Polyethylenglykolreste enthalten, was durch Antikörperdetektion nach intravenöser oder intraduodenaler Verabreichung bestimmt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Beispiel 1: Herstellung von pegyliertem G-CSF
A. Herstellung von rekombinantem menschlichen met-G-CSF
Rekombinantes menschliches met-G-CSF wurde wie vorstehend beschrieben gemäß Souza, US-PS 4,810,643, hergestellt. Das verwendete rhG-CSF war ein von E. coli abgeleitetes rekombinantes Expressionsprodukt mit der (durch die DNA-Sequenz kodierten) nachstehend gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NOs:1 und 2):
(Dies war auch die nicht-pegylierte Zusammensetzung, die für die Kontrolltiere eingesetzt wurde.) Alternativ dazu kann man gekauftes Neupogen^® für die nachstehenden Pegylierungsverfahren verwenden (die US-Packungsbeilage davon ist hier durch eine Referenz umfasst). Rekombinantes menschliches Material wurde für die hier beschriebenen Untersuchungen an Nagern eingesetzt. Natürlich kann man bei der Behandlung von nicht-menschlichen Säugern, falls gewünscht, rekombinante nicht-menschliches G-CSFs verwenden wie rekombinantes G-CSF aus Maus, Rind, Kaninchen, usw.; vgl. z.B. WO 91/05798 und WO 89/10932.
B. Herstellung von chemisch modifiziertem G-CSF
Rekombinantes menschliches met-G-CSF mit vorherrschend 2, 3 oder 4 gebundenen Polyethylenglykolmolekülen wurde in den Beispielen mit pegyliertem G-CSF eingesetzt. Eine Bindung erfolgte über die reaktiven Aminogruppen. Das mittlere Molekulargewicht des pegylierten G-CSF betrug zwischen etwa 36 500 Dalton und etwa 42 500 Dalton, wobei das Molekulargewicht der Polyethylenglykolketten jeweils etwa 6000 Dalton betrug (das mittlere Molekulargewicht für dieses Material betrug zwischen etwa 29 kDa und etwa 90 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE). Wie vorstehend beschrieben, können die verwendeten Polyethylenglykolmoleküle verschiedene Größen besitzen. Frühere Untersuchungen zeigten jedoch (Daten nicht gezeigt), dass die Verwendung von G-CSF, das vorherrschend mit 2 oder 3 PEG-2000-Molekülen pegyliert ist, zu einer schnellen Beseitigung und daher zu keiner anhaltenden Zirkulierung (die für eine orale Verabreichung unerwünscht sein kann) führt. Der Grad der Derivatisierung mit Polyethylenglykol wurde auf folgende Werte bestimmt: monopegyliert, 3,4%; dipegyliert, 31,9%; tripegyliert, 49,3% und tetrapegyliert, 15,4%. Die in vitro-biologische Aktivität (wie bestimmt durch Aufnahmetests von 3H-Thymidin) wurde im Vergleich zu nicht-pegyliertem, rekombinantem met-G-CSF auf 9% bestimmt. Die in vivo-biologische Aktivität wurde auf 268% von nicht-pegyliertem rekombinanten met-G-CSF bestimmt.
Das nachstehende Verfahren wurde für die Herstellung des pegylierten G-CSF verwendet, das in den hier beschriebenen Untersuchungen eingesetzt wurde.
Das Polyethylenglykol wurde in drei Schritten hergestellt: Zuerst erfolgte die Synthese des Ethylesters von α-Carboxymethyl-ω-methoxypolyethylenglykol (CM-MPEG). 8,3 mmol Monomethoxypolyethylenglykol (MPEG) von Union Carbide (MW = 6000) wurde in 300 ml t-Butanol bei 50°C unter Stickstoff gelöst. 84 mmol Ethylbromacetat wurden sodann hinzugegeben und erneut über Nacht bei 50°C inkubiert. Nach Filtrierung durch einen gesinterten Glastrichter und nach Zugabe von 200 ml Methylenchlorid wurde das Filtrat 5-fach unter vermindertem Druck ein konzentriert. Der Ethylester von CM-MPEG wurde sodann durch Zugabe von 1 Volumen des konzentrierten Filtrats zu 5–10 Volumina Diethylether bei 4°C gefällt und auf einem gesinterten Glastrichter gesammelt und getrocknet.
Sodann erfolgte die Synthese von α-Carboxymethyl-ω-methoxypolyethylenglykol (CM-MPEG). 50 g des CM-MPEG-Ethylesters wurden in 200 ml 0,1 M NaOH gelöst. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff wurde die Lösung auf 4°C abgekühlt und der pH-Wert auf 3 mit 2 N HCl eingestellt. NaCl wurde vor einer Extraktion (3×) mit gleichen Volumina Methylenchlorid bis zur Sättigung hinzugegeben. Die kombinierte organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und auf ein Endvolumen von 100 ml einkonzentriert. Das CM-MPEG wurde durch Zugabe zu 500 ml Diethylether bei 4°C gefällt, gesammelt und 50 g wurden erneut in 150 ml 0,1 M NaOH gelöst. Das CM-MPEG wurde erneut durch Zugabe zu 500 ml Diethylether bei 4°C gefällt, gesammelt und getrocknet.
Sodann erfolgte die Vervollständigung der Synthese des N-Hydroxysuccinimidylesters von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol (SCM-MPEG). 5 mmol des CM-MPEG, 10 mmol N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 10 mmol Dicyclohexylcarbodümid (DCC) wurden in 120 ml wasserfreiem Methylenchlorid kombiniert. Nach 8-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt und das Filtrat vor einer Zugabe zu 600 ml Diethylether bei 4°C auf 50 ml einkonzentriert.
Das ausgefallene SCM-MPEG wurde durch Filtration auf einem gesinterten Glastrichter gesammelt und erneut in wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Nach einer zweiten Fällung in Diethylether wurde das SCM-MPEG gesammelt und getrocknet. Das SCM-MPEG wurde durch eine spektroskopische Analyse und durch HPLC vor einer Konjugation mit rhG-CSF charakterisiert.
Ein 15-facher molarer Überschuss des N-Hydroxysuccinimidylesters von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol (SCM-MPEG, wie vorstehend beschrieben hergestellt) wurde zu 100 ml einer Lösung von rhG-CSF (10 mg/ml, in 100 mM Bicin, pH 8,0) gegeben. Es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und sodann mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt (5×). Der pH-Wert wurde mit 1 mM HCl auf 4,0 eingestellt.
Das PEG-G-CSF wurde durch FPLC mit Hilfe einer Toyopearl SP 550C-Säule (5 × 17 cm) (Pharmacia) gereinigt, die mit 700 ml 0,2 N NaOH vorgewaschen und mit 1,3 1 Säulenpuffer, 20 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, vorequilibriert war. Das Reaktionsgemisch wurde bei einer Flussrate von 8 ml/min auf die Säule geladen und die Säule sodann mit 1 l des Säulenpuffers gewaschen. 1,3 l Elutionspuffer (Säulenpuffer mit 1 M NaCl) wurde auf die Säule in einem Schrittgradienten gepumpt und das PEG-G-CSF bei 350 mM NaCl eluiert.
Die PEG-G-CSF enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, auf etwa 100 ml in einer Amicon-Zelle mit einem Rührwerk unter Verwendung einer YM 10 Diaflo-Ultrafiltrationsmembran mit einem Durchmesser von 76 mm (Amicon) einkonzentriert. Es erfolgte sodann ein Puffer-Austausch des PEG-G-CSF unter Verwendung von 600 ml Formulierungspuffer (10 mM Natriumacetat, pH 4,0, 5% Mannit und 0,004% Tween 80). Die A₂₈₀ wurde bestimmt und das Protein auf 1 mg/ml mit Formulierungspuffer verdünnt, filtersterilisiert und in Gefäße verteilt.
Die in vitro-biologische Aktivität des pegylierten G-CSF wurde durch Messung der stimulierten Aufnahme von ³H-Thymidin in Knochenmarkszellen von Mäusen vor einer Verwendung in den nachstehenden Untersuchungen bestimmt. Die in vivo-biologische Aktivität wurde auch vor der Verwendung durch eine subkutane Injektion von Hamstern (20 oder 100 μg/kg PEG-G-CSF) und Messen der Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen (WBK) bestimmt. Die Bioaktivität wurde im Vergleich zu nicht-pegyliertem G-CSF als Fläche unter der WBK/Zeit-Kurve nach Subtraktion der Träger-Kontrollkurve berechnet. Die relative Bioaktivität des PEG-G-CSF wurde als Prozent der Bioaktivität im Vergleich zu nicht-modifiziertem G-CSF ausgedrückt (AUC_test/AUC_G-CSF × 100).
