DE69421828T2

DE69421828T2 - Verwendung von 1,5-dideoxy-1,5-imino-d-glucitol n-alkylderivaten zur behandlung von hepatitis b infektionen

Info

Publication number: DE69421828T2
Application number: DE69421828T
Authority: DE
Inventors: Timothy Block; Baruch Blumberg; Raymond Dwek
Original assignee: Monsanto Co; GD Searle LLC
Current assignee: Monsanto Co; GD Searle LLC
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2014-12-24
Also published as: PT739205E; CA2181033C; CN1149253A; KR100348657B1; ES2140652T3; AU1403795A; DK0739205T3; US6037351A; ATE186836T1; JPH09508111A; CN1074921C; GR3032527T3; EP0739205A1; EP0739205B1; WO1995019172A1; JP3628021B2; DE69421828D1; CA2181033A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von N-Alkylderivaten von 1,5-Dideoxy-1,5-imino-D-glucitol zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibierung von Replikation und Sekretion von Hepatitis B Virus in Zellen, die mit diesem Virus infiziert sind und zur Verwendung in einer Methode zur Inhibierung von Hepatitis B Virus.
Hepatitis B Virus (HBV) ist ein Verursacher von akuter und chronischer Lebererkrankung [Ayoola et al., Bull. World Health Organ. 66, 443-455 (1988)]. Obwohl wirksame Impfung verfügbar ist [zwei zur Zeit verfügbare HBV Impfstoffe sind Merck's Recombivax HB und SmithKline Beecham's Engerix-B], gibt es immer noch mehr als 300 Millionen Menschen, die weltweit chronisch mit dem Virus infiziert sind [Eder et al., in Progress in Liver Diseases, Herausgeber Popper and Schaffner (Grune & Stratton, Orlando, FL), Band 8, Seiten 367-394 (1986)]. Für diese besitzt der Impfstoff keinen therapeutischen Wert. Gemäß Dr. Richard Duma, Exekutiver Direktor der National Foundation for Infectious Diseases, treten jährlich allein in den Vereinigten Staaten etwa 300000 Fälle von HBV Infektionen auf [Med. World News 34(8), 20-21 (1993)]. Zwischen 25 bis 40% von denjenigen, die chronisch mit HBV Virus infiziert worden sind, entwickeln ernsthafte Lebererkrankungen. Es ist deshalb wichtig wirksame anti-HBV Therapien zu finden.
Alpha Interferon ist verwendet worden zur Behandlung von HBV Infektion mit versprechenden Ergebnissen bei einigen Patienten [Hoofnagle and Jones, Seminars in Liver Disease 9, 231-233 (1989); und Perrillo, Seminars in Liver Disease 9, 240-248 (1989)]. Die einzige Behandlung von chronischer HBV Infektion, die zur Zeit durch die U. S. FDA anerkannt wird, ist rekombinantes Interferon alfa-2b (Intron A, Schering-Plough). Klinische Tests auf die Verwendung des Nukleosidanalogs Fialuridin zur Behandlung von chronischer Hepatitis B wurden kürzlich aufgegeben auf Grund von Arzneimittelbedingtem Leberversagen bei sechs von 20 Patienten. Folglich besteht ein großer Bedarf an einer sicheren Arzneimittelbehandlung von Hepatitis B.
Kürzliche Berichte schlagen vor, daß die Viruscodierte DNA Polymerase, die als eine reverse Transcriptase funktioniert, ein attraktives Ziel ist [Doong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8495-8499 (1991); Lee et al., Antimicrob. Agent Chem. 33, 336-339 (1989); Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8541-8544 (1989); und Venkateswaran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 274-278 (1987)].
Andere Virus-vermittelte Verfahren haben nicht auf antivirale Intervention gezielt. Wirksame antivirale Therapy für HBV umfaßt wahrscheinlich mehrfache Strategien, einschließlich Mittel, die das Immunsystem des Wirtes beeinflussen als auch diejenigen, die mit verschiedenen Stufen im Lebenszyklus des Virus interferieren. Es ist deshalb von Interesse, die Möglichkeit zu erforschen, daß andere nicht Polymerase-vermittelte Stufen. Im Viruslebenszyklus gegenüber Intervention verwundbar sind.
1,5-Dideoxy-1,5-imino-D-glucitol (das ebenfalls bekannt ist als 1-Deoxynojirimycin oder DNJ) und dessen N-Alkylderivate sind bekannte Inhibitoren von dem N-gebundenen Oligosaccharid verarbeitenden Enzymen, α-Glucosidase I und II. Saunier et al., J. Biol. Chem. 257, 14155-14161 (1982); Elbein, Ann. Rev. Biochem. 56, 497-534 (1987). Als Glucoseanaloge haben sie außerdem das Potential, Glucosyltransferasen zu inhibieren. Newbrun et al., Arch. Oral Biol. 28, 516-536 (1983); Wang et al., Tetrahedron Lett. 34, 403-406 (1993). Ihre inhibitorische Aktivität gegen die Glucosidasen hat zur Entwicklung dieser Verbindungen als antihyperglycemische Mittel und antivirale Mittel geführt. Siehe z. B. PCT Internationale Anm. WO 87/03903 und U. S. Patente: 4,065,562; 4,182,767; 4,533,668; 4,639,436; 4,849,430; 4,957,926; 5,011,829; und 5,030,638.
Studien über die Wirksamkeit von inhibierenden Mitteln auf Hepatitis B Virus (HBV) sind bisher spärlich gewesen auf Grund des Mangels an zugelassenen Zellkultursystemen für Versuchszwecke. Das heißt die bisherige Unfähigkeit, Zellkulturen zu reproduzieren und auf produktive Weise mit dem Virus zu infizieren ist eine ernsthafte Begrenzung der Entdeckung von brauchbaren anti-HBV Mitteln gewesen.
