DE69432223T2

DE69432223T2 - Onkoprotein protein kinase

Info

Publication number: DE69432223T2
Application number: DE69432223T
Authority: DE
Inventors: Masahiko Hibi; Michael Karin; Anning Lin
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: AU7338094A; DE69432223D1; JP2925740B2; WO1995003323A1; US5804399A; WO1995003324A1; ES2191032T3; JPH09500535A; JP3745558B2; US6193965B1; AU7366894A; US5605808A; PT728143E; EP0726908A4; DK0728143T3; US5994513A; CA2166981C; CA2167302A1; AU700137B2; US5837244A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Proteinkinasen, Onkogene und Onkoproteine und insbesondere eine Proteinkinase, welche die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne bindet, phosphoryliert und verstärkt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Eine Anzahl viraler und zellulärer Gene wurden als potentielle Krebsgene identifiziert, die zusammen als Onkogene bezeichnet werden. Die zellulären Homologen der viralen Onkogene, die Protoonkogene oder C-Onkogene, wirken bei der Steuerung des Zellwachstums und der Differenzierung oder vermitteln in intrazellulären Signalsystemen. Die Produkte der Onkogene werden gemäß ihrer zellulären Lage, beispielsweise sekretierte, Oberflächen-, cytoplasmatische und Kernonkoproteine, klassifiziert.
Protoonkogene, die Proteine exprimieren, die auf den Zellkern abzielen, machen einen kleinen Anteil der Onkogene aus. Diese Kernprotoonkogene wirken typischerweise direkt als Transaktivatoren und Regulatoren der RNA- und DNA-Synthese. Kernonkogenprodukte weisen die Fähigkeit auf, Veränderungen in der Genregulation herbeizuführen, was zu einem anormalen Zellwachstum und schließlich zu Neoplasie führt. Beispiele für Kernonkogene umfassen die myc-, ski-, myb-, fos- und jun-Gene.
Das c-Jun-Protein, welches durch das c-jun-Protoonkogen codiert wird, ist eine wichtige Komponente des dimeren, sequenzspezifischen, transkriptionellen Aktivators AP- 1. Wie andere transkriptionelle Aktivatoren enthält c-Jun zwei funktionale Domänen, welche eine DNA-bindende Domäne und eine Transaktivierungsdomäne einschließen. Die DNA-bindende Domäne ist an dem C-Terminus lokalisiert und ist eine BZip-Struktur, welche aus konservierten basischen (B) und Leucinzipper (ZIP)-Domänen besteht, die zur DNA-Bindung bzw. Dimerisierung benötigt werden. Der N-Terminus enthält die Transaktivierungsdomäne. Obwohl die Expression von c-Jun durch viele extrazelluläre Signale schnell induziert wird, wird dessen Aktivität ebenfalls posttranslational durch eine Proteinphosphorylierung reguliert. Die Phosphorylierung von Stellen, welche nahe der DNA-Bindungsdomäne von c-Jun gehäuft auftreten, inhibiert die DNA-Bindung (Boyle, et al., Cell, 64: 573, 1991; Lin, et al., Cell; 70: 777, 1992). Die Phosphorylierung von zwei anderen Stellen, Ser 63 und Ser 73, die innerhalb der Transaktivierungsdomäne lokalisiert sind, steigert die Fähigkeit von c-Jun, die Transkription zu aktivieren (Binetruy, et al., Nature 351: 122, 1991; Smeal, et al., Nature 345: 494, 1991). Die Phosphorylierungsgeschwindigkeiten dieser Stellen sind bei nicht stimulierten Zellen niedrig und werden als Reaktion auf Wachstumsfaktoren wie beispielsweise den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) oder v-Sis oder die Expression von durch Onkogene aktivierten Src-, Ras- und Raf-Proteinen schnell erhöht. Bei myeloiden und lymphoiden Zellen wird die Phosphorylierung dieser Stellen durch den Phorbolester, TPA, stimuliert, nicht aber in Fibroblasten und Epithelzellen. Diese Unterschiede können auf unterschiedlichen Arten der Ha-ras- Regulation in lymphoiden Zellen gegenüber Fibroblasten beruhen.
Bei der Aktivierung der Transkription durch spezifische Promotoren kooperieren viele Proteine miteinander. Durch diese Kooperation kann ein Gen transkribiert werden und ein Proteinprodukt erzeugt werden. Mitglieder der Familie der Fos-Protoonkogene zusammen mit Mitgliedern der Familie der Jun-Gene bilden stabile Komplexe, welche an einer AP-1-Stelle an die DNA binden. Die AP-1-Stelle ist in der Promotorregion einer großen Anzahl von Genen lokalisiert. Die Bindung des Fos/Jun-Komplexes aktiviert die Transkription eines Gens, das mit einer AP-1-Stelle assoziiert ist. Bei Zellen, welche ihre wachstumsregulatorischen Mechanismen verloren haben, wird angenommen, dass dieser Fos/Jun-Komplex auf der AP-1 Stelle "sitzen bleibt", was eine Überexpression eines bestimmten Gens verursacht. Da viele proliferative Störungen aus der Überexpression eines ansonsten normalen Gens wie beispielsweise eines Protoonkogens resultieren, wäre es wünschenswert, Zusammensetzungen zu identifizieren, welche die übermäßige Aktivierung dieser Gene behindern.
Seit vielen Jahren wurden verschiedene Arzneimittel im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, die Expression von Genen oder die Translation ihrer Boten zu Proteinprodukten zu verändern. Ein Problem bei der bestehenden Arzneimitteltherapie ist, dass diese dazu neigt, unterschiedslos zu wirken und gesunde Zellen wie auch neoplastische Zellen zu beeinflussen. Dieses ist ein Hauptproblem bei vielen Formen der Chemotherapie, bei welcher es hauptsächlich aufgrund der Wirkung der toxischen Arzneimittel auf gesunde Zellen ernste Nebenwirkungen gibt.
In Anbetracht des Vorstehenden besteht ein Bedarf, spezifische Targets in den anomalen Zellen, welche mit der Überexpression von Genen in Verbindung stehen, deren Expressionsprodukte an zellproliferativen Störungen beteiligt sind, zu identifizieren, um potentielle negative Wirkungen auf gesunde Zellen zu verringern. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Target zur Verfügung.
Pulverer et al. (1991) Nature 357, 670-674 offenbaren die Phosphorylierung von c- Jun, die durch MAP-Kinasen vermittelt wird.
Pulverer et al. (1993) Oncogene 8, 407-415 offenbaren die gemeinsame Reinigung von mitogenaktivierten Proteinkinasen mit U937-Leukämiezellen mit einer Phorbolester-induzierten c-Jun-Kinaseaktivität.
Die EP-A-0599077 offenbart einen zellulären Antitumorimpfstoff, welcher Tumorzellen umfasst, in welche das c-fos-Gen allein oder zusammen mit c-Jun eingefügt wurde.
Hattori et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9148-9152 offenbaren die Struktur und chromosomale Lokalisation des funktionalen intronfreien menschlichen JUN- Protoonkogens.
Bohmann et al. (1987) Science 238, 1386-1392 offenbaren ein menschliches Protoonkogen c-Jun, welches ein DNA-bindendes Protein mit den strukturellen und funktionalen Eigenschaften des Transkriptionsfaktors AP-1 codiert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Proteinkinase (JNK) bereit, welche die c- Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne phosphoryliert. JNK1 ist dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Molekulargewicht von 46 kD (bestimmt durch reduzierende SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)) aufweist und eine Serin- und Theonin- Kinaseaktivität aufweist. Insbesondere phosphoryliert JNK1 die Serinreste 63 und 73 von c-Jun.
Demgemäss stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, welches gekennzeichnet ist dadurch, dass es:
(a) ein Molekulargewicht von 46 kD, bestimmt durch reduzierende SDS- PAGE, aufweist;
(b) Serin- und Theonin-Kinaseaktivität aufweist; und
(c) die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne phosphoryliert;
wobei das Polypeptid nicht das ERK1-Polypeptid mit 44 kD oder das ERK2-Polypeptid mit 42 kD ist.
Da das Produkt des jun-Protoonkogens ein Transaktivatorprotein ist, welches an AP- 1-Stellen bindet, kann die Regulation der c-Jun-Aktivierung wichtig sein, um die normale Genexpression und die Wachstumskontrolle in einer Zelle zu beeinflussen. Die Entdeckung von JNK stellt ein Mittel zum Identifizieren von Zusammensetzungen bereit, welche die JNK-Aktivität beeinflussen, wodurch die c-Jun-Aktivierung und die anschließende Aktivierung von Genen, die mit AP-1-Stellen assoziiert sind, beeinflusst werden.
Die Identifizierung der JNK erlaubt nun den Nachweis des Spiegels der spezifischen Kinaseaktivität, die mit der Aktivierung von c-Jun und AP-1 verbunden ist. Zusätzlich stellt die Erfindung ein Reagenz bereit, welches die Kinaseaktivität der Kinase der Erfindung moduliert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Zellproliferationsstörung, die mit der Kinase verbunden ist, wobei das Reagenz ein Polynukleotid mit einer Sequenz ist, die antisense zu der Polynukleotidsequenz ist, welche die Kinase codiert, einen Antikörper, welcher an die Kinase bindet, ein synthetisches Peptid mit der Sequenz SEQ ID NR: 1 oder einen Antikörper, welcher an das synthetische Peptid mit SEQ ID NR: 1 bindet.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein synthetisches Peptid bereit, welches den JNK-Bindungsbereich auf c-Jun umfasst, welcher den Aminosäuren 33-79 (SEQ ID NR: 1) entspricht. Das Peptid ist als ein kompetitiver Inhibitor des natürlich vorkommenden c-Jun in Situationen nützlich, wo es wünschenswert ist, das Ausmaß der c-Jun-Aktivierung durch die JNK zu verringern.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls JNK2, eine neue Proteinkinase mit einer Aktivität, die der von JNK1 ähnelt, und welche ein Molekulargewicht von 55 kD aufweist. Demgemäss stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, welches gekennzeichnet ist dadurch, dass es:
(a) ein Molekulargewicht von 55 kD; bestimmt durch reduzierende SDS- PAGE, aufweist;
(b) eine Serin- und Threonin-Kinaseaktivität aufweist; und
(c) die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne phosphoryliert;
wobei das Polypeptid kein ERK-Polypeptid ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine SDS-PAGE von Kern- und cytosolischen Extrakten aus FR3T3 (-)- und Ha-ras-transformierten FR3T3 (+)-Zellen nach Inkubation mit ³²P-ATP und GSTcJun (wt), GSTcJun(Ala63/73) oder GST.
Fig. 2 zeigt eine SDS-PAGE von A) HeLaS3-Zellen, entweder unbehandelt oder mit UV-Licht bestrahlt, und B) Jurkat-Zellen, entweder unbehandelt oder mit TPA inkubiert. Die Zellextrakte wurden mit ³²P-ATP und GST-cJun (wt), GSTcJun(Ala63/73) oder GST inkubiert.
Fig. 3 zeigt eine Phosphopeptidkartierung von GST-cJun und c-Jun, die durch JNK phosphoryliert wurden. 3A zeigt Karten von GSTcJun und (B) zeigt Karten von c-Jun.
Fig. 4A zeigt eine SDS-PAGE von phosphorylierten Proteinen nach Elution von JNK aus GSTc-Jun nach Wäschen mit NaCl, Harnstoff, Guanidin-HCl (GuHCl) oder SDS.
Fig. 4B zeigt eine SDS-PAGE von phosphoryliertem c-Jun, nachdem GSTcJun(wt) kovalent mit GSH-Kügelchen verknüpft wurde und mit einem Ganzzellextrakt von TPA-stimulierten Jurkat-Zellen inkubiert wurde.
Fig. 5 zeigt einen Kinasetest im Gel. GSTcJun-GSH-Agarosekügelchen wurden mit Zellextrakten von A) TPA-stimulierten Jurkat-Zellen auf SDS-Gelen, die in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von GSTcJun (wt) polymerisiert wurden; B) Extrakten von nichtstimulierten oder UV-stimulierten HeLa-Zellen und nichtstimulierten oder TPA-stimulierten Jurkat-Zellen; und C) Extrakten aus Zellen von logarithmisch wachsenden K562- und Ha-ras-transformierten FR3T3-, TPA-stimulierten Jurkat- und U937-Zellen und UV-bestrahlten HeLa-, F9- und QT6-Zellen inkubiert.
Fig. 6A ist ein Proteingel von verschiedenen GST-c-Jun-Fusionsproteinen; Fig. 6B zeigt eine SDS-PAGE von Ganzzellextrakten von UV-bestrahlten Hela S3-Zellen nach einer Passage über GSH-Kügelchen, welche die GST-Fusionsproteine enthielten, wie sie in Fig. 6A gezeigt sind; Fig. 6C zeigt eine SDS-PAGE von phosphorylierten GSTcJun-Fusionsproteinen, die mit 1 M NaCl von den GSH-Agarosekügelchen eluiert wurden.
Fig. 7A zeigt Muster von GST, GSTcJun und GSTvJun wie sie in E. coli exprimiert werden; Fig. 7B zeigt die phosphorylierten Proteine von 7A aus Extrakten von TPA-aktivierten Jurkat-Zellen, die mit GSH-Kügelchen inkubiert wurden; Fig. 7C zeigt das cJun-Protein nach Phosphorylierung mit Protein, das an GSTcJun- und GSTvJun-Kügelchen gebunden war.
Fig. 8 zeigt die CAT-Aktivität in Zellen, die verschiedene Anteile der c-Jun-Aktivierungsdomäne (cJ = AA1-223; 33 = AA33-223; 43 = AA43-223; 56 = AA56-223; A63,73 = AA1-246(Ala 63/73)) und einen CAT-Reporter enthalten, in Abwesenheit oder Gegenwart von A) Ha-ras oder B) einer UV-Behandlung.
Fig. 9 zeigt SDS-PAGE-Analysen von ³²P- und ³&sup5;S-markierten F9-Zellen, die mit v-Jun und c-Jun in Abwesenheit oder Gegenwart von A) Ha-ras oder B) einer UV- Exposition transfiziert wurden.
Fig. 10 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von c- Jun. Die Pfeile repräsentieren die Aminosäurereste 33-79.
Fig. 11A zeigt einen Northernblot der gesamten cytoplasmatischen RNA aus Jurkat-Zellen. Die Zellen wurden mit 50 ng/ml TPA (T), 1 ug/ml A23187 (A) oder 100 ng/ml Cyclosporin A (CsA) für 40 Minuten, entweder allein oder in Kombination, wie angegeben inkubiert. Die Spiegel der c-jun-, jun-B-, jun-D, c-fos- und α-Tubulinexpression wurden durch Hybridisierung mit zufällig primenden cDNA-Sonden bestimmt.
Fig. 11B zeigt Jurkat-Zellen nach Inkubation mit löslichem anti-CD3 (OKT3), 2 ug/ml löslichem anti-CD28 (9.3) oder einer Kombination von 50 ng/ml TPA und 1 ug/ml A23817 (T/A) wie angegeben für 40 Minuten. Die gesamte cytoplasmatische RNA wurde isoliert, und 10 ug-Proben wurden unter Verwendung von c-jun-, jun-D- und c-fos-Sonden analysiert. Eine IL-2-Induktion durch dieselben Behandlungen wurde nach 6 Stunden Stimulation durch Blothybridisierung unter Verwendung von IL-2- und α-tubulinspezifischen Sonden gemessen.
Fig. 11C zeigt Jurkat-Zellen, die mit 10 ug von entweder -73Col-LUC- oder -60Col- LUC-Reporterplasmiden transfiziert wurden. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen aliquotiert und für 9 Stunden mit 50 ng/ml TPA, 1 ug/ml A23187 oder 100 ng/ml CsA, entweder allein oder in Kombination, wie angegeben inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, und die Luciferaseaktivität wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte von drei Experimenten, die dreifach durchgeführt wurden, gezeigt.
Fig. 12A zeigt Jurkat-Zellen (10&sup6; Zellen pro Bahn), die mit 0,5 ug eines SRα-cJun- Expressionsvektors transfiziert wurden und 24 Stunden später für 3 Stunden mit ³²P- Orthophosphat (1 mCi/ml) markiert wurden. Nach 15 Minuten Behandlung mit 50 ng/ml TPA (T), 1 ug/ml A23187 (A) und 100 ng/ml CsA, entweder allein oder in Kombination, wie angegeben, wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert, und c-Jun wurde durch Immunpräzipitation isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. Die c-Jun- Banden sind angegeben.
Fig. 12B zeigt 2 · 10&sup7; Jurkat-Zellen, die für 3 Stunden mit entweder ³&sup5;S-Methionin (900 uCi/ml) oder ³²P-Orthophosphat (1 mCi/ml) markiert wurden. Nach 15 Minuten Inkubation mit 50 ng/ml TPA + 1 ug/ml A23178 (T/A) in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 ng/ml CsA oder ohne Zugabe, wie angegeben, wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert und c-Jun durch Immunpräzipitation isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. Die c-Jun-Bande ist angegeben.
Fig. 12C zeigt alle c-Jun-spezifischen Proteinbanden, die in Fig. 12A gezeigt sind, welche aus gleichen Zahlen von Zellen isoliert wurden, aus dem Gel ausgeschnitten wurden und einer tryptischen Phosphopeptidkartierung unterzogen wurden. Gezeigt ist ein typisches Ergebnis (dieses Experiment wurde wenigstens dreimal wiederholt). N: nichtstimulierte Zellen; T: Zellen, die mit 50 ng/ml TPA behandelt wurden; T/A: Zellen, die mit 50 ng/ml TPA und 1 ug/ml A23187 behandelt wurden; T/A + CsA: Zellen, die mit T/A und 100 ng/ml CsA behandelt wurden. a, b, c, x und y entsprechen den verschiedenen tryptischen Phosphopeptiden von c-Jun, die früher von Boyle et al., (Cell, 64: 573-584, 1991) und Smeal, et al., (Nature, 354: 494-496, 1991) beschrieben wurden. T1 und T2 entsprechen den unbedeutenderen Phosphorylierungsstellen; Thr91, 93 und 95 (Hibi, et al., Genes & Dev 7: 000, 1993).
Fig. 13A zeigt Ganzzellextrakte (WCE) von Jurkat-Zellen, die mit TPA (T, 50 ng/ml)A23187 (A, 1 ug/ml) oder CsA (100 ng/ml) für 15 Minuten allein oder in Kombination inkubiert wurden und durch SDS-PAGE (100 ug Protein/Bahn) auf Gelen aufgetrennt wurden, die in Abwesenheit oder Gegenwart von GST-cJun (1-223) gegossen wurden. Die Gele wurden einem Renaturierungsprotokoll unterzogen und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert. Die Proteinbanden, welche den 55kD- und 46kD-Formen von JNK entsprechen, sind angegeben.
Fig. 13B zeigt einen WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden, welche mit 5 ul GSH-Agarosekügelchen, die mit 10 ug GST-cJun (1- 223) beschichtet waren, für 12 Stunden bei 4ºC inkubiert wurden. Nach gründlichem Waschen wurden die Kügelchen in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, für 20 Minuten bei 30ºC inkubiert, wonach die Proteine durch Inkubation in SDS-Probenpuffer dissoziiert wurden und durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden. Die 49kD-Bande entspricht GST-cJun (1-223).
Fig. 13C zeigt einen WCE (200 ug) von Jurkat-Zellen, die wie in Fig. 13A beschrieben behandelt wurden und mit GST-cJun (1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert wurden. Die gebundene Fraktion wurde in SDS-Probenpuffer eluiert und durch- SDS-PAGE auf einem Gel, das GST-cJun (1-223) enthielt, aufgetrennt. Das Gel wurde renaturiert und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert, um die JNK-Polypeptide zu markieren.
Fig. 14 zeigt einen Phosphorylierungstest von Kulturen von FR3T3, CV-1, PC12 und Mäusethymocyten, welche für 15 Minuten in Gegenwart von TPA (50 ng/ml, T), A23817 (1 ug/ml, A) und/oder CsA (100 ng/ml) wie angegeben inkubiert wurden. Ein WCE, der aus 2-4 · 10&sup5; Zellen für die etablierten Zelllinien und 1,5 · 10&sup6; Zellen für die primären Thymocyten hergestellt wurde, wurde mit GSTcJun (1-223)-GSH- Agarosekügelchen inkubiert. Nach dem Waschen wurde die JNK-Aktivität durch einen Festphasen-Phosphorylierungstest bestimmt.
Fig. 15 zeigt einen WCE (5 ug) von Jurkat- (Feld A) oder Mäusethymocyten (Feld C), die mit 1 ug kinasedefizienter ERK1 in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, für 20 Minuten inkubiert wurden. Die phosphorylierten Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Bande, welche der Mutante ERK1 entsprach, ist angegeben. Ein WCE (20 ug) von Jurkat- (Feld A) oder Mäusethymocyten (Feld C), die wie oben beschrieben behandelt wurden, wurde mit anti-ERK-Antikörpern immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP und 2 ug MBP enthielt, für 15 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die phosphorylierten Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Band, welche dem phosphorylierten MBP entsprach, ist in den Feldern B und D angegeben.
Fig. 16A zeigt Jurkat-Zellen (1 · 10&sup7;), die für 15 Minuten mit entweder normalem Mäuseserum, 1 ug/ml anti-CD3 und/oder 2 ug/ml anti-CD28 in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 ng/ml CsA wie angegeben inkubiert wurden. WCE wurden hergestellt, und 100 ug-Proben wurden im Hinblick auf eine JNK-Aktivierung unter Verwendung eines Kinasetests im Gel analysiert.
Fig. 16B zeigt einen WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie für Fig. 16A beschrieben mit GSTcJun(1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert wurden und im Hinblick auf eine JNK-Aktivität unter Verwendung des Festphasen-Kinasetests getestet wurden. Dieselben WCE (20 ug) wurden mit anti-ERK2-Antikörpern immunpräzipitiert und im Hinblick auf MBP-Kinaseaktivität getestet.
Fig. 16C zeigt einen WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie in Fig. 16A beschrieben mit verschiedenen Stimuli allein oder deren Kombinationen behandelt wurden, wurden mit GSTcJun(1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert und im Hinblick auf JNK-Aktivität unter Verwendung des Festphasen-Kinasetests getestet. Dieselben Proben (20 ug) wurden ebenfalls im Hinblick auf eine auf MBP-Kinaseaktivität wie in Fig. 16B beschrieben getestet.
Fig. 17A zeigt Jurkat-Zellen (2 · 10&sup6; Zellen pro Punkt), die mit 0,4 mCi ³²P- Orthophosphat für 3 Stunden markiert wurden und mit nichtspezifischem Antikörper (1 ug/ml Mäuse-IgG; Kontrolle), 1 ug/ml anti-CD3, 2 ug/ml anti-CD28, 10 ng/ml TPA oder 500 ng/ml A23187 (A) wie angegeben inkubiert wurden. Nach 2 Minuten wurden die Zellen geerntet, lysiert und Ha-Ras wurde durch Immunpräzipitation isoliert. Das Guaninnukleotid, das an Ha-Ras gebunden war, wurde extrahiert, durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt und quantifiziert. Die gezeigten Werte stellen die Durchschnitte von zwei getrennten Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden, dar.
