DE69406544T2

DE69406544T2 - Etikettierreagenz und nachweismethode

Info

Publication number: DE69406544T2
Application number: DE69406544T
Authority: DE
Inventors: William Jonathan 5 Thorntree Drive Herts. Hp23 4Je Cummins; Edwin Oxford Ox2 6Xj Southern
Original assignee: Oxford Gene Technology Ltd
Current assignee: Oxford Gene Technology IP Ltd
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1998-02-26
Anticipated expiration: 2014-08-02
Also published as: EP0711362A1; CA2168010C; EP0778280B1; RU2158310C2; US6218111B1; WO1995004160A1; ES2108479T3; JPH09501830A; NO960370D0; CA2168010A1; GB9315847D0; ATE230409T1; AU7269194A; FI960403A; EP0711362B1; DE69406544D1; HUT73802A; DK0711362T3; CN1131440A; CN1088758C

Description

Bei biologischen und chemischen Analysen ist die Verwendung von Analytmolekülen, die mit Reportergruppen markiert sind, Routine. Die Erfindung betrifft den Gedanken, daß man Reagenzien mit mindestens zwei Analytgruppen bereitstellt, die mit einer oder mehreren Reportergruppen verbunden sind. Solche Reagenzien können auf den unten beschriebenen Wegen verwendet werden, um viel mehr analytische Information zu erzeugen, als einfach markierte Analyten es können. Es ist möglich, Reportergruppen so zu kodieren, daß Reagenzien, die mehrere Analytgruppen und mehrere Reportergruppen tragen, kombinatorisch synthetisiert werden können und gleichzeitig verwendet werden können und daß die Reportergruppen in der analytischen Stufe aufgelöst werden können.
WO 93/06121 (Affymax) beschreibt eine synthetische Oligoner- Bibliothek, die eine Vielzahl verschiedener Mitglieder umfaßt, wobei jedes Mitglied ein Oligoner umfaßt, das aus.einer Sequenz von Monomeren aufgebaut ist, die an eine oder mehrere kennzeichnende Markierungen gebunden sind, die die Sequenz von Mononeren in dem Oligomer identifizieren. Die Verbindung zwischen dem Oligoner und der Erkennungsmarkierung bildet bevorzugt ein festes Teilchen. Die Erkennungsmarkierung ist bevorzugt ein Oligonucleotid.
Proc. Natl. Acad. Sci., Band 89, Nr. 12, 15. Juni 1992, Seiten 5381 bis 5383 (S. Brenner und R.A. Lerner) beschreiben die kodierte kombinatorische Chemie zur Herstellung einer Bibliothek von Reagenzien, die jeweils eine genetische Oligonucleotidmarkierung enthalten.
In Rapid Communications in Mass Spectrometry, Band 6, Seiten 369 bis 372 (1992) beschreiben G.R. Parr et al. eine matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie von synthetischen Oligodesoxyribonucleotiden.
In Nucleic Acids Research, Band 21, Nr. 15, 25. Juli 1993, Seiten 3347 bis 3357, beschreiben E. Nordhoff et al. die Ionenstabilität von Nucleinsäuren bei einer durch Infrarotmatrix unterstützten Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie.
Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Reagenz umfassend
a) einen Analytanteil, der mindestens zwei Analytreste umfaßt und gebunden ist an
b) einen Markierungsanteil, der eine oder mehrere Reportergruppen umfaßt, die geeignet sind zum Nachweis durch Massenspektrometrie, unter Ausschluß von Oligonucleotiden,
wobei eine Reportergruppe einen Analytrest kennzeichnet und die Reportergruppe an jeder Position des Markierungsanteils so ausgewählt ist, daß sie einen Analytrest an einer definierten Position des Analytanteils kennzeichnet.
Bevorzugt ist der Analytanteil mit den Markierungsanteil über eine Bindung verbunden, die spaltbar ist, z.B. durch Licht spaltbar ist. Es kann eine Verbindungsgruppe vorgesehen sein, an die sowohl der Analytanteil als auch der Markierungsanteil gebunden sind. Bevorzugt ist der Analytanteil eine Kette von n-Analytresten und der Markierungsanteil ist eine Kette von bis zu n-Reportergruppen, wobei die Reportergruppe an jeder Position der Markierungskette so ausgewählt ist, daß sie den Analytrest an einer entsprechenden Position der Analytkette kennzeichnet. n ist eine ganze Zahl von mindestens 2, bevorzugt 3 bis 20.
Die Erfindung kann zum Nachweis aller interessierenden Analyten verwendet werden. Diese schließen eine Protein/Peptidkette, so daß die Analytreste Aminosäurereste sind; eine Nucleinsäure/Oligonucleotidkette, so daß die Analytreste Nucleotidreste sind; eine Kohlenhydratkette, so daß die Analytreste Zuckerreste sind, ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Außerdem kann der Analyt eine Klasse von kleinen Molekülen mit biologischer, pharmakologischer oder therapeutischer Aktivität sein. Zum Beispiel könnte es ein Kernmolekül sein, mit der Fähigkeit, verschiedene Substituentengruppen, z.B. Alkyl-, Ester-, Amin- und Ethergruppen etc. in kombinatorischer Weise mit Mass enspektronetrie-Markierungen zu variieren.
Der Markierungsanteil und/oder die oder jede Reportergruppe darin ist fähig beobachtet/nachgewiesen/analysiert zu werden, um Informationen über die Art des Analytanteils und/oder der Analytreste darin zu liefern.
In einer Ausführungsform hat das Reagenz die Formel A - L - R, worin A eine Kette von n-Analytresten ist, die den Analytanteil bilden, L der Linker ist, R eine Kette von bis zu n-Reportergruppen ist, die den Markierungsanteil bilden und n 2 bis 20 ist, wobei der Markierungsanteil Informationen enthält, die den Ort der Analytreste in dem Analytanteil definieren.
Der Markierungsanteil besteht aus einer oder mehreren Reportergruppen, die durch ihre Masse unterscheidbar sind und daher nit Massenspektronetrie analysiert werden können. Die Reportergruppen können chemisch unterschiedlich sein und daher voneinander durch das Molekulargewicht unterschieden werden. Oder die Reportergruppen können chemisch identisch sein, sich voneinander aber dadurch unterscheiden, daß sie verschiedene Isotopen enthalten (z.B. ¹²C/¹³C und ¹H/²H, wie unten diskutiert). Der Markierungsanteil und/oder die Reportergruppen sind geeignet oder ausgebildet zur Analyse durch Massenspektrometrie, z.B. nach Abspaltung von dem Reagenz mit photochemischen oder anderen Mitteln.
Die Vorteile der Massenspektrometrie als Nachweissystem sind: die große Empfindlichkeit - nur wenige 100 Moleküle sind notwendig, um ein gutes Signal zu ergeben; der weite dynamische Bereich und die hohe Auflösung - Moleküle in einen Massenbereich von 100 bis 200.000 Dalton können aufgelöst werden mit einer Auflösung von mehr als 0,01; die Vielseitigkeit - Moleküle mit vielen verschiedenen chemischen Strukturen können leicht analysiert werden; die Möglichkeit Analyten bildlich darzustellen, indem die Massenspektrometrie z.B. mit einer Raster-Laser-Desorption kombiniert wird; und die Fähigkeit, quantitative statt nur qualitative Messungen durchzuführen.
Somit vereinigt die Markierung durch Masse die Vorteile der Radioaktivität und der Fluoreszenz und hat zusätzliche Beiträge, die zu neuen Anwendungen führen.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Bibliothek der obigen Reagenzien, wobei die Bibliothek aus einer Vielzahl von Reagenzien besteht, die jeweils einen anderen Analytanteil mit n-Analytresten umfassen. Zum Beispiel kann die Bibliothek aus 4n-Reagenzien bestehen, die jeweils eine verschiedene Oligonucleotidkette mit n-Nucleotidresten umfassen. Die Reagenzien der Bibliothek können gemischt in Lösung zusammen vorhanden sein.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Testmethode, die die Stufen umfaßt, daß man: eine Zielsubstanz bereitstellt; die Zielsubstanz mit der Bibliothek von Reagenzien unter solchen Bedingungen inkubiert, damit mindestens ein Reagenz an die Zielsubstanz bindet; nicht gebundene Reagenzien entfernt; die Markierungsanteile des oder jedes gebundenen Reagenzes gewinnt und die gewonnenen Markierungsanteile analysiert als Hinweis auf die Art der an die Zielsubstanz gebundenen Analytanteile.
Die Zielsubstanz kann immobilisiert sein, da dies ein geeignetes Mittel liefert, um gebundenes von nicht gebundenem Reagenz zu trennen. In einem Aspekt kann die Zielsubstanz ein Organismus oder ein Gewebe oder eine Gruppe von Zellen sein und der Test kann durchgeführt werden, um eine Familie von in Frage kommenden Arzneimitteln zu screenen. In einem weiteren Aspekt kann die Zielsubstanz eine Nucleinsäure sein und dieser Aspekt wird unten genauer diskutiert.
Es wird nun auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, worin:
- Figur 1 ein allgemeines Schema für die Synthese von erfindungsgemäßen Reagenzien ist.
- Figur 2 Reagenzien mit drei verschiedenen Systemen von Markierungsketten, die Reportergruppen enthalten, zeigt.
- Figur 3A ein Diagramm ist, das die Synthese kodierter Oligonucleotide zeigt und
- Figur 3B ein Diagramm ist, das das Ablesen des Codes einer Markierungs kette zeigt.
- Figur 4 ein Diagramm ist, das die Sequenzanalyse durch fortschreitende Ligierung zeigt.
- Figur 5 ein Diagramm ist, bei dem die Sequenz, die durch Hybridisierung abgelesen wird, auf einen Oligonucleotid-Assay ausgedehnt wird.
Legenden zu den Figuren 1 und 2 sind am Ende der Beschreibung enthalten.
Es wird Bezug genommen auf die beispielhaften Anwendungen unten, bei denen beschrieben wird, wie die Methode für die Analyse von Nucleinsäuresequenzen und das Screenen von in Betracht kommenden Arzneimitteln angewendet werden kann.

Synthese von kodierten Markierungen

Das Prinzip der Methode, die zur gleichzeitigen Markierung mehrerer Analyten verwendet wird, ist ähnlich dem, das von Brenner und Lerner (1992) zur Kodierung von Peptiden mit daran gebundenen Nucleinsäuresequenzen vorgeschlagen wurde. Die Intention dieser Idee ist es, eine Markierung zuzufügen, die durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden kann und durch Sequenzierung des erzeugten DNA-Moleküls abgelesen werden kann.
Die Struktur der Reagenzien wird am besten erläutert, indem man betrachtet, wie sie hergestellt werden könnten. Die Synthese beginnt mit einem bivalenten oder multivalenten Linker, der stufenweise in einer Richtung verlängert werden kann, um dem Analyten einen Rest zuzufügen und in der anderen Richtung, um für den Rest spezifische Reportergruppen zuzufügen (Figur 1). Wir gehen von der Vorstellung aus, daß. eine Mischung organischer Verbindungen hergestellt werden soll, wobei verschiedene Reste in jede Stufe der Synthese eingeführt werden. Zum Beispiel könnte die Mischung einen Satz von Peptiden mit verschiedenen Aminosäuresequenzen oder von Oligonucleotiden mit verschiedenen Basensequenzen oder einen Satz von Varianten mit möglicher pharmakologischer Aktivität, wobei verschiedene Gruppen an eine Kernstruktur gebunden sind, umfassen; in jedem Fall ist es erwünscht, jede Strukturvariante mit einer einzelnen Markierung zu markieren. Dies erfolgt, indem die Synthese auf jeder Stufe aufgeteilt wird, wo verschiedene Reste der interessierenden Verbindung zugefügt werden und entsprechende Reste der Markierung zugefügt werden.
Als Beispiel wird davon ausgegangen, man wollte eine Mischung von 4096 Hexanucleotiden herstellen, jedes mit einer eindeutigen Markierung. Vier Proben eines bivalenten Linkers würden mit jeder der Basen und mit der für die Base eindeutigen Reportergruppe gekuppelt (Figur 3a). Die vier Proben werden dann gemischt, in vier Teile geteilt und das Verfahren wiederholt. Das Ergebnis ist ein Satz von Dinucleotiden, jeweils mit einer eindeutigen Markierung. Das Verfahren wird wiederholt, bis sechs Kupplungsstufen abgeschlossen sind.