In einer Studie wurde über N-Methyldeoxynojirimycin berichtet, daß es die Bildung von Maushepatitisvirus (MHV) inhibiert, wobei das Erscheinen von E2 auf der Zelloberfläche verzögert wurde. Siehe Repp et al., J. Biol. Chem. 280, 15873-15879 (1985); Datema et al., Pharmac. Ther. 33, 221-286, bei 260 (1987). Jedoch hat MHV keine Beziehung zu dem Hepatitis B Virus (HBV). Einerseits ist HBV ein Mitglied der Hepadnavirus-Familie und ist ein kleines Virus, gegenüber Menschen pathogen. Die HBV Größe beträgt etwa 42 nM mit einer DNA Genomgröße von 3,5 kb.
Andererseits ist MHV ein Mitglied der Coronavirus-Familie und ist ein großes RNA-haltiges Virus das nicht pathogen gegenüber Menschen ist, obgleich menschliche Coronaviruspathogene, die Infektionen der oberen Atemwege verursachen, üblich sind. Die MHV Größe beträgt etwa 100-150 nM (wobei es ziemlich pleiotropisch ist), mit einer RNA Genomgröße von etwa 30 kb. Es bestehen ziemlich wenige Ähnlichkeiten zwischen HBV und MHV. Weitere Hintergrundinformation und vollständige Beschreibung der Coronaviren (einschließlich MHV) kann man bekommen durch Bezugnahme auf K. Holmes, in Virology, 2. Auflage, aufgelegt durch B. Fields, Seiten 841-856, Raven Press, New York, NY, 1990.
Die Unfähigkeit die Ergebnisse von einem Virus für das andere Virus vorauszusagen, ist ersichtlich aus den kürzlichen Berichten von zwei unterschiedlichen wissenschaftlichen Gruppen, daß Hepatitis Delta Virus (HDV) Sekretion nicht abhängig war von HBVsAg Glycolisierung. W. Hui-Lin et al., Abstr. 115, und C. Gureau et al., Abstr. 117, in Abstracts of Papers Presented at the 1994 Meeting, "Molecular Biology of Hepatits B Viruses", October 3-6, 1994, Institut Pasteur, Paris, France.
HDV spezifiziert nicht sein eigenes Hüllprotein. Es infiziert die gleichen Zellen wie HBV und verwendet das HBV S Antigen (HBV Hüllprotein) um infektiöse, reife HDV Teilchen herzustellen. Mit Hilfe von Bestimmung hängt die HBV Sekretion von der Glycosylierung und Glycantrimming ab. Das heißt obgleich HBV und HDV aus den gleichen Hüllproteinen zusammengesetzt sind, ist die HDV Sekretion unabhängig von der Glycosylierung, während HBV sehr empfindlich gegenüber Glycosylierung ist.
Die Wirkung des Glycosylierungsinhibitors, Tunicamycin, auf Hepatitis B Virus Zellkultursysteme ist beschrieben worden durch Pizer et al., J. Virol. 34, 134-153 (1980); Datema et al., supra bei 270. Jedoch verhindert Tunicamycin unerwünschterweise und vollständig die Addition von N-gekoppelten Oligosacchariden an neu synthetisierte Polypeptide. Das heißt die Behandlung mit Tunicamycin resultiert in vollständiger Inhibierung der N-gekoppelten Glycosylierung von Proteinen und ist sehr toxisch gegenüber Zellen. Außerdem resultiert die Tunicamycin-Behandlung von HBV infizierten Zellen in einer signifikanten Reduktion der HBV Sekretion.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird ein Medikament bereitgestellt zur Inhibierung von Hepatitis B Virus (HBV) in Zellen, die mit diesem Virus infiziert sind. Die Methode umfaßt die Verwendung eines N-Alkylderivates von 1,5-Dideoxy-1,5-imino-D-glucitol, worin diese Alkylgruppe von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, in einer wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung dieser Zellen, um Replikation und Sekretion von HBV Virionen zu inhibieren. Die N- Alkylgruppe ist vorzugsweise Butyl.
In einem bevorzugten erläuternden Beispiel der Erfindung wird bei N-Butyl-1,5-dideoxy-1,5-imino- D-glucitol (NB-DNJ) gezeigt, daß es die Sekretion von HBV Teilchen unterdrückt und intrazelluläre Retention von HBV DNA in sowohl stabil transfizierten HepG 2.2.15 Zellen als auch HBV infizierten HepG2 Zeilen verursacht.
HepG2 Zellen sind wohl bekannte, weit verstreute und leicht erhältliche human Hepatoma-Zellen. Die Schaffung und die Eigenschaften der HepG2 Zelllinie werden beschrieben in U. S. Patent 4,393,133. Proben dieser Zelllinie sind außerdem erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8065 und von der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK. Diese Zellen sind verwendet worden als eine Quelle von unterschiedlichen Proteinen, d. h. Gewebefaktorinhibitor (TFI) auch bekannt als Lipoprotein verbundene Coagulationsinhibitor (LACI) durch Broze und Miletich, Proc. Natl, Acad. Sci. US 84, 1886-1890 (1987) und in US. Patenten 4,996,852, 5,106,833 und 5,212,091.
HepG 2.2.15 Zellen sind Derivate von HepG2 Zellen und werden hergestellt wie beschrieben durch Sells et al., Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987).
Die Unterdrückung der Sekretion von HBV Teilchen durch die erfindungsgemäße Verwendung war äußerst unerwartet, da vorher berichtet worden war, daß Tunicamycin-Behandlung von HBV produzierenden Zellen in einer normalen HBV Teilchensekretion resultiert. Siehe Grippon et al., Mol. Biol. HBV, San Diego, CA, Abstract Seite 67 (1992). Es wurde gefunden durch die vorliegenden Erfinder, daß die Sekretion von HBV Virionen, jedoch keine überlebenden Teilchen, inhibiert wird durch die vorliegende Erfindung.
Die Zunahme an intrazellulärer HBV DNA, resultierend aus der Behandlung durch die erfindungsgemäße Methode, war ebenfalls unerwartet.