Beispiel 2: In vitro-Schutz vor im Intestinum auftretenden Proteasen
Diese Untersuchung zeigt, dass pegyliertes G-CSF in vitro extrem widerstandsfähig (ohne eine andere protektive Formulierung) gegenüber einer Proteolyse durch das Enzym Trypsin, das im Intestinum auftritt, ist. Obwohl nicht maßgebend, ist dieses Modell ein Hinweis auf die in vivo-Bedingungen im Intestinum, da etwa die gleichen Verhältnissen an Enzymen und physiologischen Bedingungen (pH-Wert, Temperatur, Salzgehalt) verwendet wurden.
Im allgemeinen wurde pegyliertes G-CSF (wie vorstehend beschrieben hergestellt) mit Trypsin inkubiert und die Reaktion nach verschiedenen Zeiträumen über eine Inkubationszeit von 4 Stunden abgebrochen. Die zu diesen Zeitpunkten entnommenen Proben wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting in Bezug auf den Abbaugrad getestet, wobei Antikörper gegen G-CSF verwendet wurden, die mit iodiertem Protein A nachgewiesen wurden. Die Ergebnisse, die in der grafischen Darstellung in 2 gezeigt sind, zeigen die schützenden Wirkungen der Pegylierung: nach 30 Minuten waren mehr als 90% des pegylierten Materials intakt, während etwa 55% des nicht-pegylierten Materials intakt waren. Nach 240 Minuten waren immer noch wenigstens 90% des pegylierten Materials vorhanden, während das nicht-pegylierte Material weniger als 30% betrug. In vivo gäbe es andere Enzyme und weitere Faktoren, die die Abbaugeschwindigkeit beeinflussen würden.
Die Verfahren waren wie folgt: rhG-CSF oder PEG-G-CSF, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, wurden bei 100 μg/ml in einem Gesamtvolumen von 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 37°C mit Trypsin (1 μg/ml, Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Die Zeiten sind angegeben. Bei den entsprechenden Zeitpunkten wurde eine 200 μl-Probe entnommen und zu einem Eppendorf-Röhrchen bei 4°C mit 9 μl eines Protease-Inhibitor-Cocktails gegeben, der aus N-Tosyl-L-lysinchlormethylketon (TLCK), 20 μg; (4-Amidinophenyl)-methansulfonylfluorid (APMSF), 16 μg; und alpha-2-Macroglobulin, 1 IU (alle von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bestand. Nach sorgfältigem Mischen wurden 5 μl der Probe (5 μg G-CSF) auf 5 μg/ml in PBS verdünnt. 50 ng des Proteins wurden unter reduzierenden Bedingungen wie von Lämmli (Nature 227:680–685 (1970)) beschrieben auf einem SDS-PAGE (Integrated Separations Systems oder ISS, Natich, MA) aufgetrennt. Nach einem Transfer wurde das Protein durch Inkubation mit einem polyklonalen Antikörper gegen rhG-CSF nachgewiesen. Der gebundene anti-G-CSF-Antikörper wurde sodann durch Inkubation des Blots mit ¹²⁵I-Protein A (Amersham, Arlington Heights, IL) und Autoradiographie nachgewiesen. Eine Quantifizierung des verbleibenden intakten Proteins und der Abbauprodukte erfolgte durch Ausschneiden und Auszählen des Immobilons unter Verwendung des Autoradiogramms als Vorlage.
Beispiel 3: In vivo-duodenale Verabreichung von pegyliertem G-CSF führt zu biologischen Wirkungen
Das in vivo-Rattenmodell, bei dem PEG-G-CSF direkt an das Duodenum verabreicht wird, ist ein Hinweis für eine orale Verabreichung, da es, wie vorstehend beschrie ben, Formulierungen für eine Verabreichung von Arzneimitteln an das Intestinum, jenseits der feindlichen Umgebung des Mundes, des Ösophagus und des Magens gibt. Die Tiere, denen pegyliertes G-CSF so verabreicht worden war, zeigten eine erhöhte Anzahl von weißen Blutkörperchen gegenüber den Kontrollen (nur Träger). Dies zeigt, dass das pegylierte, biologisch aktive G-CSF nicht nur bei den Bedingungen im Duodenum überlebte, sondern auch die Abgrenzung des Intestinums an den Blutkreislauf durchtrat.
Eine weitere Untersuchung verglich die Wirkungen einer intraduodenalen Verabreichung gegenüber einer intravenösen Verabreichung. Diese Bioäquivalenzanalyse zeigte, dass im Vergleich zu einer intravenösen Verabreichung intraduodenal verabreichtes PEG-G-CSF (1) 4–5% der biologischen Wirksamkeit besaß (wie bestimmt durch die Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen nach 90 Stunden) und (2) etwa 2% der Serummenge aufwies (wie bestimmt durch ELISA nach 90 Stunden). Die Art der Dosierung wurde auch verglichen, d.h. eine chronische Verabreichung gegenüber einer akuten Verabreichung. Dabei wurden die Reaktionen gegenüber durch eine Infusion und durch einen Bolus verabreichtem PEG-G-CSF verglichen.
Materialien und Verfahren
A. Tiere.
Männliche SPF-Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–350 g, die in Übereinstimmung mit allen anwendbaren Gesetzen und Regulierungen behandelt wurden, wurden eingesetzt. Für jede Kohorte wurden nachstehend 4 oder 5 Tiere verwendet.
B. Operativer Eingriff.
Die Tiere wurden mit 50 mg/kg intraperitonealem Nembutol betäubt. Das Duodenum aller Tiere wurde freigelegt und ein kleiner Einschnitt erfolgte in der Wand des Duodenums. Ein Katheter (für die Verabreichung des Arzneimittels verwendet) [10 cm Silastic-Medizinschlauch, 0,02 × 0,037 Zoll, Baxter, Irvine, CA] wurde in das distale Ende des Duodenums (etwa 8 cm) inseriert, so dass das PEG-G-CSF durch den operativen Einschnitt nicht in den Blutkreislauf eintreten würde (wodurch es ein Artefakt hervorrufen würde). Zudem stellt die Freisetzung des Arzneimittels am distalen Ende des Duodenums (in dem Teil, der nahe zum Jejunum liegt) einen Anhaltspunkt für die Wirkung einer Formulierung bereit, die für die Freisetzung einer aktiven Verbindung in das Duodenum geschaffen wurde (d.h. die typische Freisetzung könnte gerade oberhalb der Duodenum-Jejunum-Grenze erfolgen). Eine Freisetzung am distalen Ende vermeidet den Influx aus der Galle, der Proteasen enthält. Nach einer Verabreichung von PEG-G-CSF wurde der Einschnitt mit einer Tabaksbeutelnaht geschlossen und die Tiere gewöhnlich gehalten.
C. Verabreichung.
Die Verabreichung des pegylierten G-CSF erfolgte auf zwei Wegen: (1) durch eine direkte Bolusverabreichung durch den Katheter und (2) durch Infusion mit einer implantierten Pumpe (für eine Dauerverabreichung über einen Zeitraum von 24 Stunden). Für jeden Verabreichungstyp wurden eine Kontrollgruppe mit nicht-pegyliertem G-CSF und Träger-Kontrollen verwendet.
Für eine intraduodenale Bolusverabreichung wurde PEG-G-CSF (wie vorstehend beschrieben hergestellt) in eine 1 cc-Spritze mit einem Schlauchadapter gegeben und sodann durch den Katheter direkt in das Duodenum injiziert. Die Proteine wurden bei den angegebenen Dosen in das Duodenum in 200 μl Formulierungspuffer (10 mM Natriumacetat, pH 4,0 und 0,004% Tween 80) injiziert. Der Katheter wurde entnommen und die Sutur fest verschlossen. Das Tier konnte sich erholen.
Für eine intravenöse Bolusverabreichung (als Kontrollen verwendet) wurden 200 μl Formulierungspuffer mit der erforderlichen Proteindosis durch die Penisvene verabreicht.
Für die intraduodenale Pumpeninfusion wurde eine osmotische Pumpe [Alzet, miniosmotische Pumpe, Modell 2001D (Alza), Palo Alto, CA] an der Spitze des Katheters angebracht, die in der Peritonealhöhle lag (vgl. 1). Vor der Anbringung wurde die Pumpe mit pegyliertem G-CSF (wie vorstehend beschrieben hergestellt) oder mit Kontrollen in der angegebenen Dosis in 221 μl Formulierungspuffer gefüllt und die Pumpe durch Osmose aktiviert (durch Absorption von Wasser aus dem Tier, um das Arzneimittel herauszudrücken), um 8–9 μl/h 24 Stunden lang zu verabreichen. In allen Fällen betrifft der für die Dosis angegebene Wert die Gesamtdosis über 24 Stunden. Der Einschnitt wurde geschlossen und das Tier konnte sich erholen.