Die Linker und Reportergruppen

Die Linker sollten eine Gruppe haben, die mit der Analytsynthese kompatibel ist - Hydroxyl-, Amino- oder Sulfhydrylgruppen sind geeignet, um die Oligonucleotidsynthese zu starten, und ähnliche Gruppen können gefunden werden, um andere Wege zu starten, z.B. die Synthese von Polypeptiden. Für einige Klassen von Verbindungen kann es wünschenswert sein, mit einer "Kern"-Verbindung zu starten, die einen Teil des Analyten bildet. Die Auswahl der Gruppe/Gruppen für den Start der Addition der Reportergruppen hängt von der Art der Reportergruppen und der für die Kupplung verwendeten Chemie ab. Diese Chemie muß mit der, die zur Synthese des Analyten verwendet wird, kompatibel sein. Zum Beispiel gibt es für die Oligonucleotidsynthese eine Reihe von Alternativen. Die eingeführte Methode verwendet Benzoyl- und Isopropylgruppen, um die Basen zu schützen, säurelabile Tritylgruppen für den vorübergehenden Schutz der 5'-OH-Gruppen während des Kuppelns und β-Cyanoethylgruppen, um die Phosphate zu schützen. Die für das Kuppeln der Reportergruppen verwendete Methode sollte diese Schutzgruppen oder andere Bindungen in dem Oligonucleotid nicht angreifen und die Synthese der Markierungen sollte nicht durch die Kupplung, Oxidation und Abspaltung der Schutzgruppen, die bei der Verlängerung des Oligonucleotids verwendet wird, beeinflußt werden.
Die Kupplung der Reportermonomere oder das Blockieren der Kette können in jeder Stufe unvollständig sein (Figur 2, B und C), so daß der Analyt an einen ineinandergesetzten Satz von Reporterstrukturen gekuppelt wird. Dies macht es leichter, die Struktur des Analyten aus der Zusammensetzung der Markierung abzuleiten (Figur 1; Figur 3). Um die Synthese einfacher zu machen, ist es wünschenswert, daß der Linker an einen festen Träger gebunden wird durch eine Bindung, die ohne Abbau des Analyten oder der Reportergruppen gespalten werden kann. Alternativ kann der Linker eine Gruppe tragen, z.B. eine geladene Gruppe oder eine lipophile Gruppe, die eine Abtrennung von Zwischenprodukten und dem Endprodukt von den Reagenzien ermöglicht.
Die Reportergruppen können viele Formen aufweisen, wobei die Hauptüberlegung die Notwendigkeit ist, die Zusammensetzung oder die Sequenz der Markierung durch Massenspektrometrie abzulesen. Möglichkeiten schließen Gruppen mit verschiedenen Atom- oder Formeewichten ein, z.B. aliphatische Ketten verschiedener Länge oder verschiedener isotopischer Zusammensetzung. Durch Verwendung isotopisch markierter Methylengruppen ist es möglich, eine Gruppe mit einem einmalig vorhändenen Formelgewicht jeder der vier verschiedenen Reportergruppen zuzuordnen (Tabelle 1). Tabelle 1 Beispielhafte Reportergruppen auf Basis von Isotopen von Wasserstoff und Kohlenstoff:
Für das Beispiel der Oligonucleotide können diese Markierungen einen Satz bilden, der es zuläßt, daß die Base an jeder Position in dem Oligonucleotid aus den zunehmenden Massen der Teuprodukte in den Reihen abgelesen werden kann (Tabelle 2).
Alle Oligonucleotidsequenzen geben eine einzigartige Reihe von Markierungs-Fragmentgewichten, vorausgesetzt, daß der kleinste Anstieg bei der Zufügung einer Reportergruppe größer ist, als der Massenunterschied zwischen der kleinsten und der größen Reportergruppe. Tabelle 2 Beispielhaftes Oligonucleotid mit isotopischen Reportergruppen:
P = photolabiler Linker
Fp = Formelgewicht von P
Für die Massenspektrometrie ist es wünschenswert, einen einfachen Weg zu haben, um die Markierungskette von dem Analyt abzuspalten. Es gibt mehrere Möglichkeiten. Methoden, die mit Oligonucleotid- und Peptidanalyten kompatibel sind, sind die folgenden: durch Licht induzierte Spaltung einer photolabilen Bindung; enzymatische Spaltung, z.B. einer Esterbindung; durch radikale induzierte Spaltung.
Ein weiteres Erfordernis ist es, daß die Markierungen mit den chemischen und biochemischen Verfahren, die für die Analyse verwendet werden, kompatibel sein sollten: zum Beispiel müssen Oligonucleotide, die für die molekulare Hybridisierung oder für eine der vorgeschlagenen Sequenzierungsmethoden verwendet werden, löslich sein und dürfen bestimmte enzymatische Reaktionen, die in der Analyse verwendet werden, nicht hemmen. Die Erfahrung hat gezeigt, daß Oligoethylenglykol- Bindungen, ähnlich den in Tabelle 1 gezeigten Methylenanaloga, mit der molekularen Reassozuerung von Oligonucleotiden kompatibel sind. Außerdem sind solche Bindungen mit mindestens einigen enzymatischen Reaktionen kompatibel, da gezeigt werden konnte, daß Oligonucleotide, die an Glas über einen Hexaethylenglykollinker gebunden sind, in einen 5'-Phosphomonoester umgewandelt werden können durch Behandlung mit Polynucleotidkinase und ATP.

Wünschenswerte Eigenschaften des Linkers

Für die in Betracht gezogenen Anwendungen ist es wünschenswert, daß das Linkermolekül die folgenden Eigenschaften hat: Es sollte möglich sein, es an einen festen Träger zu binden, damit synthetische Cyclen zur Herstellung des Analyten mit entsprechenden Markierungen ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Reinigung von Zwischenprodukten durchgeführt werden können. Nach den Synthesecyclen sollte der Linker von dem festen Träger entfernt werden können unter Bedingungen, die den Analyten und die Markierungen intakt lassen. Die funktionelle Gruppe für die Markierungssynthese sollte so sein, daß die leichte Synthese von Markierungen möglich ist, die voneinander durch Massenspektrometrie unterscheidbar sind.
Der Linker sollte geschützte funktionelle Gruppen haben, die eine Verlängerung des Analyten und der Markierungen getrennt zulassen, unter Bedingungen, bei denen die Chemie für den einen Teil nicht den anderen Teil stört.
Der Linker sollte bevorzugt eine geladene Gruppe tragen, so daß die Massenspektrometrie ohne eine Matrix durchgeführt werden kann. Weiterhin ist es wünschenswert, daß die Markierungen Verbindungen umfassen, die flüchtig genug sind, um im Massenspektrometer zu verdampfen, ohne komplexe Techniken, wie das Elektronensprühen, in Anspruch nehmen zu müssen. Die Markierungen sollten entweder stabile Ionen erzeugen oder Ionen, die Bruchstücke mit charakteristischem Muster ergeben, die verwendet werden können, um den entsprechenden Analyten zu identifizieren.
Die Verbindung zwischen der Markierung und dem Analyt sollte bevorzugt durch Licht spaltbar sein, so daß Markierungen direkt im Massenspektrometer durch Laserbestrahlung gespalten werden können und eine weitere Spaltung, um sie vollständig zu entfernen, um biochemische Stufen, wie die Ligierung, zuzulassen, in geeigneter Weise durch Bestrahlung mit einer Lampe durchgeführt werden können.
Die verbundenen Produkte sollten bevorzugt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich sein, so daß sie in biochemischen Reaktionen verwendet werden können.
Die hier beschriebenen Beispiele zeigen Linker mit diesen gewünschten Eigenschaften.

Photospaltbare Gruppe

Die photospaltbare Gruppe basiert auf der bekannten photolabilen o-Nitrobenzylgruppe. Diese Gruppe wurde als Schutzgruppe sowohl für die Phosphatgruppe als auch für die 2'-Hydroxygruppe bei der Oligonucleotidsynthese verwendet [siehe Überblick in Pillai Synthesis 1 (1980)]. Der o-Nitrobenzylgruppe selbst fehlt eine weitere Funktionalisierung für eine anschließende Bindung an einen Linker zwischen Markierungen und Analyt. Aus kommerziellen Quellen verfügbar ist die Verbindung 5-Hydroxy-2-nitrobenzylalkohol. Es ist bekannt, daß OMe-Gruppen an die 5,4-Position additiert werden können ohne wesentliche Verminderung der photolabilen Eigenschaften (siehe Überblick von Pillai). Daher wurde der 5-Hydroxy-2-nitrobenzyl alkohol als Ausgangspunkt verwendet mit dem Ziel, die DNA-Synthese von dem Benzylalkohol und der Linkerkette zu den Markierungen durch eine Etherkupplung an der 5-Hydroxygruppe zu verlängern.
Es besteht die Forderung, daß eine funktionelle Gruppe vorhanden ist, damit eine kombinatorische Synthese von Analyten und Markierungen möglich ist. Ein Linkeram ist daher erforderlich von der photospaltbaren Gruppe zu der erforderlichen funktionellen Gruppe für die Markierungssynthese. Es ist auch bevorzugt, daß die kombinatorische Synthese an einem festen Träger durchgeführt wird. Daher muß der Linkerarm bivalent sein bei den funktionellen Gruppen und orthogonale Schutzgruppen haben, um eine selektive synthetische Umwandlung zuzulassen. Bevorzugte Markierungsreagenzien enthalten Glycolbindungen/Etherbindungen. Für die Synthese werden Oligonucleotide normalerweise an einen langkettigen Amino- CPG-Träger über die 3'-Hydroxygruppe und eine Succinesterbindung gebunden. Daher wird davon ausgegangen, daß die erforderlichen funktionellen Gruppen Alkohole sind.
Die folgende Zwischenprodukt-Verbindung wurde synthetisiert.
Diese umfaßt einen aromatischen Linker, der
- eine Methoxytritylgruppe (-CH&sub2;ODMT) für die Analytsynthese;
- eine o-Nitrogruppe für die Photospaltung;
- eine O-t-Butyldiphenylsilylgruppe (OTBDPS) für die Markierungssynthese;
- eine tertiäre Amingruppe für die Umwandlung in eine positiv geladene Gruppe für die Analyse mit Massenspektrometrie und
- eine N-Hydroxysuccinimidylgruppe für die Bindung an einen Träger trägt.
Wenn der Analyt ein Peptid ist, sind nur geringe Modifikationen bei den Bedingungen zu beachten. Die 2-Nitrobenzylgruppe ist unter den meisten Bedingungen der Peptidsynthese stabil und verwandte Analoga wurden bereits als photolabile Gruppen für die Peptidsynthese verwendet (siehe Übersicht von Pillai und die darin enthaltenen Literaturstellen). Es gibt bereits mehrere Harze, die für die Peptidsynthese geeignet sind mit verschiedenen Arten der Spaltung. Die orthogonalen Schutzgruppen für Analyt- und Markierungssynthese basieren auf t-Butoxycarbonyl- und 2-Methoxyethoxymethylgruppen. Die t-Butoxycarbonylgruppe wird verwendet, um die Aminogruppe in den Aminosäuren zu schützen, wobei die Abspaltung durch Behandlung mit Trifluoressigsäure bewirkt wird. Die 2-Methoxyethoxymethylgruppe wird verwendet, um die markierenden Gruppen und die Markierungen auf Basis von 1,n-Alkyldiolderivaten wie vorher mit unterschiedlicher Masse, zu schützen. Es wurde gezeigt, daß die Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppen mit den 2-Methoxyethoxymethyl-Schutzgruppen kompatibel ist. Die 2-Methoxyethoxymethylgruppen können selektiv mit Zinkbromid in Dichlormethan abgespalten werden. Die obigen Ausführungen erläutern das Verfahren, der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt jedoch, daß diese Gruppe von orthogonalen Schutzgruppen keinesfalls beschränkend ist, sondern nur als repräsentatives Beispiel dient.

Nachweis und Analyse der Reportergruppen

Die Photospaltung ist die bevorzugte Methode zur Freisetzung der Markierungen von den Analyten; sie ist schnell, kann in trockenem Zustand durchgeführt werden und Abtast-Laser können verwendet werden, um in einem sehr kleinen Maßstab abzubilden, der klein genug ist, um Merkmale innerhalb der Zellen abzubilden (de Vries et al., 1992), so daß die vorgeschlagene Methode verwendet werden könnte, um die Positionen spezifischer Analyten nachzuweisen, die verwendet wurden, um die Oberfläche oder das Innere von Zellen oder verschiedene Zellen in einem Gewebeschnitt "anzufärben", wie es erforderlich sein kann, um Wechselwirkungen zwischen Liganden darzustellen, z.B. inbetracht kommende Arzneimittel und deren Rezeptoren.
Photoempfindliche Schutzgruppen sind für einen breiten Bereich von chemischen Resten verfügbar [Übersicht bei Pillai, 1980]. Die photolabile o-Nitrobenzylgruppe, die als Schutzgruppe für einen breiten Bereich von Verbindungen verwendet werden kann, bildet einen idealen Ausgangspunkt für einen Linker für viele Analyten, die in Betracht gezogen werden könnten, unter anderem Peptide und Oligonucleotide. Wenn man das Beispiel der Oligonucleotide nimmt, liefert es eine photoempfindliche Verbindung, die quantitativ unter Bildung einer Hydroxylgruppe gebrochen werden kann. Dies läßt es zu, daß das Oligonucleotid mit abgespaltener Schutzgruppe an der Verlängerung durch Ligierung teilnimmt, wie für die ünten erläuterte Sequenziermethode beschrieben. Außerdem ist es bekannt, daß die Gruppe während der Oligonucleotidsynthese stabil ist. Es wäre notwendig, den Benzylring zu modifizieren, um eine Gruppe bereitzustellen, die verwendet werden kann, um die Synthese der Markierungen zu starten; Reportergruppen, wie die Oligoethylenglycolreihe, die oben beschrieben wurde, stören die photochemische Spaltungsreaktion der ortho-Nitrobenzoylgruppe nicht (Pillai op. cit.). Andere Gruppen können dem aromatischen Ring zugefügt werden, die die Spaltung verbessern; solche Gruppen könnten dazu verwendet werden, eine geladene Gruppe/geladene Gruppen zuzufügen, um die Analyse im Massenspektrometer zu vereinfachen. Moderne Massenspektrometer können wenige 100 Moleküle messen mit einer Auflösung, die besser ist als 1 Dalton pro Hundert, bis zu einer Gesamtmasse von 200 kD. Ein bevorzugter photolabiler Linker kann somit dargestellt werden, bei dem die positiv geladene Gruppe R direkt an den aromatischen Ring gebunden ist oder in einer der Linkerarme vorhanden ist: Nucleotid
R = positiv geladene Gruppe