Da HBV Hüllproteine nur ein oder zwei N-gekoppelte Glycane je Molekül enthalten, war die Fähigkeit, die Sekretion eines solchen mittleren (bezogen auf Gewicht) glycosylierten Proteins und ihre virionen Produkte durch die N-Alkylderivate von DNJ überraschend im Gegensatz zu ihrer geringeren Wirkung auf die Sekretion von HIV, das stark glycosylierte Hüllproteine enthält, es war außerdem unerwartet, zu finden, daß HBV Virionen und Teilchen, die große Cocarboxy-terminale Proteine, LHBs und mittlere MHBs enthalten empfindlicher gegenüber N-Butyl DNJ waren als kleine SHBs angereicherte Teilchen.
Ein anderer Vorteil der Verwendung der definierten N-Alkylderivate von DNJ ist deren relative nicht-Toxizität. Beispielsweise weiß man, daß das N-Butylderivat nicht toxisch ist (TD&sub5;&sub0; > 5 mM) bei seiner wirksamen Konzentration zur Inhibierung von HIV Replikation (ECK = 43 uM). Siehe z. B. Bryant et al., Abstracts of 10th International Conference on AIDS, Berlin, June 7-11, 1993. Es wurde außerdem hier gezeigt, daß 90% von HepG 2.2.15 Zellen, die infiziert waren mit HBV und behandelt waren mit 1000 ug/ml des N-Butylderivates von DNJ, genauso lebensfähig waren wie unbehandelte Kontrollproben.
In Hinblick auf die hier demonstrierten Ergebnisse glaubt man, daß andere Verbindungen, die den Transport von HBV Virionen oder Stufen bei dem Glycosylierungstrimmweg inhibieren, brauchbar sein werden bei der Inhibierung von HBV Morphogenese in Zellkulturen und Säugerwirten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Während die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die besonders den Gegenstand, der die Erfindung bildet, besonders darlegen und genau beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung besser verstanden wird aus der folgenden erläuternden detaillierten Beschreibung zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 die Genkarte von HBV Hüllproteinen zeigt. Die oberste Linie zeigt eine lineare Karte von HBs Genen, mit den angegebenen preS1, preS2 und S Domänen. Die Nummern unter dieser Karte zeigen die Grenzen der Domänen an, ausgedrückt als Aminosäurenummer. Die Nummern variieren für unterschiedliche HBV Stränge. Die Prozentangaben in der rechten Spalte zeigen die Fraktion von nicht-, mono- und di-glycosylierten Proteinen für jedes HBs. Werte stammen von Gerlich und Bruss, in Molecular Biology of Hepatits B Virus, herausgegeben von A. McLachlan, CRC Press, Seiten 109-144 (1992) und in Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, herausgegeben von R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc., Seiten 41-82 (1992).
Fig. 2 zeigt in zwei Teilen, Fig. 2A und 2B, Autoradiogramme von HBV DNA im Medium und Zellen von Kulturen, die mit N-Butyldeoxynojirimycin (NBDNJ) behandelt wurden. HepG 2.2.15 Zellen waren 6 Tage lang gezüchtet in Gegenwart der angegebenen Konzentration von NBDNJ mit einer Veränderung des Mediums. Nach dem sechsten Tag (sieben Tage in Kultur) wurden Zellen und Medium gesammelt. Autoradiogramme der gefundenen viralen DNA durch Hybridisierung von Membranen zu HBV Sonden werden gezeigt.
Fig. 2A: Autoradiogramm eines Southern blot von DNA, gewonnen aus dem Medium von 2.2.15 Zellen, die im Medium ohne NBDNJ (Bahnen 1 und 2) und in den folgenden NBDNJ Konzentrationen gehalten wurden: 200 ug/ml (Bahn 3); 500 ug/ml (Bahn 4) und 1000 ug/ml (Bahn 5).
Fig. 2B: Autoradiogramm von Southern blot von gesamter intrazellulärer DNA, vollständig digestiert mit EcoRI, aus Zellen, die in Abwesenheit von NBDNJ (Bahn 1) und in Gegenwart der folgenden NBDNJ Konzentrationen gehalten wurden:
Bahn 2: 200 ug/ml;
Bahn 3: 500 ug/ml;
Bahn 4: 1000 ug/ml.
Bahn 5: EcoRI digestierte DNA, isoliert von Virionen, die aus unbehandelten 2.2.15 Zellen hergestellt wurden.
Bahn 6: Plasmid DNA als Hybridisierungskontrolle. Pfeile zeigen die erwartete Mobilität für entspannte zirkuläre HBV Genome (A) und linearisierte 3.2 kb Genome (B) an.
Fig. 3 in vier Teilen, Fig. 3A, 3B, 3C und 3D zeigt Gelelektrophorese und Histogramme von HBV DNA in den Zellen und im Medium von HepG2 Zellen, die mit HBV infiziert und mit NBDNJ behandelt wurden.
Fig. 3A und Fig. 3C: DNA von Virionen, immun ausgefällt mit monoclonalen Antikörpern zu MHBs, wurde amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und aufgelöst durch Agarosegelelektrophorese.
Bahn 1: Molekulargewicht-Markierungen;
Bahn 2: leer;
Bahn 3: Medium von Zellen, die kein NBDNJ erhielten;
Bahnen 4 und 5: Medium von Zellen, die 200 ug/ml NBDNJ erhielten;
Bahnen 6 und 7: 500 ug/ml NBDNJ;
Bahnen 8 und 9: 700 ug/ml NBDNJ, 10 und 11: 1000 ug/ml NBDNJ.
Diese Banden wurden sichtbar gemacht durch Dichtemessung und die Bereiche unter den Peaks werden in Fig. 3C gezeigt, worin das Mittel der beiden Proben von jeder NBDNJ Konzentration abgetragen wurde.
Fig. 3B und Fig. 3D: DNA von dem intrazellulären Feld der in Fig. 3A mit HBV infizierten und mit NBDNJ behandelten Kulturen wurden durch PCR amplifiziert. Die Bahnen enthalten amplifizierte DNA von folgenden Proben: (A)
Bahnen 1 und 2: kein NBDNJ;
Bahnen 3 und 4: 200 ug/ml NBDNJ;
Bahnen 5 und 6: 500 ug/rnl NBDNJ;
Bahnen 7 und 8: 700 ug/ml NBDNJ;
Bahnen 9 und 10: 1000 ug/ml NBDNJ.