Für die intravenöse Pumpeninfusion des Proteins erfolgte ein Einschnitt (etwa 3–4 cm) unter dem Nacken der Ratte. Die linke Halsvene wurde freigelegt und der 10 cm Silastic-Katheter 2 cm in die Vene eingeführt. Die Alzet-Pumpe mit den Proteinen wurde an den Katheter angebracht und in das Genick zwischen den Schulterblättern implantiert.
D. Dosierung.
Für eine intraduodenale Infusion wurden die Proteine, PEG-G-CSF und nicht-pegyliertes G-CSF, in Dosen von mehr als 750 μg/kg über 24 Stunden an die Tiere verabreicht (für die tatsächlichen Mengen vgl. die Figuren). Für die intravenöse Infusion betrugen die Proteindosen weniger als 50 μg/kg über 24 Stunden. Den Tieren, die Proteine über eine intraduodenale Bolusverabreichung erhielten, wurden Dosen von 500 μg/kg verabreicht, während die intravenöse Bolus-Dosis ~5 μg/kg betrug.
E. Aufzeichnung.
Für die intraduodenalen Infusionsuntersuchungen wurden Blutproben (500 μl) aus der Schwanzvene aller Test- und Kontrollgruppen in 12 Stunden-Intervallen 96 Stunden lang entnommen. Im Fall der Untersuchungen mit der Bolus-Injektion wurden intraduodenale oder intravenöse Blutproben (500 μl) durch einen Dauerkatheter in der rechten Halsvene entnommen. Die Katheter wurden 2 Tage vor der Verabreichung des Arzneimittels implantiert, damit sich die Tiere erholen konnten und wurden durch zweifaches Spülen pro Tag mit 100 μl Salzlösung mit 20 U/ml Heparin durchgängig gehalten.
Die Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen wurde mit Hilfe eines Sysmex (Baxter, Irvine, CA) F-800-Mikrozellen-Zählgeräts bestimmt. Serum wurde durch Zentrifugation der Blutproben in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 12 000 Upm (11 750 × g) für 15 Minuten hergestellt. Das Serum wurde entfernt und bei –80°C bis zur Durchführung eines ELISA für rhG-CSF gelagert.
Die Serummengen von PEG-G-CSF und nicht-pegyliertem G-CSF wurden durch ELISA mit einem monoklonalen Antikörper, der für G-CSF spezifisch war, bestimmt (Quantikine, erhältlich von R&D Systems, Indianapolis, Indiana, US), wobei gemäß den Herstelleranleitungen, die hier durch eine Referenz umfasst sind, vorgegangen wurde. Die Standardkurven wurden mit 5000 pg/ml bis 78 pg/ml genau des gleichen Proteins, das an die Tiere verabreicht worden war, erstellt. Die Serummengen der Proteine wurden sodann aus der relevanten Kurve bestimmt.
Ergebnisse
1. Intraduodenale Infusion (3 und 4).
Wie in 3 zu erkennen, wies die Kohorte, die intraduodenal PEG-G-CSF erhielt, viel höhere Gesamtzahlen an weißen Blutkörperchen nach 12 Stunden (~36 000/μl) auf als die intraduodenalen nicht-pegylierten Kontrollen (~16 000/μl). Man kann auch erkennen, dass die letzte Gruppe, genauso wie die i.d. Trägergruppe die WBK-Zahl der Basislinie (T=0) nicht überschreitet (vgl. 3). Ein interessanter Punkt ist, dass das intraduodenal verabreichte PEG-G-CSF eine frühere Erhöhung der weißen Blutkörperchen stimuliert als eine intravenöse Verabreichung. Die Dosen für die intraduodenale und intravenöse Verabreichung sind jedoch sehr unterschiedlich (da der Vergleich dieser Reaktionen für die Bestimmung der Bioäquivalenz erfolgte, vgl. Tabelle 2). Diese frühere Erhöhung der WBK-Zahl kann das Ergebnis der verschiedenen Dosen oder Verabreichungswege sein, dadurch, dass (a) es einen Unterschied in der Geschwindigkeit der Produktion weißer Blutkörperchen gibt oder (b) es einen Unterschied in der Aktivierung von Neutrophilen und daher der Margination gibt oder (c) eine Kombination aus beidem. Eine weitere Beobachtung ist, dass weder das nicht-pegylierte G-CSF noch die Träger-Kohorten eine erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen bis nach 48 Stunden (nachdem sich die PEG-G-CSF-Reaktion zu erhöhen begann) zeigten und dies kann auf der Abstoßung der osmotischen Pumpe oder auf anderen Artefakten des Immunsystems beruhen.
Die Serummengen für das gleiche Experiment sind in 4 gezeigt. Keine Werte sind für die Kontrollgruppe mit nicht-pegyliertem G-CSF gezeigt, da mit dem ELISA-Test keine nachweisbaren Serummengen von rhG-CSF (d.h. weniger als 50 pg/ml) nachgewiesen werden konnten. Die Serummengen, die durch eine intraduodenale und intravenöse Infusion von PEG-G-CSF erreicht wurden, sind aufgrund der verschiedenen Dosen nicht direkt vergleichbar. Anstelle dessen wurden diese Daten für die Bestimmung einer Bioverfügbarkeit eingesetzt und sind in Tabelle 2 gezeigt. Man kann jedoch erkennen, dass die Serummengen von PEG-G-CSF nach einer intraduodenalen Infusion des Proteins stark erhöht sind, während die nach einer Verabreichung über denselben Weg von nicht-pegyliertem G-CSF nicht nachweisbar sind.
2. Bolusverabreichung (5 und 6).
Wie in 5 zu erkennen, betrug die Gesamtzahl an WBK für die Testgruppe nach 5 Stunden etwa 21 500/μl, während im Fall der G-CSF-Kontrollgruppe die Menge nach 5 Stunden viel geringer war (etwa 16 000/μl) und nicht signifikant gegenüber der Basislinie (T=0) erhöht war. Wie in dieser Figur ebenfalls zu erkennen, erzeugte G-CSF alleine eine Wirkung in dem kurzen Zeitraum, was zeigt, dass die Abgrenzung des Intestinums ein Überschreiten der größeren pegylierten und der kleineren nicht-veränderten Moleküle ermöglichte. Die fortwährenden WBK-Mengen für das pegylierte Produkt zeigen einen Schutz vor der Umgebung des Duodenums und eine erhöhte Zirkulationszeit im Serum im Vergleich zu nicht-pegyliertem G-CSF. Der gleiche schnelle Anstieg der WBK ist bei der i.d.-Verabreichung im Vergleich zu der i.v.-Verabreichung zu erkennen. 6 zeigt die durch ELISA bestimmten Serummengen an PEG-G-CSF, das durch den i.d.- und i.v.-Weg verabreicht wurde und von nicht-pegyliertem Material, das durch den i.d.-Weg verabreicht wurde. Im Fall der pegylierten Kohorte blieben die Serummengen während der ersten 6 Stunden relativ konstant und erhöhten sich danach allmählich, wobei die Erhöhung eine Parallele zu dem i.v. verabreichten Material bildete. Wie zu erkennen, entsprachen die Serummengen des nicht-pegylierten G-CSF den halben Werten der PEG-G-CSF-Gruppe und waren extrem variabel (manche Tiere wiesen nicht-nachweisbare Mengen auf) und lagen unterhalb der Nachweisgrenze in der gesamten Gruppe nach 6 Stunden.
3. Bioäquivalenz-Untersuchung.
Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um die intraduodenale Verabreichung der Proteine mit einer intravenösen Verabreichung zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine intraduodenale Verabreichung durch das Infusionsverfahren etwa 4% bis 5% der biologischen Wirksamkeit ("Bioäquivalenz") von intravenös verabreichtem pegylierten G-CSF aufweist, wie durch die Anzahl an weißen Blutkörperchen bestimmt wurde. Daten, die diese WBK-Anzahl betreffen, sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Die Bioverfügbarkeit, die durch die Serummengen (1,8%) bestimmt wurde, ist etwas niedriger als die aufgrund der WBK bestimmte (4,6%). Die Daten, die die Serummengen betreffen, sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
Im allgemeinen wird der prozentuale Wert für eine Bioäquivalenz durch Messen der Fläche unter der Kurve für die Anzahl der weißen Blutkörperchen ("AUC") für intraduodenal verabreichtes ("id") Material (für den Träger berichtigt) und Dividieren dieser Zahl durch den AUC für intravenös ("iv") verabreichtes Material (erneut für den Träger berichtigt) bestimmt. Diese Zahl wird mit der reziproken Dosis multipliziert. Das Produkt wird mit 100 für die prozentuale Angabe multipliziert. Für eine Bioverfügbarkeit im Hinblick auf das Serum ist die Berechnung die gleiche.
Die Gleichung kann wie folgt dargestellt werden:
In den nachstehenden Tabellen bedeutet "NN" nicht nachweisbar.
