CZ145297A3 - Papilloma viral capside proteins, process of their preparation and purification as well as use thereof - Google Patents

Description

Vynález se týká čištěných rekpmbinantních g papilomavirových (PV) proteinů a způsobů přípravy^ení, j použití a formulace těchto proteinů. _n

Dosavadní stav techniky

Infekce papilomaviry (PV) se vyskytuje u různých živočichů, mezi něž patři lidé, ovce, psi, kočky, králíci, opice, hadi a krávy. Papilomaviry infikují epiteliální buňky, obvykle vyvolávají benigní epiteliální nebo fibroepiteliální nádory v místě infekce. Papilomaviry jsou druhově specifická infekční agens; lidské papilomaviry infikují pouze člověka.

Papilomaviry se na základě hostitele, kterého infikují, mohou zařazovat do odlišných skupin. Lidské papilomaviry (HPV) se dále rozdělují na více než 70 typů v závislosti na homologii DNK sekvence. Papilomaviry se jeví být typově specifickými imunogeny. Imunita neutralizující infekci jedním typem papilomaviru nezaručuje imunitu proti jiným typům papilomavirů.

U lidí různé typy lidských papilomavirů (HPV) způsobují různá onemocnění. Lidské papilomaviry (HPV) typu 1,2,3,4,7,10 a 2 6 až 29 způsobují u lidí s normální a narušenou imunitou benigní bradavice. Lidské papilomaviry (HPV) typu 5,8,9,12,14,15,17,19 až 25, 36 a 46 až 50 způsobují u lidí z narušenou imunitou mělké léze. Lidské papilomaviry (HPV) typu 6,11,34,39,41 až 44 a 51 až 55 způsobují benigní kondylomata na sliznicích pohlavních orgánů a dýchacího ústrojí. Lidské papilomaviry (HPV) typu 16 a 18 způsobují epiteliální dysplazie genitálních sliznic a jsou spojovány s většinou karcinomů in sítu a invazivních karcinomů děložního čípku, pochvy, vulvy a anální trubice.

Papilomaviry jsou malé (50 až 60 nm) , ikosaedrické, DNK viry, bez virového obalu. Nesou až ošum časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virového genomu jsou označeny El až E7 a LI a L2, kde E značí časný (early) a L značí pozdní (latě) . LI a L2 otevřené čtecí rámce kódují - virové kapsidové proteiny. Časné geny (značeny E) odpovídají za funkce jako jsou replikace viru a transformace buňky.

Protein označený LI je hlavní kapsidový protein a jeho molekulární váha je 55 až 60 kDa. Protein označený L2 je méně významný kapsidový protein, jehož předpokládaná molekulární váha je 55 až 60 kDa, elektroforéza na polyakrylovém gelu stanovila hodnotu jeho molekulární váhy na 75 až 100 kDa. Imunologická data naznačují, že většina L2 proteinu leží uvnitř proteinu LI. Otevřený čtecí rámec LI je mezi různými papilomaviry vysoce stálý. Protein L2 je mezi různými papilomaviry méně stálý.

Geny označené jako LI a L2 jsou vhodnými cíli pro imunoprofylaxi. Také některé časné geny se jeví jako potenciální cíle pro vývoj vakcíny. Studie na systémech králičích papilomavirů (cottontail rabbit papilomavirus; CRPV) a hovězích papilomavirů (BPV) ukázaly, že zvířata imunizovaná těmito proteiny, které byly exprimovány v . bakteriích, nebo použitím vektorů vakcinie, byla chráněna proti virové infekci. Exprese papilomavirových genů LI v expresních systémech bakulirů nebo použitím vektorů vakcinie vede k vytvoření partikul!, které jsou podobné virovým partikulím (virus-like particles; VLP) . Tyto partikule se používají k vyvolání imunologické odezvy, vzniká vysoký titr protilátek neutralizující virus, což způsobuje ochranu proti

L2 proteiny, brání to, že není přístupné velké množství čištěného viru a proteinu. Vzhledem k tomu, že není snadné kultivovat papilomavury in vitro, je také obtížné připravit pomnožením papilomavirů in vitro požadované množství proteinu LI a L2. Proto je problematická chemická, imunologická a biologická charakterizace papilomavirů a jejich proteinů. Z těchto důvodů je užitečné vyvinout snadno obnovitelný zdroj surových papilomavirových proteinů, zvláště papilomavirových proteinů LI a L2 nebo modifikovaných proteinů LI a L2. Je také užitečné vyvinout způsoby čištění velkého množství surových papilomavirových proteinů na úrověň čistoty, která je vhodná pro imunologické studie a vývoj vakcíny. Vhodná se jeví také příprava velkého množství papilomavirových proteinů, které mají imunitu propůjčující vlastnosti přirozených proteinů, jako je konformace přirozeného proteinu. Dále je vhodné vytvořit způsob analýzy papilomavirových proteinů a způsob určení relativní čistoty a složení těchto proteinů. Takové vysoce čisté proteiny se mohou použít pro přípravu různých činidel pro studii papilomavirové infekce; taková činidla zahrnují například polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a analytické standardy.

Farmaceuticky využitelné kompozice obsahující DNK nebo proteiny kódované DNK se mohou tvořit podle známých způsobů jako je přidání farmaceuticky přijatelných nosičů. Příklady takových nosičů a způsobů tvoření kompozic se nachází v Remington's Pharmaceutial Sciences. Za účelem vytvoření farmaceuticky přijatelné kompozice vhodné pro účinnou aplikaci, tyto kompozice obsahují účinné množství proteinu nebo partikul! podobných virovým partikulám (virus-like particles; VLP) . Takové kompozice mohou obsahovat proteiny nebo partikule podobné virovým partikulám (virus-like particles; VLP), které jsou odvozené z více než jednoho typu lidského papilomaviru.

Léčebné nebo diagnostické kompozice podle vynálezu se podávají osobě v množství, které je dostatečné pro léčbu nebo diagnostiku papilomavirových infekcí. Účinné množství může kolísat podle řady faktorů, takových jako jsou individuální kondice, váha, pohlaví a věk. Jiné faktory zahrnují způsob podání. Většinou se kompozice podává v dávkách v rozmezí přibližně od do lmg.

Existují různé způsoby podávání farmaceutických kompozic, jako jsou podkožní, lokální, ústní, mukosální, intravenózní a intramuskulární.

Vakcíny podle vynálezu obsahují DNK, RNK nebo proteiny kódované DNK, které obsahují antigenní determinanty nezbytné pro vyvolání tvoření neutralizujících protilátek v hostiteli. Takové vakcíny jsou dostatečně bezpečné, aby se mohly podávat bez nebezpečí klinické infekce; nemají vedlejší toxické účinky; mohou se podávat účinným způsobem, jsou stabilní a kompatibilní s vakcínovými nosiči.

Vakcíny se mohou podávat rozličnými způsoby: ústně, parenterálně, podkožně, mukozálně, intravenózně nebo intramuskulárně. Dávka kolísá v závislosti na kondici, pohlaví, váze a věku osoby; na způsobu podání; a typu papilomaviru, který se ve vakcíně použil. Vakcína se může podávat ve formě kapsulí, suspenzí, elixírů nebo kapalných roztoků. Vakcína se může tvořit s imunologicky přijatelným nosičem.

Vakcíny se podávají v množství, které je účinné pro léčbu, což znamená v množství dostatečném pro vyvolání imunologicky ochranné odezvy. Účinné množství pro léčbu může kolísat podle typu papilomaviru. Vakcína se může podávat v jedné nebo více dávkách.

přítomnosti oligonukleotidů DNK s chybným párováním. Při alternativních podmínkách oligonukleotidy DNK s chybným párováním mohou stále hybridizovat s DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo typu 16 (HPV16) a tak umožňují detekci a izolaci DNK, která kóduje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) nebo typu 16 (HPV16).

Čištěná DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo typu 16 (HPV16) podle vynálezu nebo její fragmenty se mohou používat pro izolací a čištění homologů a fragmentů lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) z jiných zdrojů. Za tímto účelem se nejdříve DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) smíchá za vhodných hybridizačních podmínek se vzorkem, který obsahuje DNK kódující homology lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Dále se může izolovat komplex hybridizované DNK, z něhož se může získat DNK kódující homologní DNK.

Je známo, že různé kodóny, které kódují specifické aminokyseliny, obsahují podstatné množství nadbytečné informace. Proto se tento vynález také týká těch sekvencí DNK, které obsahují alternativní kodóny kódující konečnou translaci shodné aminokyseliny. Pro účely této specifikace sekvence nesoucí jeden nebo více zaměnitelných kodónů se budou definovat jako degenerovaná varianta. Předmětem vynálezu jsou také mutace. Jde o mutace sekvence DNK nebo ranslačního proteinu, který v podstatě nemění konečné fyzikální vlastnosti exprimovaného proteinu. Například náhrada valinu leucinem, argininu lysinem nebo asparaginu glutaminem nemůže změnit funkčnost polypeptidu.

Je známo, že sekvence DNK kódující peptid se mohou změnit tak, aby kódovaly peptid mající vlastnosti odlišné od těch, jenž charakterizují přirozeně se vyskytující peptid. Způsoby pozměňující sekvence DNK zahrnují, ale nejsou omezeny na místně cílenou mutagenezi.

Zde používaný termín funkční derivát lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) znamená látku, která má biologickou aktivitu (buď funkční nebo strukturní) , která se podstatně podobá biologické aktivitě lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Termín funkční deriváty zahrnuje fragmenty, varianty, degenerované varianty, analogy a homology nebo chemické deriváty lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Termín fragment se vztahuje na libovolný polypeptidu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Termín varianta znamená molekulu podstatně podobnou strukturou a funkcí buď celé molekule lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo jejímu fragmentu. Molekula je podstatně podobná lidskému papilomaviru typu 6a (HPV6a) , jestliže obě molekuly mají podstatně podobnou strukturu nebo jestliže obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Proto, jestliže dvě molekuly mají podobnou aktivitu, jsou považovány za jestliže struktura jedné z molekul se druhé nebo dokonce, jestliže dvě aminokyselinové sekvence nejsou identické. Termín funkční derivát nezahrnuje lidský papilomavirus typu 6b (HPV6b).

varianty dokonce, nenachází u té

Termín analog znamená molekulu podstatně funkčně podobnou buď celé molekule lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo jejímu fragmentu.

Pro klonování DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se mohou používat různé způsoby. Tyto způsoby zahrnují, ale nejsou omezeny na přímou funkční expresi genů lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a), po níž následuje konstrukce cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo knihovny genomové DNK ve vhodném expresivním vektorovém systému. Dalším způsobem je skríning cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo knihovny genomové DNK, vytvořené v bakteriofágu nebo v plazmidovém vektoru, pomocí značené oligonukleotidové sondy odvozené z aminokyselinové sekvence lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další způsoby zahrnují skríning cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) nebo knihovny genomové DNK, vytvořené v bakteriofágu nebo v plazmidovém vektoru s neúplnou DNK, která kóduje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) . Tato parciální DNK se získá amplifikaci DNK fragmnetu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) pomocí specifické polymerázové řetězové reakce (PCR), pro kterou je třeba vytvořit degenerované primery z aminokyselinové sekvence čištěného lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další způsob je izolace RNK z buněk produkujících lidský papilomavirus typ 6a (HPV6a) a translace RNK na protein pomocí in vitro nebo in vivo translačního systému. Translace RNK na peptid nebo protein povede k produkci nejméně části proteinu HPV6a, který se může určit například aktivitou tohoto proteinu nebo imunologickou reaktivitou s anti-HPV6a protilátkami. Při této metodě se může zkoumat celková RNK izolovaná z buněk produkujících lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) pro přítomnost RNK kódující při nejmenším část lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další frakcionace celkové RNK proběhne oddělením RNK lidského papilomaviru typu 6a od ostatní RNK. Peptid nebo protein produkovaný tímto způsobem se může zkoumat za účelem poskytnutí aminokyselinových sekvencí, které se používají pro vytvoření primerů pro produkci cDNK lidského papilomaviru typu 6a. Dále RNK používaná pro translaci se může zkoumat za účelem poskytnutí nukleotidových sekvencí kódujících lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) a sond vhodných pro skríning knihovny cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Tyto metody jsou v oboru známy a jsou uvedeny například v publikaci Sambrook,j., Fritsch,E.F., Maniatis,T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

Je zřejmé, že další typy knihoven stejně jako knihovny vytvořené z jiných buněk nebo buněčných typů se mohou použít pro izolaci DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a). Další typy knihoven zahrnují, ale nejsou omezeny na knihovny DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a). Další typy knihoven zahrnují, ale nejsou omezeny na knihovny cDNK odvozené z jiných buněk nebo buněčných linií, které obsahují lidský papilomavirus typ 6a nebo knihovny genomové DNK.

Řada způsobů je vhodná pro přípravu knihoven cDNK. Tyto způsoby se uvádějí například v publikaci Sambrook,J., et al. jak je shora uvedeno. Je zřejmé, že DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a se může také izolovat z vhodné knihovny genomové DNK. Pro vytvoření knihoven genomové DNK se může použít řada metod, které se popisují v publikaci Sambrook,J., at al. jak je shora uvedeno.

Klonovaná DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo její fragmenty, které je možné získat zde popsanými způsoby, se mohou po molekulárním klonování do expresních vektorů obsahujících vhodný promotor a další vhodné transkripční regulační elementy rekombinantně exprimovat. Tyto vektory se vnáší do prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk za účelem produkce rekombinantního lidského papilomaviru typu 6a. Metody pro uvedené manipulace se plně popisují v publikaci Sambrook. J., et al. jak je shora uvedeno a jsou známy v oboru.

Expresívní vektory se zde definují jako sekvence DNK, které se vyžadují pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNK ve vhodném hostiteli. Takové vektory se mohou používat pro expresi eukaryontních genů v různých hostitelích jako jsou bakterie, sinice, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky hub a živočišné buňky. Specificky vytvořené vektory umožňují přenos DNK mezi hostiteli takovými jako jsou bakterie-kvasinka nebo bakterie-živočišná buňka nebo bakterie-buňky hub nebo bakterie-buňky obratlovců. Vhodně konstruovaný expresívní vektor by měl obsahovat: počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, selekční markéry, omezený počet restrikčních míst, potenciál pro vysoký počet kopií a aktivní promotory. Promotor se definuje jako sekvence DNK, která řídí RNK polymerázu, aby se navázala na DNK a tak inicijovala syntézu RNK. Silný promotor se vyznačuje vysokou frekvencí iniciace transkripce. Expresívní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky vytvořené plazmidy nebo viry.

Různé savčí expresívní vektory se mohou používat k expresi DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo jejích fragmentů v savčích buňkách. Běžně dostupné savčí expresívní vektory, které mohou být vhodné pro rekombinantní expresi lidského papilomaviru typu 6a, zahrnuji, ale nejsou omezeny na pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593)pBV-1(8-2)(ATCC37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt(ATCC 37199), pRSVneo(ATCC 37198), pSV2dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC 37460) a %ZD35(ATCC 37565).

Různé bakteriální expresívní vektory se mohou používat k expresi DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo jejích fragmentů v bakteriálních buňkách. Běžně dostupné bakteriální expresívní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na pETlla (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Různé expresívní vektory hub se mohou používat k expresi DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo jejích fragmentů v buňkách hub. Běžně dostupné expresívní vektory hub zahrnují, ale nejsou omezeny na pYES2 (Invitrogen) a Pichia expresívní vektor (Invitrogen).

Různé expresívní vektory hmyzích buněk se mohou používat k expresi DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo jejích fragmentů v hmyzích buňkách. Běžně dostupné expresívní vektory hmyzích buněk zahrnují, ale nejsou omezeny na pBlue Bac III (Invitrogen).

Expresívní vektor obsahující DNK, kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) , nebo její fragmenty se může použit pro expresi HPV6a proteinů nebo fragmentů HPV6a proteinů v buňce, tkáních, orgánech nebo v živočiších (zahrnují se i lidé). Hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní, zahrnují, ale nejsou omezeny na bakteria jako je E.coli, buňky hub jako je kvasinka, savčí buňky zahrnující, ale nejsou omezeny na buněčné linie lidského, hovězího, prasečího, opičího původu a linie pocházející z hlodavců, dále hmyzí buňky zahrnující, ale nejsou omezeny na buněčné linie získané z Drosophila a z housenek bource morušového. Vhodné a dostupné buněčné linie získané ze savčích druhů zahrnují, ale nejsou omezeny na L buňky L-M (TK) (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M (ATCC CCL 1.2), 293(ATCC CRL 1573, Ráji(ATCC CCL 86), CV-1(ATCC CCL 70), COS1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1(ATCc CRL 1651), CHOK-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3(ZTCC

CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C1(ATCC CCL 26) a MRC-5(ATCC CCL 171) .