Fig. 3D: Histogramm des Bereichs unter den mittleren Peaks der densitometrischen Spur des Gels in Fig. 3B.
Fig. 4 in sechs Teilen, Fig. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F, zeigen HBV Antigene, die in dem nicht-fraktionierten Kulturmedium vorliegen und teilweise gereinigte Virionenpräparate. Gleiche Volumen der angegebenen Proben wurden auf HBV Hüllantigene getestet, unter Anwendung der Enzymgebundenen Imminosorbent-Versuchsmethode (ELISA). Proben von nicht fraktioniertem Medium (Fig. 4A, 4B und 4C) oder teilweise gereinigtem Virus (Fig. 4D, 4E und 4F) von 3-tägigen Kulturen wurden getestet auf HBV SHBs ("S) (Fig. 4A und 4D), LHBs: "PreS1" (Fig. 4B und 4E) oder MHBs "PreS2" (Fig. 4C und 4F) Epitopen. Die Kulturen wurden in der angegebenen Konzentration von NBDNJ gehalten, ausgedrückt in millimolaren Einheiten und gezeigt entlang der X- Achse.
Zum Vergleich, 2,28 mM gleicht in etwa 500 ug/ml NBDNJ. Die Y-Achse zeigt das kolorimetrische Signal der ELISA Reaktion in willkürlichen OD Einheiten, abgelesen durch den Plattenableser.
Fig. 5 in drei Teilen, Fig. 5A, 5B und 5C, zeigt Western blot Analyse von LHBs und MHBs im Medium von NBDNJ behandelten und unbehandelten Kulturen. Polyethylenglycol (PEG) Prezipitate von Kulturmedium (Fig. 5A) oder teilweise gereinigte Virionen, HBs Fasern und Kugeln von ungereinigten (Fig. 5B) und NBDNJ behandelten (Fig. 5C) Kulturen wurden aufgelöst durch SDS-PAGE (13,5% Acrylamid), auf Immobilinpapier übertragen und mit PreS1 und PreS2 spezifischen monoclonalen Antikörpern inkubiert.
- Die Bahnen sind wie angezeigt über jedem Teil von Fig. 5. 1,0 ug des HBV Genotyps D, gereinigt aus Humanserum wird als Kontrolle verwendet.
- Molekulargewichtsanzeigen (mw) in Kilodalton (kd) werden auf der rechten Seite von jedem Teil von Fig. 5 gezeigt.
- Pfeile auf der linken Seite zeigen LHBs (51) und MHBs (52) Polypeptide.
Die HBV Hülle enthält drei Co-Carboxy-terminale Proteine (HBs), genannt großes (LHBs), mittleres (MHBs) und kleines (SHBs) Protein (siehe Fig. 1). Diese Proteine resultieren aus der alternierenden Translationsinitiation eines einzigen offenen Leserasters (ORF) [Ganem, in Hepadnaviren, Herausgeber Mason und Seger (Springer-Verlag), Seiten 61-84 (1991)]. Alle drei HBs Proteine kommen vor mit den komplexartigen N-gekoppelten Oligosacchariden an Aminosäure 146 der S-Domäne [siehe Fig. 1 und Gerlich und Bruss, in Molecular Biology of Hepatitis B Virus, Herausgeber A. McLachlan, CRC Press, Seiten 109-144 (1992) und in Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, Herausgeber R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc., Seiten 41-82 (1992)].
MHBs (jedoch niemals LHBs) kommen ebenfalls vor mit Hybrid-artigen Oligosacchariden innerhalb der preS2-Domäne. Während der natürlichen Infektion mit HBV produziert die Leber einen großen Überschuß an HBs Proteinen, die entweder als faserige oder kugelige sub-virale Teilchen mit einem Durchmesser von 20nM abgeschieden werden [Ganem, in Hepadnaviren, Seiten 61-84 (1991); und Gerlich und Bruss, in Molecular Biology of Hepatitis B Virus und in Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, supra.]. HBs Kugeln sind am reichlichsten vorhanden und enthalten fünf bis zehnmal weniger LHBs als HBs Fasern und HBV Teilchen. MHBs ist die geringste Komponente von allen drei Typen von Teilchen [Gerlich and Bruss, in Molecular Biology of Hepatitis B Virus und in Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, supra.].
Die Morphogenese von HBV ist komplex. Man glaubt, daß vorvereinigte virale Kernteilchen sich an die cytosolischen Stellen von viralen Hüll-(Oberfläche)-Proteinen anlagern, die in die endoplastische Reticulum-(ER)-Membran eingefügt wurden [Gerlich and Bruss, in Molecular Biology of Hepatitis B Virus und in Hepatits B Vaccines in Clinical Practice, supra.].
Nach Erreichen der Hüllen entwickeln sich die Virionen zu dem Lumen von ER, von wo sie durch den Golgi Apparat in die extrazelluläre Flüssigkeit transportiert werden. Unreife Glycoproteine enthalten drei terminale Glucosereste an den N-gekoppelten Oligosacchariden.
Man glaubt, daß die Entfernung der terminalen Glucosereste eine wichtige Rolle bei der Migration von unreifen Glycoproteinen von dem ER zu dem Golgi spielt [Datema and Romero, Phamacol. Thera. 33, 221-286 (1987)]. Der Imminozucker, NBDNJ, ist ein potenter Inhibitor von α-Glucosidase I, ein zelluläres Enzym, das terminale Glucosereste von entstehenden Oligosacchariden entfernt, und man fand, daß er die Bildung von cytotoxischen Human Immunodeficiency Virus (HIV) in vitro unterdrückt [Karpas et a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9229-9233 (1988); U. S. Patent 4,849,430 und Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8120-8124 (1987). Da HBV Sektretion LHBs und SHBs erfordert, die beide N-gekoppelte Oligosaccharide tragen, wurde die Wirkung von NBDNJ auf Virussynthese getestet.
Um die Erfindung weiter zu erläutern wurden nachstehende detaillierte Beispiele durchgeführt, obgleich zu verstehen ist, daß die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele oder darin beschriebene Einzelheiten begrenzt ist.