Fig. 17B zeigt Jurkat-Zellen, die mit ³²P-Orthophosphat markiert wurden und entweder mit TPA oder anti-CD3 stimuliert wurden. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, und der GTP-Gehalt von Ha-Ras wurde bestimmt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Proteinkinase (JNK) bereit, welche an einen wohldefinierten Bereich des c-Jun-Protoonkoproteins bindet und zwei Stellen innerhalb seiner Aktivierungsdomäne phosphoryliert. Die Phosphorylierung dieser Stellen erhöht die Fähigkeit von c-Jun, die Transkription zu stimulieren und eine onkogene Transformation zu vermitteln.
Die Aktivität von c-Jun wird durch Phosphorylierung reguliert. Verschiedene Stimuli, einschließlich transformierender Onkogene und UV-Licht, induzieren die Phosphorylierung der Serine 63 und 73 in der N-terminalen Aktivierungsdomäne von c-Jun, wodurch sie dessen Transaktivierungsfunktion verstärken. Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Molekulargewicht von 46 kD, bestimmt durch reduzierende SDS-PAGE, aufweist, Serin- und Threoninkinaseaktivität aufweist und in der Lage ist, die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne zu phosphorylieren. Dieses Protein wird als JNK1 bezeichnet. Zusätzlich wird ein zweites JNK-Protein (55kD), das als JNK2 bezeichnet wird, beschrieben.
Der Begriff "isoliert" bedeutet jedes JNK-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder jedes Gen, das ein JNK-Polypeptid codiert, das im wesentlichen von anderen Polypeptiden bzw. Genen oder von anderen Verunreinigungen, mit welchen das JNK- Polypeptid oder Gen normalerweise in der Natur gefunden werden könnte, frei ist.
Die Erfindung umfasst ein funktionales Polypeptid, JNK, und funktionale Fragmente von diesem. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "funktionales Polypeptid" auf ein Polypeptid, welches eine biologische Funktion oder Aktivität besitzt, welche durch einen definierten Funktionstest identifiziert wird und welche mit einer bestimmten biologischen, morphologischen oder phänotypischen Veränderung in der Zelle verbunden ist. Die biologische Funktion kann beispielsweise bei einem Polypeptidfragment, das so klein ist wie ein Epitop, an welchen ein Antikörpermolekül binden kann, bis zu einem großen Polypeptid, welches in der Lage ist, an der charakteristischen Induktion oder Programmierung von phänotypischen Änderungen innerhalb der Zelle teilzunehmen, variieren. Ein enzymatisch funktionales Polypeptid oder Fragment der JNK besitzt eine Kinaseaktivität der c-Jun-N-terminalen Aktivierungsdomäne. Ein "funktionales Polynukleotid" bezeichnet ein Polynukleotid, welches ein funktionales Polypeptid, wie es hierin beschrieben ist, codiert.
Kleinere Modifikationen der primären JNK-Aminosäuresequenz können zu Proteinen führen, welche im wesentlichen eine äquivalente Aktivität im Vergleich zu dem JNK- Polypeptid, das hierin beschrieben ist, aufweisen. Solche Modifikationen können gewollt sein, wie beispielsweise durch gezielte Mutagenese, oder können spontan sein. All die Polypeptide, welche durch diese Modifikationen erzeugt werden, sind hierin umfasst solange wie die Kinaseaktivität der JNK vorliegt. Weiterhin kann eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren ebenfalls zu einer Modifikation der Struktur des resultierenden Moleküls führen, ohne seine Kinaseaktivität signifikant zu verändern. Dieses kann zu der Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, das eine breitere Anwendbarkeit aufweisen würde. Beispielsweise ist es möglich, amino- oder carboxyterminale Aminosäuren zu entfernen, welche für die JNK- Kinaseaktivität nicht benötigt werden.
Das JNK-Polypeptid der Erfindung umfasst ebenfalls konservative Veränderungen der Polypeptidsequenz. Der Begriff "konservative Veränderung", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Ersatz eines Aminosäurerests durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umfassen die Substitution eines hydrophoben Restes wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Restes durch einen anderen, wie beispielsweise die Substitution von Arginin statt Lysin, Glutamin- statt Asparaginsäure oder Glutamin statt Asparagin und dergleichen. Der Begriff "konservative Veränderung" umfasst ebenfalls die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Stammaminosäure unter der Voraussetzung, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid hervorgerufen wurden, ebenfalls mit dem unsubstituierten Polypeptid immunreaktiv sind.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein synthetisches Peptid bereit, welches an die c-Jun-N- terminale Kinase, JNK, bindet. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1 und konservative Variationen umfassen das synthetische Peptid der Erfindung. Diese Sequenz repräsentiert die Aminosäuren 33-79 des c-Jun-Polypeptids (Angel, et al., Nature, 332(6160): 166, 1988). Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "synthetisches Peptid" ein Peptid, das nicht ein vollständiges natürlich vorkommendes Proteinmolekül umfasst. Das Peptid ist "synthetisch" in der Hinsicht, dass es durch menschliches Eingreifen unter Verwendung solcher Techniken wie chemischer Synthese, rekombinanter Gentechniken oder Fragmentierung von vollständigen Antigenen oder dergleichen erzeugt werden kann.
Die Peptide der Erfindung können durch solche üblicherweise verwendeten Methoden wie den Schutz von alpha-Aminogruppen mit t-BOC oder FMOC synthetisiert werden. Beide Methoden beinhalten schrittweise Synthesen, wodurch eine einzelne Aminosäure in jedem Schritt, beginnend bei dem C-Terminus des Peptids, hinzugefügt wird (siehe Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1981, Unit 9). Peptide der Erfindung können ebenfalls durch die wohlbekannten Festphasen- Peptidsynthesemethoden synthetisiert werden, die von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1962, und Stewart und Young, Solid Phase Peptides Synthesis, (Freeman, San Francisco, 1969, Seiten 27-62) beschrieben werden, welche ein Copoly(styroldivinylbenzol) verwenden, das 0,1-1,0 mmol Amine/g Polymer enthält. Nach Abschluss der chemischen Synthese können die Peptide entschützt werden und von dem Polymer durch Behandlung mit flüssiger HF-10% Anisol für ca. 1/4-1 Stunde bei 0ºC abgespalten werden. Nach Verdampfen der Reagenzien werden die Peptide mit 1%iger Essigsäurelösung aus dem Polymer extrahiert, welche dann lyophilisiert wird, um das Rohmaterial zu ergeben. Dieses kann normalerweise durch solche Techniken wie Gelfiltration auf Sephadex G-15 unter Verwendung von 5% Essigsäure als einem Lösungsmittel gereinigt werden. Die Lyophilisierung geeigneter Fraktionen der Säule wird das homogene Peptid oder Peptidderivate ergeben, welche dann durch solche Standardtechniken wie Aminosäureanalyse, Dünnschichtchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie, Ultraviolettabsorptionsspektroskopie, molare Drehung, Löslichkeit charakterisiert werden können und durch den Festphasen- Edman-Abbau quantifiziert werden können.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, welche das JNK-Polypeptid der Erfindung und das synthetische Peptid der SEQ ID NR: 1 codieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polynukleotid" auf ein Polymer von Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden in Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren Konstrukts. Die DNA, welche das Polypeptid der Erfindung codiert, kann aus cDNA-Fragmenten oder aus Oligonukleotiden zusammengebaut werden, welche ein synthetisches Gen liefern, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden. Die Polynukleotidsequenzen der Erfindung umfassen DNA-, RNA- und cDNA-Sequenzen.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung können durch mehrere Methoden erhalten werden. Beispielsweise kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungsvorgängen isoliert werden, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: 1) Hybridisierung von Sonden mit genomischen oder cDNA-Bibliotheken, um gemeinsame Nukleotidsequenzen nachzuweisen; 2) Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken, um gemeinsame Strukturmerkmale nachzuweisen, und 3) Synthese durch die Polymerasekettenreaktion (PCR).
Die Hybridisierungsvorgänge sind nützlich zum Screenen von rekombinanten Klonen unter Verwendung markierter gemischter synthetischer Oligonukleotidsonden, wobei jede Sonde potentiell die vollständige komplementäre Sequenz einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe ist, welche eine heterogene Mischung von denaturierten doppelsträngigen DNAs umfasst. Für ein solches Screenen wird die Hybridisierung vorzugsweise entweder mit einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Die Hybridisierung ist besonders nützlich beim Nachweis von cDNA-Klonen, die aus Quellen stammen, wo eine extrem geringe Menge der mRNA-Sequenzen in Bezug auf das interessierende Polypeptid vorliegt. Anders ausgedrückt ist es durch ein Verwenden stringenter Hybridisierungsbedingungen, die darauf ausgerichtet sind, eine nichtspezifische Bindung zu vermeiden, beispielsweise möglich, die autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Klons durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit der einzigen Sonde in der Mischung, welche dessen vollkommenes Gegenstück ist, zu ermöglichen (Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9: 879, 1981).
Die Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen, welche JNK codieren, kann ebenfalls erreicht werden durch: 1) Isolierung von doppelsträngigen DNA-Sequenzen aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die notwendigen Codons für das interessierende Polypeptid zu liefern; und 3) in vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryotischen Donorzelle isoliert wurde. Im letzteren Fall wird möglicherweise ein doppelsträgiges DNA-Gegenstück der mRNA gebildet, welches im allgemeinen als cDNA bezeichnet wird. Von diesen drei Methoden zur Entwicklung spezifischer DNA- Sequenzen zur Verwendung in rekombinanten Verfahren ist die Isolierung von genomischen DNA-Isolaten das am wenigsten übliche. Dieses ist aufgrund des Vorliegens von Introns besonders zutreffend, wenn es wünschenswert ist, die mikrobielle Expression von Säugetierpolypeptiden zu erhalten.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist oft das Verfahren der Wahl, wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist. Wenn die vollständige Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids nicht bekannt ist, ist die direkte Synthese der DNA-Sequenzen nicht möglich, und das Verfahren der Wahl ist die Synthese von cDNA-Sequenzen, Zu den Standardverfahren zum Isolieren von interessierenden cDNA-Sequenzen gehört die Bildung von Plasmide oder Phagen enthaltenden cDNA-Bibliotheken, welche durch die reverse Transkription von mRNA abgeleitet werden, die in Donorzellen, die ein hohes Niveau der genetischen Expression aufweisen, reichlich vorliegt. In Kombination mit der Technologie der Polymerasekettenreaktion verwendet, können sogar seltene Expressionsprodukte geklont werden. In den Fällen, wo wesentliche Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Herstellung markierter einzel- oder doppelsträngiger DNA- oder RNA-Sondensequenzen, welche eine Sequenz kopieren, die möglicherweise in der Ziel-cDNA vorliegt, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, welche mit klonierten Kopien der cDNA durchgeführt werden, die zu einer einzelsträngigen Form denaturiert wurden (Jay et al., Nucl. Acid Res. 11: 2325, 1983).
Eine cDNA-Expressionsbibliothek wie beispielsweise Lambda gt11 kann auf ein JNK- Polypeptid mit wenigstens einem Epitop indirekt gescreent werden, indem Antikörper verwendet werden, die für JNK spezifisch sind. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal abgeleitet sein und verwendet werden, um das Expressionsprodukt nachzuweisen, das ein Hinweis auf das Vorliegen der JNK-cDNA ist.
Eine Polynukleotidsequenz kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, jedoch muss die Degeneriertheit des Codes berücksichtigt werden. Polynukleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, welche als Folge des genetischen Codes degeneriert sind. Die Polynukleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, die als Folge des genetischen Codes degeneriert sind. Es gibt 20 natürliche Aminosäuren, von denen die meisten durch mehr als ein Codon spezifiziert werden. Daher sind, solange die Aminosäuresequenz der JNK zu einem funktionalen Polypeptid führt (wenigstens im Fall des sense-Polynukleotidstrangs) alle degenerierten Nukleotidsequenzen von der Erfindung umfasst.
Die Polynukleotidsequenz für JNK umfasst ebenfalls Sequenzen, die zu dem Polynukleotid, das JNK codiert, komplementär sind (antisense-Sequenzen). Antisense- Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu wenigstens einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (Weintraub, Scientific American, 262: 40, 1990). Die Erfindung umfasst alle antisense-Polynukleotide, die in der Lage sind, die Produktion des JNK-Polypeptids zu inhibieren. In der Zelle hybridisieren die antisense-Nukleinsäuren mit der entsprechenden mRNA, wobei sie ein doppelsträngiges Molekül bilden. Die antisense-Nukleinsäuren stören die Translation der mRNA, da die Zelle keine mRNA translatieren wird, die doppelsträngig ist. Antisense-Oligomere mit ca. 15 Nukleotiden sind bevorzugt, da diese leicht synthetisiert werden und es weniger wahrscheinlich ist als bei großen Molekülen, dass diese Probleme verursachen, wenn sie in die JNK-produzierende Zielzelle eingeführt werden. Die Verwendung von Antisense-Methoden, um die Translation von Genen zu inhibieren, ist im Stand der Technik wohlbekannt (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172: 289, 1988).
Zusätzlich sind Ribozymnukleotidsequenzen für die JNK von der Erfindung umfasst. Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Fähigkeit besitzen, andere einzelsträngige RNA in einer Weise, die zu DNA-Restriktionsendonukleasen analog ist, spezifisch zu spalten. Durch die Modifikation der Nukleotidsequenzen, welche diese RNAs codieren, ist es möglich, Moleküle herzustellen, die spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und dieses spalten (Cech, J. Amer. Med.-Assn., 260: 3030, 1988). Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass, da diese sequenzspezifisch sind, nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden.
Es gibt zwei grundlegende Typen von Ribozymen, nämlich den Tetrahymena-Typ (Hasselhoff, Nature, 334: 585, 1988) und den "Hammerhead"-Typ. Ribozyme vom Tetrahymena-Typ erkennen Sequenzen, welche eine Länge von 4 Basen aufweisen, während Ribozyme vom "Hammerhead"-Typ Basensequenzen mit 11-18 Basen in der Länge erkennen. Je länger die Erkennungssequenz, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese Sequenz ausschließlich in der Ziel-mRNA-Spezies vorkommt. Folglich sind Ribozyme vom Hammerhead-Typ gegenüber Ribozymen vom Tetrahymena- Typ bevorzugt, um eine spezifische mRNA-Spezies zu inaktivieren, und Erkennungssequenzen mit 18 Basen sind bevorzugt gegenüber kürzeren Erkennungssequenzen.
Die JNK-Polypeptide der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, welche immunreaktiv sind oder an Epitope der JNK-Polypeptide binden. Antikörper der Erfindung umfassen ebenfalls Antikörper, welche an das synthetische Peptid in SEQ ID NR: 1 binden. Ein Antikörper, welcher im wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Epitopspezifitäten besteht, wie auch verschiedene monoklonale Antikörperpreparationen werden bereitgestellt. Monoklonale Antikörper werden aus Antigen-enthaltenden Fragmenten des Proteins durch Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik wohlbekannt sind (Kohler, et al., Nature, 256: 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausg., 1989).
Der Begriff "Antikörper", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, umfasst intakte Moleküle wie auch Fragmente von diesen wie beispielsweise Fab, F(ab')&sub2; und Fv, welche in der Lage sind, die Epitopdeterminante zu binden. Diese Antikörperfragmente behalten eine gewisse Fähigkeit bei, selektiv an ihr Antigen oder ihren Rezeptor zu binden, und sind wie folgt definiert:
(1) Fab, das Fragment, welches ein monovalentes Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpermoleküls enthält, kann durch Verdau des gesamten Antikörpers mit dem Enzym Papain, um eine intakte leichte Kette und einen Teil einer schweren Kette zu ergeben, erzeugt werden;
(2) Fab', das Fragment eines Antikörpermoleküls kann erhalten werden, indem der gesamte Antikörper mit Pepsin behandelt wird, worauf eine Reduktion folgt, um eine intakte leichte Kette und einen Teil der schweren Kette zu ergeben; zwei Fab'-Fragmente werden pro Antikörpermolekül erhalten;
(3) (Fab')&sub2;, das Fragment des Antikörpers, das erhalten werden kann, indem der gesamte Antikörper mit dem Enzym Pepsin behandelt wird, ohne anschließende Reduktion; F(ab')&sub2; ist ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfidbindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als ein gentechnisch hergestelltes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, exprimiert als zwei Ketten; und
(5) einkettiger Antikörper ("SCA"), definiert als ein gentechnisch hergestelltes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette, den variablen Bereich der schweren Kette, verknüpft durch einen geeigneten Polypeptidlinker enthält, als ein genetisch verbundenes einkettiges Molekül.
Verfahren zur Erzeugung dieser Fragmente sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)).
Wie in dieser Erfindung verwendet, bedeutet der Begriff "Epitop" jegliche antigene Determinante auf einem Antigen, an welche der Paratop eines Antikörpers bindet. Epitope Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie beispielsweise Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und weisen gewöhnlich spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristika wie auch spezifische Ladungscharakteristika auf.
Antikörper, welche an das JNK-Polypeptid der Erfindung binden, können hergestellt werden, indem ein intaktes Polypeptid oder Fragmente, die kleine Peptide von Interesse enthalten, als das immunisierende Antigen verwendet werden. Das Polypeptid oder ein Peptid wie beispielsweise die Sequenz ID NR: 1, das verwendet wurde, um ein Tier zu immunisieren, kann von einer translatierten cDNA abgeleitet sein oder aus einer chemischen Synthese stammen, wobei dieses nach Wunsch mit einem Trägerprotein konjugiert werden kann. Solche üblicherweise verwendeten Träger, die chemisch an das Peptid gekoppelt werden, umfassen Keyhole limpet Hämocyanin (KLH), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanustoxoid. Das gekoppelte Peptid wird dann verwendet, um das Tier (z. B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) zu immunisieren.
Wenn dieses gewünscht ist, können polyklonale oder monoklonale Antikörper weiter gereinigt werden, beispielsweise indem diese an eine Matrix gebunden werden und aus dieser eluiert werden, an welche das Polypeptid oder ein Peptid, gegen welches die Antikörper hervorgerufen wurden, gebunden ist. Die Fachleute auf dem Gebiet kennen verschiedene Techniken, die in der Immunologie zur Reinigung und/oder Konzentration polyklonaler Antikörper wie auch monoklonaler Antikörper üblich sind (siehe z. B. Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Es ist ebenfalls möglich, eine Antiidiotyptechnologie zu verwenden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die einen Epitop nachahmen. Beispielsweise wird ein antiidiotypischer monoklonaler Antikörper, der gegen einen ersten monoklonalen Antikörper erzeugt wurde, eine Bindungsdomäne in dem hypervariablen Bereich aufweisen, welche das "Abbild" des Epitops ist, der durch den ersten monoklonalen Antikörper gebunden wird. So kann in der vorliegenden Erfindung ein antiidiotypischer Antikörper, der aus einem Antikörper erzeugt wurde, welcher an das synthetische Peptid der Erfindung bindet, an die Stelle auf der JNK binden, welche an c-Jun bindet, wodurch verhindert wird, dass die JNK an c-Jun bindet und dieses phosphoryliert.
Polynukleotidsequenzen, welche das Polypeptid oder das synthetische Peptid (SEQ ID NR: 1) der Erfindung codieren, können entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten exprimiert werden. Die Wirte können mikrobielle, Hefe-, Insekten- und Säugetierorganismen umfassen. Verfahren zum Exprimieren von DNA-Sequenzen mit eukaryotischen oder viralen Sequenzen in Prokaryoten sind im Stand der Technik wohlbekannt. Biologisch funktionale virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zur Expression und Replikation in einem Wirt geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um die DNA-Sequenzen der Erfindung einzubauen.
