DE69430665T2

DE69430665T2 - Empfindlicher nukleinsäure-sandwichhybridisierungs-assay und kits

Info

Publication number: DE69430665T2
Application number: DE69430665T
Authority: DE
Inventors: Herman J. Blok; Fred R. Kramer; Ulf D. Landegran; Paul M. Lizardi; Sanjay Tyagi
Original assignee: Public Health Research Institute of City of New York Inc
Current assignee: Medicine And Dentistry Of Ne Us, University of
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-14
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2014-01-15
Also published as: EP0688366A4; EP0688366B1; US5759773A; EP0688366A1; DE69430665D1; JP3778925B2; AU6031094A; WO1994016108A1; JPH08505770A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäurehybridisierungs-Assays, insbesondere auf Sandwichhybridisierungs-Assays, die Oligonukleotid-Hybridisierungsproben verwenden. Solche Assays haben eine breite Anwendbarkeit, einschließlich der Assays für mutierte Gene, Assays für Pathogene in biologischen Proben sowie Assays für einen Organismus oder Virus in der Nahrung, landwirtschaftlichen Produkten oder in der Umwelt.
Oligonukleotidproben bilden extrem spezifische und stabile Komplexe, bekannt als "Hybride", mit Nukleinsäure-Targets, die Target-Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche komplementär zu den Proben sind. Die Assays, welche dieses Prinzip verwenden, beinhalten im allgemeinen die Schritte des in Kontaktbringens von Nukleinsäuren in einer Probe mit Oligonukleotidproben unter solchen Bedingungen, dass die Bildung von spezifischen Proben- Target-Hybriden gefördert wird, das Wegwaschen von nicht-hybridisierten Proben sowie das Messen der Zahl der Proben, die hybridisiert sind (im allgemeinen durch Messung eines Signalerzeugers, der mit den Proben assoziiert ist), als Maß für die Zahl der vorhandenen Target-Nukleinsäuresequenzen (Gillespie & Spiegelman, 1965). Für den Nachweis kann ein radioaktives Atom oder eine Fluoreszenz-Komponente verwendet werden. Für den Nachweis einer geringen Zahl von Targetmolekülen können die Proben eine amplifizierbare Gruppe enthalten, wie eine amplifizierbare Reporter-RNA (Chu et al., 1986), oder alternativ eine amplifizierbare rekombinante RNA, die eine eingebettete Probensequenz enthält (Lizardi et al., 1988). Wenn die Bakteriophagen Qβ-Replicase für die Amplifikation verwendet wird, wird eine RNA-Probe direkt amplifiziert, wobei eine DNA-Probe indirekt amplifiziert werden kann. Dies bedeutet, dass die Probe transkribiert wird, um ein RNA-Molekül herzustellen, welches dann direkt amplifiziert wird (Martinelli et al., 1992). In dieser Anmeldung werden die Proben als "amplifizierbar" bezeichnet, wenn sie direkt amplifizierbar oder indirekt amplifizierbar sind.
Sandwichhybridisierungs-Assays sind bekannt (Dunn & Hassell, 1977; Ranki et al., 1983; Syvanen et al., 1986). Bei Nukleinsäure-Sandwich-Assays wird eine "Einfangprobe" verwendet, um das Target, an das eine "Reporterprobe" auch hybridisiert werden kann oder nicht, an eine feste Oberfläche zu binden. Manchmal werden die Reporterproben als "Signalproben" bezeichnet. Die Einfangprobe hybridisiert mit dem Target an einer Stelle, die von der "Targetsequenz" unterschiedlich ist, welche mit den Reporterproben hybridisiert. Der erzielte Komplex umfasst eine Target-Nukleinsäure und eine Einfangprobe, die auch mit dem Target hybridisiert ist, und möglicherweise eine oder mehrere Reporterproben, die auch an dem Target hybridisiert sind. Die Einfangprobe hat ein Ende, der sogenannte "Kopf", der mit dem Target hybridisierbar ist, sowie ein zweites Ende, der sogenannte "Schwanz", der eine Komponente umfasst, welche die Einfangprobe an eine feste Oberfläche, wie die Oberfläche eines Partikels, bindet. Die Hybridisierung der zwei Proben wird durch die Inkubation mit dem Target in Lösung erzielt, wobei von beiden Proben ein Überschuss, im allgemeinen ein großer Überschuss, verwendet wird. Anschließend erfolgt ein Unlöslichmachen, das heißt, eine Immobilisierung an einer festen Oberfläche. Ein heftiges Waschen wird verwendet, um überschüssige Reporterproben, die nicht an die Targets hybridisiert haben, zu entfernen, bevor die Reporterproben nachgewiesen werden.
Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays, einschließlich der obigen Sandwich-Assays, leiden an ihrer niedrigen Empfindlichkeit, die hervorgerufen wird durch einen Hintergrund oder "Rauschen" aufgrund der nicht-spezifischen Bindung der Reporterproben an die Partikel oder an die anderen festen Oberflächen. Eine Vorbehandlung der Partikel mit Albumin, um die nicht-spezifische Bindung zu blockieren, wurde verwendet, um diesen Hintergrund oder das Rauschen zu reduzieren, wie beispielsweise die kovalente Vernetzung der Reporterproben an die Targets, um ein mehr stringentes Waschen zu ermöglichen (Yabusaki et al., 1986). Ein Verfahren für die Reduktion des Hintergrundes aufgrund der nicht-spezifischen Bindung von markierten Proben besteht in der Einführung eines Restriktionsortes in die Probe und Trennung der Markierung von einem immobilisierten Proben-Target-Hybrid unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und in der Durchführung einer Fest-Flüssig-Trennung, bevor die Markierung abgelesen wird (U.S. Patent Nr. 4,445,619 (1988)). Die Proben-Target-Hybride wurden auch mit einem Verfahren, das als "reversibles Targeteinfangen" (Morrissey et al., 1989; Hunsaker et al., 1989) bekannt ist, von einer festen Oberfläche auf eine andere überführt. Bei dem reversiblen Targeteinfangen werden die Komplexe oder Hybride aus Einfangprobe/Target/Reporterprobe wiederholt von den Partikeln freigesetzt, in einen neuen Behälter, der neue Partikel enthält überführt, wieder eingefangen (immobilisiert auf den Oberflächen der neuen Partikel mittels der Schwänze der Einfangproben) und heftig gewaschen. Nach einer gewissen Zahl von Kreisläufen aus Freisetzung, Übertragung, Wiedereinfangen und Waschen, kann die Zahl der Reporterproben, die nicht-spezifisch an die Endpartikel gebunden sind, signifikant reduziert sein. Der Gesamtprozess ist so effektiv hinsichtlich der Entfernung von nicht-spezifisch gebundenen Reporterproben, dass bei Verwendung einer konventionellen Reporterprobe mit einem radioaktiven Atom oder einer Fluoreszenzkomponente kein Hintergrund nachgewiesen werden kann (Thompson et al., 1989). Das reversible Targeteinfangen ist jedoch, schwierig und zeitaufwendig, maschinenintensiv und teuer.
Wenn amplifizierbare Reporterproben (Lizardi et al., 1988) in Verbindung mit dem reversiblen Targeteinfangen verwendet werden, können die Target-Nukleinsäuren in Proben in Konzentrationen nachgewiesen werden, die niedriger sind als die Konzentrationen, die mit konventionellen Reporterproben (Lomeli et al., 1989) nachgewiesen werden können. Die erzielten Assays stellen die empfindlichsten Hybridisierungs-Assays dar, die heute bekannt sind (Pritchard & Stefano, 1991).
Keiner der Assays, welche die oben beschriebenen Verfahren zur Reduktion des Hintergrundes verwenden, eliminiert vollständig diesen Hintergrund. Selbst die empfindlichsten von diesen Assays, welche das reversible Targeteinfangen verwenden, sind nicht ausreichend empfindlich, um den vollen Vorteil der Leistung auszunutzen, die von amplifizierbaren Reporterproben bereitgestellt wird. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass etwa 10.000 nicht-spezifisch gebundene Reporterproben selbst nach dreimaligem Kreislauf mit dem reversiblen Targeteinfangen (Lomeli et al., 1989) vorliegen. Dies schränkt die Empfindlichkeit des Assays auf Proben ein, die 10.000 Targetmoleküle oder mehr enthalten.
"Intelligente Proben", das heißt Proben, deren Fähigkeit zur Erzeugung eines Reportersignals von einer geeigneten Hybridisierung zu ihren Targets abhängig ist (das heißt, "Target-abhängig"), wurden als ein Weg vorgeschlagen, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Ein Beispiel für eine intelligente Probe ist eine Probe, die einen "molekularen Schalter" enthält, wo die Signalerzeugung von einer Konformationsänderung abhängig ist, die in der Probe stattfindet (Lizardi et al., 1992).
Ein anderes Beispiel für intelligente Proben, das veröffentlicht worden ist, ist eine "binäre DNA-Probe". Ein Paar von DNA-Reporterproben, die benachbart zueinander auf dem DNA- Targetmolekül angeordnet sind, hybridisiert und eine dieser Proben fungiert auch für die Immobilisierung der Hybride auf einer festen Oberfläche, was ein Waschen erlaubt. Die Proben können in einer Target-abhängigen Weise ligiert werden, nämlich durch eine Ligation mit einer DNA-abhängigen DNA-Ligase. Das ligierte Produkt, ein DNA-"Reportermolekül", kann selbst nachgewiesen werden, wenn eine Reporterprobe verwendet wird für die Immobilisierung der Proben-Target-Hybride an eine feste Oberfläche, und wenn die andere Reporterprobe ein radioaktives Atom oder eine Fluoreszenzkomponente enthält (Landegren et al., 1988; Landegren und Hood, 1991). Ein Probenpaar kann mit einem Target hybridisieren und dabei eine Lücke zwischen sich frei lassen. Die Lücke kann mit Deoxyribonukleotiden gefüllt und dann durch Ligation geschlossen werden (WO 90 0169A, Segen Diagnostics Inc. (1990)). Alternativ kann das DNA-Reportermolekül, welches an einer Oberfläche durch eine der binären Proben immobilisiert ist, entweder direkt oder indirekt amplifizierbar sein. Qβ- Replicase kann verwendet werden, um das DNA-Reportermolekül direkt zu amplifizieren, oder das DNA-Reportermolekül kann durch de Bakteriophagen T7 RNA-Polymerase transkribiert werden, um ein RNA-Transkript herzustellen, welches ein Templat für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ist, wie die Qβ-Replicase. In jedem Fall führt die exponentielle Amplifikation zu einem nachweisbaren Produkt, dessen Nachweis die Gegenwart der Target-Nukleinsäure anzeigt (Martinelli et al., 1992). Bei bekannten Assays mit binären Proben binden nicht- hybridisierte, immobilisierende Proben (das heißt, eine der binären DNA-Proben) an die feste Oberfläche, wie dies die nicht-hybridisierten Einfangproben in den Sandwichhybridisierungs- Assays tun, die unitäre Reporterproben verwenden.
Andere Assays verwenden Target-abhängige, signalerzeugende Reaktionen. Solche Reaktionen umfassen die Ligasekettenreaktion, LCR (Barany, 1991), die Polymerasekettenreaktion, PCR (Erlich et al., 1991), die Multienzym-Amplifikationsreaktion, 3SR (Guatelli et al., 1990), die Strangverdrängungs-Amplifikationsreaktion, SDA (Walker et al., 1992) und die Target-abhängige Replikationsreaktion, TDR (Kramer & Lizardi, 1989).
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, die Empfindlichkeit von Nukleinsäurehybridisierungs-Assays zu verbessern, vorzugsweise ein Assay bereitzustellen, der sowenig wie 100 Moleküle einer Target-Nukleinsäure nachweisen kann und dies vorzugsweise ohne Hintergrund, so dass negative Proben kein Signal erzeugen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, hochempfindliche Nukleinsäurehybridisierungs-Assays bereitzustellen, die nicht die Nachteile des reversiblen Targeteinfangens besitzen, das komplex, kostenintensiv, zeitaufwendig und maschinenintensiv ist.
Eine weitere Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines hochempfindlichen Assays, der mit der exponentiellen Amplifikation kompatibel ist, um den Nachweis von seltenen Target-Nukleinsäuren zu ermöglichen.
Es ist eine besondere Aufgabe dieser Erfindung einen hochempfindlichen Nukleinsäurehybridisierungs-Assay bereitzustellen, der ohne ein ausgerüstetes Labor, selbst unter Feldbedingungen durchgeführt werden kann. In dieser Hinsicht sind insbesondere Assays wünschenswert, die keine Partikel erfordern, sondern einen einfach zu verwendenden Feststoff.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, einen Nukleinsäurehybridisierungs-Assay mit quantitativ und qualitativ verbesserter Empfindlichkeit bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich werden.
In dieser Beschreibung sowie in den angehangenen Ansprüchen wird manchmal auf ein Molekül im Singular (zum Beispiel "eine Einfangprobe") Bezug genommen. Das gleiche gilt für einen Komplex (zum Beispiel "ein Proben-Target-Hybrid"). Es sei angemerkt, dass in Wirklichkeit viele Kopien verwendet oder hergestellt werden. Manchmal wird der Plural verwendet anstelle des Ausdrucks "Kopien von", was beschwerlich ist. Fachleute werden die Bedeutung aus dem Zusammenhang erkennen.
Die Assays gemäß dieser Erfindung sind Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assays, wobei damit gemeint ist, dass es sich um Nukleinsäurehybridisierungs-Assays handelt, die eine Immobilisierung eines Targets auf der Oberfläche eines Festkörpers und das Waschen des Festkörpers umfassen. Die Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assays nach dieser Erfindung umfassen wenigstens eine Verbesserung, vorzugsweise jedoch eine Kombination von Verbesserungen, um den Hintergrund zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu verbessern. Ein notwendiges Merkmal dieser Assays ist die Verwendung einer Einfangprobe, womit eine Probe gemeint ist, die nicht eine Reporterprobe ist und die verwendet wird, um entweder Targets oder Hybride aus Reporterprobe/Target auf der Oberfläche eines Festkörpers zu immobilisieren. Es kann mehr als eine Einfangprobe verwendet werden (damit sind wenigstens zwei Einfangproben gemeint, die mit verschiedenen Sequenzen des Targets hybridisierbar sind), wobei aber wenigstens eine Probe verwendet werden muss. Gemäß dieser Erfindung ist eine "Reporterprobe" auf eine Probe beschränkt, die nicht dazu dient, Reporterproben-Targets auf einer festen Oberfläche zu immobilisieren. Binäre Probenassays gemäß dem Stand der Technik umfassen nicht die Verwendung einer Einfangprobe. Sie verwenden vielmehr eine der binären Reporterproben als Mittel für die Immobilisierung von Hybriden aus Reporterprobe/Target auf einer festen Oberfläche. Somit sind die binären Reporterproben, die im Stand der Technik der binären Probenassays verwendet werden, keine "Reporterproben", wie dies für den Ausdruck gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich der angehangenen Ansprüche, gilt. Es wird angenommen, das dies eine bisher nicht gewürdigte Quelle von signifikantem Hintergrund bereitstellt, da viele (typischerweise 10¹&sup0; bis 10¹³) Kopien des immobilisierenden Reportergens nicht weggewaschen werden, was eine hohe Konzentration bereitstellt, um eine Target unabhängige Ligation zu favorisieren. Aus diesem oder einem anderen Grund wird eine signifikante Verbesserung erzielt, wenn eine getrennte Einfangprobe in einem binären Probenassay verwendet wird.