BEISPIELE

METHODEN:

Zellen und Medien:

HepG2-Zellen wurden geliefert von der European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK). HepG2 2.15 [2.2.15, Sells and Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)] Zellen wurden erhalten von Dr. George Acs (Mt. Sinai Medical College, New York, USA).
Alle Kulturgewebe wurden in 5% CO&sub2; in RPMI 1640 (GIBCO) Medium gehalten, das ergänzt worden war durch 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kalbsserum (Techgen, London, U. K.), 50 units/ml Penicillin und Streptomycin, 1mM Glutamin (GIBCO). Für 2.2.15 Zellen wurde dem Medium 200 ug/ml Antibiotikum G418 (Genticin, GIBCO) zugesetzt wie in Sells und Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987).
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gemessen durch Fließcytometrie unter Verwendung eines FACScancytometers, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA, nach Inkubierung mit Propidiumiodid, wie in Platt und Jacob, Eur. J. Biochem. 208, 187-193 (1992).

Infektion von HepG2-Zellen:

HBV wurde gereinigt aus Humanserum oder aus dem Medium von kultivierten Zellen durch Sedimentation auf zwischen 40 und 46% Saccharose (w/w) gefolgt durch Ultrazentrifugierung, [Seifer et al., Virol. 179, 300-311 (1990)]. Virionen wurden dialisiert in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, eingeengt, behandelt mit V8-Protease (aus Staphylococcus aureus, Sigma Chemical Co.) über Nacht bei 37ºC, 8 Stunden zentrifugiert durch 20% Saccharose10,01 M Tris, pH 7,4, 0,14M NaCl, 0,005 M EDTA (TNE) Kissen. Die Pellets wurden resuspendierfin Wachstumsmedium und dann verwendet, um HepG2-Zellen zu inokulieren.

Immunzuckerverbindungen:

Die Synthese von NBDNJ ist wohl bekannt und wird beschrieben durch Fleet et al. FEBS Letters 237, 128-132 (1988). NBDNJ wird geliefert durch G. D. Searle/Monsanto Co. als Verbindung SC- 48334.

Ermittlung von viraler DNA:

Medium von etwa 5 · 10&sup6; Zellen wurde mit Polyethylenglycol (PEG) 8000 (Sigma) ausgefällt, nach Klärung wie in Sells und Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987) in 0,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und durch ein Kissen aus 20% Saccharose in PBS 5 Stunden lang bei 50.000 rpm in einem Beckman T100.3 Rotor sedimentiert (etwa 75.000 · g).
DNA wurde hergestellt aus Pellets wie in Sells und Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005- 1009 (1987). Für Southern blots [Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)], wurde DNA durch Elektrophorese aufgelöst durch 1,2% Agarose, in H+ gebundenes (Amersham) Filterpapier übertragen und hybridisiert mit radioaktiver 32p (Amersham) HBV Sonde (hergestellt durch die Random Priming Methode, beschrieben durch den Kit Hersteller (Amersham) unter Verwendung von pHBV als Templat [Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2888-2892 (1991)].
Progenie-Virus im Medium von HepG2-Zellen, die infiziert waren mit Serum, das von HBV stammte, wurde durch Ausfällungsmedium mit monoclonalen Antikörpern gegenüber den PreS2 Epitopen ermittelt. DNA von immun ausgefällten Virionen wurde amplifiziert durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern aus Nucleotiden 2815 und 190 mit Bezug auf das virale Genom (unter Verwendung der EcoRl Stelle als Nuclotid 1). DNA wurde hergestellt aus Zelllysaten durch Standardmethoden, wie beschrieben durch [Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)].

Ermittlung von HBV Proteinen durch den Enzyme Linked Immunoabsorbant-Versuch (ELISA).

Die hier verwendeten monoclonalen Antikörper sind wohl bekannt und werden beschrieben durch Heerman et al., J. Virol. 52, 396-402 (1984) für Antikörper gegenüber PreS1 (MA 18/7); Heerman et al., Intervirology 28: 14-21 (1987) für Antikörper gegen PreS2 (Q 19/10) siehe auch Gerlich and Bruss, Molecular Biology of Hepatits B Virus, Herausgeber A. McLachlan, CRC Press, 109-144 (1992) und in Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, Herausgeber R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc., Seiten 41-82 (1992) und Heerman et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease, Herausgeber Zuckermann, A. R. Liss, 697-701 (1988) für Antikörper gegenüber S (C20-2).].
Proben wurden inkubiert in geschichteten Mikrotiternäpfchen (über Nacht bei 4ºC) mit monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für LHBs, MHBs oder SHBs Epitopen sind und mit 1% BSA in PBS blockiert. Nach Inkubierung mit Virusproben 1 Stunde lang (37ºC) wurden die Platten 4 mal gewaschen mit PBS/0,1% Tween 20 nicht ionisches Detergent.
Gebundene Antigene wurden bestimmt durch Inkubierung mit Peroxidase, die mit Ziegen anti-HBs Antikörper konjugiert war (Behring), gefolgt durch Entwicklung in Orthophenylendiamin (0,33 mg/ml PBS-Peroxid-Lösung). Optische Dichte wurde abgelesen in einem Behring Plattenableser. Tests an gereinigtem Virus und Gesamtmedium wurden durchgeführt über eine Serie von Probenverdünnungen, um die richtige Quantifizierung sicherzustellen.