Tabelle 1 Bioäquivalenz von PEG-G-CSF_id gegenüber PEG-G-CSF_iv, wie bestimmt anhand der Anzahl an weißen Blutkörperchen
Tabelle 2 Bioverfügbarkeit von PEG-G-CSF_id gegenüber PEG-G-CSF_iv wie bestimmt anhand von Serummengen
Somit zeigt Tabelle 1, dass nach einer id-Infusion für 24 Stunden von PEG-G-CSF das Material in den Blutkreislauf eingetreten war und eine messbare biologische Reaktion aufweist, die viel stärker (4,6%) ist als für natives rhG-CSF (0%). Tatsächlich stimuliert nicht-pegyliertes rhG-CSF bei einer id-Infusion keine Reaktion weißer Blutkörperchen und es treten keine nachweisbaren Mengen des Proteins im Serum auf.
Im Gegensatz dazu führte eine Bolusverabreichung von PEG-G-CSF und rhG-CSF nicht zu solch großen Unterschieden zwischen den zwei Proteinen. Der Grund für die nahezu gleichen WBK-Reaktionen für das PEG-G-CSF und für natives G-CSF liegt möglicherweise in der Tatsache, dass die erfassten Zeitpunkte nicht jenseits von 24 Stunden lagen und daher der Hauptteil der PEG-G-CSF-Reaktion, d.h. ein langdauernder erhöhter WBK-Wert, nicht gemessen wurde. Ein Vergleich der Se rummengen von PEG-G-CSF und rhG-CSF über ausschließlich den 24 Stunden-Zeitraum zeigt eine viel stärkere Bioverfügbarkeit des pegylierten Proteins, wobei der AUC 10-fach höher ist. Man kann jedoch erkennen, dass die Serummengen nach der Bolusverabreichung von PEG-G-CSF viel geringer sind als nach der Infusion (0,05% Bioverfügbarkeit im Vergleich zu 1,8%). Es scheint, dass die Infusion des Proteins die beste Bioverfügbarkeit und therapeutischen Reaktionen bereitstellt und dass eine Tablettenformulierung, die eine Langzeit- oder Dauerexposition des Darms gegenüber PEG-G-CSF bereitstellt, bevorzugt wäre.
Diese Daten sind ferner in 3 veranschaulicht. Wie zu erkennen, weist intraduodenal verabreichtes PEG-G-CSF eine frühere Wirkung auf die Anzahl weißer Blutkörperchen auf als intravenös verabreichtes PEG-G-CSF. Ebenfalls gezeigt sind die Kontrollen mit Träger und nicht-pegyliertem G-CSF, die keine solche Erhöhung der Anzahl an weißen Blutkörperchen aufweisen. Die nach 24 Stunden für den Träger gezeigte Erhöhung kann auf einer Abstoßung der osmotischen Pumpe oder auf anderen Artefakten des Immunsystems beruhen.
4 veranschaulicht weiter die intravenöse und intraduodenale Verabreichung von PEG-G-CSF. Obwohl die verabreichten Dosen sehr unterschiedlich sind, zeigt 4, dass die Beseitigungsgeschwindigkeit des id verabreichten PEG-G-CSF ähnlich zu der für intravenös verabreichtes Material ist. Erneut waren wie durch die Daten der Tabelle 1 gezeigt die Serummengen an nicht-pegyliertem G-CSF nicht messbar.
Somit zeigen die hier aufgeführten in vivo-Untersuchungen die Verfügbarkeit eines chemisch modifizierten Proteins für die Aufnahme durch das Intestinum und die therapeutische Aktivität eines solchen Proteins. Insbesondere zeigen die Untersuchungen, dass an das Intestinum verabreichtes, pegyliertes G-CSF im Blutkreislauf auftritt und eine Erhöhung der Anzahl an weißen Blutkörperchen hervorruft. Es wird deutlich, dass die orale Formulierung einer derartigen Zusammensetzung ein nützliches Arzneimittel sein wird.
Beispiel 4: Bestätigung der Serummengen
Eine interessante Beobachtung bei Einsatz des ELISA-Tests war, dass im Fall des Infusionssystems die Serummengen an PEG-G-CSF abnahmen, während die Pumpe aktiv war. Zusätzlich war die Bioverfügbarkeit des Proteins, dargestellt durch die Serumwerte, durchwegs niedriger als die Bioäquivalenzwerte, d.h. die Reaktion, und dies galt insbesondere für die Bolusverabreichung. Um diese Daten zu bestätigen, wurde ein sensitiverer Test eingesetzt. Die Daten wurden bestätigt (vgl. nachstehende Tabelle 3). Eine Erklärung dafür ist, dass die anfängliche Reaktion gegenüber PEG-G-CSF eine rasche Erhöhung der Menge an Neutrophilen hervorruft. Das Auslösen dieses raschen Anstiegs erhöhte auch die apparente Beseitigung des Proteins, möglicherweise aufgrund einer Erhöhung der Anzahl an G-CSF-Rezeptoren auf den Neutrophilen. Mit dem Anstieg der Neutrophilenzahl scheinen die Serummengen des Proteins abzunehmen (da es an die Neutrophilen gebunden wird und so nicht im Serum erscheint; es tritt somit keine Anhäufung von PEG-G-CSF im Serum auf). Dies stimmt mit den veröffentlichten Ergebnissen überein; vgl. G. Morstyn et al., TIPS 10:154–159 (1989); Layton et al., Blood 74:1303–1307 (1989).
Für diesen Test wurde ¹²⁵I-markiertes PEG-G-CSF in den vorstehend beschriebenen Verfahren mit einer iv- und id-Verabreichung verwendet. Der Unterschied liegt in der Dosierung, da hier 1/1000 der in den vorhergehenden Untersuchungen verwendeten Dosis eingesetzt wurde: 661 ng/kg für die intravenöse Verabreichung und 728 ng/kg für die intraduodenale Verabreichung (während Mikrogramm-Mengen zuvor verwendet wurden). Die Gesamt-Blutmengen an TCA-präzipitierbarem ¹²⁵I-Marker wurden in einem Cobra 5000 Gamma-Zähler (Packard, Downers Grove, IL) bestimmt und die Daten in Picogramm pro ml umgerechnet.
Die Ergebnisse der intravenösen und intraduodenalen Verabreichung des ¹²⁵I-markierten PEG-G-CSF sind in 7a gezeigt. Wie zu erkennen, wurden durch die Verabreichung von niedrigen, nicht-therapeutischen Dosen des Proteins, wobei eine Erhöhung der Neutrophilen nicht stimuliert wurde, Mengen im Fließgleichgewicht an PEG-G-CSF durch beide Verabreichungswege erreicht. Sobald die Pumpen nach 24 Stunden fertig waren, nahmen parallel dazu die Mengen des Proteins im Blut ab, wie man erwarten würde. Selbst mit der erhöhten Nachweis-Sensitivität dieses Verfahrens sind Blutmengen unter 20 pg/ml nicht nachweisbar (vgl. die id-Verabreichung).
Eine Berechnung des einzelnen AUC für jedes Tier in der Kohorte ist in 7b gezeigt und dies ist ohne die Veränderung bei der Beseitigung des Proteins ein genaueres Maß für die eigentliche Bioverfügbarkeit. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3 Bioverfügbarkeit von ¹²⁵I-markiertem PEG-G-CSF_id gegenüber ¹²⁵I-markiertem PEG-G-CSF_iv, wie bestimmt unter Verwendung von Gesamt-Blutmengen.
Die Daten für den AUC ergeben einen Wert für die Bioverfügbarkeit von 3,5% im Vergleich zur intravenösen Verabreichung, die dem Wert von 4,6% für die in Tabelle 1 dargestellte Bioäquivalenz näher kommt.
Beispiel 5: Lokalisierung des Verabreichungsziels im Dünndarm
Wie vorstehend beschrieben, ist eine Vielzahl oraler Dosierungsformulierungen verfügbar und in einem Aspekt erfolgt die Formulierung derart, dass sich die Tablette (oder Kapsel, usw.) an einem gewünschten Ort im Darm auflöst. Diese in situ-Untersuchung erfolgte, um die Stelle im Dünndarm aufzufinden, bei der die Bioverfügbarkeit, die anhand der Serummengen des Proteins bestimmt wurde, optimal (in diesem Fall maximal) war. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Verabreichung an das Duodenum und das Ileum die höchsten Serummengen des Proteins liefern.
Materialien und Verfahren
Das hier verwendete in sihi-geschlossene Schleife-Tiermodell war eine modifizierte Version des von Schilling und Mitra, Pharm. Res. 9:1003–1009 (1992) beschriebenen.
Tiere:
Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 g hungerten 16–20 Stunden vor dem Experiment. Wasser wurde ad libitum gegeben. Die Tiere wurden durch eine intraperitoneale Injektion eines Gemisches aus 90 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin anästhetisiert. Ein Drittel bis eine Hälfte der ursprünglichen Dosis wurde danach alle 45–60 Minuten verabreicht, um den Zustand der Anästhesie/Analgesie aufrechtzuerhalten. Die innere Körpertemperatur wurde auf 37°C gehalten, indem das Tier auf ein Heizkissen gelegt wurde.