DNA-Sequenzen, welche die Polypeptide codieren, können in vitro durch DNA- Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. "Wirtszellen" sind Zellen, in welchen ein Vektor vermehrt werden kann und seine DNA exprimiert werden kann. Der Begriff umfasst ebenfalls jegliche Nachkommen der betreffenden Wirtszelle. Dieses wird so verstanden, dass alle Nachkommen zu der Ursprungszelle nicht identisch sein können, da während der Replikation Mutationen auftreten können. Solche Nachkommen sind jedoch umfasst, wenn der Begriff "Wirtszelle" verwendet wird. Verfahren für einen stabilen Transfer, d. h., wenn die fremde DNA kontinuierlich in dem Wirt beibehalten wird, sind im Stand der Technik bekannt.
In der vorliegenden Erfindung können die JNK-Polynukleotidsequenzen in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Der Begriff "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, einen Virus oder ein anderes Vehikel, das im Stand der Technik bekannt ist, welches durch die Insertion oder den Einbau der Gensequenzen manipuliert wurde. Derartige Expressionsvektoren enthalten eine Promotorsequenz, welche die effiziente Transkription der insertierten genetischen Sequenz des Wirtes erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor wie auch spezifische Gene, welche eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Vektoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen den auf T7 basierenden Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987), den pMSXND-Expressionsvektor zur Expression in Säugetierzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem, 263: 3521, 1988) und die von Baculovirus abgeleiteten Vektoren zur Expression in Insektenzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Das DNA- Segment kann in dem Vektor funktionsfähig verknüpft mit regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor (z. B. T7-, Metallothionein I- oder Polyhedrinpromotoren), vorliegen.
Der Vektor kann einen phänotypisch selektierbaren Marker umfassen, um Wirtszellen zu identifiziren, welche den Expressionsvektor enthalten. Beispiele von Markern, die typischerweise in prokaryotischen Expressionsvektoren verwendet werden, umfassen Antibiotikaresistenzgene für Ampicillin (β-Lactamasen), Tetracyclin und Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase). Beispiele für derartige Marker, die typischerweise in Säugetierexpressionsvektoren verwendet werden, umfassen das Gen für Adenosindeaminase (ADA), Aminoglycosidphosphotransferase (neo, G418), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (TK) und Xanthinguaninphosphoribosyltransferase (XGPRT, gpt).
Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch herkömmliche Techniken durchgeführt werden, welche den Fachleuten wohlbekannt sind. Wenn der Wirt prokaryotisch ist, wie beispielsweise E. coli, können kompetente Zellen, welche zur DNA-Aufnahme fähig sind, durch Vorgänge, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, aus Zellen hergestellt werden, die nach einer exponentiellen Wachstumsphase geerntet wurden und anschließend durch das CaCl&sub2;-Verfahren behandelt wurden. Alternativ können MgCl&sub2; oder RbCl verwendet werden. Die Transformation kann ebenfalls nach Bildung eines Protoplasten aus der Wirtszelle oder durch Elektroporation durchgeführt werden.
Wenn der Wirt ein Eukaryot ist, können solche Verfahren der Transfektion von DNA wie Calciumphosphatcopräzipitate, herkömmliche mechanische Verfahren wie z. B. Mikroinjektion, Elektroporation, Insertion eines Plasmids, das in Liposomen eingeschlossen ist, oder virale Vektoren verwendet werden. Eukaryotische Zellen können ebenfalls mit DNA-Sequenzen, welche die Polypeptide der Erfindung codieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, das einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie beispielsweise das Herpes simplex-Thymidinkinasegen, cotransformiert werden. Ein weiteres Verfahren ist, einen eukaryotischen viralen Vektor wie beispielsweise den Simianvirus 40 (SV40) oder den Rinderpapillomvirus zu verwenden, um eukaryotische Zellen vorübergehend zu infizieren oder transformieren und das Protein zu exprimieren. (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman Herausg., 1982). Beispiele für Säugetierwirtszellen umfassen COS-, BHK-, 293- und CHO-Zellen.
Die Isolierung und Reinigung eines von einer Wirtszelle exprimierten Polypeptids oder von Fragmenten von diesem, die durch die Erfindung bereitgestellt wurden, können durch herkömmliche Mittel einschließlich präparativer Chromatographie und immunologischer Trennungen, unter Beteiligung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, durchgeführt werden.
Die JNK-Proteinkinase der Erfindung ist nützlich in einem Screening Verfahren zum Identifzieren von Verbindungen oder Zusammensetzungen, welche die Aktivität der Kinase beeinflussen. Somit stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren einer Zusammensetzung zur Verfügung, welche die c- Jun-N-terminale Kinase beeinflusst, welches das Inkubieren der Komponenten, welche die zu testende Zusammensetzung und die Kinase oder ein Polynukleotid, welches die Kinase codiert, umfassen, unter Bedingungen, die ausreichen, um zu ermöglichen, dass die Komponenten wechselwirken, dann anschließend das Messen der Wirkung, welche die Zusammensetzung auf die Kinaseaktivität oder auf das Polynukleotid, welches die Kinase codiert, hat, umfasst. Die beobachtete Wirkung auf die Kinase kann entweder inhibitorisch oder stimulierend sein. Beispielsweise kann die Zunahme oder Abnahme der Kinaseaktivität gemessen werden, indem eine radioaktive Verbindung wie beispielsweise ³²P-ATP zu der Mischung der Komponenten zugegeben wird, und der radioaktive Einbau in c-Jun oder ein anderes geeignetes Substrat für die JNK beobachtet wird, um zu bestimmen, ob die Verbindung die Proteinkinaseaktivität hemmt oder stimuliert. Ein Polynukleotid, welches die Kinase codiert, kann in einen Expressionsvektor eingefügt werden, und die Wirkung einer Zusammensetzung auf die Transkription der Kinase kann beispielsweise durch eine Northernblot-Analyse gemessen werden.
Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung ein Reagenz zur Verwendung in einem Verfahren der Behandlung einer zellproliferativen Störung, die mit der JNK verbunden ist, zur Verfügung, welches typischerweise die Verabreichung an einen Patienten mit der Störung einer therapeutisch wirksamen Menge des Reagenzes, welches die Kinaseaktivität moduliert, umfasst. Der Begriff "therapeutisch wirksam" bedeutet, dass die Menge von beispielsweise dem monoklonalen Antikörper oder dem antisense- Nukleotid, welches verwendet wird, eine ausreichende Menge darstellt, um die mit der JNK verbundene Störung zu verbessern. Der Begriff "zellproliferative Störung" bezeichnet bösartige wie auch nichtbösartige Zellpopulationen, die morphologisch oft von dem umgebenden Gewebe verschieden zu sein scheinen. Beispielsweise kann das Reagenz nützlich sein, um bösartige Geschwüre verschiedener Organsysteme wie beispielsweise Lunge, Brust, Lymphe, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt wie auch Adenokarzinome zu behandeln, welche bösartige Geschwüre wie beispielsweise die meisten Darmkrebsarten, Nierenzellkarzinome, Prostatakrebs, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Dünndarmkrebs und Ösophaguskrebs einschließen.
Das Reagenz ist ebenfalls nützlich, um nicht bösartige oder mit dem Immunsystem zusammenhängende zellproliferative Störungen wie beispielsweise Psoriasis, Pemphigus vulgaris, Behcet-Syndrom, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), ischämische Herzkrankheit, Postdialysesyndrom, Leukämie, rheumatoide Arthritis, erworbenes Immundefzienzsyndrom, Vasculitis, septischen Schock und andere Typen akuter Entzündungen und Lipidhistiozytose zu behandeln. Besonders bevorzugt sind immunpathologische Störungen. Im wesentlichen wird angenommen, dass jede Störung, die etiologisch mit einer JNK-Kinaseaktivität verknüpft ist, auf die Behandlung anspricht.
Die Behandlung umfasst die Verabreichung eines Reagenzes, welches die JNK-Kinaseaktivität moduliert. Der Begriff "modulieren" soll die Unterdrückung der Expression der JNK, wenn diese überexprimiert ist, oder die Verstärkung der JNK-Expression, wenn diese unterexprimiert ist, umfassen. Er soll ebenfalls die Unterdrückung der Phosphorylierung von c-Jun, beispielsweise durch Verwendung des Peptids der SEQ ID NR: 1 als einem kompetitiven Inhibitor der natürlichen c-Jun-Bindungsstelle in einer Zelle, umfassen. Wenn eine zellproliferative Störung mit einer JNK-Überexpression verbunden ist, können derartige unterdrückende Reagenzien wie eine antisense- JNK-Polynukleotidsequenz oder ein JNK-bindender Antikörper in eine Zelle eingeführt werden. Zusätzlich kann ebenfalls ein antiidiotypischer Antikörper, welcher an einen monoklonalen Antikörper bindet, der ein Peptid der Erfindung bindet, verwendet werden. Alternativ kann, wenn eine zellproliferative Störung mit einer Unterexpression oder Expression eines mutierten JNK-Polypeptids verbunden ist, eine sense- Polynukleotidsequenz (der DNA-codierende Strang) oder ein JNK-Polypeptid in die Zelle eingeführt werden.
Die Antikörper der Erfindung können parenteral durch Injektion oder durch schrittweise Infusion über die Zeit hinweg verabreicht werden. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intracavitär oder transdermal verabreicht werden.
Präparationen für eine parenterale Verabreichung eines Peptids oder eines Antikörpers der Erfindung umfassen sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie beispielsweise Olivenöl und injizierbare organische Ester wie beispielsweise Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließend Salzlösung und gepufferter Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringers Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Lactat oder fette Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoffregenerationslösungen, Elektrolytregenerationslösungen (wie beispielsweise jene, die auf Ringers Dextrose basieren) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Zusätze wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Chelatbildner und inerte Gase und dergleichen können ebenfalls vorliegen.
Polynukleotidsequenzen, einschließlich antisense-Sequenzen, können durch verschiedene Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, therapeutisch verabreicht werden. Eine solche Therapie würde ihre therapeutische Wirkung durch die Einführung des JNK-Polynukleotids in Zellen von Tieren mit der proliferativen Störung erreichen. Die Beförderung des JNK-Polynukleotids kann erreicht werden, indem ein freies Polynukleotid oder ein rekombinanter Expressionsvektor wie beispielsweise ein chimärer Virus oder ein kolloidales Dispersionssystem verwendet werden. Besonders bevorzugt zur therapeutischen Beförderung von Nukleotidsequenzen ist die Verwendung von zielgerichteten Liposomen.
Verschiedene virale Vektoren, welche für eine Gentherapie verwendet werden können wie sie hierin gelehrt wird, umfassen Adenovirus, Herpesvirus, Vaccinia oder vorzugsweise einen RNA-Virus wie beispielsweise einen Retrovirus. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines Mäuse- oder Vogelretrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in welche ein einzelnes fremdes Gen eingefügt werden kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Moloney-Mäuseleukämievirus (MoMuLV), Harvey-Mäusesarkomavirus (HaMuSV), Mäusebrusttumorvirus (MuMTV) und Roussarkomavirus (RSV). Eine Anzahl zusätzlicher retroviraler Vektoren kann mehrere Gene einbauen. All diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker übertragen oder einbauen, so dass transduzierte Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Durch Einfügen einer JNK-Sequenz in den viralen Vektor zusammen mit einem anderen Gen, welches z. B. den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, ist der Vektor nun zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können zielspezifisch gemacht werden, indem beispielsweise ein Polynukleotid, das einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein codiert, eingefügt wird. Ein bevorzugtes Targeting wird erreicht, indem ein Antikörper verwendet wird, um gezielt an den retroviralen Vektor zu binden. Die Fachleute kennen spezifische Polynukleotidsequenzen oder können diese leicht ohne aufwendige Experimente ermitteln, welche in das retrovirale Genom eingefügt werden können, um eine zielspezifische Beförderung des retroviralen Vektors, welcher das JNK-Polynukleotid enthält, zu ermöglichen.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, erfordern sie eine Unterstützung, um infektiöse Vektorteilchen zu produzieren. Diese Unterstützung kann beispielsweise bereitgestellt werden, indem Helferzelllinien verwendet werden, die Plasmide enthalten, welche alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen innerhalb des LTR enthalten. Diesen Plasmiden fehlt eine Nukleotidsequenz, welche es dem Verpackungsmechanismus möglich macht, ein RNA-Transkript zur Einkapselung zu erkennen. Helferzelllinien, welche Deletionen des Verpackungssignals aufweisen, umfassen beispielsweise ψ2, PA317 und PA12, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Zelllinien erzeugen leere Virionen, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingeführt wird, bei welchen das Verpackungssignal intakt ist, aber die Strukturgene durch andere interessierende Gene ersetzt sind, kann der Vektor verpackt werden und das Vektorvirion erzeugt werden. Die Vektorvirionen, welche durch dieses Verfahren erzeugt wurden, können dann verwendet werden, um eine Gewebezellline wie beispielsweise NIH 3T3-Zellen zu infizieren, um große Mengen von chimären retroviralen Virionen zu erzeugen.
Ein weiteres zielgerichtetes Beförderungssystem für JNK-Polynukleotide ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Kügelchen und auf Lipiden basierende Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischter Mizellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, welche als Beförderungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es wurde gezeigt, dass große unilamellare Vesikel (LUV), welche in der Größe von 0,2-4,0 um reichen, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inneren eingekapselt werden und an Zellen in einer biologisch aktiven Form abgegeben werden (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Zusätzlich zu Säugetierzellen wurden Liposomen zur Beförderung von Polynukleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein effizientes Gentransfervehikel ist, sollten die folgenden Charakteristika vorliegen: (1) Einkapselung der interessierenden Gene mit einer hohen Effizienz, während deren biologische Aktivität nicht beeinträchtigt wird; (2) bevorzugtes und wesentliches Binden an eine Zielzelle im Vergleich zu Nichtzielzellen; (3) Beförderung des wässrigen Inhalts des Vesikels zu dem Cytoplasma der Zielzelle mit hoher Effizienz; und (4) genaue und effektive Expression der genetischen Information (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988).
Das Targeting der Liposomen kann auf der Grundlage von anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifizierung basiert auf dem Grad der Selektivität, beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellspezifsch. Das mechanistische Targeting kann, danach unterschieden werden, ob es passiv oder aktiv ist. Ein passives Targeting verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen, sich auf Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen, welche Sinosoidalkapillaren enthalten, zu verteilen. Ein aktives Targeting beinhaltet andererseits die Veränderung des Liposoms durch ein Koppeln des Liposoms an einen spezifischen Liganden wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, einen Zucker, ein Glycolipid oder Protein, oder durch ein Verändern der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um ein Targeting zu Organen und Zelltypen, die von den natürlich vorkommenden Lokalisationsstellen verschieden sind, zu erreichen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen einer Zelle mit JNK- Kinaseaktivität oder einer zellproliferativen Störung, die mit der JNK verbunden ist, bereit, welches das Inkontaktbringen einer Zellkomponente mit c-Jun-N-terminaler Kinaseaktivität mit einem Reagenz, welches an die Komponente bindet, und das Messen der Wechselwirkung des Reagenzes mit der Komponente umfasst. Solche Reagenzien können verwendet werden, um relative Spiegel der JNK-Expression im Vergleich zu normalem Gewebe zu messen. Die Zellkomponente kann eine Nukleinsäure wie beispielsweise DNA oder RNA oder ein Protein sein. Wenn die Komponente eine Nukleinsäure ist, ist das Reagenz eine Nukleinsäuresonde oder ein PCR-Primer. Die Wechselwirkung eines Nukleinsäurereagenzes mit einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit c-Jun-N-terminaler Kinaseaktivität codiert, wird typischerweise unter Verwendung von radioaktiven Markierungen gemessen, jedoch werden den Fachleuten weitere Typen von Markierungen bekannt sein. Wenn die Zellkomponente ein Protein ist, ist das Reagenz typischerweise eine Antikörpersonde. Die Sonden werden direkt oder indirekt nachweisbar, beispielsweise mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym markiert. Die Durchschnittsfachleute werden andere geeignete Markierungen zur Bindung an den Antikörper kennen oder werden in der Lage sein, solche durch routinemäßige Versuche zu ermitteln.
Vorzugsweise ist die Sonde zur Identifizierung einer Zelle mit JNK-Kinaseaktivität ein c-Jun-Protein. Die JNK-Aktivität innerhalb einer Zelle wird durch das Ausmaß der Phosphorylierung der c-Jun-Proteinsonde gemessen. Beispielsweise kann die Menge der JNK-Aktivität in einem Zellextrakt gemessen werden, indem der Extrakt mit c- Jun-Protein gemischt wird und eine radioaktive Verbindung wie beispielsweise ³²P- ATP zu der Mischung der Komponenten zugegeben wird. Die Menge der Radioaktivität, die in die c-Jun-Sonde eingebaut wird, wird beispielsweise durch SDS-PAGE festgestellt und mit einer Zellkontrolle, die c-Jun und ein normales Niveau der JNK- Kinaseaktivität enthält, verglichen.
Das c-Jun-Substrat kann auf einer Mikrotiterschale mit 96 Vertiefungen immobilisiert werden, und Extrakte aus behandelten Zellen können zu den Vertiefungen zugegeben werden. Die Vertiefungen werden dann gewaschen, und ein geeigneter Puffer, der ³²P-ATP enthält, wird zu den Vertiefungen zugegeben. Die Phosphorylierungsreaktion läuft ca. 15 Minuten, und die Vertiefungen werden gewaschen und gezählt. Modifikationen des Tests umfassen ein Immobilisieren des Substrats unter Verwendung von Kügelchen oder magnetischen Teilchen und nicht radioaktiven Prozeduren, um die Phosphorylierung des Substrats zu messen, wobei z. B. monoklonale Antikörper und ein Nachweissystem verwendet werden (z. B. biotinylierte Antikörper und die Avidinperoxidasereaktion).
Das Jun-Protein, das in dem Verfahren zum Nachweis der JNK-Kinase verwendet wird, das oben beschrieben wurde, kann als Einheit aus einem einzelnen Protein oder als ein Fusionsprotein existieren. Das Fusionsprotein besteht vorzugsweise aus c-Jun und Glutathion-S-Transferase (GST) als einem Trägerprotein. Die c-jun-Nukleotidsequenz wird 3' von dem Trägerprotein in einen Expressionsvektor wie beispielsweise pGEX oder solche Derivate wie pGEX2T oder pGEX3X kloniert, das Gen wird exprimiert, die Zellen werden lysiert, und der Extrakt wird über eine Säule gegeben, die ein Harz enthält, oder direkt mit einem Harz gemischt, an welches das Trägerprotein bindet. Wenn GST der Träger ist, wird ein Glutathion (GSH)-Harz verwendet. Wenn Maltose-bindendes Protein (MBP) der Träger ist, wird ein Amyloseharz verwendet. Andere Trägerproteine und das geeignete Bindungsharz sind den Fachleuten bekannt.
Die Materialien der Erfindung sind ideal zur Herstellung eines Kits geeignet. Der Kit ist nützlich zum Nachweis des Spiegels einer c-Jun-N-terminalen Kinase, wobei dieser einen Antikörper umfasst, welcher an eine c-Jun-N-terminale Kinase bindet, oder eine Nukleinsäuresonde, welche mit einem JNK-Nukleotid hybridisiert, wobei der Kit ein Trägermittel umfasst, das in Kompartimente unterteilt ist, um in enger Begrenzung darin einen oder mehrere Behälter wie beispielsweise Fläschchen, Röhrchen und dergleichen aufzunehmen, wobei jeder der Behälter eines der getrennten Elemente umfasst, die in dem Test verwendet werden sollen. Beispielsweise kann einer der Behälter einen monoklonalen Antikörper der Erfindung enthalten, welcher nachweisbar markiert ist oder werden kann. Der Kit kann ebenfalls Behälter aufweisen, die einen Puffer (mehrere Puffer) enthalten und/oder einen Behälter, welcher ein Nachweismittel umfasst (z. B. ein Biotin-bindendes Protein wie beispielsweise Avidin oder Streptavidin), das an ein Reportermolekül (z. B. eine enzymatische oder fluoreszierende Markierung) gebunden ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen aber nicht beschränken. Während die Verfahren typisch sind für jene, die verwendet werden können, können andere, die den Fachleuten bekannt sind, alternativ verwendet werden.