Expresívní vektory se mohou vnést do hostitelských buněk za použití jedné z řady způsobů, mezi něž patří transformace, transfekce, lipofekce, fúze protoplastů a elektroporace. Buňky obsahující expresívní vektory se klonálně pomnožují a zkoumá se jejich schopnost produkovat HPV6a protein. Pro určení klonu hostitelských buněk exprimujících lidský papilomavirus typu 6a se může použit několik způsobů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na imunologickou reaktivitu s protilátkami proti lidskému papilomaviru typu 6a a prokázání jisté aktivity hostitelských buněk, která je spjata s výskytem lidského papilomaviru typu 6a. Jde o navázání ligandů specifických pro lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) nebo o signální transdukci, která se definuje jako odezva zprostředkovaná interakcí HPV6a specifických ligandů s lidským papilomavirem typu 6a.

K expresi fragmentů DNK lidského papilomaviru se také používá in vitro produkovaná syntetická mRNK nebo přirozená mRNK. Syntetická mRNK nebo mRNK izolovaná z buněk produkujících lidský papilomavirus typu 6a se může účinně překládat v různých bezbuněčných systémech, které zahrnují, ale nejsou omezeny na extrakty moučných červů a extrakty retikulocytů, stejně jako v buněčných systémech, které zahrnují, ale nejsou omezeny na preferovanou mikroinjektáž do žabích oocytů.

Následuje exprese HPV6a proteinů v hostitelské buňce. HPV6a protein se izoluje za účelem získání jeho čisté formy. Existuje několik vhodných a dostupných metod pro čištění HPV6a proteinu. Jak se zde popisuje, rekombinantní HPV6a protein se může čistit z buněčného lyzátu a extraktů samostatnou aplikací nebo různými kombinacemi metod, mezi něž patří frakcionace pomocí solí, iontoměničová chromatografie, vylučovací chromatografie, adsorpční chromatografie na hydroxylapatitu, chromatografie založená na hydrofobních interakcích.

Dále rekombinantní HPV6a protein může být oddělen od jiných buněčných proteinů použitím imunoafinitních kolon obsahujících monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou specifické pro plnou délku vznikajícího HPV6a proteinu nebo jeho polypeptidových fragmentů. Existuje řada metod pro přípravu monoklonálních a polyklonálních protilátek. Monoklonální a monospecifické protilátky zde používané jsou definovány jako jediný druh protilátek nebo vícečetný protilátkový druh s homogenní vazebnou charakterakteristikou vzhledem k HPV6a proteinu. Homogenní vazebnost je zde definována jako schopnost určitého druhu protilátek vázat se na specifický epitop nebo antigen.

Je zřejmé, že způsoby produkce monospecifických protilátek se mohou využít k přípravě protilátek, které jsou specifické vůči fragmentům HPV6a polypeptidu nebo vůči celé délce nascentního HPV6a polypeptidu. Mohou se tedy tvořit monospecifické protilátky, které jsou specifické pro zcela funkční HPV6a protein nebo jeho fragmenty.

Tento vynález se týká metod vhodných pro vyhledávání sloučenin, které modulují expresi DNK nebo RNK kódujících HPV6a protein stejně jako funkci(e) HPV6a proteinu(ů) in vivo. Sloučeniny, které modulují tyto aktivity mohou být DNK, RNK, peptidy, proteiny nebo neproteinové organické molekuly. Tyto látky mohou zvýšit nebo utlumit expresi DNK nebo RNK kódující HPV6a protein nebo mohou ovlivnit funkci tohoto proteinu. Pro detekci zmíněných látek existuje řada testů. Jeden druh testů jsou tzv. ano/ne testy, které se používají pro určení změn v expresi nebo ve funkci. Test se může hodnotit kvantitativně srovnáním exprese nebo funkce testovaného vzorku se standardním vzorkem.

Jestliže souprava obsahuje DNK lidského papilomaviru typu 6a, fragmenty DNK lidského papilomaviru typu 6a, protilátky proti DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo proti HPV6a proteinu, může se připravit RNK lidského papilomaviru typu 6a nebo HPV6a protein. Takové soupravy se používají pro detekci DNK, která hybridizuje s DNK lidského papilomaviru typu 6a, nebo pro detekci přítomnosti HPV6a proteinu(ů) nebo peptidových fragmentů ve vzorku. Taková charakterizace je využitelná pro různé účely mezi něž patři, ale nejsou omezeny na soudní analýzy a epidemiologické studie.

Nukleotidové sekvence, které jsou komplementární k DNK sekvenci kódující lidský papilomavirus typu 6a, se mohou syntetizovat za účelem tzv. antisense terapie (brání transkripci DNK) . Mezi molekuly s uvedenou schopností patří DNK, stabilní deriváty DNK jako jsou fosforothioaty a nebo methylfosfonáty, RNK, stabilní deriváty RNK takové jako 2'-0alkylRNK nebo jiné antioligonukleotidové napodobeniny lidského papilomaviru typu 6a. Anti-molekuly lidského papilomaviru typu 6a se vnáší do buněk mikroinjektáží, lipozomovou kapsulací nebo pomocí v buňce exprimováného vektoru, který nese anti-sekvenci. HPV6a antisense terapie se může zvláště využít při léčení onemocnění, kde je nutné redukovat aktivitu lidského papilomaviru typu 6a.

Termín chemický derivát popisuje molekulu, která obsahuje další chemické části, které normálně nejsou součástí molekuly. Takové chemické části mohou zlepšit například rozpustnost, poločas rozpadu, absorbci základní molekuly. Naopak chemické části mohou i utlumit nežádoucí vedlejší účinky základní molekuly nebo její toxicitu. Příklady takových chemických částí jsou popsány v různých publikacích jako je Remington's Pharmaceutical Sciences.

Látky, které se určují metodami zde uvedenými, se mohou užívat samostatně ve vhodných dávkách stanovených rutinními testy za účelem dosažení optimální inhibice lidského papilomaviru typu 6a nebo jeho aktivity, přičemž se minimalizuje potenciální toxicita. Navíc se může vyžadovat současné nebo následné podávání dalších agens.

Výhodné je podávat látky podle vynálezu jedenkrát denně nebo rozdělit celkovou denní dávku do více dávek. Látky se mohou podávat různými způsoby například: intranasálně, transdermálně, formou čípků, ústně a podobně.

Při kombinované léčbě s více než jedním aktivním agens, kde aktivní látky existují v oddělených dávkových formách, se mohou tyto látky podávat současně nebo rozloženě v jiném čase.

Dávkový režim látek podle vynálezu je závislý na mnoha faktorech, například typ, specie, věk, váha, pohlaví a zdravotní stav pacienta; pacientova funkce ledvin a jater; a zvláště použitá aktivní látka. Lékař může snadno určit a předepsat účinné množství léku, které je nutné pro prevenci, kontrolu nebo zastavení postupu příznaků. Určení rozmezí koncentrace léku, ve kterém je látka účinná a ne toxická, vyžaduje optimální přesnost. Účinná koncentrace aktivní látky je závislá na kinetice její dostupnosti v cílových místech, což zahrnuje distribuci, rovnováhu a vylučování léku.

U metod podle vynálezu zde popsané látky mohou tvořit aktivní přísady a jsou většinou podávány ve směsi s vhodně vybranými farmaceuticky přijatelnými ředidly nebo nosiči (zde jsou shrnuty pod název nosné materiály) s ohledem na zamýšlenou formu podávání, to je orální tablety, kapsule, elixíry, syrup, čípky, gely a podobně, v souladu s běžnou farmaceutickou praxí.

Například za účelem ústního podávání tabletových nebo kapsulových forem se může aktivní látka kombinovat s orálním, netoxickým, farmaceuticky přijatelným, inertním nosičem jako je etanol, glycerol, voda a podobně. Pokud je to nutné, do směsi se dále mohou začlenit pojivá, maziva, dezintegrační a barvící činidla. Vhodná pojivá jsou škrob, želatina, přírodní cukry jako jsou glukóza nebo beta-laktóza, kukuřičná sladidla, přirozené nebo syntetické gumy jako jsou akácie, tragekant nebo alginat sodný, karboxymethylceluloza, polyethylenglykol, vosky a podobně. Maziva, která se používají v těchto dávkovačích formách zahrnují oleát sodný, srearat sodný, stearat horečnatý, benzoat sodný, acetat sodný, chlorid sodný a podobně. Dezintegrační činidla zahrnují škrob, methylcelulozu, agar, bentonit, xanthanovou gumu a podobně.

V případě kapalných forem aktivní složky se mohou kombinovat s aromatickými suspendujícími nebo dispergačními činidly, jako jsou syntetické a přírodní gumy, například tragakant, akacie, metylcelulóza a podobně. Dalším dispergačním činidlem, které se může použít je glycerin a podobně. V případě parenterálního podávání se vyžadují sterilní suspenze a roztoky. Izotonické přípravky, které zpravidla obsahují vhodné konzervační činidla, se používají pro intravenózní podávání.

Lokální přípravky obsahují aktivní složku, která může být ve směsi s různými nosičovými materiály dobře známými v oboru, jsou to alkoholy, gel aloe vera, allantoin, glycerin, oleje s vitaminem A a E, minerální olej, PPG2 myristylpropionat a podobně, tvoří například alkoholické roztoky, lokální čističe, čistící krémy, kožní gely, pleťové vody nebo krémové nebo gelové šampóny.

Látky podle vynálezu se mohou také podávat pomocí lipozomálních zaváděcích systémů, jako jsou malé unilamelární váčky, velké unilamelární váčky a multilamelární váčky. Liposomy se mohou tvořit z různých fosfolipidů, jako jsou cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.

Látky podle vynálezu se mohou také zavádět pomocí monoklonálních protilátek, které slouží jako jednotlivé nosiče, s nimiž je molekula látky spojena. Látky podle vynálezu se mohou také spojovat s rozpustnými polymery, které slouží jako cílitelné nosiče. Takové polymery zahrnují polyvinylpyrrolidon, kopolymer pyranu, polyhydroxypropylmetha krylamid-fenol, polyhydroxyethylaspartamid-fenol nebo polyethyleneoxid-polylysin substituovaný palmitoylovým zbytkem. Dále se látky podle vynálezu mohou vázat na biologicky rozložitelné polymery, které se používají pro řízené uvolňování léků, jsou to například polymer kyseliny mléčné, polyepsilon kaprolaktonu, kyselina polyhydroxykaprolaktonová, kyselina polyhydroxybutanová, polyortoestery, polyacetaly, polykyanoakrylaty a zesíťované nebo kopolymery hydrogelů.

polydihydropyrany, amfipatické blokové

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje dvousměrný kvasinkový expresivní vektor, který se používá pro expresy kapsidových proteinů LI a/nebo L2.

Na obrázku 2 je elektronový mikrograf partikul! podobných virovým partikulím (virus-like particles; VLP), které obsahují protein LI lidského papilomavirů typu 6a exprimováných v kvasinkách.

Na obrázku 3 je elektronový mikrograf partikul! podobných virovým partikulím (virus-like particles; VLP), které obsahují proteiny L1/L2 lidského papilomavirů typu 6a exprimováných v kvasinkách.

Na obrázku 4 se znázorňuje schéma konstrukce kmene číslo 1558 S. erevísiae.

Na obrázku 5 se znázorňuje schéma konstrukce kmene číslo 1569 S. erevísiae.

Na obrázku 6 se popisují základní kroky postupu čištění.

Na obrázku 7 je seznam kmenů.

Obrázek 8 ukazuje analýzu způsobem SDS-PAGE proteinu L1+L2 lidského papilomaviru typu 16 (HPV16) získaného z kvasinek. Vedle konečných čištěných partikulí podobných virovým partikulím (VLP) se použily i vzorky odebrané z jednotlivých kroků čištění. Vzorky v jednotlivých drahách jsou popsány v tabulce. Je zahrnut gel obarvený koloidní Coomassie a Western bloty testované antiserem proti proteinům LI a L2.

Na obrázku 9 je alternativní postupy čištění proteinu LI králičího papilomaviru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava kvasinkového kmene U9.

Kmen 2150-2-3 Saccharomyces cerevisiae (MATalpha, leu204,adel, cir°) se získal od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA) . Buňky kmene 2150-2-3 se pomnožují přes noc při teplotě 37°C v 5 ml media YEHD (Carty et al., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-121). Buňky se třikrát promývají sterilní destilovanou vodou a resuspendují ve 2 ml sterilní destilované vody. 0,1 ml buněčné suspenze se dá na každou ze šesti ploten s 5-fluoro-orotovou kyselinou (FOA) za účelem selekce ura3 mutantů (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Plotny se inkubuji při teplotě 30°C. 250 ml media obsahuje: 3,5 g Difco kvasinkovou dusíkatou bázi bez aminokyselin a síranu amonného; 0,5 g 5fluoro-orotové kyseliny; 25 mg uracilu a 10 g dextrozy.

Medium se sterilizuje filtrací přes membránu s póry o velikosti 0,2 μη a pak se smíchá s 250 ml 4% Bacto-agaru (Difco) udržovaném při teplotě 50°C, s 10 ml roztoku adeninu o koncentraci 1,2 mg/ml a s 5 ml roztoku L-leucinu (180 mg/ml) . 20 ml takto získaného media se nalilo do každé petriho misky.

Po pěti dnech inkubace se objevila řada kolonií. Jednotlivé kolonie se izolují rozetřením na čerstvé FOA plotny, které se inkubují při teplotě 30°C. Řada kolonií z druhé sady FOA ploten se testuje pro přítomnost ura3 mutantů vytvořením dvou otisků na YEHD plotny a plotny bez uracilu. Požadovaný výsledek je dobrý růst na YEHD mediu a kolonie nerostou na mediu bez uracilu. Získal se jeden izolát (U9) , který vykazuje tyto vlastnosti. Kmen se uchovává zmrazený v glycerolu (kmen číslo #325) při teplotě -70°C.

Příklad 2: Příprava vektoru pro přerušení kvasinkového genu MNN9.

Za účelem připravit vektor pro přerušení kvasinkového genu MNN9, je nezbytné nejdříve klonovat tento gen z genomové DNK S.cerevisiae. To umožňuje standardní způsob polymerázové řetězové reakce (PCR). Vytvořily se primery 5'konce a 3'konce vhodné pro amplifikaci celé délky sekvence kódující MNN9 gen. (Zymogenetics: přihláška EPO č. 88117834.7, publikace č. 0314-096-A2). Použily se tyto oligonukleotidové primery s lemovací sekvencí (podtrženo), kterou rozeznává restrikční endonukleáza Hind III:

sense primer : 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' antisense primer: 5'TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC

CTC-3'

Iniciační methioninový kodon pro gen MNN9 je zvýrazněn tučným písmem. Polymerázová řetězová reakce (PCR) probíhá za použití genomové DNK z kmene JRY 188 S.cerevisiae (Řine et al.) jako templátu, Tag DNK polymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklů amplifikace (94°C 1 min., 37°C 2 min., 72°C 3 min.). Výsledný 1,2 kbp velký fragment PCR se štěpí restriktázou HindlII, čistí se na gelu a liguje se vektorem pUC13 (Pharmacia), který se štěpil restriktázou HindlII a upravoval se alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid se označil pll83.

Za účelem přerušení genu MNN9 kvasinkovým genem URA3 se plazmid pBR322-URA3 (obsahující 1,1 kbp velký HindlII fragment kódující gen URA3 z S.cerevisiae subklonovaný do HindlII místa plazmidu pBR322) štěpí restriktázou HindlII a 1,1 kbp velký fragment DNK nesoucí funkční gen URA3 se čistil na gelu, T4 DNK polymerázou se vytvoří tupé konce fragmentu a ten se pak liguje s plazmidem pll83, který se štěpil restriktázou PmlI (PmlI štěpí sekvenci kódující gen MN9). Výsledný plazmid pll99 obsahuje přerušení genu MNN9 funkčním genem URA3.

Příklad 3: Konstrukce kmene 1372 obsahujícího přerušení genu MNN9 a odvozeného z kmene U9.