Western Blots:

Proben wurden in Puffer gelöst, durch Elektrophorese aufgelöst durch 13,5% SDS Polyacrylamidgele (SDS-PAGE) und auf PVDF (Millipore) Membrane übertragen und mit 5% Milchpulver blockiert wie in Gultekin und Heerman, Analytical Biochem. 172, 320-329 (1989) beschrieben. Nach Inkubierung mit primären Antikörpern über Nacht bei Raumtemperatur in 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TNE und zweitem Antikörper (Peroxidase konjugiert mit Ziegen anti- Maus IgG Serum) eine Stunde lang in TNE bei Raumtemperatur, wurden die Membranen in Peroxid-Diaminobenzidin entwickelt (Sigma) PBS, wie in der Gebrauchsanweisung des Herstellers beschrieben.

ERGEBNISSE

NBDNJ reduziert die Menge an mit HBV DNA verknüpften Virionen, die in das Medium durch 2.2.15 Zellen freigesetzt wird:

2. 2.15 Zellen wurden gewonnen aus der HepG2 Linie und chronisch infektiöse HBV als auch subvirale Teilchen in das Kulturmedium abgesondert [Heerman et al., J. Virol. 52, 396-402 (1984); und Sells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)].
Um die Wirkung von NBDNJ auf die Produktion und Sekretion von HBV zu bestimmen, wurden 2.2.15 Zellen im Medium gehalten, das einen Bereich von NBDNJ Konzentrationen aufwies sechs Tage lang, mit einer Veränderung des Mediums am dritten Tag. Nach sechs Tagen in der Verbindung wurde DNA vom Virus isoliert (wie unter vorstehenden "Methoden" beschrieben). Virale DNA wurde bestimmt durch Hybridisierung von Southern blots zu radioaktiv markierten HBV DNA Sonden, wie in Fig. 2A gezeigt.
Virus-spezifische DNA, die mit der erwarteten Mobilität von entspannten Kreisen und DNA mit linearer Genomenlänge migrierte [Sells et al., J. Virol. 62, 2836-2844 (1988)] wurde bestimmt in den Proben, die von unbehandeltem Kulturmedium stammten (Bahnen 1 und 2). Es besteht eine klare Dosis abhängige Abnahme an Virus-spezifischer DNA, die von dem Zellmedium stammt, die mit NBDNJ behandelt wurde (Bahnen 3, 4 und 5). Der in Fig. 2A gezeigte Autoradiograph wurde durch Densitometrie quantifiziert. Densitometrie ergab, daß 500 ug/ml (2,28 mM) und 1000 ug/ml NBDNJ in einer Abnahme von 90 bzw. 99% resultierte.
Die Abnahme erfolgte nicht auf Grund von Toxizität von NBDNJ, da 90% der Zellen, die sechs Tage lang in 1000 ug/ml NBDNJ gehalten wurden, so lebensfähig waren wie unbehandelte Kontrollen wie bestimmt durch FACs Analyse von mit Propidiumiodid gekennzeichneten Zellen und [35]-S Methionin- Einarbeitung in Proteine.

2.2.15 Zellen, die mit NBDNJ behandelt wurden enthalten erhöhte Spiegel an intrazellulärer HBV DNA.

Die durch NBDNJ vermittelte Verringerung an mit HBV DNA verknüpften Virionen im Medium könnte erfolgt sein auf Grund einer Verringerung an viraler DNA Synthese. Alternativ könnte sie erfolgt sein auf Grund eines post-synthetischen Ereignisses wie Virionzusammenschluß, Transport oder Austritt aus den Zellen. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Menge an intrazellulärer HBV spezifischer DNA in unbehandelten und NBDNJ behandelten 2.2.15 Zellen verglichen.
Gesamtzelluläre DNA wurde hergestellt aus behandelten und unbehandelten Zellen und vollständig digestiert mit EcoRI, um virale Genome zu linearisieren. Fast gleiche Microgramm Mengen an Digestionsprodukten, (wie durch Ethidiumbromidfärbung und Hybridisierung an eine zellspezifische Sonde bestimmt) wurden aufgelöst durch Elektrophorese, Southern blotted und hybridisiert mit der HBV spezifischen Sonde (Fig. 2B). HBV Genome mit Einheitslängen, die als 3,2 kb Banden migrierten, wurden in DNA festgestellt, die von unbehandelten 2.2.15 Zellen (Bahn 1) und Virionen stammten, die aus Kontrollkulturmedium isoliert worden waren (Bahn 5).
Bahnen 2, 3 und 4 enthalten DNA, die von Zellen stammt, die mit 200, 500 bzw. 1000 ug/ml NBDNJ behandelt worden waren. Es besteht ein klarer Dosis abhängiger Anstieg in der Menge an HBV DNA, die in NBDNJ behandelten Zellen vorliegt verglichen mit unbehandelten Zellen. Die Densitometrie dieser Autoradiogramme legt nahe, daß Zellen, die mit 200, 500 und 1000 ug/ml NBDNJ behandelt wurden, einen 1,7-, 3,0-, 5,1-fachen Anstieg in HBV-Kopiefülle zeigen, wenn auf Beladungsvariationen eingestellt wird unter Anwendung von Hybridisierung zu einem zellulären MHC Klasse III Gen, G1, als eine Beladungskontrolle.

HepG2 Zellen, infiziert mit HBV und behandelt mit NBDNJ, setzen weniger Progenievirus frei.

