DE68915540T2

DE68915540T2 - Für zellen eindringbares medizinisches material und kunsthaut.

Info

Publication number: DE68915540T2
Application number: DE68915540T
Authority: DE
Inventors: Takeo Terumo Kabushik Katakura; Mikio Terumo Kabushiki K Koide; Jun Terumo Kabushiki K Konishi; Yuichi Mori; Kenichi Terumo Kabushik Ohsaki; Kaoru Terumo Kabushiki Oyamada; Ken Terumo Kabushiki Ka Tatebe; Katsutoshi Yoshisato
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1988-03-09
Filing date: 1989-03-09
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2009-03-10
Also published as: EP0403650A1; AU3212689A; WO1989008465A1; EP0403650B1; AU632273B2; US5263983A; EP0403650A4; DE68915540D1

Description

[Technisches Gebiet]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein für Zellen durchdringliches medizinisches Material, das ohne Schwierigkeiten in lebende Gewebe assimilierbar ist und sich als künstliches Gewebe eignet. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch die Applikation dieses medizinischen Materials als künstliche Haut.

[Hintergrund der Erfindung]

Eine Implantation hat sich als sehr wirksam zur Behandlung von in einem Teil von Geweben auftretenden Mängeln oder irreversibler Funktionsstörungen erwiesen. Zur Vermeidung des als Abstoßung bekannten Problems einer Immununverträglichkeit wird hierbei vorzugsweise Gewebe von anderen Stellen des Patienten oder seiner Verwandten transplantiert, d.h. eine Allotransplantation durchgeführt. Derart günstige Implantationsgewebe stehen jedoch nicht immer zur Verfügung. So wurden auch bereits Untersuchungen zur Schaffung implantierbarer künstlicher Gewebe durchgeführt.
Ein erster Versuch zur Bereitstellung von abstoßungsfreien künstlichen Geweben besteht darin, ein Material niedriger histologischer Reaktionsfähigkeit, d.h. ein Material, welches das Gewebe und das immunzelluläre System nicht sensibilisiert, zu schaffen. Ein Beispiel für diesen Versuch ist eine Studie zur Erhöhung der Hydrophobizität eines durch Polyurethane repräsentierten synthetischen polymeren Materials.
Ein zweiter Versuch besteht in der Bereitstellung eines Materials, das rasch und vor der Einleitung der Immunreaktion in die Gewebe assimiliert werden kann und dabei als Teil eines Organs funktioniert. Insbesondere soll hierbei das Gewebe ähnlich den angrenzenden Geweben aufgebaut werden, indem eine solche Zelle mit Gewebe heilender Funktion als Fibroblast in das von lebenden Körpern stammende Material, z.B. Kollagen, eindringen gelassen wird. Da das derart gebildete neue Gewebe nicht mehr länger "nicht-eigen" ist, kommt es zu keiner Immununverträglichkeit. Es läßt sich folglich sagen, daß dieser Versuch dem (geschilderten) ersten Versuch überlegen ist.
Auch dieser zweite Versuch besitzt jedoch folgende Nachteile.
Künstliche Materialien aus Kollagen u.dgl., die von lebenden Körpern herrühren, zeigen eine hohe Affinität zu zellulärem Gewebe, sie werden jedoch durch Kollagenase oder andere im lebenden Körper vorhandene Enzyme leicht zersetzt. Folglich reicht die Zeit für das Eindringen von Fibroblasten u.dgl. zum Aufbau neuer Gewebe nicht aus. Somit ist es erforderlich, die physikalischen Eigenschaften des Materials durch Einbau irgendwelcher Vernetzungen zu verstärken, damit das betreffende Material der durch Kollagenase bedingten Zersetzung zu widerstehen vermag. Zu diesem Zweck kann man sich einer dehydratisierenden Vernetzung unter Erwärmen oder einer chemischen Vernetzung mit Chemikalien bedienen. Von diesen Vernetzungsmaßnahmen ist die dehydratisierende Vernetzung sicherer als die chemische Behandlung, man erreicht hierbei jedoch eine geringere Widerstandsfähigkeit gegen Kollagenase als bei der chemischen Vernetzung. Somit bedient man sich im allgemeinen einer chemischen Vernetzung alleine oder einer chemischen Vernetzung in Kombination mit der dehydratisierenden Vernetzung.
Die Widerstandsfähigkeit gegen Kollagenase läßt sich durch Schaffung einer Vernetzungsstruktur in der geschilderten Weise deutlich verbessern. Wenn beispielsweise ein Kollagen durch bloßes Dehydratisieren unter Erwärmen auf 110ºC im Vakuum während 24 h vernetzt wird, geht das vernetzte Kollagen innerhalb eines Tages beim Stehenlassen in einer 3 Einheiten/ml Kollagenase enthaltenden Lösung bei 37ºC in Lösung. Wird andererseits das Kollagen mit einem Vernetzungsmittel vom Isocyanattyp vernetzt, zeigt es selbst bei 7-tägigem Stehenlassen in einer 1000 Einheitein/ml Kollagenaselösung bei 37ºC keine Änderungen seines Aussehens.
Andererseits führt die Ausbildung einer derart starken Vernetzungsstruktur zu einer deutlichen Verminderung der dem Kollagen eigenen guten Affinität zu Zellen oder Geweben. Folglich wird das Eindringen von Zellen derart gehemmt, daß sich die gewünschte Bildung neuen Gewebes nicht erreichen läßt.
Wie bereits ausgeführt, ist es schwierig, beiden Anforderungen, nämliche einer guten Widerstandsfähigkeit gegen Enzyme und einer guten Affinität zu Zellen oder Geweben, bei von lebenden Körpern herrührenden Materialien, z.B. Kollagen, zu genügen. Obwohl - wie gesagt - der zweite Versuch sehr ansprechend ist, konnte bislang noch kein den geschilderten Anforderungen genügendes Material bereitgestellt werden.
Das für Zellen durchdringliche medizinische Material könnte sich zwar als Beschichtungsmaterial zur Einbettung künstlicher Organe oder künstlicher Gefäße eignen, seine Verwendung als künstliche Haut dürfte jedoch leichter realisierbar und besser wirksam sein.
Eine künstliche Haut ist ein künstliches medizinisches Material zur zeitweiligen oder dauerhaften Abdeckung des verletzten Bereichs zur Verhinderung von Bakterieninfektionen oder einer "Überschwemmung" mit Humor, wenn irgendein Hautgewebe durch Verbrennen oder Verbrühen verletzt ist. Somit stellt künstliche Haut einen Ersatz für eine Transplantation körpereigener Haut dar.
Zum selben Zweck wie bei künstlicher Haut können als Wundabdeckungsmaterialien, wie bisher Gaze, absorbierende Baumwolle u.dgl. verwendet werden. Nachteilig an diesen Materialien ist jedoch, daß sie (nur) eine geringe Hemmfähigkeit gegen Bakterieninfektionen aufweisen. Da sie darüber hinaus das Exudat rasch absorbieren, trocknet die Wundoberfläche zu stark aus, was bei ihrer Ablösung zu Schmerzen, Bluten u.dgl. führt. Wird zur Vermeidung dieses Problems - wie dies manchmal der Fall ist - eine Salbe u.dgl. mitverwendet, stellt sich ein weiterer Nachteil ein, indem nämlich das Exudat so unzureichend absorbiert wird, daß die Wundoberfläche übermäßig feucht bleibt.
Bei grofflächigen Wundoberflächen werden folgende filmartige Abdeckungen verwendet. Zu der ersten Kategorie gehören Silikongaze, ein Film aus Silikonkautschuk, eine Lage aus synthetischen Fasern, wie Nylon, Teflon u.dgl. mit velourartiger Obeflächenstruktur und andere synthetische Materialien. Zu einer zweiten Kategorie gehören lyophilisierte Schweinehaut, Gewirke aus Chitin, Filme aus Kollagen, ein Polyaminosäureschwamm, ein Mucopolysaccharidkomplexkollagenfilm und andere von lebenden Körpern herrührende Materialien.
Nachteilig an filmartigen Abdeckungen aus den betreffenden synthetischen Materialien sind ihre unzureichend dichte Haftung an dem verletzten Bereich und ihre geringe Dampfdurchlässigkeit zusammen mit ihrer ausgeprägten Neigung zur Riβbildung. Filmartige Abdeckungen aus lebenden Körpern sind zwar vergleichsweise besser an lebende Körper anpaßbar, man hat jedoch Schwierigkeiten, auf genügend Rohmaterial zurückgreifen zu können. Darüber hinaus besitzen die meisten derselben Antigenizität und neigen zur Zerstörung durch bakterielle Infektion oder den Kontakt mit dem Exudat.
Neben den beschriebenen filmartigen Abdeckungen wurden auch bereits bestimmte komplexe Filme aus kollagenbehandelten Nylonnetzen und Silikonfilmen entwickelt und in den Handel gebracht. Diese komplexen Filme haften dicht an der Wundoberfläche und zeigen eine geeignete Wasserdurchlässigkeit. Der komplexe Film haftet jedoch an der Wundoberfläche, da das Granulationsgewebe im Laufe des Heilungsprozesses in das Nylonnetz eindringt. Da das Nylonnetz das Granülationsgewebe ohne Zersetzung behält, muß der komplexe Film nach der Heilung unter erheblichen Schmerzen abgezogen werden.