Za účelem přerušení genu MNN9 v kmeni U9 (#325) 30 μg plazmidu se štěpilo restriktázou HindlII, aby vznikla kazeta mnn9:: URA3. Buňky kmene č. 325 se transformují DNK plazmidu pll99 štěpenou restriktázou HindlII pomocí sferoplastové metody (Hinnen et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929-1933) a transformanty se selektují na syntetickém agarovém mediu bez uracilu obsahující 1M sorbitol. Syntetické medium obsahuje na jeden litr destilované vody: 20 g agaru; 6,7 g kvasinkové dusíkaté báze bez aminokyselin; 0,04 g adeninu; 0,05 g L-tyrozinu; 182 g sorbitolu; 20 g glukózy; 10 ml roztoku #2 bez leucinu. Roztoku #2 bez leucinu obsahuje na jeden litr destilované vody: 2 g L-argininu; 1 g histidinu; 6 g L-leucinu; 6 g L-izoleucinu; 4 g L-lyzinu; 1 g L-methioninu; 6 g L-fenylalaninu; β g L-threoninu a 4 g Ltryptofanu.

Po inkubaci při teplotě 30°C po dobu pěti dní se objeví řada kolonií. Z deseti kolonií se připravila chromozomální DNK a štěpí se restriktázami HindlII a EcoRI. Štěpená DNK se hodnotí metodou Southern blot (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989). Jako sonda se použije 1,2 kbp velký HindlII fragment nesoucí gen MNN9 (izolovaný z plazmidu pll99). Určil se izolát (kmen #1372), který vykazuje očekávaný posun pruhu DNK na blotu a extremní tvorbu shluků kolonií, což je typické pro mnn9 mutanty.

Příklad 4: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasinkového genu HIS3.

Za účelem konstrukce kazety, ve které gen HIS3 S.cerevisia je přerušen genem URA3 se plazmid YEp6 (K.Struhl et al., 1979, Proč.Nati.Acad.Sci., USA 76:1035) štěpí restriktázou BamHI a výsledný 1,7 kbp velký BamHI fragment nesoucí gen HIS3 se čistí na gelu, T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce a liguje se s plazmidem pUC18, který se štěpil restriktázou BamHI a ošetřil se T4 DNK polymerázou. Vzniklý plazmid (označený pl501 nebo pUC18-HIS3) se štěpí restriktázou Nhel (Nhel štěpí sekvenci kódující gen HIS3) a fragment vektoru se čistí na gelu, T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce a pak se ošetří telecí alkalickou fosfatázou (CIP). Gen URA3 se izoluje štěpením plazmidu pBR322-URA3 restriktázou HindlII a 1,1 kbp velký fragment nesoucí gen URA3 se čistí na gelu, T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce a liguje se s Nhel fragmentem pUC18-HIS3. Výsledný plazmid (označený pUC18-his3::URA3 nebo pl505) obsahuje kazetu, ve které kvasinkový gen HIS3 je přerušený funkčním genem URA3.

Příklad 5: Konstrukce vektoru přerušení kvasinkového genu PRB1 pomocí genu HIS3.

Plazmid FP8AH nesoucí gen PRB1 z S.cerevisiae poskytl Dr. E.Jones z Carnegie-Mellon University (C.M.Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263). Plazmid se štěpil restriktázami HindlII a Xhol. 3,2 kbp velký fragment DNK nesoucí gen PRB1 se čistí na gelu a T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce. Plazmid pUC18 se štěpil restriktázou BamHI, čistil se na gelu a T4 DNK polymerázou se upravily tupé konce. Výsledný fragment vektoru se liguje s fragmentem, který nese gen PRB1. Vznikl plazmid pUC18-PRBl. Plazmid YEp6, který obsahuje gen HIS3, se štěpí restriktázou BamHI. Výsledný 1,7 kbp velký BamHI fragment nesoucí funkční gen HIS3 se čistil na gelu a T4 DNK polymerázou se upravily tupé konce. Plazmid pUC18-PRBl se štěpil restriktázami EcoRV a Ncol, který štěpí sekvenci kódující gen PRB1 a odstraňuje aktivní místo proteázy B a lemovací sekvenci. 5,7 kbp velký EcoRV-NcoI fragment nesoucí residuální 5' a 3'- části kódující sekvence PRB1 genu v plazmidu pUC18 se čistil na gelu, T4 DNK polymerázou se upravily tupé konce, defosforyloval se telecí alkalickou fosfatázou a ligoval se s fragmentem nesoucí gen HIS3, který je zakončen tupými konci. Výsledný plazmid (označený pUC1826 prbl::HIS3, uchováno pod číslem #1245) obsahuje funkční gen HIS3 v místě, kde se odstranila část genu PRB1.

Příklad 6: Konstrukce kvasinkového od U9 kmene odvozeného kmene obsahujícího přerušení genů MNN9 a PRB1.

Kmen 1372, který je odvozený od kmene U9 obsahuje přerušení genu MNN9, se popisuje v příkladu 3. Klonální izoláty kmene 1372 se pasážují na plotnách s 5-fluoroorotovou kyselinou (FOA) (jak popisuje příklad 1) za účelem selekce ura3 mutantů. Získala se řada izolátú kmene 1372 nesoucí gen URA3 a jeden izolát (kmen 12930-190-S1-1) se vybral za účelem přerušení genu HIS3. Vektor nesoucí přerušený gen HIS3 pUC18-his3::URA3 (pl505) se štěpil restriktázami Xbal a EcoRI za účelem vytvoření lineární kazety his3::URA3, která se použije pro transformaci kmene 12930-190-S1-1 lithium acetátovým způsobem. (Methods in Enzymology, 194:290(1991)). Transformanti Ura⁺ se selektují na syntetickém agarovém mediu bez uracilu. Za účelem najít klonální izoláty se jednotlivé kolonie přenášejí na uvedené medium a pak se vytvoří replika ploten na mediu, kde chybí buď uráčil nebo histidin a tak se identifikují izoláty, které jsou Ura⁺ a His'. Jeden izolát (kmen 12930-230-1) se vybral za účelem vytvoření podstatného přerušení genu PRB1. Vektor nesoucí přerušený gen PRB1 (pUC18-prbl::HIS3, #1245) se štěpí restriktázami Sací a Xbal, aby se vytvořila lineární kazeta prbl::HIS3, která se použije pro transformaci kmene 12930230-1 lithium acetátovým způsobem. Transformanti His se selektují na agarovém mediu bez histidinu a jednotlivé izoláty se roztírají na stejném mediu za účelem získání klonálních izolátú. Genomová DNK se připravuje z řady výsledných His⁴· izolátú, které se štěpí restriktázou EcoRI a pak se elektroforezuji na 0,8% agarózovém gelu. Pak následuje

Southern blot analýza za použití radioaktivně značené 617 bp velké sondy reagující s genem PRB1, která se připravuje

polymerázovou	řetězovou	reakcí	(PCR) za	použití
oligonukleotidových primerů:
5'	TGG TCA TCC	CAA ATC	TTG AAA 3'
5'	CAC CGT AGT	GTT TGG	AAG CGA 3'

Získalo se jedenáct izolátú, kde sonda hybridizuje s 2,44 kbp velkým prbl::HIS3 fragmentem DNK. Což je v kontrastu s hybridizací sondy s 1,59 kbp velkým fragmentem genu PRB1 divokého typu. Jeden z těchto izolátů obsahující požadované prbl::HIS3 přerušení se vybral pro další použití a označil se jako kmen #1558.

Příklad 7: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasinkového genu PEP4.

Gen PEP4 z S. cerevisiae se klonuje z kvasinkové genomové knihovny následujícím způsobem. Buňky E.coli obsahující kvasinkovou genomovou knihovnu pLSlOl (Shultz and Friesen, 1983, J.Bacteriol. 155:8-14) se přes noc pomnoží v 5 ml LB media, které obsahuje 100 μg/ml ampicilinu. Ředění 10'⁴ a 10~⁵ této kultury se nanesou na plotnu s LB mediem a ampicilinem. Připraví se otisk plotny s koloniemi na nitrocelulózovou membránu. Polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Taq DNK polymerázy, celé plazmidové DNK z kvasinkové knihovny pLSlOl a následujících oligonukleotidových primerů připravených na základě publikované DNK sekvence pro gen PEP4 (C.A.Woolford et al., Mol.Cell.Biol. 6:2500 (1986)) se získá 600 bp velká sonda pro kvasinkový gen PEP4.

sense primer: 5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3' antisense primer: 5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3'

Polymerázová řetězová reakce probíhá ve 25 cyklech (94°C lmin., 37°C 2min., 72°C 3min.). Sonda vytvořená polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) se čistí na gelu, radioaktivně se značí a používá se pro hybridizaci s koloniemi na membráně, která je popisuje shora. U několika kolonií je hybridizace s PEP4 sondou pozitivní. Tyto kolonie se přenesou na LB medium z ampicilinem. Plazmidová DNK z několika těchto izolátů se připravuje alkalickou-SDS lyží (Sambroock et al., shora uvedeno) a štěpí se restriktázou BamHI. Zjistily se očekávané pruhy odpovídající velikostí 14 kbp velkému vektoru a 6,9 kbp velkému inzertu PEP4. Po štěpení s restriktázami EcoRI a Xhol se získá 1,5 kbp velký pruh odpovídající genu PEP4. Jeden izolát (kmen #860 E.coli) vybral pro další použití, štěpí restriktázoi BamHI vykazující očekávané výsledky se Plazmidová DNK z kmene #8 60 se a vzniklý 6,9 kbp velký BamHI fragment DNK nesoucí chromozomální gen PEP4 se subklónuje do BamHI místa plazmidu pUC13, vzniká plazmid p890. Plazmid p890 se pak štěpí restriktázou Ncol (která štěpí kódující sekvenci genu PEP4) , čistí se na gelu, T4 DNK polymerázou se upravují tupé konce a liguje se s 1,1 kbp fragmentem s tupými konci, který nese funkční gen URA3 (připravený podle příkladu 2) . Výsledný plazmid obsahuje gen PEP4 přerušený genem URA3 a označil se jako pUC13-pep4::URA3 (kmen #906).

Příklad 8: Konstrukce kmenů číslo 1569, 1538 a 1592, které jsou odvozeny od kmene U9 a obsahují mutanty prbl a pep4.

Za účelem přerušit gen HJS3 v kmeni U9 se štěpí vektor pUC18-his3::URA3 restriktázami EcoRI a Xbal a pak se použije pro transformaci kmene U9 lithium acetátovou metodou. Transformanti Ura⁺ se selektují na agarovém mediu bez uracilu. Za účelem najít klonální izoláty se jednotlivé kolonie přenášejí na uvedené medium a pak se vytvoří replika ploten na mediu, kde chybí buď uráčil nebo histidin a tak se identifikují izoláty, které jsou Ura⁺ a His'. Jeden izolát (kmen číslo 1524) se vybral za účelem vytvoření podstatného přerušení genu PRB1. Vektor nesoucí přerušený gen PRB1 pUC18prbl::HIS3 se štěpí restriktázami Sací a Xbal a pak se používá pro transformaci kmene číslo 1524 litium acetátovou metodou. Transformanti His⁺ se selektují na agarovém mediu bez histidinu. Za účelem najít klonální izoláty se jednotlivé kolonie přenášejí na uvedené medium. Genomová DNK se připravuje z řady výsledných His⁺ izolátů a hodnotí se Southern blot hybridizací s radioaktivně značenou sondou PRB1. Jeden z izolátů (kmen číslo 1537), který vykazuje požadované přerušení genu PRB1 genem HIS3 (to je prbl::HIS3), se vybral pro přerušení genu PEP4. Kmen číslo 1537 se pasážuje na plotnách s 5-fluoro-orotovou kyselinou (FOA) za účelem selekce ura3 izolátů a jeden izolát (kmen číslo 1541) se vybral pro další použití.

Za účelem přerušení genu PEP4 v kmeni číslo 1541 se vektor nesoucí přerušený gen PEP4 pUC13-pep4::URA3 štěpil restriktázou Xhol, aby se vytvořila lineární kazeta pep4::URA3, která se použije pro transformaci kmene číslo 1541 lithium acetátovým způsobem. Transformanti Ura⁺ se selektují na agarovém mediu bez uracilu. Za účelem najít klonální izoláty se jednotlivé kolonie přenášejí na uvedené medium. Genomová DNK se připravuje z řady výsledných Ura⁺ transformantů a hodnotí se metodou Southern blot za použití radiaktivně značené sondy pro gen PEP4. Jeden izolát (kmen číslo 1569) vykazující požadované přerušení genu PEP4 genem URA3 se vybral pro další použití. Kmen číslo 1538 byl vytvořen v nezávislém pokusu stejnou sekvencí jednotlivých kroků. Kmen číslo 1538 se odvodil od kmene U9. Kmen číslo 1538 obsahuje prbl a pep4 mutanty. Dále ura3 derivát kmene číslo 1569 se získal pasáží na plotnách s 5-fluoro-orotovou kyselinou (FOA). Výsledný ura3 derivát kmene číslo 1569 se označil jako kmen číslo 1592.

Příklad 9: Extrakce nukleové kyseliny z biopsie.

Od 25-ti leté pacientky po porodu se získala velká vulvární léze condyloma acuminatum. Fragment této léze se zamrazil v kapalném dusíku, pak se zpracoval Braunovým mikrodismembratorem II (B.Braun Instruments, Melsungen, Germany). Výsledný materiál se rozpustil v 0,6 % (hmotnost/objem) dodecylsulfátu sodném (SDS), natrávil se proteinasou K v množství 50 μg/ml a extrahoval se směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol. DNK se vysrážela etanolem a její množství se určilo UV spektrofotometricky. Přítomnost DNK s vysokou molekulární váhou se prokázala elektroforezou na agarosovém gelu a následným obarvaním ethidium bromidem.

Příklad 10: Typování DNK lidského papilomavirů (HPV).

DNK lidského papilomavirů (HPV) se určila použitím hybridního záchytového testu, který se nazývá Víra Type Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD) . Užívané HPV sondy se rozdělily na dvě části, jejichž složení je dáno vztahem každého typu k maligním nádorům genitálního traktu. Skupina sond označena jako skupina A obsahuje málo rizikové typy lidského papilomavirů (HPV), jsou to typ 6,11,42,43 a 44. Sonda B obsahuje vysoce rizikové typy 16,18,31,33,35,45,51 a

56. Za účelem určení subtypu lidského papilomaviru (HPV) se celková DNK štěpila restrikčními endonuklazami Pstl, BamHI a HindlII a následující Sothernův přenos proběhl za vysoce přísných podmínek, teplota tání byla 15°C.

Příklad 11: Klonování genomu lidského papilomaviru typu 6a.

Celková DNK, která se extrahovala ze vzorku HPV6apozitivní biopsie, se štěpila endonukleazou HindlII. Dále následuje dělení na základě velikosti na 0,8 % preparačním gelu vyhotoveném z agarosy tající za nízké teploty. Z gelu se vyřízla oblast obsahující DNK o velikosti přibližně 8 kbp a agarosa se štěpila s enzymem Gelase™ (Epicentre

Technologies, lne., Madison, WI) , vzorek se ligoval do vektoru pUC18 (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ) štěpeným eznymem HindlII a pak defosforylovaným. Následovala transformace kompetentních DH5 buněk E.coli (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD) . Z plazmidové knihovny se vybraly klony pozitivní na HPV6a pomocí hybridizace kolonií s oligonukleotidem odvozeným z pozitivního řetězce DNK značeným ³²P. Oligonukleotid je komplementárního k 3'- konci Li genu lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) (5'-GAG AGA TCT_TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'). Izoloval se plazmid pUC18 obsahující 8,1 kbp velký genom lidského papilomaviru typu 6a charakterizoval se pomocí štěpení restrikčním Southernovým přenosem. Tento plazmid se označil jako pUC18-HPV6a. Plazmidová DNK se připravila použitím Quigen™ Plasmid Maxi kit (Qu igen lne., Chatsworth, CA).

(HPV6a) a enzymem a

Příklad 12: Sekvenční analýza plazmidu pUC18-HPV6a.

Za účelem určení celé sekvence lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se na základě uveřejněné sekvence lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) syntetizovaly sekvenční primery. Sekvenovaly se oba řetězce celého 8,1 kbp velkého genomů lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) pomocí dideoxy řetězové terminační metody za použití soupravy PRISM™ a automatizovaného sekvenátoru Applied Biosystems (ABI) (č. 373A) . Při sekvenaci se postupovalo podle instrukcí výrobce (ABI, lne., Foster City, CA). V případech, kde antikódující a kódující sekvence nesouhlasí, syntetizovaly se další HPV6a specifické primery za účelem znovu sekvenovat spornou oblast v obou směrech.