BEISPIEL I

PLASMIDE UND EXPRESSION VON GST-FUSIONSPROTEINEN

Der Glutathion-S-Transferase (GST)-cJun-Expressionsvektor, pGEX2T-cJun(wt), wurde konstruiert, indem ein aufgefülltes BspHI-PstI-Fragment (welches AS 1-223 codiert) aus RSV-cJun(BspHI) in die SmaI-Stelle von pGEX2T (Pharmacia) eingeführt wurde. RSV-cJun(BspHI) wurde konstruiert, indem die Translationsinitiationssequenz CTATGA von RSV-cJun durch gezielte Mutagenese zu TCATGA verändert wurde. Der GSTcJun(Ala63/67)(BspHI)-Expressionsvektor wurde auf dieselbe Weise von RSV- cJun(Ala63/73) abgeleitet (Smeal, et al., supra, 1991) und wurde verwendet, um pGEX2T-cJun(Ala63/67) zu konstruieren. Die verschiedenen GSTcJun-Trunkierungsmutanten wurden konstruiert, indem die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wurde, um verschiedene Bereiche der cJun-codierenden Region zu amplifizieren. Die Sequenzen der Primer sind nachstehend angegeben:
Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Strategene, La Jolla, CA) amplifiziert, mit BamHI und PstI verdaut und in BamHI-, PstI-Stellen von pBluescript SK+ (Strategene) subkloniert. Die BamHI-EcoRI-Fragmente wurden aus pBluescript ausgeschnitten und in BamHI-, PstI-Stellen von pGEX3X (Pharmacia) subkloniert. Einige Konstrukte wurden erzeugt, indem BamHI-AvaI-Fragmente der PCR-Produkte und das AvaI-EcoRI-Fragment von pGEX2T-cJun(wt) in BamHI-, Eco- RI-Stellen von pGEX3X eingefügt wurden. pGEX3X-cJun(33-223) wurde konstruiert, indem ein XhoII-EcoRI-Fragment in pGEX3X eingefügt wurde.
Die v-Jun- und Küken-c-Jun-Sequenzen wurden von RCAS VC-3 bzw. RCAS CJ-3 abgeleitet (Bos, et al., Genes Dev, 4: 1677, 1990). GST-Fusionsvektoren für v-Jun und Küken-c-Jun wurden konstruiert, indem NcoI-Fragmente von RCAS VC-3 und RCAS CJ-3 in die NcoI-Stelle von pGEX-KG eingefügt wurden (Guan and Dixon, Anal. Biochem., 192: 262, 1989). Dieselben Fragmente, die verschiedene Teile der c-Jun- und v-Jun-codierenden Bereiche enthielten, wurden in pSG424, einen GAL4-DNA-Bindungsdomänenexpressionsvektor, kloniert (Sadowski und Ptashne, Nucl. Acids Res., 17: 753, 1989).
Die GST-Fusionsproteinexpressionsvektoren wurden in den XL1-Blue- oder NM522- Stamm von E. coli transformiert. Proteininduktion und Reinigung wurden durchgeführt wie früher beschrieben (Smith und Johnson, Gene, 67: 31, 1988). Die Menge des gereinigten Fusionsproteins wurde mit dem Bio-Rad-Proteintestkit abgeschätzt. Bei einigen Experimenten wurden die GST-Fusionsproteine nicht von den Glutathion (GSH)-Agarosekügelchen eluiert und wurden auf den Kügelchen zur Isolierung der c- Jun-N-terminalen Kinase zurückgehalten.

Zellkultur und Herstellung von Zellextrakten

FR3T3-, Ha-ras-transformierte FR3T3-, HeLaS3- und QT6-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagel-Medium (DMEM), das 10% fötales Kalbserum (FCS), 100 U/ml Penicillin (Pc) und 100 ug/ml Streptomycin (Sm) enthielt, kultiviert. Jurkat-, K562- und U937-Zellen wurden in RPMI 1640, das mit 10% FCS, 100 U/ml Pc und 100 ug/ml Sm ergänzt war, kultiviert. F9-Zellen wurden in 45% DMEM, 45% Ham's F12, 10% FCS, 100 U/ml Pc und 100 ug/ml Sm kultiviert. Kern- und cytoplasmatische Extrakte wurden hergestellt wie von Dignam, et al., (1983) beschrieben. Um Ganzzellextrakte (WCE) herzustellen, wurden die geernteten Zellen in WCE-Puffer: 25 mM HEPES pH 7,7, 0,3 M NaCl; 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 20 mM β-Glycerophosphat, 0,1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 2 ug/ml Leupeptin, 100 ug/ml PMSF suspendiert. Die Zellsuspension wurde für 30 Minuten bei 4ºC rotiert, und der Extrakt wurde durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten aufgeklart. Die Proteinmenge wurde mit dem Bio-Rad-Proteintestkit abgeschätzt.

Transfektionsexperimente

Transfektionsexperimente wurden unter Verwendung von RSV-cJun-, RSV-vJun- und GAL4-Jun-, GAL4-vJun- und Ha-Ras(Leu 61)-Expressionsvektoren wie früher beschrieben durchgeführt (Boyle, et al., supra, 1991; Binetruy, et al., supra, 1991; Smeal, et al., supra, 1991). Die CAT-Aktivität wurde bestimmt wie in Beispiel 8 unten beschrieben wird. Die c-Jun- und v-Jun-Proteinexpression und -Phosphorylierung wurde analysiert wie von Smeal, et al., supra, 1991; Smeal, et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3507, 1992) beschrieben wird.

Proteinreinigung

GST-Fusionsproteine wurden durch Affinitätschromatographie auf GSH-Agarose wie beschrieben gereinigt (Smith, et al., Gene, 67: 31-40, 1988). Gereinigte MAP-Kinase (eine Mischung aus ERK1 und ERK2) wurde von Dr. M. Cobb (University of Texas Southwestern) erhalten. JNK-46 wurde aus UV-bestrahlten HeLa S3-Zellen durch Standardflüssigchromatographie gereinigt. Eine auf einen Epitop gerichtete JNK wurde aus vorübergehend transfizierten COS-Zellen immungereinigt. Kurz gesagt wurden COS-Zellen mit 20 mM Tris (pH 7,6), 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM β-Glycerophosphat, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 100 uM Na-Orthovanadat, 10 ug/ml Leupeptin, 1 mM PMSF solubilisiert. JNK wurde durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers M2, welcher an Protein A-Sepharose gebunden war, isoliert. Die Kügelchen wurden gründlich mit Puffer A (20 mM Hepes (pH 7,7), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Triton X-100) gewaschen. JNK wurde von der Säule mit 3 M Harnstoff in Puffer A eluiert und gegen Puffer A mit 10% Glycerol dialysiert.

BEISPIEL 2

KINASETESTS

Festphasenkinasetest

Zellextrakte wurden so verdünnt, dass die endgültige Zusammensetzung des WCE- Puffers war: 20 mM HEPES pH 7,7, 75 mM NaCl, 2,5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EDTA, 0,05 Triton X-100, 0,5 mM DTT, 20 mM β-Glycerolphosphat, 0,1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 2 ug/ml Leupeptin, 100 ug/ml PMSF. Die Extrakte wurden mit 10 ul GSH-Agarosesuspension (Sigma) gemischt, an welche entweder 10 ug GST oder GST-Jun-Fusionsproteine gebunden waren. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei 4ºC in einem Mikrozentrifugenröhren rotiert und durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 20 Sekunden pelletiert. Nach Wäschen mit 4 · 1 ml HEPES-Bindungspuffer (20 mM MEPES, pH 7,7, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EDTA, 0,05% Triton X-100) wurden die pelletierten Kügelchen in 30 ul Kinasepuffer (20 mM HEPES, pH 7,6, 20 mM MgCl&sub2;, 20 mM β-Glycerolphosphat, 20 uM p-Nitrophenylphosphat, 0,1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 2 mM DTT), welcher 20 uM ATP und 5 uCi γ-³²P-ATP enthielt, resuspendiert. Nach 20 Minuten bei 30ºC wurde die Reaktion beendet, indem mit HEPES-Bindungspuffer gewaschen wurde. Phosphorylierte Proteine wurden mit 30 ul 1,5 · Laemmli-Probenpuffer eluiert und auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgelöst, worauf eine Autoradiographie folgte. Eine Quantifizierung des eingebauten Phosphats wurde durch Schneiden des Gels in Scheibchen und Szintillationszählung bestimmt. Phosphorylierte GST-Fusionsproteine wurden aus den Gelscheibchen eluiert und einer Phosphopeptidkartierung, wie sie beschrieben wurde (Boyle, et al., supra, 1991), unterzogen.

Kinasetest im Gel

Ein Kinasetest im Gel wurde wie von Kameshita und Fujisawa, Anal. Biochem., 183: 139 (1989) beschrieben mit leichten Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt wurden c-Jun-Bindungsproteine aus Ganzzellextrakten unter Verwendung von GSH- Agarosekügelchen, die 80 ug GST-cJun enthielten, wie oben beschrieben isoliert. Die Proteine wurden in Laemmli-Probenpuffer eluiert und auf 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgelöst, welches in Abwesenheit oder Gegenwart von GST-cJun (40 ug/ml) polymerisiert wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel zweimal jeweils 30 Minuten mit 100 ml 20% 2-Propanol, 50 mM HEPES pH 7,6 gewaschen, um das SDS zu entfernen. Nachdem das Gel zweimal jeweils 30 Minuten mit 100 ml Puffer A (50 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM β-Mercaptoethanol) gewaschen worden war, wurde es in 200 ml 6 M Harnstoff in Puffer A bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, worauf Reiheninkubationen in Puffer A, welcher 0,05% Tween 20 und entweder 3 M, 1,5 M oder 0,75 M Harnstoff enthielt, folgten. Nachdem das Gel mehrere Male jeweils 1 Stunde mit 100 ml Puffer A, der 0,05% Tween 20 enthielt, bei 4ºC gewaschen worden war, wurde es mit Kinasepuffer, der 50 uM ATP und 5 uCi/ml γ-³²P-ATP enthielt, bei 30ºC für 1 Stunde inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Gel mit 100 ml 5% Trichloressigsäure und 1% Natriumpyrophosphat bei Raumtemperatur mehrere Male gewaschen, worauf ein Trocknen und eine Autoradiographie folgten.

