DE60226182T2

DE60226182T2 - Agarase und Gen dafür

Info

Publication number: DE60226182T2
Application number: DE60226182T
Authority: DE
Inventors: Jun Tomono; Hiroaki Sagawa; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2022-02-27
Also published as: EP1365025A1; JPWO2002068659A1; EP1365025A4; ATE307889T1; JP4346308B2; KR100601331B1; WO2002068659A1; DE60226182D1; US20040132036A1; DE60206885T2; EP1624065A2; KR100601333B1; KR20030078910A; JP4411351B2; EP1624065B1; ATE392477T1; CN1531595A; CN100549177C; DE60206885D1; US20080096249A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine neue Agarase, die Agarase-Aktivität bei einer hohen Temperatur besitzt, und ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, das Agarase-Aktivität bei einer hohen Temperatur besitzt und ein Gen, das für dieses Polypeptid kodiert. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das Agarase-Aktivität bei einer hohen Temperatur besitzt, durch genetische Manipulation unter Verwendung dieses Gens.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine α-Agarase mit Aktivität bei einer hohen Temperatur, die zur Herstellung von Agarooligosacchariden mit niedrigen Polymerisationsgraden und verschiedenen physiologischen Aktivitäten aus Agarose verwendbar ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben und die Verwendung dieses Enzyms. Die Erfindung beschreibt auch eine β-Agarase mit Aktivität bei einer hohen Temperatur, die zur Extraktion von einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem Agarosegel nach einer Agarosegel-Elektrophorese verwendbar ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben, die Verwendung dieses Enzyms und ein Verfahren zum Extrahieren einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem Agarosegel unter Verwendung dieses Enzyms.
Hintergrund
Agarose ist der Grundbestandteil von Agar. Agarose ist ein Polysaccharid, das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose alternativ miteinander über α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen verbunden sind. Man muss Agarose in kleinere Moleküle abbauen, um Oligosaccharide aus Agar zu isolieren. Zu diesem Zweck sind Verfahren, bei denen Agarose chemisch abgebaut wird, und Verfahren, bei denen Agarose enzymatisch verdaut wird, üblicherweise bekannt. In einem chemischen Abbauverfahren kann Agarose unter Verwendung einer Säure hydrolysiert werden. In diesem Fall werden hauptsächlich α-1,3-Bindungen gespalten. Zwei Arten von Enzymen, β-Agarasen, welche β-1,4-Bindungen in Agarose spalten, und α-Agarasen, welche α-1,3-Bindungen in Agarose spalten, sind dafür bekannt, dass sie Agarose spalten.
Oligosaccharide, die durch Spaltung von Agarose bei β-1,4-Bindungen erhalten werden, werden als Neoagarooligosaccharide bezeichnet. Neoagarooligosaccharide besitzen D-Galaktose an ihren reduzierenden Enden und ihre Polymerisationsgrade werden durch ganze Zahlen angegeben. Andererseits werden Oligosaccharide, die durch Spaltung von Agarose an den α-1,3-Bindungen erhalten werden, als Agarooligosaccharide bezeichnet. Agarooligosaccharide besitzen eine 3,6-Anhydro-L-Galaktose an ihren reduzierenden Enden und ihre Polymerisationsgrade werden durch ganze Zahlen angegeben. Kürzlich wurde gezeigt, dass Agarooligosaccharide, die 3,6-Anhydro-L-Galaktose an ihren reduzierenden Enden besitzen, physiologische Aktivitäten aufweisen, wie Apoptose-induzierende Aktivität, karzinostatische Aktivität, verschiedene Antioxidanzien-Aktivitäten, immunregulatorische Aktivität, antiallergene Aktivität, antiinflammatorische Aktivität und Aktivität zur Inhibierung von α-Glycosidase ( WO 99/24447 , japanische Patentanmeldung Nr. 11-11646 ). Basierend auf den physiologischen Aktivitäten können pharmazeutische Zusammensetzungen und funktionelle Nahrungsmittel oder Getränke, welche die Agarooligosaccharide als ihre Wirkstoffe enthalten, bereitgestellt werden.
Es ist schwierig, die Größen von produzierten Oligosacchariden in einem Verfahren zu kontrollieren, bei dem Agarose chemisch abgebaut wird. Insbesondere ist es ziemlich schwierig, kleinere Oligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden selektiv herzustellen (z. B. T. Tokunaga et al., Bioscience & Industry, 49: 734 (1991)). Wenn eine β-Agarase verwendet wird, können nur Neoagarooligosaccharide, die nicht die oben genannten physiologischen Aktivitäten besitzen, erhalten werden, da dieses Enzym lediglich β-1,4-Bindungen spaltet.
Es wird erwartet, dass Agarooligosaccharide mit physiologischen Aktivitäten unter Verwendung einer α-Agarase hergestellt werden, welche eine Aktivität zur Spaltung von α-1,3-Bindungen besitzt. Bekannte α-Agarasen umfassen Enzyme, die durch einen marinen Gram-negativen Bakterienstamm GJ1B (Carbohydrate Research, 66: 207–212 (1978); dieser Stamm wird im European Journal of Biochemistry, 214: 599–607 (1993) als Alteromonas agarlyticus GJ1B bezeichnet), und ein Bakterium der Gattung Vibrio ( JP-A 7-322878 ; Stamm JT0107-L4) hergestellt werden. Jedoch ist es nicht möglich, Agarobiose herzustellen, die nennenswerte physiologische Aktivitäten besitzt, indem die α-Agarase, die von Alteromonas agarlyticus GJ1B abstammt, verwendet wird, da das Enzym keine Hexasaccharide oder kürzere Oligosaccharide verdauen kann. Auch kann die α-Agarase, die von dem Bakterium der Gattung Vibrio abstammt, nicht zur Herstellung von Agarooligosacchariden verwendet werden, wenn Agarose als Ausgangsmaterial verwendet wird, da dieses Enzym seine Aktivität nur auf Hexasacchariden und kürzere Oligosacchariden ausübt und auf Agarose überhaupt nicht wirkt.
Die Erfinder haben intensiv geforscht, um ein Enzym zu erhalten, das α-1,3-Bindungen in Agarose spaltet und Agarooligosaccharide mit bemerkenswerten physiologischen Aktivitäten erzeugt, und fanden zwei Mikroorganismen, die Enzyme mit Eigenschaften produzieren, die für diesen Zweck geeignet sind. Die durch diese Mikroorganismen hergestellten Enzyme wurden isoliert und es wurden deren physikalische und chemische sowie enzymatische Eigenschaften gezeigt. Weiter isolierten die Erfinder Gene für die beiden Enzyme und fanden ein Verfahren zur einfachen Herstellung von Polypeptiden mit α-Agarase-Aktivitäten mittels einer genetischen Manipulation unter Verwendung der Gene ( WO 00/50578 ). Wenn man beabsichtigt, Agarooligosaccharide zu erhalten, indem gelöste Agarose mit einer der beiden α-Agarasen behandelt wird, muss die Reaktionstemperatur auf ungefähr 40°C erniedrigt werden, da die optimalen Reaktionstemperaturen der Enzyme ungefähr 40°C betragen. In einem solchen Fall kann, wenn die Agarose-Konzentration hoch ist, Agarose erstarren und die enzymatische Reaktion kann verhindert werden. Wenn ein solches Enzym verwendet werden soll, muss daher die Behandlung unter Verwendung einer niedrigen Agarose-Konzentration durchgeführt werden. Demgemäß kann Agarose bei einer hohen Konzentration nicht behandelt werden und die Produktivitäten von Agarooligosacchariden sind niedrig. Daher ist eine thermostabile α-Agarase wünschenswert, die eine Aktivität bei einer hohen Temperatur besitzt, bei der Agarose nicht erstarrt ist, selbst wenn Agarose bei einer hohen Konzentration gelöst ist.
Andererseits ist die Extraktion einer Nukleinsäure oder dergleichen, die einer Behandlung mit einem Restriktionsenzym oder einer Amplifikationsreaktion ausgesetzt war, aus einem Agarosegel nach einer Agarosegel-Elektrophorese auf dem Gebiet der Genmanipulation weit verbreitet. Eine β-Agarase mit einer optimalen Tem peratur von ungefähr 37°C wird für dieses Verfahren konventionellerweise verwendet. Auch muss in diesem Fall die Reaktionstemperatur erniedrigt werden, was von der optimalen Temperatur des Enzyms abhängt, und die Agarose-Konzentration muss erniedrigt werden, indem ein zu behandelndes Agarosegel, das eine Nukleinsäure oder dergleichen enthält, in einem großen Volumen Wasser gelöst wird, um zu verhindern, dass Agarose erstarrt. In diesem Fall wird die Konzentration der Nukleinsäure oder dergleichen, die gewonnen werden soll, unweigerlich auch vermindert. Die verminderte Konzentration verursacht Probleme, da sie zu einer geringeren Ausbeute und geringeren Wirksamkeit des Agarose-Verdaus sowie einem längeren Verfahren führt. Eine Agarase, die für eine Reaktion bei einer Temperatur verwendet werden kann, die höher ist als die konventionelle Temperatur, ist notwendig, um die Probleme zu lösen. Eine β-Agarase, die von dem Flavobakterium sp. Stamm NR19 stammt, der in dem US-Patent Nr. 5,869,310 beschrieben wurde, kann als eine solche Agarase angesehen werden, obwohl deren optimale Temperatur nicht so hoch ist und die Thermostabilität nicht ausreichend ist. Daher ist eine thermostabile β-Agarase mit einer Aktivität bei einer hohen Temperatur, bei der Agarose bei einer hohen Konzentration nicht erstarrt, wünschenswert. Die FR 2 786 500 beschreibt das Gen agaA aus Alteromonas agarilytica und die α-Agarase AgaA, die durch das Gen kodiert wird. Der EMBL-Datenbankeintrag mit der Zugangsnummer AF121273 beschreibt die Nukleotidsequenz des Alteromonas agarilytica-α-Agarase-Vorläufergens.
Wie oben beschrieben, bestehen im Stand der Technik Probleme hinsichtlich der Herstellung von Agarooligosacchariden und der Extraktion eines Stoffes wie einer Nukleinsäure aus einem Agarosegel.
Aufgaben der Erfindung
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität, das zur effizienten Herstellung von Agarooligosacchariden verwendet werden kann, eine Aminosäuresequenz dieses Polypeptids, ein Gen, das für dieses Polypeptid kodiert, ein Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids und ein Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgrund der oben beschriebenen Probleme haben die Erfinder intensiv geforscht und Recherchen durchgeführt, um ein Enzym, das α-1,3-Bindungen in Agarose bei einer hohen Temperatur spaltet und zur Herstellung von Agarooligosacchariden mit nennenswerten physiologischen Aktivitäten verwendbar ist, und ein Enzym, das β-1,4-Bindungen in Agarose bei einer hohen Temperatur spaltet und für eine effiziente Extraktion von einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem Agarosegel verwendbar ist, zu erhalten. Als Ergebnis haben die Erfinder erfolgreich einen Mikroorganismus entdeckt, der zwei Enzyme produziert, welche die Eigenschaften aufweisen, die für die erwähnten Zwecke geeignet sind. Die Enzyme wurden aus dem Mikroorganismus isoliert und deren physikalische und chemische sowie enzymatische Eigenschaften wurden bestimmt.
Die Erfinder haben weiter erfolgreich Gene isoliert, die für diese Enzyme kodieren, und fanden Verfahren zur einfachen Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer α-Agarase-Aktivität und des Polypeptids mit β-Agarase-Aktivität mittels genetischer Manipulation unter Verwendung der Gene. Auf diese Weise wurde die Erfindung vervollständigt.
Die Erfindung wird wie folgt beschrieben. Der erste Aspekt der Erfindung betrifft eine neue Agarase, die eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(i) einer Aminosäuresequenz, die aus 772 Resten von der Aminosäurezahl 318 bis zu der Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht,
(ii) einer Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 und
(iii) einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 hybridisierbar ist, wobei die Agarase eine Aktivität zur Hydrolyse einer α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose aufweist.

Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das für ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität kodiert. Das Gen kodiert die Agarase des ersten Aspekts. Beispiele für das Gen sind ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die aus 2316 Nukleo tiden von der Nukleotidzahl 952 bis zu der Nukleotidzahl 3267 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 besteht.
Der dritte Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das unter stringenten Bedingungen mit einem Gen hybridisierbar ist, das eine Nukleotidsequenz enthält, die aus 2316 Nukleotiden von der Nukleotidzahl 952 bis zu der Nukleotidzahl 3267 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 besteht, und für eine Agarase mit einer Aktivität zur Hydrolyse einer α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose kodiert.
Der vierte Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Gen, das für eine Agarase kodiert, die eine Aminosäuresequenz enthält, die aus 772 Resten von der Aminosäurezahl 318 bis zu der Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht, (b) dem Gen des dritten Aspekts, und (c) einem Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens 70% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 aufweist, und für eine Agarase mit einer Aktivität zur Hydrolyse einer alpha-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anydro-L-Galaktose und D-Galaktose kodiert.
Der fünfte Aspekt der Erfindung betrifft eine transformierte Zelle, die das rekombinante DNA-Molekül des vierten Aspekts trägt.
Der sechste Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Agarase des ersten Aspekts, wobei das Verfahren ein Kultivieren des Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) und ein Gewinnen der Agarase des ersten Aspekts aus der Kultur umfasst.
Der siebte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Agarase, wobei das Verfahren ein Kultivieren der transformierten Zelle des fünften Aspekts und ein Gewinnen der Agarase aus der Kultur umfasst.
Der achte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids, wobei das Verfahren ein Spalten von Agarose mit der Agarase des ersten Aspekts und ein Gewinnen eines Agarooligosaccharids aus dem Spaltprodukt umfasst.
Der neunte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbessern der Thermostabilität der Agarase des ersten Aspekts, wobei das Verfahren ein Deletieren eines Polypeptids, das bis zu 30% der Agarase ausgehend von dem N-Terminus ausmacht, umfasst.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hier verwendet bezeichnet ein Oligosaccharid ein Saccharid, das aus zwei oder mehreren und 10 oder weniger Monosacchariden aufgebaut ist. Ein Agarooligosaccharid bezeichnet ein Oligosaccharid, das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose abwechselnd miteinander über α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen verbunden sind und 3,6-Anhydro-L-Galaktose an seinem reduzierendem Ende besitzt. Ein Neoagarooligosaccharid bezeichnet ein Oligosaccharid, das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose abwechselnd miteinander über α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen miteinander verbunden sind und 3,6-Anhydro-L-Galaktose an seinem nicht-reduzierenden Ende besitzt.
Ein Polysaccharid bezeichnet ein Saccharid, das ein anderes ist als Monosaccharide und Oligosaccharide.
Die Agarase der Erfindung ist eine, die eine Aminosäuresequenz enthält, die aus 772 Resten von der Aminosäurezahl 318 bis zu der Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht. In einer Ausführungsform ist sie ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, in der in der oben genannten Aminosäuresequenz ein oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder eingeführt wurden und die mindestens 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr oder mehr bevorzugt 90% oder mehr Homologie zu der vorstehend genannten Aminosäuresequenz aufweist. Die Homologie kann gemäß einem bekannten Verfahren unter Verwendung eines jeglichen Computerprogramms für eine solche Berechnung wie DNASIS (Takara Shuzo) berechnet werden.
Die erfindungsgemäße Agarase kann sowohl auf Polysaccharide (z. B. Agarose) als auch auf Oligosaccharide (z. B. Agarooligosaccharide und Neoagarooligosaccharide) wirken. Zum Beispiel beträgt die optimale Reaktionstemperatur 45°C oder höher.
Die erfindungsgemäße Agarase ist eine α-Agarase, die eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose hydrolysiert. Beispiele hierzu umfassen Agarase II, die eine α-Agarase ist, die von einem marinen Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) produziert wird.
Agarase II, die durch den Mikroorganismus NAB2-1-1 produziert wird, ist ein Enzym, das eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose in einem Polysaccharid oder einem Oligosaccharid hydrolysiert. Das Enzym wirkt auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger sind als Agarohexaose (z. B. Agarooctaose), sowie auf Neoagarohexaose und Neoagarooligosaccharide, die länger sind als Neoagarohexaose.
β-Agarase ist ein Enzym, das eine β-1,4-Bindung zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose hydrolysiert und sowohl auf Polysaccharide (z. B. Agarose) als auch Oligosaccharide (z. B. Agarohexaose) wirken kann. Beispiele hierzu umfassen Agarase I, die eine β-Agarase ist, die durch einen marinen Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) produziert wird.
Agarase I, die durch den Mikroorganismus NAB2-1-1 produziert wird, ist ein Enzym, das eine β-1,4-Bindung zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose in einem Polysaccharid oder einem Oligosaccharid hydrolysiert. Das Enzym wirkt auf Agarose, Neoagarohexaose und Neoagarooligosaccharide, die länger sind als Neoagarohexaose (z. B. Neoagarooctaose) sowie Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger sind als Agarohexaose.
Ein Verfahren zur Messung der Aktivitäten der oben genannten Enzyme und die physikalischen und chemischen sowie enzymatischen Eigenschaften der Enzyme sind unten beschrieben.
(1) Enzymologisches Messverfahren
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Agarase und der weiteren, hier beschriebenen Agarase wird durch Durchführung einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung von Agarose L03 (Takara Shuzo) als Substrat gemessen und die entstehende Agarotetraose oder Neoagarotetraose wird dann unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie quantifiziert. Genauer gesagt besteht das hier verwen dete Verfahren zur Messung einer enzymatischen Aktivität, das hier zur Messung einer Aktivität von einer gereinigten Enzympräparation oder einem Enzym im Verlauf der Aufreinigung verwendet wird, aus folgenden Schritten:
Eine Lösung, die eine Agarase bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) oder 0,5% (w/v) enthält, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I) enthält, oder 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthält, wird hergestellt. 180 μl dieser Lösung wird als Substrat mit 20 μl einer Enzymlösung vermischt. Das Gemisch wird bei 50°C für 5 bis 30 Minuten reagieren gelassen, vorzugsweise für 10 Minuten, und dann in kochendem Wasser erhitzt oder bei 75°C für 1 Minute zum Abstoppen der Reaktion erhitzt. 30 μl des Reaktionsgemisches werden auf eine TSKgel-α-2500-Säule (innerer Durchmesser: 7,8 mm; Länge: 300 mm; Tosoh) aufgetragen. Agarotetraose, die bei einer Verzögerungszeit von ungefähr 25 Minuten eluiert wird, oder Neoagarotetraose, die bei einer Verzögerungszeit von ungefähr 24 Minuten eluiert wird, wird unter Verwendung von 70% Acetonitril-Lösung als ein Eluent bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/Minute quantifiziert. Eine Einheit (1 U) wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 μmol Agarotetraose in 10 Minuten produziert.
(2) Optimaler pH
Einem Enzym wurde es ermöglicht, auf Agarose als Substrat in einem Reaktionsgemisch zu wirken, das unter Verwendung von Acetatpuffer (pH 4,5), Malatpuffer (pH 5,5), Acetatpuffer (pH 6,0, 6,5) oder Tris-HCl-Puffer (pH 7,0, 7,5, 8,8) präpariert wurde. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass sowohl Agarase I als auch Agarase II ihre Aktivitäten zum Verdau von Agarose unter schwach sauren bis schwach basischen Bedingungen ausüben.
(3) Optimale Temperatur
Erfindungsgemäße Agarase II besitzt eine hohe enzymatische Aktivität bei Temperaturen im Bereich von 45 bis 55°C und weist eine maximale Aktivität bei ungefähr 50°C auf. Agarase I weist eine hohe enzymatische Aktivität bei Temperaturen im Bereich von 45 bis 70°C auf und weist eine maximale Aktivität bei ungefähr 55 bis 65°C auf.
(4) Thermostabilität
Es wurden die verbleibenden Aktivitäten der Enzympräparationen nach einer Behandlung bei 48°C, 50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für einen gegebenen Zeitraum gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass Agarase II 40% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 55°C für 10 Minuten aufwies. Agarase I wies 100% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 60°C für 10 Minuten; 100% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 60°C für 20 Minuten; 98% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 60°C für 30 Minuten; 100% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 65°C für 10 Minuten; 95% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 65°C für 20 Minuten; 90% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 65°C für 30 Minuten; und 90% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 65°C für 60 Minuten auf.
(5) Ca-Ionen-Erfordernis
Bekannte Agarasen benötigen Calcium zur Ausübung ihrer Aktivitäten. Die Calcium-Ionen-Erfordernisse der jeweiligen Agarasen wurden untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass in der Abwesenheit von Calcium-Ionen Agarase II 60% der Aktivität aufwies, die in der Gegenwart von Calcium-Ionen ausgeübt wurde. In der Abwesenheit von Calcium-Ionen besaß Agarase I 100% der Aktivität, die in der Gegenwart von Calcium-Ionen ausgeübt wurde. Daher übten sowohl Agarase II als auch Agarase I ihre Aktivitäten ohne den Zusatz von Calcium-Ionen aus.
Erfindungsgemäße Agarase II wird in der Gegenwart von CaCl₂ stabilisiert, während sie nicht durch Mangan-Ionen oder Magnesium-Ionen beeinflusst wird.
(6) Molekulargewicht
Die Molekulargewichte von Agarase II und Agarase I wurden auf ungefähr 117 000 bzw. auf ungefähr 48 000 anhand von SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bei Verwendung eines 10–20% Polyacrylamid-Gradientengels geschätzt.
(7) Aminosäuresequenzierung gemäß dem Edman-Abbauverfahren
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen von Agarase II und Agarase I, die gemäß dem Edman-Abbauverfahren bestimmt wurden, waren Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe bzw. Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly. Die N-ter minalen Aminosäuresequenzen von Agarase II und Agarase I sind in SEQ ID NO: 2 bzw. 1 gezeigt.
Wie unten beschrieben, wurden sowohl ein Gen, das für Agarase II kodiert, als auch ein Gen, das für Agarase I kodiert, isoliert. Es wurden auch die Aminosäuresequenzen, die durch diese Gene kodiert werden, bestimmt. Aminosäuresequenzen, die durch das Agarase II-Gen und das Agarase I-Gen kodiert werden, sind in der SEQ ID NO: 23 bzw. 22 gezeigt. Ein Polypeptid, das aus 772 Aminosäuren von der Aminosäurezahl 318 bis zur Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht, weist die Aktivität der erfindungsgemäßen α-Agarase auf und ein Polypeptid, das aus 417 Aminosäuren von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl 437 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 besteht, weist die Aktivität der β-Agarase auf.
Die erfindungsgemäße Agarase kann von einer Kultur aufgereinigt werden, die durch Kultivierung des Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) erhalten wurde. NAB2-1-1 wurde von Meereswasser als Bakterium isoliert, das Agar assimiliert. Es hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
[Mikrobiologische Eigenschaften]
(1) Morphologie
Künstliches Meereswasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde präpariert. Pepton (Difco) wurde bei einer Konzentration von 0,3% (w/v) und Hefeextrakt (Difco) bei einer Konzentration von 0,02% (w/v) dazu gegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 mit 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Agarose L03 (Takara Shuzo) wurde bei einer Konzentration von 0,1% (w/v) dazu gegeben. Nach der Sterilisation in einem Autoklav wurde der oben genannte Mikroorganismus in das Gemisch angeimpft und bei 37°C über Nacht bei 120 UpM kultiviert. Der in der Kultur gewachsene Mikroorganismus war ein Gram-negatives Bazillus, das beweglich war, ein polares Flagellum aufwies, aerob war und Salz benötigte.
(2) Wachstum
Künstliches Meereswasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde präpariert. Pepton (Difco) wurde bei einer Konzentration von 0,3% (w/v) und Hefe extrakt (Difco) bei einer Konzentration von 0,02% (w/v) dazu gegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 mit 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Agar (Nacalai Tesque) wurde bei einer Konzentration von 1,5% (w/v) dazu gegeben. Das Gemisch wurde autoklaviert, um Platten herzustellen. Wenn der oben genannte Mikroorganismus auf die Platten angeimpft wurde, wurde gezeigt, dass

(i) er bei 30 bis 40°C gut wuchs;
(ii) das Agar-Gel flüssig wurde, als die Zellen wuchsen; und
(iii) er bei einem pH von 6,0 bis 8,0 gut wuchs.