Instrumentarium

Die vorgeschlagenen molekularen Markierungen können mit einer von verschiedenen Formen der Massenspektrometrie analysiert werden. Für viele Zwecke ist es nicht notwendig, die Markierungen in Bruchstücke zu zerlegen, obwohl es wünschenswert ist, die Markierungen von den Analyten abzuspalten, und tatsächlich kann es unerwünscht sein, da es zu Zweideutigkeiten kommen kann. Entwicklungen in letzter Zeit in der Massenspektrometrie lassen die Messung sehr großer Moleküle ohne eine zu starke Fragmentierung zu und da es möglich ist, den Linker so auszubilden, daß er leicht gespalten wird unter den Bedingungen, bei denen der Rest der Markierung stabil ist, könnte die Fragmentierung der Markierung während der Messung vermieden werden. Die Analytgruppe wird in den meisten Fällen weniger flüchtig sein als die Markierung und in vielen Anwendungen wird sie an einen festen Träger gebunden sein und daher wird verhindert, daß sie die Massenspektrometrie stört.
Der oben dargestellte Linker ist sehr labil bei Photonenbestrahlung unter Bedingungen, die keine Spaltung der meisten kovalenten chemischen Bindungen verursachen. Ein geeignetes Instrument wurde beschrieben [de Vries et al., 1992]. Darin wird ein Laser verwendet, der auf einen Punkt von < 1µm fokussiert werden kann. Bilder von bis zu 250 mm werden abgetastet, indem ein Objekttisch bewegt wird, der auf 0,1 µm eingestellt werden kann.
Dieses Instrument läßt auch eine lonisierung der zu messenden Molekülart zu, indem ein ionisierender Laser über die Oberfläche des Objekttischs strahlt, so daß er mit der Molekülart, die durch den Desorptionslaser freigelegt wird, eine Wechselwirkung eingeht. Dies könnte für die vorliegende Methode nützlich sein, wenn es nicht möglich wäre, einen geladenen Rest in die Markierungen einzubringen oder wenn eine Fragmentierung zum Ablesen der Markierungen wünschenswert ist.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung einer Zielnucleinsäure, wobei das Verfahren die folgenden Stüfen umfaßt: daß man
a) ein Oligonucleotid immobilisiert auf einem Träger bereitstellt,
b) die Zielnucleinsäure mit dem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert,
c) das Hybrid von b) mit der Bibliothek, wie definiert, inkubiert, wobei man die Reagenzien in Lösung miteinander vermischt, so daß eine Oligonucleotidkette eines ersten Reagenzes der Bibliothek mit der Zielnucleinsäure benachbart dem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert wird,
d) die benachbarten Oligonucleotide ligiert, wodurch ein ligiertes erstes Reagenz gebildet wird,
e) andere nicht ligierte Reagenzien entfernt und
f) den Markierungsanteil des ligierten ersten Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines ersten Teils der Zielnucleinsäure.

Beispielhafte Anwendungen

Es werden mögliche Anwendungen erläutert, indem auf Wege Bezug genommen wird, in denen kodierte Oligonucleotide für die Nucleinsäure-Analyse verwendet werden könnten.
1. Nucleinsäuresequenz-Bestimmung durch progressive Ligierung (Figur 4)
Die zu bestimmende Sequenz wird zuerst in Stufe b) mit einem Oligonucleotid, das an einen festen Träger gebunden ist, hybridisiert. Wenn die zu sequenzierende DNA in einem Einzelstrangvektor, z.B. dem Bakteriophagen M13, kloniert wurde, kann das "Primer"-Oligonucleotid auf dem festen Träger so ausgewählt werden, daß es Teil der Vektorsequenz ist. In Stufe c) wird der feste Träger, der die Hybride von Stufe b) trägt, mit einer Lösung der kodierten Oligonucleotid-Reagenzien inkubiert, z.B. mit der vorher erwähnten Bibliothek, die alle Sequenzen einer gegebenen Länge umfaßt, z.B. 4096 Hexanucleotide (4n n-mers, im allgemeinen). In Stufe d) wird eine Ligase zugefügt, so daß das Hexanucleotid, das zu den ersten sechs Basen der Ziel-DNA komplementär ist, sich mit dem immobilisierten Primer-Oligonucleotid verbindet. Durch diese Stufe wird ein erstes kodiertes Oligonucleotid-Reagenz aus der Bibliothek durch Ligierung der Oligonucleotidkette mit dem immobilisierten Primer-Oligonucleotid verbunden und wird hier als ligiertes erstes Reagenz bezeichnet.
In Stufe e) werden nicht ligierte Reagenzien entfernt, z.B. durch Waschen. In Stufe f) wird der. Linker des ligierten ersten Reagenzes gebrochen, um die Markierungskette zu lösen, die gewonnen und analysiert wird als Hinweis auf die Sequenz eines ersten Teils der Ziel-DNA.
Bevorzugt legt die Entfernung des Linkers eine Hydroxyl- oder Phosphatgruppe am Ende der ersten Oligonucleotidkette frei und macht sie für die Ligierung der Oligonucleotidkette eines zweiten Reagenzes verfügbar. Verschiedene Methoden zum Aufbrechen des Linkers, einschließlich einer photochemischen und enzymatischen und chemischen Hydrolyse, können verwendet werden, um die 3'-Hydroxyl- oder 5'-Phosphatgruppe, die für die weitere Ligierung erforderlich ist, zu erzeugen. Die Stufen c), d), e) und f) werden dann wiederholt. Diese Stufen betreffen eine Hybridisierung eines zweiten Reagenzes aus der Bibliothek, Gewinnung durch Ligierung und Analyse der Markierungskette des ligierten zweiten Reagenzes und die Erzeugung weiterer 3'-Hydroxyl- oder 5'-Phosphatgruppen, die für die weitere Ligierung notwendig sind. Das Verfahren kann wiederholt werden, bis die gesamte DNA-Sequenz abgelesen wurde oder bis die Ausbeuten bei der Reaktion zu niedrig werden, um nützlich zu sein.
Vier Stufen dieser Sequenz sind schematisch in Figur 4 gezeigt. Das erste Diagramm entspricht der Situation am Ende von Stufe e) nach der ersten Runde. Das zweite Diagramm entspricht der Situation am Ende von Stufe f). Das dritte Diagramm entspricht der Position am Ende von Stufe c) bei der zweiten Runde. Das vierte Diagramm entspricht der Situation am Ende von Stufe d) bei der zweiten Runde. Daß die Technik cyclisch ist, wird angedeutet.
2. Nucleinsäure-Sequenzierung mehrfacher Matrizen durch aufeinanderfolgende Ligierung
In einer Ausweitung des ersten Beispiels wird in Betracht gezogen, daß viele Sequenzen gleichzeitig analysiert werden könnten. Zum Beispiel könnten einzelne Klone der zu sequenzierenden DNA immobilisiert werden:
a) man könnte eine Anordnung von Bezugspunkten verwenden, an deren Ende jeweils das gleiche Vektor-Oligonucleotid immobilisiert ist. Ein einzelner Klon der Ziel-DNA wird mit dem an jedem einzelnen Bezugspunkt immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert. Die Anordnung von Bezugspunkten, die diese Hybride tragen, wird dann mit der Bibliothek kodierter Oligonucleotid-Reagenzien inkubiert in einer Lösung, die auch die Inhaltsstoffe für die Ligierung enthält. Als Ergebnis dieser Stufe trägt jeder Bezugspunkt ein anderes ligiertes Reagenz.
Schließlich wird die Markierungskette jedes ligierten Reagenzes gewonnen und wie vorher analysiert. Wenn die Bezugspunkte der Anordnung in einem geeigneten Abstand voneinander angeordnet sind, können sie in die Näpfe von Mikrotiterplatten getaucht werden, wobei die erste Platte die zu sequenzierenden Matrizen enthält, die zweite die Bibliothek von Reagenzien und die Ligierungslösung und die dritte Platte ein Reagenz zur Abspaltung der Markierungsketten von den Bezugspunkten enthält.
b) Alternativ könnte eine Oberfläche mit dem Primer- Oligonucleotid beschichtet werden, bevorzugt kovalent gebunden über das 5'-Ende oder alternativ an irgendeinem anderen Punkt. Einzelne Klone der zu sequenzierenden DNA werden im Abstand voneinander auf den beschichteten Träger aufgetupft, so daß jeder einzelne Klon der Ziel-DNA mit dem immobilisierten Oligonucleotid an einem einzelnen im Abstand voneinander angeordneten Ort des Trägers hybridisiert wird. Der Träger wird dann mit einer Lösung inkubiert, die die Bibliothek von Reagenzien und die Inhaltsstoffe für die Ligierung enthält. Nicht ligierte Reagenzien werden entfernt. Dann wird der Linker des ligierten Reagenzes an jedem im Abstand voneinander angeordneten Ort abgespalten und die Markierung gewonnen und analysiert.
Die Spaltung wird bevorzugt mit einer Methode wie der Laser-Desorption bewirkt, die kleine Bereiche auf der Oberfläche ansprechen kann. Ein Vorteil dieser Lösung ist es, daß eine sehr große Anzahl von DNA-Sequenzen zusammen analysiert werden kann.
3. Ausdehnung der Methoden zur Sequenz-Bestimmung durch Hybridisierung mit Oligonucleotiden

a) Format I

Methoden zum Auftüpfeln von DNA's mit hoher Dichte auf Membranen sind gut eingeführt [Hoheisel et al., 1992; Ross et al., 1992]. Für die Fingerprint- und Sequenz- Bestimmung müssen die Oligonucleotide entweder einzeln oder in kleinen Gruppen angewendet werden, damit die Hybridisierungsmuster nicht zu kompliziert sind, um sie zu interpretieren; daher gibt nur ein geringer Anteil der Matrizen ein Signal bei jeder Analyserunde. Wenn das Signal von jeder Hybridisierung kodierte Information enthielte, die es zuließe, die Sequenz zu bestimmen, könnten komplexere Mischungen verwendet werden und bei jeder Hybridisierungsrunde könnte viel mehr Information gesammelt werden. Die Komplexität der Mischung würde von der Länge der DNA-Matrizen und von der Fähigkeit der Analysemethode, die Sequenzen gemischter Oligonucleotide auf zutrennen, abhängen.
Nucleinsäuresonden, die mit diesen Markierungen für die Massenspektrometrie oder mit Reportergruppen kodiert sind, sind sehr wertvoll, wenn die Verwendung von mehrfachen Sonden vorteilhaft ist, z.B. bei dem DNA-Fingerprint oder der Mutationsanalyse. Die Massenspektrometrie-Markierungen bieten den Vorteil der Verviel fältigung.
Eine Anzahl verschiedener Sonden, die jeweils mit einer eigenen einmalig vorhandenen und geeigneten Massenspektrometrie-Markierung markiert sind, kann zusammen in typischen Nucleinsäure-Hybridisierungstests verwendet werden. Die Sequenz jeder einzelnen Sonde, die hybridisiert, kann einzeln bestimmt werden in Gegenwart anderer, wegen der Auftrennung und Auflösung der Markierungen im Massenspektrum.
Gemäß diesem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung einer Ziel-Nucleinsäure, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt, daß man:
i) die Ziel-Nucleinsäure immobilisiert an einem Träger bereitstellt. Bevorzugt werden einzelne Klone der Ziel-Nucleinsäure im Abstand voneinander auf dem Träger angeordnet.
ii) die immobilisierte Ziel-Nucleinsäure von i) mit einer Vielzahl der oben beschriebenen kodierten Oligonucleotid-Reagenzien inkubiert, so daß die Oligonucleotidketten verschiedener Reagenzien mit der Zielnucleinsäure auf dem Träger hybridisiert werden,
iii) nicht hybridisierte Reagenzien entfernt und
iv) den Markierungsanteil jedes Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-Nucleinsäure.
Bevorzugt wird danach die Bibliothek von Reagenzien verwendet, wobei die Hybridisierungs-, Ligierungs-, Spaltungs- und Analysestufen cyclisch wiederholt werden, um zusätzliche Informationen über die Sequenz der Ziel-Nucleinsäure zu liefern.