Sekvence DNK HPV6a a HPV6b jsou z 97% shodné, obsahují z celkového počtu 8 010 párů baží 229 párů baží odlišných. Ve srovnání se sekvencí lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) se našly nejpodstatnější rozdíly v dlouhé regulační oblasti (LCR; v poloze nukleotid 7 205 až nukleotid 106) . Nezávisle na několika jednotlivých změnách nukleotidů v dlouhé regulační oblasti lidského papilomaviru typu 6a, se našly dvě inzerce. Jedna je 94 párů baží velká a nachází se v poloze nukleotid 7 350 a druhá je 19 párů baží velká a je umístěna v poloze nukleotid 7 804. Ve srovnání s genomem lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se našla v poloze nukleotid 7 615 delece o velikosti 6 párů baží.

Příklad 13: Konstrukce kvasinkového expresivního vektoru pro protein LI lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a LI).

DNK lidského papilomaviru typu 6a se použila jako templát pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Gen HPV6a LI se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.) v 35 cyklech (94°C lmin, 48°C lmin, 72°C lmin 45 vteřin) a následujících oligonukleotidových primerů, které obsahují lemovací místo rozeznatelné restriktázou BglII (podtrženo):

sense primer: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' antisense primer: 5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C -3'

Sense primer vedoucí sekvenci zavádí kvasinkovou nepřekládanou bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu HPV6a LI. 1,5 kbp velký produkt PCR se štěpí restriktázou BglII a čistí se na gelu.

Konstrukce expresivního vektoru pGALlO probíhá izolací 1,4 kbp velkého Sphl fragmentu pocházejícího z vektoru pUC18-GALlp-GAL10p obsahujícího dvousměrný promotor GAL. Vektor zahrnuje divergentní promotor GAL1/GAL10 z plazmidu pBM272 (poskytl Dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis), který je na každé straně olemovaný kopií kvasinkového transkripčního terminátoru ADH1 (Bennetzen, J.L. and Halí, B.D. (1982)

J.Biol.Chem.257:3018-30251

Dále zahrnuje

BamHI klonovací místo nacházející se mezi GAL1 promotorem a promotorem terminátoru první kopií transkripčního klonovaciho místo GAL10

ADH1.

terminátoru ADH1 a Smál divergentním transkripčního lokalizované mezi a druhou kopií

Kvasinový pendlující vektor sestávající se z plazmidu pBR322, kvasinkového genu LEU2-d a kvasinkového 2 pm velkého kruhu s restrikčním místem Sphl je ligovaný s 1,4 kbp velkým Sphl fragmentem promotoru GAL. Výsledný vektor pGALlO se linearizuje restriktázou BamHI, která rozeznává restrikční místo mezi promotorem GAL1 a transkripčním terminátorem ADH1.

Vektor pGALlO štěpený restriktázou BamHI a PCR fragment genu HPV6a LI štěpený restriktázou BglII se ligují a vzniklý plazmid se používá pro transformaci DH5 buněk E.coli (BRL). Izoloval se plazmid pCl/l-GAL obsahující gen HPV6a LI a označil se jako pl3173-357-6. Gen LI v plazmidu pl3173-357-6 se sekvenoval (ABI sekvenátor číslo 373A) a ukazuje se, že je identický jako gen LI v klonu pUC18-HPV6a.

Příklad 14: Konstrukce kvasinkového expresívního vektoru genů HPV6a LI a L2.

Plazmid pl3173-357-6 (pGALlO a HPV6a LI) se štěpí restriktázou Smál, který rozeznává restrikční místo mezi promotorem GAL10 a transkripčním terminátorem ADH1. 1,4 kbp velký gen HPV6a L2 se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití DNK plazmidu pUC18HPV6a jako templátu, Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.), amplifikace probíhá v 10 cyklech (94°C lmin, 48°C lmin, 72°C lmin 45vteřin) a používají se následující oligonukleotidové priméry, které obsahují lemovací sekvenci s Smál restríkčním místem (zvýrazněno podtržením):

sense primer: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC CAG ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3' antisense primer: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG.3'

Sense primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou vedoucí sekvenci bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu HPV6a L2. Produkt PCR se štěpí restriktázou Smál, čistí se na gelu a liguje se s plazmidem pl3173-357-6 štěpeným restriktázou Smál. Izoloval se plazmid pGALlO, který obsahuje geny HPV6a LI a L2, a označil se jako pl4049-7-2. Gen L2 se sekvenoval (ABI sekvenátor #373A) a zjistilo se, že je shodný z genem L2 z klonu pUC18-HPV6a.

Příklad 15: Exprese HPV6a LI a koexprese HPV6a LI a L2 v kvasinkách.

Plazmidy pl3173-357-6 (pGAL+HPV6a LI) a pl4049-7-2 (pGAL10+HPV6a LI a L2) se používaly pro transformaci kmenů číslo 1569 (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir°) a 1558 (MATa, leu2-04, prbl, adel, mnn9, cir⁰) . Výsledné rekombinantní kmeny získané použitím hostitelského kmene číslo 1558 jsou kmeny číslo 1644 (HPV6a LI) a kmen číslo 1670 (HPV6a L1+L2), jak se uvádí v tabulce. Klonální izoláty se kultivují v YEHD mediu obsahující 2 % galaktózy, při teplotě 30°C a po dobu 68 až 78 hodin. Po získání buněk, se pelet buněk rozbije skleněnými kuličkami a buněčný lyzát se testuje imunoblotem, zda dochází k expresi proteinu HPV6a LI nebo HPV6a L2. Vzorky obsahující 40 pg celkového buněčného proteinu se elektroforezuj1 na 10 % Tris-glycinovém gelu za redukujících a denaturujících podmínek a elektroblotuj1 se na nitrocelulozové membrány. Protein LI se imunodetekuje použitím králičího sera proti fúznímu proteinu trpE-HPVll (Brown, D.R. et al., Virology 201:46-54), které slouží jako primární protilátky, a oslích anti-králíčího IgG celých protilátek (Amersham, lne.) vázaných na křenovou peroxidázu (HRP), které se používají jako sekundární protilátky. Na membrány se použila chemoluminiscenční ECL™ detekční souprava (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích vyjma negativní kontroly (vektor bez genů Ll nebo L2) se detekoval 50 až 55 kDa velký pruh odpovídající proteinu Ll.

Protein L2 se detekoval jako 70 kDa velký pruh Westernovým testem za použití sera z myší jako primárních protilátek o ředění 1:250. Sérum se připravilo třinásobnou imunizací myší fúzním proteinem trpE-HPV6a L2, který se připravil způsobem podle Carter et al. . Jako sekundární protilátky se použily ovčí anti-myšší IgG (Amersham, lne.) vázané na křenovou peroxidázu (HRP) v ředění 1:1 000.

Za účelem EM testu (elektronová mikroskopie) (Structure Probe, West Chester, PA) se alikvot každého vzorku umístil na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12wolframové (PTA), pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 OOOx.

Partikule podobné virovým partikulím (VLP) se pozorovaly ve všech vzorcích kvasinek. Jejich průměr je v rozmezí 50-55 nm. Kvasinky nesou buď HPV6a Ll nebo HPV6a Ll a L2 koexpresivní plazmidy. V kontrolním vzorku kvasinek se nepozorovaly žádné partikule podobné virovým partikulím (VLP).

Příklad 16: Fermentace HPV6a L1+L2 (kmen číslo 1670).

Kmen číslo 1670 rostoucí na povrchu plotny se přenese do kapalného media bez leucinu, které obsahuje na jeden litr:8,5 g kvasinkové dusíkaté báze (Difco) bez aminokyselin a síranu amonného; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantarové; 5 g síranu amonného; a 0,25 g L-tyrozinu; pH tohoto media se před sterilizací upraví hydroxidem sodným na hodnotu 5,0 až 5,3. Kultura se kultivovala při teplotě 28°C, po dobu 25 hodin na rotační míchačce při otáčkách 250 ot/min. Zmrazená kultura se připravila přidáním sterilního glycerolu v konečné koncentraci 17% (v/o). Kultura se uchovává při teplotě -70°C v alikvotech o objemu 1 ml v kryozkumavkách. Inokulum pro fermentaci kmene číslo 1670 se připraví do stejného media (500 ml do dvoulitrové nádoby) a přenosem rozmraženého obsahu kryo-zkumavek do dvoulitrových nádob a inkubuje se při teplotě 28°C, po dobu 25 hodin a míchá se na rotační míchačce při 250 ot/min. Po inokulaci se pro další inkubaci kmene číslo 1670 používá fermentor New Brunswick SF-116 s pracovním obsahem 10 1. Používané medium obsahuje na jeden litr: 20 g kvasinkového extraktu (Difco); 10 g Sheffieldova HySoy peptonu; 20 g glukózy; 20 g galaktozy; pH media před sterilizací se upraví na hodnotu 5,3. Celkový obsah (500 ml) dvoulitrové inokulační nádoby se přenese do fermentoru, kde se kultura inkubuje při teplotě 28°C, provzdušňuje se 5 1 vzduch za min, míchá se při 400 ot/min a za tlaku 0,0245 MPa. Míchání se může zintenzivnit, je-li nutné udržet hodnotu rozpuštěného kyslíku vyšší než 40% saturace. Průběh fermentace se pozoruje měřením obsahu glukózy způsobem offline (Beckman Glokose 2 Analyzer) a hmotnostní spektroskopií (Perkin-Elmer 1200) způsobem online. Po 69 hodinách inkubace je hustota buněk 9,9 g suché buněčné hmoty na jeden litr. Kultura se koncentruje filtrací přes dutá vlákna (náplň Amicon H5MPO1-43, filtrační systém Amicon DC-10) na objem přibližně 2 litry, diafiltruje se se 2 1 fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnany a před přelitím do centrifugačních lahví o objemu 500 ml se dále koncentruje (na objem přibližně 1 1). Buněčný pelet se získá centrifugací při 8 000 ot/min (rotor Sorval GS3), po dobu 20 minut a při teplotě 4°C. Po vylytí supernatantu se pelet (celkové množství 225 g mokré váhy buněk) uchovává při teplotě -70°C.

Příklad 17: Čištění rekombinantních kapsidových proteinů HPV6a L1+L2.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky kmene číslo 1670 se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -70°C. Zmrazené buňky (mokrá váha 38 g) se rozmrazují při teplotě 20 až 23°C a resuspendují se v 50 ml pufru LI (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do pufru se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A o konečné koncentraci 2 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 56 MPa ve třech cyklech v mikrofluidizeru MHO (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Rozbité buňky se centrifugují při 5 OOOxg po dobu 10 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje L1+L2 antigen.

Supernatant se naředí 1:5 přidáním pufru A (20 mM MOPS, pH7,0) a aplikuje se na anexovou záchytovou kolonu (5 cm v průměru x 4 cm) . Náplní kolony je pryskyřice Fractogel®EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrem A. Následuje promytí pufrem A a antigen je vymyt gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Určení, která frakce obsahuje protein LI, se provede imuno-dot blotem.

Frakce obsahující protein LI, které se určily imuno-dot blotem, se testují za účelem zjištění celkového množství proteinu pomocí Bradfordovy metody následované SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a Western blotu.

Shromažďují se frakce vykazující srovnatelnou čistotu a srovnatelné množství proteinu LI. Antigen se koncentruje frakcionací se síranem sodným. Roztok se upraví na hodnotu 63% saturovaného síranu sodného přidáním pevného činidla, zatímco je jemně míchán po dobu 30 minut. Vzorek se umístí na led a nechá se precipitovat po dobu 30 minut, pak se centrifuguje při 12 OOOxg. Pelet se resuspenduje ve 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl).

Resuspendovaný pelet se dělí na vylučovací chromatografické koloně o velikosti (průměr kolony 2,6 cm x 89 cm) na základě velikosti. Náplň kolony je pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) , pufr je PBS. Chromatografie probíhá za teploty 20 až 23°C. Frakce se testují metodou SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a detekují se Western blotem. Shromažďují se nejčistčí frakce, které se pak koncentrují.

Konečný produkt se testuje metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Odhaduje se, že proteiny LI a L2 jsou z 85% homogenní. Zda jde určitě o proteiny LI a L2 se dokáže použitím příslušného antisera. Konečný produkt se rozdělí na alikvoty a uchovává se při teplotě -70°C. Tímto způsobem se získalo celkem 3 mg proteinu.

Pomocí strukturní sondy (West Chester, PA) probíhá analýza elektronovou mikroskopií. Alikvot každého vzorku se umístil na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na dobu 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12-wolframové (PTA) , pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 000x. Potvrdila se přítomnost partikul!

podobných virovým partikulím (VLP) o velikosti 50 až 55 nm.

Příklad 18: Konstrukce vektoru pro expresi genu CRPV Li.

Gen CRPV LI se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) z plazmidu pLAII, který obsahuje celý CRPV virový genom (Dr. Peter Howley, NCI), za použití Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.); a následujících oligonukleotidových primerů obsahujících lemovací sekvenci s BG1II restrikčním místem (zvýrazněno podtrženým písmem). Amplifikace probíhá v 35 cyklech (94°C 1 min; 50°C 1 min; 72°C 2 min).

sense primer: 5' -GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3' antsense primer: 5'-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3 '

Sense primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou vedoucí sekvenci bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu CRPV LI. 1,6 kbp velký produkt PCR se štěpí restriktázou BglII, čistí se na gelu a subklonuje se do BglII restrikčního místa vektoru pSP72 (Promega). Vzniká plazmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l).

Jeden subklon se celý sekvenoval a zjistilo se, že se ve 4 nukleotidech liší od publikované sekvence CRPV LI. Tyto odlišnosti nezpůsobují změny v aminokyselinách. Gen LI se získal z plazmidu pSP72-CRPV-Ll jako BglII fragment a subklonuje se do jediného BamHI restrikčního místa, které se nachází mezi kvasinkovým promotorem GAL10 a transkripčním terminátorem ADH1 v kvasinkovém expresívním vektoru, který obsahuje GAL10 promotor z plazmidu YEp52 (broach et al., Exp. Manipulation of gene expression, 1983, 83:81-116) a transkripční terminátor ADH1 z kostry stejného vektoru. Vzniklý plazmid se označil p!2930-323-6-i.

Příklad 19: Konstrukce vektoru pro expresi genu CRPV L2.

Gen CRPV L2 se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.) z plazmidu pLAII štěpeného restriktázou Sáli, čištění 7,9 kbp velkého fragmentu na gelu a ligací se sebou samým. Používá se následujících oligonukleotidových primerů obsahujících lemovací sekvenci s EcoRI restrikčním místem (zvýrazněno podtrženým písmem). Amplifikace probíhá v 35 cyklech (90°C 1 min; 50°C 1 min; 72°C 2 min) .

sense primer: 5'-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3' antisense primer: 5'-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3 '

Sense primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou vedoucí sekvenci bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu CRPV L2. 1,5 kb velký produkt PCR se štěpí restriktázou

EcoRI, čistí se na gelu a subklonuje se do EcoRI restrikčního místa vektoru pUC18-GALlp-GAL10p s dvousměrným promotorem.

Vektor obsahuje divergentní kvasinkový promotor GAL1/GAL10 Tento vektor obsahuje jediné BamHI restrikční místo mezi promotorem GAL1 a první kopií transkripčního terminátoru ADH1, dále obsahuje jediná EcoRI a Smál restrikční místa ležící mezi promotorem GAL1 a druhou kopií transkripčního terminátoru ADH1. Výsledná expresivní kazeta je nesena na 1,4 kb velkém Sphl fragmentu. Jeden klon (pl2930-295-2-2) obsahující požadovaný L2 inzert, který přiléhá k promotoru GAL10, se celý sekvenoval. Zjistilo se, že se liší šesti nukleotidy od publikované sekvence, 4 nukleotidy způsobují změny v aminikyselinách. Sekvenční analýza původní templatové DNK potvrdila, že tyto změny byly přítomné také v plazmidu pLAII a nebyly tedy vneseny PCR. Vektor pUC18-GALlp-GAL10p obsahující gen L2 se štěpí restriktázou Sphl a 2,9 kb velký fragment nesoucí ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHl expresivní kazetu se liguje s velkým Sphl fragmentem kvasinkového pendlujícího vektoru. Výsledný plazmid se označil jako p!2930-323-2-3.

Příklad 20: Exprese kapsidových proteinů CRPV LI a L2 v kvasinkách.