NAB2-1-1 wurde am 10. Januar 2001 (das Datum der ursprünglichen Hinterlegung) bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-7855 hinterlegt.
Informationen bezüglich der taxonomischen Einordnung des oben genannten Mikroorganismus kann erhalten werden, indem die Nukleotidsequenz des Gens, das für die ribosomale 16S-RNA (16S rRNA) kodiert, analysiert wird. Es ist bekannt, dass die Nukleotidsequenz des Gens für die 16S rRNA spezifisch für jeden mikrobiellen Stamm ist. Insbesondere wird chromosomale DNA von dem Mikroorganismus NAB2-1-1 extrahiert. Es wird eine PCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die verwendet werden können, um eine Region des Gens oder eines Teils davon zu amplifizieren. Eine Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragments wird bestimmt. Eine Homologie-Recherche, bei der die GeneBank-Datenbank eingesetzt wird, wird gegen die bestimmte Sequenz durchgeführt. Dadurch können Mikroorganismen, die ähnliche Nukleotidsequenzen in der Region aufweisen, d. h. taxonomisch nahe Mikroorganismen, identifiziert werden.
Ein DNA-Fragment, das sich von einem Gen für die ribosomale 16S RNA in dem Mikroorganismus NAB2-1-1 ableitet, wurde gemäß dem Verfahren, das in dem Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology, 10: 31–42 (1995) beschrieben wurde, amplifiziert. Die in der Literatur beschriebenen Primer 27f und 1492r wurden für die PCR verwendet (Nukleotidsequenzen der Primer 27f und 1492r sind in den SEQ ID NO: 32 bzw. 33 gezeigt). Die Nukleotidsequenz des entstehenden amplifizierten DNA-Fragments wurde analysiert. Als Ergebnis wurden die folgenden Mikroorganismen gefunden, die jeweils die höchste Homologie von ungefähr 90% der oben ge nannten Region mit dem Mikroorganismus aufweisen, der die erfindungsgemäße Agarase produziert:
Pseudoalteromonas sp. KT0812A
Aeromonas schubertii
Die erfindungsgemäße Agarase kann von NAB2-1-1 erhalten werden sowie von einer spontanen oder künstlichen Mutante von NAB2-1-1 oder einem Mikroorganismus, der zu der Gattung gehört, zu der NAB2-1-1 gehört, und in der Lage ist, die erfindungsgemäße Agarase herzustellen.
Eine künstliche Mutante kann gemäß einem bekannten Verfahren erhalten werden, wie Bestrahlung, ultraviolette Bestrahlung oder Behandlung mit einem mutagenen Agens.
Es ist bekannt, dass die Homologie zwischen den Nukleotidsequenzen von Genen für die 16S rRNA von Mikroorganismen, die zu derselben Gattung gehören, im Allgemeinen ungefähr 99% oder mehr beträgt. Daher kann ein Mikroorganismus, bei dem dessen Nukleotidsequenz des Gens für die 16S rRNA eine Homologie von 99% oder mehr im Vergleich zu dem Mikroorganismus NAB2-1-1 aufweist, wie der erfindungsgemäße Mikroorganismus NAB2-1-1, verwendet werden.
Ein Medium, das eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und dergleichen, die durch den Mikroorganismus genutzt werden kann, ebenso wie Agar, Agarose oder dergleichen als Kohlenstoffquelle enthält, kann als Medium zur Kultivierung des Mikroorganismus verwendet werden. Ein kommerziell erhältliches Agar oder Agarose kann verwendet werden. Beispiele von Stickstoffquellen umfassen Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Trypton und Pepton. Hefeextrakt und Pepton werden bevorzugt verwendet. Eine solche Stickstoffquelle kann auch als Kohlenstoffquelle neben Agar oder Agarose verwendet werden. Weiterhin können Natriumchlorid, Eisencitrat, Magnesiumchlorid, Natriumsulfat, Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbromid, Strontiumchlorid, Natriumborat, Natriumsilicat, Natriumfluorid, Ammoniumnitrat, Dinatriumhydrogenphosphat und dergleichen in Kombination als Salze verwendet werden.
Insbesondere kann ein Medium, das durch Zusatz von Pepton, Hefeextrakt und Agar oder Agarose zu einem Medium, das aus künstlichem Meerwasser Jamarin S besteht, hergestellt wird, vorzugsweise verwendet werden. Es ist bevorzugt, Agar oder Agarose bei einer Konzentration von 0,1 bis 2,0% zuzugeben. Festes oder flüssiges Medium kann hergestellt werden, indem die Konzentration von Agar oder Agarose in geeigneter Weise verändert wird. Eine Flüssigkultur unter Verwendung einer Konzentration von 0,1 bis 0,3% ist für die Zwecke der Herstellung des Enzyms bevorzugt, wohingegen eine Festkultur unter Verwendung einer Konzentration von 1,2 bis 2,0% für die Zwecke der Konservierung von Zellen bevorzugt ist. Wenn Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für eine Flüssigkultur verwendet wird, kann sie bei einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% verwendet werden.
Beispielsweise kann die Kultivierungstemperatur 30 bis 40°C, der pH des Mediums 6,0 bis 8,0 und die Kultivierungszeit 12 bis 48 Stunden betragen, obwohl die Kulturbedingungen mehr oder weniger in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Mediums variieren können.
Die während der Kultivierung hergestellte α-Agarase und/oder die β-Agarase wird, wie oben beschrieben, in das Äußere der Zellen sekretiert. Die Zellen werden dann nach der Kultivierung mittels Zentrifugation, Filtration oder dergleichen entfernt, um einen Kulturüberstand zu erhalten.
Der entstehende Kulturüberstand kann unter Verwendung von Vakuumkonzentration oder Ultrafiltration konzentriert werden, um ein flüssiges Enzym herzustellen. Alternativ kann der Kulturüberstand zu einem pulverigen Enzym mittels Lyophilisierung, Sprühtrocknung oder dergleichen umgewandelt werden, um eine Enzym-Rohpräparation herzustellen. Die α-Agarase und/oder die β-Agarase kann teilweise durch ein konventionelles Aufreinigungsverfahren aufgereinigt werden, wie z. B. durch Aussalzung mit Ammoniumsulfat oder durch Lösungsmittelpräzipitation. Weiter kann eine gereinigte Enzympräparation, die nach einer Elektrophorese eine einzelne Bande ergibt, unter Verwendung von bekannten Aufreinigungsverfahren erhalten werden, wie z. B. Säulenchromatographien (z. B. Anionenaustauschsäule und Gelfiltrationssäule) in Kombination.
Agarooligosaccharide wie Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose können durch Reaktion der so erhaltenen Kultur oder der erfindungsgemäßen α-Agarase mit einem variierenden Aufreinigungsgrad mit einem Polysaccharid, das in der Rotalge enthalten ist (z. B. Agar oder Agarose), als Substrat produziert werden.
Agarose ist ein Polysaccharid, das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose abwechselnd über α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen miteinander verbunden sind. Eine β-Agarase ist ein Enzym, das β-1,4-Bindungen in Agarose hydrolysiert. Oligosaccharide mit D-Galaktose an ihren reduzierenden Enden, die durch die Wirkung dieses Enzyms hergestellt werden, werden als Neoagarooligosaccharide bezeichnet, die nicht die physiologischen Aktivitäten aufweisen, wie sie die Agarooligosaccharide besitzen. Wenn eine α-Agarase, die α-1,3-Bindungen in Agarose spaltet, verwendet wird, können Agarooligosaccharide mit 3,6-Anhydro-L-Galaktose an deren reduzierenden Enden hergestellt werden. Es sind zwei Enzyme, die sich von Alteromonas agarlyticus GJ1B und einem Bakterium der Gattung Vibrio (Stamm JT0107-L4) ableiten, als α-Agarasen bekannt. Jedoch kann die von Alteromonas agarlyticus GJ1B produzierte α-Agarase nicht auf Agarohexaose oder kürzere Oligosaccharide wirken, wohingegen die α-Agarase, die von dem Bakterium der Gattung Vibrio abstammt, keine Agarose verdauen kann. Daher war es nicht möglich, Agarobiose oder Agarotetraose aus Agarose als Ausgangsstoff unter Verwendung einer solchen α-Agarase effizient herzustellen.
Die kürzlich durch die Erfinder gefundenen α-Agarasen, die in der WO 00/50578 beschrieben sind, sind Enzyme, die auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide wirken, die länger sind als Agarohexaose. Daher wirken sie auf Agarose, um Agarooligosaccharide zu produzieren. Weiter können sie eine einzelne α-1,3-Bindung in Agarohexaose spalten, welche als Ergebnis dieser Aktivität erzeugt wird. Indem diese Enzyme verwendet werden, ist es möglich, Agarobiose und Agarotetraose, ein Disaccharid und ein Tetrasaccharid, die unter Verwendung von konventionellen Verfahren kaum hergestellt wurden, herzustellen. Die optimalen Reaktionstemperaturen von diesen Enzymen betragen ungefähr 40°C. Agarose wird oft bei einer Konzentration von 1% (w/v) verwendet. Bei dieser Konzentration ist sie bei 50°C nicht erstarrt, aber sie ist bei 40°C erstarrt. Das bedeutet, dass, wenn ein konventionelles Enzym verwendet wird, Agarose bei einer hohen Konzentration bei der optimalen Reaktionstemperatur für das Enzym erstarrt ist und die enzymatische Reaktion verhindert werden kann. Daher war es schwierig, Agarobiose oder Agarotetraose effizient herzustellen.
Andererseits kann sie für eine Reaktion bei einer Temperatur, bei der Agarose nicht erstarrt ist, verwendet werden, da die optimale Reaktionstemperatur der erfin dungsgemäßen α-Agarase 50°C beträgt. Daher ermöglicht sie eine effiziente Herstellung von Agarooligosacchariden.
Die erfindungsgemäße α-Agarase ist ein Enzym, das auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide wirkt, die langer sind als Agarohexaose, wie anhand der oben genannten physikalischen und chemischen Eigenschaften gezeigt. Daher wirkt sie auf Agarose, um Agarooligosaccharide herzustellen. Weiter kann sie α-1,3-Bindungen in Agarooligosacchariden spalten, die als Ergebnis der Wirkung erzeugt werden, um kleinere Agarooligosaccharide zu erzeugen, wie z. B. Agarobiose und Agarotetraose. Zusätzlich ist ihre optimale Temperatur hoch und sie ist in exzellenter Weise thermostabil. Daher ist es unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-Agarase möglich, Agarobiose und Agarotetraose zu erhalten, d. h. ein Disaccharid und ein Tetrasaccharid, die bislang mit den konventionellen Verfahren in großen Mengen ohne Verhinderung einer Reaktion aufgrund einer Erstarrung von Agarose schwierig herzustellen waren.
Substratspezifitäten der konventionellen α-Agarasen und der erfindungsgemäßen α-Agarase sind in Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle bezeichnet + und – die Fähigkeit bzw. Unfähigkeit des Enzyms, das Substrat zu verdauen. Tabelle 1