b) Format II

Es ist möglich, Nucleinsäuresequenzen aus dem Muster der Doppelstränge zu bestimmen, die gebildet werden, wenn sie mit einer Anordnung von Oligonucleotiden hybridisiert werden. Die Länge der Sequenz, die bestimmt werden kann, ist ungefähr die Quadratwurzel der Größe der Anordnung: wenn eine Anordnung mit allen 65.536 Octanucleotiden verwendet wird, sollten die zu bestimmenden Sequenzen ungefähr 200 bp haben [Southern et al., 1992]. Die Beschränkung der Größe wird durch den Zwang auferlegt, daß keine Folge von 8 Basen mehr als einmal in der zu bestimmenden Sequenz auftreten sollte. Die Anordnung und ihre Verwendung zur Sequenzbestimmung werden in der Internationalen Patentanmeldung WO 89/10977 beschrieben und ein Verfahren, um eine Anordnung von immobilisierten Oligonucleotiden bereitzustellen, z.B. mit ihren 5'-Enden oder ihren 3'-Enden auf einer Oberfläche, wird in der Internationalen Anmeldung WO 90/03382 beschrieben.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Sequenzlänge, die bestimmt werden kann, stark verlängert werden. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfaßt das Verfahren die Stufen, daß man:
a) eine Anordnung von Oligonucleotiden, die im Abstand voneinander auf einem Träger immobilisiert sind, bereitstellt, wobei das Oligonucleotid an einem Ort verschieden ist von Oligonucleotiden an anderen Orten. Bevorzugt ist die Sequenz des durch eine. kovalente Bindung auf jedem im Abstand voneinander angeordneten Ort des Trägers immobilisierten Oligonucleotids bekannt,
b) die Ziel-Nucleinsäure mit der Anordnung von immobilisierten Oligonucleotiden inkubiert, um Hybride an einem oder mehreren im Abstand voneinander angeordneten Orten auf dem Träger zu bilden,
c) die Hybride von b) mit der Bibliothek kodierter Oligonucleotid-Reagenzien inkubiert, so daß eine Oligonucleotidkette eines Reagenzes der Bibliothek mit der Zielnucleinsäure benachbart jedem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert wird,
d) benachbarte Oligonucleotide ligiert, wodurch ligierte Reagenzien an einem oder mehreren im Abstand voneinander angeordneten Orten des Trägers gebildet werden,
e) andere nicht ligierte Reagenzien entfernt und
f) den Markierungsanteil jedes ligierten Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-Nucleinsäure.
Bevorzugt wird die Spaltung der Markierungskette an jedem im Abstand voneinander angeordneten Ort photochemisch bewirkt mit einem Laser. Bevorzugt erfolgt die Analyse der Markierungsketten durch Massenspektrometrie. Bevorzugt werden Hybridisierung, Ligierung, Spaltung und Analysestufen cyclisch wiederholt, wie oben beschrieben, um zusätzliche Informationen über die Sequenz der Ziel-Nucleinsäure zu erhalten.
Eine bevorzugte Sequenz von Arbeitsschritten ist in den vier Diagrammen, die die Figur 5 bilden, gezeigt. Das erste Diagramm zeigt die Position zu Beginn von Stufe b). Das zweite Diagramm zeigt die Position am Ende von Stufe b) - ein Teil der Ziel-Nucleinsäure wurde mit einem gebundenen Oligonucleotid, das einen Teil der Anordnung bildet, hybridisiert. Das dritte Diagramm zeigt die Position am. Ende von Stufe c) und das vierte Diagramm zeigt die Position am Ende von Stufe d); ein Reagenz aus der Bibliothek wurde mit der Ziel- Nucleinsäure hybridisiert und mit dem immobilisierten Oligonucleotid ligiert.
Die Ergebnisse dieser Ausdehnung des bekannten Verfahrens sind dramatisch. Eine einzelne Ausdehnung um eine Länge, die gleich ist der Länge der Oligonucleotide in der Anordnung quadriert die Gesamtlänge, die abgelesen werden kann, vorausgesetzt, daß die Methode, die zum Ablesen der Markierungen verwendet wird, Mischungen auftrennen kann. In diesem Fall ist die Länge, die aus einer Anordnung von Octanucleotiden, die um 8 Basen verlängert sind, abgelesen werden kann, etwa 60.000 Basen.
Vergleich der Hybridisierungsanalyse mit markierten Oligonucleotiden mit:

a) Methoden auf Gelbasis

Bei dem fortschrittlichsten Gerät für die automatisierte Sequenzanalyse können etwa 40.000 Basen pro Tag gelesen werden. Dies schließt nicht die Zeit für biologische und biochemische Verfahren ein, die notwendig sind, um die Ansätze, die auf das Gel geladen werden, bereitzustellen. Wenn man annimmt, daß Matrizen auf eine Oberfläche in einer Dichte von 1 pro Quadratmillimeter aufgetragen werden können [Hoheisel et al., 1992; Ross et al., 1992] könnten 10.000 auf einefläche von 100 mm x 100 mm aufgetragen werden. Nach der Hybridisierung wäre ein Vielfaches von markierten Oligonucleotiden in jeder Zelle vorhanden, so daß ein einzelner 2 Nanosekunden-Puls des Lasers genug Markierung zum Ablesen freisetzen könnte, aber selbst wenn man annimmt, daß 100 Pulse notwendig sind, wäre die Gesantzeit, um eine Zelle abzulesen, wenige Millisekunden, so daß alle 10.000 Zellen in wenigen Minuten abgelesen werden könnten. Wenn die Oligonucleotide Hexamere wären, wären die erhaltenen rohen Daten ungefähr 60.000 Basen. Für die Sequenzbestimmung wären diese nicht so informativ wie die äquivalenten rohen Daten von einem Gel, da viel längere kontinuierliche Reihen von einem Gel abgelesen werden. Dieser Vorteil für Gele würde natürlich verloren gehen, wenn die von der Anordnung abgelesene Sequenz um weitere Analyserunden verlängert werden könnte. Der Hauptvorteil der Lösungen auf Basis einer Anordnung ist der Parallelismus, der es möglich macht, tausende von Matrizen zusammen zu analysieren; die Anzahl, die auf einem Gel analysiert werden kann, ist durch die Breite des Gels auf weniger als 50 begrenzt.

b) Vorliegende Methoden auf Basis einer Anordnung

Die Hauptnachteile bestehender Methoden auf Basis einer Anordnung sind:.
a) Die Sequenz, die von einer Anordnung der Größe N abgelesen werden kann, ist nur N, so daß die meisten Zellen der Anordnung leer sind. Indem man markierte Oligonucleotide zufügt, könnte die Besetzung der Anordnung nahezu vollständig sein, so daß aus den meisten Zellen Informationen erhalten werden könnten. Der Grund hierfür ist, daß zusätzliche Information von den Markierungen dazu beiträgt, Zweideutigkeiten aufgrund mehrfacher Besetzungen kurzer Stränge in der Zielsequenz auszuräumen (Tabelle 3).
b) Die Sequenzlänge, die bei jeder Wechselwirkung mit einem Oligonucleotid durch Hybridisierung abgelesen wird, ist notwendigerweise auf die Länge des Oligonucleotids begrenzt. Dies verursacht Probleme beim Ablesen durch sich wiederholende Sequenzen, z.B. Aufeinanderfolgen einzelner Basen. Die Ausdehnung des Ablesens durch Ligierung läßt es zu, so lange abzulesen, bis wiederholte Ligierungen sich überschneiden.
c) Von den derzeitigen Nachweismethoden hat die Radioaktivität eine hohe Empfindlichkeit, aber eine schlechte Auflösung, die Fluoreszenz eine geringe Empfindlichkeit und eine hohe Auflösung; beide sind relativ langsam. Der Vorschlag, Massenspektrometrie zu verwenden, könnte die Auflösung, die Geschwindigkeit und die Empfindlichkeit verbessern, ebenso würde sie die Möglichkeit beitragen, die Sequenzen von Markierungen abzulesen.
Im allgemeinen ist die Sequenz, die aus Matrizen bestimmt werden kann, die auf im Abstand voneinander angeordneten Anordnungen verteilt sind, 4L = 2L worin L die Summe der kontinuierlichen Längen, die von Oligonucleotiden abgelesen werden, ist. Dies schließt die Länge des Oligonucleotids auf dem festen Träger in Beispiel 3b, nicht aber in Beispiel 2 ein.
Analyten mit möglicher pharmakologischer Aktivität.
Viele Arzneimittel sind gewebespezifisch. Ihre Wirkung hängt oft von einer Wechselwirkung mit einem Zelloberflächen-Rezeptor ab. Es gibt Familien von Arzneimitteln auf Basis von Kernstrukturen; z.B. gibt es mehrere, die kurze Peptide umfassen. Es ist nützlich, wenn man vorgesehene Arzneimittel verfolgt, um zu sehen, welche Zellen oder Gewebe sie als Ziel haben. Es wäre nützlich, viele verschiedene Kandidaten gleichzeitig zu verfolgen. Unter Verwendung von Bibliotheken von Analyten, die mit kodierten Massenmarkierungen markiert sind, wäre es möglich, Wechselwirkungen nachzugehen, indem man Zellen oder Gewebe mit dem Massenspektrometer untersucht. Wenn Markierungen durch photolabile Schutzgruppen gebunden wären, wäre es möglich, ganze Bereiche von Tieren oder Geweben abzubilden unter Verwendung der Abtast-Laser-Spaltung gekoppelt mit Massenspektrometrie.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Die Beispiele 1 bis 6 zeigen Stufen des folgenden Reaktionsschemas 1 zur Synthese einer Verbindung (8), die einen aromatischen Linker umfaßt, der eine Methyloxytritylgruppe (-CH&sub2;ODMT) für die Analytsynthese, eine o-Nitrogruppe für die Photospaltung; eine O-t-Butyldiphenylsilylgruppe (OTBDPS) für die Markierungssynthese; eine tertiäre Aminogruppe für die Umwandlung in eine positiv geladene Gruppe zur Analyse durch Massenspektrometrie und eine N-Hydroxysuccinimidylgruppe zur Bindung an einen Träger trägt.
Die Beispiele 7 und 8 zeigen die anschließenden Stufen gemäß dem folgenden Reaktionsschema 2.
Die Beispiele 9 und 10 zeigen Stufen gemäß dem folgenden Reaktionsschema 3 zur Herstellung von Reportergruppen (13) auf Basis von Propan-1,3-diol.
Die Beispiele 11 bis 13 zeigen Stufen gemäß dem folgenden Reaktionsschema 4, die das Binden eines geschützten Propan-1,3-diolrestes als Reportergruppe an eine Verbindung (6) betreffen.
Die Beispiele 14 bis 19 beschreiben die Herstellung, Charakterisierung und Verwendung verschiedener Reagenzien der Erfindung.

Generelle Angaben

5-Hydroxy-2-nitrobenzylalkohol wurde von Aldrich, Glas mit kontrollierter Porengröße mit langkettigen Alkylaminogruppen von Sigma erworben. Wasserfreie Lösungsmittel beziehen sich auf Material mit Aldrich Sure Seal Qualität, das unter Stickstoff verpackt wurde. Triethylamin wurde über Calciumhydrid vordestilliert und unter Stickstoff vor der Verwendung aufbewahrt. Andere Lösungsmittel und Reagenzien sind aus vielen kommerziellen Quellen erhältlich.
¹H-NMRs wurden erhalten an einem Jeol 270 MHz-Gerät unter Verwendung des angegebenen Lösungsmittels und mit Tetramethylsilan als Referenz.
Infrarot-Analysen wurden erhalten an einem Nicolet 5DXC F.T.IR-Gerät entweder als Kaliumbromidscheibe oder als Chloroformlösung, je nach Angabe.
Die Schmelzpunkte wurden an einem Gallenkamp-Schmelzpunkt- Gerät erhalten und sind unkorrigiert.
DCS wurden auf Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4; DC-Platten mit Aluminium-Rückseite laufen gelassen unter Verwendung des angegebenen Lösungsmittelsystems. Die Platten wurden sowohl mit Ultraviolettlicht und/oder Eintauchen in eine 3 %ige G/V ethanolische Lösung von Molybdophosphorsäure und Erwärmen mit einem Heißluftstrahler sichtbar gemacht. Tritylgruppen enthaltende Molekülarten zeigen einen hellorangen Fleck, Alkohole einen blauen Fleck.
Die Silicagel-Chromatographie wurde durchgeführt unter Verwendung von Silicagel mit Blitzqualität, Teilchengröße
40 T 63 µm.
Die in dem Reaktionsschemata und dem Text verwendeten Abkürzungen:
DMT - 4,4'-Dimethoxytrityl
THF - Tetrahydrofuran
TBDPS - tert.-Butyldiphenylsilan
DMAD 4-Dimethylaminopyridin
DCCI - Dicyclohexyldicarbodiimid
CH&sub2;CL&sub2; - Dichlormethan
CPG - Glas mit kontrollierter Porengröße
Mel - Iodmethan
Tresyl - 2,2,2-Trifluorethylsulfonyl

Beispiel 1

Synthese von 5-Hydroxy-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-nitrobenzylalkohol (Verbindung 2, Schema 1)

Zu 5-Hydroxy-2-nitrobenzylalkohol (5,11 g, 30,2 mmol), gelöst in wasserfreiem Pyridin (40 ml), wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (10,25 g, 30,2 mmol) zugegeben und der Kolben verschlossen. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur insgesamt 72 Stunden lang Rühren gelassen. Die DC-Analyse (Ether/Petrolether 40 bis 60ºC, 65 %/35 %) zeigte die Gegenwart eines neuen Tritylgruppen enthaltenden Materials mit einem RF von 0,27 und das Verschwinden des Ausgangsalkohols. Das Pyridin wurde dann durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die letzten Spuren durch gleichzeitige Verdampfung mit Toluol (x2) entfernt wurden. Der entstehende Gummi wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Lösung mit Wasser (x1) und Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem rötlichbraunen Gummi eingedampft. Der Gummi wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gelöst und dann auf eine Silicagelsäule (14 cm x 6,5 cm) aufgetragen, die mit Ether/-Petrolether 40- 60ºC, 65 %/35 % eluiert wurde. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt, was einen grauweißen Feststoff ergab (13,49 g, 95 %, Schmelzpunkt 80 bis 82ºC unter Zersetzung) . Eine Analyseprobe wurde erstellt durch Umkristallisieren aus Chloroform/Petrolether 40-60ºC, Schmelzpunkt 134 bis 137ºC unter Zersetzung.
¹H-NNR (270 MHz, CDCl&sub3; 8): 3,79 (s, 6H, DMT-OCH&sub3;), 4,63 (s, 2H, CH&sub2;-ODMT), 6,77-6,85 (m, 5H, Aryl), 7,22-7,49 (m, 9H, Aryl), 7,63 (s, 1H, Aryl) , 8,06 (d, 1H, J = 9,06 Hz, Aryl) IR (KBr-Scheibe), 1610, 1509, 1447, 1334, 1248, 1090, 1060, 1033, 828 cm&supmin;¹.