IV-Katheterisierung.
Die Kanülierung der rechten externen Halsvene erfolgte durch Insertion eines 10 cm langen Stücks eines Silastic-Schlauchs (Baxter, Irvine, CA). Ein Kragen aus einem 1 cm langen Stück eines PE 200 Polyethylenschlauchs wurde am äußeren Ende des Silastic-Schlauchs angebracht. Vor einer Insertion wurde die Kanüle mit einer Salzlösung mit 10 U/ml Heparin gefüllt. Eine 23 Gauge-Nadel wurde in die Kanüle inseriert und zusammen mit einer heparinisierten 1 ml-Spritze für das Entfernen von Blutproben eingesetzt.
Katheterisierung des Gallengangs.
Eine Kanülierung des Gallengangs war notwendig, um eine übermäßige Anhäufung von Galle in dem nicht-abgebundenen Darm über die 4 Stunden des Experiments zu verhindern. Ein abdominaler Einschnitt an der Mittellinie erfolgte und das Duodenum und ein kleiner Teil des Intestinums wurden herausgezogen und auf ein Mullkissen gelegt, das mit physiologischer Salzlösung befeuchtet war, um den Gallengang zu exponieren. Es erfolgten zwei Ligaturen, wobei eine Ligatur unmittelbar vor dem Pankreasgewebe fest abgebunden wurde, um den Gallenfluss zu vermeiden und die zweite Ligatur teilweise 5 mm von der ersten Ligatur und in der Nähe der Leber abgeschnürt wurde. Ein Polyethylenschlauch (0,28 mm id und 0,61 mm od), der an einem Ende abgeschrägt war, wurde in den Gallengang in Richtung der Leber durch einen feinen Einschnitt eingebracht. Der Katheter wurde jenseits der zweiten Ligatur vorgeschoben, die sodann geschlossen wurde, um den Katheter im Gallengang zu sichern. Die freien Enden der ersten Ligatur wurden sodann gesichert.
ID-Verabreichung.
Sodann wurden die Abschnitte des Intestinums mit einer Schnur gemessen. Die Experimente wurden mit einzelnen Tieren durchgeführt, um die Resorption von PEG-G-CSF aus dem Duodenum (11 cm vom Pylorus), dem proximalen Jejunum (20 cm vom Pylorus), dem distalen Ileum (6 cm oberhalb des Caecums) und des Kolons (10 cm vom Caecum) zu testen. Der gewünschte Abschnitt wurde an jedem Ende geöffnet und ein Stück eines Tygon-Schlauchs (4 mm o.d. von VWR Scientific, Cerritos, CA) wurde in die proximale Öffnung inseriert. Eine Peristaltik-Pumpe wurde verwendet, um 30 ml physiologische Salzlösung (Abbott Laboratories, Chicago, IL) bei 37°C und 2 ml/min in das Intestinum zu perfundieren, um den restlichen Darminhalt zu entfernen. Jeder Abschnitt (10 cm) wurde über und unter den Einschnitten geschlossen, um einen Flüssigkeitsverlust zu verhindern und Luft wurde durch den Abschnitt gepumpt, um die restliche Salzlösung zu entfernen. Eine PEG-G-CSF-Lösung in 500 μl Formulierungspuffer (10 mM Natriumacetat, pH 4,0, 5% Mannit und 0,004% Tween 80) wurde bei einer Dosis von 750 μg/kg in den mittleren Teil des Abschnitts mit Hilfe einer 27 Gauge-Halbzollnadel injiziert. Der Abschnitt wurde vorsichtig in seine ursprüngliche Position innerhalb der Peritonealhöhle zurückgebracht und die Abdomenhöhle mit Operationsklammern verschlossen. Blutproben (250 μl) wurden 0, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180 und 240 Minuten nach einer Verabreichung für die Bestimmung der rhG-CSF-Konzentrationen im Plasma entnommen. Die Volumina der Blutproben wurden während des gesamten Experiments durch das gleiche Volumen physiologischer Salzlösung in dem Tier ersetzt.
Intravenöse Verabreichung.
Für die Bestimmung der Bioverfügbarkeit von enteral resorbiertem PEG-G-CSF wurde das pegylierte Cytokin durch die Penisvene (50 μg/kg in 100 μl Formulierungspuffer) an eine nüchterne, mit Kanülen versehene (iv und Gallengang) Ratte verabreicht. Blutproben wurden genauso wie bei der id-Verabreichung entnommen.
Analyse.
Plasma wurde abgetrennt, dadurch, dass das Blut zuerst in ein EDTA-beschichtetes Eppendorf-Röhrchen, das auf Eis gehalten wurde, gegeben und sodann bei 10 000 Upm 15 Minuten zentrifugiert wurde. Serumproben wurden eingefroren und bei –80°C bis zur Untersuchung auf rhG-CSF durch einen ELISA von R&D Systems gelagert.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Daten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Fehlerrate, wie durch Fehlerbalken gezeigt, kann zum Teil darauf beruhen, dass die 3 Tiere der Gruppe an getrennten Tagen untersucht wurden. Dies würde die Unterschiede in jeder Untersuchung erhöhen, obwohl Berichtigungen für bestimmte Veränderungen erfolgten, d.h. das Gewicht der Ratten, usw. 8 zeigt jedoch, dass die höhergelegenen Bereiche des Darms, d.h. das Duodenum und das Ileum, in Bezug auf eine Resorption von PEG-G-CSF im Vergleich zu den niederen Bereichen, wie das Kolon, bevorzugt sind.
Diese Tatsache wird durch die AUC-Analyse für Serummengen des Proteins bestätigt, die in 9 gezeigt sind. Unerwarteterweise zeigen die Daten deutlich, dass der Dünndarm die bevorzugte Stelle für eine orale Verabreichung von PEG-G-CSF ist, im Gegensatz zum Dickdarm, der nicht bevorzugt ist. Man nimmt im allgemeinen an, dass das Kolon die durchlässigste Region des Darms ist und abgesehen von der vorhandenen Bakterienflora für Proteine weniger kritisch ist als die Proteaseaktiveren Regionen des Duodenums, Jejunums und Ileums.
Weitere Untersuchungen können weitere Information in Bezug auf die Dosierung und die Extrapolierung der optimalen Formulierung von Spezies zu Spezies bereitstellen.
Beispiel 6: Formulierung von PEG-G-CSF mit Dioleoylphosphatidylglycerin
Rekombinantes menschliches G-CSF kann stark mit einem negativ geladenen Lipid interagieren, das die Stabilität des G-CSF-Proteins erhöht. PEG-G-CSF bildet ebenfalls diese starke Interaktion mit schützenden Wirkungen. Dieses Beispiel zeigt, dass die schützenden Wirkungen eine positive Wirkung auf die intraduodenale Bioverfügbarkeit von PEG-G-CSF nach Formulierung des Proteins mit einem negativ geladenen Lipid aufweisen.
Dieses Beispiel betrifft das negativ geladene Lipid Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG). Andere Formulierungen, bei denen negativ geladene Lipide zusammen mit Proteinen verwendet werden, die den geschmolzenen Globularzustand bilden können, sind in der zugleich anhängigen U.S.S.N. 08/132,413, "Stable Proteins: Phospholipid Composition and Methods" beschrieben, die hier durch eine Referenz umfasst ist. Die Verwendung solcher negativ geladener Lipide als Binder in oralen Dosierungsformulierungen wurde zuvor gezeigt und kann bei den hier beschriebenen oralen Dosierungsformen hilfreich sein.
Verfahren.
DOPG von Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, Alabama, wurde in wasserfreiem Chloroform in einer Endkonzentration von 100 mg/ml gelöst. 100 μmol des Lipids (797 μl) wurden unter vermindertem Druck getrocknet und sodann 1 ml Milli-Q-Wasser hinzugefügt, um eine 100 mM-Lösung des Lipids herzustellen. Diese Lösung wurde 5 Minuten in einem Sonifizierungswasserbad (Modell G 112SP1T von Laboratories Supply Inc., Hicksville, NY) sonifiziert oder bis die Lipidlösung klar war. 9 μmol der DOPG-Lösung (90 μl) wurden zu 90 nmol rhG-CSF oder PEG-G-CSF, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, in 1 mM HCl hinzugegeben. Die Lösung wurde gevortext und auf ein Endvolumen von 2 ml mit 1 mM HCl eingestellt. Die Lösung wurde sodann in die Alzet-osmotischen Pumpen gegeben und in die Tiere wie zuvor beschrieben implantiert. Die Dosen sind in 10 gezeigt.
Ergebnisse.