Ein zweites Merkmal der Assays gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Trennung der Targets oder der Hybride aus Reporterprobe/Target von den Einfangproben, wenn die Targets alleine oder die Hybride aus unitärem Target/Reporterprobe durch die Einfangproben immobilisiert werden, und bevorzugt, wenn die Hybride aus Target/binären Reporterproben durch die Einfangproben immobilisiert werden. Die Trennung wird durch Schneiden und anschließender Isolierung der Teile erzielt, das heißt, des Targets oder der Hybride aus Reporterprobe/Target. Mit "Schneiden" ist hier gemeint, dass Aufbrechen von wenigstens einer Phosphordiesterbindung an einer geeigneten Stelle oder Stellen in dem Target oder in der Einfangprobe.
Es wird angenommen, dass die einbechaltenen Einfangproben eine nicht erwünschte Quelle für einen bedeutenden Hintergrund darstellen, da viele (typischerweise 10¹³) Kopien der Einfangprobe Stellen für das nicht-spezifische Binden der Reporterproben darstellen. Die Gegenwart der Einfangproben kann auch einen signifikanten Hintergrund hervorrufen, wenn sie während des Nachweises des Reportermoleküls mittels Fluoreszenz vorhanden sind. Wenn binäre Proben verwendet werden, ist die Trennung der Einfangprobe bevorzugt, aber nicht essentiell für alle Ausführungen dieser Erfindung. Die Verwendung von binären Proben, einer getrennten Einfangprobe und das stringente Waschen oder das reversible Targeteinfangen wird in einigen Fällen die Anforderungen an die Empfindlichkeit befriedigen.
Die Verbesserungen nach der Erfindung hinsichtlich der Förderung der Empfindlichkeit sind in einem großen Umfang anwendbar auf Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assays. Das Target kann DNA oder RNA sein. Die Reporterprobe oder die Reporterproben können DNA oder RNA sein. Die Einfangprobe kann DNA oder RNA sein. Ferner kann die Einfangprobe chemisch synthetisierte Nukleotidanaloga enthalten, wie 2'-O-Methylnukleotide.
Bei Ausführungsformen, welche die Trennung der Hybride aus Reporterprobe/Target von den Einfangproben umfassen, ist weder die Natur der Reporterprobe oder der Proben noch das Verfahren für die Erzeugung eines nachweisbaren Signals kritisch. Die Probe kann unitär oder die Proben können binär sein. Eine unitäre intelligente Probe kann verwendet werden. Die Probe oder eine der binären Proben kann eine nachweisbare Komponente enthalten, die ein radioaktives Atom oder eine Fluoreszenzkomponente, oder kann ein Enzym umfassen, das mit einem farblosen Substrat inkubiert werden kann, um eine große Zahl an gefärbten Produkten zu erzeugen (Leary et al., 1983). Die signalerzeugenden Techniken, welche die exponentielle Amplifikation verwenden, sind bevorzugt. Die Reporterprobe oder das Reportermolekül kann ein Templat für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase sein (Lomeli et al., 1989). Andere exponentielle Amplifikationstechniken, die verwendet werden können, sind LCR, PCR, 3SR, SDA und TDR.
Bei Ausführungsformen, welche die Trennung der Targets von den Einfangproben umfassen, was als "Targetreinigung" bezeichnet wird, müssen die Assays eine Targetabhängige, signalerzeugende Technik aus der Gruppe von LCR, PCR, 3SR, SDA und TDR umfassen.
Das Verfahren für die Signalerzeugung ist nicht kritisch. Jedes geeignete Verfahren für die Signalerzeugung kann verwendet werden, wie das radioaktive Zählen oder die Tomographie, die Kolorimetrie, die Fluoreszenz oder die Lumineszenz. Der Signalnachweis kann "im Fluge" oder über die Zeit für den quantitativen Nachweis geschehen.
Der Typ der festen Oberfläche, auf der die Einfangprobe immobilisiert wird, ist nicht kritisch. Der Festkörper kann ein Partikel sein, ein Messstab oder die Oberfläche einer Röhre. Jede geeignete Immobilisierungstechnik kann verwendet werden und zwar in Abhängigkeit, ob die Immobilisierung permanent oder reversibel ist, wie bei dem reversiblen Targeteinfangen. Bei den Ausführungsformen mit den binären Proben ist eine Ligation in einer Target- abhängigen Weise erforderlich, wobei das Verfahren nicht kritisch ist. Eine Protein- oder Ribozymligase kann verwendet werden sowie ein nicht enzymatisches Verfahren, wie eine chemische Ligation, eine lichtinduzierte Ligation oder eine Eigenligation.
Bei den Ausführungsformen mit einer binären Probe, wo die Trennung der Einfangproben angewandt wird, kann die Ligation der Trennung vorhergehen oder anschließend erfolgen, wobei aber eine Ligation nach Trennung bevorzugt ist. Ferner ist die Art, in der die Einfangproben isoliert werden, nicht kritisch. Verfahren für die Abtrennung einer Festphase von einer Flüssigphase sind gut bekannt, was in typischerweise das Ansaugen und das Dekantieren umfasst. Die Trennung von der Einfangprobe (oder den Einfangproben) wird vorzugsweise ohne ein reversibles Targeteinfangen durchgeführt, wobei aber eine Kombination der Techniken verwendet werden kann. Ohne das reversible Targeteinfangen kann die Einfangprobe oder die Einfangproben permanent an einer festen Oberfläche gebunden werden, zum Beispiel wenn der Schwanz der Einfangprobe eine Biotinkomponente hat und wenn die Oberfläche der Partikel kovalent gebundene Streptavidinmoleküle oder Avidinmoleküle zur Bindung des Biotins besitzt.
Bei den Ausführungsformen, welche die Trennung von den Einfangproben umfassen, verwenden bevorzugte Ausführungsformen das Schneiden mit der Ribonuklease H ("RNase H"), die RNA schneidet, welche an DNA hybridisiert wird. Eine DNA-Einfangprobe wird für ein RNA-Target verwendet, wobei dann das Target geschnitten wird. Eine RNA-Einfangprobe wird für ein DNA-Target verwendet, wobei dann die Einfangprobe geschnitten wird.
Bevorzugte Ausführungsformen nach der Erfindung sind Assays für RNA-Targets, da RNA-Targets, die für den Nachweis geeignet sind, in den meisten Fällen häufiger in Proben vorliegen als entsprechende DNA-Targets.
Für sehr empfindliche Assays ist die exponentielle Amplifikation der Reporterproben entweder direkt oder indirekt (nach Transkription) bevorzugt. Assays, die amplifizierbare Reporterproben verwenden, können theoretisch bis zu einem Targetmolekül nachweisen, da eine einzelne amplifizierbare Reporterprobe als Templat für die Erzeugung von Milliarden von seinen Kopien dienen kann (Levisohn und Spiegelman, 1968), was zum Nachweis der Ursprungsreporterprobe führt. Die praktische Beschränkung des Nachweises ist festgelegt durch die Effizienz des Verfahrens, welches die Reporterproben, die nicht an den Targetmolekülen hybridisiert sind, entfernt. Die Empfindlichkeit des Assays, der das reversible Targeteinfangen verwendet, ist beschränkt auf die Persistenz der nicht-spezifisch gebundenen Reporterproben, wie dies oben dargestellt wurde. Durch die vorliegende Erfindung wird das Maß der Beständigkeit der nicht-hybridisierten Reporterproben deutlich reduziert, was Assays mit einer tausendfach größeren Empfindlichkeit und mehr erlaubt.
Bevorzugte Ausführungsformen nach der Erfindung verwenden amplifizierbare binäre Proben. Dies bedeutet Proben, die, wenn sie miteinander ligiert sind (und nur, wenn sie miteinander ligiert sind), ein Reportermolekül bilden, das exponentiell amplifiziert werden kann oder das als Templat für die Erzeugung eines Moleküls dient, das exponentiell amplifiziert werden kann. Bei bevorzugten Ausführungsformen nach der Erfindung umfasst die Gruppe der Reportermoleküle, die durch die Ligation von zwei binären Proben gebildet werden können: 1) rekombinante RNA, die direkt exponentiell durch die Inkubation mit einer kompatiblen RNA-abhängigen RNA-Polymerase amplifiziert werden können (Miele et al., 1983); 2) DNA-Template, die einen Promoter (oder eine Sequenz, die durch Inkubation mit einer DNA-Polymerase verlängert werden kann, um einen Promoter zu bilden) und eine Sequenz umfassen, die für eine RNA codiert, welche mit der DNA-abhängigen RNA- Polymerase, die kompatibel mit dem Promoter ist, transkribiert werden kann, so das die Transkripte dann exponentiell durch Inkubation mit einer kompatiblen RNA-abhängigen RNA- Polymerase amplifiziert werden können; und 3) DNAs oder RNAs, die als Template für eine exponentielle Amplifikationsreaktion dienen können, wie LCR, PCR, 3SR, SDA und TDR.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden feste Oberflächen mit kovalent gebundenem Streptavidin und verwenden Einfangproben, die eine Biotinkomponente enthalten, so dass die Einfangproben permanent an die Oberfläche der Partikel gebunden werden können. Obwohl bevorzugte Ausführungsformen im Labor paramagnetische Partikel als Festkörper verwenden, besteht ein Aspekt des Schneidens/Abtrennung gemäß der vorliegenden Erfindung darin, dass sie Assays ermöglicht, die kein gut ausgerüstetes Labor erfordern. Messstäbe oder Reaktionsgefäße (Teströhrchen) können als Festkörper für einen Assay dienen, der besonders für die Durchführung unter Feldbedingungen angepasst ist.
Bevorzugte Ausführungsformen nach der Erfindung verwenden binäre Proben, eine getrennte Einfangprobe und die Trennung der Hybride aus binärer Probe/Target von den Einfangproben (wodurch die Target unabhängigen Hybride deutlich reduziert werden, die sich aus binären Proben bilden, welche nicht-spezifisch an die Einfangproben gebunden werden). Bei diesen bevorzugten Ausführungsformen ist ein einzelner Waschzyklus ausreichend, um die nicht-hybridisierten, binären Proben, die nicht-hybridisierten, zellulären Nukleinsäuren und alle anderen zellulären Materialien zu entfernen. Vorzugsweise wird die Trennung vor der Ligation durchgeführt.
Bevorzugte Ausführungsformen nach der Erfindung sind Assays für RNA-Targets, wobei binäre Proben aus RNA und eine Target-abhängige RNA-Ligase verwendet werden. Es kann entweder eine DNA-abhängige DNA-Ligase oder eine Ribozymligase als RNA-abhängige RNA-Ligase verwendet werden. Als DNA-abhängige DNA-Ligase wird bevorzugt die Bakteriophagen T4 DNA-Ligase oder die E. coli DNA-Ligase verwendet. Als Ribozymligase wird bevorzugt die Tetrahymena-Ribozymligase verwendet (Doudna & Szostak, 1989). Eine andere Ausführungsform der Erfindung verwendet RNA-Targets, binäre Proben aus DNA und eine geeignete DNA-Ligase, wie die T4 DNA-Ligase.
In bevorzugten Ausführungsformen, die binäre Proben verwenden, die bei Ligation mit sich selber (und nur, wenn sie miteinander ligiert werden) ein Reportermolekül bilden, welches entweder direkt oder indirekt exponentiell amplifiziert werden kann, ist es bevorzugt, dass das Molekül, welches exponentiell amplifiziert werden kann, ein Templat für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die RNA-abhängige RNA-Polymerase eine Bakteriophagen RNA-abhängige RNA-Polymerase, wie die Qβ-Replicase, MS2-Replicase oder die SP-Replicase. In der am meisten bevorzugtesten Ausführungsform ist die RNA- abhängige RNA-Polymerase die Qβ-Replicase. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die RNA-abhängige RNA-Polymerase aus eukaryotischen Zellen isoliert, die mit einem Virus infiziert sind, wie Zellen, die infiziert sind mit dem Trespenmosaik-Virus, Cowpeamosaik- Virus, Gurkenmosaik-Virus oder dem Polio-Virus. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die RNA-abhängige RNA-Polymerase die T7 RNA-Polymerase (Konarska und Sharp, 1989).
Bei Ausführungsformen, bei denen das Molekül, welches exponentiell amplifiziert werden kann, eine rekombinante RNA ist, die als Templat für die Qβ-Replicase dient, ist es bevorzugt, dass die Sequenz des rekombinanten Templates von der Sequenz einer RNA gemäß der folgenden Gruppe abstammt: MDV-1 RNA, mikrovariante RNA, nanovariante RNA, CT RNA, RQ135 RNA, RQ120 RNA und Qβ RNA. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist RNA die MDV-1 RNA.
Bei den Ausführungsformen, bei denen das Molekül, welches exponentiell amplifiziert werden kann, eine rekombinante RNA ist, die eine MDV-1 RNA-Sequenz umfasst, in die eine Probensequenz eingelagert worden ist (Lizardi et al., 1988 und Lomeli et al., 1989), kann die Probensequenz an jeder Stelle innerhalb der Sequenz von MDV-1 RNA eingesetzt werden. Obgleich bevorzugte Orte für die Einsetzung einer Sequenz in die MDV-1 RNA (und tatsächlich für die Insertion einer Probensequenz in jedes andere RNA-Templat für eine RNA- abhängige RNA-Polymerase) solche sind, die in Haarnadelschleifen vorliegen, welche an dem äußeren Rand des Moleküls in Regionen angeordnet sind, die entfernt von den Regionen vorliegen, die für eine Replikation erforderlich sind (Miele et al., 1983), kann die Probensequenz an jeder Stelle eingefügt werden und die erzielte Rekombinante kann getestet werden, um zu sehen, ob sie exponentiell replizierbar ist. Verfahren für die Identifizierung von möglichen Haarnadelschleifen, die als geeignete Insertionsstellen dienen können, Verfahren für die Herstellung der gewünschten rekombinanten RNAs sowie Verfahren für das Testen der erzielten Rekombinanten, um zu sehen, ob sie exponentiell durch Inkubation mit einer kompatiblen RNA-abhängigen RNA-Polymerase repliziert werden können, sind solche Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind.