Beispiel 2

Synthese von O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-5-[1-(3-brom-1-oxypropyl)]-2-nitrobenzylalkohol (Verbindung 3, Schema 1)

Zu Verbindung 2 (10,18 g, 21,6 mmol), gelöst in Aceton (150 ml) wurde 1,3-Dibronpropan (11 ml, 108 mmol) und Kaliumcarbonat (4,47 g, 32,3 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann insgesamt 3 Stunden lang auf 80ºC erhitzt und dann bei Raumtemperatur weitere 16 Stunden lang gerührt. Die DC- Analyse (Ether/Petrolether 40 T 60ºC, 60 %/40 %) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung von zwei neuen tritylhaltigen Molekülarten; RF 0,48 Haupt-, RF 0,23 kleinerer Peak. Das Aceton wurde dann durch Rotationsverdampfen entfernt und der entstehende Rückstand zwischen Wasser und Dichlormethan aufgetrennt. Die Dichlormethanlösung wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Dichlormethanlösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Gummi eingedampft. Der Gummi wurde in Dichlormethan (20 ml) gelöst und dann auf eine Silicagelsäule (6,5 cm x 14 cm) aufgetragen, die mit Ether/Petrolether 40-60ºC, 60 %/40 % eluiert wurde. Die reinen Produktfraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt, was Verbindung 3 als weißen Feststoff ergab (8,18 g, 64 %, Schmelzpunkt 132 T 134ºC, RF 0,48 Ether/Petrolether 40-60ºC, 60 %/40ºC) Eine kleine Probe wurde aus Ethylacetat/Petrolether für analytische Zwecke umkristallisiert, Schmelzpunkt 132 bis 134ºC.
¹H-NMR: (270 MHz CDCl&sub3;, δ) : 2,40 (m, 2H, -CH&sub2;C &sub2;-CH&sub2;), 3,64 (t, 2H, J = 6,32 Hz, CH&sub2;br), 3,79 (s, 6H, OCH&sub3;), 4,27 (t, 2H, J = 6,04 Hz, -OC &sub2;CH&sub2;), 4,66 (s, 2H, ArCH&sub2;ODMT), 6,84 (d, 4H, J=8,79 Hz, DMT-Aryl), 7,20-7,50 (m, 10H, 9 DMT-Aryl, 1 Aryl), 7,68 (s, 1H, Aryl) , 8,1 (d, 1H, J=9, 06 Hz, Aryl)
IR (KBr-Scheibe) 1608, 1577, 1511, 1289, 1253, 1230, 1174, 1065, 1030 cm&supmin;¹.

Beispiel 3

Synthese von N-[O-(tert.-Butyldiphenylsilyl)-2-oxyethyl)]-N- (2-hydroxyethyl)amin (Verbindung 5, Schema 1)

Zu Natriumhydrid (0,76 g einer 60%igen Dispersion in Öl, 19 mmol) unter N&sub2; wurde wasserfreies THF (15 ml) und anschließend eine Aufschlämmung von Diethanolamin (2 g, 19 mmol) in THF (30 ml) in einer solchen Rate zugegeben, daß die Wasserstoff-Entwicklung zugelassen war. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter N&sub2; gerührt, wobei sich in dieser Zeit ein grauer Niederschlag bildete. Das erzeugte Alkoxid wurde durch Zugabe von tert.- Butylchlordiphenylsilan (4,95 ml, 19 mmol) abgeschreckt und anschließend wurde der Ansatz bei Raumtemperatur 2 Stunden unter N&sub2; gerührt. Die DC-Analyse (Ethylacetat) zeigte die Erzeugung von zwei bezüglich des Ausgangsmaterials neuen UV- positiven Flecken, Hauptpeak RF 0,05, kleinerer Peak RF 0,60. Das THF wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand in 0,1 M Natriumbicarbonatlösung gelöst. Das Produkt wurde dann mit Ethylacetat (x2) extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden dann vereinigt und mit Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingedampft. Dieses Öl wurde auf eine Silicagelsäule aufgetragen, die mit Chloroform/Methanol, 90 %/10 % eluiert wurde. Fraktionen mit einem RF von 0,33 wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft, was eine Verbindung 5 als weißen kristallinen Feststoff ergab (3,93 g, 60 %, Schmelzpunkt 73 T 75ºC). Eine kleine Probe wurde aus Ethylacetat/Petrolether 40-60ºC für Analysezwecke umkristallisiert, Schmelzpunkt 76 T 77ºC.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ) : 1,06 (s, 9H, tBu), 2,13 (brs, 1H, O , mit D&sub2;O austauschbar), 2,78 (m, 4H, CH&sub2;NHC &sub2;-), 3,63 (t, 2H, J=5,22 Hz, -CH&sub2;OSi-), 3,78 (t, 2H, J=5,22 Hz, C &sub2;OH), 7,40 (m, 6H, Aryl) , 7,66 (m, 4H, Aryl).
IR (KBr-Scheibe) 3100, 1430, 1114, 1080, 969, 749, 738, 707 cm&supmin;¹.

Beispiel 4

Synthese von N-[O-(tert.-Butyldiphenylsilyl)-2-oxyethyl]-N- [O-(3(O-(4,4'-dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)-3- oxypropyl]-N-(2-hydroxyethyl) anm (Verbindung 6, Schema 1)

Zu Verbindung 3 (7,46 g, 12,6 mmol) gelöst in 1-Methyl-2- pyrrolidinon (65 ml) wurde Verbindung 5 (8,63 g, 25,2 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann insgesamt 5 Stunden lang auf 80ºC erhitzt, bevor sie abkühlen gelassen wurde und bei Raumtemperatur weitere 16 Stunden lang rühren gelassen wurde. Die DC-Analyse (Ethylacetat) zeigte die Bildung einer neuen Tritylgruppen-haltigen Molekülart, RF 0,51 und restliche Mengen der zwei Ausgangsmaterialien. Der gemischte Ansatz wurde in eine Mischung aus Wasser (600 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gegossen und das Produkt mit Ethylacetat (3 x 200 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden dann vereinigt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Ethylacetat wurde dann durch Rotationsverdampfen entfernt, was einen braunen Gummi ergab, aus dem sich langsam ein kristallines Produkt bildete. Eine minimale Menge an Ethylacetat wurde zugegeben, um den restlichen Gummi aufzulösen, so daß das kristalline Produkt abfiltriert werden konnte, das Hydrogenbromidsalz von Verbindung 5. Die Ethylacetat-Lösung wurde dann auf eine Silicagelsäule (13 cm x 6,5 9m) aufgetragen, die mit Ethylacetat eluiert wurde. Eine unzureichende Auftrennung der restlichen Verbindung 3 und des gewünschten Produktes wurde auf dieser Säule erhalten, so daß die Produktfraktionen vereinigt wurden und zu einem Gummi eingedampft wurden. Dieser Gummi wurde in der minimal notwendigen Menge Ethylacetat gelöst und auf eine weitere Silicagelsäule (14 cm x 6,5 cm) aufgetragen, wobei unter Verwendung eines Gradienten eluiert wurde, zuerst Ethylacetat/Petrolether 40 T 60ºC, 50 %/50 % und anschließend Ethylacetat. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt, was Verbindung 6 als Gummi ergab. Die letzten Spuren des Lösungsmittels wurden entfernt, indem der Gummi eine Stunde in Hochvakuum gebracht wurde. Die Ausbeute des Produktes war 7,64 g, 71%.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ) : 1,04 (s, 9H, tBu), 1,97 (m, 2H, -CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;-), 2,7 (m, 6H, NC &sub2;), 3,56 (m, 2H, CH&sub2;0H), 3,75 (m, 2H, CH&sub2;OSi), 3,78 (s, 6H, DMT-OCH&sub3;), 4,12 (m, 2H, ArOC &sub2;CH&sub2;), 4,64 (s, 2H, ArC &sub2;ODMT), 6,74-6,85 (m, 5H, Aryl), 7,2-7,65 (m, 20H, Aryl), 8,95 (d, 1H, Aryl)
IR (KBr-Scheibe), 1608, 1579, 1509, 1287, 1251, 1232, 1112, 1092, 1064, 1035, 826, 754, 703, 613 cm&supmin;¹.

Beispiel 5

Synthese von N-[O-(tert.-Butyldiphenylsilyl)-2-oxyethyl]-N- [O(3-(O-(4,4'-dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)- 3-oxypropyl]-N-[O-(3-carboxylatopropionyl)-2-oxyethyl]amin (Verbindung 7, Schema 1)

Zu Verbindung 6 (5,64 g, 6,59 mmol), gelöst in wasserfreiem Dichlormethan (40 ml) und wasserfreiem Pyridin (50 ml), wurde Bernsteinsäureanhydrid (2,06 g, 20,6 mmol) und Dimethylaminopyridin (210 mg, 1,72 mmol) zugegeben und der Kolben verschlossen. Der Ansatz wurde dann insgesamt 72 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die DC-Analyse (Methanol/Ethylacetat, 10 %/90 %) zeigte die Bildung einer neuen Tritylgruppen-haltigen Molekulart, RF 0,45 und das Verschwinden des Ausgangsmaterials. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, wobei die letzten Spuren von Pyridin durch gleichzeitige Verdampfung mit Toluol (x2) entfernt wurden. Der entstehende Gummi wurde dann zwischen Chloroform und Wasser aufgeteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase weiter mit Chloroform (x1) extrahiert. Die organischen Phasen wurden dann vereinigt und mit Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Chloroform-Lösung wurde dann mit wasserfreiem Magliesiumsulfat getrocknet und zu einem Gummi eingedampft. Die letzten Spuren des Lösungsmittels wurden dann entfernt, indem der Gummi eine Stunde lang in Hochvakuum gestellt wurde, was Verbindung 7, 6,75 g, ergab. Dieses Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ: 1,0 (s, 9H, tBu), 1,9 (m, 2H, CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 2,5 (m, 4H, COC &sub2;C &sub2;COOH), 2, 7 (m, 6H, N-C &sub2;), 3, 7 (m, 2H, CH&sub2;OSi), 3,75 (s, 6H, DMT-OC &sub3;), 4,1 (m, 4H, C &sub2;OCO und Ar-OCH&sub2;CH&sub2;), 5,6 (s, 2H, ArCH&sub2;ODMT), 6,7 (d, 1H, Aryl), 6,8 (d, 4H, Aryl), 7,2 T 7,7 (m, 20H, Aryl), 8,02 (d, 1H, Aryl).
IR (CHCL&sub3;-Lösung) 1736, 1608, 1579, 1509, 1288, 1251, 1232, 1175, 1158, 1112, 1093, 1065, 1035, 755, 703 cm&supmin;¹.

Beispiel 6

Synthese von N-[O-(tert.-Butyldiphenylsilyl)-2-oxyethyl]-N- [O-(3-(O-(4,4-dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)-3- oxypropyl]-N-[(O-(succinyl-(3-carboxylatopropionyl)))-2-oxyethyl]amin (Verbindung 8, Schema 1)

Zu Verbindung 7 (2,99 g, 3,13 mmol), gelöst in wasserfreiem Dichlormethan (30 ml), wurde Dicyclohexylcarbodiimid (0,710 g, 3,45 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (0,396 g, 3,44 mmol) zugegeben und der Kolben verschlossen. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur 18 Stunden lang rühren gelassen, wobei sich zu dieser Zeit ein weißer Niederschlag bildete. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und die Dichlormethan-Lösung mit Wasser (x1) und Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Dichlormethan-Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft, was einen Schaum ergab, 3,26 g (99 %) . Die DC-Analyse (Ethylacetat) zeigte nur eine Tritylgruppen-haltige Molekülart, RF 0,74 und keine signifikanten Einschließungen. Versuche, eine Analyseprobe bereitzustellen, indem eine kleine Menge des Materials über eine Silicagelsäule geleitet wurde, führten zur Zersetzung des aktiven Esters zu der Säure (Verbindung 7). Das Material wurde daher in allen weiteren Ausstattungen ohne weitere Reinigung verwendet.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,04 (s, 9H, tBu), 1,97 (m, 2H, CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 2,50 T 2,75 (m, 6H, Succinyl CH&sub2; + -OCC &sub2;), 2,76- 2,86 (m, 6H, NC &sub2;), 3,08 (m, 2H, C &sub2;CO&sub2; Succinyl), 3,77 (s, 6H, DMTOC &sub3;), 3,86 (m, 2H, C &sub2;OSi), 4,1 T 4,2 (m, 4H, ArOC &sub2; + C &sub2;O&sub2;C), 4,63 (s, 2H, Ar H&sub2;ODMT, 6,7 T 6,9 (m, 5H, Aryl), 7,01 T 7,7 (m, 20H; Aryl), 8,05 (d, 1H, Aryl).
IR (KBr-Scheibe), 1742, 1713, 1509, 1288, 1251, 1211, 1175, 1090, 1067 cm&supmin;¹. Schema 1 Pyridin Aceton N-Methylpyrrolidinon Schema 1 (Fortsetzung) Pyridin

Beispiel 7

Glas mit kontrollierter Porengröße mit langkettigen Alkylaminogruppen (Verbindung 9, Schema 2)
Glas mit kontrollierter Porengröße mit langkettigen Alkylaminogruppen (Sigma Chemical Co., 3,5 g) wurde mit Trichloressigsäure (1,5 g), gelöst in Dichlormethan (50 ml), 2,5 Stunden lang vorbehandelt, mit Aliquots von Dichlormethan (insgesamt 100 ml) und wasserfreiem Ether (insgesamt 100 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zu dem CPG-Träger wurde dann wasserfreies Pyridin (35 ml), Dimethylaminopyridin (42 mg, 344 µmol), Triethylamin (280 ul, 201 mmol) und Verbindung (8) (siehe Schema 1) (736 mg, 700 µmol) zugegeben. Die Mischung wurde dann vorsichtig insgesamt 18 Stunden lang bewegt, wonach anschließend die Kügelchen mehrfach mit Pyndin (7 x 10 ml), Methanol (5 x 15 ml) und Chloroform (5 x 15 ml) gewaschen wurden und dann im Vakuum getrocknet wurden.