Die Ergebnisse sind in 10, in der eine Wirkung auf die Anzahl der weißen Blutkörperchen dargestellt ist, und in 11 gezeigt, in der die Serummengen dargestellt sind. Bei der Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen erzeugte die Verwendung von PEG-G-CSF eine stärkere Reaktion selbst im Vergleich zu nicht-pegyliertem G-CSF + DOPG (vgl. 10(a) und 10(b)). Ein Vergleich von PEG-G-CSF ohne DOPG und PEG-G-CSF + DOPG in 10(b) verdeutlicht, dass DOPG die biologische Wirkung in Bezug auf die erhöhte Gesamtzahl weißer Blutkörperchen von an den Darm verabreichtem PEG-G-CSF verstärkt. Die Verstärkung durch PEG-G-CSF + DOPG entsprach nahezu dem zweifachen Wert von PEG-G-CSF alleine.
Die Ergebnisse werden durch die Serummengen des Proteins bestätigt, die in 11 gezeigt sind. Wie zu erkennen, führt eine enterale Infusion von PEG-G-CSF + DOPG zu einer wenigstens zweifachen Erhöhung der Serummengen des Proteins gegenüber PEG-G-CSF alleine. Die Pharmakokinetiken des derivatisierten Proteins sind jedoch unverändert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung eines anionischen Lipids wie DOPG in einer oralen Formulierung von PEG-G-CSF die therapeutische Reaktion erhöht, die durch das derivatisierte Protein ausgelöst wird. Die verstärkte Reaktion scheint das Ergebnis einer besseren Bioverfügbarkeit des PEG-G-CSF zu sein.
Beispiel 7: Herstellung und Charakterisierung der Pegylierung von IFN-Con₁
Für die vorliegenden Studien wurde pegyliertes IFN-Con₁, wie beschrieben in den U.S.-PSen 4,695,623 und 4,897,471, verwendet. Das pegylierte Material wurde präpariert und gemäß dem Derivatisierungsgrad fraktioniert.
Verfahren.
20 mg IFN-Con₁ (1 μmol wurde mit einem 20-fachen molaren Überschuss 6K SCM-MPEG (Union Carbide, S. Charleston, WV) (123 mg oder 20 μmol in 6,26 ml 1× PBS bei pH 7,0 vermengt. Die Reaktion wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur vor Verdünnung (x3) auf 20 ml mit destilliertem Wasser gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde vor der Aufreinigung unter Verwendung von FPLC auf einer S-Sepharose-HP-Säule (1,6 × 10 cm) (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit 40 ml 0,2 N NaOH vorgewaschen und mit 100 ml Säulenpuffer, 20 mM Natriumcitratpuffer pH 3,5 (Puffer A) vorequilibriert war, mit 20 mM Natriumcitrat, pH 3,5 verdünnt (2×). Das Reaktionsgemisch wurde auf die Säule bei einer Flussrate von 1 ml/Minute geladen. Die Säule wurde dann mit 60 ml des Säulenpuffers gewaschen. Das PEG-IFN-Con₁ wurde mit 20 Säulenvolumina (oder 400 ml) Elutionspuffer, 20 mM Natriumcitrat, pH 3,5, der 1 M NaCl enthielt, (Puffer B) eluiert, der als ein linearer Gradient mit 0 bis 45% und dann mit einem Säulenvolumen (oder 20 ml) eines linearen Gradienten aus 45%–70% aufgetragen wurde. Puffer B wurde bei 70% für drei Säulenvolumina (oder 60 ml) gehalten. Das PEG-IFN-Con₁ wurde von der Säule zwischen 30–70% Puffer B eluiert.
Ergebnisse.
Für die vorliegenden Studien wurde IFN-Con₁, das zu unterschiedlichen Graden mit SCM-MPEG derivatisiert war, verwendet. Gruppen von fünf Fraktionen wurden gesammelt und von der FPLC gepoolt und diese Fraktionen wurden dann konzentriert und charakterisiert.
Charakterisierung durch Größenausschlusschromatographie
Verfahren.
Bei den Fraktionen wurde der Puffer gegen 1 × PBS auf PD-10-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) ausgetauscht. Das PEG-IFN-Con₁ befand sich in einem Endvolumen von 3,5 ml und die Proteinkonzentration wurde durch Absorption bei A280 bestimmt (Extensionskoeffizient = 1,14). Die Fraktionen wurden durch Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex 200-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) charakterisiert, mit 100 mM NaPO₄, pH 6,9 eluiert und bei 280 nm durch einen UV-Detektor detektiert. Die Fraktionen wurden auch auf einer 4–20% SDS-PAGE analysiert (Novex, San Diego, CA).
Ergebnisse.
Das PEG-IFN-Con₁ wurde in Gruppen mit unterschiedlichen Pegylierungsgraden des Proteins aufgeteilt, wie zusammengefasst in Tabelle 4. "Kein PEG" bezeichnet solche Moleküle, bei denen nachweisbare Polyethylenglykolreste fehlen. Die Verhältnisse (" 1:1", "2:1", etc.) bezeichnen die PEG-Rest:IFN-Con₁-Rest-Verhältnisse in jeder Fraktion ("F1" bis "F6"). Es geht hervor, dass Fraktion 1 den größten Anteil von Tri-, Tetra- und Penta-pegylierten IFN-Con₁-Molekülen enthielt.
Tabelle 4 Fraktionen von PEG-IFN-Con₁.
Zur Bestimmung der Wirkung der Pegylierung auf die enterale Bioverfügbarkeit des Proteins wurden die Fraktionen F1 (bei der nahezu alles Protein mindestens 3 Polyethylenglykolmoleküle enthält) und F5 (bei der eine Mehrzahl der Moleküle weniger als drei gebundene Polyethylenglykolreste aufweist) in den Tierstudien verwendet.
In vitro-Bioaktivität.
Das F5-derivatisierte Material zeigte eine Aktivität in vitro, was durch Messung der Inhibition der viralen Replikation in einer kultivierten Zelllinie bestimmt wurde, jedoch zeigte das F1-Material keine solche Aktivität.
Verfahren.
HeLa-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 15 000 Zellen/Vertiefung ausplattiert und für 24 Stunden bei 37°C bei 5% Kohlendioxid in Grundmedium (Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM), das 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 Gew.-% nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1 Gew.-% Gentamicinsulfat und 1% HEPES-Puffer enthielt) mit 10% FBS inkubiert. IFN-Con₁ wurde mit mehreren Verdünnungen im Bereich von 40 bis 0,02 ng/ml (40 000 bis 19,53 Einheiten) in Grundmedium und 0,2% FBS hergestellt. Einhundert Mikroliter von jedem Standard und des geeigneterweise verdünnten PEG-IFN-Con₁ wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Für die Positiv(kein IFN-Con₁) und Negativ- (kein Virus) Kontrollen wurden 100 μl Grundmedium alleine zugegeben. Nach der weiteren Inkubation für 19 bis 23 Stunden wurde das Medium abgesaut und mit 100 μl des Anregeviruses, d.h. Enzephalomyocarditisvirus (EMCV) bei einer Verdünnung, die 100–1000 Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID)-Einheiten entspricht, in DMEM mit 1% FBS ersetzt. Die Platten wurden weiter für ungefähr 22 Stunden inkubiert, das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mit 200 μl wasserfreiem Methylalkohol für fünf Minuten fixiert. Das Fixat wurde entfernt und die Zellen wurden es wurde 30 Minuten in 0,5% Gentian-Farbstoff gefärbt, dann vom Farbstoff freigespült und für eine halbe bis 2 Stunden luftgetrocknet. Der Farbstoff wurde mit 200 μl Ethylenglykolmonomethylether eluiert und es wurde 30 Minuten geschüttelt. Die Absorption von jeder Vertiefung bei 650 nm wurde in einem V-max-kinetischem Mikroplattenlesegerät, Modell 88026 (Molecular Devices) bestimmt. Die Ergebnisse für den Standard wurden als log-Konzentration von IFN-Con₁ gegenüber dem Prozentsatz der Farbstoffaufnahme grafisch aufgetragen. Eine Regressionsanalyse des linearen Teils der Kurve zwischen 10 bis 83% Farbstoffaufnahme wurde durchgeführt und die Bioaktivität des PEG-IFN-Con₁ wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben.
Ergebnisse.
Das F1 zeigte keine messbare in vitro-Bioaktivität. F5 hatte mindestens eine 24,5%ige Aufrechterhaltung der ursprünglichen in vitro-Bioaktivität im Vergleich zu dem nicht-modifizierten IFN-Con₁ (siehe Tabelle 5). Es ist anzumerken, dass, obwohl das Material der Fraktion 1 (höhere Pegylierung) keine detektierbare Aktivität in diesem in vitro-Assay zeigte, dies nicht mit der in vivo-Aktivität korrelieren muss.