In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die exponentiell amplifizierbaren, rekombinanten RNAs eine eingefügte Probensequenz, die zwischen 30 und 80 Nukleotiden lang ist. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform enthalten die exponentiell amplifizierbaren, rekombinanten RNAs eine inserierte Probensequenz, die etwa 40 Nukleotide lang ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Weg, bei dem die Sequenz der exponentiell amplifizierbaren, rekombinanten RNA in "Hälften" für die Einlagerung in die Sequenz von jeder binären Probe aufgeteilt ist, derjenige, wo die Sequenz der exponentiell amplifizierbaren, rekombinanten RNA in der Mitte der Probensequenz aufgeteilt ist. Um dieses Konzept darzustellen, sei angenommen, dass die exponentiell amplifizierbare, rekombinante RNA auf einer Sequenz basiert, die 220 Nukleotide lang ist, und das die Rekombinante eine eingelagerte Probensequenz enthält, die 40 Nukleotide lang ist, und das die Probensequenz zwischen den Nukleotiden 60 und 61 der 220 Nukleotid langen Sequenz eingefügt ist (was zu einer Sequenz von 260 Nukleotiden führt). Dann würde in einer bevorzugten Ausführungsform die linke Probe eine Sequenz umfassen, die aus den ersten 60 Nukleotiden der 220 Nukleotid langen Sequenz besteht und sofort benachbart dazu (an einem Ende der binären Probe, zum Beispiel an dem 3'-Ende) würden die ersten 20 Nukleotiden der 40 Nukleotid langen eingelagerten Probesequenz sein; die rechte binäre Probe würde die zweiten 20 Nukleotiden der 40 Nukleotid langen, eingelagerten Probesequenz (an dem 5'-Ende der binären Probe) umfassen und sofort benachbart dazu würden die verbleibenden 160 Nukleotiden der 220 Nukleotid langen Sequenz vorliegen.
Wenn die binäre Probe aus RNA besteht und sie durch Transkription von DNA- Templaten hergestellt werden, ist es bevorzugt, dass die binäre Probe, die an ihrem 5'-Ende eine Probensequenz hat, mit Guanosin beginnt, da Guanosin als 5'-Nukleotid bei Synthesen bevorzugt ist, welche bekannte DNA-abhängige RNA-Polymerasen verwenden.
Wenn die binären Proben aus RNA bestehen und eine Ribozymligase verwendet wird, um die binären Proben zu verknüpfen, ist es notwendig, dass die binäre Probe, die an ihrem 5'-Ende eine Probensequenz hat, ein zusätzliches Guanosin an ihrem 5'-Ende enthält. Dieses Guanosin wird durch das Ribozym entfernt, wenn die binären Proben miteinander ligiert werden.
Wenn die binären Proben aus DNA bestehen und eine von ihnen einen Promoter besitzt (oder eine Sequenz, die durch Inkubation mit einer DNA-Polymerase verlängert werden kann, um einen Promoter zu bilden) und wenn sie miteinander ligiert werden, besitzt die erzielte DNA eine Sequenz, die für eine RNA codiert, die durch eine RNA-Polymerase, die mit dem Promoter kompatibel ist, transkribiert werden kann, wobei es dann eine Reihe von bevorzugten Ausführungsformen hinsichtlich des Aufbaus der binären Proben gibt. Diese bevorzugten Ausführungsformen umfassen: 1) eine binäre Probe, die für eine Promotersequenz codiert, sollte eine Haarnadelstruktur an ihrem 3'-Ende haben, wobei der Stamm davon entweder einen (doppelsträngigen) Promoter umfasst oder durch Inkubation mit einer DNA-Polymerase verlängert werden kann, um einen (doppelsträngigen) Promoter zu bilden, wodurch die Anforderung beseitigt wird, dass ein separater komplementärer DNA- Strang vorhanden sein muss, um mit der Sequenz, die für den Promoter codiert, zu hybridisieren, um einen funktionellen Promoter zu bilden; 2) wenn eine binäre Probe eine Haarnadelstruktur an ihrem 3'-Ende enthält, die einen (doppelsträngigen) Promoter umfasst, ist es bevorzugt, dass dieses 3'-Ende als Primer für seine eigene Verlängerung durch Inkubation mit einer DNA-Polymerase verwendet wird, was zu der Erzeugung eines doppelsträngigen Templates für die Transkription mit einer kompatiblen DNA-abhängigen RNA-Polymerase führt und so die hemmenden Wirkungen der Gegenwart der Haarnadelstrukturen auf die Transkription eliminiert (wenn das Templat einzelsträngig bleibt); und 3) es ist bevorzugt, dass eine binäre Probe, die für eine Promotersequenz codiert, nicht für die Region der amplifizierbaren rekombinanten RNA codiert, welche die Bindungsstelle für die kompatible RNA-abhängige RNA-Polymerase umfasst, was zu einem Aufbau führt, der sicherstellt, dass die kurzen Transkripte, die von dieser binären Probe (falls sie nicht ligiert ist) synthetisiert werden können, nicht in der Lage sind, sich zu replizieren.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Verfahren für den Nachweis: 1) den Einbau eines radioaktiven Nukleotides in die RNA während der Amplifikation und 2) das Binden eines Moleküls, wie Ethidiumbromid oder Propidiumiodid, das fluoreszierend wird, wenn es an die amplifizierte RNA bindet.
Unter Verwendung von amplifizierbaren binären RNA-Proben, getrennten DNA- Einfangproben, abspalten der Hybride aus Reporterproben/Target von den Einfangproben durch Inkubation mit RNase H und Isolieren der Hybride aus Reporterproben/Target von Partikeln, welche die Einfangproben enthalten, wurde gezeigt, dass ein Assay nach der Erfindung RNA-Targetmoleküle qualitativ und quantitativ in Mengen detektieren kann, die sich von 100 bis 10.000.000 Molekülen pro Probe erstrecken sowie eine HIV-1 infizierte, menschliche Lymphocytenzelle in einer Probe detektieren kann, die 100.000 nicht infizierte menschliche Lymphocytenzellen enthält, wobei dies ohne Hintergrundsignal für Proben, die keine Targetmoleküle enthalten, sowie für Proben, die keine infizierten Zellen enthalten, möglich ist. Dieses Maß an Empfindlichkeit wird ohne Rückgriff auf das reversible Targeteinfangen erzielt.
Die Erfindung umfasst auch diagnostische Kits für vorausgewählte Targets. Die Kits nach der Erfindung können eine unitäre Reporterprobe, wenigstens eine Einfangprobe, ein Abspaltungsmittel sowie Instruktionen für die Durchführung eines diagnostischen Assays enthalten. Die Kits können ein Paar von binären Proben, wenigstes eine Einfangprobe und Instruktionen enthalten. Bevorzugte Kits enthalten ein Paar von binären Proben, wenigstens eine Einfangprobe, ein Abspaltungsmittel und Instruktionen. Bevorzugte Kits können auch Enzyme (zum Beispiel RNase H, T4 DNA-Ligase und Qβ-Replicase) und wahlweise andere Reagenzien umfassen.
Eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich besonders bevorzugter Ausführungsformen, folgt in der anschließenden detaillierten Beschreibung.
Fig. 1 zeigt ein Assay nach Beispiel 1.
Fig. 2 zeigt die Sequenzen der Proben von Beispiel 1.
Fig. 3 zeigt die Herstellung von binären Proben von Beispiel 1.
Fig. 4 zeigt die typischen Ergebnisse eines Assays gemäß Beispiel 1 für bekannte Mengen eines Targetmoleküls.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse eines Assays gemäß Beispiel 1 für bekannte Mengen an infizierten Zellen.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines anderen Assays nach Beispiel 1 für bekannte Mengen an infizierten Zellen.
Fig. 7 zeigt das Assay nach Beispiel 2.
Fig. 8 zeigt die Sequenzen der Proben von Beispiel 2.
Fig. 9 zeigt das Assay von Beispiel 3.
Fig. 10 zeigt das Assay von Beispiel 4.
Wie erwähnt, ist diese Erfindung breit anwendbar für Nukleinsäure- Sandwichhybridisierungs-Assays, die Reporterproben und getrennte Einfangproben verwenden, das heißt, Einfangproben die keine Reporterproben darstellen.
Es wird wenigstens eine Einfangprobe verwendet, wahlweise mehr als eine Einfangprobe, wie in dem am meisten bevorzugten, hochempfindlichen Assay, der im nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben wird. Die Verwendung von zwei Einfangproben im Gegensatz zu einer Einfangprobe erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein gegebenes Targetmolekül eingefangen wird, da der Vorgang des Einfangens nicht zu 100% wirksam ist.
Es ist wünschenswert, dass die Hybride aus Einfangprobe/Target stabil sind, so dass die Hybride nicht während des Assays verloren gehen. Fachleute sind in der Lage, eine geeignete Hybridlänge auszuwählen, die ausreichend lang ist, um den Verarbeitungsbedingungen eines bestimmten Assays zu wiederstehen. Im allgemeinen sind 30-50 Basenpaare als Hybridlängen bei Hybriden aus Einfangprobe/Target bevorzugt, was die Länge des Kopfes (in Nukleotiden) der Einfangprobe definiert. Der Schwanz der Einfangprobe oder der Einfangproben wird verwendet, um die Einfangprobe zu immobilisieren und sie mit einer festen Oberfläche zu hybridisieren, wobei dies entweder permanent oder reversibel geschieht. Wenn die Trennung der Einfangprobe oder Proben gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der Schwanz der Einfangprobe eine Biotingruppe ist, die mit einer Streptavidin-beschichteten, festen Oberfläche reagieren wird. Zwischen dem Kopf einer Einfangprobe und dem Schwanz ist ein Abstandsstück, im allgemeinen eine Oligonukleotidsequenz. Es werden Assays bevorzugt, bei denen die Hybridisierungen und die Ligationen in Lösung durchgeführt werden, das heißt, wenn die Targets nicht an eine feste Oberfläche immobilisiert sind. Charakteristisch für solche bevorzugten Assays ist, dass das Abstandsstück ziemlich kurz sein kann. Bevorzugte Abstandsstücke sind 3-8 Nukleotiden lang.
Der Schneideschritt und das oder die Schneidemittel, die geeignet sind, hängen von der Natur der Target-Nukleinsäure ab, der Natur der Einfangproben und von der Natur der Reporterproben, falls vorhanden. Im allgemeinen können acht verschiedene Situationen auftreten. Die Tabelle 1 identifiziert jede Situation durch eine römische Ziffer. Tabelle 1
Die folgenden neun Schneidetechniken zeigen die Vielzahl der Wege, mit denen die Hybride aus Reporterprobe/Target von Einfangproben durch Schneidemittel freigesetzt werden können, wobei hier auf die Situationen in der Tabelle 1 verwiesen wird.
1. Schneiden eines RNA-Targets mit einer Einzelstrang-spezifischen Ribonuklease (wie die Ribonuklease A oder die Ribonuklease T1) (Situation IV). Da diese Ribonukleasen keine DNA spalten, werden nicht-spezifisch gebundene Reporterproben von den Einfangproben nicht freigesetzt. Eine Ausführungsform von dieser Technik ist in Beispiel 6 beschrieben. Diese Schneidetechnik ist nicht anwendbar auf die Targetreinigung.
2. Ortsspezifisches Schneiden eines RNA-Targets mit einem Ribozym (Situation I, II, III und IV). Da das Ribozym eine bestimmte Stelle in der Target-RNA schneidet (Haseloff & Gerlach, 1988), wird dem Assay ein drittes Element der Spezifität hinzugefügt. Das Schneiden der Target-RNA geschieht in der Region zwischen den Stellen im Target, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden, so dass das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche freigesetzt wird. Zwei Ausführungen von dieser Technik sind im Beispiel 3 beschrieben.
3. Ortsspezifisches Schneiden eines RNA-Targets mit Ribonuklease III ("RNase III") unter Verwendung einer ortsidentifizierenden Probe aus RNA (Situation IV). Die ortsidentifizierende Probe ist komplementär zu einer vorausgewählten Stelle in dem Target, die in der Region zwischen den Stellen auftritt, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden. Die ortsidentifizierende Probe ist in der Originalhybridisierungsmischung enthalten. Da die Ribonuklease III nur doppelsträngige RNA an besonderen Sequenzen schneidet (Krinke & Wulff, 1990), wird ein drittes Element der Spezifität dem Assay hinzugefügt. Das Schneiden der Target-RNA geschieht in der Region zwischen den Stellen, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden, wodurch das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche freigesetzt wird. Es wurde experimentell gefunden, dass die Ribonuklease III fast alle doppelsträngigen RNAs schneidet, sofern sie ausreichend lang sind. Aus diesem Grund ist die Verwendung der Ribonuklease III in den Situationen I, II, III nicht bevorzugt. Eine Ausführungsform von dieser Technik ist in Beispiel 4 beschrieben.
4. Ortsspezifisches Schneiden eines RNA-Targets mit der Ribonuklease H unter Verwendung einer ortsidentifizierenden Probe aus DNA (Situation I). Die ortsidentifizierende Probe ist komplementär zu einer vorausgewählten Stelle in dem Target, die in der Region zwischen den Stellen auftritt, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden. Die ortsidentifizierende Probe ist in der Originalhybridisierungsmischung enthalten. Da die Ribonuklease H nur RNA schneidet, die mit DNA hybridisiert ist, ist das Schneiden auf den Ort beschränkt, wo die ortsidentifizierende Probe bindet. Die Verwendung einer ortsidentifizierenden Probe führt ein drittes Element der Spezifität in den Assay ein. Das Schneiden der Target-RNA geschieht in der Region zwischen den Stellen, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden, wodurch das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche freigesetzt wird.
5. Ortsspezifisches Schneiden eines DNA-Targets mit einer Restriktionsendonuklease unter Verwendung einer ortsidentifizierenden Probe aus DNA (Situation V, VI, VII und VIII). Die ortsidentifizierende Probe ist komplementär zu einer vorausgewählten Stelle in dem Target, die in der Region zwischen den Stellen auftritt, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden. Die ortsidentifizierende Probe ist in der Originalhybridisierungsmischung enthalten. Da die Restirktionsendonuklease nur doppelsträngige DNA an bestimmten Sequenzen schneidet, wird ein drittes Element der Spezifität dem Assay hinzugefügt. Das Schneiden der Target-DNA geschieht in der Region zwischen den Stellen, wo die Einfangprobe und die Reporterprobe binden, wodurch ein Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche freigesetzt wird.