Beispiel 8

Methylierung der an den CPG-Träger gebundenen tertiären Aminogruppen (Verbindung 10, Schema 2)
Zu dem derivatisierten Glas mit kontrollierter Porengröße mit langkettigen Alkylaminogruppen (Verbindung 9, Schema 2) (1,01 g) wurde wasserfreies THF (10 ml) und Iodmethan (0,5 ml, 8 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde dann vorsichtig insgesamt 18 Stunden lang bewegt, wonach die Kügelchen mehrmals mit wasserfreiem THF (5 x 10 ml) gewaschen wurden und dann im Vakuum getrocknet wurden. Schema 2 Pyridine

Beispiel 9

Synthese von einfach geschützten 1,3-Propandiolderivaten (Verbindungen 12a und 12b, Schema 3) - allgemeines Vorgehen

Zu Natriumhydrid (1,05 g einer 60%igen Dispersion in Öl, 26,3 mmol) unter N&sub2; wurde wasserfreies THF (10 ml) und anschließend 1,3-Propandiol-Derivat (26,3 mmol), gelöst in wasserfreiem THF (20 ml), tropfenweise zugegeben. Weiteres 30 Minuten langes zusätzliches Rühren unter N&sub2; stellte die Alkoxidbildung sicher, was durch die Bildung eines grauen Niederschlags festgestellt wurde. Das erzeugte Alkoxid wurde durch tropfenweise Zugabe von tert.-Butylchlordiphenylsilan (7,24 g, 26,3 mmol), gelöst in wasserfreiem THF (20 ml), und anschließendes Rühren des Ansatzes unter N&sub2; weitere 40 Minuten lang abgeschreckt. Das THF wurde dann durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand zwischen Dichlormethan und 0,1 M Natriumbicarbonat-Lösung aufgetrennt. Die Dichlormethan-Lösung wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (xl) gewaschen. Die Dichlormethan-Lösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde auf eine Silicagelsäule (16 cm x 5 cm) aufgetragen, die mit einer Ether/Petrolethermischung 40T60ºC, 30 %/70 % eluiert wurde. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft, was das gewünschte 1,3-Propandiol-Derivat lieferte.
Für die Details der Verbindungen siehe unten.
12a 1-O-tert.-Butyldiphenylsilyl-1,3-propandiol, weißer kristalliner Feststoff, RF 0,21 Ether/Petrolether 40T60ºC, 30 %/70 %, 7,61 g, 92 %, Schmelzpunkt 40T42ºC.
IR (KBr-Scheibe) 3400, 1448, 1112, 822, 734, 702, 689, 506, 488 cm&supmin;¹.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,06 (s, 9H, tBu), 1,80 (m, 2H, CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 2,45 (t, 1H, OH), 3,84 (m, 4H, OC &sub2;CH&sub2;C &sub2;O-), 7,40 (m, 6H, Aryl), 7,68 (m, 4H, Aryl).
12b 2-Methyl-1-O-tert.-butyldiphenylsilyl-1,3-propandiol. Farbloses Öl, RF 0,21 Ether/Petrolether 40T60ºC, 30 %/70 %, 6,60 g, 77 %.
IR (dünner Film) 3400, 1472, 1428, 1087, 1040, 823, 740, 702 cm&supmin;¹.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 0,82 (d, 3H, J=6,87 Hz, C &sub3;), 1,06 (s, 9H, tBu), 2,0 (m, 1H, C -CH&sub3;), 2,68 (t, 1H, OH), 3,64 (m, 4H, C &sub2;CH(CH&sub3;)C &sub2;), 7,40 (m, 6H, Aryl), 7,68 (m, 4H, Aryl)
Siehe P.G. McDougal et al. JOC, 51, 3388 (1986) bezüglich des allgemeinen Verfahrens zur Monosilylierung.symmetrischer 1,n- Diole.

Beispiel 10

Synthese von Treslat-Derivaten (Verbindungen 13a und 13b, Schema 3) - allgemeines Vorgehen
Zu dem Alkoholderivat (4,94 mmol) gelöst in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) und trockenem Triethylamin (0,84 ml, 6,03 mmol) unter N&sub2;, das auf -15º T -30ºC gekühlt war, wurde Tresylchlorid (1 g, 5,48 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (5 ml) tropfenweise 20 T 40 Minuten lang zugegeben. Weiteres 30 Minuten langes Rühren unter N&sub2; bei -15º T -30ºC vervollständigte die Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde dann in einen Scheidetrichter überführt und mit eisgekühlter 1,0 M Salzsäure (x1), eisgekühltem Wasser (x1) und eisgekühlter Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Dichlormethan-Lösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft, was das Treslat ergab. Die Treslate wurden bei -20ºC unter N&sub2; aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Für genaue Details der Verbindungen siehe unten.
13a 1-O-tert.-Butyldiphenylsilyl-3-O-tresyl-1,3-propandiol. Weißer kristalliner Feststoff, 1,74 g, 77 %, Schmelzpunkt 34 T 35ºC. 3 ml dieser Reaktionsmischung wurden vor der Aufarbeitung des Ansatzes zur Zugabe zu anderen Reaktionen entnommen.
¹H-NMR (270MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,06 (s, 9H, tBu), 1,97 (m, 2H, CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 3,77 (t, 2H, J=5,49 Hz, C &sub2;-O-Si), 3,84 (q, 2H, J=8,79 Hz, CF&sub3;-C &sub2;-O), 4,54 (t, 2H, J=6,05 Hz, Tresyl O-C &sub2;), 7,42 (m, 6H, Aryl), 7,64 (m, 4H, Aryl)
IR (KBr-Scheibe) 1386, 1329, 1274, 1258, 1185, 1164, 1137, 1094, 941, 763, 506 cm&supmin;¹.
13b 2-Methyl-1-O-tert.-butyldiphenylsilyl-3-O-tresyl-1,3-propandiol. Farbloses Öl, 2,57 g, 99 %.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 0,97 (d, 3H, J=6, 87 Hz, CH&sub3;), 1,06 (s, 9H, tBu), 2,10 (m, 1H, C CH&sub3;), 3,6 (m, 2H, C &sub2;OSi), 3,8 (q, 2H, J=8,79 Hz, CF&sub3; C &sub2;), 4,40 (m, 2H, Tresyl-O-C &sub2;), 7,40 (m, 6H, Aryl), 7,64 (m, 4H, Aryl).
Bezüglich allgemeiner Details der Treslate siehe R.K. Crossland et al. JACS, 93, 4217 (1971). Schema 3

Beispiel 11

Synthese von N-[Acetoxy-2-oxyethyl]-N-[O-(3 (O-(4,4'-dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)-3-oxypropyl]-N-2- hydroxyethyl]amin (Verbindung 15, Schema 4)

Zu Verbindung 11 (1,72 g, 1,92 mmol), gelöst in wasserfreiem THF (20 ml), wurde Tetrabutylammoniumfluorid (0,55 ml einer 1 M Lösung in TEF, 1,92 mmol) zugegeben. Der Ansatz wurde dann insgesamt 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Wasser (50 ml) verdünnt und das THF durch Rotationsverdampfung entfernt. Die wäßrige Lösung wurde dann mit Chloroform (x1) extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem Gummi eingedampft. Das Produkt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, wobei die Säule mit Ethylacetat eluiert wurde. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer verdampft, was Verbindung 12 als farblosen Gummi ergab, der langsam beim Stehen kristallisierte; 0,73 g, 58 %, Schmelzpunkt 95 T 97ºC, RF 0,26 Ethylacetat.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,75 (brs, 1H, OH), 2,0 T 2,1 (m, SH, O&sub2;CCH&sub3;+CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;) , 2, 70 T 2, 81 (m, 6H, C &sub2;N) , 3,58 (m, 2H, C &sub2;OSi), 3,79 (s, 6H, DMT-OC &sub3;), 4,17 (m, 4H, C &sub2;O), 4,64 (s, 2H, ARC &sub2;ODMT), 6,83 (d, 4H, DMT-Aryl), 7,2 T 7,5 (m, 10H, Aryl), 7,69 (s, 1H, Aryl), 8,10 (d, 1H, Aryl).
IR (KBr-Scheibe, 3459, 1738, 1608, 1577, 1506, 1444, 1313, 1288, 1250, 1230, 1175, 1154, 1070, 1035, 984 cm&supmin;¹.

Beispiel 12

Synthese von N-[O-(tert.-Butyldiphenylsilyl)-2-oxyethyl]-N- [O-(3(O-(4,4'-dimethoxytrityl)-1-oxyymethyl-4-nitrophenyl)-3- oxypropyl]-N-[acetoxy-2-oxyethyl]amin (Verbindung 14, Schema 4)

Zu Verbindung 6 (1,73 g, 2,02 mmol), gelöst in wasserfreiem Pyridin (10 ml), wurde Essigsäureanhydrid (0,5 ml, 4,54 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (55 mg, 0,45 mmol) zugegeben und der Kolben verschlossen. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur insgesamt 16 Stunden lang gerührt, wonach eine DC-Analyse (Methanol/Ethylacetat 5 %/95 %) das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung eines neuen Tritylgruppen-haltigen Flecks, RF 0,80, zeigte. Das Pyridin wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, wobei die letzten Spuren durch gleichzeitiges Verdampfen mit Toluol (x2) entfernt wurden. Der entstehende Gummi wurde zwischen Chloroform und Wasser aufgeteilt. Die Chloroform-Lösung wurde abgetrennt und mit Kochsalzlösung (x1) gewaschen. Die Chloroform-Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft, was einen farblosen Gummi ergab, 1,94 g. Dieses Material war rein genug, um in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet zu werden.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,04 (s, 9H, tBu), 1,9 (m, 2H, CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 2,01 (s, 3H, -O&sub2;CCH&sub3;), 2,74 (m, 6H, C &sub2;N), 3,7 (m, 2H, C &sub2;OSi), 3,8 (s, 6H, DMT-OC &sub3;), 4,1 (m, 4, C &sub2;O), 4,63 (s, 2H, ArC &sub2;ODMT), 6,78 (d, 1H, Aryl), 6,83 (d, 4H, DMT, Aryl), 7,2 T 7,8 (m, 20H, Aryl), 8,05 (d, 2H, Aryl).

Beispiel 13

Synthese von N-[Acetoxy-2-oxyethyl]-N-[O-(3 (O-(4,4'- dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)-3-oxypropyl]-N- [O-(tert.-butyldiphenylsilyl)-3-oxo-6-oxyhexyl]amin (Verbindung 16, Schema 4)

Zu Verbindung 12 (66 mg, 0,10 mmol), gelöst in wasserfreiem Acetonitril (5 ml), wurde Kaliumcarbonat (55 mg, 0,4 mmol) und Verbindung 13a (1 ml der Reaktionsmischung, ungefähr 0,30 mmol) zugegeben und der Kolben dann mit einem Calciumchlorid-Trocknungsröhrchen verschlossen. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur insgesamt 22 Stunden lang gerührt, wonach das Kaliumcarbonat abfiltriert wurde und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt wurde. Das entstehende Öl wurde dann auf eine Silicagelsäule (14 cm x 1 cm) aufgetragen und das Produkt mit einer Mischung aus Ether/Petrolether 40T60ºC, 75 %/25 % eluiert. Die reinen Produkt-Fraktionen wurden vereinigt und zu einem klaren Gummi verdampft, 6 mg, 6 %, RF 0,47 in Ether/Petrolether 40T60ºC, 80 %/20%.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 1,05 (s, 9H, tBu), 1,8 (m, 2H, CH&sub2;C CH&sub2;OSi), 1, 9 (m, SH, O&sub2;C H&sub3; + ArOC &sub2;-), 2,76-2, 92 (m, 6H, C &sub2;N), 3,51 (t, 2H, J=6,6 Hz, OC &sub2;CH&sub2;CH&sub2;OSi), 3,79 (s, 6H, DMT-OCH&sub3;), 3,85 (m, 2H, C &sub2;OSi), 4,12 T 4,23 (m, 4H, ArOC &sub2;CH&sub2; + NCH&sub2;C &sub2;OCOCH&sub3;), 4,64 (s, 2H, ArC &sub2;ODMT), 6,83 (m, 5H,1 Aryl + DMT-Aryl), 7,23 T 7,50 (m, 16H, Aryl), 7,68 (m, 4H, Aryl), 8,10 (d, 1H, J=9,06Hz, Aryl).
Durch analoge Reaktionsbedingungen wurde die folgende Verbindung auch synthetisiert unter Verwendung des Treslats 13b.
N-[Acetoxy-2-oxyethyl]-N-[O(3(O(4,4'-dimethoxytrityl)-1-oxymethyl)-4-nitrophenyl)-3-oxypropyl]-N[O-(tert.-butyldiphenylsilyl)-5-methyl-3-oxo-6-oxyhexyl]amin. Die Verbindung ist ein klarer Gummi, RF 0,53 in Ether/Petrolether 40T60ºC, 80 %/20 %.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl&sub3;, δ): 0,88 (d, 3H, CH-CH&sub3;), 1,00 (s, 9H, tBu), 1,9 T 2,1 (m, 6H, O&sub2;CCH&sub3; + C -CH&sub3; + CH&sub2;C &sub2;CH&sub2;), 2,7 T 3,0 (m, 6H, C &sub2;N), 3,4 T 3,7 (m, 4H, C &sub2;O), 3,79 (s, 6H, DMT-OCH&sub3;), 4,0 T 4,4 (m, 6H, C &sub2;O-), 4,64 (s, 2H, Ar C &sub2;ODMT), 6,83 (m, SH, Aryl), 7,2 T 7,7 (m, 20H, Aryl), 8,01 (d, 1H, Aryl).