[Beschreibung der Erfindung]

Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines für Zellen durchdringlichen medizinischen Materials, das aufgrund der gewünschten Widerstandsfähigkeit gegen zersetzende Enzyme unter in-vivo-Umständen über eine bestimmte Zeit hinweg zusammen mit seiner günstigen Affinität zu Zellen und Geweben die erforderliche mechanische Festigkeit behält. Ferner sollte ein Verfahren zur Herstellung des betreffenden Materials geschaffen werden.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer künstlichen Haut mit akzeptabler Funktion als Ersatz für durch Transplantation übertragene körpereigene Haut unter Verwendung des betreffenden medizinischen Materials sowie in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung derselben. Die erfindungsgemäße künstliche Haut vermag eine bakterielle Infektion und einen Überlauf des Körperfluidums zu verhindern, wenn man sie zeitweilig oder dauernd zum Abdecken einer Wundoberfläche verwendet. Darüber hinaus vermag sie eine ausreichende Reparatur des Gewebes infolge Zellwachstums zu beschleunigen.
Das für Zellen durchdringliche medizinische Material gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und eine im lebenden Körper absorbierte biologische Trägersubstanz mit gegenüber dem denaturierten Kollagen höherer Beständigkeit gegen enzymatischen Abbau, wobei das Verhältnis denaturiertes Kollagen/Trägersubstanz etwa 5 - 80% (g/v) beträgt und die Trägersubstanz aus einer Gruppe Kollagen, Fibroin, Polymilchsäure, Mucopolysaccharid und Alginsäure ausgewählt ist.
Die erste künstliche Haut gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Trägerschicht aus Fibroin, eine auf einer Seite der Trägerschicht auflaminierte Wundkontaktschicht und eine auf die andere Seite der Trägerschicht zur Steuerung des Feuchtigkeitsdurchtritts auflaminierte den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht, wobei die Wundkontaktschicht denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmiges Kollagen umfaßt. Das faserförmige Kollagen besitzt eine höhere Beständigkeit gegen enzymatische Zersetzung als das denaturierte Kollagen. So wirkt das faserförmige Kollagen als Trägersubstanz für das denaturierte Kollagen. Vorzugsweise wird mindestens einer Schicht, nämlich der Wundkontaktschicht, der Trägerschicht und der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht, ein antibakterielles Mittel einverleibt.
Die zweite künstliche Haut gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Trägerschicht aus einer faserförmigen Kollagenmatrix mit Vernetzungsstruktur, eine auf eine Seite der Trägerschicht auflaminierte Wundkontaktschicht und eine auf die andere Seite der Trägerschicht zur Steuerung des Feuchtigkeitsdurchtritts auflaminierte, den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht, wobei die Wundkontaktschicht denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmiges Kollagen enthält. Vorzugsweise wird mindestens einer Schicht, nämlich der Wundkontaktschicht, der Trägerschicht und der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht, ein antibakterielles Mittel einverleibt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von künstlicher Haut dient der Herstellung- der genannten ersten oder zweiten künstlichen Haut. Dieses Verfahren umfaßt folgende Stufen:
Eine Stufe der Zubereitung eines Lösungsgemischs mit denaturiertem Kollagen eines Helixanteils von 0 - 80% und faserförmigem Kollagen;
eine Stufe des Aufbringens einer Fibroinmembran oder einer faserförmigen Kollagenmembran mit Vernetzungsstruktur auf die flüssige Oberfläche des Lösungsgemischs und einer anschiießenden Durchführung einer Lyophilisierung, wobei ein Verbundgebilde aus einer Trägerschicht aus der Fibroinmembran oder der Fibrillierten Kollagenmembran und einer Wundkontaktschicht aus einer porösen Substanz mit dem denaturierten Kollagen und dem faserförmigen Kollagen entsteht; eine Stufe einer Ausbildung eines viskosen dünnen Films aus einer Substanz zur Bereitstellung einer Feuchtigkeitsdurchtrittsmembran auf einer Unterlage mit ablösungsfähiger Oberfläche;
eine Stufe des Aufbringens der Oberfläche der Trägerschicht auf die viskose dünne Membran und
eine Stufe des Trocknens des viskosen dünnen Films bis zur Härtung und eines anschließenden 1- bis 24-stündigen Erwärmens auf 50 - 180ºC in einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr.
Vorzugsweise sollte mindestens einer der Lösungen mit denaturiertem Kollagen und faserförmigem Kollagen, der Fibroinmembran oder der faserförmigen Kollagenmembran mit Vernetzungsstruktur oder dem viskosen dünnen Film zur Bereitstelung der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht ein antibakterielles Mittel einverleibt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen beschrieben:

Für Zellen durchdringliches medizinisches Material

Das erfindungsgemäße, für Zellen durchdringliche medizinische Material basiert auf der Erkenntnis der Tatsache, daß Zellen ohne Schwierigkeiten in eine Kollagenschicht, in der das Kollagen bis zu einem Helixanteil an 0 - 80% denaturiert wurde, einzudringen vermögen.
Zunächst wird das denaturierte Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% beschrieben. Der Helixanteil bezieht sich auf den Gehalt der Tripelkettenhelix, die für Kollagen charakteristisch ist. In dem denaturierten Kollagen ist ein gewisser Teil der oder die gesamte Tripelkettenhelix in eine willkürliche Spirale übergegangen. Folglich entspricht der [1-Helixanteil] dem Denaturierungsgrad. Das denaturierte Kollagen erhält man durch Erwärmen, chemische Behandlung oder physikalische Behandlung von Kollagen. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des denaturierten Kollagens besteht in einer Wärmebehandlung
Ein solches denaturiertes Kollagen wird beispielsweise wie folgt zubereitet: Das von der Lederhaut von Rindern stammende Kollagenmaterial wird in einer Säure oder einem Alkali behandelt, wobei man aus einer Tripelkettenhelix bestehendes Kollagen erhält. Das hierbei erhaltene Kollagen wird sukzessive in Gegenwart von Wasser 20 min bis 24 h lang auf 50ºC - 125ºC, vorzugweise 90 - 121ºC, erwärmt, um die Tripelkettenhelix zu einer willkürlichen Spirale zu denaturieren. Wenn beispielsweise 30 min lang auf 60ºC erwärmt wird, stellt sich der Helixanteil auf etwa 40% ein. Wenn 24 h auf 100ºC erwärmt wird, wird der Helixanteil 0%. Der Helixanteil läßt sich mit Hilfe des Rotationsdichroismus-Spektrometers (CD) oder Infrarotspektralphotometers bestimmen (vgl. P.L. Gorden und Mitarbeiter in "Macromoles", 1(6), 954 (1974) und M. Nakura, Hashimoto und Mitarbeiter in "High Polymer Article Collection", 41(8), 473 (1984)). Die in dieser Beschreibung angegebenen Werte für den Helixanteil sind die auf der Basis spektroskopischer Messungen errechneten Ergebnisse. Zufälligerweise hat es sich aufgrund elektrophoretischer Testergebnisse gezeigt, daß ein Teil des Kollagenmoleküls in diesem denaturierten Kollagen gespalten war.
Das erfindungsgemäß eingesetzte denaturierte Kollagen besitzt, wie bereits erwähnt, einen Helixanteil von 0 - 80%, vorzugsweise 0 - 50%. Zweckmäßigerweise sollte ein denaturiertes Kollagen eingesetzt werden, bei dem der antigene Teil (Teropeptid) am Ende des Kollagenmoleküls entfernt wurde. Ein solches Kollagen ohne Antigenizität und ohne dieses Teropeptid ist allgemein unter der Handelsbezeichnung "Aterokollagen" bekannt. Aterokollagen erhält man durch Behandeln des Ausgangskollagens mit einer Säure oder einem Alkali und anschließend mit spezifisch auf das Teropeptid einwirkendem Pepsin.
Da die Helix des in dem erfindungsgemäßen medizinischen Material verwendeten denaturierten Kollagens in eine willkürliche Spirale überführt und unterwegs teilweise gespalten wurde, vermögen Zellen offensichtlich leicht in das denaturierte Kollagen einzudringen. Andererseits dürfte dieses denaturierte Kollagen relativ rasch durch Kollagenase zersetzt werden und aus eigener Kraft nicht ausreichend lange erhalten bleiben, bis durch das Eindringen von Fibroblasten neue Gewebe gebildet werden. Folglich muß das erfindungsgemäße medizinische Material notwendigerweise nicht nur das denaturierte Kollagen, sondern auch das Trägersubstrat mit hoher Widerstandsfähigkeit gegen enzymatische Zersetzung durch Kollagenase o.dgl. enthalten, damit die erforderliche mechanische Festigkeit in der Umgebung des lebenden Körpers eine bestimmte Zeit lang erhalten bleibt. Diese Trägersubstanz wird im folgenden erläutert.
Die zu diesem Zweck verwendete Trägersubstanz muß der Wirkung des zersetzenden Enzyns so lange widerstehen können, bis genügend Zellen eingedrungen sind, und ferner biologisch verträglich sein. Beispiele für eine solche Substanz sind Polyester, Polyurethan, Vinylchlorid und sonstige Kunstharze. Bevorzugtere Trägersubstanzen sind jedoch biologische Substanzen, wie Kollagen, Fibroin, Polymilchsäure, Mucopolysaccharide und Alginsäure, die letztlich im lebenden Körper absorbiert werden. Besonders bevorzugt wird Kollagen, insbesondere Aterokollagen ohne das Antigenizität aufweisende Teropeptid.
Bei dem als Trägersubstanz verwendeten Kollagen handelt es sich natürlicherweise um nicht-denaturiertes Kollagen, das nicht der geschilderten Denaturierungsbehandlung unterworfen wurde. Vorzugsweise sollte es aus einem Kollagen, dem Vernetzungsstruktur verliehen wurde, bestehen. Zum Einführen der Vernetzungsstruktur in das Kollagen kann man sich eines üblichen Verfahrens bedienen. So kann beispielsweise das Kollagen erwärmt oder mit einem Vernetzungsmittel behandelt werden. Im Falle der Wärmebehandlung wird das Kollagen 1 - 24 h auf 50 - 180ºC, vorzugsweise 2 - 8 h auf 10 - 120ºC, in einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr erwärmt. Hierbei erfolgt eine thermische Dehydratisierung. Bei der Behandlung mit einem Vernetzungsmittel sind diesem keine speziellen Grenzen gesetzt. So eignen sich beispielsweise Aldehydvernetzungsmittel wie Clutaraldehyd, Isocyanatvernetzungsmittel, wie Hexamethylendiisocyanat, und Carbodiimldvernetzungsmittel wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid.
Als solche Trägersubstanz kann vorzugsweise auch das faserförmige Kollagen verwendet werden. Das faserförmige Kollagen erhält man durch Neutralisieren des aus einer Tripelkettenhelix bestehenden Kollagens mit Hilfe eines Phosphatpuffers bei 37ºC. Hierbei wird die wasserlösliche und dispergierbare Tripelkettenhelixstruktur zu einer faserförmigen Struktur mit Periodizität umgebaut und das Kollagen unlöslich gemacht.
Das durch Einführen einer Vernetzungsstruktur in das faserförmige Kollagen erhaltene vernetzte faserförmige Kollagen eignet sich besonders gut als Trägersubstanz. Das dispergierbare Tripelkettenkollagen wird durch Einführen einer Vernetzungsstruktur hinsichtlich seiner Eigenschaften, z.B. seiner mechanischen Festigkeit, nicht besonders verbessert, wenn jedoch in fibrilliertes Kollagen eine Vernetzungsstruktur eingeführt wird, werden dessen Eigenschaften, z.B. die mechanische Festigkeit, infolge der synergistischen Effekte der faserförmigen Struktur und Vernetzungsstruktur deutlich verbessert. Die Vernetzungsstruktur wird nach Ausbildung der Faserstruktur eingeführt. Wenn der in das faserförmige Kollagen eingeführte Vernetzungsgrad zu gering ist, erreicht man keine ausreichende physikalische Festigkeit. Wenn er andererseits zu hoch ist, werden die Struktur und bevorzugte Eigenschaften des Kollagens geopfert. Folglich muß der Vernetzungsgrad in Abhängigkeit von den Bedingungen in geeigneter Weise festgelegt werden. Bei Verwendung eines Vernetzungsmittels erreicht man einen geeigneten Grad (an Vernetzung) bei einer Vernetzungsmittelkonzentration von allgemein 0,01 - 5% (g/v) oder vorzugsweise 1 - 3% (g/v).
Bei dem erfindungsgemäßen medizinischen Material mit hervorragender Durchdringungsfähigkeit für Zellen infolge des genannten denaturierten Kollagens läßt sich aufgrund der Mitverwendung einer Trägersubstanz eine ausreichende Festigkeit erhalten, bis sich durch ein ausreichendes Eindringen von Zellen ein lederhautartiges Bindegewebe gebildet hat. Mit anderen Worten gesagt, bildet die Trägersubstanz in dem denaturierten Kollagen eine Skelettstruktur, die der Zersetzungswirkung eines Enzyms widersteht. Darüber hinaus wird bei Verwendung einer biologischen Substanz, wie Kollagen, als Trägersubstanz diese letztendlich durch die enzymatische Wirkung zersetzt. Folglich wird sie vollständig im Körper assimiliert. Das Verhältnis denaturiertes Kollagen/Trägersubstanz beträgt etwa 5 - 80% (g/v) oder vorzugsweise 10 - 50% (g/v).
Das erfindungsgemäße medizinische Material kann je nach der vorgesehenen Anwendung in den verschiedensten Formen, z.B. als Film oder Schwamm, bereitgestellt werden. Hierbei kann die Trägersubstanz lediglich in dem denaturierten Kollagen dispergiert werden. Andererseits kann das denaturierte Kollagen auch in die schwammartige Matrix der Trägersubstanz imprägniert werden.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen medizinischen Materials wird später noch näher erläutert werden. Obwohl bei dem folgenden Verfahren Kollagen als Trägersubstanz verwendet wird, kann man sich desselben Verfahrens auch bei Verwendung anderer Trägersubstanzmaterialien, als Kollagen bedienen.
Bei einem ersten Verfahren wird zunächst eine wäßrige Kollagenlösung zubereitet. Diese wird in zwei Hälften geteilt. Die erste Hälfte wird stehengelassen, die zweite Hälfte wird zur Denaturierung des Kollagens erwärmt. Die erhaltene denaturierte Kollagenlösung und die nicht-denaturierte Kollagenlösung werden miteinander gemischt und in eine geeignete Form gebracht. So kann beispielsweise das Gemisch durch Lösungsmittelgießen in einen Film oder durch Gefriertrocknen in einen porösen Schwamm überführt werden. Danach wird erforderlichenfalls der Film oder Schwamm einer thermischen oder chemischen Vernetzung unterworfen.
Bei einem zweiten Verfahren wird unter Verwendung lediglich der bei dem obigen Verfahren erhaltenen nicht-denaturierten Kollagenlösung in der geschilderten Weise ein poröser Film oder poröser Schwamm hergestellt. Die hierbei erhaltene Film- oder Schwammatrix wird dann thermisch oder chemisch vernetzt. Schließlich wird die Matrix in die denaturierte Kollagenlösung getaucht und an Luft oder im Vakuum getrocknet oder gefriergetrocknet.
Das Verhältnis denaturiertes Kollagen/Trägersubstanz beträgt etwa 5 - 80% (g/v) ode vorzugsweise 10 - 50% (g/v).