6. Schneiden eines RNA-Targets mit der Ribonuklease H an der Stelle, wo der Kopf einer DNA-Einfangprobe gebunden ist (Situation III). Da die Ribonuklease H nur RNA, die an DNA hybridisiert ist, schneidet, ist das Schneiden auf diese spezifische Stelle limitiert. Durch geeigneten Aufbau der Einfangprobe, was von Fachleuten vollständig erkannt werden wird, zerstört das Schneiden der Target-RNA das Hybrid aus Einfangprobe/Target und setzt so das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche frei. Eine Ausführungsform von dieser bevorzugten Technik ist in Beispiel 1 beschrieben.
7. Schneiden einer RNA-Einfangprobe mit der Ribonuklease H an der Stelle, wo ein DNA-Target gebunden ist (Situation VII). Da die Ribonuklease H nur RNA, die an DNA hybridisiert ist, schneidet, ist das Schneiden auf diese spezifische Stelle beschränkt. Durch geeigneten Aufbau der Einfangprobe, was von Fachleuten vollkommen erkannt werden wird, zerstört das Schneiden des Kopfes der Einfangprobe das Hybrid aus Einfangprobe/Target und setzt so das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche frei. Eine Ausführungsform von dieser Technik ist in Beispiel 8 beschrieben.
8. Schneiden eines RNA-Target mit der Ribonuklease III an der Stelle, wo der Kopf einer RNA-Einfangprobe gebunden ist (Situation II). Da die Ribonuklease III nur doppelsträngige RNA schneidet, ist das Schneiden auf diese spezifische Stelle beschränkt. Das Schneiden von beiden Strängen der RNA in dem Hybrid aus Einfangprobe/Target setzt das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche frei. Eine Ausführungsform von dieser Technik ist in Beispiel 5 beschrieben.
9. Schneiden eines DNA-Targets mit einer Restriktionsendonuklease an der Stelle, wo der Kopf einer DNA-Einfangprobe gebunden ist (Situationen VII und VIII). Das Schneiden von beiden Strängen der DNA in dem Hybrid aus Einfangprobe/Target setzt das Hybrid aus Reporterprobe/Target von der festen Oberfläche frei. Eine Ausführungsform von dieser Technik ist in Beispiel 7 beschrieben.
Die Assays nach der Erfindung verwenden bestimmte Assay-Techniken, die von Fachleuten für Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assays vollkommen verstanden werden.
Die Techniken werden für Ausführungsformen beschrieben, bei denen die Hybride aus Reporterprobe(n)/Target von den Einfangproben getrennt sind. Ein großer Überschuss von Reporterproben und Einfangproben wird einer Probe unter Bedingungen zugesetzt, die eine Hybridisierung fördern. Die Hybridisierung geschieht vorzugsweise in Lösung. Eine Vor- Immobilisierung der Einfangproben an einer festen Oberfläche ist nicht bevorzugt und ist andererseits aber auch nicht ausgeschlossen. Die Immobilisierung über die Schwänze der Einfangproben folgt, nachdem der Überstand entfernt und der Festkörper, vorzugsweise heftig, gewaschen wurde. Ein klarer Überstand wird dann zugesetzt. Falls verwendet, setzt das Schneiden die Hybride aus Reporterprobe/Target in dem Überstand frei, der dann von dem Festkörper, der die Einfangproben enthält, isoliert wird und zwar durch Dekantieren oder Ansaugung. Wenn binäre Proben verwendet werden, werden sie vorzugsweise an diesem Punkt des Assays ligiert.
Es folgen die Amplifikation, falls gewünscht, und der Nachweis. Verschiedene Nachweismethoden sind gut bekannt, wie die Bestrahlung (Verwendung eines radioaktiven Nukleotidtriphosphates), Kolorimetrie (zum Beispiel Verwendung eines Enzyms, das eine Farbänderung in einem Substrat bewirken kann), Fluoreszenz (zum Beispiel Verwendung eines Farbstoffes, wie Propidiumiodid) und Lumineszenz (zum Beispiel Verwendung eines alkalischen Phosphatase-Substrates, welches Photonen beim Schneiden freisetzt). Der Nachweis kann qualitativ und quantitativ erfolgen, wie dies nachfolgend diskutiert wird.
Bevorzugte Ausführungsformen verwenden Isolierungsverfahren, bei denen die Einfangproben, die an die Partikel gebunden sind, physikalisch aus der Lösung entfernt werden können, welche die freigesetzten Hybride aus Reporterprobe/Target enthält. Wenn nicht-magnetische Partikel verwendet werden, kann eine Zentrifuge verwendet werden, um die Partikel an den Boden der Testgefäße zu bringen, wobei dann der Überstand, der die Hybride aus Reporterprobe/Target enthält, durch Ansaugung entfernt werden kann. Wenn die Partikel magnetisch sind (was bevorzugt ist, da eine Zentrifuge dann nicht notwendig ist), kann ein Magnet verwendet werden, um die Partikel an den Wänden des Testgefäßes zu ziehen, wobei dann der Überstand, der die Hybride aus Reporterprobe/Target enthält, entfernt werden kann.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden paramagnetische Partikel, die Streptavidin enthalten, welches kovalent an den Oberflächen gebunden ist, sowie Einfangproben, die eine Biotinkomponente an ihren Schwänzen enthalten (sodass die Einfangproben permanent an die Oberfläche der Partikel oder an Perlen gebunden werden können).
Bevorzugte Ausführungsformen des Assays gemäß der Erfindung, insbesondere für hochempfindliche Assays, sind Assays für RNA-Targets und sie verwenden RNA- Reporterproben, die das Potential zur Erzeugung eines einfach nachweisbaren, amplifizierten Signals von selbst einem einzelnen Reportermoleküls besitzen, und verwenden ferner wenigstens eine DNA-Einfangprobe und die Ribonuklease H.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden Reporterproben, die binäre Hybridisierungsproben sind. Keine dieser Proben immobilisiert das Target auf einer festen Oberfläche, da diese Proben in einer Target-abhängigen Reaktion nur miteinander ligiert werden können, wenn sie korrekt benachbart zueinander hybridisiert werden. Wenn sie ligiert sind, formen die Proben ein rekombinantes Reportermolekül, das exponentiell amplifizierbar ist mit der Qβ-Replicase und zwar entweder direkt (als Templat für die Replicase dienend) oder indirekt (als Transkriptionstemplat dienend, wobei die Transkripte dann als Template für die Replicase wirken). Am bevorzugtesten sind Assays für RNA-Targets, die DNA-Einfangproben und binäre RNA-Proben verwenden. Die Verfahren nach der Erfindung sind insbesondere attraktiv, wenn binäre Hybridisierungsproben verwendet werden, wo die Ligations- und Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden, ohne dass die Gegenwart von festen Oberflächen stören. Im Gegensatz dazu verwenden bekannte Verfahren, die binäre Hybridisierungsproben anwenden, eine dieser binären Proben für die Immobilisierung der Hybride aus Probe/Target (Landegren et al., 1988 und Martinelli et al., 1992). Diese Verfahren haben den Nachteil, dass feste Oberflächen während der Ligation vorliegen.
Eine wichtige Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Assay, der sehr geringe Mengen an Targetmolekülen nachweisen kann, so wenig wie 100 in einer Probe, ohne das ein Hintergrundsignal bei negativen Proben auftritt. Beispiel 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform von solch einem Assay. Das Assay nach Beispiel 1 ist ein Assay für ein RNA-Target unter Verwendung von binären RNA-Reporterproben, deren Ligation ein RNA- Reportermolekül erzeugt, das direkt durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, in diesem Fall Qβ-Replicase, amplifizierbar ist. Die Verwendung einer getrennten Einfangprobe erlaubt das Wegwaschen von nicht benutzten Kopien der binären Reporterproben vor der Ligation der binären Reporterproben. Die Ligation ist Target-abhängig. Die Target-unabhängie Ligation, von der angenommen wird, dass sie eine Quelle für den Hintergrund darstellt, wird durch das Wegwaschen der beiden binären Reporterproben stark reduziert im Vergleich zu einer binären Reporterprobe, die in hoher Konzentration immobilisiert an einer festen Oberfläche vorliegt.
Selbst mit diesen Verfahren verbleiben nicht-spezifisch gebundene Reporterproben als Ursache für den Hintergrund erhalten. Ein reversibles Targeteinfangen ist eine Technik, welches diese Quelle am Hintergrund auf ein niedriges Niveau, das für viele Assays akzeptabel ist, reduzieren kann. Das reversible Targeteinfangen hat jedoch signifikante Nachteile. Zunächst ist es kostenintensiv, zeitaufwendig, komplex und maschinenintensiv. Zweitens gibt es die Möglichkeit des Verlustes von einigen Hybriden aus Reporterprobe/Target bei jeder Runde des reversiblen Targeteinfangens. Drittens wird angenommen, dass die Einfangproben selbst Stellen für das nicht-spezifische Binden der Reporterproben darstellen. Bei dem reversiblen Targeteinfangen werden alle Einfangproben zurückgehalten und zwar die wenigen, die an Targets gebunden sind, und der große Überschuss, der nicht an Targets gebunden ist.
Das Assay nach Beispiel 1 berücksichtigt alle diese Nachteile. Hybride aus Reporterprobe/Target werden von beiden Einfangproben durch Schneiden der Hybride aus Reporterprobe/Target/Einfangprobe mit Ribonuklease H getrennt. Dieses Schneiden setzt die Hybride aus Reporterprobe/Target frei und lässt die Einfangproben und die nicht-spezifisch daran gebundenen Reporterproben zurück an der Oberfläche Festkörpers (im Beispiel 1 ist der Festkörper durch paramagnetische Partikel dargestellt), was eine einfache physikalische Trennung erlaubt. Die Ligation wird nach dieser Trennung durchgeführt. Eine Amplifikation direkt mit Qβ-Replicase und ein Nachweis folgen.
Durch diese Kombination der Schritte wurde der Hintergrund aufgrund der nicht- spezifischen Hybridisierung auf Null reduziert. Der erzielte Assay war ausreichend empfindlich, umso wenig wie 100 Target-Nukleinsäuremoleküle nachzuweisen. Schließlich und am wichtigsten war es möglich durch Kombination der Verwendung einer intelligenten Probe, zum Beispiel binäre Reporterproben, und einer getrennten Einfangprobe mit einem Schritt, der die Hybride aus Reporterprobe/Target von den Einfangproben trennt, diese extrem empfindlichen Assays durchzuführen, ohne das ein Rückgriff auf das kostenträchtige, zeitaufwendige, komplexe und maschinenintensive, reversible Targeteinfang-Verfahren notwendig war. Demgemäss können empfindliche Hybridisierungsassays auf Messstreifen durchgeführt werden, wobei einfache Waschtechniken genutzt werden, die im Allgemeinen bei klinischen Immunassays zur Anwendung kommen.
Wie bereits früher vermerkt, umfasst die Erfindung auch Kits für die Durchführung der Assays gemäß der Erfindung. Ein bevorzugter Kit kann einige oder alle der folgenden Gegenstände enthalten:
1. 5 M Guanidinthiocyanat (GuSCH)-Puffer für die Lyse der Zellen in klinischen Proben;
2. eine Mischung, die Einfangproben und Reporterproben enthält, vorzugsweise binäre Proben, für ein vorausgewähltes Nukleinsäuretarget;
3. einen Festkörper, wie ein Messstreifen, ein Reaktionsgefäß oder paramagnetische Partikel, mit daran kovalent gebundenem Streptavidin;
4. eine magnetische Trennvorrichtung;
5. Nukleotide;
6. Ribonuklease H, T4 DNA-Ligase und Qβ-Replicase;
7. Puffer für die Ligation und die Amplifikation;
8. Reagenzien für den Nachweis der amplifizierten Reporter, wie radioaktives alpha-P²²- Cytidintriphosphat oder Propidiumiodid;
9. falls die binären Proben aus DNA bestehen, das Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase und T7 RNA Polymerase; und
10. Instruktionen für die Durchführung des Assays gemäß der Erfindung.
Ein "nacktes" Kit kann nur binäre Reporterproben, wenigstens eine Einfangprobe und die Instruktionen, also die Gegenstände 2 und 10 enthalten. Ein anderes Kit kann eine unitäre Reporterprobe, wenigstens eine Einfangprobe und ein Schneidemittel, vorzugsweise die Ribonuklease H, sowie die Instruktionen, also die Gegenstände 2, 6 und 10, enthalten. Ein etwas mehr vollständiges Kit für bevorzugte Assays wird binäre Reporterproben, wenigstens eine Einfangprobe plus wenigstens die Gegenstände 1, 3, 6 und 10 sowie den Gegenstand 9, falls geeignet, enthalten. Ein Kit, der wenigstens die Gegenstände 1-3 und 5-10 (Gegenstand 9 nur, wenn es geeignet ist) enthält, ist, falls der Festkörper ein Messstreifen oder ein Reaktionsgefäß ist, besonders bevorzugt für Assays, die außerhalb eines gut ausgerüsteten Labors durchgeführt werden.
Wie oben bereits angemerkt, sind bestimmte Ausführungsformen gemäß der Erfindung Typen der Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assays, die eine Targetreinigung umfassen.
Die Beschreibung in den vorhergehenden Abschnitten bezüglich der Einfangproben, der Schneidschritte und der Isolierungsschritte ist im Wesentlichen anwendbar auf die Targetreinigung, wobei es aber die Ausnahme gibt, dass die Reporterproben nicht berücksichtig werden müssen, da sie während der Targetreinigung nicht vorhanden sind. Bevorzugte Targets für die Assays mit der Targetreinigung gemäß der Erfindung sind RNA- Targets, da die für einen Nachweis geeigneten RNA-Targets in den meisten Fällen sehr viel häufiger in Proben vorliegen als die entsprechenden DNA-Targets.
Wenn nach der Targetreinigung LCR folgt, wird insbesondere die Verwendung von RNA- Proben und einer RNA-abhängigen Ligase bevorzugt, wie die T4 DNA-Ligase, (ein Proteinmolekül) oder Tetrahymena Ribozymligase (ein RNA-Molekül). Falls das letztere Molekül verwendet wird, haben die LCR-Proben Hybridisierungslängen von nicht mehr als etwa neun Nukleotiden.
Ein bevorzugtes Kit für einen Assay gemäß der vorliegenden Erfindung, der die Targetreinigung umfasst, kann einige oder alle der folgenden Gegenstände umfassen:
1. 5 M GuSCN;
2. DNA Einfangprobe(n) für ein vorausgewähltes RNA-Target;
3. einen Festkörper, wie paramagnetische Partikel, beschichtet mit Streptavidin;
4. eine magnetische Trennvorrichtung;
5. Ribonuklease H;
6. RNA LCR-Primer;
7. T4 DNA-Ligase;
8. LCR-Puffer; und
9. Instruktionen.
Ein vollständiges Kit umfasst alle Gegenstände 1-9. Ein "nacktes" Kit umfasst wenigstens die Gegenstände 2, 6 und 9. Ein universelles Kit für die Targetreinigung bei Ausführungsformen von Assays gemäß der Erfindung wird wenigstens die Gegenstände 2 und 9, vorzugsweise auch die Gegenstände 3 und 5 umfassen.