Tabelle 5 Bioaktivität von PEG-IFN-Con₁.
Beispiel 8: Proteolyse von IFN-Con₁
Dieses Beispiel zeigt, dass in der Abwesenheit einer chemischen Modifikation Konsensus-Interferon durch Proteasen, die im Darm vorliegen, proteolysiert wird.
Verfahren.
Das Proteolyseprotokoll für IFN-Con₁ entsprach im Wesentlichen dem für PEG-G-CSF und G-CSF beschriebenen. Trypsin lag mit 0,5 μg/ml, Chymotrypsin mit 0,5 μg/ml und 35S-markiertes IFN-Con₁ lag mit 50 μg/ml in einem Gesamtvolumen von 525 μl PBS vor. Die Inkubation wurde bei 37°C durchgeführt. Zu den geeigneten Zeitpunkten, die 0, 15, 30, 60, 120, 240 und 360 Minuten entsprachen, wurden 50 μl der Probe abgenommen und in ein Eppendorf-Gefäß bei 4°C gegeben, das 7 μl eines Proteaseinhibitorcocktails enthielt, der aus 2,5 μg N-Tosyl-L-Lysinchlorethylketon (TLCK); 1,6 μg (4-Amidinophenyl)methansulfonylfluorid (APMSF) und 0,25 IU α-2-Makroglobulin, jeweils von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), bestand. Die Probe wurde dann mit 14 μl 4X Reduktionspuffer (0,5 M Tris, 75% Glycerin, 1% Bromphenolblau, 20% SDS, 2% β-Mercaptoethanol) verdünnt und 500 ng des Proteins wurde auf einem 17–27% SDS-PAGE-Gel von Integrated Separation Systems (ISS) (Natick, MA) laufen gelassen. Das Gel wurde dann auf Immobilon (ISS) unter Verwendung eines semi-dry-Elektroblotters (ISS) überführt. Das Immunoblotting wurde unter Verwendung eines Anti-IFN-Con₁-Antikörpers als dem primären Antikörper durchgeführt. Die entstehenden Immunoblots wurden auf einem Molecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA) analysiert.
Ergebnisse.
Die Anfälligkeit des IFN-Con₁-Proteins gegenüber den Darmproteasen Trypsin und Chymotrypsin ist in 12 dargestellt. Die grafische Darstellung zeigt die folgenden Daten:
Tabelle 6 Daten für die Proteolyse von INF-Con₁ (Figur 12)
Es geht hervor, dass IFN-Con₁ am meisten für Trypsin anfällig ist und gegenüber Chymotrypsin resistenter ist. Die Protease Trypsin ist fähig, >80% des Cytokins innerhalb von 30 Minuten zu verdauen, was einem Verdau von G-CSF ähnelt ( 2). Ähnliche Spiegel des Verdaus mit Chymotrypsin wurden lediglich nach zwei Stunden Inkubation beobachtet. Eine Regressionsanalyse der Daten (nicht gezeigt) zeigt, dass unter den verwendeten Bedingungen in diesem in vitro-Proteolyse-Assay IFN-Con₁ einen T1/2 für dessen Verdau von 5,9 Stunden in der Gegenwart von Trypsin, 7,25 Stunden mit Chymotrypsin und 5,1 Stunden sowohl mit Trypsin als auch Chyrnotrypsin zusammen aufweist.
Beispiel 9: Intraduodenale Verabreichung von PEG-IFN-Con₁
Dieses Beispiel zeigt die intraduodenale Verabreichung sowohl von pegyliertem IFN-Con₁ als auch von dem nicht-modifizierten Material. Es wurde sowohl intravenöse als auch intraduodenale Verabreichung durchgeführt und Serumproben wurden auf das Vorliegen von IFN-Con₁ unter Verwendung eines Antikörperassays analysiert. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, war Konsensus-Interferon im Blutstrom nach einer intraduodenalen Verabreichung vorhanden. Je mehr das Protein pegyliert war, umso höher war der Serumspiegel des IFN-Con₁.
Verfahren.
Die verwendeten Verfahren sind ähnlich denen, wie sie oben für PEG-GCSF verwendet wurden. Alzet-Pumpen (24 Stunden Infusion) wurden wie zuvor für eine Verabreichung an männliche Sprague-Dawley-Ratten (durchschnittliches Körpergewicht 350 +/– 6,7 g) verwendet. Es wurden sowohl intravenöse als auch intraduodenale Vergleiche zur Bestimmung der Bioverfügbarkeit durchgeführt. Das Material wurde in PBS formuliert. Der Dosierungsplan war wie folgt:
Intravenöse
Intraduodenale
Verfahren für den Antikörperassay:
Zum Testen wurden Blutproben von den Ratten (250 μl) entnommen und es wurde Serum präpariert. Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 100 ml/Vertiefung mit einem 1:1000-verdünnten von Kaninchen abgeleiteten polyklonalen Antikörper gegen IFN-Con₁ (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) in 15 mM Natriumcarbonat und 35 mM Natriumbicarbonat, pH 9,2, beschichtet. Die Beschichtung wurde durchgeführt, indem mit dem Antikörper bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit einer anschließenden Inkubation über Nacht bei 4°C inkubiert wurde. Nach der Dekantierung wurden 300 μl einer Blockierungslösung, die aus PBS, das 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN₃ enthielt, zusammengesetzt war, in den Vertiefungen bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. 50 μl eines TNE-Puffers, der aus 50 mM Trizma-Base, pH 7,4, bestand und der 150 mM NaCl, 13 mM EDTA und 0,25 mM Thimerosol enthielt, wurden mit 0,1% Tween 20 zu den Vertiefungen zusammen mit 50 μl Standard oder verdünnter Probe gegeben. Die Standardkurven wurden in dem Assay etabliert, indem entweder nichtmodifiziertes IFN-Con₁ oder PEG-IFN-Con₁ verwendet wurde, was von der jeweiligen Verabreichung an die Testratte abhing. Die EIA-Platten wurden dann für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und für weitere zwei Stunden bei 37°C. Nach der Dekantierung wurden die Platten zweimal mit einer Standardwaschlösung gewaschen (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, Kat. Nr. 50-63-00). Ein monoklonaler Antikörper der Maus gegen IFN-Con₁ (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), der 1:4000 in TNE-Puffer mit 10% FBS verdünnt war, wurde zugegeben und die Probe wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Dekantierung wurde die EIA-Platte zweimal gewaschen und ein von Ziege abgeleiteter Anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (HRPO) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), wurde mit einer Verdünnung von 1:2000 zugegeben. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten dekantiert und viermal gewaschen. 100 μl der TMB-Peroxidasesubstratlösung (Kirkegaard & Perry Laboratories, Kat. Nr. 50-76-00) wurden dann zugegeben und die Probe wurde für 5 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 50 μl 1 M H₃PO₄ abgestoppt und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen.
Ergebnisse:
Dieses Beispiel zeigt, dass chemisch modifiziertes Konsensus-Interferon über den Darm in den Blutstrom gelangt. Es wurden Vergleiche zwischen intravenös und intraduodenal in fundiertem IFN-Con₁ und PEG-IFN-Con₁ durchgeführt. Die Serumspiegel des therapeutischen Proteins sind in den 13, 14 und 15 gezeigt.
Intravenöse Verabreichung.
Die intravenösen Verabreichungsdaten zeigen, dass eine Pegylierung zu einer Anhäufung von IFN-Con₁ im Serum führt. Spiegel im Fließgleichgewicht von PEG-IFN-Con₁ werden bei ungefähr 30 bis 35 ng/ml für sowohl F5- (niedrig), als auch F1- (hoch) Materialien erreicht, siehe 14 bzw. 15. Nicht-modifiziertes IFN-Con₁ erreicht jedoch Serumspiegel im Fließgleichgewicht bei viel geringeren Mengen, 3–5 ng/ml (13), selbst wenn ähnliche Dosen des Proteins intravenös infundiert wurden. Die Daten sind unten gezeigt:
Tabelle 7 Daten für die Infusion von IFN-Con₁ (Figur 13)
Tabelle 8 Daten für die Infusion von PEG-IFN-Con₁ (F5) (Figur 14)
Tabelle 9 Daten für die Infusion von PEG-IFN-Con₁ (F1) (Figur 15)
Eine sehr ungenaue Bestimmung der Clearance der drei Proteine kann durchgeführt werden, nachdem die Pumpen mit der Abgabe aufgehört haben, beginnend beim 24 Stunden-Zeitpunkt bis zu einem Zeitpunkt von 96 Stunden. Durch eine einfache Regressionsanalyse kann ein T_1/2 bestimmt werden und diese Werte sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10 T_1/2 von IFN-Con₁ und PEG-IFN-Con₁.