Substrat

Agarose Agarohexaose Agarotetraose

Alteromonas agarlyticus GJ1B + - -

Bakterium der Gattung Vibrio (JT0107-L4) - + +

Agarase 1–7 und Agarase 4–3 + + -

Agarase II + + -
Die Agarooligosaccharide, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-Agarase produziert werden, enthalten Agarobiose und Agarotetraose. Die Agarooligosaccharide können Agarohexaose oder Agarooligosaccharide enthalten, die langer sind als Agarohexaose, so lange deren Vorkommen nicht mit dem Verwendungszweck interferiert. Zum Beispiel kann Agar, Agarase oder Oligosaccharide, die von Agar oder Agarose stammen, als Ausgangsstoff zur Herstellung von Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-Agarase verwendet werden. Die verwendeten Bedingungen für die Wirkung der α-Agarase sind nicht besonders beschränkt, so lange das Enzym seine Aktivität unter den verwendeten Bedingungen ausübt. Zum Beispiel ist es bevorzugt, dass Agarase II bei einem pH von 6,0 bis 8,0 bei 45°C bis 55°C wirkt. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches ist nicht spezifisch beschränkt, so lange sie für die Wirkung des Enzyms geeignet ist.
Wie oben beschrieben, sind die unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-Agarase produzierte Oligosaccharide hauptsächlich Hexasaccharide oder kürzere Oligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden. Jedoch ist es möglich, gegebenenfalls Oligosaccharide mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden zu produzieren, indem die Reaktionsbedingung oder dergleichen zweckmäßig ausgewählt werden. Es ist auch möglich Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose unabhängig zu erhalten, indem die so erhaltenen Oligosaccharide aufgetrennt und aufgereinigt werden.
Agar oder Agarose kann in Agarooligosaccharide wie Neoagarobiose, Neoagarotetraose und Neoagarohexaose verdaut werden, indem es der Kultur oder der β-Agarase mit verschiedenen Aufreinigungsgraden, die wie oben beschrieben erhalten wurde, erlaubt wird, auf ein Polysaccharid, das in der Rotalge enthalten ist (z. B. Agar oder Agarose), zu wirken.
Enzyme, die von Vibrio sp. JT0107-1,4 ( JP-A 8-38172 ) und Pseudomonas altantica stammen (Morrice, L. M. et al., Eur. J. Biochem., 135, 553–558 (1983)), sind als β-Agarasen bekannt. Die optimalen Reaktionstemperaturen davon betragen ungefähr 30°C. Wenn ein solches Enzym für eine Extraktion einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem Agarosegel verwendet wird, wird die Reaktion verhindert, da Agarose bei einer Temperatur, bei der das Enzym seine Aktivität ausübt, erstarrt ist. Daher kann es nicht in praktischer Anwendung verwendet werden. Enzyme, die von Flavobakterium sp. Stamm NR19 ( US-Patent Nr. 5,869,310 ), Pseudomonas sp. N-7 ( JP-B 7-97987 ) und Vibrio sp. PO-303 ( JP-A 8-294389 ) abstammen, sind dafür bekannt, dass ihre optimale Reaktionstemperaturen höher sind als die der oben genannten Enzyme. Da jedoch ihre optimalen Temperaturen (55°C oder darunter) niedriger sind als der Schmelzpunkt eines Agarosegels mit niedrigem Schmelzpunkt (65°C), bestehen Probleme hinsichtlich der praktischen Verwendung.
Andererseits besitzt die hier beschriebene β-Agarase eine hohe Aktivität in einem weiten Temperaturbereich (50°C bis 70°C) und übt ihre maximale Aktivität bei 55°C bis 65°C aus. Daher ermöglicht sie eine Reaktion, bei der ein Agarose-Gel vollständig geschmolzen ist. Weiter verbleibt 98% der Aktivität der β-Agarase nach einer Behandlung bei 65°C für 30 Minuten, was darauf hindeutet, dass sie in exzellenter Weise thermostabil ist. Daher ermöglicht die Verwendung der β-Agarase eine effiziente Extraktion einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem Agarosegel, ohne dass eine Erstarrung von Agarose verhindert werden muss. Eine solche Extraktion ist mit konventionellen Verfahren nur schwierig durchführbar.
Das erfindungsgemäße α-Agarase-Gen ist ein Gen, das für die erfindungsgemäße α-Agarase kodiert. Daher betrifft es eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Aminosäuresequenz für ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert. Beispiele von erfindungsgemäßen α-Agarase-Genen umfassen ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, das für Agarase II kodiert, die von dem Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) stammt. Gene, die für Agarase II kodieren, sind beispielhaft durch ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid bestehend aus 772 Aminosäureresten von der Aminosäurezahl 318 bis zur Aminosäurezahl 1089 in SEQ ID NO: 23 kodiert, veranschaulicht.
Die erfindungsgemäßen α-Agarase-Gene umfassen auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz besitzt, bei der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in die oben genannte Aminosäuresequenz eingeführt wurden, und eine α-Agarase-Aktivität besitzt.
Auch umfassen die erfindungsgemäßen Gene ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 2316 Nukleotiden von der Nukleotidzahl 952 bis zur Nukleotidzahl 3267 in SEQ ID NO: 21 besteht. Die erfindungsgemäßen Gene umfassen auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, bei der ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in die oben genannte Nukleotidsequenz eingeführt wurden, und für ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert.
Weiter umfassen die erfindungsgemäßen Gene eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert. Eine Hybridisierung kann gemäß einem Verfahren, wie es beispielsweise von T. Maniatis et al. (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory beschrieben wurde, durchgeführt werden. Die stringenten Bedingungen umfassen z. B. die Inkubation mit einer Sonde bei 65°C über Nacht in einer Lösung, die 6 × SSC (1 × SSC: 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 mg/ml Herings-Sperma-DNA enthält.
Ein β-Agarase-Gen ist ein Gen, das für ein Polypeptid mit der oben genannten β-Agarase-Aktivität kodiert. Es betrifft daher eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Aminosäuresequenz für ein Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert. Beispiele der β-Agarase-Gene umfassen ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für Agarase I kodiert, die von dem Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) stammt. Gene, die für Agarase I kodieren, sind z. B. ein Gen mit einer Nuldeotidsequenz, die für ein Polypeptid, das aus 417 Aminosäureresten von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl 437 in SEQ ID NO: 22 besteht, kodiert.
Die β-Agarase-Gene umfassen auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz besitzt, bei der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in der oben genannten Aminosäuresequenz eingeführt wurden, und eine β-Agarase-Aktivität besitzt.
Auch umfassen die β-Agarase-Gene ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 1251 Nukleotiden von der Nukleotidzahl 61 bis zur Nukleotidzahl 1311 in SEQ ID NO: 20 besteht. Die β-Agarase-Gene umfassen auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, bei der ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in der oben genannten Nukleotidsequenz eingeführt wurden und für ein Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert.
Weiter umfassen die β-Agarase-Gene eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert. Die stringenten Bedingungen sind beispielsweise solche wie oben beschrieben.
Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Agarase-Gen wie folgt kloniert werden.
Genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine Agarase produziert, präpariert. Die genomische DNA kann gemäß einem geeigneten bekannten Verfahren präpariert werden. Zum Beispiel kann sie präpariert werden, indem Verfahren wie eine Lysozymbehandlung, Proteasebehandlung, RNAse-Behandung, Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation in Kombination verwendet werden. Die so erhaltene genomische DNA wird durch geeignete bekannte Mittel, wie Sonifizierung oder Verdau mit einem Restriktionsenzym abgebaut. Die entstehenden DNA-Fragmente werden entsprechend einem konventionellen Verfahren in einen Vektor eingebaut (z. B. einen Plasmidvektor), um rekombinante DNA-Moleküle zu konstruieren. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in einen geeigneten Wirt (z. B. Escherichia coli) eingeführt, um Transformanten zu erhalten. Verfahren zur Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen, Transformation und dergleichen, die für den zu verwendenden Vektor und Wirt geeignet sind, können aus konventionellen Verfahren ausgewählt werden, z. B. solchen, die in Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe beschrieben werden. Auf diese Weise wird eine genomische Bibliothek, die eine Transformante enthält, die ein Agarase-Gen beherbergt, erhalten.
Als nächstes wird die genomische Bibliothek durchmustert, um die Transformante, die das Agarase-Gen beherbergt, auszuwählen. Das Agarase-Gen kann von der Transformante isoliert werden. Beispiele von Screening-Verfahren sind wie folgt.
(1) Screening unter Verwendung der Expression der Agarase-Aktivität als Index
Eine genomische Bibliothek wird auf Agarplatten wachsen gelassen. Eine Transformante, die ein Agarase-Gen beherbergt, exprimiert ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität. Das Polypeptid lysiert Agar-Gel durch die Wirkung seiner Agarase-Aktivität. Folglich wird eine Kolonie oder ein Plaque ausgewählt, die/der Agar-Gel in einer Agarplatte lysiert.
(2) Screening unter Verwendung von Antikörpern
Eine teilweise aufgereinigte oder gereinigte Roh-Enzympräparation von einer Agarase wird wie oben beschrieben hergestellt. Ein Anti-Agarase-Antikörper wird unter Verwendung der Präparation der Agarase als ein Antigen gemäß einem konventionellen Verfahren hergestellt.
Eine genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Die gewachsenen Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefilter übertragen. Exprimierte rekombinante Proteine werden auf die Filter zusammen mit den Kolonien oder Plaques übertragen. Die rekombinanten Proteine auf den Filtern werden mit dem Anti-Agarase-Antikörper reagieren gelassen, um einen Klon zu identifizieren, der mit dem Antikörper reagiert.
Der Klon, der mit dem Antikörper reagiert, kann gemäß einem bekannten Verfahren identifiziert werden, z. B. durch Reaktion eines Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpers mit den Filtern, die mit dem Anti-Agarase-Antikörper reagiert haben, Inkubation der Filter mit einem homogenen Substrat und anschließendes Nachweisen der entwickelten Farbe.
Wenn ein Expressionsvektor, der eine starke Expression von einem Gen in einer DNA, die in den Vektor eingebaut ist, bewirkt, für die Konstruktion der genomischen Bibliothek verwendet wird, die in den oben beschriebenen Verfahren (1) oder (2) eingesetzt werden soll, kann eine Transformante, die das Gen von Interesse beherbergt, leicht ausgewählt werden.
(3) Screening durch Hybridisierung unter Verwendung einer DNA-Sonde
Eine genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Gewachsene Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefilter übertragen. DNA wird auf den Filtern durch Denaturierung immobilisiert. Die DNA auf den Filtern wird an eine markierte Sonde gemäß einem konventionellen Verfahren hybridisiert, um einen Klon zu identifizieren, der an die Sonde hybridisiert.