Beispiele

Beispiel 1: RNA-Target, binäre RNA-Proben, DNA-Einfangproben und Schneiden mit Ribonuklease H

Die vorliegende Erfindung reduziert den Hintergrund bei Sandwichhybridisierungs- Assays und vereinfacht gleichzeitig das Format der Assays. Die Ausführungsform, welche binäre RNA-Proben verwendet, führt zu einem extrem empfindlichen Assay, der allgemein in der Fig. 1 dargestellt ist, für den Nachweis eines RNA-Targets, hier dargestellt durch HIV- Virus-RNA. Die Targetsequenz 2 von Target 1 ist in der Integraseregion der HIV-RNA lokalisiert. Das Assay beginnt mit Lösen der Probe in 5 M Guanidinthiocyanat (GuSCH). Eine Mischung von vier verschiedenen Nukleinsäureproben wird dann der Probe zugesetzt. Diese Proben hybridisieren mit der HIV-RNA, wie dies in der Fig. 1 dargestellt ist. Zwei der Proben sind Einfangproben 3, 4, die aus DNA bestehen. Jede Einfangprobe hat eine Hybridisierungssequenz 5 oder 6 an ihrem 3'-Ende, das komplementär zu dem Target 1 ist. Die Einfangproben 3, 4 haben auch eine Biotinkomponente 7 an ihren 5'-Enden. Die anderen zwei Proben 8, 9 sind binäre Reporterproben aus RNA. Nach der Hybridisierung werden die Hybride auf der Oberfläche der paramagnetischen Partikel 10 gefangen, die mit Streptavidin 11 beschichtet sind, das stark an die Biotinkomponente 7 der Einfangproben bindet. Die paramagnetischen Partikel 10 werden dann intensiv gewaschen, um nicht-hybridisierte binäre Proben zu entfernen. RNase H wird dann hinzugesetzt, um die Target-RNA in der Region zu schneiden, wo sie mit den Einfangproben hybridisiert. Das Schneiden der Target-RNA befreit die Hybriden 12 aus binären Proben/Target (in der Fig. 1 nach der Ligation gezeigt) von den Einfangproben.
Der Schneide-Freisetzungsschritt ist quantitativ und spezifisch. Die binären Proben, die nicht-spezifisch an die DNA-Einfangproben oder an der Oberfläche der paramagnetischen Partikel haften (das heißt die Quellen eines Hintergrundsignales), werden durch das Schneiden nicht freigesetzt. Die paramagnetischen Partikel 10 werden verworfen. Assays, welche diese Target-abhängige Freisetzung verwenden, erreichen in einem einzelnen Schritt ein Signal-Rausch-Verhältnis, das ähnlich oder besser als das Signal-Rausch-Verhältnis ist, welches bei dem mehrstufigen, reversiblen Target-Einfangverfahren erzielt wird.
In dem Überstand sind die Paare der binären Proben, die korrekt benachbart zueinander auf ihren Targets hybridisiert sind, miteinander ligiert in einer Target-abhängigen Weise. Die ligierten Proben 13 werden dann durch Inkubation mit Qβ-Replicase amplifiziert. Das amplifizierte Signal ist stark von der Gegenwart des Targets abhängig und die Signalgröße kann als eine Funktion der Zeit benutzt werden, um quantitativ die Zahl der HIV-RNA in der anfänglichen Probe zu bestimmen. Durch Kombination des Target-abhängigen, RNase H bedingten Freisetzungsschrittes mit einem Target-abhängigen Ligationsschritt wird das Hintergrundsignal vollkommen eliminiert.