BEISPIEL 3

BINDUNG EINER PROTEINKINASE AN GST-cJun-GSH- AGAROSEKÜGELCHEN

Das Fusionsprotein, GSTcJun(wt), kann über seinen GST-Anteil an Glutathion (GSH)- Agarosekügelchen binden, um eine Affinitätsmatrix zur Identifikation von c-Jun- Bindungsproteinen, welche Proteinkinasen einschließen können, zu erzeugen. Eine Ha-ras-Transformation von FR3T3-Zellen führt zu einer erhöhten Phosphorylierung von c-Jun an Ser 63 und 73 (Binetruy, et al., supra, 1991; Smeal, et al., supra, 1991). Vorläufige Experimente zeigten, dass transformierte Zellen höhere Spiegel an c-Jun-N-terminaler Kinaseaktivität enthielten, während die Spiegel der c-Jun-C- terminalen Kinaseaktivität unverändert blieben. Um einen bequemeren Test zur Charakterisierung der c-Jun-N-terminalen Kinaseaktivität zu entwickeln, wurden Kern- und cytoplasmatische Extrakte von nichttransformierten und transformierten FR3T3- Zellen mit GSTcJun(wt)-GSH-Agarosekügelchen gemischt. FR3T3(-)- und Ha-ras- transformierte FR3T3(+)-Zellen wurden für 24 Stunden in 0,5% FCS gehalten und geerntet, um Kern- und cytosolische Extrakte herzustellen. Diese Extrakte (hergestellt aus einer gleichen Anzahl von Zellen) wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die 10 ug GST-cJun(wt), GSTcJun(Ala63/73) oder GST enthielten, gemischt. Nach 3 Stunden Inkubation wurden die Kügelchen abzentrifugiert, viermal gewaschen und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, für 20 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem in SDS-Probenpuffer gewaschen wurde, Die eluierten Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgelöst. Die Lage der GSTcJun-Fusionsproteine ist in Fig. 1 angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Proteinkonzentration statt der Anzahl der Zellen (300 ug des cytosolischen Extrakts und eine entsprechende Menge des Kernextrakts) verwendet wurde, um die Mengen der Extrakte, die in diesem Test verwendet wurden, zu normieren. Dieses Verfahren führte zu der Phosphorylierung von GSTcJun(wt), was nahe legt, dass eine Proteinkinase an dieses gebunden hat und dieses phosphoryliert hat, während es an der GSH-Agarose befestigt war (Fig. 1). Andererseits konnte keine Phosphorylierung von GST, welches an GSH-Agarose gebunden war, durch diesen Test nachgewiesen werden.
Dasselbe Experiment wurde wiederholt, indem ein GSTcJun(Ala63/73)-Fusionsprotein verwendet wurde, bei welchem beide Serine an Position 63 und 73 zu Alaninen umgewandelt waren, um eine Kinase zu identifzieren, die auf Ser 63 und 73 von c-Jun gerichtet ist. Die Phosphorylierung dieses Proteins war beträchtlich niedriger als die von GSTcJun(wt) (Fig. 1). Diese Experimente bestätigten die früheren Beobachtungen, dass die Kinaseaktivität, welche die N-terminalen Stellen von c-Jun beeinflusst, bei einer Has-ras-Transformation erhöht war, und sind konsistent mit den Unterschieden in dem Ausmaß der c-Jun-N-terminalen Phosphorylierung zwischen transformierten und untransformierten Zellen, welche durch eine in vivo-Markierung nachgewiesen wurden (Binetruy, et al., supra, 1991; Smeal, et al., supra, 1991, 1992). Die Kinaseaktivität, welche durch diesen Festphasentest nachgewiesen wurde, lag sowohl in den cytosolischen als auch den Kernfraktionen vor und war in dem Cytosol auf der Basis pro Zelle mehrfach höher. Es ist jedoch möglich, dass ein gewisser Teil der Kinase während der Zellfraktionierung aus den Kernen in das Cytosol ausgetreten ist.
Der Festphasentest wurde verwendet, um die N-terminale-c-Jun-Kinaseaktivität in anderen Zelltypen zu untersuchen. Eine Exposition von HeLa-Zellen an UV aktiviert den Ha-Ras-Signalweg und führt zu einer großen Zunahme der N-terminalen Phosphorylierung von c-Jun (Devary, et al., Cell, 71: 1081, 1992). Die Behandlung von HeLa-Zellen mit dem Phorbolester, TPA, hat andererseits nur einen marginalen Effekt auf die N-terminale Phosphorylierung von c-Jun (Boyle, et al., 1991). HeLa S3- Zellen wurden für 12 Stunden ohne Serum hungern gelassen (serum starved) und entweder unbehandelt gelassen, mit UV-Licht bestrahlt (40 J/m²) oder mit TPA inkubiert (100 ng/ml). Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten (min) nach UV- oder TPA-Exposition geerntet. Ganzzellextrakte (ungefähr 800 ug Protein), die aus einer gleichen Anzahl von Zellen isoliert wurden, wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die 10 ug von entweder GST, GSTcJun(wt) oder GSTcJun(Ala 63/73) enthielten, gemischt. Nach 3 Stunden Inkubation, gefolgt von einem gründlichen Waschen, wurde der Festphasen-Phosphorylierungstest wie oben beschrieben durchgeführt. Nach einer 20minütigen Reaktion wurden die Proteine in SDS-Probenpuffer dissoziieren gelassen und durch SDS-PAGE aufgelöst.
Wie in Fig. 2A gezeigt ist, wurde die N-terminale c-Jun-Kinaseaktivität innerhalb von 5 Minuten nach UV-Bestrahlung erhöht und war nach 30 Minuten 250-fach höher als bei nicht stimulierten Zellen. Die Wirkung von TPA war jedoch im Vergleich zu der von UV geringfügig. Wie schon vorher gefunden wurde, wurde GSTcJun(wt) effizienter phosphoryliert als GSTcJun(Ala63/73), wogegen GST nicht phosphoryliert wurde. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den in vivo-Messungen der c-Jun-Phosphorylierung (Boyle, et al., supra, 1991; Devary, et al., supra, 1992).
Eine TPA-Behandlung von Jurkat-T-Zellen führte im Gegensatzu zu HeLa-Zellen zu einer Stimulation der c-Jun-Phosphorylierung an Ser 63 und 73. Jurkat-Zellen wurden für 2 Stunden ohne Serum hungern gelassen und entweder unbehandelt gelassen oder mit TPA (50 ng/ml) für 10 oder 30 Minuten stimuliert. Ganzzellextrakte, die aus 5 · 10&sup6; Zellen hergestellt wurden, wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die GST, GSTcJun(wt) oder GSTcJun(Ala63/73) enthielten, gemischt. Eine Phosphorylierung der GST-Proteine, die an den Kügelchen befestigt waren, wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die schneller laufenden Banden entsprechen Abbauprodukten der GSTcJun-Proteine.
In Jurkat-Zellen wurde anders als bei HeLa-Zellen gefunden, dass die N-terminale Kinaseaktivität stark durch TPA aktiviert wurde (25-fach nach 30 Minuten) (Fig. 2B). Diese Kinase bevorzugte ebenfalls GSTcJun(wt) gegenüber GSTcJun(Ala63/73) und band nicht an den GST-Anteil oder phosphorylierte diesen. Zusammen legen diese Funde nahe, dass die Kinase, die durch den Festphasentest nachgewiesen wurde, c-Jun an Ser 63 und 73 phosphoryliert, und dass ihre Regulation parallel läuft zu der der c-Jun-N-terminalen Phosphorylierung, die durch in vivo-Markieren untersucht wurde.

BEISPIEL 4

PHOSPHORYLIERUNG DER SERINE 63 UND 73 DURCH GEBUNDENE KINASE, JNK

Um die genauen Phosphoakzeptorstellen zu bestimmen, die von der Kinase verwendet werden, welche an GSTcJun bindet, wurden die phosphorylierten GSTcJun(wt)- und GSTcJun(Ala63/73)-Proteine einer zweidimensionalen tryptischen Phosphopeptidkartierung unterzogen. Ganzzellextrakte von Ha-ras-transformierten FR3T3-Zellen (2,5 mg), UV-bestrahlten HeLa-Zellen (200 ug) oder TPA-stimulierten Jurkat-Zellen (1,2 mg) wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die entweder GSTcJun(wt) oder GSTcJun(Ala63/73) enthielten, gemischt. Die GSTcJun-Proteine wurden wie oben beschrieben durch die gebundene Kinase phosphoryliert, durch SDS-PAGE isoliert, aus dem Gel ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und einer zweidimensionalen Phosphopeptidkartierung unterzogen. Die X-, Y-, T1- und T2-Phosphopeptide sind angegeben. Alle Autoradiogramme wurden für dieselbe Zeitdauer exponiert.
Wie in Fig. 3A gezeigt ist, phosphorylierten die Kinasen, die aus Ha-ras-transformierten FR3T3-Zellen, UV-bestrahlten HeLa-Zellen und TPA-stimulierten Jurkat-Zellen isoliert wurden, GSTcJun an X, Y und zwei weiteren Peptiden, T1 und T2. X und Y entsprechen einer Phosphorylierung von Ser-73 bzw. Ser-63 (Smeal, et al., supra, 1991) und fehlten in Verdaus von GSTcJun(Ala63/73), welche höhere relative Spiegel von T1 und T2 enthielten. Eine Phosphoaminosäureanalyse zeigte, dass T1 und T2 nur Phosphothreonin enthalten. Durch eine Deletionsanalyse wurden diese Threonine den AS 91, 93 oder 95 von c-Jun zugeordnet.
Wie unten beschrieben wird, wurde die Kinase, die an GSTcJun band, aus den Kügelchen eluiert und verwendet, um rekombinantes c-Jun-Protein mit voller Länge in Lösung zu phosphorylieren (Fig. 3B). Rekombinantes c-Jun-Protein wurde in vitro durch die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) phosphoryliert, welche von den GSTcJun (wt)-GSH-Agarosekügelchen eluiert wurde. Zusätzlich wurde c-Jun durch Immunpräzipitation aus ³²P-markierten F9-Zellen isoliert, welche mit c-Jun- und Ha-Ras- Expressionsvektoren kotransfiziert wurden (Smeal, et al., supra, 1991). Mengen mit gleichen Zählimpulsen jeder Proteinpräparation wurden mit Trypsin verdaut und einer Phosphopeptidkartierung unterzogen. Die Wanderpositionen von X-, X'- (einem Derivat von X, das durch Alkylierung erzeugt wurde; Smeal, et al., supra, 1991), Y-, b- und c-Phosphopeptiden sind angegeben.
Wie auch in vivo gefunden wurde, phosphorylierte die gebundene Kinase c-Jun vorwiegend an Ser 73, worauf die Phosphorylierung von Ser 63 folgte. Zusätzlich phosphorylierte die gebundene Kinaseaktivität c-Jun schwach an zwei von seinen C- terminalen Stellen, was zu dem Auftreten der Phosphopeptide b und c führte. Da dieses die erste Proteinkinase ist, die mit einer klaren Spezifität für wenigstens eine der N-terminalen Stellen von c-Jun nachgewiesen wurde, wurde sie JNK für cJun-N- terminale Proteinkinase genannt.

BEISPIEL 5

BINDUNG VON JNK AN cJUN

Um die Stabilität der Wechselwirkung zwischen GSTcJun und JNK zu untersuchen, wurden Extrakte von TPA-stimulierten Jurkat-Zellen mit GSTcJun(wt)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert. Nach einem gründlichen Waschen wurden die Kügelchen einer Elution mit steigenden Konzentrationen von NaCl, Harnstoff, Guanidin-HCl und SDS unterzogen. Die Elution der JNK wurde anhand ihrer Fähigkeit untersucht, rekombinantes c-Jun in Lösung zu phosphorylieren. GSTcJun(wt)-GSH-Agarosekügelehen wurden für 3 Stunden mit einem Ganzzellextrakt von TPA-stimulierten Jurkat-Zellen inkubiert und wurden nach 4 Wäschen einer Elution in Kinasepuffer, der steigende Konzentrationen von NaCl, Harnstoff, Guanidin-HCl (in M) oder SDS (in %) enthielt, unterzogen (Fig. 4). Die eluierten Fraktionen (gleiche Volumina) wurden bei 4ºC gegen Kinasepuffer, der 10% Glycerol und kein ATP enthielt, dialysiert und dann mit rekombinantem c-Jun-Protein (250 ng) in Gegenwart von 20 uM ATP und 5 uCi γ-³²P- ATP für 20 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Menge der Kinase, welche nach den Elutionsschritten (R-Bahnen) auf den Kügelchen zurückblieb, wurde durch Inkubation der isolierten Kügelchen mit Kinasepuffer in Gegenwart von 20 uM ATP und 5 uCi γ- ³²P-ATP für 20 Minuten bei 30ºC bestimmt. Die phosphorylierten Proteine wurden wie oben beschrieben durch SDS-PAGE analysiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Wanderpositionen von GSTcJun und c-Jun sind angegeben.
Überraschend wurde gefunden, dass JNK sehr stark an GSTcJun bindet; nur ein kleiner Anteil der Kinaseaktivität wurde mit 0,5 M NaCl eluiert, und selbst nach Elution mit 2 M NaCl verblieb der Großteil der Kinase auf den Kügelchen (Fig. 4A). Ungefähr 50% der gebundenen Kinase wurden durch 1 M Harnstoff eluiert, und der Rest wurde durch 2 M Harnstoff eluiert. Eine nahezu vollständige Elution wurde durch entweder 0,5 M Guanidin-HCl oder 0,01% SDS erreicht. Unter all diesen Elutionsbedingungen wurde GSTcJun(wt) ebenfalls teilweise aus den GSH-Agarosekügelchen eluiert. Dieses legt nahe, dass die Stabilität des JNK:c-Jun-Komplexes ähnlich ist zu der des GST:GSH-Komplexes.
GSTcJun(wt) wurde kovalent mit GSH-Agarosekügelchen verknüpft, indem Bromcyan verwendet wurde, und mit einem Ganzzellextrakt von TPA-stimulierten Jurkat-Zellen inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurde ein Teil der Kügelchen mit Kinasepuffer eluiert, welcher enthielt: kein ATP (Fig. 4B, Bahn 2), 20 uM ATP (Bahn 3) oder 50 pM ATP (Bahn 4). Die eluierten Fraktionen (gleiche Volumina) wurden mit rekombinantem c-Jun-Protein (500 ng) als einem Substrat und 5 uCi γ-³²P-ATP für 30 Minuten inkubiert. Zusätzlich wurden die Kügelchen nach Elution mit entweder Kinasepuffer allein (Bahn 1) oder Kinasepuffer, der 50 uM ATP enthielt (Bahn 5), mit c-Jun- Protein (500 ng) in Gegenwart von 5 uCi γ-³²P-ATP für 30 Minuten inkubiert. Die Phosphorylierung von c-Jun (angegeben durch den Pfeil) wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Die Zugabe von exogenem c-Jun zu Kinase-beladenen GSH-Agarosekügelchen, mit welchen GSTcJun kovalent verknüpft war, führte zu deren effizienter Phosphorylierung (Fig. 4B, Bahn 1). Dieses legt nahe, dass JNK nach der Phosphorylierung von GSTcJun von diesem dissoziiert und exogenes c-Jun phosphoryliert. Zusätzlich führte eine Inkubation mit Kinasepuffer, der ATP enthielt, zu der Elution von JNK aus den GSTcJun-Kügelchen, wie durch deren Fähigkeit gezeigt wird, exogenes c-Jun zu phosphorylieren (Fig. 4B, Bahnen 2-4). Nach Inkubation mit 50 uM ATP verblieben weniger als 20% der Kinase auf den Kügelchen (vergleiche Bahnen 1 und 5, Fig. 4B).

BEISPIEL 6

JNK1 IST EIN PROTEIN MIT 46 kD

Ein Kinasetest im Gel wurde durchgeführt, um die Größe der JNK zu bestimmen. GSTcJun-GSH-Agarosekügelchen wurden mit einem Ganzzellextrakt von TPA-stimulierten Jurkat-Zellen inkubiert, gründlich gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden in SDS-Probenpuffer eluiert und auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt, die in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von GSTcJun(wt) polymerisiert wurden. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 6 M Harnstoff inkubiert und einer Renaturierung wie in Beispiel 1 beschrieben unterzogen. Die renaturierten Gele wurden in Kinasepuffer, der 50 uM ATP und 5 uCi/ml γ-³²P-ATP enthielt, für 1 Stunde bei 30ºC inkubiert, gewaschen, fixiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
In beiden Fällen wurde eine Proteinbande, deren apparentes Molekulargewicht 46 kD betrug, phosphoryliert (Fig. 5A). Die Phosphorylierung war zweimal mehr effizient in Gegenwart von GSTcJun. Dieses zeigt, dass die Proteinbande mit 46 kD entweder autophosphorylierte JNK oder ein komigrierendes Protein ist. In Eluaten der GST- GSH-Agarosekügelchen wurde kein ³²P-markiertes Protein nachgewiesen.
Derselbe Kinasetest im Gel wurde verwendet, um eine erhöhte JNK-Aktivität bei der TPA-Stimulation von Jurkat-Zellen oder der UV-Bestrahlung, von HeLa-Zellen zu demonstrieren (Fig. 5B). GSTcJun-GSH-Agarosekügelchen wurden mit Ganzzellextrakten von nichtstimulierten oder UV-stimulierten HeLa-Zellen und nichtstimulierten oder TPA-stimulierten Jurkat-Zellen inkubiert. Nach einem Waschen wurden die gebundenen Proteine in SDS-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Renaturierung wurde das Gel in Kinasepuffer, der 50 uM ATP und 5 uCi/ml γ- ³²P-ATP enthielt, inkubiert, und die phosphorylierten Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis, dass das apparente Molekulargewicht der JNK 46 kD beträgt. Um zu bestimmen, ob dieselbe N-terminale c-Jun- Kinase in verschiedenen Zelltypen vorliegt, wurde der Kinasetest im Gel verwendet, um Extrakte von menschlichen Erythroleukämiezellen K562, menschlichen histiocytischen Leukämiezellen U937, Jurkaf-Zellen, HeLa-Zellen, embryonalen Karzinomzellen F9, Ha-ras-transformierten FR3T3-Zellen und Wachtelfibroblasten QT6 zu untersuchen. Die HeLa-, F9- und QT6-Extrakte wurden aus UV-bestrahlten Zellen hergestellt, und die U937- und Jurkat-Extrakte wurden aus TPA-stimulierten Zellen erzeugt, während die K562-Zellen keiner speziellen Behandlung unterzogen wurden. Alle Zellen enthielten eine Proteinkinase, die an GSTcJun band und bis ca. 46 kD wanderte (Fig. 5C). Einige Zellen, insbesondere QT6-Zellen, enthielten eine zweite weniger häufige Proteinkinasespezies, die bei ca. 55 kD wanderte. Die Aktivitäten der beiden Kinasen wurden durch Zellstimulation induziert. GSTcJun(wt)-GSH-Agarosekügelchen wurden mit Ganzzellextrakten von logarithmisch wachsenden K562- und Ha-ras- transformierten FR3T3-Zellen, TPA-stimulierten Jurkat- und U937-Zellen und UV- bestrahlten HeLa-, F9- und QT6-Zellen inkubiert. Nach einem Waschen wurden die gebundenen Proteine eluiert und durch den Kinasetest im Gel, wie er oben beschrieben wird, analysiert.
Ein weiterer Beweis, dass JNK 46 kD in der Größe aufweist, wurde erhalten, indem die GSTcJun-gebundene Proteinfraktion des TPA-stimulierten Jurkat-Zellextrakts durch SDS-PAGE aufgetrennt wurde. Nach Elution und Renaturierung der fraktionierten Proteine wurde das Molekulargewicht der Hauptproteinkinase, die an GSTcJun band, die zu einer spezifischen Phosphorylierung von Ser 63 und 73 in der Lage war, als 46 kD bestimmt. Obwohl die Größen von ERK1 und ERK2, 44 bzw. 42 kD, eng an der von JNK liegen, zeigt, eine Westernblotanalyse unter Verwendung eines Antiserums, das mit beiden ERKs reagiert, dass die JNK mit 46 kD immunologisch mit keiner von diesen verwandt ist. Zusätzlich ist die JNK immunologisch nicht mit Raf-1 verwandt. Zusätzlich wurde ein Polypeptid mit 55 kD identifiziert, das eine JNK- Aktivität zeigte, jedoch scheint das mit 46 kD c-Jun effizienter zu binden (Hibi, et al., Genes Dev 7: 2135, 1993).