Die Differenz bei der Clearance von PEG-IFN-Con₁ im Vergleich zu nichtmodifiziertem IFN-Con₁ ist sehr hoch, insbesondere im Vergleich zu G-CSF und PEG-G-CSF. Selbst wenn hoch pegyliertes G-CSF bei hohen Dosen verwendet wird, beträgt der T_1/2 für nicht-modifiziertes Protein 0,95 Stunden im Vergleich zu 2,3 Stunden für PEG-G-CSF.
Intraduodenale Verabreichung.
Die Serenspiegel des Cytokins nach einer intraduodenalen Verabreichung sind auch in den 13–15 wiedergegeben. Je stärker das Protein pegyliert war, um so höher war der Serumspiegel von IFN-Con₁, was unerwartet war. Das höher pegylierte Cytokin (F1) (15) besaß einen höheren Serumspiegel nach einer intraduodenalen Verabreichung als das Material mit weniger PEG-Resten sowie das nicht-modifizierte Material. Diese Korrelation ist überraschend, wenn man das große Molekulargewicht des hoch derivatisierten IFN-Con₁ (tri-, tetra-, pentapegyliert) im Vergleich zu der Form mit weniger PEG-Resten (F5-, mono-, dipegyliert) bedenkt. Während der Grund dafür nicht ganz klar ist, könnte dies eine merklich höhere Zirkulationszeit des pegylierten Proteins widerspiegeln (Tabelle 10). Zusätzlich oder alternativ kann eine Pegylierung die Fähigkeit des Proteins beeinflussen, die Darmbarriere zu überwinden. Bei einer intraduodenalen Verabreichung war das Material mit der geringeren Pegylierung im Serum 2,4-fach konzentrierter als nicht modifiziertes Protein, aber das höher pegylierte Material war 13-fach höher konzentriert (als nicht modifiziertes Protein). Bei dem am meisten pegylierten IFN-Con₁ waren erhöhte und messbare Serenspiegel des Proteins bis nach 72 Stunden detektierbar.
Ratten, die nicht modifiziertes IFN-Con₁ erhielten, wiesen erhöhte Spiegel des Proteins nach 6 Stunden auf, aber diese fielen schnell auf ungefähr 150 pg/ml ab (dies kann eine geringere Detektionsgrenze bedeuten, da die Serenspiegel auf einem Plateau von 150 pg/ml nach 96 Stunden blieben).
Bioverfügbarkeit.
Das höher pegylierte Material zeigte eine höhere Bioverfügbarkeit als das Material mit weniger PEG-Resten. Die Bioverfügbarkeit wurde berechnet, indem die Serenspiegel nach einer intravenösen Verabreichung mit denen nach einer intraduodenalen Verabreichung verglichen wurden (13 bis 15). Es geht daraus hervor, dass die Serenspiegel nach einer intravenösen Infusion nach 96 Stunden nicht vollständig auf den Grundwert für das pegylierte IFN-Con₁ zurückgingen. Jedoch wurden Werte für die Bioverfügbarkeit, die von der Fläche unter der Kurve bestimmt wurden (AUC), ermittelt und sie sind in Tabelle 11 unten zusammengefasst.
Tabelle 11 AUC und Bioverfügbarkeit von nicht pegyliertem und pegyliertem IFN-Con₁.
Obwohl < 1% des intraduodenal verabreichten PEG-IFN-CON₁ (im Vergleich zu intravenös verabreichtem) im Blutstrom vorhanden war, zeigen diese Daten, dass die hoch pegylierte Form (F1) tatsächlich eine fünffach höhere Bioverfügbarkeit hatte als die derivatisierte Form (F5) mit weniger Polyethylenglykolresten pro Proteinmolekül.
Ein anderer Weg, die Daten zu betrachten, ist es, die pegylierte Form des Proteins, die intraduodenal infundiert wurde, direkt mit dem nicht-modifizierten Protein, das intravenös infundiert wurde, zu vergleichen. Dieser Vergleich liefert einen Maßstab für die Gesamtwirkung der Pegylierung des Proteins auf die Aufnahme aus dem Darm. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst, die auch einige der PEG-G-CSF-Daten wiederholt:
Tabelle 12 Wirkung der Pegylierung auf die enterale Bioverfügbarkeit eines Cytokins.
Das vorstehend verwendete PEG-G-CSF war eine Population von Molekülen, in der eine Mehrzahl wenigstens drei Polyethylenglykolmoleküle in einer Bindung enthielt (vgl. infra). Somit war der Grad der Derivatisierung ähnlich dem des stärker deriva tisierten PEG-IFN-Con₁ (F1). Die Ergebnisse in Tabelle 12 zeigen, dass diese zwei derivatisierten Proteine eine ähnliche Bioverfügbarkeit aus dem enteralen Weg aufweisen, falls sie mit dem nicht-modifizierten Protein bei einer intravenösen Infusion verglichen werden. Daher ist eine bevorzugte Form eines pegylierten Cytokins für eine enterale und daher orale Verabreichung ein stark pegyliertes Derivat.
Im allgemeinen wird für pegyliertes G-CSF und pegyliertes IFN-Con₁ eine viel stärkere enterale Bioverfügbarkeit gezeigt als für das enteral infundierte nicht-pegylierte Cytokin. Obwohl die genaue Ursache nicht bekannt ist, könnte die Erhöhung der Bioverfügbarkeit auf der Widerstandsfähigkeit der pegylierten Form gegenüber Proteasen, der längeren Zirkulationszeit des derivatisierten Proteins, was eine Anhäufung im Körper ermöglicht, eine Wirkung auf das Durchdringen des Proteins durch die enterale Schranke oder auf einer Kombination dieser Faktoren beruhen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Orale Dosierungsformulierung, die als Wirkstoff enthält: eine Population von Konsensus-Interferon-Molekülen, wobei die meisten dieser Konsensus-Interferon-Moleküle von dieser Population durch Verknüpfung von mindestens zwei pharmazeutisch verträglichen Polymermolekülen an die Konsensus-Interferon-Moleküle chemisch modifiziert sind, wobei die Polymermoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol, Copolymeren von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextranpolyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin, wobei die Polymermoleküle (i) eine Resistenz gegenüber Proteolyse des chemisch modifizierten Konsensus-Interferons verleihen und (ii) eine Aufnahme des chemisch modifizierten Konsensus-Interferons in den Blutstrom aus dem Darm ermöglichen; und wobei die Konsensus-Interferon-Moleküle mit einem anionischen Lipid assoziiert sind.
Orale Dosierungsformulierung nach Anspruch 1, wobei das pharmazeutisch verträgliche Polymermolekül Polyethylenglykol ist.
Orale Dosierungsformulierung nach Anspruch 1, wobei die verknüpften Polymermoleküle eine Abgabe des Konsensus-Interferons an den Dünndarm ermöglichen.
Orale Dosierungsformulierung nach Anspruch 1, wobei das Konsensus-Interferon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IFN-con1, IFN-con2 und IFN-con3.
Orale Dosierungsformulierung nach Anspruch 1, wobei das anionische Lipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), Ei-Phosphatidylglycerol, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Ei-Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatsäure (DOPA), Dimyristoylphosphatsäure (DMPA), Dipahnitoylphosphat säure (DPPA), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS), Dimyristoylphosphatidylserin (DMPS), Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), Ei-Phosphatidylserin, Lysophosphatidylglycerol, Lysophosphatidylethanolamin und Lysophosphatidylserin.
Verfahren zur Herstellung einer oralen Dosierungsformulierung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: (a) chemische Modifikation einer Population von Konsensus-Interferon-Molekülen, so dass eine Mehrheit der Mitglieder dieser Population solche sind, an denen mindestens zwei pharmazeutisch verträgliche Polymermoleküle verknüpft sind, wobei die Polymermoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol, Copolymeren von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextranpolyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin, wobei die Polymermoleküle (i) eine Resistenz gegenüber Proteolyse des chemisch modifizierten Konsensus-Interferons verleihen und (ii) eine Aufnahme des chemisch modifizierten Konsensus-Interferons in den Blutstrom aus dem Darm ermöglichen; und (b) Formulierung eines solchen chemisch modifizierten Konsensus-Interferons mit einem anionischen Lipid und einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur oralen Verabreichung.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das pharmazeutisch verträgliche Polymermolekül Polyethylenglykol ist.
Orale Dosierungsformulierung nach Anspruch 6, wobei die verknüpften Polymermoleküle eine Abgabe des Konsensus-Interferons an den Dünndarm ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Konsensus-Interferon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IFN-con1, IFN-con2 und IFN-con3.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das anionische Lipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), Ei-Phosphatidylglycerol, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Ei-Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatsäure (DOPA), Dimyristoylphosphatsäure (DMPA), Dipalmitoylphosphatsäure (DPPA), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS), Dimyristoylphosphatidylserin (DMPS), Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), Ei-Phosphatidylserin, Lysophosphatidylglycerol, Lysophosphatidylethanolamin und Lysophosphatidylserin.