Sonden, die für dieses Screening verwendet werden, umfassen ein Oligonukleotid, das auf der Basis von Information über die oben genannte Aminosäuresequenz der Agarase hergestellt wurde, ein Oligonukleotid, das auf der Basis von Information über eine andere Aminosäuresequenz hergestellt wurde, und ein PCR-Fragment, das unter Verwendung von Primern amplifiziert wurde, die auf der Basis von Information über eine solche Aminosäuresequenz hergestellt wurden. Beispiele von Markierungen, die für die Sonden verwendet werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Digoxigeninmarkierung und eine Biotinmarkierung.
Eine genomische Bibliothek, die auf Transformanten angereichert wurde, die ein Agarase-Gen beherbergen, das wie folgt hergestellt wurde, kann als genomische Bibliothek für das Screening verwendet werden.
Genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine Agarase produziert, präpariert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und dann auf einen Nylon- oder Nitrocellulosefilter gemäß einem konventionellen Verfahren geblottet. Die DNA auf dem Filter wird an die oben genannte markierte Sonde gemäß einem konventionellen Verfahren hybridisiert, um ein DNA-Fragment nachzuweisen, das an die Sonde hybridisiert. DNA-Fragmente, die dem Signal entsprechen, werden extrahiert und von dem Agarosegel aufgereinigt.
Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden in einen Vektor (z. B. einen Plasmidvektor) gemäß einem konventionellen Verfahren eingebaut, um rekombinante DNA-Moleküle zu konstruieren. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in einen geeigneten Wirt (z. B. Escherichia coli) eingeführt, um Transformanten zu erhalten. Ein Transformationsverfahren, das für den zu verwendenden Vektor geeignet ist, kann aus konventionellen Verfahren ausgewählt werden, beispielsweise solchen, die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe beschrieben wurden. Auf diese Weise wird eine genomische Bibliothek, die auf Transformanten angereichert ist, die ein Agarase-Gen beherbergen, erhalten.
Es kann ein Screening unter Verwendung solch einer genomischen Bibliothek effizienter durchgeführt werden.
Das Gen von Interesse wird kloniert, indem Transformanten in den Verfahren (1) bis (3) wie oben beschrieben durchmustert werden. Unter Verwendung einer PCR kann eine Klonierung in vitro ohne Verwendung von Transformanten durchgeführt werden.
Genomische DNA wird von einem Mikroorganismus präpariert, der eine Agarase produziert. Eine PCR wird unter Verwendung von genomischer DNA als Matrize und einem Primerpaar, das auf der Basis der Aminosäuresequenzinformation der Agarase hergestellt wurde, durchgeführt. Somit kann ein DNA-Fragment, das ein Agarase-Gen enthält, erhalten werden. Weiter kann das Agarase-Gen mit voller Länge, beispielsweise durch Hybridisierung, indem das Fragment als eine Sonde verwendet wird, oder eine PCR, in der Primer verwendet werden, die basierend auf der Nukleotidsequenz des Fragments hergestellt wurden, erhalten werden. Die wie vorstehend beschrieben erhaltene Nukleotidsequenz des Gens kann gemäß einem bekannten Verfahren bestimmt werden. Wenn der Klon nicht für das vollständige Agarase-Polypeptid kodiert, kann das gesamte offene Leseraster (ORF) für die Agarase erhalten werden, indem in wiederholter Weise eine Prozedur angewendet wird, welche die Präparation einer neuen Sonde auf der Basis der bestimmten Nukleotidsequenz und ein Screening einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Sonde umfasst, um so einen neuen Klon zu erhalten. Ein Klon, der das vollständige ORF enthält, das für die Agarase kodiert, kann beispielsweise basierend auf der so erhaltenen Information hergestellt werden.
Ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität kann in großen Mengen durch genetische Manipulation hergestellt werden, indem das Gen, das für die Agarase kodiert und das wie oben beschrieben erhalten wurde, mit einem geeigneten Expressionsvektor verbunden wird.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Gens wird unten kurz beschrieben.
Zellen, die durch Kultivierung des Mikroorganismus NAB2-1-1 erhalten wurden, werden unter Verwendung von Lysozym lysiert, Proteine werden entfernt, es wird eine Ethanolpräzipitation und dergleichen durchgeführt, um chromosomale DNA zu erhalten. Die chromosomale NAB2-1-1-DNA wird vollständig mit einem Restriktionsenzym verdaut. Ein Adapter, der dem Restriktionsenzym entspricht, wird an die verdaute DNA ligiert. Es wird eine PCR unter Verwendung der entstehenden chromosomalen DNA als Matrize sowie einem Primer, der auf der Basis der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Agarase I hergestellt wurde, und einem Primer, der der Nukleotidsequenz des Adapters entspricht, durchgeführt.
Eine Nukleotidsequenz, die für die erfindungsgemäße Agarase kodiert, kann durch Analysieren der Nukleotidsequenz des wie oben beschrieben erhaltenen PCR-Produkts bestimmt werden. Wenn die vollständige Sequenz nicht bestimmt werden kann, kann das oben genannte Verfahren wiederholt werden. Alternativ kann ein Primer-Waking durchgeführt werden, indem die chromosomale DNA als Matrize verwendet wird.
Der auf der Basis der Aminosäuresequenz der Agarase entworfene Primer kann ein gemischter Primer sein. Alternativ ist es möglich, neue Primer zu verwenden, die auf der Basis einer Nukleotidsequenz von einem Amplifikationsprodukt hergestellt werden, das mittels einer PCR unter Verwendung von Primer, die auf der Basis der N-terminalen und internen Aminsäuresequenzen und der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Matrize präpariert werden, erhalten wird.
Das so erhaltene Gen, das für Agarase II kodiert, hat ein ORF, das für ein Polypeptid kodiert, das aus 1089 Aminosäuren besteht. Die Nukleotidsequenz des ORF ist in SEQ ID NO: 21 gezeigt. Die durch die Nukleotidsequenz des ORFs kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Eine Nukleotidsequenz, die dem P2 entspricht (die N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase II), eine stromaufwärts gelegene Nukleotidsequenz, die für 26 Aminosäuren mit einer Signalpeptid-ähnlichen Sequenz kodiert, und eine SD-ähnliche Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region sind in der Nukleotidsequenz des Gens vorhanden.
Daher ist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 ein Beispiel der erfindungsgemäßen α-Agarase. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der zuvor bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase II zeigt, dass Agarase II ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz, beginnend von der Aminosäurezahl 27 bis zur Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht, und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz, beginnend von der Nukleotidzahl 79 bis zur Nukleotidzahl 3270 (einschließlich dem Terminations-Codon) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 kodiert wird.
Es sind drei vermeintliche Ca-Bindungsregionen (171–184, 271–283 und 987–999) in dem ORF vorhanden.
Das Gen, das für Agarase I kodiert, hat ein ORF, das für ein Polypeptid kodiert, das aus 438 Aminosäuren besteht. Die Nukleotidsequenz des ORFs ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz des ORFs kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 22 gezeigt. Eine Nukleotidsequenz, die dem P1 entspricht (die N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase I), eine stromaufwärts gelegene Nukleotidsequenz, die für 20 Aminosäuren kodiert, und eine SD-ähnliche Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region sind in der Nukleotidsequenz des Gens vorhanden.
Daher ist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 ein Beispiel für eine Agarase. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der zuvor bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase I zeigt, dass Agarase I ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz, beginnend von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl 438 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22, besteht, und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz, beginnend von der Nukleotidzahl 61 bis zur Nukleotidzahl 1314 (einschließlich dem Terminations-Codon) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 20, kodiert wird.
Die Aminosäuresequenz von Agarase I, die wie oben beschrieben erhalten wurde, besitzt lediglich eine Homologie von 33% mit einer Aminosäuresequenz einer bekannten β-Agarase des Flavobakteriums sp. Stamm NR19.
Ein rekombinantes DNA-Molekül kann hergestellt werden, indem ein Gen, das für die erfindungsgemäße Agarase kodiert (z. B. das Gen, das für Agarase II kodiert), mit einem geeigneten Vektor verknüpft wird. Weiterhin kann eine Transformante hergestellt werden, indem das rekombinante DNA-Molekül in einen geeigneten Wirt eingeführt wird. Die erfindungsgemäße Agarase wird in einer Kultur hergestellt, die erhalten wird, indem die Transformante kultiviert wird. Es ist daher möglich, die erfindungsgemäße Agarase (z. B. Agarase II) in großen Mengen mittels der Transformante herzustellen.
Eine mutierte Agarase kann erzeugt werden, indem eine Mutation in ein Gen, das für eine Agarase kodiert, gemäß einem bekannten Verfahren eingeführt wird. Beispiele von Verfahren zum Einführen einer Mutation, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Oligonukleotid-"Double-Amber"-Verfahren (Hashimoto-Gotoh, T. et al., Gene, 152: 271–275 (1995)), das "gapped duplex"-Verfahren (Kramer, W. et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441 (1984); Kramer, W. et al., Methods in Enzymology, 154: 350 (1987)) und das Kunkel-Verfahren (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1985); Kunkel, T. A., Methods in Enzymology, 154: 367 (1987)).
Die Agarase von Interesse kann außerhalb einer Transformante sekretiert werden, indem ein Gen exprimiert wird, das für ein Polypeptid kodiert, in dem eine Signalsequenz an den N-Terminus der zu exprimierenden Agarase angefügt wird. Die Signalsequenz ist nicht auf eine bestimmte beschränkt und kann beispielsweise die Signalsequenz für Agarase I sein, wie sie durch die Aminosäurezahl 1 bis zur Aminosäurezahl 20 in der SEQ ID NO: 22 dargestellt ist. Diese Signalsequenz wird durch eine Nukleotidsequenz beginnend von der Nukleotidzahl 1 bis zur Nukleotidzahl 60 in der SEQ ID NO: 20 kodiert. Alternativ kann es sich z. B. um die Signalsequenz für Agarase II handeln, wie sie durch die Aminosäurezahl 1 bis zur Aminosäurezahl 26 in der SEQ ID NO: 23 dargestellt ist. Diese Signalsequenz wird durch eine Nukleotidsequenz beginnend von der Nukleotidzahl 1 bis zur Nukleotidzahl 78 in der SEQ ID NO: 21 kodiert.
Beispiele von Vektoren, die verwendet werden können, um die rekombinanten DNA-Moleküle herzustellen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Plasmidvektoren, Phagenvektoren und Virusvektoren. Ein geeigneter Vektor kann in Abhängigkeit von dem Zweck, für den die rekombinante DNA verwendet werden soll, ausgewählt werden. Wenn ein rekombinantes DNA-Molekül konstruiert wird, um eine Agarase herzustellen, ist ein Vektor, der einen Promotor und/oder andere Regionen zur Expressionskontrolle enthält, bevorzugt. Beispiele von solchen Plasmidvektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pKF19k, pT7BlueT und pET16b. Wirte, die zur Herstellung von Transformanten verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und filamentöse Pilze sowie kultivierte Zellen von Säugetieren, Fischen, Insekten und dergleichen. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das unter Verwendung eines Vektors konstruiert wird, der für den Wirt geeignet ist, wird zur Herstellung einer Transformante verwendet.