Plamidy p!2930-323-6-l a pl2930-323-2-3 se použily pro transformaci kmenů číslo 1569, 1538, BJ5462 (E.W.Jones,

Methods in Enzymology 194 (1991)428-453) a kmene číslo BJ1995 (Jones, ve stejné publikaci) S.cerevisiae. Klonální izoláty se kultivují v YEHD mediu obsahující 2 % galaktózy, při teplotě 30°C a po dobu 48 až 72 hodin. Po získání buněk, se pelet buněk rozbije skleněnými kuličkami, přidá se TritonX100 v množství, aby jeho konečná koncentrace byla 0,5%, a buněčný lyzát se testuje imunoblotem, zda dochází k expresi proteinu CRPV LI a L2. Vzorky obsahující 40 μg celkového buněčného proteinu se elektroforezují na 12 % Tris-glycinovém gelu (Novex) za redukujících podmínek a elektroblotují se na

PVDF membrány (Novex) . Proteiny CRPV LI a L2 se detekují použitím polyklonálního anti-Ll a anti-L2 králičího antisera (dárek od Dr. John Kreider, Hershey Medical Center), které slouží jako primární protilátky, a proteinu A vázaného na křenovou peroxidázu (HRP), který se používá jako sekundární protilátky. Na membrány se použila chemoluminiscenční ECL™ detekční souprava (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích nesoucích LI expresívní plazmid se detekoval 55 až 61 kDa velký pruh odpovídající proteinu LI. Ve všech vzorcích kvasinkových klonů nesoucích L2 expresívní plazmid se detekoval přibližně 90 kDa velký pruh odpovídající proteinu L2 .

Žádný signál se nedetekoval ve vzorcích odvozených z kvasinkových klonů nesoucích LI expresívní plazmid pomocí antí-L2 antisera nebo obráceně (Obrázek 6)

Na základě těchto výsledků exprese se vybraly pro další studie tyto rekombinantní kavsinkové kmeny: kmen číslo 1582, který je hostitelským kmenem číslo 1569 obsahující plazmid pl2930-323-6-l; a kmen číslo 1583, který je hostitelským kmenem číslo 1538 obsahující plazmid pl2930-323-2-3.

Příklad 21:

A. Čištění rekombinantního kapsidového proteinu CRPV LI.

Buňky kmene číslo 1582 uchovávané v -70°C se rozmrazí a suspendují se ve stejném objemu lyžujícího pufru (20mM fosforečnan sodný,. pH7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) . K suspenzi buněk se přidají proteázové inhibitory PMSF a pepstatin A v možství, aby jejich konečná koncentrace byla 2 mM respektive 1,7 mM. Buňky se lyžují v 10-ti cyklech v mikrofluidizeru. Lyzát se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut. Supernatant se převrství přes 5-ti centimetrový polštář 45 % sacharozy (v/o) v jednom litru pufru a LI se získá centrifugací při 100 OOOxg po dobu 4 hodin. Pelet se resuspenduje v 1/10 objemu LI pufru. Resuspendovaný pelet se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut. K supernatantu se přidá Tween-80 v množství, aby jeho konečná koncentrace byla 0,01%, a supernatant se frakcionizuje při teplotě místnosti podle velikosti vylučovací chromatografii na koloně o objemu 1 700 ml (průměr kolony 5 cm) s pryskyřicovou náplní Sephacryl S-1000 (Pharmacia) . Použitý pufr pro tuto kolonu má složení 10 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl, 0,01 % Tween-80.

Frakce obsahující imunoreaktivní materiál se určí immunodot blotovacím testem, spojí se a koncentrují se na 1/6 objemu ultrafiltrací za použiti míchaných jamek (Amicon) s YM-100 membránou (100 000 MWCO) o průměru 7 6 mm. Produkt se sterilizuje filtrací přes membránu Millex-GV s póry o velikosti 0,22 pm (Millipore).

B. Charakterizace rekombinantního kapsidového proteinu LI.

Identita konečného produktu se ověřuje Western blotem a N-terminální sekvenční analýzou. Čistota se určuje metodou SDS-PAGE s Coomassie a barvením stříbrem a roztoky dělící kapilární elektroforezou (SSCE) s optickou detekcí při vlnové délce 215 nm. Metoda SSCE určila, že protein LI je ze 75% čistý. Elektronová mikroskopie vykazuje přítomnost partikul! podobných virovým partikulím (VLP), průměr partikul! je 50 až 55 nm.

C. Analytická podle velikosti vylučovací kapalinová chromatografie (HPLC).

Za účelem zjistit přítomnost partikul! podobných virovým partikul! (VLP) se vzorky dělily na frakce podle velikosti vylučovací chromatografii. Chromatografie probíhá na PerkinElmer Series 410 Biopump HPLC s autoinjektorem ISS 100, který obsahuje 200 mikrolitrovou injekční smyčku. Použila se G5000PW kolona o rozměrech 7,5 x 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA) naplněná s TSK gelem. Za účelem monitorování vymývání proteinu z kolony se použila optická detekce při vlnové délce 280 nm pomocí diodového detektoru Perkin-Elmer LC-235. Složení mobilní fáze je 0,5 mM NaCL v lOmM pufru fosforečnanu sodného, pH7,2. Rychlost průtoku je 0,5 ml/min. Sbírají se frakce o objemu 1 ml. Kalibrace kolony se uskutečnila proteinovým standardem (Sigma) a rekombinantním povrchovým antigenem hepatitidy B (Recombivax™, Merck & Co., West Point, PA). Detekce antigenu ve frakcích získaných během vymývání kolony proběhla imunodot blotem.

D. Imunodot blot.

mikrolitrů vzorku každé frakce se aplikuje na pruh membrány PVDF (imunobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA) , která je navlhčena a umístěná na vlhký blotovací papír. Vzorky se nechají nasát do membrány a membrána se umístí do blokujícího roztoku (5% (v/o) netučné sušené mléko rozpuštěné v 0,15 M NaCl, 0,02 % (v/o) azid sodný a 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,2) a ta se inkubuje při teplotě místnosti za jemného míchání po minimální dobu tří hodin. Blokující roztok se nahradí roztokem primárních protilátek.

Primární protilátky se vybírají v závislosti na antigenu, který se má určit.

Protein CRPV Ll se testuje pomocí králičího anti-CRPV sera pozdní odezva (Biodesigne International, Kennebunk,

ΜΕ). Protein CRPV L2 se testuje pomocí králičího anti-CRPV L2 sera. Protein HPV6a LI se testuje pomocí monoklonálích protilátek MAB 837 (Chemicon International, lne., Temecula, CA) . Protein HPV6a L2 se testuje pomocí myššího anti-HPV6a L2-trpE fúzního sera.

Zviditelnění imunokomplexů probíhá použitím standardních metod pomocí druhých protilátek spojených s alkalickou fosfatázou a chromogenního substrátu NBT_BCIP.

E. Příprava vakcíny z rekombinantního kapsidového proteinu CRPV LI.

Čištěný rekombinantní kapsídový protein se absorbuje do Al(OH)3 v koncentraci 100 μg/ml.

Příklad 22: A. Čištění rekombinantního kapsidového proteinu CRPV LI - schéma 2.

Všechny kroky probíhají při teplotě 4°C, není-li uvedeno j inak.

Buňky kmene číslo 1582 uchovávané v -70°C se rozmrazí a suspendují se ve stejném objemu lyžujícího pufru (20mM fosforečnan sodný, pH7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). K suspenzi buněk se přidají proteázové inhibitory PMSF a pepstatin A v možství, aby jejich konečná koncentrace byla 2 mM respektive 1,7 mM. Buňky se lyžují použitím BioNeb systémem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut. Supernatant se převrství přes 5-ti centimetrový polštář 45 % sacharozy (v/o) v jednom litru pufru a LI se získá centrifugací při 100 OOOxg po dobu 4 hodin. Pelet se resuspenduje v 1/10 objemu LI pufru. Resuspendovaný pelet se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut.

Supernatant se naředí 1:5 pufrem PBS, přečistí se centrífugací za použití rotoru Sorvall SA-600 při 6 500 ot/min po dobu 10 min při teplotě 4°C. Supernatant se filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,22 gm a dělí se anexovou chromatografií.

Anexová chromatografie probíhá na Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC s 5 mililítrovou injekční smyčkou. Používá se kolona o rozměrech 150 mm x 10 mm v průměru s pryskyřicovou náplní Fractogel EMF TMA-650 (S) s póry o velikosti 25 až 40 mikronů (EM Separations, Gibbstown, NJ). Za účelem monitorování vymývání proteinu z kolony se použila optická detekce při vlnové délce 280 nm pomocí diodového detektoru Perkin-Elmer LC-235. Kolona byla ekvilibrována pufrem A o složení 0,15 M NaCl v 0,01 M pufru fosforečnanu sodného, pH7,2. Rychlost průtoku je 0,75 ml/min. Vzorek se nanese na kolonu a kolona se promývá pufrem A, za účelem odstranit nenavázaný materiál. Vázaný materiál se vymývá po dobu 5 min. NaCl s lineárním koncentračním gradientem 0,15 až 0,65 M, pak následuje vymývání s koncentračním gradientem 0,65 M až 1,15 M po dobu 30 min. Detekce antigenu ve frakcích, které se sesbíraly během vymývání, se uskutečňuje imunodot blotem. Spojily se frakce obsahující imunoreakční materiál (t.j. frakce vymyté hodnotou gradientu mezi 0,81 M až 1,05 M NaCl).

Frakce se koncentrují centrifugačním koncentračním přístrojem Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) na 1/5 objemu.

Koncentrát se dělí vylučovací chromatografií použitím pryskyřice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na koloně o rozměrech 87 mm x 27 mm v průměru. Průtoková rychlost v koloně je 2,5 ml/min. Vymývání se monitoruje při vlnové délce 280 nm. Antigen se detekuje imunoblotem.

Frakce obsahující imunoreaktivní materiál se spojí a koncentrují se ultrafiltrací za použití míchaných jamek (Amicon, lne., Beverly, MA) s membránou YM-100 (Amicon, lne., Beverly, MA) s průměrem 43 mm v atmosféře dusíku při tlaku 0,07 MPa.

Konečný produkt se charakterizuje metodou SDS-PAGE s Coomassie barvením a roztoky dělící kapilární elektroforézou (SSCE). Konečný produkt podle schématu 2 je z 88% čistý, jak se stanovil pomocí metody SSCE.

Příklad 23: Čištění rekombinantního kapsidového proteinu CRPV LI - schéma 3, obrázek 17

Všechny kroky probíhají při teplotě 4°C, není-li uvedeno j inak.

Buňky kmene číslo 1582 uchovávané v -70°C se rozmrazí a suspendují se ve stejném objemu lyžujícího pufru (20mM fosforečnan sodný, pH7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). K suspenzi buněk se přidají proteázové inhibitory PMSF a pepstatin A v možství, aby jejich konečná koncentrace byla 2 mM respektive 1,7 mM. Buňky se lyžují použitím BioNeb systémem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut. Supernatant se převrství přes 5-ti centimetrový polštář 45 % sacharozy (v/o) v jednom litru pufru a LI se získá centrifugací při 100 OOOxg po dobu 4 hodin. Pelet se resuspenduje v 1/10 objemu LI pufru. Resuspendovaný pelet se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut.

Supernatant se extrahuje 1/2 objemu chloroformu. Odebere se vodní fáze a čistí se centrifugací při 12 000 ot/min na mikrocentrifuze Beckman po dobu 5 min při teplotě místnosti.

Supernatant se ředí 1:5 pufrem PBS, přečistí se centrifugací za použití rotoru Sorvall SA-600 při 6 500 ot/min po dobu 10 min při teplotě 4°C. Supernatant se filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,22 pm a dělí se anexovou chromatografií.

Anexová chromatografie probíhá na Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC s 5 mililitrovou injekční smyčkou. Používá se kolona o rozměrech 150 mm x 10 mm v průměru s pryskyřicovou náplní Fractogel EMF TMA-650 (S) s póry o velikosti 25 až 40 mikronů (EM Separations, Gibbstown, NJ) . Za účelem monitorování vymývání proteinu z kolony se použila optická detekce při vlnové délce 280 nm pomocí diodového detektoru Perkin-Elmer LC-235. Kolona byla ekvilibrována pufrem A o složení 0,15 M NaCl v 0,01 M pufru fosforečnanu sodného, pH7,2. Rychlost průtoku je 0,75 ml/min. Vzorek se nanese na kolonu a kolona se promývá pufrem A, za účelem odstranit nenavázaný materiál. Vázaný materiál se vymývá po dobu 5 min. NaCl s lineárním koncentračním gradientem 0,15 až 0,65 M, pak následuje vymývání s koncentračním gradientem 0,65 M až 1,15 M po dobu 30 min. Detekce antigenu ve frakcích, které se sesbíraly během vymývání, se uskutečňuje imunodot blotem. Spojily se frakce obsahující imunoreakční materiál (t.j. frakce vymyté hodnotou gradientu mezi 0,81 M až 1,05 M NaCl).

Frakce se koncentrují centrifugačním koncentračním přístrojem Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) na 1/5 objemu.

Koncentrát se dělí vylučovací chromatografií použitím pryskyřice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na koloně o rozměrech 87 mm x 27 mm v průměru. Průtoková rychlost v koloně je 2,5 ml/min. Vymývání se monitoruje při vlnové délce 280 nm. Antigen se detekuje imunoblotem.

Frakce obsahující imunoreaktivní materiál se spojí a koncentrují se ultrafiltrací za použití míchaných jamek (Amicon, lne., Beverly, MA) s membránou YM-100 (Amicon, lne., Beverly, MA) s průměrem 43 mm v prostředí dusíku při tlaku 0,07 MPa.

Konečný produkt se charakterizuje metodou SDS-PAGE s Coomassie barvením a roztoky dělící kapilární elektroforézou (SSCE). Konečný produkt podle schématu 3 je z 95% čistý, jak se stanovil pomocí metody SSCE.

Roztok dělící kapilární elektroforéza (SSCE).

Vzorky partikul! podobných virovým partikulím (VLP) CRPV (přibližně 0,2 mg/ml) se zahřívají po dobu 15 minut při teplotě 100°C v 1 % 2-merkaptoetanolu a v 1 % SDS (v/o) .

Vzorek se elektrokineticky nanesl do kapiláry z taveného křemene o rozměrech 42 cm (22 cm k detektoru) x 0,05 mm v průměru, ekvilibrovanou 10 lumen objemy 0,1 N NaOH, vody a dělícího činidla ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA) vedle referenčního markru, kterým je kyselina melitová. Aplikuje se separační napětí 300 V/cm použitím přístroje Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Vymývání vzorku se monitoruje absorbancí při vlnové délce 215 nm a data se zaznamenávají pomocí software Nelson Turbochrom 3.

Příklad 24: Ochrana proti tvoření papilomů způsobených králičím papilomavirem (CRPV) pomocí vakcinace partikulemi podobnými virovým partikulím (VLP) obsahujících protein CRPV LI pocházejících z kvasinek.

Pět novozelandských bílých králíků se intramuskulárně imunizuje buď 135 μg LI VLP (čistota 75%) absorbovaných na kamenec nebo 100 μg rekombinantního povrchového antigenu hepatitidy B (čistota 99%) absorbovaném na hydroxidu, hlinitém. Tento antigen se používá jako negativní kontrola. Zvířata dostala 2 další dávky po 8 týdnech před tím, než byly testovány králičím virem (CRPV) , což se stalo 10 dní po poslední dávce. Sera odebraná před imunizací, při každé dávce a před testováním králičím virem se analyzují k proteinu Li specifickou ELISOU. Deska s 96 jamkami se pokryje s 5 μg surového lyzátu proteinu CRPV-L1 nebo CRPV L2 pocházejícího z kvasinek. Protein se odstraní a desky se blokují v roztoku 10 % suchého mléka (Carnation) a TTBS (20 mM TRIS pH7,4, 500 mM NaCl, 0,1 % Tween) po dobu 2 hod. a teplotě 4°C. Po té, co se deska promyje roztokem TTBS, se do roztoku 1% mléka a TTBS přidá ředěné králičí sérum a inkbuje se po dobu 2 hodin při teplotě 4°C. Desky se promyjí roztokem TTBS a do roztoku 1% mléka a TTBS se přidá anti-králičí IgG vázané na alkalickou fosfatázu (Kirkegaard and Perry Labs., Inc.) v ředění 1:1 000 a desky se inkubují po dobu 2 hodin při teplotě 4°C. Desky se promyjí roztokem TTBS a detekční reakce se vyvolá přidáním pnitrilfenylfosforečnanu (Kirkegaard and Perry Labs., Inc.). Reakce se zastaví přidáním 5 % EDTA. Absorbance se měří při vlnové délce 405 nm. je pozitivní, jestliže poměr absorbance L1/L2 je 2:1.