2.2.15 Zellen sind ein geeignetes System, um HBV Produktion in einer stabil transfizierten Umgebung zu studieren. Jedoch HBV Pregenomsynthese in diesen Zellen kann von integrierten viralen DNA Templaten erfolgen und nicht kovalent geschlossenen zirkularen viral DNA Templaten, wie man annimmt, daß sie während natürlicher Infektion erfolgen [Sells et al., J. Virol. 62, 2836-2844 (1988)]. Außerdem produzieren diese Zellen blanke Kernpartikel als auch eine Vielzahl von subgenomen viralen DNA Produkten, die in das Medium freigesetzt werden [Sells et al., supra].
Deshalb wurden HepG2 Zellen mit Protease modifiziertem HBV infiziert. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium ersetzt durch entweder Kontrollmedium oder Medium, das unterschiedliche Konzentrationen von NBDNJK enthielt. Fünf Tage nach der Infektion wurden Progenie-Virionen immun ausgefällt mit monoclonalen Antikörper spezifisch für die zentrale Portion der PreS2 Domäne. HBV spezifische DNA Sequenzen wurden amplifiziert durch PCR unter Verwendung von HBV spezifischen Primern. Produkte dieser Reaktion wurden aufgelöst durch Agarosegelelektrophorese und sichtbar gemacht nach Ethidiumbromidfärbung (Fig. 3A). Die 519 Basen-Paar-Produkte (Pfeil, Fig. 3A) wurden quantifiziert durch densitometrische Analyse und der Fleck wird in Fig. 3C gezeigt. Obwohl PCR die Unterschiede zwischen ursprünglichen DNA Konzentrationen in Proben unterbewerten kann, ist es ersichtlich, daß Medium von Zeilen, die mit Protease behandeltem Virus infiziert wurden und mit 700 ug/ml (3,2 mM) NBDNJ behandelt wurden, eine Größenordnung weniger virale DNA enthalten als unbehandelte Proben. Diese Ergebnisse zeigen, daß die NBDNJ vermittelte Verringerung an HBV, das in das Medium freigesetzt wird, nicht dem transfizierten 2.2.15 Zellsystem eigen ist.

HepG2 Zellen, infiziert mit HBV und behandelt mit NBDNJ, enthalten erhöhte Mengen an intrazellulärer HBV DNA.

Da das Kulturmedium von HBV infizierten HepG2 Zellen, behandelt mit NBDNJ, ähnlich den 2.2.15 Zellen war mit Bezug auf die reduzierte Menge von mit DNA verknüpften Virionen, war es von Interesse, zu wissen, ob ein gleichzeitiger Anstieg an viraler DNA innerhalb der behandelten Zellen vorlag. Die gesamtzellulare DNA wurde hergestellt aus Proben, die denjenigen in Fig. 3A und C entsprachen. Intrazelluläre HBV spezifische DNA wurde unter Verwendung von PCR amplifiziert. Produkte der Reaktion wurden aufgelöst durch Agarosegelelektrophorese und das Ethidiumbromid gefärbte Gel (Fig. 3B) wurde durch Densitometrie analysiert (Fig. 3D). HepG2 Zellen, die mit HBV infiziert worden und mit NBDNJ nachbehandelt wurden speicherten klar größere Mengen an viraler DNA als unbehandelte Zellen.

Das behandelte Kulturmedium von NBDNJ und unbehandelte 2.2.15 Zellen enthielten ähnliche Mengen an HBV Hüllantigen.

2. 2.15 Zellen scheiden Virionen ab als auch sub-virale Teilchen [Sells et al., J. Virol. 62, 2836- 2844 (1988)]. Die durch NBDNJ vermittelte Reduktion an Virion-verknüpfter DNA im Kulturmedium könnte eine Reflektion auf eine allgemeine Verminderung der Sekretion von allen HBS enthaltenden Partikeln sein. Wahlweise könnte eine selektive Verringerung der seltenen Virionteilchen stattgefunden haben mit einer relativen Einsparung der anderen Formen, die in verschwenderischem Überschuß vorliegen.
Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Menge und Art der Hüllantigene im Kulturmedium durch sowohl ELISA als auch Western Analyse bestimmt. Eine ELISA Analyse von SHBs, MHBs und LHBs Antigen, die im klaren Kulturmedium vorlagen wird in Fig. 4A, B und C gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß keine signifikante Wirkung auf die Gesamtmenge von SHBs (S) und LHBs (PreS1) Antigenen im Medium vorliegt. Es besteht eine gemäßigte, Dosen abhängige Verringerung der Gesamtmenge an MHBs (PreS2) Antigen im Medium. Diese Verringerung beträgt etwa das 2,5 fache bei der höchsten NBDNJ Konzentration (4, 5 mM oder etwa 1000 ug/ml). Diese Ergebnisse wurden bestätigt durch Western blot Analyse. Fig. 5A zeigt Western blots des Mediums von Kontrollkulturen und von denjenigen, die mit 1000 ug/ml behandelt wurden. Hier wird gezeigt, daß Medium von mit NBDNJ behandelten (Fig. 5A, Bahn 3) und unbehandelten Kulturen (Fig. 5A, Bahn 2) ähnliche Mengen an MHBs (52) und LHBs (51) Antigen enthalten.
Somit verursacht NBDNJ keine allgemeine Reduktion der Menge an SHB und LHBs Antigenen im Kulturmedium. Es besteht jedoch eine zweifache Verringerung an der Menge von MBHs Antigen im Medium von 2.2.15 Zellen, die mit 1000 ug/ml NBDNJ behandelt wurden, wie durch ELISA bestimmt.

Das Kulturmedium von mit NBDNJ behandelten 2.2.15 Zellen enthält reduzierte Mengen an HBV Hüllantigenen, die als intakte Virionen sedimentieren.