A. Synthese der Proben

Die in diesem Beispiel (Fig. 2) verwendeten Einfangproben haben drei funktionelle Teile. Ein Kopf von 40-50 Nukleotiden, der mit einem vorausgewählten Target hybridisiert, ein Abstandsstück von etwa 4 Nukleotiden sowie einen Schwanz, der fest mit der festen Oberfläche bindet. Der Schwanz stellt eine Biotinkomponente dar und bindet kovalent an das 5'-Ende von jeder Einfangprobe. Die Biotinkomponente kann irgendwo an der Einfangprobe befestigt werden, einschließlich dem 3'-Ende und intern. Der Schwanz kann aus einem anderen Affinitätsreagenz hergestellt sein, wie ein Homopolynukleotid.
Die Fig. 1 zeigt die Art und Weise, in der die Einfangproben 3, 4 an das Target 1 binden. Zwei verschiedene Einfangproben wurden verwendet, um die Effizienz des Einfangens zu erhöhen und um die Stränge der Freisetzung der binären Komplexe aus Probe/Target zu erhöhen. Die zwei Einfangproben 3, 4 binden an das Target 1 an jeder Seite der Targetsequenz 2, an der die binären Proben binden. Die Hybridisierungssequenz 5 der Einfangprobe 3 ist komplementär zu der Region 4415458 der genomischen HIV-RNA. Die Hybridisierungssequenz 6 der Einfangprobe 4 ist komplementär zu der Region 4808-4852 der genomischen HIV-RNA. Die Fig. 2 zeigt die Sequenzen der zwei Einfangproben 3, 4, die in diesem Beispiel verwendet wurden. Die Unterstreichungen zeigen die Hybridisierungssequenzen 5, 6, die komplementär zu der Target-RNA sind. Beide Einfangproben wurden auf einem DNA-Synthesegerät hergestellt.
Das gewünschte Reportermolekül bei dieser besonderen Ausführungsform erfordert die Ligation der zwei binären Proben, wie dies in der Fig. 1 gezeigt ist. Die Verwendung der binären Proben ist eine bevorzugte Ausführungsform. Fig. 1 zeigt den Aufbau der binären Reporterproben 8, 9. Das 5'-Ende 14 der Probe 8 besteht aus ersten neunundsechzig Nukleotiden der replizierbaren Probe für HIV, die in unseren vorherigen Studien verwendet wurde (Lomeli et al., 1989). Die nächsten dreiundzwanzig Nukleotide stellen die Probensequenz 15 dar, die komplementär zu der Region 4596-4618 der genomischen HIV- RNA ist. Das 5'-Ende der Probe 9 besteht aus der Probensequenz 17 mit 19 Nukleotiden, die komplementär zu der Region 4577-4595 der genomischen HIV-RNA ist. Der Rest 16 der Probe 9 entspricht den Nukleotiden 95-280 der replizierbaren Probe für HIV, die in den vorherigen Studien verwendet wurde (Lomeli et al., 1989). Die Fig. 2 zeigt die Sequenzen der binären Proben 8, 9. Die Unterstreichungen zeigen die Hybridisierungssequenzen 15, 17 an, die zu der Targetsequenz komplementär sind. Keine dieser Moleküle ist ein guter Replikator, wenn eine Inkubation mit Qβ-Replicase erfolgt, wobei sie aber ein exponentiell replizierbares Reportermolekül bilden, wenn sie miteinander ligiert werden.
Die binären Proben 8, 9 werden durch Transkription von DNA-Templaten hergestellt, die in einer Polymerasekettenreaktion (PCR), die in der Fig. 3 dargestellt ist, erzeugt werden. Das Plasmid 20, das in Lomeli et al., 1989 auf der Seite 1827 beschrieben ist und das als Plasmid pT7MDVHIV20 bezeichnet wird, wurde als Quelle der MDV-Sequenzen in den PCR- Reaktionen verwendet. Der relevante Abschnitt des Plasmides ist in der Fig. 3 gezeigt. Er ist selbstverständlich doppelsträngig. Vier PCR-Primer 21, 22, 23 und 24 wurden so ausgewählt, dass sie zusätzliche Sequenzen zu den PCR-Produkten 27, 28 bereitstellen, die nicht in dem Plasmid 20 vorhanden waren, die aber erforderlich waren. Das PCR-Produkt 27 wird aus den Primern 21, 22 gebildet. Das PCR-Produkt 28 wird aus den Primern 23, 24 gebildet. Das Primer 22 stellte die terminalen dreiundzwanzig Nukleotiden 25 in dem Templat für die Probe 8 bereit. Das Primer 23 stellte den T7 Promoter 26 an dem 5'-Ende des Templates für die Probe 9 bereit. Das Plasmid 20 stellte einen T7 Promoter in der Region des Primers 21 bereit. Die Probe 8 wurde in gewöhnlicher Weise von ihrem PCR-Templat transkribiert, wobei die Synthese der Probe 9 eine Modifikation in den Transkriptionsbedingungen durch die T7 RNA- Polymerase erforderte. Der Donor der Phosphatgruppe in einer Ligationsreaktion, in diesem Fall die Probe 9, muss ein einzelnes Phosphat an seinem 5'-Ende enthalten. Die durch Transkription hergestellten RNA-Moleküle haben im Normalfall ein Triphosphat an ihren 5'- Enden. Um die Probe 9 mit einer einzelnen Phosphatgruppe an ihrem 5'-Ende herzustellen, wurde ein zehnfacher Überschuss von Guanosin-5'-Monophosphat gegenüber den Nukleosid- 5'-Triphosphaten in der Transskriptionsreaktion vorgenommen. Dies führt zu der Einlagerung von Guanosin-5'-Monophosphat an der ersten Position der Probe 9. Im Ergebnis besaßen die Kopien der Probe 9 das erforderliche Monophosphat an ihren 5'-Enden. Nach der Transskription wurde jede der binären Proben RNAs 8, 9 durch präparative Polyacrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Die RNA eluierte direkt von den Gelscheiben in eine 2 M Guanidinthiocyanat (GuSCH)-Lösung.
Seitdem dieses Beispiel durchgeführt wurde, wurde entdeckt, dass die Probe 9 durch die Verwendung eines zwanzigfachen Überschusses an Guanosin-5'-Monophosphat im Vergleich zu einem zehnfachen Überschuss, wie oben berichtet, verbessert werden kann. Die Effizienz der Ligation verdreifacht sich von 10% auf 30%, wenn der größere Überschuss verwendet wird.

B. Hybridisierung, Einfangen, Waschen und Freisetzung

Das Assay von diesem Beispiel wurde mit Proben durchgeführt, die bekannte Mengen an HIV RNA-Molekülen enthielten. Eine RNA, die der mRNA des Integrasegens von HIV entsprach, wurde als Modelltarget verwendet. Diese RNA wurde durch Transskription von der linearisierten Plasmid pGEM-Integrase hergestellt, die in dem Labor synthetisiert wurde. Acht Röhrchen mit unterschiedlichen Mengen, zum Beispiel 10.000.000, 1.000.000, 100.000, 10.000, 1.000, 100, 10 und 0 Molekülen, an Integrase-RNA in 50 Mikroliter von 2 M GuSCH wurden durch serielle Verdünnung hergestellt. Eine 2 M GuSCH Lösung (50 Mikroliter), die 1013 Moleküle von jeder Einfangprobe und 2 · 10¹&sup0; Moleküle von jeder der binären Proben enthielt, wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt. Die Hybridisierung wurde durch Inkubation bei 37ºC für eine Stunde durchgeführt. Eine 30 ul Suspension an paramagnetischen Partikeln, die mit Streptavidin (Promega) beschichtet waren, wurde dann der Hybridisierungsmischung zugegeben. Die Hybride aus Proben/Target wurden auf der Oberfläche der paramagnetischen Partikel durch eine 10-minütige Inkubation bei 37ºC eingefangen. Die Partikel wurden viermal mit 2 M GuSCH gewaschen, dreimal mit 300 mM KCl und schließlich zweimal mit 1 · Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl; pH 7,5; 5 mM MgCl&sub2;; 1 mM DTT; 1 mM ATP). Nach dem Waschen wurde eine Einheit von E. coli RNase H (Pharmacia), die in 50 ul von 1 · Ligasepuffer gelöst war, zugegeben. Die Hybride aus binären Proben/Target wurden von der Oberfläche der paramagnetischen Partikel durch eine 10-minütige Inkubation bei 37ºC freigesetzt. Die Röhrchen, welche die Mischung enthielten, wurden in dem Magnetfeld, welches durch eine magnetische Trennvorrichtung bereitgestellt wurde, angeordnet, um die paramagnetischen Partikel an die Wände der Teströhrchen zu ziehen. Der Überstand wurde dann durch Ansaugung von den paramagnetischen Partikeln getrennt und in ein frisches Röhrchen gegeben. Die Hybride aus Probe/Target wurden dann mit T4 DNA-Ligase inkubiert, um die binären Proben, die korrekt mit den Targets hybridisiert waren, zu ligieren. Die Ligation wurde in 40 ul des Überstandes durch Zugabe von 40 Einheiten der T4 DNA-Ligase und Inkubation bei 37ºC für eine Stunde durchgeführt.
Das Assay nach diesem Beispiel wurde auch mit Proben durchgeführt, die bekannte Mengen an Zellen enthielten, die mit HIV infiziert waren. Um die Spezifität und die Empfindlichkeit dieses Assays mit den klinischen Proben zu demonstrieren, wurden menschliche periphere Lymphozyten mit HIV infiziert. Diese infizierten Zellen wurden dann seriell mit nicht infizierten, menschlichen, peripheren Lymphozyten verdünnt. Acht Röhrchen wurden vorbereitet, die unterschiedliche Mengen an infizierten Zellen enthielten, zum Beispiel 600.000, 60.000, 6.000, 600, 60, 6 und 0 infizierte Zellen. Die Gesamtzahl der Zellen pro Röhrchen betrug beispielsweise 600.000. Die Röhrchen wurden zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. 240 ul von 5 M GuSCH wurde zu jedem Röhrchen hinzugesetzt. Die Röhrchen wurden dann für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Nach der Lyse wurden 40 ul von jedem Röhrchen überprüft. Eine 60 ul Lösung, die alle vier Proben enthielt, wurde dem Lysat hinzugesetzt. Die Zugabe von dieser Lösung reduzierte die GuSCH- Konzentration in dem Lysat auf 2 M. Die Hybridisierung und alle nachfolgenden Reaktionen wurden in gleicher Weise, wie dies in dem vorherigen Paragraphen beschrieben wurde, durchgeführt.

C. Amplifikation

Die Reportermoleküle, die ligierte binäre Proben umfasste, wurden dann durch Inkubation mit Qβ-Replicase amplifiziert. Es ist nicht notwendig, die Hybride aus Reportermolekül/Targert vor der Amplifizierung wegzuschmelzen. Eine Mischung, die alle Komponenten der Replikationsreaktion enthielt, wurde dann zu jedem der acht Röhrchen hinzugegeben. Die Endreaktionsmischung (120 ul) war 24 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgCl&sub2;, 400 micromolar ATP, 400 micromolar GTP, 400 micromolar UTP, 400 micromolar alpha-P³²- CTP und enthielt 50 ug pro ml Qβ-Replicase. Jede Reaktion wurde bei 37ºC inkubiert und 4 ul Proben wurden dann von jeder Reaktion jede Minute in dem Intervall zwischen 10 und 31 Minuten der Inkubation abgezogen. Jede Probe wurde mit einer 45 ul Stopplösung gemischt (120 mM NaCl, 20 mM EDTA und 3 ug pro mo Proteinase K). Diese Lösung stoppte die Replikation durch Maskieren des erforderlichen Magnesiumions. Die Stopplösungen wurden in Titerplatten vor Zugabe der Proben angeordnet. Die RNA in jeder gestoppten Reaktion wurde von den nicht eingelagerten Nukleosidtriphosphaten durch Fällung der RNA in einer sauren Lösung getrennt (360 mM Phosphorsäure, 20 mM Natriumpyrophosphat und 2 mM EDTA), auffangen des Niederschlags auf einer Blottingmembran (Zeta Probe, Biorad) sowie durch anschließendes Waschen der Membran mit der sauren Lösung. Die RNA auf den Plots wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

D. Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eine hohe Empfindlichkeit ohne Hintergrund zu erzielen. Die Fig. 4 zeigt ein typisches Ergebnis des oben beschriebenen Assays für eine Verdünnungsserie von Molekülen der HIV-Integrase RNA. Die Fig. 4 ist ein Autoradiogramm. Jede Reihe zeigt das Signal von einer gegebenen Probe über die Zeit, wie angezeigt. Die Intensität von jedem Fleck in der Fig. 4 ist proportional zu der Menge an RNA, die in dem Röhrchen zum Zeitpunkt vorhanden war, in dem die Probe gezogen wurde. Der Zeitpunkt, an dem die RNA zuerst in dem Autoradiogramm zu erkennen ist, hängt von der Zahl der Targets ab, die vorhanden waren. Je größer die Zahl der Targets, umso früher erscheint das Signal. Es gibt eine Verzögerung von wenigstens etwa zwei Minuten für jeden zehnfachen Anstieg in der Zahl der Targets. 100 Targetmoleküle ergaben ein deutliches Signal. Zehn Targetmoleküle oder keine Targetmoleküle führten zu keinem Signal und zwar selbst nach einer zusätzlichen Inkubation von 8 Minuten (nicht gezeigt). 100 Moleküle von dem HIV RNA-Target waren klar nachweisbar und alles was niedriger war, ergab kein Signal.
Wie angemerkt, betrug die Mindestzahl an Targets, die nachgewiesen werden konnten, 100 Moleküle. Die Zahl der ligierten, replizierbaren RNA-Moleküle in dem entsprechenden Röhrchen vor der Replikation war jedoch deutlich niedriger. Es wurde experimentell bestimmt, dass die Zahl der Komplexe aus Probe/Target, die nach Hybridisierung, Einfangen, Waschen und Freisetzung verblieben, 30% der Ursprungszahl an vorhandenen Targets betrug. Es wurde ferner bestimmt, dass die Effizienz der Ligation 10% betrug. In dem Röhrchen, in dem ursprünglich 100 Targetmoleküle vorlagen, waren somit wahrscheinlich nur 3 replizierbare RNA-Moleküle vorhanden. Da wenigstens ein replizierbares RNA-Molekül erforderlich ist, um eine Amplifikationsreaktion zu starten, führen Proben, die weniger als 100 Moleküle enthalten, wahrscheinlich nicht zu einer Signalerzeugung. Da eine infizierte klinische Probe wahrscheinlich wenigstens 1.000 Targetmoleküle enthält (entsprechend einer einzelnen infizierten Zelle), hat dieser extrem empfindliche Assay eine angemessene Empfindlichkeit für praktisch alle klinischen Anwendungen. Die Verbesserung bei der Synthese von Probe 9, wie oben berichtet, wo die Ligationseffizienz verdreifacht wurde, verbessert die Empfindlichkeit des Assays noch mehr.
Die Fig. 5 und 6 zeigen die Ergebnisse von zwei Experimenten, welche die klinische Anwendbarkeit dieser Erfindung demonstrieren sollen. Sie zeigen die Ergebnisse von Assays gemäß diesem Beispiel für Proben, die HIV-infizierte, menschliche, periphere Lymphozyten enthielten. Die Fig. 5 und 6 sind Autoradiogramme, wie dies im Zusammenhang mit der Fig. 4 beschrieben wurde. Die Ergebnisse der zwei Experimente, wenn sie zusammen betrachtet werden, zeigen, dass eine infizierte Zelle in einer Probe nachgewiesen werden kann, die 100.000 nicht infizierte Zellen enthält. Es wurde ferner kein Signal bei Proben beobachtet, die keine infizierten Zellen enthielten. Bei beiden Experimenten enthielt jede Probe eine Gesamtzahl von 100.000 Zellen. Bei dem ersten Experiment (Fig. 5) zeigen die Ergebnisse eine deutliche Beziehung zwischen der Zahl der infizierten Zellen in einer Probe und den Zeitpunkt des Auftretens des Signals. Je größer die Zahl der infizierten Zellen, umso früher erscheint das Signal. Somit ist der Assay sowohl quantitativ als auch qualitativ. Die zwei Kontrollen, die jeweils 100.000 nicht infizierte Zellen (und keine infizierten Zellen) enthielten, zeigten kein Signal. Das Röhrchen, welches eine infizierte Zelle enthielt, zeigte jedoch auch kein Signal. Es wird vermutet, dass nach der Lyse die Probe nicht vollständig gemischt wurde. Die lysierten Proben sind extrem viskos (aufgrund der Gegenwart an zellulärer DNA) und, da nur etwa sechs infizierte Zellen in den 240 ul Volumen des Lysates vorlagen, war die Wahrscheinlichkeit des Nicht-Erfassens von jeder HIV-RNA in der 40 ul Probe, die von der Probe für den Assay abgezogen wurde, groß. Um solch eine Möglichkeit zu eliminieren, wurden die Proben eingefroren und aufgetaut und dann intensiv gemischt, bevor sie für das nächste Experiment verwendet wurden. Der Assay wurde mit diesen gut gemischten Proben wiederholt. Die Ergebnisse von den sechs Proben am unteren Ende der Fig. 6 zeigen, dass die obige Vermutung korrekt war und das nach einer geeigneten Mischung das Röhrchen, welches die Nukleinsäure von etwa einer infizierten Zelle enthielt, ein starkes Signal mit einer entsprechenden Verzögerungszeit ergab.
Eine weitere Aufgabe des zweiten Experimentes bestand in der Schätzung der Zahl der Moleküle an HIV-RNA in jeder infizierten Zelle. Für diesen Zweck wurden zwei Standards hergestellt. Der Standard 1, das erste Standardröhrchen, enthielt 1.000.000 HIV-Integrase mRNA-Transkripte. Der Standard 2, das zweite Standardröhrchen, enthielt ein Lysat von 100.000 nicht infizierten Zellen und 1.000.000 Moleküle der HIV-Integrase mRNA-Transkripte. Die Ergebnisse von diesem Experiment gemäß den zwei Proben am oberen Ende von Fig. 6 belegen, dass die Gegenwart des Lysates aus nicht infizierten Zellen nur einen geringen Quencheffekt hat. Mit dem aus diesem internen Standard erzielten Signal konnte dann abgeschätzt werden, dass jede infizierte Zelle etwa 3.000 HIV-Targetmoleküle enthielt.
Zur Vorsicht sei auf die folgende Anmerkung verwiesen. Das verwendete Labor wird zur Forschung mit replizierbaren RNA-Molekülen verwendet, die eine Tendenz besitzen, aus der Luft kontaminiert zu werden. Bei einem Test des obigen Assays wurde ein abweichendes Signal in einem der Röhrchen erzielt. Die elektrophoretische Analyse der amplifizierten RNA ergab, dass kein Reporter anwesend war. Qβ-Replicase amplifiziert eine Reihe von RNAs und die Probe war kontaminiert.