BEISPIEL 7

SCHILDERUNG DER KINASEBINDUNGSSTELLE

Deletionsmutanten von GSTcJun, denen entweder die N-terminalen oder C-terminalen Sequenzen fehlten (Fig. 6A), wurden verwendet, um die JNK-Bindungsstelle zu definieren. GSTcJun-Fusionsproteine, die verschiedene c-Jun-Sequenzen enthielten, wurden in E. coli exprimiert und durch Binden an GSH-Agarose isoliert. Die gebundenen Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie Blue angefärbt. Die Zahlen zeigen die Aminosäuren von c-Jun, die in jedem Fusionsprotein vorliegen. Die Wanderpositionen der intakten GST-Fusionsproteine sind durch die Punkte angegeben. Schneller wandernde Banden sind Abbauprodukte.
Diese Proteine wurden auf GSH-Agarosekügelchen immobilisiert und mit einem Extrakt von UV-bestrahlten HeLa-Zellen inkubiert. Ganzzellextrakte von UV-bestrahlten HeLa S3-Zellen wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die gleiche Mengen der verschiedenen GST-Fusionsproteine enthielten, gemischt. Nach einem Waschen wurden die Kügelchen für 20 Minuten in Kinasepuffer, welcher γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert. Die GST-Fusionsproteine wurden aus den Kügelchen eluiert und durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die Wanderpositionen der intakten GST-Fusionsproteine sind durch die Punkte angegeben. Nach Inkubation mit Ganzzellextrakten von UV-bestrahlten HeLa-Zellen und Waschen wurde ein Teil der gebundenen JNK-Fraktion mit 1 M NaCl eluiert und im Hinblick auf seine Fähigkeit untersucht, rekombinantes c-Jun (250 ng) in Lösung zu phosphorylieren. Die Proteinphosphorylierung wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Das Binden der JNK wurde durch deren Fähigkeit untersucht, die GSTcJun-Fusionsproteine, welche alle sowohl Ser 63 als auch 73 enthielten, zu phosphorylieren (Fig. 6B). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass irgendeine der Trunkierungen die Konformation von c-Jun verändert haben könnte, was die Präsentation von deren N-terminalen Phosphoakzeptoren beeinflussen könnte, ohne die JNK-Bindung zu beeinflussen, wurde die Kinase, die aus diesen Kügelchen eluiert wurde, im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, exogenes c-Jun mit voller Länge in Lösung zu phosphorylieren (Fig. 6C). Die Ergebnisse, die mit beiden Tests erhalten wurden, zeigten, dass die Entfernung der Aminosäuren (AS) 1-21 keine Auswirkung auf die JNK-Bindung hatte. Die Entfernung von AS 1-32 verminderte die Phosphorylierung von GSTcJun, wies aber nur eine kleine Auswirkung auf die Kinasebindung auf. Die Entfernung von AS 1-42 jedoch schloss die Kinasebindung vollständig aus. Im Gegensatz zu den N-terminalen Trunkierungen wiesen die zwei C-terminalen Trunkierungen, die untersucht wurden, keine Auswirkung auf die JNK-Bindung auf, und ein GST-Fusionsprotein, das AS 1-79 von c-Jun enthielt, zeigte die volle Bindungsaktivität. Damit bilden AS 33-79 die Kinasebindungsstelle.
Die JNK-Bindungsstelle umfasst die δ-Region, die sich über AS 31-57 von c-Jun erstreckt, die in v-Jun deletiert sind (Vogt und Bos, 1990). Um die Beteiligung der δ- Region an der Kinasebindung festzustellen, wurden GST-Fusionsproteine, welche die N-terminale Aktivierungsdomäne von Hühner-c-Jun (AS 1-144) oder die äquivalente Region von v-Jun enthielten (Fig. 7A), konstruiert. Die Aktivierungsdomäne (AS 1- 144) von Hühner (ch)-c-Jun und die äquivalente Region von v-Jun wurden mit GST fusioniert und in E. coli exprimiert. GST-Fusionsproteine wurden auf GSH-Agarosekügelchen isoliert und durch SDS-PAGE und Anfärben mit Coomassie Blue analysiert. Die Wanderpositionen der intakten Proteine sind durch die Punkte angegeben. Nach dem Laden dieser GST-Fusionsproteine auf GSH-Agarose wurden die Kinasebindungstests wie oben beschrieben durchgeführt.
Extrakte von TPA-aktivierten Jurkat-Zellen wurden mit GSH-Agarosekügelchen, die GST, GSTcJun(ch) oder GSTvJun enthielten, inkubiert. Nach einem Waschen wurden die Kügelchen in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert, und das phosphorylierte GST-Fusionsprotein wurde wie für Fig. 6 beschrieben analysiert. Die gebundene Proteinfraktion wurde aus den GSTcJun(Ch)- und GSTvJun-Kügelchen eluiert und im Hinblick auf ihre Fähigkeit, c-Jun in Lösung zu phosphorylieren, wie für Fig. 6 beschrieben analysiert. Während Hühner-GSTcJun die Kinase genauso effizient band wie menschliches GSTcJun, fand bei GSTvJun keine JNK-Bindung statt (Fig. 7B, C).

BEISPIEL 8

DIE JNK-BINDUNG IST FÜR EIN ANSPRECHEN AUF HA-RAS UND UV NOTWENDIG

Eine Phosphorylierung von Ser 63 und 73 ist zur Potenzierung der c-Jun-vermittelten Transaktivierung durch Ha-Ras erforderlich (Smeal, et al., supra, 1991). Wenn die Bindung von JNK bei dieser Reaktion eine Rolle spielt, sollten Mutationen, welche die Kinasebindung in vitro vermindern, die Stimulierung der cJun-Aktivität durch Ha-Ras in vivo abschwächen. Diese Beziehung wurde durch Kotransfektionstests untersucht. Expressionsvektoren wurden konstruiert, um chimäre GAL4-cJun- und GAL4-vJun- Proteine zu exprimieren, welche aus der DNA-bindenden Domäne des Hefeaktivators GAL4 (Sadowski und Ptashne, 1989) und N-terminalen Sequenzen von c-Jun oder v- Jun bestehen. Die Fähigkeit dieser Chimären, den GAL4-abhängigen Reporter 5xGAL4-Elb-CAT zu aktivieren (Lillie und Green, 1989), wurde in Abwesenheit oder Gegenwart eines kotransfizierten Ha-Ras-Expressionsvektors untersucht (Fig. 8A). F9-Zellen wurden mit 1,0 ug Expressionsvektor kotransfiziert, welcher die angegebenen chimären GAL4-cJun-Proteine codierte, welche verschiedene Teile der c-Jun- Aktivierungsdomäne [cJ = AS 1-223; 33 = AS 33-223; 56 = AS 56-223; A63, 73 = AS 1-246(Ala63/73)] und 2,0 ug eines 5xGAL4-Elb-CAT-Reporters in Abwesenheit oder Gegenwart der angegebenen Mengen (in ug) von pZIPNeoRas(Leu61) enthielten. Die Gesamtmenge des Expressionsvektors wurde konstant gehalten, und die Gesamtmenge der transfizierten DNA wurde unter Verwendung von pUC18 und der geeigneten Menge an pZIPneo auf 15 pg gebracht. Die Zellen wurden 28 Stunden nach der Transfektion geerntet, und die CAT-Aktivität wurde bestimmt. Gezeigt sind die Durchschnitte von zwei Experimenten, die als mehrfache Aktivierung gegenüber dem Spiegel der Reporterexpression berechnet wurden, den man in Abwesenheit der GAL4-Jun-Expressionsvektoren sieht.
Während die Deletion von AS 1-32 von c-Jun zu einer kleinen Abnahme des Ha-Ras- Ansprechvermögens führte (9,8-fache Induktion gegenüber einer 19-fachen Induktion für wt GAL4-cJun), führte die Deletion von AS 1-42 oder 1-55 zu einer größeren Abnahme bei dem Ha-Ras-Ansprechvermögen (5,2-fache Induktion). Eine ähnliche Abnahme bei dem Ha-Ras-Ansprechvermögen wurde bei der Substitution von c-Jun- Sequenzen durch v-Jun-Sequenzen beobachtet (4,7-fache Induktion). Tatsächlich sprachen die GAL4-cJun(56-223)- und GAL4-vJun-Chimären nur zweifach besser an als GAL4-cJun(1-246; Ala63/73), bei welchem Ser 63 und 73 zu Alaninen umgewandelt wurden. Diese Chimäre zeigte nur eine marginale Reaktion (2-fach) auf Ha-Ras. Derselbe Satz von GAL4-cJun- und GAL4-vJun-Fusionsproteinen wurde im Hinblick auf das UV-Ansprechvermögen getestet. F9-Zellen wurden wie oben beschrieben transfiziert, außer dass statt der Kotransfektion mit pZIPNeoRas die Zellen 8 Stunden nach der Transfektion entweder an 40 J/m² UV-C ausgesetzt wurden oder nicht ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden geerntet und 20 Stunden später auf CAT-Aktivität hin getestet. Fig. 8B zeigt die Durchschnitte von zwei Experimenten, die wie oben beschrieben berechnet wurden.
Wie in Fig. 8B gezeigt ist, waren jene Proteine, die unfähig waren, JNK in vitro zu binden, in vivo unfähig, auf UV anzusprechen. Während die Aktivität von GAL4-cJun (1-223) durch UV 7,5-fach stimuliert wurde, wurden die Aktivitäten von GAL4-cJun (43-223), GAL4-cJun (56-223) und GAL4-vJun nur 1,5-fach induziert.
Um die Rolle der JNK-Bindung bei der c-Jun-Phosphorylierung zu zeigen, wurden F9- Zellen mit c-Jun- und v-Jun-Expressionsvektoren in Abwesenheit oder Gegenwart eines aktivierten Ha-Ras-Expressionsvektors transfiziert. Eine UV-Bestrahlung wurde ebenfalls verwendet, um den Ha-Ras-Weg zu aktivieren (Devary, et al., 1992). v-Jun und c-Jun wurden durch Immunpräzipitation aus ³²S- oder ³²P-markierten F9-Zellen isoliert, die in Abwesenheit oder Gegenwart von pZIPNeoRas (Leu61) mit v-Jun- und c-Jun-Expressionsvektoren transfiziert wurden. Die isolierten Proteine wurden durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Gezeigt sind die Ergebnisse eines typischen Experiments für jedes Protein. Man beachte, dass das ³²P-markierte v-Jun-Autoradiograrnm 3-mal länger exponiert wurde als das entsprechende c-Jun-Autoradiogramm, um Signale mit ähnlicher Intensität zu erzeugen. v-Jun und c-Jun wurden aus ³²P- und ³²S-markierten F9-Zellen isoliert, die mit v-Jun- oder c-Jun-Expressionsvektoren transfiziert wurden. Eine Hälfte der Zellen wurde für 30 Minuten mit UV-C (40 J/m²) bestrahlt, bevor die Jun-Proteine durch Immunpräzipitation isoliert wurden. In diesem Fall stellen die c-Jun- und v-Jun-Bahnen gleiche autoradiographische Expositionen dar. Die zwei Pfeilspitzen zeigen die Wanderpositionen der zwei Formen von c-Jun (Devary, et al., 1992), wogegen das Quadrat die Wanderposition von v-Jun anzeigt.
Eine Immunpräzipitation von ³²S-markierten Zellen zeigte, dass c-Jun und v-Jun mit ähnlichen Spiegeln exprimiert wurden und dass ihre Expressionsspiegel weder durch Ha-Ras (Fig. 9A) noch UV (Fig. 9B) beeinflusst wurden. Eine Immunpräzipitation von ³²P-markierten Zellen zeigte, dass sowohl Ha-Ras als auch UV die Phosphorylierung von c-Jun stimulierten, wogegen die Phosphorylierung von v-Jun, deren Grundniveau mehrfach niedriger war als das von c-Jun, durch keine der Behandlungen verstärkt wurde. Wie schon früher beobachtet wurde (Devary, et al., supra, 1991), war UV ein stärkerer Induktor der c-Jun-Phosphorylierung, was zu dessen verlangsamter elektrophoretischer Mobilität führte. Eine Phosphopeptidkartierung bestätigte, dass die Ha-Ras-Expression eine sehr viel kleinere Wirkung auf die Phosphorylierung von v-Jun im Vergleich zu ihrer Wirkung auf c-Jun aufwies. Wie schon früher gezeigt wurde (Smeal, et al., supra, 1991), wurde v-Jun nur an einer Stelle phosphoryliert, welche dem Ser 73 von c-Jun entspricht.

BEISPIEL 9

Antiseren und Proteine

Polyklonales c-Jun-Antiserum wurde von Binetruy, et al., (Nature, 351: 122-127, 1991) beschrieben. Der monoklonale anti-CD3-Antikörper OKT3 (Van Wauwe, et al., J. Immunol, 124: 2708-2713, 1980) wurde von Dr. Amnon Altman, La Jolla Institute for Allergy and Immunology erhalten, und der monoklonale anti-CD28-Antikörper 9.3 wird in Hansen, et al., (Immunogenetics, 10: 247-260, 1980) beschrieben. Die anti- ERK2- und anti-ERK-Antikörper wurden von Dr. M. Weber bzw. Dr. M. Cobb (University of Texas Southwestern) zur Verfügung gestellt. Die Expression und Reinigung von GST-cJun (1-223) wurde beschrieben (Hibi, et al., Genes & Dev 7: 2135, 1993). Der bakterielle Expressionsvektor für eine kinasedefiziente ERK-1 war eine Gabe von Dr. M. Cobb, und das rekombinante Protein wurde von Dr. J. Hagstrom hergestellt und gereinigt. MBP wurde bei Sigma gekauft.

Zellkultivierung, metabolische Markierung und Immunpräzipitation

Jurkat-Zellen wurden in RPMT mit 10% fötalem Kaibserum (FCS), 1 mM Glutamat, 100 u/ml Penicillin (pen), 100 ug/ml Streptomycin (strep) und 250 ng/ml Amphotericin kultiviert (Vollmedium). HeLa S3-, CV-1- und FR3T3-Zellen wurden in DMEM, das mit 10% FCS, 100 u/ml pen, 100 ug/ml strep ergänzt war, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37ºC mit 5% CO&sub2; kultiviert. Mäusethymocyten wurden aus 8 Wochen alten Balb/C-Mäusen durch Gradientenzentrifugation auf Lymphozytenseparationsmedium (Pharmacia) präpariert. Die Lymphozyten wurden für 5 Stunden bei 37ºC in RPMI + 10% FCS kultiviert, bevor sie stimuliert wurden. Jurkat-Zellen wurden für 90 Minuten mit 0,5 mCi/ml γ-³²P-Orthophosphat (ICN Radiochemicals) in einem Medium, welchem Natriumphosphat fehlte, markiert. Die markierten Zellen wurden wie angegeben mit TPA (Sigma) und A23187 (Calbiochem), 1 ug/ml, behandelt. Wenn dieses verwendet wurde, wurde Cyclosporin A (CsA) (Sandoz), 100 ng/ml in Ethanol, 10 Minuten vor der Zellstimulierung zugegeben. Nach der Stimulierung wurden die markierten Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, dann mit RIPA-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% DOC, 0,1% SDS), welcher mit Phosphataseinhibitoren (20 mM β-Glycerophosphat, 10 mM p- Nitrophenylphosphat, 1 mM Na&sub3;VO&sub4;) und Proteaseinhibitoren (10 ug/ml Leupeptin, Aprotonin, Pepstatin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) ergänzt war, lysiert. c- Jun wurde wie beschrieben (Binetruy, et al., supra, 1992) immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE analysiert, worauf eine Peptidkartierung folgte (Boyle, et al., Cell, 64: 573-584, 1991; Lin, et al., Cell, 70: 777-789, 1992). Ha-Ras wurde mit Y13-259 immunpräzipitiert. Ha-Ras-gebundene Nukleotide wurden extrahiert und wie von Satoh, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 15: 5993-5997, 1990) beschrieben analysiert.

RNA-Extraktion und Northern-Blot-Analyse

Exponentiell wachsende Jurkat-Zellen (10&sup6;/ml), die in RPMI-Vollmedium kultiviert wurden, wurden, wenn dieses zutraf, für 15 Minuten mit CsA vorbehandelt, dann für weitere 40 Minuten verschiedenen Behandlungen unterzogen. Die gesamte cytoplasmatische RNA wurde wie früher beschrieben extrahiert (Angel, et al., Cell, 49: 729-739, 1987). 10 ug RNA wurden denaturiert, indem diese für 60 Minuten bei 55ºC mit Glyoxal inkubiert wurden und auf einem 1%-Agarosegel in Phosphatpuffer fraktioniert wurden. Die fraktionierte RNA wurde auf eine Zetabind-Nylonmembran (CUNO Labs) geblottet und mit. ³²P-markierten cDNA-Sonden hybridisiert, die für c-jun, jun- B, jun-D, c-fos, α-Tubulin und IL-2 spezifisch waren.