Künstliche Haut

Die erfindungsgemäße künstliche Haut besteht aus einem unter Verwendung des geschilderten für Zellen durchdringlichen medizinischen Materials hergestellten mehrlagigen komplexen Film. In typischer Weise handelt es sich hierbei um einen komplexen Film dreilagiger Struktur (vgl. Fig. 1). In Fig. 1 bezeichnet die Bezugszahl 1 eine Trägerschicht. Auf die Unterseite der Trägerschicht 1 ist eine Wundkontaktschicht 2 auflaminiert. Auf die Oberseite der Trägerschicht 1 ist eine den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3 auflaminiert. Das für Zellen durchdringliche medizinische Material wird in der Wundkontaktschicht 2 verwendet. Diese Schichten werden nun im einzelnen beschrieben.

(1) Wundkontaktschicht 2

Als Wundkontaktschicht 2 wird insbesondere das genannte, für Zellen durchdringliche medizinische Material mit faserförmigem Kollagen als Trägersubstanz verwendet. Dies bedeutet, daß die Wundkontaktschicht 2 aus denaturiertem Kollagen mit dem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmigem Kollagen besteht. Auf eine Beschreibung der Zusammensetzung u.dgl. der diese Komponenten enthaltenden Wundkontaktschicht wird hier verzichtet, da diese bereits beschrieben wurden. Selbstverständlich kann die Wundkontaktschicht wie auch das bereits genannte medizinische Material zu beliebigen Formen, z.B. als Film und Schwamm, ausgeformt werden. Die Trägersubstanz kann lediglich in dem denaturierten Kollagen dispergiert sein, oder das denaturierte Kollagen kann beispielsweise in die schwammartige Matrix der Trägersubstanz imprägniert werden.
Die Wirkungen der Wundkontaktschicht 2 bestehen in einer direkten Abdeckung der Wundoberfläche zum weichen Schutz (derselben), in einer Schmerzunterdrückung, in einer mäßigen Feuchtigkeitsvorsorge und in einer Verhinderung einer bakterieilen Infektion. Sie soll Ferner eine Bildung von neuem Gewebe durch Zellproliferation fördern und eine Heilung begünstigen. Die aus einem solchen für Zellen durchdringlichen medizinischen Material bestehende Wundkontaktschicht 2 besitzt sämtliche dieser Funktionen, und fördert insbesondere eine Bildung von neuem Gewebe. Wenn sie einmal auf die Wundoberfläche appliziert ist, kommt es, insbesondere zusammen mit einem frühzeitigen Eindringen von Fibroblasten, zu einer Infiltration von Makrophagen, Neutrophilen und sonstigen eine Entzündung herbeiführenden Zellen. Dies führt zur Bildung von lederhautartigem Bindegewebe unter Beschleunigung der Wundheilung. Auf eine weitere Erläuterung der Zelleninvasion wird hier verzichtet, da diese bereits im Zusammenhang mit dem medizinischen Material detailliert beschrieben wurde. Da die Wundkontaktschicht 2 letztlich durch Enzyme zersetzt wird, wird sie im Körper absorbiert. Folglich ist, anders als bei bekannter künstlicher Haut, deren Entfernung nicht von Schmerzen begleitet.

(2) Trägerschicht 1

Die Trägerschicht 1 erhöht die mechanische Festigkeit der Wundkontaktschicht 2 und gestattet ein glattes Eindringen von Zellen in die Wundkontaktschicht 2.
Wie bereits ausgeführt, besitzt die Wundkontaktschicht aufgrund der Mitverwendung von faserförmigem Kollagen eine spezifische Beständigkeit gegen Kollagenase. Die mechanische Festigkeit als Abdeckmaterial läßt jedoch immer noch zu wünschen übrig, und da sie letztendlich im Körper assimiliert wird, braucht man irgendeinen tragenden Körper zum Schutz derselben gegen äußere Einwirkung. Folglich muß die Trägerschicht 1 eine spezielle mechanische Festigkeit aufweisen. Gleichzeitig darf die Trägerschicht 1 ein Eindringen von Zellen in die Wundkontaktschicht 2 nicht hemmen. Als diesen Anforderungen genügendes Material wird bei der künstlichen Haut der ersten Ausführungsform Fibroin verwendet. Bei der künstlichen Haut der zweiten Ausführungsform wird faserförmiges Kollagen mit Vernetzungsstruktur verwendet.
Fibroin ist ein biologisches Material und besteht aus einem einen Hauptbestandteil von Seide bildenden Protein. Da bekanntlich Seidenzwirn als chirurgisches Nahtmaterial verwendet wird, stellt Fibroin ein Protein hervorragender Stabilität in lebenden Körpern dar. Eine wäßrige Fibroinlösung läßt sich durch Auflösen von Fibroin in einer konzentrierten neutralen Lösung von Salzen, wie Lithiumbromid oder Calciumchlorid, und Dialysieren der Lösung u.dgl. herstellen. Diese wäßrige Fibroinlösung wird bei -18ºC bis 0ºC eingefroren und aufgetaut, um eine kristalline Struktur vom β-Typ zu bilden.
Hierbei entsteht ein wasserunlösliches poröses Gewirk [Jun Umagoshi, Kobunshi Kagaku (Polymer Chemistry), 30, 582 (1973)]. Dieses poröse Fibroingewirk zeigt eine bessere Stabilität in lebenden Körpern als übliches Kollagen mit Vernetzungsstruktur. So kann es in geeigneter Weise als Trägerschicht einer künstlichen Haut zur Abdeckung der Wundober-Fläche über lange Zeit hinweg verwendet werden.
Das faserförmige Kollagen mit Vernetzungsstruktur wurde bereits beschrieben. Wenn in faserförmiges Kollagen eine Vernetzungsstruktur eingeführt wird, werden die mechanische Festigkeit und sonstige Eigenschaften durch die synergistische Wirkung der Faserstruktur und Vernetzungsstruktur deutlich verbessert. Folglich wird es in vorteilhafter Weise als Trägerschicht einer künstlichen Haut verwendet.