Ein Verfahren zur Herstellung von Agarase I durch eine genetische Manipulation ist unten kurz beschrieben.
Ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das beispielsweise eine Aminosäuresequenz beginnend von der Aminosäurezahl 21 in der SEQ ID NO: 22 besitzt, wird in einen geeigneten Plasmidvektor eingeführt (z. B. pKF19k (Takara Shuzo, pT7BlueT (Takara Shuzo) oder pET16b (Takara Shuzo)), um ein Plasmid zu konstruieren. Escherichia coli (z. B. Escherichia coli JM109 oder BL21(DE3)pLysS), das mit einem solchen Plasmid transformiert wurde, wird in einem geeigneten Flüssigmedium kultiviert. Die Induktion wird unter Verwendung von IPTG oder dergleichen, falls notwendig, durchgeführt. Das Polypeptid, das von dem DNA-Fragment kodiert wird, das in das Plasmid eingefügt wurde, wird exprimiert. Die β-Agarase-Aktivität, die durch eine solche Transformante in einem Einheitsvolumen der Kultur exprimiert wird, ist gewöhnlicherweise höher als die einer Kultur von NAB2-1-1.
Bei der Agarase II kann eine Transformante, die Agarase II exprimiert, durch genetische Manipulation wie oben für Agarase I beschrieben unter Verwendung eines DNA-Fragments, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das beispielsweise eine Aminosäuresequenz beginnend von der Aminosäurezahl 27, 181 oder 318 in der SEQ ID NO: 23 besitzt, hergestellt werden. Die entstehende Transformante exprimiert eine α-Agarase-Aktivität und die Aktivität in einem Einheitsvolumen der Kultur ist gewöhnlicherweise höher als die einer Kultur von NAB2-1-1.
Die erfindungsgemäße Agarase, die wie oben beschrieben durch genetische Manipulation hergestellt wurde, kann durch ein konventionelles Aufreinigungsverfahren wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Lösungsmittelpräzipitation partiell aufgereinigt werden. Weiter kann eine gereinigte Enzympräparation erhalten werden, die eine Einzelbande nach einer Elektrophorese ergibt, indem bekannte Aufreinigungsverfahren, wie Säulenchromatographien (z. B. Anionen-Austauschsäule und Gelfiltrationssäule), in Kombination verwendet werden.
Wenn die durch genetische Manipulation hergestellte erfindungsgemäße Agarase unlöslich ist, kann sie gemäß einem bekannten Verfahren löslich gemacht und gewonnen werden.
Agarooligosaccharide wie Agarobiose, Agarotetraose, Agarohexaose und Agarooctaose können hergestellt werden, indem die so erhaltene erfindungsgemäße rekombinante α-Agarase mit einem variierenden Aufreinigungsgrad mit einem Polysaccharid, das in der Rotalge enthalten ist (z. B. Agar oder Agarose), als Substrat reagieren gelassen wird.
Zum Beispiel können die Agarooligosaccharide durch eine Reaktion bei 50°C für 16 Stunden unter Verwendung von 1% (w/v) Agarose als Substrat hergestellt werden.
In ähnlicher Weise kann ein Stoff (z. B. eine Nukleinsäure) in einem Agarosegel effizient extrahiert werden, indem es der so erhaltenen rekombinanten β-Agarase mit einem variierenden Aufreinigungsgrad ermöglicht wird, auf ein Agarosegel einzuwir ken, das einer Elektrophorese einer Nukleinsäure oder dergleichen unterzogen wurde.
Zum Beispiel kann im Falle einer Elektrophorese auf einem 1% (w/v) oder 3% (w/v) Agarosegel ein Stoff in dem Gel effizient extrahiert werden, indem es der rekombinanten β-Agarase ermöglicht wird, auf das Agarosegel, das den Stoff von Interesse enthält, bei 67°C für 10 Minuten einzuwirken.
Die Thermostabilität der erfindungsgemäßen Agarase kann verbessert werden, indem bis zu 30% des ORFs von dem N-Terminus deletiert werden. Die zu entfernende Region ist nicht spezifisch beschränkt, so lange sie bis zu 30% (z. B. 10%, 20% etc.) des ORFs beträgt. Zum Beispiel kann die Thermostabilität der Agarase II verbessert werden, indem 29,1% (d. h. 317 Aminosäuren) von dem N-Terminus der Agarase II deletiert werden. Eine besonders bemerkenswerte Verbesserung bei der Thermostabilität wird in der Gegenwart von Calcium beobachtet.
Es gibt keine spezifische Beschränkung hinsichtlich des Verfahrens zum Entfernen eines N-terminalen Teils zur Verbesserung der Thermostabilität. Es kann durch Behandlung mit einer Protease oder unter Verwendung von genetischen Manipulationstechniken durchgeführt werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer, sollen jedoch nicht deren Umfang beschränken.
Beispiel 1
Verfahren zur Aktivitätsmessung
Nach der Aufreinigung der erfindungsgemäßen Agarase oder der weiteren hier beschriebenen Agarase wurde die Aktivität der gereinigten oder partiell gereinigten Enzympräparation gemessen, indem eine Enzymreaktion unter Verwendung von Agarose L03 (Takara Shuzo) als Substrat durchgeführt wurde und dann die entstandene Agarotetraose oder Neoagarotetraose unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie quantifiziert wurde. Das Verfahren ist weiter unten im Detail beschrieben.
Es wurde eine Lösung, die Agarose bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) oder 0,5% (w/v) enthält, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I) enthält, oder in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthält, hergestellt. 180 μl dieser Lösung wurden als Substrat mit 20 μl einer Enzymlösung vermischt. Das Gemisch wurde bei 50°C für 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 10 Minuten, umgesetzt und dann in kochendem Wasser oder bei 75°C für eine Minute erhitzt, um die Reaktion abzustoppen. 30 μl des Reaktionsgemisches wurden auf eine TSKgel-α-2500-Säule aufgetragen (innerer Durchmesser: 7,8 mm; Länge: 300 mm; Tosoh). Die Flution wurde unter Verwendung einer 70% Acetonitril-Lösung als Eluent bei einer Flussrate von 0,8 ml/Minute durchgeführt. Agarotetraose, die mit einer Verzögerungszeit von ungefähr 25 Minuten eluiert wurde, oder Neoagarotetraose, die mit einer Verzögerungszeit von ungefähr 24 Minuten eluiert wurde, die beide durch die Enzymreaktionen erzeugt wurden, wurde quantifiziert. Eine Einheit (1 U) wird als eine Enzymmenge definiert, welche 1 μmol Agarotetraose oder Neoagarotetraose in 10 Minuten produziert.
Beispiel 2
Herstellung von Agarase aus NAB2-1-1
100 ml künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurden hergestellt. Pepton (Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden mit Konzentrationen von 0,3% (w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu gegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Das entstehende Gemisch wurde in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt. 0,4 g NuSieve GTG Agarose (Takara Shuzo) wurden dazu gegeben. Nach der Sterilisation, bei der ein Autoklav verwendet wurde, wurde NAB2-1-1 in das Gemisch angeimpft und bei 37°C bei 120 UpM über Nacht kultiviert. Die entstehende Kultur wurde als Vorkultur verwendet.
Die Hauptkultivierung wurde wie folgt durchgeführt. 3000 ml künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurden in einem 5000 ml-Glasgefäß-Fermenter hergestellt. Pepton (Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden bei Konzentrationen von 0,3% (w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu gegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 eingestellt. 12 g NuSieve GTG Agarose (Takara Shuzo) wurden dazu gegeben. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven sterilisiert. 30 ml der Vorkultur wurden in das Gemisch angeimpft und bei 37°C bei 250 UpM für 18 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde dann bei 8000 × g für 20 Minuten zentrifu giert, um ungefähr 3000 ml eines Überstandes, von dem Zellen entfernt worden waren, zu isolieren.
Die folgenden Verfahren wurden bei 4°C oder darunter durchgeführt.
Der Überstand wurde in eine Dialysemembran (Sanko Junyaku) gegeben und dann in ungefähr 500 g Polyethylenglykol für zwei Nächte getaucht, um ihn ungefähr um das 10-fache zu konzentrieren. 300 ml des Konzentrats wurden gegen Puffer I (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthält) zur Entsalzung dialysiert.
Das Dialysat wurde auf eine Säule geladen (φ 2,0 cm × 12 cm), die mit einem Anionen-Austauscherharz, DEAE Toyopearl 650M (Tosoh), gefüllt war, das mit dem Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit ungefähr 120 ml Puffer I gewaschen. Die nicht-adsorbierte Fraktion und die Waschfraktion (ungefähr 400 ml) wurden gesammelt und als eine Agarase I-Fraktion kombiniert. Die Flution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 mM bis 1000 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen: 400 ml). Eine Fraktion von ungefähr 160 ml, die bei einer Natriumchloridkonzentration zwischen 300 mM und 600 mM eluiert wurde, wurde als eine Agarase II-Fraktion gesammelt.
Die Agarase I-Fraktion und die Agarase II-Fraktion wurden gegen Puffer 11 (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid, 5% Glycerin und 1 mM PMSF enthält) zur Entsalzung dialysiert.
Die Agarase II-Fraktion wurde weiter einer Aufreinigung wie folgt unterzogen. Die dialysierte Agarase II-Fraktion wurde auf eine Säule geladen (φ 2,0 cm × 8,0 cm), die mit 25 ml QAE Toyopearl 550C (Tosoh) gefüllt war. In diesem Fall wurde die Flution unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 mM bis 800 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen: 250 ml). Eine Fraktion von ungefähr 70 ml, die bei ungefähr 500 mM eluierte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde gegen Puffer II dialysiert und auf ein Volumen von ungefähr 1 ml unter Verwendung der Zentrifugations-Ultrafiltrationsmembran CENTRIPREP-10 (Amicon) konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration unterzogen, bei der eine Säule (φ 0,8 cm × 50 cm), die mit Sephadex G-100 (Pharmacia) gefüllt war und die mit Puffer II äquilibriert worden war, verwendet wurde. Eine Agarase II-Fraktion von ungefähr 20 ml wurde erhalten. Diese Fraktion wurde auf ein Volumen von unge fähr 1 ml konzentriert, indem wiederum eine Ultrafiltrationsmembran verwendet wurde.
Die Elektrophorese des gereinigten Proteins auf einem Polyacrylamidgel, das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, zeigte, dass es beinahe vollständig bis zur Homogenität gereinigt war. Die Gesamtaktivität betrug ungefähr 150 U.
Die Agarase I-Fraktion wurde weiter einer Aufreinigung wie folgt unterzogen.
Die dialysierte Agarase I-Fraktion (ungefähr 400 ml) wurde an eine Säule (φ 2,0 cm × 9,5 cm) adsorbiert, die mit CM Toyopearl 650 (Tosoh) gefüllt war und die mit Puffer II äquilibriert worden war. Die Flution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 mM bis 1000 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen: 300 ml). Eine Agarase I-Fraktion von ungefähr 90 ml, die bei einer Natriumchloridkonzentration von bis zu 300 mM eluierte, wurde gesammelt. Diese Fraktion wurde über Nacht gegen Puffer II dialysiert, der 1,0 M Ammoniumsulfat enthielt, und auf eine Säule geladen (φ 2,0 cm × 9,5 cm), die mit 30 ml Butyl Toyopearl 650M (Tosoh) gefüllt war und mit demselben Puffer äquilibriert worden war. Die Flution wurde unter Verwendung eines Gradienten von 1,0 M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen: 300 ml). Eine Agarase I-Fraktion (ungefähr 60 ml), die mit Konzentrationen im Bereich von 300 mM bis 0 M eluiert wurde, wurde gewonnen. Wie Agarase II wurde die Fraktion gegen Puffer II dialysiert und auf ein Volumen von ungefähr 1 ml unter Verwendung der Zentrifugations-Ultrafiltrationsmembran CENTRIPREP-10 (Amicon) konzentriert.