Titr protilátek anti-Ll se objevuje 4 týdny po první injekci a roste s každou další dávkou. Kontrolní zvířata jsou negativní. Šest týdnů po testování s CRPV jsou vakcinovaná zvířata bez bradavic na 15 místech z 15 (virus je ředěn 1:2 nebo 1:12). Zatímco kontrolní zvířata vykazují tvorbu bradavic na 12 místech z 15-ti (ředění viru je 1:2) nebo na 9 místech z 15 (při ředění 1:12). Po 15 týdnech jsou vakcinovaná zvířata bez bradavic.

Virus neutralizující assay probíhá (v podstatě podle metody Christensen et al., 1991, Virology 181:572-579) smíšením králičího sera s králičím papilomavirem (CRPV) a následným testováním králíků s králičím papilomavirem (CRPV). Standard pro stanovení neutralizujících protilátek se provedl neutralizací viru (na 3 místech ze 3 se netvoří bradavice). Analyzují se sera z 5 vakcinovaných a z 5 kontrolních zvířat. Sera získaná po 1 dávce VLP s proteinem CRPV LI obsahují protilátky, které zcela neutralizují neředěný virus z 80% (u 4 králíků z 5) . Po 2 nebo 3 dávkách VLP s proteinem CRPV LI má 100% králíků protilátky, které neutralizují virus. Kontrolní sera nevykazují žádnou virus neutralizující aktivitu. V závislosti na konečném titru sera vybraných vakcinovaných zvířat se může sérum naředit 10 až 1 000 krát a stále je stoprocentně neutralizující.

Příklad 25: Konstrukce vektoru pro koexpresi genu CRPV L1/L2 z jednoho plazmidu.

Plazmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l) se štěpí restriktázou BglII a 1,5 kbp velký BglII fragment nesoucí otevřený čtecí rámec CRPV LI (CRPV LI ORF) s kvasinkovou 5'nepřekládanou vedoucí sekvencí se čistí na gelu. Plazmid pl2930-323-2-3 se štěpí restriktázou BamHI, která rozeznává restrikční místo mezi promotorem GALI a terminátorem transkripce ADHI. Fragment lineárního vektoru se čistí na gelu a pak se liguje se zmíněným BglII fragmentem CRPV LI. Vzniká plazmid pl2930-366-l-2. Tento výsledný plazmid obsahuje otevřený čtecí rámec CRPV-L1, který se řídí promotorem GALI a otevřený čtecí rámec CRPV-L2, který se řídí promotorem GAL10.

Příklad 26: Konstrukce vektoru pro koexpresi genu CRPV L1/L2 ze dvou plazmidů.

Vektor pUC18-GALlp-GAL10p obsahující gen L2 se štěpí restriktázou Sphl. 2,9 kb velký fragment nesoucí expresívní kazetu ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt se čistí na gelu a T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce. Kvasinkový pendlující vektor YEp24 (Botstein et al., Gene 8:17 (1979)) se štěpí restriktázou BamHI, T4 DNK polymerázou se upraví tupé konce, defosforyluje se telecí alkalickou fosfatázou a pak se liguje s L2 expresívní kazetou s tupými konci. Vzniká plazmid p!594.

Příklad 27: Koexprese genu CRPV LI a L2 v kvasinkách.

Plazmid pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) se použil pro transformaci kmenů číslo 1569 a BJ5462 S.cerevisiae (systém zjedním plazmidem). Výsledné transformanty se selektují na syntetickém agarovém mediu bez leucinu. V paralelním experimentu se kmen číslo 1592 kotransformuje s CRPV LI expresívním vektorem pl2930-323-6-l a YEp24-GAL10p-L2 expresívním vektorem pl594 (systém dvou plazmidů) a výsledné transformanty obsahující oba vektory se selektují na syntetickém agarovém mediu bez leucinu a uracilu. Klonální izoláty obou systémů se kultivují v YEHD mediu obsahující 2 % galaktózu, při teplotě 30°C a po dobu 48 až 72 hodin. Po získání buněk, se pelet buněk rozbije skleněnými kuličkami, přidá se TritonX-100 v množství, aby jeho konečná koncentrace byla 0,5%, a buněčný lyzát se testuje imunoblotem, zda dochází k expresi proteinu CRPV LI a L2. Vzorky obsahující 50 μρ celkového buněčného proteinu se elektroforezuj! na Tris-glycinovém gelu (Novex)s gradientem 8 až 16 % za redukujících a denaturačních podmínek a elektroblotuj! se na PVDF membrány (Novex) . Proteiny CRPV LI a L2 se detekují použitím polyklonálního anti-Ll a anti-L2 králičího antisera (dárek od Dr. John Kreider, Hershey Medical Center), které slouží jako primární protilátky, a proteinu A vázaného na křenovou peroxidázu (HRP), který se používá jako sekundární protilátky. Na membrány se použila chemoluminiscenční ECL™ detekční souprava (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích nesoucích LI expresívní plazmid se detekoval 55 až 61 kDa velký pruh odpovídající proteinu LI. Ve všech vzorcích Ve všech vzorcích kvasinkových klonů nesoucích L1+L2 expresívní plazmid se detekoval přibližně 90 kDa velký pruh odpovídající proteinu L2. Žádný signál se nedetekoval ve vzorcích odvozených z kvasinkových klonů nesoucích LI expresívní plazmid (Obrázek 6) . Žádný signál se nedetekoval ve vzorcích z buněk obsahujících pouze L2 expresívní vektor.

Příklad 28: Čištění partikulí podobných virovým partikulám (VLP) nesoucích proteiny CRPV LI a CRPV L1+L2 pro studii provedenou elektronovou mikroskopií (EM).

Kvasinkami exprimované proteiny CRPV LI a CRPV L1+L2 se částečně čistí a koncentrují za účelem studie elektronovou mikroskopií (EM). Jeden až 1,5 1 media EYHD obsahující 2 % galaktozu se inokuluje kmenem číslo 1569 nebo BJ5462 S.cerevisiae, které jsou transformovány L1+L2 koexpresívním vektorem pl2930-366-l-2 a kultivuje se při teplotě 30°C a po dobu 4 8 až 72 hodin. V pararelním experimentu se buňky kmene číslo 1569 kotransformuj i CRPV-L1 expresívním vektorem pl2930-323-6-l a YEp24-GAL10p-L2 plazmidem pl594 a kultivují se za stejných podmínek. Pelet získaných buněk se zamrazí při teplotě -70°C. Všechny následující kroky probíhají při teplotě 4°C. Pelet buněk se rozmrazí a suspenduje se ve stejném objemu LI pufru (20 mM fosforečnan sodný pH7,2, 100 mM NaCL, 1,7 mM EDTA). Do buněčné suspenze se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A o konečné koncentraci 2 mM, respektive 1,7 μΜ. Buňky se lyžují 3 až 5 pasážemi ve mikrofluidizeru. Lyzát se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut. Supernatant se převrství přes 5-ti centimetrový polštář 45 % sacharozy (v/v) v jednom litru pufru a proteiny LI, L2 nebo L1+L2 se získají centrifugací při 100 OOOxg po dobu 4 hodin. Pelet se resuspenduje v 1/10 objemu LI pufru. Resuspendovaný pelet se čistí centrifugací při 5 OOOxg po dobu 10 minut.

Za účelem EM testu (elektronová mikroskopie) (Structure Probe, West Chester, PA) se alikvot každého vzorku umístí na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12wolframové (PTA) , pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 OOOx.

Ve všech kvasinkových vzorcích nesoucích buď CRPV LI expresívní plazmid nebo plazmid pro koexpresi CRPV LI a L2 jsou přítomny partikule podobné virovým partikulím (VLP), jejichž průměr je menší nebo roven 25 nm. Žádné partikule podobné virovým partikulím (VLP) nejsou pozorovány v kvasinkových kontrolních vzorcích, které nesou samotný L2 expresívní plazmid.

Příklad 29: Exprese genu CRPV LI (kmen číslo 1582) a genu HPV6a LI (kmen číslo 1644) v obohaceném komplexním a chemicky definovaném mediu.

Inokula těchto kmenů se připraví v syntetickém mediu bez leucinu, jak se shora popisuje, a to se přenese do míchaných kultivačních nádob. Použité míchané nádoby mají vysokou provzdušňovací kapacitu (70 ml kapaliny do 300 ml nádoby, Tunair Labware) . Do media se přidá přibližně 0,5 ml/1 protipěnícího činidla (UCON LB-625, Union Carbide). Obohacené komplexní medium obsahuje na jeden litr: 40 g kvasinkového extraktu Difco; 20 g Sheffieldova HySoy peptonu; 30 g glukózy; 50 g galaktozy; pH media se upravilo před sterilizací na hodnotu 5,3. Použité chemicky definované medium je stejné jako medium, které popisuje Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16:1197-1212 1974), ale obohacené s (na jeden litr) : 0,1 g cholinchloridu; 0,4 g adeninu; 30 g glutamatu sodného, která slouží jako zdroj dusíku; 0,2 g uracilu; 20 g glukózy; 40 g galaktozy. Nádoby se inokulují se 3 ml inokula, inkubují se po dobu 66 hodin při teplotě 28°C a míchají se na rotační míchačce při 250 ot/min. Za účelem ověření exprese proteinů pomocí imunoblotu použitím anti-CRPV LI a anti-HPV6a LI antiser, se z nádob odebírají vzorky.

Příklad 30: klonování genů HPV16 LI a L2.

Z Caski buněk (ATCC #CRL 1550) se standardním postupem (Sambrook et al., popsáno shora) extrahuje celková genomová DNK. DNK se štěpí endonukleázami Bstl 1071 a Sphl a elektroforezuje se na 0,8 % agarozovém preparativním gelu tajícím za nízké teploty. Oblast odpovídající DNK o přibližné velikosti 3,5 kbp se z gelu vyřízne a agaroza se štěpí Gelase™ (Epicentre Technologies, lne.) Na gelu 5 tupými konci, které se se liguje s oligodeoxynukleotidovými spojovníky s tupými konci, které obsahují skryté HindlII restrikční místo. Ligační směs se štěpí restriktázou HindlII za účelem doplnění a přibližně 3,5 kbp velká DNK se dělí podle velikosti na agarozovém gelu, jak se popisuje shora. Na gelu čištěná DNK se liguje s DNK plazmidu pUC18, která se štěpila s restriktázou HindlII a defosforylovala se. Následuje transformace kompetentních enzymem čištěná DNK polymerázou, upraví T4 DNK fosforylovanými buněk DH5 E.coli (BRL). Plazmidová knihovna se testuje za účelem zjištění klonů pozitivních na HPV16 pomocí hybridizace kolonií. Jako sonda se použije antisense oligodeoxynukleotidu značeného ³²P, který je komplementární k 3'-konci genu HPV6a LI (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Izoluje plazmid pUC18 obsahující 3,3 kbp velký genomový fragment lidského papilomavirů typu 16 (HPV16) a charakterizuje se štěpením restrikčnímy enzymy a analýzou Sothernovým přenosem. Tento plazmid se označil jako pUC18HPV16L1/L2 a obsahuje celé LI a L2 kódující sekvence DNK. Plazmidová DNK se připravila použitím soupravy Qiagen™ Plasmid Maxi kit (Qiagen, lne.).

Příklad 31: Konstrukce kvasinkového expresívního vektoru pro gen HPV16 LI.

Klon pUC18-HPV16Ll/L2 se použil jako templat pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Gen HPV16 LI se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.) v 10 cyklech (94°C lmin, 48°C lmin, 72°C lmin 45 vteřin) a následujících oligonukleotidových primerů, které obsahují lemovací místo rozeznatelné restriktázou BglII (podtrženo):

sense primer: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGC CC-3' antisense primer: 5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG

CGT TTA GC-3'

Sense primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou vedoucí sekvenci bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu HPV16 LI. 1,5 kbp velký produkt PCR se štěpí restriktázou BglII, čistí se na gelu a liguje se s vektorem pGALlO štěpeným restriktázou BamHI. Izoloval se plazmid obsahující gen HPV16 LI a označil se pl4049-37-l. Gen LI obsažený v plazmidu pl4049-37-l se sekvenuje použitím soupravy PRISM™ (ABI, lne.) a ABI sekvenátoru modelu číslo 373A podle instrukcí výrobce. Gen LI v tomto izolátu obsahuje 3 změny nukleotidů ve srovnání s upravenou publikovanou sekvencí prototypu (Kirnbauer, R.et al. (1993) J.Virol.67:6929-6936). Tyto změny vedou ke změnám dvou aminikyselin: His-202 na Asp; Thr-266 na Ala. Sekvenční analýza původní templatové DNK potvrdila, že tyto změny jsou také přítomny v genomovém klonu pUC18HPV16L1/L2 a nebyly tedy způsobeny PCR.

Příklad 32: Konstrukce kvasinkového expresívního vektoru pro gen HPV16 LI a L2.

Plazmid pl4049-37-l se štěpí restriktázou Smál, která rozeznává restrikční místo mezipromotorem GAL10 a terminátorem transkripce ADH1. 1,4 kbp velký gen HPV16 L2 se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití DNK pUCl6-HPV16L1/L2 jako templatu a Vent polymerázy (New England Biolabs, lne.). Amplifikace probíhá v 10 cyklech (94°C lmin, 48°C lmin, 72°C lmin 45 vteřin) a užívají se následující oligonukleotidové primery, které obsahují lemovací místo rozeznatelné restriktázou BglII (podtrženo):

sense primer: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA

AAC GTT CTG CAA AAC-3' antisense primer: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3'

Sense primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou vedoucí sekvenci bezprostředně k iniciačnímu metioninovému kodonu (zvýrazněno tučným písmem) proti směru transkripce genu HPV16 L. 1,5 kbp velký L2 produkt PCR se štěpí restriktázou Smál, čistí se na gelu a liguje se s vektorem pl4049-37-l štěpeným restriktázou Smál. Izoloval se plazmid pLSllO obsahující geny HPV16 Ll a L2 a označil se pl4049-42-2. Gen L2 obsažený v plazmidu pl4049-42-2 se sekvenuje použitím soupravy PRISM™ (ABI, lne.) a ABI sekvenátoru modelu číslo 373A podle instrukcí výrobce. Gen L2 v tomto izolátu obsahuje 5 změn nukleotidů ve srovnání s upravenou publikovanou sekvencí prototypu (Kirnbauer, R.et al. (1993) J.Virol.67:6929-6936) .

Tyto změny vedou ke změně jedné aminokyseliny: Ser-269 na Pro. Sekvenční analýza genomového klonu pUC18-HPV16Ll/L2 potvrdila, že tyto změny jsou také přítomny v původní templatové DNK a nebyly tedy způsobeny PCR.

Příklad 33:

A. Exprese genu HPV16 Ll a koexprese genů HPV16 Ll a L2 v kvasinkách.

Plazmidy pl4049-37-l a pl4049-42-2 se použijí pro transformaci kmene číslo 1558 S. cerevisiae. Jak je ukázáno v tabulce výslednými kmeny jsou kmen číslo 1678 (HPV16 Ll) a kmen číslo 1679 (HPV16 L1+L2). Klonální izoláty se kultivují v YEHD mediu obsahující 2 % galaktózu, při teplotě 30°C a po dobu 68 až 78 hodin. Po získání buněk, se pelet buněk rozbije skleněnými kuličkami a buněčný lyzát se testuje imunoblotem, zda dochází k expresi proteinu HPV6a LI nebo HPV6a L2. Vzorky obsahující 40 μς celkového buněčného proteinu se elektroforezuji na 10 % Tris-glycinovém gelu za redukujících a denaturujících podmínek a elektroblotuji se na nitrocelulozové membrány. Protein HPV16 LI se imunodetekuje použitím králičího polyklonálního antisera proti fúznímu proteinu trpE-HPVll LI (Brown, D.R. et al., Virology 201:4654), které slouží jako primární protilátky, a oslích antikrálíčího IgG protilátek (Amersham, lne.) vázaných na křenovou peroxidázu (HRP), které se používají jako sekundární protilátky. Na membrány se použila chemoluminiscenční ECL™ detekční souprava (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích vyjma negativní kontroly (vektor bez genů LI nebo L2) se detekoval 50 až 55 kDa velký pruh odpovídající proteinu LI. Protein L2 se detekoval jako 7 0 kDa velký pruh imunoblotem za použití myššího anti-HPV16 L2 sera vytvořeného proti fúzním proteinům trpE-L2, které se exprimují v E.coli. Toto sérum se používá jako primární protilátky. Jako sekundární protilátky se používá kozí anti-myšší IgG vázané na křenovou peroxidázu (HRP) (Amersham, lne.). Membrány se detekovaly shora popsaným způsobem.