Proteinkinasetests

Exponentiell wachsende Zellen wurden für die angegebenen Zeiten stimuliert, und hypotonische Detergenzzellextrakte wurden wie beschrieben hergestellt (Hibi, et al., Genes and Dev., supra, 1993). Der Festphasen-Phosphorylierungstest zum Messen der JNK-Aktivität wurde durch inkubierte Extrakte mit GSTcJun (1-223)-GSH-Agarosekügelchen wie beschrieben (Hibi, et al., supra., 1993) und wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die ERK1- und 2-Aktivität wurde über einen Immunkomplex-Kinasetest unter Verwendung von MBP als einem Substrat (Minden, et al., Nature, 1993) getestet.

Reporter Expressionsvektoren und Transfektionen

-79 jun-LUC, -73/+63 Col-LUC, -60/+63 Col-LUC wurden schon früher beschrieben (Deng und Karin, 1993). Das IL2-LUC-Reporterplasmid wurde konstruiert, indem der IL2-Promotor (298 bp) aus IL2CAT/+1 (Serfling, et al., EMBO J., 8: 465-473, 1988) in den p20Luc-Vektor (Deng und Karin, Genes and Dev., 7: 479, 1993) zwischen die SacI- und die KpnI-Stelle subkloniert wurde. Der c-Jun-Expressionsvektor pSRallc-Jun wurde konstruiert, indem das menschliche c-jun-HindIII-NotI-Fragment aus pRSVc- Jun (Binetruy, et al., supra., 1991) durch Ligation von glatten Enden in dem pSRαII- Vektor subkloniert wurde. pBJ-CNA und pBJ-CNB stammten von Dr. G. Crabtree, Stanford University. β-Actin-LUC stammte von Dr. C. Glass, UCSD.
T-Ag-Jurkat-Zellen, ein Derivat der menschlichen Jurkat-T-Zelllinie, welche stabil mit dem SV40 large T-Antigen (eine Gabe von Dr. G. Crabtree) transfiziert ist, wurden bis auf 10&sup6;/ml kultiviert, dann bei 2 · 10&sup7;/ml in frischem Vollmedium resuspendiert. 10&sup7; Zellen (0,5 ml) wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit Reporterplasmiden (5 ug, -79 jun-LUC; 10 ug, -73/+63 Col-LUC oder -60/+63 Col-LuC; 5 ug IL2-LUC) gemischt, dann bei 250 V, 960 uF in einer 0,4 cm-Küvette unter Verwendung eines Bio-Rad GenePulser einer Elektroporation unterzogen. Nach der Elektroporation wurden die Zellen unmittelbar für 10 Minuten auf Eis gestellt, dann vor der Stimulation für 24 Stunden in 10 ml Vollmedium resuspendiert. 0,5 ug pSRallc-Jun wurden verwendet, um 10&sup7; Jurkat-Zellen zu transfizieren. Die Luciferaseaktivität wurde wie beschrieben bestimmt (Deng und Karin, supra., 1993).

Analyse von GDP und GTP, die an RAS p21 gebunden sind

10 · 10&sup6; Jurkat-Zellen wurden für 3 Stunden mit ³²P-Orthophosphat (ICN Radioehemicals) bei 1 mCi/ml in 5 mM Na&sub3;VO&sub4; phosphatfreiem DMEM, das mit 1 mg/ml BSA ergänzt war, markiert. Vor dem Ernten wurden die Zellen mit TPA, 10 ng/ml, A23187, 1 ug/ml, anti-CD3-Antikörper (OKT3), 10 ug/ml, anti-CD28-Antikörper, 2 ug/ml, oder deren Kombinationen stimuliert. Nach der Behandlung für einen bestimmten Zeitraum wurden die Zellen einmal unmittelbar mit eiskaltem PBS, zweimal mit eiskalter Tris-gepufferter Salzlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 10,5% Nonidet P-40/1 ug/ml Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) gewaschen, Ras p21 wurde mit dem monoklonalen Antikörper Y 12-259 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) immunpräzipitiert. Der GDP/GTP-Gehalt von Ras wurde wie beschrieben (Satoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 15: 5993, 1990) durch DSC analysiert und mit einem radioanalytischen Abbildungssystem von Ambis (Ambis, San Diego, CA) quantifiziert.

BEISPIEL 10

SYNERGISTISCHE INDUKTION DER AP-1-AKTIVITÄT WÄHREND DER T-ZELLAKTIVIERUNG

Während des ersten Stadiums der T-Lymphozytenaktivierung werden early response- Gene schnell induziert (Crabtree, Science, 243: 355, 361, 1989; Zipfel, et al., Mol. Cell Bio., 9: 1041-1048, 1989). Die Induktion der jun- und fos-Gene während der Aktivierung der Jurkat T-Zelllinie wurde untersucht. Zwei verschiedene kostimulatorische Paradigmen wurden verwendet, wobei das eine TPA und den Ca²&spplus;-Ionophor A23187 einsetzte und das zweite auf der gleichzeitigen Stimulation des TCR-Komplexes mit einem Antikörper gegen seine CD3-Komponente (OKT3; Van Wauwe, et al., J. Immund 124: 2708-2713, 1980) und der Stimulation des CD28-Hilfsrezeptors mit einem anti-CD28-Antikörper (9.3; Hansen, et al., Immunogenetics, 10: 247-260, 1993; June, et al., Immunol. Today, 11: 211-216, 1990) beruhte. Die gesamte cytoplasmatisehe RNA wurde aus Jurkat-Zeilen extrahiert, die mit 50 ng/ml TPA (T), 1 ug/ml A23187 (A) oder 100 ng/ml Cyclosporin A (CsA) für 40 Minuten entweder allein oder in Kombination wie angegeben inkubiert wurden. Nach der Fraktionierung von 10 ug- Proben auf einem Agarosegel und einer Überführung auf eine Nylonmembran wurden die Spiegel der c-jun-, jun-B-, jun-D-, c-fos und α-Tubulin-Expression durch Hybridisierung mit zufällig primenden cDNA-Sonden bestimmt.
Als zweites wurden Jurkat-Zellen mit 10 ug/ml löslichem anti-CD3 (OKT3), 2 ug/ml löslichem anti-CD28 (9.3) oder einer Kombination aus 50 ng/ml TPA und 1 ug/ml A23817 (T/A) wie angegeben für 40 Minuten inkubiert. Die gesamte cytoplasmatische RNA wurde isoliert, und 10 ug-Proben wurden wie oben beschrieben analysiert, wobei c-jun, jun-D- und c-fos Sonden verwendet wurden. Eine IL-2-Induktion durch dieselben Behandlungen wurde nach 6 Stunden Stimulierung durch Blothybridisierung unter Verwendung von IL-2- und α-Tubulin-spezifischen Sonden gemessen.
Sowohl das erste als auch das zweite kostimulatorische Paradigma induzierte die IL-2-Transkription (Fig. 11B). Eine optimale Induktion von c-jun erforderte ebenfalls eine kombinierte Behandlung mit TPA und A23187 (Fig. 11A) oder anti-CD3 und anti-CD28 (Fig. 11B). Die synergistische Induktion von c-jun durch beide kostimulatorischen Paradigmen wurde teilweise durch CsA inhibiert. jun-B wurde ebenfalls durch TPA induziert, aber seine Induktion wurde durch A23187 oder CsA nicht beeinflusst. Obwohl TPA + A23187 die jun-D-Expression potenzierten, wurde diese Wirkung ebenfalls nicht durch CsA inhibiert. Wie von Matilla, et al., (EMBO J. 9: 4425-4433, 1990) berichtet, erforderte die maximale Induktion von c-fos ebenso die Behandlung mit TPA + A23187, wurde aber nicht durch CsA inhibiert. Daher trifft die Empfindlichkeit gegenüber CsA nur auf c-jun zu. Während die Inkubation mit löslichem anti-CD3 zu der Induktion von c-jun und c-fos führte, wurde nur die c-jun- Expression durch die gleichzeitige Exposition an anti-CD28 vergrößert.
Die Wirkungen der verschiedenen Stimuli auf die AP-1-Transkriptionsaktivität in Jurkat-Zellen wurden untersucht, indem ein trunkierter, auf AP-1 ansprechender, menschlicher Kollagenasepromotor (Angel, et al, Cell, 49: 729-739, 1987), der mit dem Luciferase (LUC)-Reportergen fusioniert war, verwendet wurde. Jurkat-Zellen wurden mit 10 ug von entweder -73Col-LUC- oder -60Col-LUC-Reporterplasmiden transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen aliquotiert und für 9 Stunden mit 50 ng/ml TPA, 1 ug/ml A23187 oder 100 ng/ml CsA, allein oder in Kombination, wie angegeben inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, und die Luciferaseaktivität wurde bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind Durchschnitte von drei Experimenten, die dreifach durchgeführt wurden.
Während TPA und A23187 allein verabreicht marginale Wirkungen auf -73Col-LUC aufwiesen, führten beide zusammen zu dessen synergistischer Aktivierung (Fig. 11C). Der -60Col-LUC-Reporter, dem eine AP-1-Bindungsstelle fehlte, wurde nicht induziert. Die Induktion von -73Col-LUC wurde durch CsA inhibiert. Die Behandlung mit anti-CD3 und anti-CD28 führte ebenfalls zu einer synergistischen Aktivierung von -73Col-LUC. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem auf AP-1 ansprechenden c-jun- Promotor erhalten. Diese Funde unterscheiden sich von den früheren Messungen der AP-1-Aktivität in Jurkat-Zellen, die auf der Verwendung von synthetischen Promotoren, welche multiple AP-1-Stellen enthielten (Matilla, et al., supra, 1993; Ullman, ef al., Genes & Dev., 7: 188-196, 1993), beruhten. Während diese Funde reproduzierbar waren, zeigen frühere Studien, dass die physiologischen Kollagenase- und c-jun- Promotoren für eine genauere und gültige Messung der AP-1-Transkriptionsaktivität sorgen. Tatsächlich sind die Expressionsmuster der Kollagenase- und der c-jun- Reporter sehr ähnlich zu dem des c-jun-Gens.

BEISPIEL 11

DIE KOSTIMMULATION DER c-Jun-N-TERMINALEN PHOSPHORYLIERUNG WIRD DURCH CsA UNTERDRÜCKT

Die Induktion der c-Jun-Transkription und die optimale Stimulation von AP-1 hängt mit Änderungen bei der c-Jun-Phosphorylierung zusammen (Devary, et al., Cell, 71: 1081-1091, 1992). Die Wirkung von TPA und A23187 auf die c-Jun-Phosphorylierung in Jurkat-Zellen wurde untersucht. Um die c-Jun-Expression zu erhöhen, wurden Jurkat-Zellen mit einem c-Jun-Expressionsvektor transfiziert. Die Zellen wurden mit ³²P markiert, und c-Jun wurde aus Zellen, die verschiedenen Stimuli unterworfen wurden, immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE analysiert (Fig. 12A). Jurkat- Zellen (106 Zellen pro Bahn) wurden mit 0,5 ug eines SRα-cJun-Expressionsvektors transfiziert und 24 Stunden später für 3 Stunden mit ³²P-Orthophosphat (1 mCi/ml) markiert. Nach 15 Minuten Behandlung mit 50 ng/ml TPA (T), 1 ug/ml A23187 (A) und 100 ng/ml CsA, entweder allein oder in Kombination, wie angegeben, wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert, und c-Jun wurde durch Immunpräzipitation isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. Die c-Jun-Banden sind angegeben.
Bei nicht stimulierten Zellen wanderte phosphoryliertes c-Jun als eine einzelne Bande. Die Behandlung mit TPA für 15 Minuten induzierte das Auftreten von langsamer wandernden Banden, und eine Kostimulation mit A23187 verstärkte diesen Effekt, während CsA den Ca&spplus;&spplus;-Effekt verringerte. Innerhalb des kurzen Zeitrahmens dieses Experiments gab es minimale Auswirkungen auf die c-Jun-Expression.
Ähnliche Ergebnisse wurden durch eine Analyse der endogenen c-Jun-Expression und -Phosphorylierung erhalten (Fig. 12B). 2 · 10&sup7; Jurkat-Zellen wurden für 3 Stunden mit entweder ³&sup5;S-Methionin (900 uCi/ml) oder ³²P-Orthophosphat (1 mCi/ml) markiert. Nach 15 Minuten Inkubation mit 50 ng/ml TPA + 1 ug/ml A23187 (T/A) in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 ng/ml CsA oder ohne Zugabe, wie angegeben, wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert und c-Jun durch Immunpräzipitation isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. Die c-Jun-Bande ist angegeben. Jedoch waren aufgrund niedrigerer Expressionsspiegel einige der langsamer wandernden Formen nicht deutlich sichtbar.
Die c-Jun-Phosphorylierung wurde weiter durch zweidimensionale Phosphopeptidkartierung analysiert (Fig. 12C). Diese Analyse umfasste alle Isoformen von c-Jun. Alle c-Jun-spezifischen Proteinbanden, die in Fig. 12A gezeigt sind, welche aus einer gleichen Anzahl von Zellen isoliert wurden, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und einer tryptischen Phosphopeptidkartierung unterzogen. Gezeigt ist ein typisches Ergebnis (dieses Experiment wurde wenigstens dreimal wiederholt). N: Nicht stimulierte Zellen; T: Zellen, die mit 50 ng/ml TPA behandelt wurden; T/A: Zellen, die mit 50 ng/ml TPA und 1 ug/ml A23187 behandelt wurden; T/A + CsA: Zellen, die mit T/A und 100 ng/ml CsA behandelt wurden: a, b, c, x und y entsprechen den verschiedenen tryptischen Phosphopeptiden von c-Jun, die früher von Boyle, et al., (Cell, 64: 573-584, 1991) und Smeal, et al. (Nature, 354: 494-496, 1991) beschrieben wurden. T1 und T2 entsprechen den unbedeutenderen Phosphorylierungsstellen; Thr 91, 93 und 95 (Hibi, et al., Genes & Dat, 7: 000, 1993).
Während die Intensität des Punktes b, ein doppelt phosphoryliertes tryptisches Peptid, welches die C-terminalen Phophorylierungsstellen von c-Jun enthält (Boyle, et al., Cell 64: 573-584, 1991; Lin, et al., Cell, 70: 777-789, 1992), war mehr oder weniger unveränderlich war, führte die TPA-Behandlung zu einer kleinen Zunahme der Intensität der monophosphorylierten Form dieses Peptids (Punkt c) auf Kosten der dreifach phosphorylierten Form (Punkt a). Dieser Effekt wurde ebenfalls als Reaktion auf die Kostimulation mit TPA + A23187 beobachtet. Im Gegensatz zu HeLa-Zellen und Fibroblasfen (Boyle, et al., supra, 1991; Minden, et al., Nature, 1993) führte die TPA- Behandlung von Jurkat-Zellen zu einer erhöhten Phosphorylierung an den N-terminalen Stellen, welche Ser 63 (Punkt y) und Ser 73 (Punkt x) entsprechen, und diese Wirkung wurde durch A23187 deutlich verstärkt. CsA verhinderte die Verstärkung der N-terminalen Phosphorylierung durch A23187.

BEISPIEL 12

SYNERGISTISCHE AKTIVIERUNG DER JNK

Untersuchungen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die erhöhte N-terminale c-Jun-Phosphorylierung als Reaktion auf TPA + A23187 auf einer synergistischen Aktivierung der JNK, der Proteinkinase, die an c-Jun bindet und dessen N- terminale Stellen phosphoryliert, beruht. Die JNK existiert in zwei Formen, mit 46 kD und 55 kD in der Größe, welche beide durch externe Stimuli aktiviert werden (Hibi, et al., supra, 1993; Deng, et al., supra, 1993). Kinasetests im Gel zeigten, dass beide Formen der JNK durch TPA aktiviert wurden (Fig. 13A). Ganzzellextrakte (WCE) von Jurkat-Zellen, die für 15 Minuten mit TPA (T, 50 ng/ml), A23187 (A, 1 ug/ml) oder CsA (100 ng/ml), allein oder in Kombination, inkubiert wurden, wurden durch SDS-PAGE (100 ug Protein/Bahn) auf Gelen, die in Abwesenheit oder Gegenwart von GST-cJun (1-223) gegossen wurden, aufgetrennt. Die Gele wurden einem Renaturierungsprotokoll unterzogen und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert. Die Proteinbanden, welche den 55 kD- und 46 kD-Formen der JNK entsprechen, sind angegeben.
Während eine A23187-Behandlung allein die JNK nicht aktivierte, potenzierte diese deren Aktivierung durch TPA. CsA blockierte diese kostimulatorische Wirkung.
Die JNK kann auf GSTcJun-Glutathion (GSH)-Agaroseaffinitätsharz zurückgehalten werden und deren Kinaseaktivität durch Phosphorylierung von GSTcJun gemessen werden. WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden, wurden mit 5 ul GSH-Agarosekügelchen, die mit 10 ug GST-cJun (1-223) beschichtet waren, für 12 Stunden bei 4ºC inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die Kügelchen in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, für 20 Minuten bei 30ºC inkubiert, wonach die Proteine durch Inkubation in SDS-Probenpuffer dissoziiert wurden und durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden (Fig. 13B). Die 49 kD-Bande entspricht GST-cJun (1-223). Die schneller wandernden Banden sind Abbauprodukte (Hibi, et al., supra, 1993).
Dieser Festphasentest zeigte ebenfalls, dass die TPA-Behandlung zu einer Aktivierung der JNK führte, welche durch A23187 stark potenziert wurde, welches allein keinen Effekt aufwies. Diese synergistische Aktivierung der JNK wurde durch CsA inhibiert (Fig. 13B). Um zu beweisen, dass der Festphasentest die Aktivität derselben Polypeptide misst, die in dem Kinasetest im Gel identifiziert wurden, wurde die JNK zuerst auf GSTcJun-GSH-Agarosekügelchen isoliert und dann durch einen Kinasetest im Gel analysiert. Sowohl die 55- als auch die 46 kD-Form der JNK band an GSTcJun und wurde auf dieselbe Weise reguliert, die durch den Bindungstest offenbart wurde (Fig. 13C). WCE (200 ug) von Jurkat-Zellen, die wie in Fig. 13A beschrieben behandelt wurden, wurden wie oben beschrieben mit GST-cJun(1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert, und die gebundene Fraktion wurde in SDS-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE auf einem Gel, das GST-cJun(1-223) enthielt, aufgetrennt. Das Gel wurde renaturiert und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, inkubiert, um die JNK-Polypeptide zu markieren.