Die Elektrophorese des gereinigten Proteins auf einem Polyacrylamidgel, das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, zeigte, dass es fast bis zur Homogenität aufgereinigt war. Die Gesamtaktivität betrug ungefähr 310 U.
Beispiel 3
Untersuchen von verschiedenen Eigenschaften der Enzyme
[Identifikation von Reaktionsprodukten mit Agarase I und Agarase II]
20 μl einer Lösung mit Agarose in einer Konzentration von 0,5% (w/v) in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I) enthielt, oder 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthielt, wurde einem Verdau unter Ver wendung des gereinigten Agarase I- oder Agarase II-Enzyms ausgesetzt. Das Spaltungsprodukt wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Tosoh, TSKgel α-2500) aufgetragen und es wurde 70% Acetonitril als Eluent verwendet. Als Ergebnis wurden Hauptspitzen nach ungefähr 24 Minuten und nach ungefähr 28 Minuten für Agarase I festgestellt. Es wurde vermutet, dass diese Spitzen der Neoagarotetraose bzw. Neoagarohexaose entsprachen, basierend auf den Verzögerungszeiten, die für die Standards ermittelt wurden. Für das Spaltungsprodukt mit Agarase II wurden Hauptspitzen bei Verzögerungszeiten von ungefähr 22 Minuten, ungefähr 25 Minuten und ungefähr 29 Minuten ermittelt. Es wurde vermutet, dass diese Spitzen Agarobiose, Agarotetraose bzw. Agarohexaose entsprachen, basierend auf den Verzögerungszeiten, die für die Standards ermittelt wurden. Das Reaktionsprodukt wurde bestätigt, indem es einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wurde, wobei ein Entwicklungslösungsmittel mit einer Zusammensetzung von Chloroforin:Methanol:Essigsäure = 3:3:1 mit zwei Entwicklungsrunden verwendet wurde. Es wurden drei Agarooligosaccharide, d. h. Agarobiose (Rf-Wert = 0,76), Agarotetraose (Rf-Wert = 0,50) und Agarohexaose (Rf-Wert = 0,33) sowie zwei Neoagarooligosaccharide, d. h. Neoagarotetraose (Rf-Wert = 0,59) und Neoagarohexaose (Rf-Wert = 0,41) als Kontrollen verwendet. Als Ergebnis wurden farbbildende Substanzen unter Verwendung von Orcinol-Schwefelsäure an Positionen, die den Neoagarooligosacchariden entsprachen, für das Reaktionsprodukt, das unter Verwendung von Agarase I erhalten wurde, festgestellt. Farbbildende Substanzen wurden an Positionen, die Agarooligosacchariden entsprachen, für das Reaktionsprodukt, das unter Verwendung von Agarase II erhalten wurde, festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Agarase I eine β-Agarase ist, die eine β-1,4-Bindung zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose in einem Agarose-Molekül hydrolysiert, um Neoagarooligosaccharide herzustellen, wohingegen Agarase II eine α-Agarase ist, die eine α-1,3-Bindung in einem Agarose-Molekül hydrolysiert, um Agarooligosaccharide herzustellen.
[Ca-Ionen-Erfordernis]
Die Agarase I-Lösung und die Agarase II-Lösung wurden gegen einen Calcium-freien Puffer (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA enthält), über Nacht dialysiert. Eine Lösung, die Agarose bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) in einem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) enthält, der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA enthält, wurde dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei 50°C für 10 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen in kochendem Wasser für 1 Minute (im Falle von Agarase I) oder bei 75°C für 1 Minute (im Falle von Agarase II) abgestoppt. Dann wurden die Aktivitäten gemessen. Die Aktivität, die gemessen wurde, wenn die Reaktion unter Verwendung eines konventionellen Puffers durchgeführt wurde, der Calcium enthält, wurde als 100% festgelegt. Als Ergebnis zeigten Agarase I und Agarase II ungefähr 100% bzw. ungefähr 60% ihrer Aktivitäten.
[Optimale Temperatur]
Die Temperaturen, bei denen eine Inaktivierung der Enzyme unterdrückt wurde und bei denen die Reaktionen für Agarase I und Agarase II schnell abliefen, betrugen 50 bis 65°C bzw. 45 bis 55°C.
[Thermostabilität]
Die Enzymlösung wurde bei 48°C, 50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für einen bestimmten Zeitraum erhitzt. Eine Lösung mit Agarose bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I), oder 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthielt, wurde zu der erhitzten Lösung gegeben. Das Gemisch wurde bei 50°C für 10 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen in kochendem Wasser für 1 Minute (im Falle von Agarase I) oder bei 75°C für 1 Minute (im Falle von Agarase II) abgestoppt. Dann wurden die Aktivitäten gemessen. Die gemessene Aktivität für eine konventionelle Reaktion bei 50°C für 10 Minuten wurde als 100% festgesetzt. Als ein Ergebnis zeigte Agarase I ungefähr 85% von ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 65°C für 60 Minuten und Agarase II zeigte ungefähr 40% ihrer Aktivität nach einer Behandlung bei 55°C für 10 Minuten.
[Molekulargewicht]
Das Molekulargewicht wurde unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt, wobei ein 10–20% Polyacrylamidgel, das SDS zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad, Myosin (MW 200 000), β-Galactosidase (MW 116 250), Phosphorylase b (MW 97 400), Rinderserumalbumin (MW 66 200), Ovalbumin (MW 45 000), Carboanhydrase (MW 31 000), Trypsin-Inhibitor (MW 21 500), Lysozym (MW 14 400)) enthielt, verwendet wurde.
Die Molekulargewichte von Agarase I und Agarase II betrugen ungefähr 48 000 bzw. ungefähr 117 000, was anhand der Mobilität bestimmt wurde.
[Aminoterminale Aminosäuresequenz]
Die aminoterminalen Aminosäuresequenzen von Agarase I und Agarase II wurden gemäß dem Edman-Abbauverfahren bestimmt. Eine Lösung einer gereinigten Enzympräparation, die Agarase I und Agarase II enthielt, und die ungefähr 10 pmol des Enzymproteins entsprach, wurde einer SDS-PAGE unter Verwendung eines 10–20% Polyacrylamidgradientengels ausgesetzt. Nach der Elektrophorese wurde das auf dem Gel aufgetrennte Enzym auf eine ProBlot-Membran geblottet (Applied Biosystems). Ein Teil der Membran, an der das Enzym adsorbiert worden ist, wurde unter Verwendung des Proteinsequenzierers G1000A (Hewlett Packard) analysiert. Als Ergebnis wurden die aminoterminalen Aminosäuresequenzen von Agarase I (P1; SEQ ID NO: 1) und Agarase II (P2; SEQ ID NO: 2) als Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly bzw. als Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe bestimmt.
[Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz]
Es wurde eine Carboxymethylierung von Cysteinresten unter Verwendung von 2 nmol der gereinigten Agarase I oder II durchgeführt. Die Peptidfragmente wurden aufgetrennt und unter Verwendung von HPLC aus einem Spaltungsprodukt, das durch Verdau mit Lysylendopeptidase erhalten wurde, aufgereinigt. Es wurde μBondasphare C8 (Waters) für die Säule verwendet und Lösung A (0,1% TFA) und Lösung B (0,1% TFA, das 80% Acetonitril enthält) wurden für die Flution verwendet. Die Flution wurde bei einer Flussrate von 0,5 ml/Minute durch Erhöhen des Verhältnisses der Lösung B von 0% auf 100% in 50 Minuten in einer linearen Weise durchgeführt. Die Detektion wurde bei 214 nm für ein Sammeln von Fraktionen durchgeführt. Die entsprechenden Peptidfraktionen wurden Aminosäuresequenzanalysen unterzogen. Für Agarase I wurden die partiellen Aminosäuresequenzen PI3 (SEQ ID NO: 3) und PI4 (SEQ ID NO: 4) bestimmt. Für Agarase II wurden die partiellen Aminosäuresequenzen PII5 (SEQ ID NO: 5), PII6 (SEQ ID NO: 6) und PII7 (SEQ ID NO: 7) bestimmt.
Beispiel 4
Herstellung von Agarooligosacchariden
Agarose L03 wurde zu 2 ml Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt) bei einer Endkonzentration von 1,0% (w/v) gegeben. Es wurden ungefähr 1,0 U der gereinigten Agarase II-Präparation weiter dazu gegeben. Das Gemisch wurde bei 50°C für 16 Stunden umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch über einen 0,22 μm-Filter (Millipore) filtriert. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter denselben Bedingungen, wie sie oben zur Messung der Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung in Beispiel 1 verwendet wurden, analysiert, um die erzeugten Agarooligosaccharide zu bestimmen. Als Ergebnis wurden Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose in dem Reaktionsgemisch nachgewiesen. Es wurde somit bestätigt, dass die oben genannte Enzymreaktion diese kleineren Agarooligosaccharide produziert.
Vergleichsbeispiel 5
Herstellung von Neoagarooligosacchariden
Agarose L03 wurde zu 2 ml Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid enthielt) bei einer Endkonzentration von 1,0% (w/v) gegeben. Ungefähr 1,0 U der gereinigten Agarase I-Präparation wurden weiter dazu gegeben. Das Gemisch wurde bei 65°C für 16 Stunden umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch über einen 0,22 μm-Filter (Millipore) filtriert. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter denselben Bedingungen, die zur Messung der Aktivität der Enzyme in Beispiel 1 verwendet wurden, durchgeführt, um die erzeugten Neoagarooligosaccharide zu bestimmen. Als Ergebnis wurden Neoagarotetraose und Neoagarohexaose in dem Reaktionsgemisch nachgewiesen. Es wurde somit bestätigt, dass die oben genannte Enzymreaktion diese kleineren Neoagarooligosaccharide produziert.
Vergleichsbeispiel 6
Gewinnung von Nukleinsäure aus einem Agarosegel unter Verwendung von Agarase I
1 μg eines DNA-Molekulargewichtsmarkers, λ-HindIII (Takara Shuzo), wurde auf einem 1,0% (w/v) SeaPlaque GTG-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein Gel, das die aufgetrennten DNA-Fragmente mit Größen von ungefähr 4,4 kbp und ungefähr 6,6 kbp enthielt, wurde ausgeschnitten und in ein 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß gegeben. 1 ml eines Reaktionspuffers (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 50 mM Natriumchlorid enthielt) wurde dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen gelassen. Der Puffer wurde dann entfernt und das Gel wurde in dem Gefäß gelassen. Das Gefäß wurde bei 67°C für 5 Minuten zum Schmelzen des Gels inkubiert. 1,0 U des gereinigten Agarase I-Enzyms wurden dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei der Temperatur für 10 Minuten inkubiert. Das Eppendorf-Gefäß wurde auf Eis gegeben, um sicherzustellen, dass das Agarosegel vollständig gelöst war. Es wurde dann eine Ethanolpräzipitation gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt, um die DNA-Fragmente zu gewinnen. In ähnlicher Weise wurde ein DNA-Molekulargewichtsmarker, 100 bp Ladder-Marker (Takara Shuzo), einer Wiedergewinnung von DNA aus einem 3,0% (w/v) NuSieve GTG Agarosegel unterworfen. In diesem Fall wurden DNA-Fragmente mit 400 bp und 500 bp gewonnen. Vergleichsergebnisse der DNA-Gewinnungsraten mit denen einer kommerziell erhältlichen β-Agarase, die von Pseudoalteromonas atlantica (Takara Shuzo) stammen, sind in Tabelle 2 gezeigt.
Wenn die kommerziell erhältliche β-Agarase verwendet wird, sollte die Temperatur von einer Temperatur, die zum Schmelzen eines Agarosegels verwendet wird, auf eine Temperatur, bei der das Enzym wirken kann, vor dem Zusatz des Enzyms abgesenkt werden. Da die Reaktionstemperatur niedrig ist, wird eine lange Reaktionszeit benötigt, und die Zeit, die für das Verfahren benötigt wird, wird verlängert.