(3) Den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3

Die den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3 dient zur Steuerung des Wassergehalts auf der Wundoberfläche während der Applikation der künstlichen Haut auf die Wundoberfische. Eine Ansammlung von Exudat oder Wundsekret auf der Wundoberfläche läßt sich vermeiden, indem man sie naß und feucht hält. Dies geschieht dadurch, daß man mit Hilfe der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3 einen geeigneten Dampfdurchtritt sicherstellt. Gleichzeitig läßt sich ein Hindurchtreten der Proteinbestandteile im Exudat bzw. Wundsekret nach außen hin verhindern. Auf diese Weise werden günstige Umstände für eine Gewebereparatur geschaffen. Es ist bereits bekannt, daß eine solche den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht in einem Wundabdeckungsmaterial verwendet wird. Diese bekannten Materialien können auch für eine erfindungsgemäße künstliche Haut Verwendung finden. So läßt sich als den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3 ein Film aus einem nicht-toxischen Material mit einem Wasserfluß von etwa 0,1 - 1 mg/cm²/h verwenden.
Eine geeignete Dicke beträgt etwa 5 - 200 µm. Nicht-toxische Materialien umfassen ein Silikonharz, ein Polyacrylat, ein Polymethacrylat, Polyurethan und dergleichen. Besonders bevorzugt wird ein Silikonharz.
Diese dreilagige künstliche Haut vermag (bei Verwendung als künstliche Haut) eine hervorragende therapeutische Wirkung zu entfalten, da die Wundkontaktschicht 2 in höchst vorteilhafter Weise ein Eindringen von Zellen ermöglicht und eine )0 geeignete Beständigkeit gegen enzymatische Zersetzung aufweist. Eine akzeptable mechanische Festigkeit erhält sie durch die Trägerschicht 1. Ein geeigneter Feuchtigkeitsgehalt auf der Wundoberfläche wird durch die den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3 aufrechterhalten. Da in der Wundkontaktschicht 2 eine Verbesserung des Eindringens von Zellen und der Widerstandsfähigkeit gegen Enzyme, die beide bislang miteinander unverträglich waren, erreicht wurde, läßt sich ein weit stärkerer therapiebeschleunigender Effekt gewä.hrleisten als mit den bekannten Wundabdeckmaterialien.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der ersten und zweiten künstlichen Haut wird mindestens einer der Schichten, nämlich der Wundkontaktschicht 2, der Trägerschicht 1 und der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3, ein antibakterielles Mittel einverleibt. Geeignete antibakterielle Mittel sind Silbersulfadiazin, Gentamycin und Silbernitrat. Es können jedoch auch ohne Beschränkung verschiedene andere antibakterielle Mittel eingesetzt werden. Der Einbau solcher antibakterieller Mittel dient einer wirksamen Verhinderung antibakterieller* Infektionen. *vermutlich: bakterieller
Zu einer bakteriellen Infektion kann es bei großflächiger Verbrühung oder schwerwiegender Verbrühung (beispielsweise Verbrühung Grad III) kommen. Zur Verhinderung einer solchen bakteriellen Infektion wurde bisher eine Cremegrundlage mit einem antibakteriellen Mittel verwendet. Wird jedoch eine Cremegrundlage zusammen mit einem bekannten Wundabdeckmaterial, wie Gaze oder einer Bandage, benutzt, versickern etwa 57% der aufgetragenen Creme zusammen mit dem Extrudat oder Wundsekret in die Gaze o.dgl., wobei (nur) etwa 21% Creme auf der Wundoberfläche bleiben. Weiterhin muß die Creme täglich aufgetragen werden, was recht mühselig ist. Wenn andererseits die erfindungsgemäße künstliche Haut ein antibakterielles Mittel enthält, kann dieses nach und nach innerhalb eines bestimmten Zeitraums freigesetzt werden und folglich kann das antibakterielle Mittel kontinuierlich, ohne die, Wundoberfläche der Umgebungsluft auszusetzen und ohne mühseliges tägliches Auftragen des antibakteriellen Mittels auf die Wunde, wirken. Auf diese Weise kann in Kombination mit der das Eindringen von Bakterien verhindernden Wirkung der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht eine Bakterieninfektion wirksam verhindert werden.
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die Freigabe des in der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3 enthaltenen antibakteriellen Mittels zu überprüfen. Zunächst wurden drei Silikonfilme (etwa 0,15 g) einer Dicke von 20 µm und einer Größe von 5 cm x 5 cm hergestellt. Diese enthielten 10 mg, 20 mg bzw. 30 mg Silbersulfadiazin (AgSD). Die einzelnen Prüflinge wurden dann in 100 ml destilliertes Wasser getaucht und die Menge an im Laufe der Zeit eluiertem AgSD bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. In dieser Figur zeigt die Abszisse den zeitlichen Verlauf (in Tagen), die Ordinate die Gesamtmenge an eluiertem AgSD. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß in dem Silikonfilm enthaltenes AgSD nach und nach freigegeben wurde und dabei eine zur Herbeiführung der geschilderten Wirkung genügend große schrittweise Freigabe erreicht wird.
Wenn die Hauptaufgabe die Verhinderung eines Eindringens von Bakterien von außen her ist und man folglich einer dieser Schichten ein antibakterielles Mittel einverleiben muß, sollte dieses vorzugsweise in der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3 geschehen. Wenn andererseits die Wundoberfläche bereits mit Bakterien infiziert ist und man eine große Menge an antibakteriellem Mittel auf die Wunde applizieren muß, ist es zweckmäßig, das antibakterielle Mittel entweder der Wundkontaktschicht 2 oder der Trägerschicht 1 einzuverleiben. Selbstverständlich kann man das antibakterielle Mittel auch zwei oder drei Schichten, nämlich der Wundkontaktschicht 2, der Trägerschicht 1 und der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3 einverleiben.

Herstellungsverfahren für eine künstliche Haut

Das Herstellungsverfahren für eine künstliche Haut gemäß der Erfindung besteht aus einem Verfahren zur wirksamen Herstellung entweder der ersten oder zweiten künstlichen Haut mit einer Wundkontaktschicht, in der die Trägersubstanz lediglich in dem denaturierten Kollagen dispergiert ist. Dieses Verfahren läßt sich ohne Schwierigkeiten durch folgende Stufen a) bis f) realisieren.
a) Zunächst wird eine künstliche Kollagenlösung zubereitet und in zwei Hälften geteilt. Eine Hälfte wird stehengelassen, während die andere zur Denaturierung des Kollagens erwärmt wird. Die erhaltene Lösung von denaturiertem Kollagen und die Lösung von nicht-denaturiertem Kollagen werden miteinander gemischt. Das erhaltene Lösungsgemisch dient zur Bildung der Wundkontaktschicht 2.
b) Getrennt wird ein als Trägerschicht 3 dienender Fibroinfilm oder ein Film aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur hergestellt.
Der faserförmige Kollagenfilm mit Vernetzungsstruktur wird durch Gefriertrocknen der wässrigen Lösung des nach dem geschilderten Verfahren hergestellten vernetzten faserförmigen Kollagens in einen porösen schwammartigen Film überführt.
Der Fibroinfilm wird ebenfalls nach dem bereits geschilderten Verfahren in einen porösen Film überführt.
c) In der nächsten Stufe wird das Lösungsgemisch in einen eigenen Behälter gefüllt. Der Fibroinfilm oder der Film aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur wird auf die Flüssigkeitsoberfläche gelegt und gefriergetrocknet. Hierbei erhält man ein Verbundgebilde aus Trägerschicht 1 und Wundkontaktschicht 2. In diesem Falle besteht die Trägerschicht 1 aus einem Fibroinfilm oder einem Film aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur und die Wundkontaktschicht 2 aus einer porosen Schicht mit denaturiertem Kollagen und faserförmigem Kollagen.
d) Auf einer Unterlage mit einer ein Abziehen gestattetenden Oberfläche, z.B. einer Unterlage aus Teflon, wird eine Lösung aus einer Substanz, z.B. einem Silikon zur Herstellung eines für Feuchtigkeit durchlässigen Films zur Bildung eines viskosen dünnen Films ausgebreitet.
e) Auf den viskosen dünnen Film wird das Verbundgebilde aus Trägerschicht 1 und Wundkontaktschicht 2 derart gelegt, daß die Trägerschicht 1 mit dem viskosen dünnen Film in Berührung gelangt.
f) Nachdem der viskose dünne Film bis zur Härtung getrocknet ist, wird er unter einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr weiter 1 - 24 h bei 50 - 180ºC erwärmt. Hierbei wird der viskose dünne Film getrocknet und eine den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht 3 gebildet. Gleichzeitig wird die Steuerschicht 3 einheitlich mit der Trägerschicht 1 verbunden. Somit erhält man eine 10 künstliche Haut mit dreilagiger Struktur entsprechend Fig. 1.
Auf diese Weise läßt sich erfindungsgemäß ohne Verwendung irgendwelcher Klebstoffe ohne Schwierigkeiten eine künstliche Haut mit in Fig. 1 dargestellter Verbundstruktur herstellen.
Eine bevorzugte künstliche Haut mit einem antibakteriellen Mittel läßt sich durch Einverleiben eines antibakteriellen Mittels in das Lösungsgemisch zur Bildung der Wundkontaktschicht 2, den als Trägerschicht 1 dienenden Fibroinfilm oder Film aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur und/oder die Lösung mit der Substanz zur Bildung der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht 3 herstellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt im Querschnitt ein Beispiel einer mehrlagigen Struktur einer erfindungsgemäßen künstlichen Haut und
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Tests bezüglich der Freigaberate des in der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht der künstlichen Haut gemäß Fig. 1 einverleibten antibakteriellen Mittels.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

[A] Beispiele für das für Zellen durchdringliche medizinische Material (Beispiele 1 bis 4)

Beispiel 1: Herstellung einer Aterokollagen/denaturiertes Aterokollagen-Matrix

1,0 g Aterokollagen (AC) wurde in verdünnter Salzsäure eines pH-Werts von 3,0 gelöst.
Diese Lösung wurde in einem mit Hilfe eines Thermostaten auf 60ºC gehaltenen Ofen 30 min lang und dann bei Raumtemperatur 2 h lang stehengelassen, wobei eine Lösung von denaturiertem Aterokollagen (HAC) erhalten wurde. Der Helixanteil des erhaltenen HAC betrug etwa 40%. Unter Rühren einer 0,3 g/v%igen AC-Lösung (pH-Wert: 3,0) wurde diese mit einer 0,3 g/v%igen HAC-Lösung versetzt und gemischt. Diese Lösung wurde in ein Gefäß aus nicht-rostendem Stahl gegossen und direkt rasch bei -30ºC eingefroren. Nach ausreichendem Einfrieren wurde sie unter Vakuum bei weniger als -40ºC/0,1 Torr gefriergetrocknet. Das Produkt wurde thermisch dehydratisiert und durch 24-stündiges Wärmebehandeln bei 110ºC in einem Vakuum von weniger als -40 C/0,1 Torr vernetzt.