B. Čištění rekombinantních kapsidových proteinů L1+L2 HPV typu 16.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -70°C. Zmrazené buňky (mokrá váha 27,6 g) se rozmrazují při teplotě 20 až 23°C a resuspendují se v 40 ml pufru LI (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) . Do pufru se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A o konečné koncentraci 2 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 56 MPa ve třech cyklech v mikrofluidizeru M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Rozbité buňky se centrifugují při 5 OOOxg po dobu 10 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje L1+L2 antigen.

Supernatant se naředí 1:5 přidáním pufru A (20 mM MOPS, pH7,0) a aplikuje se na anexovou záchytovou kolonu (5 cm v průměru x 4,8 cm). Náplní kolony je pryskyřice Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separatíons, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrem A. Následuje promytí pufrem A a antigen je vymyt gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Určení, která frakce obsahuje protein LI, se provede imuno-dot blotem.

Frakce obsahující protein LI, které se určily imuno-dot blotem, se testují za účelem zjištění celkového množství proteinu pomocí Bradfordovy metody následované SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a Western blotu.

Shromažďují se TMAE frakce vykazující srovnatelnou čistotu a srovnatelné množství proteinu LI. Antigen se koncentruje frakcionací se síranem sodným. Vzorky se upraví na hodnotu 48% saturovaného síranu sodného přidáním pevného činidla, zatímco jsou jemně míchány po dobu 30 minut. Vzorky se umístí na led a nechají se precipitovat přes noc, pak se centrifuguje při 12 OOOxg. Pelet se resuspenduje ve 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl).

Resuspendované pelety se dělí na vylučovací chromatografické koloně o velikosti (průměr kolony 2,6 cm x 89 cm) na základě velikosti. Náplň kolony je pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) , pufr je PBS. Frakce se testují metodou SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a detekují se Western blotem. Spojí se nejčistčí frakce. Výsledný vzorek se koncentruje v míchané jamce o objemu 50 ml za použití 43 milimetrových membrán YM-100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosféře dusíku za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt se testuje metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Odhaduje se, že proteiny LI a L2 jsou z 70% homogenní. Zda jde určitě o proteiny Li a L2 se dokáže Western blotem za použití příslušného antisera. Konečný produkt se rozdělí na alikvoty a uchovává se při teplotě -70°C. Tímto způsobem se získalo celkem 0,53 mg proteinu.

Pomocí strukturní sondy (West Chester, PA) probíhá analýza elektronovou mikroskopií. Alikvot každého vzorku se umístil na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na dobu 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12-wolfrámové (PTA), pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 OOOx. Potvrdila se přítomnost partikulí podobných virovým partikulím (VLP) o velikosti menší nebo rovné 25 nm.

C. Čištění rekombinantních kapsidových proteinů L1+L2 HPV typu 16.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -70°C. Zmrazené buňky (mokrá váha 92,8 g) se rozmrazují při teplotě 20 až 23°C a resuspendují se v 105 ml pufru LI (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do pufru se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A o konečné koncentraci 2 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 112 MPa ve třech cyklech v mikrofluidizeru MHO (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Rozbité buňky se centrifugují při 6 lOOxg po dobu 15 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje L1+L2 antigen.

Supernatant se naředí 1:5 přidáním pufru A (20 mM MOPS, pH7,0) a aplikuje se na anexovou záchytovou kolonu (5 cm v průměru x 4,2 cm). Náplní kolony je pryskyřice Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrem A. Následuje promytí pufrem A a antigen je vymyt gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Určení, která frakce obsahuje protein Ll, se provede imuno-dot blotem.

Frakce obsahující protein Ll, které se určily imuno-dot blotem, se testují za účelem zjištění celkového množství proteinu pomocí Bradfordovy metody následované SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a Western blotu.

Shromažďují se TMAE frakce vykazující srovnatelnou čistotu a srovnatelné množství proteinu Ll. Antigen se koncentruje frakcionací se síranem sodným. Vzorky se upraví na hodnotu 35% saturovaného síranu sodného přidáním pevného činidla, zatímco jsou jemně míchány po dobu 10 minut. Vzorky se umístí na led a nechají se precipitovat po dobu 4 hodin, pak se centrifuguje při 12 OOOxg. Pelet se resuspenduje ve 20 ml pufru PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl), který obsahuje 1 mM EDTA.

Resuspendované pelety se dělí na vylučovací chromatografické koloně o velikosti (průměr kolony 2,6 cm x 89 cm) na základě velikosti. Náplň kolony je pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ), pufrem je PBS a 1 mM EDTA. Frakce se testují metodou SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a detekují se Western blotem. Spojí se nej čistci frakce. Výsledný vzorek se koncentruje v míchané jamce o objemu 50 ml za použití 43 milimetrových membrán YM100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosféře dusíku za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt se testuje metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Odhaduje se, že proteiny LI a L2 jsou z 70% homogenní. Zda jde určitě o proteiny LI a L2 se dokáže Western blotem za použití příslušného antisera. Konečný produkt se rozdělí na alikvoty a uchovává se při teplotě -70°C. Tímto způsobem se získalo celkem 3,8 mg proteinu.

Příklad 34:

A. Fermentace kmene číslo 1679 (HPV typ 16 L1+L2).

Způsob přípravy zmrazených kultur za účelem uchovávání, příprava inokula, fermentace a získání buněk kmene číslo 1679 je v podstatě shora uveden. Po 67 hodinách inkubace se dosáhne hustoty buněk o hodnotě 4,2 g suché váhy na jeden litr a celkové množství buněk je 93 g (vlhká váha).

B. Fermentace kmene číslo 1678 (HPV typ 16 LI).

Způsob přípravy zmrazených kultur za účelem uchovávání, příprava inokula, fermentace a získání buněk kmene číslo 1678 je v podstatě shora uveden. Po 70,5 hodinách inkubace se spojí obsahy dvou 10 litrových fermentací (dosáhne se hustoty buněk o 8,7 g suché váhy na jeden litr). Celkové množství buněk je 258 g (vlhká váha).

C. Čištění rekombinantního kapsidového proteinu LI HPV typu 16.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky kmene číslo 1678 se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -7 0°C. Zmrazené buňky (mokrá váha 128 g) se rozmrazují při teplotě 20 až 23°C a resuspendují se v 140 ml modifikovaného pufru LI (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl). Do pufru se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A o konečné koncentraci 2 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 112 MPa ve třech cyklech v mikrofluidizeru MHO (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Rozbité buňky se centrifugují při 11 OOOxg po dobu 40 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje LI antigen.

Supernatant se naředí 1:5 přidáním pufru A (20 mM MOPS, pH7,0) a aplikuje se na anexovou záchytovou kolonu (5 cm v průměru x 6,4 cm). Náplní kolony je pryskyřice Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrem A. Následuje promytí pufrem A a antigen je vymyt gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Určení, která frakce obsahuje protein LI, se provede imuno-dot blotem.

Frakce obsahující protein LI, které se určily imuno-dot blotem, se testují za účelem zjištění celkového množství proteinu pomocí Bradfordovy metody následované SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a Western blotu.

Shromažďují se TMAE frakce vykazující srovnatelnou čistotu a srovnatelné množství proteinu LI. Antigen se koncentruje frakcionací se síranem sodným. Vzorky se upraví na hodnotu 35% saturovaného síranu sodného přidáním pevného činidla, zatímco jsou jemně míchány po dobu 10 minut. Vzorky se umístí na led a nechají se precipitovat po dobu 5 hodin, pak se centrifuguje při 12 OOOxg. Pelet se resuspenduje ve 20 ml pufru PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl).

Resuspendované pelety se děli na vylučovací chromatografické koloně o velikosti (průměr kolony 2,6 cm x 89 cm) na základě velikosti. Náplň kolony je pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) , pufrem je PBS. Frakce se testují metodou SDS-PAGE za použití barvení stříbrem a detekují se Western blotem. Spojí se nejčistčí frakce. Výsledný vzorek se koncentruje v míchané jamce o objemu 50 ml za použití 43 milimetrových membrán YM-100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosféře dusíku za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt se testuje metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Odhaduje se, že protein LI je z 70% homogenní. Zda jde určitě o protein LI se dokáže Western blotem za použití příslušného antisera. Konečný produkt se rozdělí na alikvoty a uchovává se při teplotě -70°C. Tímto způsobem se získalo celkem 7,4 mg proteinu.

D. Analytické postupy:

Imuno-dot blot.

Vzorky se ředí (je-li to nezbytné) 1:10 Milli-Q-vodou a 10 μΐ vzorku se kápne na membrány PolyScreen™ PVDF (NEN Research Products , Boston, MA). Po usušení se membrány promyjí vodou a nechají se uschnout. Roztok primárních protilátek se připraví ředěním příslušného antisera blotovacím roztokem (5 % netučné mléko rozpuštěné v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃) .

Inkubace probíhá po dobu nejméně 1 hodiny při teplotě 20 až 23°C. Blot se 3x promývá vždy po dobu 1 minuty v pufru PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárních protilátek se připraví ředěním příslušného antisera vázaného na alkalickou fosfatázu blotujícím pufrem. Inkubace probíhá za stejných podmínek po dobu nejméně jedné hodiny. Bloty se promývají způsobem dříve popsaným a detekují se použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Pro detekci se použilo následujících protilátek:

Protein HPV6a LI se detekuje pomocí MAB 837 (Chemicon International, lne., Temecula, CA). Protein HPV6a L2 se detekuje spojením myšších anti-HPV6a L2-trpE fúzních ser čísla 641 a 647 (připravil M.Rosolowski, v našem ústavu). Protein HPV16 L2 se detekuje spojeným myšším anti-HPV16 L2trpE fúzním šerem číslo 611 (připravil K.Jansen, v našem ústavu).

Bradfordova assay pro stanovení celkového množství proteinu.

Stanovení celkového množství proteinu probíhá za použití běžně dostupného kitu Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL) . Vzorky se ředí Milli-Q-vodou. Podle standardního protokolu je potřeba objem vzorku 1 ml, pro mikrometodu je to objem 0,1 ml. V obou případech se pro přípravu standardní křivky používá BSA (Pierce, Rockford, IL). Test probíhá podle instrukcí výrobce. Standardní křivka se vynáší za použití software CricketGraph® na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Western blot.

Všechny přístroje, gely a pufry se získaly od firmy Novex (San Diego, CA) a provozovaly se a připravovaly se podle instrukcí výrobce. Vzorky se ředí na stejnou koncentraci proteinu Milli-Q-vodou a smíchají se v poměru 1:1 s inkubačním pufrem, který obsahuje 200 mM DTT. Vzorky se inkubují po dobu 15 minut při teplotě 100°C a nanesou se na předem nalitý 12 % Tris-glycinový gel. Vzorky se elektroforezují při napětí 125 V po dobu 1 hod.45 min.. Gely se vizualizují za použití buď barvení stříbrem podle různých metod publikovaných Heukeshovenem a Dernickem (Electrophoresis, 6 (1985) 103-112) nebo Coomassie barvení použitím běžně dostupné soupravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA) . V případě způsobu Western blot se proteiny nanášejí na membrány PVDF při napětí 25 V po dobu 40 minut. Membrány se suší a inkubují s roztokem protilátek stejným způsobem jak se uvádí v případě imuno-dot blotu.

Příklad 35: Příprava imunogenních kompozic.

Čištěné partikule podobné virovým partikulím (VLP) se podle známého způsobu smíchají s farmaceuticky přijatelnými nosiči, stabilizátory nebo adjuvans, které se používají při přípravě vakcín. Za účelem přípravy vakcíny se imunogenní partikule podobné virovým partikulím (VLP) podle vynálezu slučují s fyziologicky přijatelnými roztoky, jako jsou pufr PBS, fyziologický roztok nebo destilovaná voda. Imunogenní partikule podobné virovým partikulím (VLP) se podávají v dávkách v rozmezí od 0,1 do 100 μς, přednost se dává dávce od 1 do 20 μρ, za účelem dosažení požadovaného imunogenního účinku. Množství partikulí podobných virovým partikulím (VLP) v přípravku může kolísat v závislosti na různých faktorech, které zahrnují celkový stav individua, váhu, pohlaví a věk. Přípravky s VLP se mohou podávat různými způsoby, které zahrnují orální, lokální, mukozální, intramuskulární a subkutání. Tyto přípravky s VLP mohou obsahovat jediný typ partikulí podobných virovým partikulím (VLP) (t.j. VLP z lidského papilomaviru typu 6a) nebo směs partikulí podobných virovým partikulím (VLP) (t.j. VLP z lidských papilomavirů typů 6a, 11, 16 a 18).

Mohou být přítomny antimikrobiální přípravky, například timerosal. Je-li nutno, mohou se použít imunogenní antigeny podle vynálezu v kombinaci se stabilizátory a adjuvans, které se používají při přípravě vakcín. Typickými stabilizátory jsou specifické látky, například polyanionty, jako jsou heparin, inositol hexasulfát, sulfonovaný beta-cyklodextrin, méně specifické excipienty, například aminokyseliny, sorbitol, manitol, xylitol, glycerol, sacharoza, dextroza, trehaloza nebo různé podmínky, které nastávají v roztoku, například neutrální pH, vysoká iontová síla (asi 0,5 až 2 M sole) , obsah dvouvalentních kationtů (Ca²⁺,Mg²⁺) . Příklady adjuvans jsou AL(0H)₃ a A1(POJ. Vakcíny podle vynálezu se uchovávají v lednicích nebo v lyofilyzované formě.

Příklad 36: Příprava protilátek proti partikulím podobným virovým partikulím (VLP).

Čištěné partikule podobné virovým partikulím (VLP) se používají pro vyvolání tvorby protilátek. Termín protilátky zde zahrnuje polyklonální i monoklonální protilátky a jejich fragmenty, jako jsou Fv, Fab a F(ab)2 fragmenty, které jsou schopny se vázat na antigen nebo hapten. Protilátky se používají různými způsoby, například k čištění rekombinantních partikulí podobných virovým partikulím (VLP), čištění přirozených proteinů LI a L2 a v různých soupravách. Soupravy by měly obsahovat nejméně jeden oddělený kontejner, ve kterém bude těsně uzavřen nosič. Nosič zahrnuje reagencie, jako anti-VLP protilátky nebo partikule podobné virovým partikulím (VLP) vhodné pro detekci lidských papilomavirů, fragmentů lidských papilomavirů nebo protilátek proti lidským papilomavirům. Další součástí nosiče, pro účel detekce, může být značený antigen nebo enzymové substráty a podobně. Protilátky, partikule podobné virovým partikulím (VLP) nebo soupravy se využívají pro různé účely, jako jsou soudní analýzy a epidemiologické studie.

ΊΟ

Příklad 37: Čištění rekombinantního kapsidového proteinu HPV typu 11 LI.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -70°C. Zmrazené buňky (mokrá váha 180 g) se rozmrazují při teplotě 20 až 23°C a resuspendují se v 900 ml lyžujícího pufru (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) . Do pufru se přidají inhibitory proteázy AEBSF a pepstatin A o konečné koncentraci 1 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 112 MPa ve čtyřech cyklech v mikrofluidizeru M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Za účelem rozbití buněčné suspenze se přidá dostatečné mmnožství detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL), jeho konečná koncentrace je 0,5%. Buněčná suspenze se mýchá 20 hodin. Lyzát ošetřený Tritonem X100 se centrifuguje při 12 OOOxg po dobu 40 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje LI protein.

Supernatant se diafiltruje proti pěti objemům 20 mM fosforečnanu sodného, pH7,2, 0,5 M NaCl za použití membránové kazety s tangencionálním průtokem 300K (Filtron, Northborough, MA) . Rádioimunotestem a western blotem se dokázalo, že materiál zadržený na membráně obsahuje protein LI .

Dialýzovaný roztok se aplikoval na afinitní kolonu z vysokým rozlišením (11 cm v průměru x 5,3 cm). Jako náplň se použila pryskyřice SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-laGarenne, France) ekvilibrovaná 20 mM fosforečnanem sodným, pH7,2, 0,5 M NaCl. Následuje promytí s ekvilibračním pufrem a další promytí 20 mM fosforečnanem sodným, pH7,2, 1 M NaCl.