Beispiel 2: DNA-Target, binäre DNA-Proben, RNA-Einfangproben und Schneiden mit RNase H

Diese bevorzugte Ausführungsform, die allgemein in der Fig. 7 dargestellt ist, ist für die Target-DNA 51 und verwendet die binären Proben 58, 59, die aus DNA bestehen. Bei diesem Beispiel bestehen die Einfangproben 53, 54 aus RNA mit einer Biotinkomponente, wobei in diesem Fall eine terminale Biotinkomponente 57 vorlag für die Immobilisierung auf einer festen Oberfläche. Die Sequenz der Einfangproben ist in der Fig. 8 gezeigt. Jede binäre Probe ist ein Abschnitt eines DNA-Templates, welches in eine amplifizierbare RNA transkribiert werden kann. Die binäre Probe 58 enthält an ihrem 5'-Ende 64 zweiundzwanzig Nukleotide, die mit der HIV-RNA 51 in der Region 4532-4553 hybridisieren kann, ein Teil der Targetsequenz 52. Benachbart zu dieser Probensequenz 64 sind sechzig Nukleotide 63, die das 5'-Ende der MDV-1 (+) RNA codieren. Das 3'-Ende der Probe 58 bildet eine Haarschleifenstruktur 60. Wenn das 3'-Ende dieser DNA durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA- Polymerase verlängert wird, enthält die erzielte, doppelsträngige DNA einen Promoter für die T7 RNA-Polymerase, der sich zu der MDV-1 Sequenz erstreckt. Die Fig. 8 zeigt die Sequenz der Probe 58 mit der Haarschleifenstruktur 60. Die Box 67 zeigt, was der T7 Promoter sein wird, wenn das 3'-Ende der Probe 58 verlängert ist, um "die Box 67 zu füllen". Die binäre Probe 59 enthält an ihrem 3'-Ende 66 dreiundzwanzig Nukleotide, die komplementär zu der Region 4554-4576 der HIV-RNA, Teil der Targetsequenz 52, ist. Benachbart zu dieser Probensequenz 66 liegt das Segment 65, welches 158 Nukleotide umfasst, die das 3'-Ende der MDV-1 (+) RNA codieren. Die Sequenz der zwei binären DNA-Proben ist in der Fig. 8 gezeigt. Die Probe 58 wurde hergestellt durch Ligation von zwei Oligodeoxyribonukleotiden, die auf einem DNA-Synthesizer hergestellt wurden. Die Proben 59 kann in ähnlicher Weise hergestellt werden. Hier wurde die Probe 59 jedoch durch aufeinanderfolgendes Klonieren von DNA-Sequenzen in einen Bakteriophage M13 Vektor hergestellt. Einzelsträngige DNA aus dem Phagen wurde isoliert. Diese DNA wurde an den Enden der Probensequenz durch Restriktionsendonuklease geschnitten. Die Orte des Schneidens wurden doppelsträngig durch Hybridisierung mit Oligodeoxyribonukleotiden gemacht. Die geschnittene Probensequenz wurde mit Gelelektrophorese gereinigt.
Diese Proben wurden mit HIV RNA hybridisiert und die Hybriden wurden eingefangen und gewaschen in gleicher Weise, wie dies oben beim Beispiel 1 beschrieben wurde. Nach dem Waschen wurden die paramagnetischen Partikel mit RNase H inkubiert. RNase H baut solche Einfangproben ab, die mit ihren Targets hybridisiert sind und setzen die Hybride 70 aus binären Proben/Target (in Fig. 7 gezeigt) in den Überstand frei. Die Hybride in dem Überstand werden dann von dem paramagnetischen Partikel abgetrennt und in ein neues Teströhrchen überführt. Die Hybride werden dann mit T4 DNA-Ligase inkubiert, um solche binären Proben zu verbinden, die korrekt mit ihren Targets hybridisiert sind. Nach der Ligation werden die Hybride mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase und der T7 RNA- Polymerase inkubiert, um die Transkripte 71 zu erzeugen. Diese Inkubationen werden als getrennte Schritte zur Darstellung in der Fig. 7 gezeigt. Die kombinierte Wirkung von diesen Enzymen führt zu der Synthese von replizierbaren RNA-Molekülen, die anschließend exponentiell durch die Inkubation mit Qβ-Replicase (wie in Beispiel 1 beschrieben) amplifiziert werden.

Beispiel 3: RNA-Target, binäre RNA-Proben, DNA- oder RNA-Einfangprobe und Schneiden mit Ribozym

Das am meisten bevorzugteste Verfahren für eine Target-abhängige Freisetzung von Hybriden aus Reporterprobe/Target ist das Schneiden der Targets durch Inkubation mit RNase H. In bestimmten Situationen kann ein Ribozym verwendet werden, um das Target spezifisch in der Region zwischen der Einfangprobe und der Reporterprobe oder Proben zu schneiden. Obgleich ein "Hammerkopf"-Ribozym (Haseloff & Gerlach, 1988) für das Schneiden bevorzugt wurde, kann jedes andere Ribozym verwendet werden, welches an dieser Region angreift. Die Fig. 9 zeigt eine Ausführungsform dieses Beispiels, wobei ein Hammerkopf-Ribozym verwendet wurde.
Die Target RNA 81 enthält die Targetsequenz 82. Eine einzelne DNA-Einfangprobe 84, welche die Hybridisierungssequenz 85 und die Biotinkomponente 86 enthält, ist mit dem paramagnetischen Partikel 87 über ihre Streptavidinbeschichtung 88 verbunden. Ein Paar von binären RNA-Reporterproben 90, 92 hybridisierten benachbart zueinander an der Targetsequenz 82 über ihre entsprechenden Sequenzen 91, 93. Das Hammerkopf-Ribozym 89, welches die Hybridisierungssequenzen 94, 95 enthält, ist an einer Stelle zwischen der Einfangprobe 84 und den Reporterproben 90, 92 an dem Target 81 hybridisiert. Die Sequenzen 84, 85 werden manchmal "Erkennungssequenzen" genannt.
Das Ribozym 89 ist so aufgebaut, dass die Erkennungssequenz 94 (25-30 Nukleotide lang) länger ist als die Erkennungssequenz 95 (6-7 Nukleotide lang). Das Ribozym 89 wird als eine zusätzliche Probe zugefügt. Um das Schneiden des Targets bei 83 zu bewirken, wird die Magnesiumionen-Konzentration auf 20 millimolar eingestellt und die Röhrchen werden für 60 Minuten bei 55ºC inkubiert. Da die Erkennungssequenz 95 zu klein ist, um das geschnittene Target zu halten, werden die Hybride aus Reporterproben/Target in die Lösung freigesetzt. Diese Freisetzung ist Target-abhängig. Der Freisetzung folgt eine Ligation der binären Proben 90, 92 durch Inkubation mit T4 DNA-Ligase. Die ligierten Proben, das heißt, dass Reportermolekül (nicht gezeigt), wird dann durch Inkubation mit Qβ-Replicase amplifiziert.
In einer alternativen Ausführungsform dieses Beispiels wird eine RNA-Einfangprobe verwendet und der Kopf der Einfangprobe ist ein Ribozym (oder der Kopf der Einfangprobe umfasst ein Ribozym und eine zusätzliche Sequenz, die komplementär zu dem Target ist).

Beispiel 4: RNA-Target, binäre DNA-Proben, DNA-Einfangprobe und Schneiden mit RNase III unter Verwendung einer RNA ortsidentifizierenden Probe

Die Hybride aus Reporterprobe/Target können in einer Target-abhängigen Weise unter zu Hilfenahme einer 40-50 Nukleotid langen, ortsidentifizierenden Probe, die manchmal eine "Freisetzungsprobe" genannt wird, freigesetzt werden. Diese Probe sollte aus RNA bestehen und kann mit dem RNA-Target zusammen mit anderen Proben hybridisiert werden. Die Inkubation mit RNase III schneidet das Target zwischen der Einfangprobe und den binären Reporterproben und setzt die Hybride aus binären Proben/Target in die Lösung für die Amplifikation frei. Die RNase III Schneidstellen wurden in der Literatur als spezifische Sequenzen in der doppelsträngigen RNA beschrieben, wobei aber hier beobachtet wurde, dass jede doppelsträngige RNA mit mehr als 30 Nukleotiden ein gutes Substrat für die RNase III darstellt. Deshalb wird ein Hybrid zwischen einer RNA-Reporterprobe und einem RNA- Target abgebaut und die DNA-Reporterproben und die DNA-Einfangproben sollten verwendet werden.
Ein bevorzugter Aufbau für die binären DNA-Proben ist in der Fig. 10 gezeigt. Die Target-RNA enthält die Targetsequenz 102. Eine einzelne DNA-Einfangprobe 104, welche die Hybridisierungssequenz 105 und die Biotinkomponente 106 enthält, ist an die paramagnetischen Partikel 107 über ihre Streptavidinbeschichtung 108 gebunden. Ein Paar von binären DNA-Reporterproben 110, 113 sind benachbart zueinander an der Targetsequenz 102 über ihre entsprechenden Sequenzen 111, 114 hybridisiert. Die Probe 110 umfasst die terminale Region 112, die verlängert werden kann, um einen T7 Promoter zu bilden und zwar in ähnlicher Weise wie bei der Probe 58 vom Beispiel 2. Die ortsidentifizierende RNA-Probe 59 hybridisiert an dem Target 101 zwischen der Einfangprobe und den Reporterproben. Die Probe 59 war wie oben beschrieben. Die Inkubation mit RNase III schneidet das Target 101 bei 103.
Es wurde gezeigt, dass die binären DNA-Proben, wie 110, 113, durch Inkubation mit T4 DNA-Ligase in einer Target-abhängigen Weise ligiert werden können. Amplifizierbare Reporter-RNAs werden durch Transkription der ligierten, binären DNA-Proben durch Inkubation mit der T7 RNA-Polymerase erzeugt. Die nachfolgende Amplifikation der Reporter- RNAs durch Inkubation mit der Qβ-Replicase führt zu einem nachweisbaren Signal. Wenn das Reportermolekül eine rekombinante MDV-1 RNA ist, wird wenigstens das Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase zugesetzt (und selbstverständlich werden Deoxyribonukleotide zugefügt) zusammen mit der T7 RNA-Polymerase, um, falls notwendig, den Promoter zu vervollständigen, und um den DNA-Strang zu verlängern, um ein doppelsträngiges Templat zu erzeugen.