Beispiel 14

Synthese von Oligonucleotiden an festen Trägern

Glas mit kontrollierter Porengröße, das die Linker 9 und 10 trug (Verbindung 9 und 10 in Schema 2) wurde auf Säulen geladen, die für automatische Oligonucleotidsynthese-Automaten (ABI 381A) verwendet werden; die verwendeten Mengen reichten für eine Synthese im Maßstab 0,2 oder 1 µmol. Die Säulen wurden in den automatischen Synthese-Apparat eingesetzt, der dann für die geeigneten Cyclen programmiert wurde. Zwei unterschiedliche Arten von Nucleotid-Vorläufern wurden verwendet: normale Phosphoramidite, mit Dimethoxytrityl-Schutzgruppen an den 5'-Hydroxylgruppen; "reverse Synthone" mit 5'-Phosphoramiditen und Dimethoxytrityl-Schutzgruppen an den 3'-Hydroxylgruppen. Eine Liste der an diesen Trägern synthetisierten Oligonucleotide ist in Tabelle 4 gezeigt, worin R9 und R10 von den Verbindungen 9 bzw. 10 abstammen. Die Ausbeuten wurden überwacht durch die Menge an Trimethoxytrityl- Gruppen, die bei jeder Kupplung freigesetzt wurde. Diese Ausbeuten entsprechen denen, die an den CPG-Trägern erhalten wurden, die für übliche Oligonucleotidsynthese verwendet werden. Tabelle 4

Beispiel 15

Synthese von Markierungen unter Bedingungen, bei denen der Analyt intakt bleibt.

Nach der Synthese von 5'-R9T&sub5; auf Träger 9 wurde der feste Träger geteilt, ein Teil wurde mit 5 mM Tetrabutylammoniumfluorid in THF 10 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt, um die t-Bütyldiphenylsilyl-Schutzgruppe zu entfernen. Beide Proben wurden mit 29 % Ammoniak bei Raumtemperatur über Nacht behandelt, um die Produkte von dem festen Träger zu entfernen. Der Ammoniak wurde im Vakuum entfernt und der feste Rückstand in Wasser gelöst. Die HPLC zeigte die erfolgreiche Entfernung der Silyl-Schutzgruppe, wobei die DMT-Gruppe erhalten blieb. Dieses Beispiel zeigt, daß die zwei Schutzgruppen unter Bedingungen entfernt werden können, die die anderen Gruppen an Ort und Stelle lassen und weiterhin, daß die Entfernung der Schutzgruppen die Oligonucleotidkette intakt läßt.

Beispiel 16

Biochemische Reaktionen von markierten Analyten

16a. Enzymatische Phosphorylierung von markierten Oligonucleotiden. Für viele Zwecke ist es nützlich, Oligonucleotide zur Verfügung zu haben mit einer Phosphatgruppe am 5'-Ende. Eine solche Gruppe ist notwendig, wenn das Oligonucleotid als Donor in einer Ligierungsreaktion verwendet werden soll und es ist ein nützlicher Weg, um eine radioaktive Gruppe einzuführen, um biochemischen Eigenschaften zu testen.
Die Oligonucleotide A&sub5;, A&sub1;&sub0; und T&sub5; wurden hergestellt mit den Markierungen R9 und R10 gebunden am 3'-Ende, wobei die Silyl- Schutzgruppe entfernt war oder nicht. (Dies wurde erreicht, indem das Oligonucleotid, immer noch an dem festen Träger, mit einer 5 mM Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Acetonitril bei Raumtemperatur 15 Minuten lang behandelt wurde.) Diese Oligonucleotide wurden phosphoryliert unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und gamma-³³P-ATP unter Verwendung von Standard-Protokollen, die vom Lieferanten empfohlen werden. Die Dünnschicht-Chromatographie der Produkte auf mit Polyethylenimin (PEI) imprägnierter Cellulose, entwickelt in 0,5 M Ammoniumbicarbonat, zeigte in jedem Fall, daß der markierte Phosphor fast vollständig auf das Oligonucleotid übertragen worden war.
16b. Enzymatische Ligierung markierter Oligonucleotide. Für einige Anwendungen von markierten Oligonucleotiden ist es nützlich, sie mit einem Rezeptor zu ligieren. Es wurde gezeigt, daß markierte Oligonucleotide an der enzymatischen Ligierung teilnehmen können, mit folgenden.Tests:
(1) Oligonucleotide, die am 5'-Ende markiert sind.
In diesem Test war die Matrize 5'-ATCAAGTCAGAAAAATATATA (SEQ ID Nr. 1). Diese wurde mit dem Donor, 3'-TAGTTCAGTC (SEQ ID Nr. 2) hybridisiert, der am 5'-Ende unter Verwendung von radioaktivem Phosphor phosphoryliert war. Vier Ligierungsreaktionen wurden durchgeführt, jede mit einer Modifikation der Sequenz T&sub5;, die mit dem 5'-phosphorylierten Ende des Donors ligieren konnte, nach Hybridisierung an die Reihe der 5 A's in der Matrize. Die 4 Oligo-T's, die in den Reaktionen verwendet wurden, unterschieden sich in der Art ihrer 5'-Enden. Eines hatte eine Dimethoxytritylgruppe gebunden über die Hydroxylgruppe. Die zweiten und dritten hatten Markierungen R9 und R10 gebunden an das 5'-Ende über eine Phosphodiester-Bindung. Das vierte war eine positive Kontrolle mit einer normalen 5'-OH-Gruppe. Einer negativen Kontrolle fehlte jedes oligot. die Ligierungsreaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von T4-Ligase nach den Anleitungen des Herstellers. Die Reaktionen wurden analysiert mit DC auf PEI- Cellulose, in 0,75 M Ammoniumbicarbonatlösung entwickelt.
Alle vier Reaktionen zeigten einen zusätzlichen Fleck auf dem Chromatogramm mit geringerer Mobilität als der Donor; wie erwartet zeigte die negative Kontrolle keinen zusätzlichen Fleck. Dies zeigt, wie Oligonucleotide mit verschiedenen Markierungen an sequenzspezifischen Ligierungsreaktionen teilnehmen können.
Cozzarelli et al. (1967) haben gezeigt, daß Polynucleotide, die an feste Träger gebunden sind, mit einem Akzeptor in Gegenwart einer komplementären Matrize ligiert werden können.

Beispiel 17

Hybridisierung von markierten Oligonucleotiden mit Oligonucleotiden, die an einen festen Träger gebunden sind.
Beispiel 16b zeigt, daß markierte Oligonucleotide an Ligierungsreaktionen teilnehmen können, wobei ausgeschlossen wird, daß sie auch an einer Doppelstrang-Bildung in Lösung teilnehmen können, da die Ligierung von diesem Verfahren abhängt. Der folgende Versuch zeigt, daß sie auch Doppelstränge mit Oligonucleotiden, die an einen festen Träger gebunden sind, bilden können. T&sub1;&sub0; wurde auf der Oberfläche einer Folie aus aminiertem Polypropylen nach den Anleitungen des Herstellers synthetisiert. Es ist bekannt, daß dieses Verfahren ungefähr 10 pmol Oligonucleotid pro mm² liefert. Eine Lösung von A&sub1;&sub0; in 3,5 M Tetramethylammoniumchlorid (65 pmol/um), markiert am 5'-Ende mit ³³P und markiert am 3'-Ende mit R10 wurde auf die Oberfläche des derivatisierten Polypropylens gebracht und über Nacht bei 4º gelassen. Nach dem Waschen im Hybridisierungs-Lösungsmittel wurde gefunden, daß ungefähr 1/3 der Sonde mit dem gebundenen Oligo-dT hybridisiert hatte. Dies ist nahe der theoretischen Grenze der Hybridisierung, was zeigt, daß markierte Oligonucleotide an Hybridisierungsreaktionen mit hoher Effizienz teilnehmen können.

Beispiel 18

Photolyse von Markierungen

Die Möglichkeit, Markierungen durch Photolyse zu entfernen, würde ihren Nutzen stark verbessern: es würde eine direkte Analyse durch Laser-Desorption im Massenspektrometer zulassen; es würde eine einfache Methode liefern, um die Markierungen zu entfernen, um andere biochemische oder chemische Verfahren zuzulassen.

18a Massen-Photolyse

Es ist bekannt, daß die Nitrobenzylgruppe labil ist gegenüber einer Strahlung von 305 nm. Lösungen von R10A&sub1;&sub0; und R10T&sub5; in Wasser wurden 2 cm von einer Durchleuchtungsvorrichtung 20 Minuten lang unter Bedingungen bestrahlt, die keinen nachweisbaren Schaden bei den Nucleinsäuren erzeugen. Die Analyse mit HPLC zeigte die erwarteten Produkte der Photospaltung, ohne nachweisbare Reste der ursprünglichen Verbindung.
18b Durch Laser induzierte Photolyse im Massenspektrometer Proben von R10T&sub5; und T&sub5;R10 wurden auf dem Metallplättchen eines Laufzeitmassenspektrometers (Finnigan Lasermat) ohne zugegebene Matrix abgeschieden. Das Spektrum zeigte einen einzigen gesättigten Peak bei einer Masse von ungefähr 243 in der positiven Betriebsart, der in anderen Proben nicht vorhanden war.
Identifizierung durch Massenspektrometrie von verschiedenen Markierungen, die an verschiedene Analyten gebunden sind
Eine Reihenfolge von fünf Thymidinresten mit einer Dimethoxytritylgruppe gebunden als Markierung am 3'-Ende wurde synthetisiert mit üblichen Festphasenmethoden, aber unter Verwendung von "reversen Synthons". Im Massenspektrometer ergab diese Verbindung einen großen und distinkten Peak bei einer Masse von 304, in der positiven Ionen-Betriebsart. Im Gegensatz dazu ergab eine Sequenz von 10 Adenosinresten, die die mit R10 bezeichnete Markierung trugen, einen großen und distinkten Peak bei einer Masse von 243 in der positiven Ionen-Betriebsart. In beiden Fällen wurde die Laser-Desorption in Abwesenheit einer Matrix durchgeführt. In beiden Fällen waren die Peaks nicht vorhanden bei Oligonucleotiden ohne Markierung. Diese Beispiele zeigen, daß es leicht möglich ist, eine Analytsequenz zu identifizieren durch die Gegenwart eines Peaks in der massenspektrometrischen Spur, die von einer Markierung stammt, die während der Synthese des Analyten eingebaut wurde und daß charakteristische Markierungen leicht durch ihre andere Masse identifiziert werden können.

Figurenlegende

Figur 1. Allgemeines Schema zur Synthese von Molekülen mit spezifischen Markierungen.

Die Synthese geht aus von einem Linker (L) mit mindestens einer Stelle zur Addition von Gruppen, um den Analyten zu synthetisieren und einer Stelle, um die Markierung zu synthetisieren. (Der Linker kann auch reversibel während der Synthese an einen festen Träger gebunden sein und kann Stellen zur Erzeugung von Gruppen, wie geladenen Gruppen, aufweisen, die für die Analyse hilfreich sind). Pa und Pr sind vorübergehende Schutzgruppen für die Analytvorläufer bzw. Reportergruppen; sie sind durch verschiedene Behandlungen entfernbar. Zum Beispiel kann Pa eine säure- oder basenlabile Gruppe sein, z.B. eine Tritylgruppe, F-MOC oder t-BOC und Pr kann eine Gruppe sein, die durch Behandlung mit Fluorid entfernbar ist, z.B. ein Silylrest. Gruppen U-Z können auch Schutzgruppen haben, die gegenüber den Reagenzien, die zur Entfernung von Pa und Pr entfernt werden, stabil sein müssen. Die Kupplungschemie ist verschieden für verschiedene Analytarten; Standardmethoden sind für Oligonucleotid- und Peptidsynthese verfügbar.
Drei verschiedene Arten von Markierungen werden in Figur 2 beschrieben. Für das erste Schema wird jede Verlängerung der Markierung durchgeführt mit einer Reportergruppe, die spezifisch sowohl für die Position als auch für die Art des dem Analyten zugefügten Restes ist. Eine Blockierung ist für dieses Schema nicht wichtig.
Im zweiten und dritten Schema wird die Position durch die Gesamtmasse an Reportergruppen definiert, die in dem Stadium der Synthese erreicht wurde, wenn der Rest zu dem Analyten zugegeben wird. In diesem Fall ist es wichtig, den Teil der Verlängerung der Markierung durch Blockierung eines Teils der Moleküle zu beenden. Das zweite und dritte Schema unterscheiden sich voneinander durch die Art und Weise, wie die Reportergruppen zugefügt werden. Im zweiten Schema sind sie in dem Verlängerungsmittel vorhanden, im dritten sind sie in der Blockierung vorhanden.

Figur 2. Drei Arten von molekülspezifischen Markierungen.