Protein LI se vymyje 20 mM fosforečnanem sodným, pH7,2, 2,5 M NaCl. Během promývání a vymývání se sbírají jednotlivé frakce. Použitím Bradfordovy metody se frakce testují za účelem stanovení celkového množství proteinu. Frakce se pak analyzují metodou western blot a SDS-PAGE použitím detekce koloidní Coosmassie. Frakce se také analyzují radioimunotestem.

Spojí se frakce, které vykazují srovnatelnou čistotu a obsah proteinu LI.

Konečný produkt se testuje metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Odhaduje se, že protein LI je z 90 a více procent homogenní. Zda jde určitě o protein LI se dokáže western blotem. Konečný produkt se filtruj e přes membránu s póry o velikosti 0,22 pm a uchovává se při teplotě 4°C. Tímto způsobem se získalo celkem 100 mg proteinu.

Pomocí strukturní sondy (West Chester, PA) probíhá analýza elektronovou mikroskopií. Alikvot každého vzorku se umístil na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na dobu 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12-wolframové (PTA), pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 OOOx.

Bradfordova assay pro stanovení celkového množství proteinu. Stanovení celkového množství proteinu probíhá za použití běžně dostupného kitu Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL) . Vzorky se ředí Milli-Q-vodou. Podle standardního protokolu je potřeba objem vzorku 1 ml, pro mikrometodu je to objem 0,1 ml. V obou případech se pro přípravu standardní křivky používá BSA (Pierce, Rockford, IL). Test probíhá podle instrukcí výrobce. Standardní křivka se vynáší za použití software CricketGraph® na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Western blot.

Všechny přístroje, gely a pufry se získaly od firmy Novex (San Diego, CA) a provozovaly se a připravovaly se podle instrukcí výrobce. Vzorky se ředí na stejnou koncentraci proteinu Milli-Q-vodou a smíchají se v poměru 1:1 s inkubačním pufrem, který obsahuje 200 mM DTT. Vzorky se inkubují po dobu 15 minut při teplotě 100°C a nanesou se na předem nalitý 12 % Tris-glycinový gel. Vzorky se elektroforezuji při napětí 125 V po dobu 1 hod.45 min.. Gely se vizualizují za použití buď barvení stříbrem podle různých metod publikovaných Heukeshovenem a Dernickem (Electrophoresis, 6 (1985) 103-112) nebo Coomassie barvení použitím běžně dostupné soupravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA) . V případě způsobu Western blot se proteiny nanášejí na membrány PVDF při napětí 25 V po dobu 40 minut. Membrány se promývají Milli-Q-vodou a suší se na vzduchu. Jako primární protilátky slouží polyklonální králičí antiserum vzniklé proti fúznímu proteinu TrpE-HPVllLl (dárek od Dr.D.Brown). Roztok protilátek se připraví ředěním antisera blotovacím roztokem (5 % netučné mléko rozpuštěné v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubace probíhá po dobu nejméně 1 hodiny při teplotě 20 až 23°C. Blot se 3x promývá vždy po dobu 1 minuty v pufru PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárních protilátek se připraví ředěním příslušného kozího anti-králičího IgG vázaného na křenovou peroxidázu (HRP) konjugačního antisera (Pierce, Rockford, IL) blotujícím pufrem. Inkubace probíhá za stejných podmínek po dobu nejméně jedné hodiny. Bloty se promývají způsobem dříve popsaným a detekují se použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL) .

Příklad 38: Čištění rekombinantního kapsidového proteinu HPV typu 6a LI.

Všechny kroky se provádějí při teplotě 4°C pokud není uvedeno jinak.

Buňky se uchovávají ve zmrazené formě při teplotě -70^cC. Zmrazené buňky (mokrá váha 60 g) se rozmrazují ve vodní lázni při teplotě 45°C a resuspendují se v 300 ml lyžujícího pufru (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) . Do pufru se přidají inhibitory proteázy AEBSF a pepstatin A o konečné koncentraci 1 mM, respektive 1,7 μΜ. Buněčná suspenze se rozbije při tlaku přibližně 112 MPa v pěti cyklech v mikrofluidizeru M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA) . Za účelem rozbití buněčné suspenze se přidá dostatečné mmnožství detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL) , jeho konečná koncentrace je 0,5%. Buněčná suspenze se mýchá 18 hodin. Lyzát ošetřený Tritonem X100 se centrifuguje při 12 OOOxg po dobu 40 minut, za účelem odstranění buněčného odpadu. Odebírá se supernatant, který obsahuje LI protein.

Supernatant se diafiltruje proti pěti objemům 20 mM fosforečnanu sodného, pH7,2, 0,5 M NaCl za použití membránové kazety s tangencionálním průtokem 300K (Filtron, Northborough, MA) . Radioimunotestem a western blotem se dokázalo, že materiál zadržený na membráně obsahuje protein LI.

Dialyzovaný roztok se aplikoval na kolonu z vysokým rozlišením (5 cm v průměru x 10 cm) . Jako náplň se použila pryskyřice POROS® 50HS (Perseptive Biosystems,Cambridge,MA) ekvilibrovaná 20 mM fosforečnanem sodným, pH7,2, 0,5 M NaCl. Následuje promytí s ekvilibračním pufrem. Protein LI se vymyje NaCl s lineárním gradientem 0,5 až 1,5 mM. Ve 20 mM fosforečnanu sodným, pH7,2. Během promývání a vymývání se sbírají jednotlivé frakce. Použitím Bradfordovy metody se frakce testují za účelem stanovení celkového množství proteinu. Frakce se pak analyzují metodou western blot a SDSPAGE použitím detekce koloidní Coosmassie. Frakce se také analyzují radioimunotestem.

Spojí se frakce, které vykazují srovnatelnou čistotu a obsah proteinu LI. Spojené frakce se asepticky filtrují přes membránu s póry o velikosti 0,22 μπι. Produkt se koncentruje v míchaných jamkách o objemu 50 ml za použití membrán YM-100 (Amicon, lne., Beverly, MA) s průměrem 43 mm v atmosféře dusíku při tlaku 0,028 až 0,042 MPa. Produkt se uchovává při teplotě 4°C. Tímto způsobem se připravilo celkem 2,7 mh proteinu.

Vzorek konečného produktu se dále koncentruje pomocí TCA srážením a testuje se metodou SDS-PAGE za použití barvení koloidní Coomassie. Densitometrie barvených gelů koloidní Coomassie prokázala, že protein LI je z 90 a více procent homogenní. Zda jde určitě o protein LI se dokáže western blotem.

Pomocí strukturní sondy (West Chester, PA) probíhá analýza elektronovou mikroskopií. Alikvot každého vzorku se umístil na měděnou mřížku s 200 oky potaženou uhlíkem. Na mřížku se kápla na dobu 20 vteřin kapka 2% kyseliny fosforečnano-12-wolframové (PTA), pH7,0. Před použitím mikroskopu se mřížka nechala vyschnout na vzduchu. Miskroskopické pozorování se provedlo použitím JEOL 100CX transmisního elektronového mikroskopu (JEOL USA, lne.) při akceleračním napětí 100 KV. Vzniklý mikrograf má konečné zvětšení 100 OOOx.

Bradfordova assay pro stanovení celkového množství proteinu.

Stanovení celkového množství proteinu probíhá za použití běžně dostupného kitu Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL) . Vzorky se ředí Milli-Q-vodou. Podle standardního protokolu je potřeba objem vzorku 1 ml, pro mikrometodu je to objem 0,1 ml. V obou případech se pro přípravu standardní křivky používá BSA (Pierce, Rockford, IL). Test probíhá podle instrukcí výrobce. Standardní křivka se vynáší za použití software CricketGraph® na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Western blot.

Všechny přístroje, gely a pufry se získaly od firmy Novex (San Diego, CA) a provozovaly se a připravovaly se podle instrukcí výrobce. Vzorky se ředí na stejnou koncentraci proteinu Milli-Q-vodou a smíchají se v poměru 1:1 s inkubačním pufrem, který obsahuje 200 mM DTT. Vzorky se inkubují po dobu 15 minut při teplotě 100°C a nanesou se na předem nalitý 12 % Tris-glycinový gel. Vzorky se elektroforezují při napětí 125 V po dobu 1 hod.45 min.. Gely se vizualizují koloidním Coomassie barvením použitím běžně dostupné soupravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA) .

V případě způsobu Western blot se proteiny nanášejí na membrány PVDF při napětí 25 V po dobu 40 minut. Membrány se promývají Milli-Q-vodou a suší se na vzduchu. Jako primární protilátky slouží MAB 837 (Chemicon International, lne., Temecula, CA), které jsou kovalentně vázané enzym alkalickou fosfatázu (J.Cook, MRL). Roztok protilátek se připraví ředěním antisera blotovacím roztokem (5 % netučné mléko rozpuštěné v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃) . Inkubace probíhá po dobu nejméně 1 hodiny při teplotě 20 až 23°C. Blot se 3x promývá vždy po dobu 1 minuty v pufru PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH7,2, 150 mM NaCl). Bloty se detekují použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Γ.·

Seznam sekvencí (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristika sekvence:

	(A)	délka: 30 párů baží
- ·	(B)	typ: nukleová kyselina
..	(C)	počet řetězců: jednořetězová
	(D)	typologie: lineární

(ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

CTTAAAGCTT ATGTCACTT CTCTTGTATC 30 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:

TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC 30 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

TGGTCATCCC AAATCTTGAA A 21 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:

CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A 21 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:

GAGGCTACCA GCGAGCCGGG C 21 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:

GGCCAGTGGG CCAACAGGTT 21 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 34 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC 34 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:

(i) charakteristika sekvence:

	(A)	délka: 45 párů baží
-	(B)	typ: nukleová kyselina
	(C)	počet řetězců: jednořetězová
	(D)	typologie: lineární

(ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:

CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG 45 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 34 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC 34 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 45 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:

TCCCCCGGGC ACAAAACAAA ATGGCACATA GTAGGGCCCG ACGAC 45 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 38 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:

TCCCCCGGGC TAGGCCGCCA CATCTGAAAA AAATAAGG 38 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 38 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:

GAAGATCTTC AAAACAAAAT GGCAGTGTGG CTGTCTAC 38 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:

(i) charakteristika sekvence:

(A)	délka: 34 párů baží
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	počet řetězců: jednořetězová
(D)	typologie: lineární

(ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:

GAAGATCTTT ATTAAGTACG TCTCTTGCGT TTAG 34 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:

GGAATTCACA AAACAAAATG GTTGCACGGT CACGAAAAC (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 32 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:

GGAATTCTTA TTCTGCGTAG ACAGCCACAC TG 32 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 35 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:

GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGT TTAGC 35 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 17:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 47 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:

CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTCTCTTT GGCTGCCTAT GTAGGCC 47 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 18:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 35 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:

GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGT TTAGC 35 (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 19:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 45 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19:

TCCCCCGGGC ACAAAACAAA ATGCGACACA AACGTTCTGC AAAAC (2) Informace o sekvenci SEQ ID č. 20:

(i) charakteristika sekvence:

(A)	délka: 33 párů baží
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	počet řetězců: jednořetězová
(D)	typologie: lineární

(ii) typ molekuly: cDNK (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 20:

TCCCCCGGGC TAGGCAGCCA AAGAGACATC TGA

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Papilomavirový kapsidový protein izolovaný a čištěný, vybraný ze skupiny, která zahrnuje proteiny LI, L2, L1+L2 a jejich funkční deriváty, přičemž proteiny jsou nejméně ze 70% čisté.
2. 2. Čištěný protein podle nároku 1, přičemž papilomavirus je vybrán ze skupiny zahrnující lidský papilomavirus a králičí papilomavirus.
3. 3. Čištěný protein podle nároku 1, přičemž lidský papilomavirus je vybrán ze skupiny zahrnující HPV6a,

   HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HPV45 a HPV58.
4. 4. Čištěný protein podle nároku 1, který se připravuje v umělém systému obsahujícím rekombinantního hostitele.
5. 5. Kapsidy, vyznačující se tím, že obsahují protein podle nároku 1.
6. 6. Partikule podobné virovým partikulím (VLP), vyznačující se tím, že obsahují protein podle nároku 1.
7. 7. Způsob přípravy čištěného proteinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se (a) hostitel transformuje molekulou rekombinantí DNK kódující protein vybraný za skupiny, která zahrnuje papilomavirové proteiny LI, L2, L1+L2 a jejich funkční deriváty;

   (b) transformovaný hostitel kultivuje za podmínek, které dovolují expresi molekuly rekombinantní DNK, a tak se produkuje surový rekombinantní papilomavirový protein; a (c) surový rekombinantní papilomavirový protein čistí a vzniká čištěný protein.
8. 8. Rekombinantní papilomavirový protein připravený způsobem podle nároku 7.
9. 9. Kapsidy, vyznačující se tím, že obsahují protein podle nároku 7.
10. 10. Partikule podobné virovým partikulím (VLP), vyznačující se tím, že obsahují protein podle nároku 7.
11. 11. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje protein podlá nároku 1.
12. 12. Farmaceutické přípravky, vyznačuj ící se tím, že obsahují protein podle nároku 1.
13. 13. Způsob léčby nebo prevence papilomavirové infekce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání vakcíny hostiteli podle nároku 11.
14. 14. Souprava pro detekci papilomavirů nebo protilátek vzniklých proti papilomavirům, vyznačuj ící se tím, že obsahuje činidlo vybrané za skupiny zahrnující molekulu rekombinantní DNK kódující papilomavirový protein, čištěný papilomavirový protein, partikule podobné virovým partikulím (VLP) obsahující papilomavirový protein, protilátky vytvořené proti papilomavirovému proteinu a protilátky vytvořené proti partikulím podobným virovým partikulím (VLP).
15. 15. Způsob přípravy rekombinantního papilomavirového kapsidového proteinu obsaženém v kapsidu, vyznačující se tím, že se (a) do vektoru klonuje papilomavirový gen, který kóduje nejméně jeden papilomavirový kapsidový protein;

    (b) vektor vnáší do hostitelské buňky za podmínek, které dovolují produkci papilomavirového kapsidového proteinu;

    (c) rekombinantní hostitelská buňka kultivuje za podmínek, které dovolují produkci papilomavirového kapsidového proteinu; a (d) papilomavirový kapsidový protein čistí za podmínek, které dovolují vytvoření kapsidu.
16. 16. Kapsidy, vyznačující se tím, připravují způsobem podle nároku 15.

    ž e se
17. 17. Partikule podobné virovým partikulím (VLP), vyznačující se tím, že obsahují kapsidy podle nároku 16.
18. 18. Způsob vyvolání imunní odezvy u obratlovců, vyznačující se tím, že se zvířeti podávají kapsidy podle nároku 16.
19. 19. Způsob vyvolání imunní odezvy u zvířete, vyznačující se tím, že se zvířeti podává protein podle nároku 1.
20. 20. Farmaceutický přípravky, vyznačuj ící se tím, že obsahují partikule podobné virovým partikulím (VLP) podle nároku 6.
21. 21. Farmaceutické přípravky, vyznačuj ící se tím, že obsahují kapsidy podle nároku 5.
22. 22. Umělý systém podle nároku 4, vyznačuj ící se tím, ž e se vybírá ze skupiny zahrnující transformované hmyzí buňky, transformované kvasinkové buňky, transformované baktreriální buňky, transformované buňky hub, transformované rostlinné buňky a transformované buňky zvířat.
23. 23. Způsob přípravy čištěných partikulí podobných virovým partikulím (VLP) obsahujících nejméně jeden čištěný papilomavirový protein, vyznačuj ící se tím, ž e se (a) roztok obsahující nejméně jeden surový papilomavirový protein zpracovává anexovou chromatografií a vzniká částečně čištěný papilomavirový protein;

    (b) částečně čištěný papilomavirový protein sráží síranem amonným; a (c) protein se dále čistí vylučovací chromatografií.
24. 24. Papilomavirové partikule podobné virovým partikulím (VLP) obsahující rekombinantní papilomavirový protein, vyznačující se tím, že jsou nejméně ze 70% čisté.
25. 25. Způsob přípravy čištěných kapsidů obsahujících nejméně jeden čištěný papilomavirový protein, vyznačuj ící se tím, ž e se (a) roztok obsahující nejméně jeden surový papilomavirový protein zpracovává anexovou chromatografií a vzniká částečně čištěný papilomavirový protein;

    (b) částečně čištěný papilomavirový protein sráží síranem amonným; a (c) protein se dále čistí vylučovací chromatografií.
26. 26. Kapsidy papilomaviru a partikule podobné virovým partikulím (VLP) obsahující rekombinantní papilomavirový protein, vyznačující se tím, že kapsidy jsou nejméně ze 70% čisté.