Referenz 1: Herstellung einer AC-Matrix

1,0 g AC wurde in verdünnter Salzsäure eines pH-Werts von 3,0 bis zu einer Konzentration von 0,3 g/v% gelöst. Diese Lösung wurde in der geschilderten Weise gefriergetrocknet und danach erwärmt, dehydratisiert und vernetzt.
Test 1: In vitro-Zell-Eindringtest einer AC/HAC-Matrix Unter Verwendung von Rattenhautfibroblasten wurde das Eindringen von Zellen in gemäß Beispiel 1 und Referenz 1 erhaltene Matrizes im Rahmen eines in vitro-Kulturtests bestimmt.
Ein Kollagenschwamm eines Durchmessers von 3,5 cm wurde auf eine 60 mm steriliserte Petri-Schale (hergestellt von Terumo) gelegt. Auf den Schwamm wurden Fibroblasten in einer Menge von 1 ml einer Konzentration von 1 x 10&sup6; Zellen/ml 10 aufgetropft und 24 h bei 37ºC gezüchtet. Weiterhin wurden 3 ml DME-Kulturmedium mit 10% FBS zugegeben und 6 Tage bei 37ºC kultiviert.
Nach dem Fixieren in einer 10%igen Neutralpuffer-Formalinlösung wurde die Probe angefärbt und mit Hilfe eines optischen Mikroskops betrachtet. Die Ergebnisse der Bewertung sind in Tabelle 1 zusammengestellt. TABELLE 1 In vitro-Test bezüglich eines Eindringens von Zellen in eine Kollagenmatrix Probe Eindringen von Zellen Fähigkeit zum Erhalt der Schwammform Bemerkung: Eindringen von Zellen Fähigkeit zum Erhalt der Schwammform - Kein Eindringen ± Schwaches Eindringen + Geringes Eindringen ++ Mittleres Eindringen +++ Deutliches Eindringen Verlorengegangen (aufgelöst) Nahezu aufgelöst Extreme Deformation trotz Erhalt des Prüflings Schwache Kontraktion, auflösend Unverändert
Aus Tabelle 1 geht hervor, daß die mit HAC gemischte Matrix im Vergleich zu der AC-Matrix alleine hinsichtlich des Eindringens von Zellen deutlich verbessert war. Aus Gründen einer Erhaltung der Schwammform dürfte es zweckmäßig sein, daß sie weniger als 80 Gew.-% HAC enthält.

Referenz 2: Herstellung von faserförmigem AC

1,0 g AC wurde in verdünnter Salzsäure eines pH-Werts von 3,0 bis zu einer 0,3 g/v%igen Lösung gelöst. Unter Rühren in einem mittels eines Thermostaten auf 4ºC gehaltenen Ofens wurde diese Lösung mit einem Phosphatpuffer versetzt, wobei eine Kollagenlösung einer Endkonzentration von 0,1% (g/v) Aterokollagen, 30 mM Dinatriumphosphat und 100 mM NaCl erhalten wurde. Die Kollagenlösung wurde 1 Tag lang in ein mittels eines Thermostaten auf 37ºC gehaltenes Bad getaucht, wobei eine Lösung von faserförmigem Kollagen (FC) erhalten wurde. Diese Lösung wurde zentrifugiert (5000 U/min, 10 min) und eingeengt, wobei eine 0,3%ige (g/v) Lösung von faserförmigem Aterokollagen (FC) erhalten wurde. Diese Lösung wurde rasch bei -30ºC gefroren und dann zur Herstellung eines Schwamms gefriergetrocknet. Dieser Schwamm wurde 2 h lang in einem Vakuum auf 110ºC erwärmt, um dehydratisiert und vernetzt zu werden.

Beispiel 2: Herstellung einer faseriges Aterokollagen/denaturiertes Aterokol lagen-Matrix

Eine 0,3%ige (g/v) FC-Lösung und die 1%ige (g/v) HAC-Lösung gemäß Beispiel 1 wurden bei 37ºC miteinander gemischt, worauf das Gemisch 1 h lang verrührt wurde. Die erhaltene Lösung wurde rasch bei -30ºC eingefroren und zur Herstellung eines Schwamms gefriergetrocknet. Danach wurde der Schwamm 2 10 h lang zum Erwärmen, Dehydratisieren und Vernetzen in einem Vakuum bei 110ºC behandelt.

Test 2: In vitro-Test, betreffend das Eindringen von Zellen in die faserförmiges Aterokollagen/denaturiertes Aterokollagen-Matrix

Durch in vitro-Kulturversuche unter Verwendung von Rattenfibroblasten entsprechend Test 1 wurde das Eindringen von Zellen in die Matrizes gemäß Beispiel 2 und Referenz 2 bewertet. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt: TABELLE 2 In vitro-Test bezüglich eines Eindringens von Zellen in eine Kollagenmatrix Probe Eindringen von Zellen Fähigkeit zum Erhalt der Schwammform
Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Matrizes mit FC sämtliche hervorragend ihre Schwammform behielten und eine ausgezeichnete Stabilität zeigten. Obwohl bei FC alleine ein schwach abweichendes Eindringen von Zellen zu beobachten war, kam es bei der Reihe mit zugesetztem HAC zu einem gleichförmigen Eindringen und einer Verteilung zahlreicher Zellen. Weiterhin lag die Schwammform der Reihe mit zugesetztem HAC trotz des in vitro-Kulturversuchsystems nahe an derjenigen von in vivo-Geweben.

Test 3: In vivo-Test einer subkutanen Einbettung einer faserförmiges Aterokollagen/denaturiertes Aterokollagen-Matrix

Die gemäß Beispiel 2 und Referenz 2 hergestellten Matrizes wurden in Rattenhaut eingebettet. Die Gewebebilder wurden pathologisch untersucht.
Zur subkutanen Transplantation (Einbettung) wurden weibliche Wistar KY-Ratten eines Gewichts von etwa 200 g verwendet. Vor der Einbettung wurden die Ratten mit 5fach verdünntem Nembutal betäubt. Das mit chirurgischem Isodine (Maiji Saika) angefeuchte Rückenhaar wurde sorgfältig und vollständig mit einem Rasierapparat geschoren. Die geschorene Rückenfläche wurde mit Isodine und Ethanol desinfiziert. Bei jedem Schnitt wurde der Einschnitt derart aufgeweitet, daß ein freier Spalt in den Areolageweben unter dem Hautmuskel der Ratten (benachbarte Schnitte sollten miteinander nicht in Verbindung stehen) gebildet wurde. Der Prüfling wurde in den Spalt eingefügt und nach unten flach umgelegt. Die Wunde wurde mit Hilfe einer Winkelnadel mittels Nylonzwirn genäht. Die Wunde wurde mit drei Nähten befestigt. Derselbe Prüfling wurde in ähnlicher Weise in eine weitere Ratte eingebettet.
Am 3. Tag bzw. 28. Tag nach der Einbettung wurden die Versuchstiere mit Hilfe von Ether oder zweifach bzw. doppelt verdünntem Nembutai getötet. Hautgewebe auf dem Rückenmuskel der Ratte wurden in einer Größe von 8 cm x 12 cm oder größer ausgeschnitten, wobei der eingebettete Prüfling in den Geweben gehalten wurde. Das Gewebe wurde in eine 10% Neutralpuffer-Formalinlösung gelegt und zur Fixierung über Nacht stehengelassen. Danach wurde es zur histopathologischen Untersuchung geschickt.
Die histopathologische Untersuchung begann mit einem Ausschneiden des Prüflings aus dem Gewebe. Um sicherzustellen, daß der Prüfling auch "getroffen" ist, wurde das Gewebe in einen Streifen von etwa 0,5 cm x 2,5 cm zurechtgeschnitten. Er wurde von Ethanol und danach Xylol durchdrungen. Zuletzt erfolgte ein Austausch durch Paraffin. Nach dem Austausch wurde das den Prüfling enthaltende Gewebe in eine heiße flüssige,Schmelze aus festem Paraffin gelegt und zur Beendigung der Paraffineinbettung rasch abgekühlt. Das in Paraffin eingebettete Gewebe wurde mit Hilfe eines Drehmikrotoms von Yamato in Scheiben geschnitten, wobei 4 µm dicke Paraffinsegmente erhalten wurden. Nach dem Entfernen des Paraffins wurde der Prüfling zur Vervollständigung des Präparats nach einem beliebigen Anfärbverfahren histopathologisch angefärbt. Zum histopathologischen Anfärben kann man sich einer Hämatoxylineosin (HE)-Anfärbung, Azan-Anfärbung, Resorcin- Fuchsin-Anfärbung und anderer Verfahren bedienen. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 3. TABELLE 3 Histopathologische Änderungen beim subkutanen Einbettungstest Prüfling Gewebeänderungen Tag Neutrophileninfiltration Eindringen von Fibroblasten Granulationsgewebeatrophie
Bei FC alleine waren am 3. Tag die Neutrophileninfiltration intensiv und das Eindringen von Fibroblasten mäßig. Am 28. Tag war das gebildete Granulationsgewebe atrophiert. Im Gegensatz dazu waren bei Anwesenheit von HAC in einer Menge von 10 oder 20 Gew.-% am 3. Tag die Neutrophileninfiltration schwach und das Eindringen von Fibroblasten glatter. Am 28. Tag war die Atrophie des Granulationsgewebes deutlich schwächer.