A. Es werden beispielhafte Markierungen aus Reportergruppen (E), die sowohl die Position (tiefgestellter Index) als auch die Identität (hochgestellter Index) der Gruppen in dem Analyten (U-Z) spezifisch angeben, gezeigt. Ein solcher Satz könnte eine Reihe von aliphatischen Ketten mit ansteigendem Formelgewicht umfassen, um die Position spezifisch anzugeben: z.B. Methylen für Position 1, Ethylen für 2, Propylen für 3 etc. Dies könnte in gruppenspezifischen Arten durch verschiedene isotopische Zusammensetzungen von Kohlenstoff und Wasserstoff differenziert werden: z.B. gibt es sechs verschiedene isotopische Zusammensetzungen von CH&sub2;, wie in Tabelle 1 oben gezeigt. Vier davon unterscheiden sich durch eine Masseneinheit und könnten leicht durch Massenspektrometrie unterschieden werden. Andere Wege der differenziellen Markierung können in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel könnten entweder die Position oder die Gruppe durch Reportergruppen mit verschiedener Ladung markiert werden. Solche Gruppen können getrennt und mit einer Anzahl von Methoden, einschließlich der Massenspektrometrie, erkannt werden.
B. Es werden Markierungen gezeigt, die durch Teilsynthese hergestellt wurden, z.B. wird gezeigt, daß jede Struktur des Analyten an eine Reihe von Markierungen gebunden ist; das erste Glied der Reihe hat eine Reportergruppe, die spezifisch für die erste Gruppe des Analyten ist; das zweite hat die erste Reportergruppe plus eine zweite Reportergruppe, die spezifisch für die zweite Gruppe des Analyten ist usw. Eine solche Reihe kann leicht hergestellt werden durch Verwendung von zwei Arten von Vorläufern, um die Markierung zu verlängern: eine, die durch eine reversible Blockierungsgruppe geschützt ist und eine, die eine weitere Verlängerung verhindert. Zum Beispiel eine Mischung aus RX und P-(CH&sub2;)nX, worin R eine nichtreaktive aliphatische Gruppe, wie eine Methyloder Ethylgruppe ist, P eine reversible Schutzgruppe ist und X ein aktivierter Rest ist, der mit der Gruppe, die durch P geschützt wird, reagieren kann. Solche Moleküle, die "blockiert" wurden durch die nichtreaktive aliphatische Gruppe nehmen nicht an der nächsten Runde der Abspaltung der Schutzgruppen und Verlängerung teil.
In B ist die gruppenspezifische Information in den Resten enthalten, die verwendet werden, um die Synthese zu verlängern. Wie in A könnte die Information durch Verwendung von Massen-Isotopen bereitgestellt werden.
Zum Beispiel fügt jede Addition eines CH&sub2;-Restes, der mit den Isotopen von C und H markiert ist, an P-(CH&sub2;)nX weitere Stellen zu, die verschiedene Massen für die Reportergruppe liefern können. Die Massen für (CH&sub2;)n liegen im Bereich von 14n bis 17n und es gibt 4 + 3(n-1) verschiedene Massen in diesem Bereich. So gibt es für die Ethylengruppe sieben verschiedene Massen im Bereich von 28 bis 34 und für die Propylengruppe 10 im Bereich von 42 bis 51.
C. Hier wird gezeigt, wie gruppenspezifische Information in anderer Weise zugefügt werden kann; in diesem Fall ist sie in dem Ketten-Abbruchglied enthalten, der "Blockierung" in Beispiel B. Wiederum könnten verschiedene Massen durch die Markierung eines aliphatischen Restes bereitgestellt werden. Informationen über die Position werden durch die Länge der Verlängerung, an der der Kettenabbruch zugefügt wurde, geliefert. Es wird angenommen, daß E (CH&sub2;)&sub2;-O ist, und die Ketten-Abbruchglieder isotopisch mit Methylgruppen mit Formelgewichten von 15 bis 19 markiert sind. Jede Verlängerung fügt 44 Masseneinheiten der Reportergruppe zu. Der Massenbereich für die kürzeste Reportergruppe wäre 44 + 15 = 59 bis 44 + 19 = 63. Der Bereich für die zweite Position wäre 88 + 15 = 103 bis 88 + 19 = 107 usw. bis zur sechsten Gruppe, wo der Bereich 284 + 15 = 299 bis 284 + 19 = 303 ist. Es gibt kein Überlappen in diesem Bereich und man kann sehen, daß die Anzahl von Reportergruppen und der Bereich ausgedehnt werden könnte durch Verwendung von Ketten-Abbruchgliedern und Verlängerungen mit mehr Atomen.

Zitierte Literatur

1. Brenner, S. and Lerner, R.A. (1992). Encoded combinatorial chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381--5383
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SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: ISIS INNOVATION LIMITED
(B) STRASSE: 2 South Parks Road
(C) ORT: Oxford
(E) LAND: Grossbritannien
(F) POSTLEITZAHL: OX1 3U8
(A) NAME: SOUTHERN, EDWIN
(B) STRASSE: 30, Staverton Road
(C) ORT: Oxford
(E) LAND: Grossbritannien
(F) POSTLEITZAHL: OX2 6XJ
(A) NAME: CUMMINS, WILLIAM JONATHAN
(B) STRASSE: 5 Thorntree Drive
(C) ORT: Tring
(D) BUNDESLAND: Herts.
(E) LAND: Grossbritannien
(F) POSTLEITZAHL: HP23 4JE
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Markierungsreagenz und Testmethode
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: GB 9315847.5
(B) ANMELDETAG: 30-JUL-1993

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ATCAAGTCAG AAAAATATAT A

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 10 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CTGACTTGAT

Claims

1. Reagenz umfassend

a) einen Analytanteil, umfassend mindestens zwei Analytreste und gebunden an

b) einen Markierungsanteil, umfassend eine oder mehrere Reportergruppen, die zum Nachweis durch Massenspektrometrie geeignet sind, unter Ausschluß von Oligonucleotiden,

wobei eine Reportergruppe einen Analytrest kennzeichnet und die Reportergruppe an jeder Position des Markierungsanteils so ausgewählt ist, daß sie einen Analytrest an einer definierten Position des Analytanteils kennzeichnet.

2. Reagenz nach Anspruch 1, worin eine Linkergruppe bereitgestellt wird, an die der Analytanteil und der Markierungsanteil gebunden ist.

3. Reagenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Analytanteil eine Kette von n Analytresten ist und der Markierungsanteil eine Kette von bis zu n Reportergruppen ist, wobei die Reportergruppe an jeder Position der Markierungskette so ausgewählt ist, daß der Analytrest an einer entsprechenden Position der Analytkette gekennzeichnet wird.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Analytanteil mit dem Markierungsanteil über eine photospaltbare Bindung verbunden ist.

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit der Formel A - L - R, worin A eine Kette von n Analytresten ist, die den Analytanteil bilden, L der Linker ist, R eine Kette von bis zu n Reportergruppen ist, die den Markierungsanteil bilden und n 2 bis 20 ist, wobei der Markierungsanteil Information enthält, die den Ort der Analytreste in dem Analytanteil definiert.

6. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin der Linker eine aromatische Gruppe, die eine Hydroxy-, Amino- oder Sulfhydryigruppe trägt für die Synthese des Analytanteils und eine reaktive Gruppe für die Synthese des Markierungsanteus umfaßt.

7. Reagenz nach Anspruch 6, worin die aromatische Gruppe, die eine Hydroxy-, Amino- oder Sulfydrylgruppe für die Synthese des Analytanteus trägt, auch eine o-Nitrogruppe für die Photospaltung trägt.

8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin eine geladene Gruppe zur Analyse durch Massenspektrometrie vorhanden ist.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Analytanteil eine Peptidkette ist.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Analytanteil eine Oligonucleotidkette ist.

11. Bibliothek der in einem der Ansprüche 1 bis 10 beanspruchten Reagenzien, worin die Bibliothek aus einer Mehrzahl von Reagenzien besteht, die jeweils verschiedene Analytanteile umfassen.

12. Bibliothek nach Anspruch 11, worin die Bibliothek aus 4fl Reagenzien besteht, die jeweils einen anderen Analytanteil umfassen, der eine unterschiedliche Oligonucleotidkette von n Nucleotiden ist.

13. Bibliothek nach Anspruch 12, worin die Reagenzien in Lösung gemischt werden.

14. Testmethode umfassend die Stufen, daß man: eine Zielsubstanz bereitstellt; die Zielsubstanz mit der Reagenzien- Bibliothek nach einem der Ansprüche 11 bis 13 unter solchen Bedingungen inkübiert, daß mindestens ein Reagenz an die Zielsubstanz bindet; nicht gebundene Reagenzien entfernt; die Markierungsanteile der oder des oder jeden gebundenen Reagenzes gewinnt und die gewonnenen Markierungsanteile analysiert als Hinweis auf die Art der an der Zielsubstanz gebundenen Analytanteile.

15. Testmethode nach Anspruch 14, worin die Zielsubstanz ein Organismus oder ein Gewebe oder eine Gruppe von Zellen ist.

16. Verfahren zur Sequenzierung einer Ziel-Nucleinsäure, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, daß man:

a) ein Oligonucleotid immobilisiert an einem Träger bereitstellt,

b) die Zielnucleinsäure mit dem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert,

c) das Hybrid von b) mit der in Anspruch 13 beanspruchten Bibliothek inkubiert, so daß eine Oligonucleotidkette eines ersten Reagenzes der Bibliothek mit der Zielnucleinsäure benachbart dem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert wird,

d) benachbarte Oligonucleotide ligiert, wodurch ein ligiertes erstes Reagenz gebildet wird,

e) andere nicht ligierte Reagenzien entfernt und

f) den Markierungsanteil des ligierten ersten Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines ersten Teils der Ziel-Nucleinsäure.

17. Verfahren nach Anspruch 16 umfassend die zusätzlichen Stufen, daß man

ci) das Hybrid von f) mit der in Anspruch 13 beanspruchten Bibliothek inkübiert, so daß eine Oligonucleotidkette eines zweiten Reagenzes der Bibliothek mit der Zielnucleinsäure benachbart der Oligonucleotidkette des ersten Reagenzes hybridisiert wird,

di) benachbarte Oligonucleotide ligiert, wodurch ein ligiertes zweites Reagenz gebildet wird,

ei) andere nicht ligierte Reagenzien entfernt und

fi) den Markierungsanteil des ligierten zweiten Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines zweiten Teils der Ziel-Nucleinsäure.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin in Stufe a) das Oligonucleotid an den Enden einer Reihe von Bezugspunkten des Trägers immobilisiert wird; in Stufe b) ein einzelner Klon der Ziel-DNA mit dem an jedem einzelnen Bezugspunkt immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert wird; in den Stufen c) und d) eine Reihe von ligierten Reagenzien gebildet wird mit unterschiedlichen Bezugspunkten, die unterschiedliche ligierte Reagenzien tragen und in Stufe f) der Markierungsanteil jedes ligierten Reagenzes gewonnen und analysiert wird als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-DNA.

19. Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin in Stufe b) jeder einzelne Klon der Ziel-DNA mit dem Oligonucleotid, das an einem einzelnen im Abstand voneinander angeordneten Ort des Trägers immobilisiert ist, hybridisiert wird; in den Stufen c) und d) eine Reihe von ligierten Reagenzien bereitgestellt wird, wobei unterschiedliche im Abstand voneinander befindliche Orte auf dem Träger verschiedene ligierte Reagenzien tragen und in Stufe f) der Markierungsanteil jedes ligierten Reagenzes gewonnen und analysiert wird als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-DNA.

20. Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin das Verfahren die Stufen umfaßt, daß man:

a) eine Anordnung von Oligonucleotiden bereitstellt, die im Abstand voneinander auf einem Träger angeordnet sind, wobei ein Oligonucleotid an einem Ort verschieden ist von Oligonucleotiden an anderen Orten,

b) die Zielnucleinsäure mit der Anordnung von immobilisierten Oligonucleotiden inkubiert, um Hybride an einem oder mehreren im Abstand voneinander angeordneten Orten auf dem Träger zu bilden,

c) die Hybride von b) mit der in Anspruch 13 beanspruchten Bibliothek inkubiert, so daß eine Oligonucleotidkette eines Reagenzes der Bibliothek mit der Ziel-Nucleinsäure benachbart jedem immobilisierten Oligonucleotid hybridisiert wird,

d) benachbarte Oligonucleotide ligiert, wodurch ligierte Reagenzien an einem oder mehreren im Abstand voneinander angeordneten Orten des Trägers gebildet werden,

e) andere nicht ligierte Reagenzien entfernt und

f) den Markierungsanteil jedes ligierten Reagenzes gewinnt und analysiert als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-Nucleinsäure.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Sequenz des durch eine kovalente Bindung an jedem im Abstand voneinander angeordneten Ort auf dem Träger immobilisierten Oligonucleotids bekannt ist.

22. Verfahren zur Analyse einer Ziel-DNA, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, daß man:

i) die Ziel-DNA immobilisiert an einem Träger bereitstellt,

ii) die immobilisierte Ziel-DNA von i) mit einer Vielzahl der in Anspruch 10 beanspruchten Reagenzien inkübiert, so daß die Oligonucleotidketten verschiedener Reagenzien mit der Ziel-DNA auf dem Träger hybridisiert werden,

iii) nicht hybridisierte Reagenzien entfernt und

iv) den Markierungsanteil jedes Reagenzes als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-DNA gewinnt und analysiert.

23. Verfahren nach Anspruch 22, umfassend die weiteren Stufen, daß man:

iia) das Hybrid von iv) mit der Bibliothek von Reagenzien, die in Anspruch 13 beansprucht wird, inkubiert, so daß Oligonucleotidketten verschiedener Reagenzien mit der Ziel-DNA hybridisiert werden,

iiia)benachbarte Oligonucleotide, die mit der Ziel-DNA hybridisiert sind, ligiert und nicht ligierte Reagenzien entfernt und

iva) den Markierungsanteil jedes ligierten Reagenzes als Hinweis auf die Sequenz eines Teils der Ziel-DNA gewinnt und analysiert.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, worin einzelne Klone der Ziel-Nucleinsäure im Abstand voneinander auf dem Träger immobilisiert werden, wobei in Stufe ii) die Oligonucleotidketten verschiedener Reagenzien mit der Ziel-Nucleinsäure an verschiedenen im Abstand voneinander befindlichen Orten auf dem Träger hybridisiert werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24, worin jeder Markierungsanteil durch Photospaltung von dem zugehörigen Reagenz gewonnen wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 25, worin der Markierungsanteil durch Massenspektrometrie analysiert wird.

27. Testausstattung, umfassend einen Träger mit zwei oder mehr im Abstand voneinander angeordneten Orten darauf; einzelne Klone einer Ziel-Nucleinsäure immobilisiert auf den im Abstand voneinander angeordneten Orten auf dem Träger und verschiedene Reagenzien nach Anspruch 10, die mit den einzelnen Klonen der Ziel-Nucleinsäure auf den im Abstand voneinander angeordneten Orten auf dem Träger hybridisiert sind.