Um die Menge an HBs zu bestimmen, die in intakten Virionen vorliegt, wurde Medium von den angegebenen Kulturen fraktioniert durch Saccharose-Gradienten durch Ultrazentrifugierung. Ausgeschiedene Virionen, die von behandelten und unbehandelten Kulturen stammten und in 40-46% Saccharose sedimentierten, wurden eingeengt und auf HBs Proteine durch ELISA getestet. Fig. 4D, 4E und 4F zeigen die Ergebnisse. Alle Formen von HBs waren leicht feststellbar in Proben, die Virionen enthielten, die aus dem Medium von unbehandelten 2.2.15 Zellen hergestellt worden waren.
Andererseits befanden sich tatsächlich keine feststellbaren HBs Proteine in Proben, die aus dem Medium von behandelten Zellen mit 2,25 und 4,5 mM (etwa 500 und 1000 ug/ml zum Vergleich) NBDNJ behandelt worden waren. Dies legt eine reduzierte Menge an intaktem Virus im Medium dieser Proben dar.
Die ELISA Ergebnisse wurden bestätigt durch Western blot Analyse von Fraktionen von dem Saccharose-Gradienten, der entweder intaktes Virus, Fasern oder Kugeln (Fig. 5B, von unbehandelten Kulturen und 5C von mit NBDNJ behandelten Kulturen) enthielt. Gleiche Volumen dieser Fraktionen des Saccharose-Gradienten wurden aufgelöst durch SDS Gelelektrophorese, auf Membranen übertragen, mit Antikörper spezifisch gegen LHBs (PreS1) inkubiert, sichtbar gemacht und dann weiter inkubiert mit Antikörper spezifisch gegen MHBs (PreS2) Epitopen. Teilweise gereinigte HBV, die von Humanserum stammten, wird in Bahnen 5 präsentiert (Fig. 5B und 5C) als eine Kontrolle.
Fraktionen distal zu den Virion-haltigen Fraktionen (in der Nähe des Bodens des Gradienten) wurden aufgelöst in Bahn 1, um die Spezifizität des Antikörpers zu zeigen. Bahnen 2, 3 und 4 (Fig. 58 und Fig. 5C) enthalten das intakte Virus, HBs Faser bzw. Kugel-enthaltende Fraktionen wie durch Sedimentation in Saccharose bestimmt und die Gegenwart (für Virionen) und Abwesenheit (für sub-virale Teilchen) von viraler DNA. Es liegt eine Verringerung der Menge von allen in Virionen vorliegenden HBs Proteinen, Fasern und Kügelchen vor, die aus dem Medium von NBDNJ behandelten Kulturen hergestellt wurden (vergleiche Bahnen 2, 3 und 4 in Fig. 5B und 5C). Die Verringerung an MHBs (PreS2 Epitop) ist besonders ernst. Die in Fig. 5B und 5C gezeigten Bilder wurden durch Densitometrie quantifiziert.
Die Densitometrieanalyse ergab, daß die Verringerung an LHBs in NBDNJ behandelten Virionproben, verglichen mit unbehandelten Proben, etwa das 4-fache betrug. Die Verringerung an MHBs in den gleichen Bahnen (Fig. 5C, Bahn 2 verglichen mit Fig. 5B, Bahn 2) war 12-fach. Es wird bemerkt, daß der Gradient, der angewandt wurde, um die verschiedenen Formen von HBs Protein zu trennen in Fraktionen resultiert, die "angereichert wurden" für unterschiedliche Formen. Das heißt, daß die Virionen enthaltenen Fraktionen wahrscheinlich auch Fasern und Kugeln enthalten. Das kann eine Unterschätzung der Wirkung von NBDNJ auf die Freisetzung von Virionen verursachen relativ zu Kugeln und Fasern, wie durch immunologische Analyse entschieden wurde.
Trotzdem stimmen die Ergebnisse der Western blot Analyse überein mit derjenigen von ELISA dahingehend, daß Medium von mit NBDNJ behandelten Kulturen ähnliche Mengen an Gesamt-HBs- Antigenen enthält jedoch stark reduziertes Antigenmaterial in Virionenfraktionen.
Die hier beschriebenen inhibierenden Verbindungen können außerdem verwendet werden zur Verabreichung an Patienten, die mit HBV infiziert wurden durch übliche Maßnahmen, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln und Trägern. Diese Verbindungen können verwendet werden in der freien Aminform oder in ihrer Salzform. Pharmazeutisch verträgliche Salzderivate werden erläutert beispielsweise durch das HCl Salz.
Die inhibierenden Verbindungen können außerdem verwendet werden in Form von Pro- Arzneimitteln wie die 6-phosphorilierten Derivate, wie sie in U. S. Patenten 5,043,273 und 5,103,008 beschrieben werden und als O-acylierte Derivate, wie beschrieben beispielsweise in U. S. Patenten 5,003,072; 5,144,037 und 5,221,746. Ein bevorzugtes dieser Derivate ist 1,5-(Butylimino)-1,5-dideoxy-D- glucitol, Tetrabutyrat.
Die Menge an zu verabreichender wirksamer Verbindung muß eine wirksame Menge sein, d. h. eine Menge, die medizinisch günstig ist jedoch keine toxischen Wirkungen hervorruft, die die Vorteile überwiegt, die deren Verwendung begleitet. Es würde erwartet werden, daß die tägliche Dosis eines erwachsenen Menschen normalerweise zwischen etwa einem und etwa 1000 mg der wirksamen Verbindung liegen würde. Die bevorzugte Verabreichungsroute ist oral in Form von Kapseln, Tabletten, Sirupen, Elixieren und dergleichen, obgleich parenterale Verabreichung ebenfalls angewandt werden kann. Geeignete Formulierungen dieser wirksamen Verbindung in pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln und Trägern in therapeutischer Dosierungsform kann hergestellt werden mit Bezugnahme auf allgemeine Texte auf diesem Gebiet wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Herausgeber Arthur Osol, 16. Auflage, 1980, Mack Publisching Co., Easton, PA., USA.

Claims

1. Verwendung eines N-Alkylderivates von 1,5-Dideoxy-1,5-imino-D-glucitol, worin diese Alkylgruppe von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, in einer wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Hepatitis B Virusinfektionen in einem infizierten menschlichen Träger zur Inhibierung von Replikation und Sekretion von Hepatitis B Virionen.

2. Verwendung von Anspruch 1, worin die Alkylgruppe Butyl ist.

3. Verwendung von Anspruch 1, worin die wirksame Hemm-Menge von etwa 1 bis etwa 1000 mg ist.