Beispiel 3: Herstellung von mit denaturiertem Kollagen beschichtetem vernetztem Kollagen

Der gemäß Referenz 2 erhaltene gefriergetrocknete Schwamm vonm faserförmigem Aterokollagen (FC) wurde über Nacht in eine 0,01% und 1% Hexamethylendiisocyanat (HDI)/Ethanol- Lösung getaucht, wobei eine chemische Vernetzung erfolgte. Jeder Schwamm wurde mit der in Beispiel 1 erhaltenen wäßrigen Lösung von denaturiertem Kollagen (HAC) in einer Menge von 30 ml versetzt. Nach ausreichendem Eintrocknen wurde er zur Schwammbildung erneut gefriergetrocknet. Letzterer wurde 2 h lang in einem Vakuum auf 110ºC erwärmt und danach weitere 24 h lang zur Dehydratisierung und Vernetzung weiter erwärmt. Hierbei wurde eine mit denaturiertem Kollagen (HAC) beschichtete Kollagenmatrix erhalten. Die endgültige Zusammensetzung wurde derart eingestellt, daß der HAC-Gehalt 10 Gew.-% betrug.

Referenz 3: Herstellung von vernetztem Kollagen

Der gefriergetrocknete Schwamm aus faserförmigem Aterokollagen (FG) alleine (entsprechend Beispiel 3 vernetzt) wurde entsprechend Beispiel 3, jedoch unter Verzicht auf eine Zugabe einer wäßrigen Lösung von denaturiertem Kollagen (HAC) als Referenz 3 hergestellt.

Test 4: In vivo-Test bezüglich einer subkutanen Einbettung mit denaturiertem Kollagen beschichteten vernetzten Kollagenmatrix

Die gemäß Beispiel 3 und Referenz 3 hergestellten Matrizes wurden entsprechend Test 3 unter die Rattenhaut eingebettet, worauf histopathologische Untersuchungen durchgeführt wurden. Die Prüflinge wurden jedoch am 7. bzw. 14. Tag entnommen. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 4. TABELLE 4 Histopathologische Änderungen beim subkutanen Einbettungstest Vernetzungsbedingungen Gewebeänderungen am 7. Tag bzw. 14 Tag Neutrophileninfiltration Eindringen von Fibroblasten Eingewebebildung Prüfling FC Mit HAC beschichtetes FC 0.01% HDI-Vernetzung 2-stundige Wärmevernetzung
Bei jedem Vergleichsbeispiel von FC war trotz teilweisen Eindringens von Neutrophilen die Infiltration der Zellenkomponenten, einschließlich der entzündlichen und reticuloendothelialen Zellen, sehr schwach. Im Gegensatz dazu verlief bei sämtlichen mit HAC beschichteten FCen die Infiltration der Zellenkomponenten sehr glatt. Es war eine teilweise Eigengewebebildung feststellbar. In einigen Fällen war eine Fremdmaterialreaktion etwas stark. Insbesondere war bei dem Prüfling auch mit HAC beschichtetem FC (0,01% HDI-Vernetzung + 2-stündige Wärmevernetzung) eine der Lederhaut, in der selbst die Neutrophileninfiltration bereits vermindert war, extrem ähnliche Struktur wieder hergestellt. Somit kann er im Hinblick auf die erfindungsgemäß zu lösenden Aufgaben als nahezu ideale Matrix angesehen werden.

Beispiel 4: Herstellung eines Kollagenschwamms mit einem Silikonfilm

Auf eine Teflon-Unterlage wurde mit Hilfe einer Präzisionsauftragvorrichtung eine 50%ige Lösung eines Silastic-Silikonklebstoffs Typ A (Dow Corning) in Hexan zur Bildung eines Films aufgetragen. Unmittelbar nach dem Auftragen wurde der in Beispiel 3 hergestellte Schwamm daraufgelegt und bei Raumtemperatur etwa 10 min lang liegengelassen. Danach erfolgte eine mindestens 1-stündige Härtung in einem Ofen bei 60ºC.

Test 5: Transplantationstest in einer Hautdefektwunde

Der gemäß Beispiel 4 hergestellte Schwamm wurde in eine Hautdefektwunde einer Ratte transplantiert. Genauer gesagt wurde in der Rückenhaut der Ratte eine Gesamthautdefektwunde (einer Größe von 2 cm x 2 cm) mit freiliegender subkutanter Muskelmembran präpariert. Der Prüfling mit einem an der Oberflächenschicht haftenden Silikonfilm wurde abgeklemmt und auf die Wundoberfläche aufgenäht. Vier Wochen nach der Transplantation wurden die Versuchstiere getötet. Das transplantierte Material und das Wundbett wurden ausgeschnitten und zu pathologischen Untersuchungen geschickt. In 4 Wochen konnte eine Kontraktion der Wunde nicht deutlich festgestellt werden. Es hat sich ein gutes Granulationsgewebe gebildet. Eine Regeneration des Oberhäutchens war feststellbar.

[B] Beispiele für eine Hautprothese und Verfahren zu ihrer Herstellung

Beispiel 5:

1) Herstellung einer Wundkontaktschicht Herstellung einer faserförmiges Kollagen/denaturiertes Kollagen-Matrix

1,0 g AG wurde in verdünner Salzsäure eines pH-Werts von 3,0 bis zu einer Konzentration von 0,3 g/v% gelöst. Unter Rühren in einem mittels eines Thermostaten auf 4ºC gehaltenen Ofen wurde diese Lösung mit Phosphatpuffer versetzt, um eine Kollagenlösung mit der Endkonzentration 0,1 g/v% Aterokollagen, 30 mM Natriumhydrogenphosphat und 100 mM NaCl zuzubereiten. Nach dem Einbringen über Nacht in einen mittels eines Thermostaten auf 37ºC gehaltenen Ofen wurde eine Lösung von Faserförmigem Kollagen (FC) erhalten. Diese Lösung wurde zentrifugiert (5 000 U/min, 10 min) und eingeengt, wobei eine 0,3 g/v%ige Lösung von faserförmigem Aterokollagen (FC) erhalten wurde. Andererseits wurde eine 1,0%ige Aterokollagen- Lösung (pH-Wert: 3,0, Salzsäure) 30 min lang in einem mittels eines Thermostaten auf 60ºC gehaltenen Ofen behandelt und dann 2 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Hierbei wurde eine Lösung von denaturiertem Aterokollagen (HAC) erhalten. Die erhaltenen Lösungen wurden bei 37ºC miteinander gemischt und 1 h lang verrührt. Dieses Lösungsgemisch wurde rasch bei -30ºC eingefroren und zur Herstellung eines Schwamms gefriergetrocknet.

2) Herstellung einer Fibroinmatrix

Gereinigte Seide wurde in einer wäßrigen 8M Lithiumbromidlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zur Dialyse in Wasser in einen Cellophanschlauch gefüllt. Nachdem eine vollständige Entfernung von Lithiumbromid bestätigt war, wurde die erhaltene wäßrige Fibroinlösung in einen Polystyrolbehälter gegossen und 24 h lang bei -10ºC eingefroren. Nach dem Auftauen auf Raumtemperatur gab sich der Fließzzustand zu erkennen. Anschließend wurde gefriergetrocknet.

3) Herstellung einer Wundabdeckung

Das Lösungsgemisch mit gemäß i) hergestelltem Kollagen/denaturiertem Kollagen wurde in ein Gefäß aus nichtrostendem Stahl gegossen. Die gemäß 2) hergestellte schwammförmige Fibroinmatrix wurde langsam darauf gelegt. In diesem Zustand wurde das Material bei -30ºC schnellgefroren. Nach ausreichendem Einfrieren wurde es gefriergetrocknet, wobei ein Schwamm zweilagiger Struktur erhalten wurde. Danach wurde mit Hilfe einer Präzisionsauftragvorrichtung auf eine Teflonunterlage eine 50%ige Lösung von Silastic-Silikonklebstoff Typ A (Dow Corning) in Hexan zur Bildung eines Films aufgetragen. Unmittelbar nach dem Auftragen wurde der Schwamm auf den Film gelegt, so daß die Fibroinmatrix die Silikonseite kontaktiert. Nach etwa 10-minütigem Liegenlassen bei Raumtemperatur wurde das Ganze in einem Ofen mindestens 1 h lang bei 60ºC gehärtet. Weiterhin wurde unter 1- stündiger Aufbewahrung in einem Vakuum die Temperatur auf 110ºC erhöht. Das Vakuum wurde 2 weitere h lang aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur gesenkt. Der Prüfling wurde entnommen, wobei die Wundabdeckung erhalten wurde.

Beispiel 6

In Stufe 3) von Beispiel 5 wurden 50 ml des Lösungsgemischs aus Kollagen und denaturiertem Kollagen mit 25 mg Silbersulfadiazin versetzt und in ein Gefäß aus nichtrostendem Stahl gegossen. Nach langsamem Darauflegen einer Fibroinmatrix wurde das Ganze bei -30ºC ausreichend schnellgefroren und gefriergetrocknet, wobei ein zweilagiger Schwamm mit einem antibakteriellen Mittel erhalten wurde. Durch ähnliches Aufkaschieren eines Silikonfilms auf diesen Schwamm wurde eine Wundabdeckung mit einem antibakteriellen Mittel erhalten.

Beispiel 7

1) Herstellung von faserförmigem Aterokollagen

1,0 g Aterokollagen wurde in verdünnter Salzsäure eines pH- Werts von 3,0 bis zu einer Konzentration von 0,3 g/v% gelöst. Die erhaltene Lösung wurde in einen mittels eines Thermostaten auf 4ºC gehaltenen Ofen gestellt und verrührt. Nach Zugabe eines Phosphatpuffers erhielt man eine Kollagenlösung einer Endkonzentration von 0,1 g/v% Aterokollagen, 30 mM Natriumhydrogenphosphat und 100 mM Natriumchlorid. Nach 1-tägigem Eintauchen in ein mittels eines Thermosaten auf 37ºC gehaltenes Bad wurde eine Lösung von faserförmigem Aterokollagen (FC) erhalten. Diese Lösung wurde bei -30ºC schnellgefroren und gefriergetrocknet, wobei ein Schwamm erhalten wurde.