BEISPIEL 13

DIE KOSTIMULATION DURCH Ca&spplus;&spplus; IST EINMALIG BEI JNK UND T-LYMPHOZYTEN

Wir haben untersucht, ob erhöhtes intrazelluläres Ca&spplus;&spplus; die JNK-Aktivierung in anderen Zellen beeinflusst. Die JNK-Aktivität wurde durch TPA in CV1- und FR3T3-Zellen schwach stimuliert, nicht aber in PC12-Zellen (Fig. 14). Kulturen von FR3T3, CV-1, PC12 und Mäusethymozyten wurden für 15 Minuten in Gegenwart von TPA (50 ng/ml, T), A23187 (1 ug/ml, A) und/oder CsA (100 ng/ml) wie angegeben inkubiert. WCE, die aus 2-4 · 10&sup5; Zellen für die etablierten Zelllinien und 1,5 · 10&sup6; Zellen für die primären Thymozyten hergestellt wurden, wurden mit GSTcJun(1-223)-GSH- Agarosekügelchen inkubiert. Nach einem Waschen wurde die JNK-Aktivität durch einen Festphasen-Phosphorylierungstest wie oben beschrieben bestimmt.
Bei keiner dieser Zellen wurde die JNK-Aktivität durch eine A231817- oder CsA- Behandlung beeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden bei HeLa-, HepG2- und Gc- Zellen erhalten. Im Gegensatz dazu war die Regulation der JNK-Aktivität in Mäusethymozyten ähnlich zu der, die in Jurkat-Zellen beobachtet wurde. TPA induzierte eine mäßige Zunahme der JNK-Aktivität, welche durch A23187 verstärkt wurde, und diese Kostimulation wurde CsA inhibiert (Fig. 14).
JNK ist eine prolinspezifische Proteinkinase, die durch extrazelluläre Stimuli aktiviert wird (Hibi, et al., supra, 1993). In dieser Hinsicht ähnelt sie den ERK1- und 2-MAP- Kinasen (Boulton, et al., Cell, 65: 663-675, 1991). Da ERK1 und 2 an der Induktion von c-fos beteiligt zu sein scheinen (Gille, et al., Nature, 358: 414-417, 1992; Marais, et al., Cell, 73: 381-393, 1993) und dadurch an der T-Zellaktivierung teilnehmen könnten, wurde ihre Regulation untersucht. Die ERK1- und ERK2-Aktivitäten wurden sowohl in Jurkat- als auch Mäusethymozyten gemessen, indem ein Immunkomplex- Kinasetest und das basische Myelinprotein (MBP) als ein Substrat verwendet wurden. Rekombinante; kinasedefiziente ERK1 wurde ebenfalls als ein Substrat zum Testen der MEK, einer Proteinkinase, die für die Aktivierung von ERK1 und 2 verantwortlich ist (Crews, et al., Science, 258: 478-480, 1992), verwendet. Sowohl die ERK- als auch die MEK-Aktivität wurden durch die TPA-Behandlung von entweder Jurkat-Zellen oder Mäusethymozyten voll stimuliert (Fig. 15).
WCE (5 ug) von Jurkat- (Fig. 15, Feld A) oder Mäusethymozyten (Feld C) wurden mit 1 ug kinasedefizienter ERK1 in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP enthielt, für 20 Minuten inkubiert. Die phosphorylierten Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt, und die Bande, welche der ERK1-Mutante entspricht, ist angegeben. WCE (20 ug) von Jurkat- (Feld B) oder Mäusethymozyten (Feld C), die wie oben beschrieben behandelt wurden, wurden mit anti-ERK-Antikörpern (eine Gabe von Dr. M. Weber) immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen und in Kinasepuffer, der γ-³²P-ATP und 2 ug MBP enthielt, für 15 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die phosphorylierten Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt. Die Bande, welche phosphoryliertem MBP entspricht, ist angegeben. A23187 und CsA hatten keine Wirkung auf eine der Aktivitäten.

BEISPIEL 14

SYNERGISTISCHE AKTIVIERUNG DER JNK DURCH ANTI-CD3 UND ANTI-CD28

Wenn die JNK bei der Signalintegration während der T-Zellaktivierung eine zentrale Rolle spielt, dann sollten andere kostimulatorische Paradigmen ebenfalls deren synergistische Aktivierung bewirken. Die Regulation der JNK als Reaktion auf eine T-Zellaktivierung mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern wurde untersucht. Jurkat-Zellen (1 · 10&sup7;) wurden für 15 Minuten entweder mit normalem Mäuseserum, 1 ug/ml anti- CD3 und/oder 2 ug/ml anti-CD28, in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 ng/ml CsA wie angegeben inkubiert. WCE wurden hergestellt, und 100 ug-Proben wurden im Hinblick auf eine JNK-Aktivierung unter Verwendung des Kinasetests im Gel wie oben beschrieben analysiert.
Während die Inkubation von Jurkat-Zellen mit entweder löslichem anti-CD3 oder löslichem anti-CD28 allein eine vernachlässigbare Wirkung auf die JNK-Aktivität aufwies, führte die gleichzeitige Inkubation mit beiden Antikörpern zu einer starken synergistischen Aktivierung beider Formen (Fig. 16A).
WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden, wurden mit GSTcJun(1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert und unter Verwendung des Festphasen-Kinasetests auf die JNK-Aktivität hin getestet. Dieselben WCE (20 ug) wurden mit anti-ERK2-Antikörpern immunpräzipitiert und im Hinblick auf eine MBP- Kinaseaktivität getestet. CsA schwächte diese Wirkung teilweise ab. Im Gegensatz dazu war eine Inkubation mit löslichem anti-CD3 ausreichend für eine effiziente Aktivierung von ERK2, welche weder durch Kostimulation mit anti-CD28 verstärkt wurde, noch durch CsA inhibiert wurde (Fig. 16B).
Um das Wesen der Signalintegration durch die JNK weiter zu untersuchen, wurde die Wirkung einer suboptimalen Dosis von TPA untersucht, welche allein nicht zu einer JNK-Aktivierung bei den Reaktionen auf entweder anti-CD3 oder anti-CD28 führt (Fig. 16C). WCE (50 ug) von Jurkat-Zellen, die wie in Feld A beschrieben mit verschiedenen Stimuli allein oder mit deren Kombinationen behandelt wurden, wurden mit GSTcJun(1-223)-GSH-Agarosekügelchen inkubiert und im Hinblick auf die JNK- Aktivität unter Verwendung des Festphasen-Kinasetests getestet. Dieselben Proben (20 ug) wurden ebenfalls im Hinblick auf eine MBP-Kinaseaktivität getestet, wie in Fig. 16B beschrieben ist.
Zusammen mit A23187 führte diese suboptimale Dosis von TPA zu einer starken synergistischen Aktivierung von JNK, nicht aber von ERK2. Die Aktivierung von JNK wurde durch CsA vollständig inhibiert. Die suboptimale Dosis von TPA führte ebenfalls zu einer starken synergistischen Aktivierung von JNK zusammen mit entweder anti-CD3 oder anti-CD28. ERK2 wurde andererseits durch anti-CD3 voll aktiviert, und suboptimales TPA, welches allein zu einer partiellen Aktivierung von ERK2 führte, wies keinen weiteren Effekt auf. Ein Aussetzen an anti-CD28 verstärkte die Aktivierung von ERK2 durch TPA nicht. JNK wurde ebenfalls effizient durch die kombinierte Behandlung mit anti-CD3 + A23187 aktiviert, nicht aber durch anti-CD28 + A23187.

BEISPIEL 15

AKTIVIERUNG VON Ha-Ras

Die Wirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die Ha-Ras-Aktivierung wurden untersucht, und die Ergebnisse in Fig. 17 gezeigt. Jurkat-Zellen (2 · 10&sup6; Zellen pro Punkt), die mit 0,4 mCi ³²P-Orthophosphat für 3 Stunden markiert wurden, wurden mit nicht spezifischem Antikörper (1 ug/ml Mäuse-IgG; Kontrolle), 1 ug/ml anti-CD3, 2 ug/ml anti-CD28, 10 ng/ml TPA oder 500 ng/ml A23187 (A) wie angegeben inkubiert. Nach 2 Minuten wurden die Zellen geerntet, lysiert, und Ha-Ras wurde durch Immunpräzipitation isoliert. Das Guaninnukleotid, das an Ha-Ras gebunden hatte, wurde extrahiert, durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt und wie in Beispiel 9 beschrieben quantifiziert. Die gezeigten Werte stellen die Durchschnitte von zwei getrennten Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden, dar. Jurkat-Zellen wurden mit ³²P-Orthophosphat markiert und entweder mit TPA oder anti-CD3 wie oben beschrieben stimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, und der GTP-Gehalt von Ha-Ras wurde wie direkt oben beschrieben bestimmt.
Während eine optimale Dosis von TPA und ein Aussetzen an löslichen anti-CD3 zu einer Aktivierung von Ha-Ras führte, die durch eine Zunahme von dessen GTP-Gehalt gemessen wurde, wies lösliches anti-CD28 keine Wirkung auf die Ha-Ras-Aktivität auf (Fig. 17A). Die Aktivierung von Ha-Ras durch entweder anti-CD3 oder TPA wurde durch Kostimulation mit entweder anti-CD28 bzw. A23187 nicht verstärkt. Während die Aktivierung von Ha-Ras durch TPA für wenigstens 20 Minuten bestehen blieb, war die Reaktion auf lösliches anti-CD3 sehr vorübergehend (Fig. 17B). Daher muss die Signalintegration stromabwärts von Ha-Ras auftreten.

SEQUENZ-ID-PROTOKOLL

SEQ ID NR: 1 ist die Aminosäuresequenz der Reste 33-79 von c-Jun.
SEQ ID NR: 2 ist die Nukleotidsequenz für einen N-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 3 ist die Nukleotidsequenz für einen N-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 4 ist die Nukleotidsequenz für einen N-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 5 ist die Nukleotidsequenz für einen N-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 6 ist die Nukleotidsequenz für einen N-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 7 ist die Nukleotidsequenz für einen C-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 8 ist die Nukleotidsequenz für einen C-terminalen Primer, welcher zur Erzeugung von c-Jun-Trunkierungsmutanten verwendet wurde.
SEQ ID NR: 9 ist die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminsäuresequenz für c-jun und c-Jun.
SEQ ID NR: 10 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von c-Jun.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
Karin, Michael
Hibi, Masahiko
Lin, Anning
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: ONKOPROTEIN-PROTEINKINASE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Spensley Horn Jubas & Lubitz
(B) STRASSE: 1880 Century Park East, Suite 500
(C) STADT: Los Angeles
(D) BUNDESLAND: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 90067
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) ART DES DATENTRÄGERS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT
(B) ANMELDETAG: 18. Juli 1994
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZUM VERTRETERANWALT:
(A) NAME: Wetherell, Jr., Ph. D., John R.,
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31,678
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: FD-3701
(ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (619) 455-5100
(B) TELEFAX: (619) 455-5110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: c-Jun/JNK-Bindungsstelle
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1..47 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: N-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..35 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: N-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..34 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: N-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..35 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: N-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..35 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: N-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..35 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: C-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..30 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: C-terminaler Primer
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..33 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2096 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: Jun
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 412..1404 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 331 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 10:

Claims

1. Ein isoliertes c-Jun-N-terminale Kinase (JNK)-Polypeptid, welches gekennzeichnet ist dadurch:

(a) dass es ein Molekulargewicht von 46 kD, bestimmt durch reduzierende SDS- PAGE, aufweist;

(b) Serin- und Threoninkinaseaktivität besitzt; und

(c) die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne phosphoryliert;

wobei das Polypeptid nicht das ERK1-Polypeptid mit 44 kD oder das ERK2-Polypeptid mit 42 kD ist.

2. Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, welches weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Serin- und Threoninkinaseaktivität für Serin 63 und Serin 73 von c-Jun spezifisch ist.

3. Eine isolierte Polynukleotidsequenz, welche das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 codiert.

4. Eine Wirtszelle, welche das Polynukleotid nach Anspruch 3 enthält.

5. Ein rekombinanter Expressionsvektor, welcher das Polynukleotid nach Anspruch 3 enthält.

6. Der Vektor nach Anspruch 5, welcher ein Virus ist.

7. Der Vektor nach Anspruch 6, wobei der Virus ein RNA-Virus ist.

8. Der Vektor nach Anspruch 7, wobei der RNA-Virus ein Retrovirus ist.

9. Der Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor ein Plasmid ist.

10. Antikörper, welche an das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 binden, oder Fragmente dieser Antikörper, welche die Fähigkeit beibehalten, das Polypeptid zu binden.

11. Die Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Antikörper polyklonal sind.

12. Die Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Antikörper monoklonal sind.

13. Ein Verfahren zum Identifizieren einer Zusammensetzung, welche die c-Jun-N- terminale Kinase nach Anspruch 1 oder 2 beeinflusst, welches umfasst:

(a) Inkubieren von Komponenten, welche die Zusammensetzung und die Kinase oder ein Polynukleotid, welches die Kinase codiert, umfassen, wobei das Inkubieren unter Bedingungen durchgeführt wird, die ermöglichen, dass die Komponenten wechselwirken; und

(b) Messen der Wirkung der Zusammensetzung auf die Kinase oder das Polynukleotid, welches die Kinase codiert.

14. Das Verfahren nach Ansprüch 13, wobei die Wirkung die Inhibition der Kinase ist.

15. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Wirkung die Stimulation der Kinase ist.

16. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung ein immunsupprimierendes Mittel ist.

17. Ein isoliertes synthetisches Peptid, bestehend aus der SEQ ID Nr. 1 oder einer konservativen Variante von dieser, wobei das Peptid an die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) nach Anspruch 1 oder 2 bindet.

18. Ein Polynukleotid, welches das Peptid nach Anspruch 17 codiert.

19. Ein Antikörper, welcher an die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 bindet.

20. Der Antikörper nach Anspruch 19, wobei der Antikörper polyklonal ist.

21. Der Antikörper nach Anspruch 19, wobei der Antikörper monoklonal ist.

22. Ein Reagenz, welches die Kinaseaktivität der c-Jun-N-terminalen Kinase nach Anspruch 1 oder 2 moduliert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Zellproliferationsstörung, die mit der Kinase zusammenhängt, wobei das Reagenz ein Polynukleotid mit einer Sequenz, die antisense zu einer die Kinase codierenden Polynukleotidsequenz ist, ein Antikörper, welcher an die Kinase bindet, ein synthetisches Peptid mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder ein Antikörper, welcher an das synthetische Peptid von SEQ ID Nr. 1 bindet, ist.

23. Das Reagenz nach Anspruch 22, welches ein monoklonaler Antikörper ist.

24. Das Reagenz nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Zellproliferationsstörung ausgewählt ist aus einer ischämischen Herzkrankheit, Leukämie, rheumatoider Arthritis, Darmkrebs, Nierenzellkarzinom, Prostatakrebs, nicht kleinzelligem Lungenkarzinom, Dünndarmkrebs, Ösophaguskrebs, erworbener Immuninsuffizienz, Vasculitis und immunpathologischen Störungen.

25. Ein Verfahren zum Identifizieren einer Zelle mit der Aktivität der c-Jun-N-terminalen Kinase nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Inkontaktbringen einer Komponente der Zelle in vitro mit einem Reagenz, welches an die Kinase oder eine die Kinase codierende Nukleinsäure bindet, und Messen der Wechselwirkung des Reagenzes mit der Komponente, wobei das Reagenz eine Nukleinsäuresonde ist, welche an die die Kinase codierende Nukleinsäure, das c-Jun-Protein oder einen Antikörper, welcher an die Kinase bindet, bindet.

26. Verwendung eines Reagenzes, welches an die Kinase nach Anspruch 1 oder 2 oder an eine die Kinase codierende Nukleinsäure bindet, bei der Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Identifizieren einer Zelle mit der Aktivität der c-Jun-N-terminalen Kinase nach Anspruch 1 oder 2 durch ein Inkontaktbringen einer Komponente einer Zeller in vivo mit dem Reagenz und Messen der Wechselwirkung des Reagenzes mit der Komponente, wobei das Reagenz eine Nukleinsäuresonde ist, welche an die die Kinase codierende Nukleinsäure, das c-Jun-Protein oder einen Antikörper, welcher an die Kinase bindet, bindet.

27. Das Verfahren oder die Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Nukleinsäure, welche die Kinase codiert, RNA ist.

28. Das Verfahren oder die Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das c-Jun-Protein ein Fusionsprotein ist.

29. Das Verfahren oder die Verwendung nach Anspruch 28, wobei das Fusionsprotein aus c-Jun und Glutathion-S-Transferase (GST) besteht.

30. Das Verfahren oder die Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die Sonde nachweisbar markiert ist.

31. Das Verfahren oder die Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Markierung ein Radioisotop, eine biolumineszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung, ein Metallchelat oder ein Enzym ist.

32. Ein Kit, der zum Nachweis der c-Jun-N-terminalen Kinase nach Anspruch 1 oder 2 nützlich ist, umfassend einen Antikörper, welcher an die c-Jun-N-terminale Kinase bindet, einen Träger, der in Kompartimente unterteilt ist, um in enger Begrenzung darin einen oder mehrere Behälter aufzunehmen, und einen Behälter, welcher eine Sonde enthält, die spezifisch mit dem Antikörper reagiert.

33. Der Kit nach Anspruch 32, wobei die Sonde ein Antikörper ist.

34. Der Kit nach Anspruch 33, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.

35. Ein isoliertes c-Jun-N-terminale Kinase (JNK)-Polypeptid, welches gekennzeichnet ist dadurch:

(a) dass es ein Molekulargewicht von 55 kD, bestimmt durch reduzierende SDS- PAGE, aufweist;

(b) eine Serin- und Threoninkinaseaktivität besitzt; und

(c) die c-Jun-N-terminale Aktivierungsdomäne phosphoryliert;

wobei das Polypeptid kein ERK-Polypeptid ist.

36. Eine isolierte Polynukleotidsequenz, welche das Polypeptid nach Anspruch 35 codiert.