Beispiel 5: RNA-Target, binäre DNA-Proben, RNA-Einfangprobe und Schneiden mit RNase III

Anstelle der in Beispiel 4 beschriebenen DNA-Einfangprobe kann die Einfangprobe auch aus RNA bestehen. Damit braucht keine ortsidentifizierende Probe verwendet zu werden. Die Hybride aus Einfangprobe/Target sind selbst die Substrate für die RNase III. Die Inkubation mit RNase III setzt die Hybride aus binären Proben/Target spezifisch frei. Dieser Freisetzung folgt eine Inkubation mit der T4 DNA-Ligase, T7 RNA-Polymerase (und möglicherweise dem Klenow-Fragment von der E. coli DNA-Polymerase, wie im Beispiel 4 diskutiert) und der Qβ- Replicase, um ein amplifiziertes Signal zu erzeugen.

Beispiel 6: RNA-Target, binäre DNA-Proben, DNA-Einfangprobe und Schneiden mit RNase A

Wenn die Einfangproben und die Reporterproben aus DNA bestehen, ist es möglich, für die Freisetzung jede Einzelstrang-spezifische Ribonuklease, wie RNase A zu verwenden. Die RNase A schneidet das Target nicht in der Proben-Target-Region, da ihr normales Substrat eine einzelsträngige RNA ist, wobei aber die Freisetzung dennoch spezifisch ist, da das Targetschneiden zwischen der Einfangprobe und der Targetsequenz durchgeführt wird. Nicht- spezifisch gebundene Reporterproben verbleiben an den Einfangproben, die permanent an der Oberfläche der Partikel gebunden sind. Der Freisetzung folgt eine Inkubation mit der T4 DNA-Ligase, T7 RNA-Polymerase (und möglicherweise dem Klenow-Fragment von der E. coli DNA-Polymerase, wie in Beispiel 4 diskutiert) und der Qβ-Replicase, um ein amplifizierbares Signal zu erzeugen.

Beispiel 7: DNA-Target, unitäre und binäre Proben, DNA-Einfangprobe und Schneiden mit einer Restriktionsendonuklease

Wenn das Target DNA ist, kann ein Restriktionsenzym verwendet werden. Die Sequenz des Kopfes der Einfangprobe wird so ausgewählt, dass er eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease enthält. Die Hybride aus Reporterprobe/Target werden von den Einfangproben durch Inkubation freigesetzt, beispielsweise durch Inkubation der paramagnetischen Partikel mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease. Die bevorzugte Ausführungsform für die Reporterprobe ist ein Paar von binären RNA-Proben, wie im Beispiel 1, wobei aber die Reporterprobe auch ein Paar von binären DNA-Proben, wie im Beispiel 4, sein kann oder die Reporterprobe kann eine unitäre DNA- oder RNA-Probe darstellen. Wenn binäre Proben verwendet werden, werden die freigesetzten Hybride aus binären Proben/Target dann mit T4 DNA-Ligase inkubiert und anschließend direkt oder indirekt amplifiziert.

Beispiel 8: DNA-Target, binäre DNA-Proben, RNA-Einfangprobe und Schneiden mit RNase H

Wenn das Target und die Reporterproben aus DNA bestehen, wobei die Einfangprobe aus RNA besteht, kann die RNase H verwendet werden, um die Hybride aus binären Proben/Target von den Einfangproben spezifisch freizusetzen. Der Freisetzung folgt eine Inkubation mit der T4 DNA-Ligase, T7 RNA-Polymerase (und möglicherweise dem Klenow- Fragment von der E. coli DNA-Polymerase, wie im Beispiel 4 diskutiert) und der Qβ-Replicase, um ein amplifiziertes Signal zu erzeugen.

Beispiel 9: Ribozymligase

Dieses Beispiel beschreibt einen Assay für ein RNA-Target, wobei binäre RNA-Proben und eine "gefesselte" Ribozymligase verwendet werden. Die Ribozymligase ist ein RNA- Molekül, welches drei Regionen umfasst: (1) eine Ribozymligase-Sequenz; (2) ein "Haken", der eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Region des Targets ist, welche nahe der Targetsequenz vorliegt; und (3) ein "Haltestrick", was eine Sequenz darstellt, welche die Ribozymligase-Sequenz mit dem Haken verbindet. Gefesselte Ribozymligasen sind offenbart in Lizardi et al., Ser. Nr. 08,005,95 für diagnostische Assays für RNA unter Verwendung von binären RNA-Proben, eingereicht am gleichen Tag wie diese Anmeldung von Tyagi, Landegren, Lizardi, Kramer und Szostak. Verwendet wird Tetrahymena Ribozymligase (Doudna und Szostak, 1989) und spezifische, binäre Proben, wie dies offenbart ist in Lizardi et al., Ser. Nr. 08,005,895.

A. Herstellung von binären Reporterproben und einer gefesselten Ribozymligase

Die "erste Probe" ist eine 71 Nukleotid lange RNA, die durch in vitro Transkription eines artifiziellen Gens erzeugt wird. Die Sequenz dieser RNA ist wie folgt:
Die letzten 9 Nukleotide dieser RNA bilden eine "erste Probensequenz" (unterstrichen), die komplementär zu der Sequenz 3'-UUGGCAUCG-5' ist, die Teil der HIV-1 RNA-Targetsequenz ist.
Die "zweite Probe" ist eine 186 Nukleotid lange RNA mit der folgenden Sequenz:
Das erste Nukleotid dieser RNA ist ein Guanosin, welches nicht mit HIV-1 RNA paart, welches aber erforderlich ist für die Ligation durch die Tetrahymena Ribozymligase (Doudna & Szostak, 1989). Die nächsten 28 Nukleotide bilden eine "zweite Probensequenz" (unterstrichen), die komplementär zu der Sequenz 3' UGACCACUUUAACGACGGUAACAGACAU-5' ist, die den anderen Teil der HIV-1 RNA- Targetsequenz darstellt, die benachbart zu dem 5'-Ende der Sequenz 3'-UUGGCAUCG-5' ist.
Die zweite Probe wird durch in vitro Transkription eines artifiziellen Gens erzeugt, welches für die gewünschte RNA-Sequenz codiert und einen T7 Promoter enthält. Das artifizielle Gen wird durch die Polymerase-Kettenreaktion (Erlich et al., 1991) erzeugt unter Verwendung der folgenden Primer:
Diese Primer werden in einer Polymerase Kettenreaktion in Gegenwart des Plasmides pT7MDVHIV20 verwendet, beschrieben auf Seite 1827 von Lomeli et al., 1989, um das artifizielle Gen für die Synthese der zweiten Probe zu erzeugen. Das 186 Nukleotid lange Transkript wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
Die gefesselte Ribozymligase wird erzeugt durch in vitro Transkription gemäß der Beschreibung von Doudna & Szostak (1989). Ein artifizielles Gen für die Transkription der gefessetlen Ribozymligase wird durch PCR von dem Plasmid pJD1100 (Doudna & Szostak, 1989) unter Verwendung der folgenden Primer erzeugt:
und 5'-CTAGCTCCCATTAAGGAGAG-3'. Das Produkt in vitro Transkription ist 345 Nukleotide lang und enthält einen Haken mit der Sequenz 5'-GTTTTTACTGGCCATCTTCCT GCTAATTTTAA-3' sowie einen Haltestrick mit der Sequenz 5'-TTTGAG-3', die mit dem P2- Stamm von der Tetrahymena Ribozymligase (Doudna & Szostak, 1989) verbunden ist. Der Haken ist komplementär zu einer Sequenz in der HIV-1 RNA, die fünf Nukleotide entfernt von der Targetsequenz ist.
Jede binäre Probe wurde getestet, um zu sehen, ob sie exponentiell durch Inkubation mit Qβ-Replicase repliziert werden kann, was niemals der Fall war.

B. Assay für HIV-1 RNA

Dieses Assay ist das gleiche Assay wie bei Beispiel 1 mit der Ausnahme, dass jede Probe in 20 ul von 5 M GuSCH gelöst wurde. Jede Probe wurde dann zu einer 80 ul Lösung hinzugegeben, die enthielt: 10¹³ Moleküle von jeder Einfangprobe, 2 · 10¹&sup0; Moleküle der ersten Probe, 2 · 10¹&sup0; der zweiten Probe und 2 · 10¹&sup0; Moleküle der gefesselten Ribozymligase. Die Hybridisierung und das Waschen wurde mit 1 M GuSCH anstelle von 2 M GuSCH durchgeführt. Anstelle des Waschens mit 1 · Ligasepuffer wurde Ribozymligase- Puffer (10 mM NH&sub4;Cl, 20 mM MgCl&sub2;, 4mM Spermidin und 30 mM Tris-HCl, pH 7,4) verwendet. Eine Einheit der RNase H, gelöst in Ribozymligase-Puffer, wird dann zugegeben und die Hybride aus binären Proben/Target werden von der Oberfläche der paramagnetischen Partikel durch eine 10-minütige Inkubation bei 37ºC freigesetzt. Die Hybride aus binären Proben/Target werden dann von den Partikeln isoliert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die isolierten Hybride aus binären Proben/Target wurden dann für 60 Minuten bei 58º C inkubiert (Doudna & Szostak, 1989) um die binären Proben in einer Target-abhängigen Weise zu ligieren. Der Rest des Assays entspricht der Beschreibung von Beispiel 1.

Referenzen

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Claims

1. Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assay zum Nachweis der Gegenwart eines vorausgewählten RNA-Targets, das eine Targetsequenz enthält, in einer Probe, umfassend die Schritte:

a) Inkubation der Probe mit einem Paar von binären RNA-Reporterproben unter Bedingungen, die eine Hybridisierung der Reporterproben mit der Targetsequenz begünstigen,

b) Inkubation der Probe mit einer DNA-Einfangprobe unter Bedingungen, die eine Hybridisierung der Einfangprobe mit dem Target begünstigen,

c) Immobilisierung der Einfangprobe auf der Oberfläche eines Festkörpers,

d) Waschen des Festkörpers nach den Schritten a, b und c,

e) Inkubation des gewaschenen Festkörpers mit Ribonuclease H, um davon ein Hybrid aus binären RNA-Proben/RNA-Target freizusetzen,

f) Abtrennung der Flüssigkeit, welche das freigesetzte Hybrid aus binären RNA- Proben/RNA-Target enthält; vorn dem Feststoff, der die Einfangprobe enthält,

g) Ligation der binären Proben mit einem Enzym, das eine RNA-abhängige RNA-Ligase ist, um ein RNA-Molekül zu bilden, welches ein Templat für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ist,

h) Amplifikation des Templats mit einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase, und

i) Nachweis der Gegenwart des amplifizierten Templats.

2. Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs-Assay zum Nachweis der Gegenwart eines vorausgewählten RNA-Targets in einer Probe, wobei ein Hybrid aus binären RNA- Reporterproben/Target mit einer DNA-Einfangprobe immobilisiert wird, das immobilisierte Hybrid gewaschen wird, eine Spaltung angewandt wird, um das Hybrid aus Reporterproben/Target von der Einfangprobe zu trennen, das abgespaltene Hybrid aus Reporterproben/Target von der Einfangprobe abgetrennt wird und die RNA-Reporterproben des Hybrids aus Reporterproben/Target mit einer RNA-abhängigen RNA-Ligase ligiert werden, um ein RNA-Molekül zu bilden, welches ein Templat für eine RNA-abhängige RNA- Polymerase ist.

3. Assay nach Anspruch 1 oder 2, worin die RNA-abhängige RNA-Ligase T4-DNA-Ligase ist.

4. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die RNA-abhängige RNA-Polymerase Qβ-Replicase ist.

5. Assay nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, worin nach dem Abtrennungsschritt f eine zweite Einfang-DNA-Einfangprobe zugefügt wird und die Schritte b-f unter Verwendung der zweiten Einfangprobe wiederholt werden.

6. Kit von Reagenzien für die Durchführung eines Nukleinsäure-Sandwichhybridisierungs- Assays zum Nachweis der Gegenwart eines vorausgewählten Targets, das eine Targetsequenz enthält, umfassend:

ein Paar von binären RNA-Reporterproben, die mit der Targetsequenz hybridisierbar sind, wobei die binären RNA-Reporterproben, wenn sie ligiert sind, ein Reportermolekül produzieren, welches exponentiell mittels einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase amplifizierbar ist, eine Einfangprobe, die mit dem Target hybridisierbar ist.

7. Kit nach Anspruch 6, ferner umfassend:

5 M GuSCH Puffer,

Ribonuclease H,

T4-DNA-Ligase,

Qβ-Replicase, und wahlweise,

wenn die Einfangprobe einen biotinylierten Schwanz hat, auch paramagnetische Partikel, die mit Streptavidin beschichtet sind, beinhaltend.