2) Herstellung einer Lösung von denaturiertem Aterokollagen

1,0 g Aterokollagen wurde in verdünnter Salzsäure eines pH- Werts von 3,0 gelöst. Diese Lösung wurde 30 min lang in einem mittels eines Thermostaten auf 60 G gehaltenen Ofen behandelt und 2 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei denaturiertes Aterokollagen (HAC) erhalten wurde. Der Helixanteil des hierbei erhaltenen denaturierten Aterokollagens betrug etwa 40%.

3) Herstellung einer faserförmiges Aterokollagen/denaturiertes Aterokollagen-Matrix

Die erhaltene 0,3 g/v%ige Lösung von faserförmigem Aterokollagen (FC) und eine 1 g/v%ige Lösung von denaturiertem Aterokollagen (HAC) wurden bei 37ºC miteiner gemischt und 1 h lang verrührt. Die erhaltene Lösung wurde bei -30ºC schnellgefroren und gefriergetrocknet, wobei ein Schwamm erhalten wurde.

4) Vernetzung von faserförmigem Aterokollagen durch thermische Dehydratisierung

Das Produkt von 1) wurde 1 h lang in einem Vakuum von unter 0,05 Torr evakuiert. Nach dem Senken der Temperatur auf 110ºC wurde das Vakuum 2 h lang aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur gesenkt und der Prüfling entnommen.

5) Isocyanatvernetzung einer faserüörmigen Aterokollagen-Matrix

Das Produkt von 1) wurde durch 24-stündiges Eintauchen in eine 0,01%ige Lösung von Hexamethylendiisocyanat (HDI) in Ethanol bei Raumtemperatur vernetzt. Danach wurde es mehr-mals mit Wasser gewaschen, um das unvernetzte Isocyanat loszuwerden und schließlich gefriergetrocknet.

6) Vernetzung einer faserförmigen Aterokollagen/denaturierten Aterokollagen-Matrix durch thermische Dehydratisierung

Das Produkt von 3) wurde 1 h lang in einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr evakuiert. Nach dem Erniedrigen der Temperatur auf 110ºC wurde das Vakuum 2 h lang bzw. 24 h lang aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur gesenkt und der Prüfling entnommen.

7) In vivo-subkutaner Einbettungstest von Kollagen- Matrizes (Test 6)

Die im vorliegenden Falle erhaltenen Matrizes wurden unter die Rattenhaut eingebettet. Die Gewebebilder wurden pathologisch untersucht. Zur subkutanen Transplantation wurden weibliche Wistar KY-Ratten eines Gewichts von etwa 200 g vewendet. Vor dem Einbetten wurden die Ratten mit 5fach verdünntem Nembutal betäubt. Das mit chirurgischem Isodine (Meiji Seika) angefeuchtete Rückenhaar wurde sorgfältig vollständig mittels eines Rasierapparats geschoren. Die geschorene Rückenoberfläche wurde mit Isodine und Ethanol desinfiziert. Bei jedem Schnitt wurde der Einschnitt so weit aufgeweitet, daß im Areolagewebe unterhalb des Hautmuskels der Ratte ein freier Spalt gebildet wurde. Der Prüfling wurde in den Spalt eingefügt und nach unten flachgelegt. Die Wunde wurde mittels einer Winkelnadel mit einem Nylonzwirn genäht. Die Wunde wurde mit drei Nähten angeheftet. Derselbe Prüfling wurde in ähnlicher Weise in eine andere Ratte eingebettet.
Am 3. bzw. 28. Tag nach der Einbettung wurden die Versuchstiere unter Verwendung von Ether oder doppelt verdünntem Nembutal getötet. Die Hautgewebe am Rückenmuskel der Ratte wurden in einer Größe von 8 cm x 12 cm oder größer ausgeschnitten, um den eingebetteten Prüfling im Gewebe zu halten. Das Gewebe wurde in eine 10%ige Neutralpuffer-Formalinlösung gelegt und zur Fixierung über Nacht darin belassen. Danach wurde es zur histopathologischen Untersuchung geschickt.
Die histopathologische Untersuchung begann mit dem Herausschneiden des Prüflings aus dem Gewebe. Damit der Prüfling sicher "getroffen" wurde, wurde das Gewebe in einem Streifen von etwa 0,5 cm x 2,5 cm zurechtgeschnitten. Es wurde mit Ethanol und dann Xylol penetriert. Schließlich erfolgte ein Ersatz durch Paraffin. Nach dem Ersatz wurde das den Prüfling enthaltende Gewebe in eine heiße flüssige Schmelze von festem Paraffin gelegt und zur Vervollständigung der Paraffineinbettung rasch abgekühlt. Das in Paraffin eingebettete Gewebe wurde mit Hilfe eines Drehmikrotoms von Yamato in Stücke geschnitten, wobei 4 µm dicke Paraffinsegmente erhalten wurden. Nach Entfernung des Paraffins wurde der Prüfling nach einem beliebigen Färbeverfahren zur Vervollständigung des Präparats histopathologisch gefärbt. Als histopathologisches Färbeverfahren eignen sich eine Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung, eine Azan-Färbung, eine Resorcin-Fuchsin-Färbung und andere Verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5 Histopathologische Änderungen beim subkutanen Einbettungstest Vernetzungsverfahren Gewebeänderungen Tag Neutrophileninfiltration Eindringen von Fibroblasten Granulationsgewebeatrophie Prüfling 0.01% HDI (Raumtemperatur, 24 h) Vernetzung durch thermische Dehyratisierung (110ºC, 2h) - : negative + : schwach ++ : mäßig +++ : Massiv 30-minütige HAC-Behandlung bei 60ºC
Mit FD alleine waren am 3. Tag die Neutrophileninfiltration intensiv und das Eindringen von Fibroblasten mäßig. Am 28. Tag war das gebildete Granulationsgewebe atrophiert. Im Gegensatz dazu waren bei Anwesenheit von 10 bzw. 20 Gew.-% HAC am 3. Tag die Neutrophileninfiltration schwach und das Eindringen der Fibroblasten glatter. Am 28. Tag war die Atrophie des Granulationsgewebes merklich geringer geworden.

8) Herstellung von künstlicher Haut

In 3) wurde die Konzentration an faserförmigem Aterokollagen auf 1,0 g/v% eingestellt. Das Lösungsgemisch aus faserförmigem Aterokollagen und denaturiertem Aterokollagen wurde in ein Gefäß aus nichtrostendem Stahl gegossen. Die gemäß 5) hergestellte, mit 0.01% HDI vernetzte schwammartige Matrix aus faserförmigem Aterokollagen wurde langsam (auf die Flüssigkeitsoberfläche) gelegt, so daß der Schwamm in der oberen Schicht der Lösung schwamm. In diesem Zustand wurde die Lösung bei -30ºC schnellgefroren und ausreichend eingefroren und schließlich in einem Vakuum von weniger als -40ºC/0,1 Torr gefriergetrocknet. Hierbei erhielt man einen Schwamm mit zweilagiger Struktur aus einer faserförmigen Aterokollagenmatrix und einer Matrix aus faserförmigem Aterokollagen und denaturiertem Kollagen. Anschließend wurde durch Auftragen einer 50%igen Lösung von Silastic-Silikonklebstoff Typ A (Dow Corning) in Hexan auf eine Teflonunterlage mittels einer Präzisionsauftragvorrichtung ein Film gebildet. Sofort nach dem Auftragen wurde der Schwamm derart aufgebracht, daß das faserförmige Aterokollagen den Silikonfilm kontakiert. Nach etwa 10-minütigem Liegenlassen bei Raumtemperatur wurde das Ganze in einem Ofen mindestens 1 h lang bei 60ºC gehärtet. In einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr wurde das Ganze 1 h lang evakuiert. Nach dem Erhöhen der Temperatur auf 110ºC wurde das Vakuum noch weitere 2 h lang aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur gesenkt. Der Prüfling wurde (aus dem Ofen) entnommen, wobei eine Hautprothese erhalten wurde.

9) Transplantationstest einer künstlichen Haut auf eine Rattenhautdefektwunde (Test 7)

Die erhaltene Matrix wurde auf die Rückenhaut einer Ratte transplantiert. Das Rückenhaar von Wistar KY-Ratten (200 - 400 g) wurde unter Nembutal-Anästhesie geschoren. Nach dem Desinfizieren der Haut mit Isodine wurde durch Freilegen des Hautmuskels am Rattenrücken eine Gesamthautdefektwunde von 20 x 20 mm präpariert. Nach Durchführung blutstillender Maβnahmen und Trocknen wurde der physiologische Kochsalzlösung enthaltende Prüfling befestigt. Der Rand des Silikonfilms wurde abgeklemmt und an 16 Stellen durch eine Naht fixiert. Vier Stücke Solfren (Termo) wurden darübergelegt. Zur Druckfixierung wurde eine elastische Binde, z.B. Elasticon, herumgewickelt. Die Wundstelle wurde 1, 2, 3 bzw. 4 Wochen später betrachtet. Am Tag 4 Wochen nach der Transplantation wurden die Versuchstiere zur Autopsie getötet. Die Ergebnisse histopathologischer Untersuchungen sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6 Groberkenntnisse und pathologische Erkenntnisse beim Transplantationstest Prüfling Wundkontraktion Gewebeänderungen 4 Wochen später Obere Schicht der Matrix Untere Schicht der Matrix HAC-Degenerierungsbedingungen Granulationsgewebe Kutikulabildung FC (Vernetzung mit 0,01% HDI) FC - 10 Gew.-% HDI (Vernetzung durch thermische Dehydratisierung) Ohne Behandlung FC - 10 Gew.-% HDI (2-stündige Vernetzung durch thermische Dehydratisierung) schwach intensiv sehr intensiv Granulation die eine falsche Lederhaut vortäuscht *1 Entzündliche Granulation *2 Einfache Gr anulation *3 vorhanden keine *1: Bestehend aus einem gekrümmten dicken Kollagenfaserfluß mit darin diffus verstreuten Spalten mit Kapillargefäßen und Fibroblasten. *2: Verbundung aus restlichen Kollagenfasern, Riesenzellen, Histiozyten und Fibroblasten, die sie phagozytieren und durch diese produziertes schwaches Kollagen. *3: Granulationsgewebe, hauptsächlich bestehend aus Fibroblasten und durch diese produzierte spärliche Kollagenfasern einfacher Struktur.

Beispiel 8

1) Herstellung eines Kollagenschwamms mit einem antibakteriellen Mittel

Ein Phosphatpuffer wurde zu einer 0,3%igen Aterokollagen-Lösung eines pH-Werts von 3,0 zugegeben, worauf das Gemisch zur Herstellung von faserförmigem Aterokollagen 4 h lang in einen mittels eines Thermostaten auf 37ºC gehaltenen Ofen gestellt wurde. Unter Rühren wurden 50 ml faserförmiges Aterokollagen mit 25 mg, 50 mg, 250 mg bzw. 500 mg pulverförmigen Silbersulfadiazins versetzt und ausreichend dispergiert. Das Gemisch wurde in ein Styrolgefäß (10 cm x 10 cm) gegossen und gefriergetrocknet. Der erhaltene Schwamm wurde 2 h lang bei 110ºC unter Vakuum vernetzt.

2) Herstellung eines Kollagenschwamms mit einem antibakteriellen Mittel

Ein Phosphatpuffer wurde zu einer 0,3%igen Aterokollagen-Lösung eines pH-Werts von 3,0 zugegeben, worauf das Gemisch zur Herstellung von faserförmigem Aterokollagen 4 h lang in einen mittels eines Thermostaten auf 37ºC gehaltenen Ofen gestellt wurde. Diese Lösung wurde zur Bildung eines Schwamms gefriergetrocknet und letzterer wurde durch 1-tägiges Eintauchen in eine ethanolische Lösung von 0,01 Hexamethylenisocyanat vernetzt. Der vernetzte Kollagenschwamm (10 cm x 10 cm) wurde in 100 ml einer ammoniakalischen Lösung von Silbernitrat (1 x 10&supmin;³ Mol/l) eingetaucht.

3) Herstellung eines Kollagenschwamms mit einem antibakteriellen Mittel

Der gemäß 2) erhaltene, in eine ammoniakalische Silbernitratlösung getauchte Kollagenschwamm wurde noch in 100 ml einer Natriumsulfadiazinlösung (1 x 10&supmin;³ Mol/l) getaucht.

4) Bewertung der antibakteriellen Aktivität (Test 8)

Muller-Hinton-Agar (Difco) wurde in einem Autoklaven behandelt und bei 50ºC gehalten. 20 ml desselben wurden in einer Petrischale verteilt und zur Verfestigung 1 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. In dieser Pufferlösung wurden zur Zubereitung von Bakterienlösungen die verschiedensten auf einer flachen Scheibe kultivierten Bakterien suspendiert. Die Bakterienlösungen wurden mittels eines Tupfers dreimal auf die gesamte Oberfläche eines jeden Kulturmediums appliziert. In den vorhergehenden Stufen hergestellte Prüflinge wurden auf eine Größe von 8 mm Durchmesser zurechtgeschnitten, auf das mit Bakterien bedeckte Kulturmedium gelegt und 18 h lang bei 37ºC kultiviert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengestellt.
Sämtliche Stämme bildeten unabhängig von der Konzentration an dem AgSD bei einer Zugabemenge von 0,25 mg/cm² oder mehr nahezu gleiche Hemmkreise. TABELLE 7 Antibakterielle Aktivität eines ein antibakterielles Mittel enthaltenden Kollagenschwamms Einheit: mm Prüfling Art Ps. aeruginosa St. epidermidis E. coli C. albicans

5) Herstellung einer künstlichen Haut mit einem antibakteriellen Mittel

In Beispiel 1 wurde die Lösung von faserförmigem Aterokollagen auf 1,0 g/v% eingestellt und mit einer Lösung von denaturiertem Aterokollagen versetzt. Unter ausreichendem Rühren werden anschließend 25 mg Silbersulfadiazin zugegeben. Das Gemisch wurde in ein Styrolgefäß gegossen. Das mit 0,01% HDI vernetzte faserförmige Aterokollagen wurde langsam zugegeben, worauf das Ganze gefriergetrocknet wurde. Anschließend wurde auf eine Teflonunterlage zur Bildung eines Films eine 50%ige Lösung von Silastic-Silikonklebstoff Typ A (Dow Corning) in Hexan mittels einer Präzisionsauftragvorrichtung aufgetragen. Sofort nach dem Auftragen wurde der Schwamm daraufgelegt, worauf das Ganze mindestens 1 h lang bei 60ºC in einem Ofen gehärtet wurde. Nach 1-stündigem Evakuieren in einem Vakuum wurde die Temperatur auf 110ºC erhöht und das Vakuum 2 h lang aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur auf Raumtemperatur gesenkt und där Prüfling herausgenommen. Hierbei erhielt man eine künstliche Haut mit einem antibakteriellen Mittel.

Claims

1. Zur Eindringung in Zellen fähiges medizinisches Material, umfassend denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und einer im lebenden Körper absorbierbaren biologischen Trägersubstanz mit im Vergleich zu denaturiertem Kollagen höherer Beständigkeit gegen enzymatischen Abbau, wobei das Verhältnis denaturiertes Kollagen/Trägersubstanz etwa 5 - 80% (g/v) beträgt und die Trägersubstanz aus einer Gruppe, bestehend aus Kollagen, Fibroin, Polymilchsäure, Mucopolysaccharid und Arginsäure ausgewählt ist.

2. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei dem denaturierten Kollagen ein antigener Teil an einem Ende des Kollagenmoleküls fehlt.

3. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz aus nicht-denaturiertem Kollagen besteht.

4. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz aus einem Kollagen ohne einen antigenen Teil an einem Ende des Moleküls besteht.

5. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz aus einem Kollagen mit Vernetzungsstruktur besteht.

6. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz aus faserförmigem Kollagen besteht.

7. Medizinisches Material nach Anspruch 6, wobei das faserförmige Kollagen eine Vernetzungsstruktur aufweist.

8. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei seine Form die Form eines Films ist.

9. Medizinisches Material nach Anspruch 8, wobei die Trägersubstanz in dem denaturierten Kollagen dispergiert ist.

10. Medizinisches Material nach Anspruch 1, wobei seine Form die Form eines Schwamms ist.

11. Medizinisches Material nach Anspruch 10, wobei die Trägersubstanz als schwammartige Matrix ausgebildet ist und sich das denaturierte Kollagen in der schwammartigen Matrix befindet.

12. Künstliche Haut, umfassend eine Trägerschicht aus Fibroin, eine auf eine Seite der Trägerschicht auflaminierte Wundkontaktschicht und eine auf die andere Seite der Trägerschicht zur Steuerung des Feuchtigkeitsdurchtritts auflaminierte, den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht, wobei die Wundkontaktschicht denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmiges Kollagen umfaßt.

13. Künstliche Haut, umfassend eine Trägerschicht aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur, eine auf eine Seite der Trägerschicht auflaminierte Wundkontaktschicht und eine auf die andere Seite der Trägerschicht zur Steuerung des Feuchtigkeitsdurchtritts auflaminierte, den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht, wobei die Wundkontaktschicht denaturiertes Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmiges Kollagen umfaßt.

14. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei dem faserförmigen Kollagen ein antigener Teil an einem Ende des Kollagenmoleküls fehlt.

15. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Wundkontaktschicht schwammförmig ausgebildet ist.

16. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei das faserförmige Kollagen in dem denaturierten Kollagen in der Wundkontaktschicht dispergiert ist.

17. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Trägersubstanz als schwammartige Matrix ausgebildet ist und sich das denaturierte Kollagen in der schwammartigen Matrix in der Wundkontaktschicht befindet.

18. Künstliche Haut nach Anspruch 12, wobei das Fibroin zur Bildung der Trägerschicht aus einem in Wasser unlöslichen vliesartigen porösen Körper besteht.

19. Künstliche Haut nach Anspruch 12, wobei das Fibroin zur Bildung der Trägerschicht aus einem vliesartigen porösen Körper besteht.

20. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei die den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht aus einer nicht-toxischen Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Silikonharz, Polyacrylatester, Polymethacrylatester und Polyurethan, besteht.

21. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei die den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernde Schicht einen Feuchtigkeitsfluß von etwa 0,1 - 1 mg/cm²/h aufweist.

22. Künstliche Haut nach Anspruch 12 oder 13, wobei in mindestens einer Schicht, nämlich der Wundkontaktschicht, der Trägerschicht und der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht, ein antibakterielles Mittel untergebracht ist.

23. Künstliche Haut nach AnsPruch 22, wobei das antibakterielle Mittel aus der Gruppe, bestehend aus Silbersulfadiazin, Centamycin und Silbernitrat, ausgewählt ist.

24. Verfahren zur Herstellung einer künstlichen Haut durch Zubereiten eines Lösungsgemischs aus denaturiertem Kollagen mit einem Helixanteil von 0 - 80% und faserförmigem Kollagen, Aufbringen eines Fibroinfilms oder eines Films aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur auf die Flüssigkeitsoberfläche des Lösungsgemischs und anschließendes Gefriertrocknen zur Ausbildung eines Verbundgebildes aus einer Trägerschicht aus dem Fibroinfilm oder dem Film aus faserförmigem Kollagen und einer Wundkontaktschicht aus einer porösen Substanz, bestehend aus denaturiertem Kollagen und fibrilliertem Kollagen, Ausbilden eines vikosen dünnen Films aus einer Substanz zur Bereitstellung eines feuchtigkeitsdurchlässigen Films auf einer Unterlage mit Abzieheigenschaften aufweisender Oberfläche, Darauflegen des Verbundgebildes, so daß der dünne Film mit dem Fibroinfilm oder Film aus fibrilliertem Kollagen in Berührung gelangen kann, und Trocknen des dünnen Films bis zur Härtung sowie 1- bis 24-stündiges Erwärmen auf 50 - 180ºC in einem Vakuum von weniger als 0,05 Torr.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Fibroinfilm oder der Film aus faserförmigem Kollagen mit Vernetzungsstruktur aus einem porösen schwammartigen Film besteht.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Lösung mit denaturiertem Kollagen und fibrilliertem Kollagen, dem Fibroinfilm, dem faserförmigen Kollagen mit Vernetzungsstruktur und/oder der den Feuchtigkeitsdurchtritt steuernden Schicht des viskosen dünnen Films ein antibakterielles Mittel einverleibt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, Wobei das antibakterielle Mittel aus der Gruppe, bestehend aus Silbersulfadiazin, Gentamycin und Silbernitrat, ausgewählt ist.