Wenn die Agarase I verwendet wird, kann andererseits das Enzym sofort nach dem Schmelzen eines Agarosegels dazugegeben werden. Da die Reaktion bei einer hohen Temperatur durchgeführt werden kann, ohne die Temperatur abzusenken, ist nur ein kurzer Zeitraum für das Verfahren erforderlich. Tabelle 2

Marker	Größe des gewonnenen DNA Fragments	Gewinnungsrate (%)*
Marker	Größe des gewonnenen DNA Fragments	Agarase I	β-Agarase (kommerziell erhältlich)
λ-HindIII	4,4 kbp	78	51
	6,6 kbp	86	55
100 bp Leiter	400 bp	84	32
	500 bp	81	45
Benötigte Zeit**		ca. 30 Min.	ca. 3 Stunden

* Menge gewonnener DNA/Menge eingesetzter DNA × 100.
** Zeit, die bis zu Ethanolpräzipitation benötigt wird.

Beispiel 7
Präparation von chromosomaler DNA aus NAB2-1-1 Ein Liter künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde hergestellt. Pepton (Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden bei Konzentrationen von 0,3% (w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu gegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Agar (Nacalai Tesque) wurde bei einer Konzentration von 0,1% (w/v) dazu gegeben. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven sterilisiert. 10 μl einer Glycerinstammlösung des Agarase-produzierenden Stamms NAB2-1-1 wurden in 2 ml Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. 1 ml der Kultur wurden in 100 ml desselben Mediums angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 × g für 10 Minuten gesammelt. Die Zellen wurden in 10 ml Puffer A (100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 100 mM NaCl und 10 mM EDTA (pH 8,0) enthielt) suspendiert. 0,25 ml einer Lysozym-Lösung (20 mg/ml) wurden dazu gegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. 2,5 ml des Puffers A, der SDS bei einer Konzentration von 5,0% enthielt, wurde dann dazugegeben. Das entstehende Gemisch wurde bei 60°C für 20 Minuten unter Schütteln inkubiert.
1,5 ml einer Protease K-Lösung (20 mg/ml) wurden dazu gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Es wurde dann ein beinahe gleiches Volumen Phenol zu dem Gemisch gegeben und das entstandene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für ungefähr 10 Minuten vorsichtig geschüttelt. Das Gemisch wurde bei 2000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in kaltes Ethanol überführt. Chromosomale DNA wurde unter Verwendung eines Glasstabs aufgewickelt.
Beinahe dasselbe Volumen Phenol wurde zu der Lösung, aus der die chromosomale DNA herausgewickelt worden war, zugegeben und ein ähnliches Verfahren wurde durchgeführt, um die chromosomale DNA erneut aufzuwickeln. Die chromosomale DNA wurde in 10 μl Puffer A suspendiert. 50 μl einer RNase A-Lösung (10 mg/ml) wurden dazu gegeben und das Gemisch wurde bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Die chromosomale DNA wurde von der Lösung durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 5 ml Puffer B (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 140 mM NaCl und 1 mM EDTA (pH 7,5)) suspendiert. Die Suspension wurde gegen denselben Puffer über Nacht dialysiert. Dann wurden ungefähr 5,0 mg der chromosomalen DNA erhalten. Die Reinheit der DNA wurde basierend auf OD260 nm/280 nm untersucht. Der Wert betrug in jedem Fall ungefähr 1,8. Die chromosomale DNA wurde zur Klonierung von Agarase I und Agarase II wie nachstehend beschrieben verwendet.
Vergleichsbeispiel 8
Klonierung des Agarase I-Gens
Gemischte Primer 1 und 2 (SEQ ID NOs: 8 und 9) wurden auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase I, P1 (SEQ ID NO: 1), wie sie in Beispiel 3 bestimmt wurde, entworfen, unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und gereinigt. Insbesondere entsprechen die gemischten Primer 1 und 2, die durch SEQ ID NOs: 8 und 9 repräsentiert sind, den Aminosäuresequenzen der Aminosäurezahlen 4 bis 10 bzw. 4 bis 13 in der Aminosäuresequenz P1. Die Klonierung des Agarase I-Gens wurde unter Verwendung dieser Primer und des LA-PCR-in-vitro-Klonierungskits (Takara Shuzo) durchgeführt.
Eine primäre PCR wurde wie folgt durchgeführt. Die in Beispiel 7 präparierte chromosomale DNA wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Ein BamHI-Adapter wurde an die Termini der verdauten DNA unter Verwendung des DNA-Ligation-Kits (Takara Shuzo) ligiert. Ein Teil davon wurde in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR gegeben. 5 μl 10 × LA-PCR-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 1 μl des gemischten Primer 1, 1 μl des Primer Cl (ein Primer, der im LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo) vorhanden ist), 0,5 μl TakaRa LA Taq und steriles Wasser auf 50 μl wurden dazu zugegeben. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überschichtet wurde, wurde das Gefäß einer Reaktion ausgesetzt, wobei das automatisierte Gen-Amplifikationsgerät Thermal Cycler (Takara Shuzo) verwendet wurde. Nach einer Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Anla gerung von Primer bei 50°C für 2 Minuten und einer Synthesereaktion bei 72°C für 2 Minuten.
Als nächstes wurde eine sekundäre PCR unter Verwendung des Reaktionsgemisches als Matrize durchgeführt. Eine PCR wurde unter denselben Bedingungen wie die der primären PCR durchgeführt, außer dass 1 μl des Reaktionsgemisches, das durch die primäre PCR als Matrize erhalten wurde, sowie eine Kombination der gemischten Primer 2 und des Primers C2 (ein Primer, der in dem LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo) vorhanden ist) verwendet wurden. Nach der PCR wurde die obere Mineralölschicht entfernt und 5 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Färbung der DNA mit Ethidiumbromid, um das Amplifikationsprodukt zu bestätigen. Als Ergebnis wurde ein ungefähr 0,8 kb DNA-Fragment nachgewiesen. Das DNA-Fragment wurde als βN bezeichnet.
Das amplifizierte βN-Fragment, das von dem Agarosegel ausgeschnitten worden war, wurde in einen pT7Blue-Vektor ligiert und verwendet, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen des amplifizierten Fragments βN wurden unter Verwendung einer Transformante gemäß des Didesoxykettenterminationsverfahrens bestimmt. Primer 3 und 4 (SEQ ID NOs: 10 und 11) wurden basierend auf der Sequenz der N-terminalen Region entworfen. Primer 5 und 6 (SEQ ID NOs: 12 und 13) wurden basierend auf der Sequenz der terminalen Region, die eine andere als die N-terminale Region ist, entworfen. Sie wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und dann gereinigt. DNA-Fragmente stromaufwärts und stromabwärts von βN wurden auf ähnliche Weise kloniert, indem diese Primer und der LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo) verwendet wurden. In diesem Fall lagerten sich die Primer bei 55°C für eine Minute an.
Für die stromaufwärts gelegene Region wurden die Primer 3 und 4 verwendet, um ein DNA-Fragment von ungefähr 0,6 kb zu erhalten, das als βUN bezeichnet wurde. Für die Region stromabwärts von βN wurden die Primer 5 und 6 verwendet, um ein DNA-Fragment von ungefähr 1,3 kb zu erhalten, das als βC bezeichnet wurde. Sowohl βUN als auch βC wurden in den pT7Blue-Vektor (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenzen wurden gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente βN, βUN und βC wurden analysiert und abgeglichen. Als Ergebnis wurde ein ORF, das für ein Protein kodiert, das aus 438 Aminosäuren besteht, gefunden.
Die Nukleotidsequenz des ORFs und die Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz des ORFs kodiert wird, sind in SEQ ID NO: 20 bzw. 22 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass in βUN eine Nukleotidsequenz für die Aminosäuresequenz P1, eine Nukleotidsequenz, die für 20 Aminosäuren stromaufwärts der Aminosäuresequenz P1 kodiert, und eine SD-ähnliche Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region vorhanden sind.
Die in Beispiel 3 bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz P1 entspricht der Sequenz ausgehend von der 21. bis zur 33. Aminosäure in der SEQ ID NO: 22. Die partiellen Aminosäuresequenzen PI3 (SEQ ID NO: 3) und PI4 (SEQ ID NO: 4), die in Beispiel 3 bestimmt wurden, stimmen mit den Sequenzen ausgehend von der 265. bis zur 272. Aminosäure bzw. der 367. bis zur 376. Aminosäure in der SEQ ID NO: 22 überein.
Beispiel 9
Klonierung des Agarase II-Gens
Die gemischten Primer 7 und 8 (SEQ ID NOs: 14 und 15) wurden auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase II, P2 (SEQ ID NO: 2) und PII6 (SEQ ID NO: 6), entworfen, die wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt wurden. Sie hybridisieren an Stränge, die sich voneinander unterscheiden. Die gemischten Primer wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und dann gereinigt.
Insbesondere entspricht der gemischte Primer 7, der durch SEQ ID NO: 14 repräsentiert ist, den Aminosäurezahlen 1–8 in der Aminosäuresequenz P2 und der gemischte Primer 8, der durch SEQ ID NO: 15 repräsentiert ist, entspricht einem komplementären Strang einer DNA, die für die Aminosäurezahlen 2–10 in der Aminosäuresequenz PII6 kodiert.
Die Klonierung des Agarase II-Gens wurde unter Verwendung dieser Primer und des LA-PCR-in-vitro-Klonierungskits (Takara Shuzo) durchgeführt.
Eine primäre PCR wurde wie folgt durchgeführt. 10 ng der chromosomalen NAB2-1-1-DNA, die in Beispiel 7 präpariert wurde, wurden in ein 0,5 ml-Gefäß für eine PCR gegeben. 5 μl von 10 × LA-PCR-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 40 pmol von jedem der gemischten Primer 7 und 8, 0,5 μl TakaRa LA Taq und steriles Wasser auf 50 μl wurden zugegeben. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überschichtet worden war, wurde das Gefäß unter Verwendung des automatisierten Gen-Amplifikationsinstruments Thermal Cycler (Takara Shuzo) einer Reaktion ausgesetzt. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, einer Anlagerung von Primer bei 50°C für 2 Minuten und der Synthesereaktion bei 72°C für 2 Minuten. Die obere Schicht des Mineralöls wurde entfernt und 5 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Färbung der DNA mit Ethidiumbromid, um das Amplifikationsprodukt zu bestätigen. Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 600 bp nachgewiesen. Das DNA-Fragment wurde als αN bezeichnet.
Das amplifizierte Fragment αN, das aus dem Agarosegel ausgeschnitten wurde, wurde in den Vektor pP7Blue ligiert und verwendet, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen des amplifizierten Fragments αN wurden unter Verwendung einer Transformante gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren bestimmt. Die Primer 9 und 10 (SEQ ID NOs: 16 und 17) wurden auf der Basis der Sequenz der N-terminalen Region entworfen. Die Primer 11 und 12 (SEQ ID NOs: 18 und 19) wurden auf der Basis der Sequenz der terminalen Region, die eine andere ist als die N-terminale Region, entworfen. Sie wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und dann gereinigt. DNA-Fragmente stromaufwärts und stromabwärts von αN wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung dieser Primer und des LA-PCR-in-vitro-Klonierungskits (Takara Shuzo) kloniert.
In diesem Fall wurde eine PCR wie folgt durchgeführt. Die chromosomale NAB2-1-1-DNA, die in Beispiel 7 präpariert wurde, wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Ein BamHI-Adapter wurde an die Termini der verdauten DNA unter Verwendung des DNA Ligation Kits (Takara Shuzo) ligiert. Ein Teil davon wurde in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR gegeben. Es wurden 5 μl von 10 × LA PCR-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 1 μl des Primers 9, 1 μl des Primers Cl, 0,5 μl TaKaRa LA Taq und steriles Wasser auf 50 μl zugegeben. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überschichtet worden war, wurde das Gefäß einer Reaktion unter Verwendung des automatisierten Gen-Amplifikationsinstruments Thermal Cycler (Takara Shuzo) unterzogen. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, einer Anlagerung von Primern bei 50°C für 2 Minuten und einer Synthesereaktion bei 72°C für 3 Minuten.
Als nächstes wurde eine sekundäre PCR unter Verwendung des Reaktionsgemisches als Matrize durchgeführt. Eine PCR wurde unter denselben Bedingungen durchgeführt wie diejenigen der primären PCR, außer dass 1 μl des Reaktionsgemisches, das durch die primäre PCR erhalten wurde, als Matrize sowie eine Kombination des Primers 10 und des Primers C2 verwendet wurden. Die obere Schicht des Mineralöls wurde entfernt und 5 μl des Reaktionsgemisches wurde einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Färbung der DNA mit Ethidiumbromid, um das Amplifikationsprodukt zu bestätigen. Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 500 bp nachgewiesen. Das DNA-Fragment wurde als αUN bezeichnet.
In ähnlicher Weise wurden die Primer 11 und 12 verwendet, um ein ungefähr 2 kb DNA-Fragment stromabwärts von αN zu erhalten, das als αC bezeichnet wurde. Sowohl αUN als auch αC wurden in den Vektor pT7Blue (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenzen wurden gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente αN, αUN und αC wurden analysiert und abgeglichen. Als Ergebnis wurde ein ORF gefunden, das für ein Protein kodiert, das aus 1089 Aminosäuren besteht. Die Nukleotidsequenz des ORF und die Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz des ORFs kodiert wird, sind in den SEQ ID NOs: 21 bzw. 23 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass in αUN eine Nukleotidsequenz für die Aminosäuresequenz P2, eine Nukleotidsequenz, die für 26 Aminosäuren mit einer Signalpeptid-ähnlichen Sequenz stromaufwärts der Aminosäuresequenz P2 kodiert, und eine SD-ähnliche Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region vorkommen.
Die Aminosäuresequenz P2 entspricht der Sequenz von der 27. bis zur 36. Aminosäure in SEQ ID NO: 23. Die partiellen Aminosäuresequenzen PII5 (SEQ ID NO: 5), PII6 (SEQ ID NO: 6) und PII7 (SEQ ID NO: 7), die in Beispiel 3 bestimmt wurden, stimmen mit den Sequenzen der 129. bis 138. Aminosäure, der 640. bis 649. Aminosäure bzw. 738. bis 747. Aminosäure in SEQ ID NO: 23 überein.
Weiter wurden drei vermeintliche Ca-Bindungsregionen (171–184, 271–283 und 987–999 in SEQ ID NO: 23) gefunden.
Vergleichsbeispiel 10
Konstruktion eines Plasmids zur Expression von Agarase I
Der Primer 13 (SEQ ID NO: 24) ist eine synthetische DNA, die eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI bei den Nukleotidzahlen 12 bis 17 und eine Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 21 bis 27 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 22 entspricht, bei den Nukleotidzahlen 19 bis 38 besitzt. Es wurde eine PCR wie folgt unter Verwendung von Primer 13 und Primer 14 (SEQ ID NO: 25), der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym PstI bei den Nukleotidzahlen 11 bis 16 hat und an einen Strang hybridisiert, der zu einem Teil ungefähr 300 bp stromabwärts von dem Leseraster für Agarase I auf dem Chromosom komplementär ist, durchgeführt. 10 pmol von jedem Primer 13 und 14, 10 ng der chromosomalen DNA von NAB2-1-1 als Matrize, 5 μl 10 × ExTaq-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 0,5 μl TakaRa ExTaq und steriles Wasser auf 50 μl wurden in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR gegeben. Das Gefäß wurde in das automatisiertes Gen-Amplifikationsinstrument Thermal Cycler (Takara Shuzo) gegeben. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 25 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Das PCR-Produkt wurde konzentriert und durch Ethanolpräzipitation entsalzt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI (Takara Shuzo) und PstI (Takara Shuzo) doppelt verdaut und dann einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen. Der EcoRI-PstI-Verdau wurde extrahiert und aufgereinigt. Das gereinigte Produkt wurde mit pUC 18 (Takara Shuzo), das mit denselben Enzymen verdaut worden war, gemischt und die Ligation wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kits (Takara Shuzo) durchgeführt. 10 μl des Ligationsgemisches wurden verwendet, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB Medium, das Agar bei einer Konzentration von 1,5% (w/v) und Ampicillin bei einer Konzentration von 50 μg/ml enthält, wachsen gelassen. Plasmide wurden aus weißen Kolonien präpariert und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt. Ein Plasmid, in das das PCR-Produkt richtig eingefügt war, wurde ausgewählt und als pNB 101 bezeichnet. pNB 101 ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 21 bis 437 in der Aminosäuresequenz von Agarase I (SEQ ID NO: 22) kodiert. Escherichia coli, das mit dem Plasmid pNB 101 transformiert worden war, wurde als Escherichia coli JM109/pNB101 bezeichnet und am 10. Januar 2001 (dem Datum der ursprünglichen Hinterlegung) bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, RIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305–8566, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-7854 hinterlegt.
Die Transformante, in die pNB101 eingebracht worden war, wurde in 2,5 ml LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 2,5 ml desselben frischen Mediums angeimpft und bei 37°C kultiviert, bis eine exponentielle Wachstumsphase erreicht wurde. Zur selben Zeit wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 20°C für weitere 2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse einzuleiten. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 150 μl einer Zellzertrümmerungslösung (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid enthielt) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Sonifizierung aufgebrochen. Der Überstand und das Präzipitat eines Extrakts wurden voneinander durch Zentrifugation getrennt und als Proben für die Messungen der β-Agarase-Aktivitäten unter Verwendung von Agarose als Substrat eingesetzt. Dann wurde Aktivität für den Überstand des Extrakts nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml Kultur enthalten war, war ungefähr um das 25-fache höher als die des Wildtyp-Stamms NAB2-1-1.
Vergleichsbeispiel 11
Expressionssystem für Agarase I unter Verwendung von pET16b
Eine PCR wurde unter Verwendung des Primers 15 (SEQ ID NO: 26) und des Primers 16 (SEQ ID NO: 27) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Matrize unter den Bedingungen wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. Der Primer 15 ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 21 bis 27 in der Aminosäuresequenz der Agarase I (SEQ ID NO: 22) entspricht, an den Nukleotidzahlen 20 bis 39 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NdeI an den Nukleotidzahlen 14 bis 19 besitzt. Der Primer 16 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym XhoI an den Nukleotidzahlen 12 bis 17 enthält und an einen Strang hybridisiert, der zu einem Teil ungefähr 300 bp stromabwärts von dem Leseraster für Agarase I auf dem Chromosom komplementär ist. Das amplifizierte Fragment wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert, mit NdeI (Takara Shuzo) und XhoI (Takara Shuzo) verdaut, extrahiert und aufgereinigt.
Das Produkt wurde in pET16b (Takara Shuzo) ligiert, das mit denselben Enzymen verdaut worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pNB201 bezeichnet. pNB201 ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 21 bis 437 in der Aminosäuresequenz von Agarase I (SEQ ID NO: 22) kodiert.
pNB201 wurde verwendet, um Escherichia coli BL21(DE3)pLysS zu transformieren und die entstandene Transformante wurde verwendet, um die β-Agarase-Aktivität wie oben in Beispiel 10 beschrieben zu bestimmen. Dann wurde Aktivität für den Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das 50-fache höher als die von NAB2-1-1.
Beispiel 12
Konstruktion eines Plasmids zur Expression von Agarase II
Der Primer 17 (SEQ ID NO: 28) ist eine synthetische DNA, die eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI bei den Nukleotidzahlen 10 bis 15 und eine Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 27 bis 33 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) entspricht, bei den Nukleotidzahlen 17 bis 37 aufweist. Es wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 17 und Primer 18 (SEQ ID NO: 29), der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BamHI bei den Nukleotidzahlen 11 bis 16 besitzt und an einen Teil ungefähr 250 bp stromabwärts von dem Leseraster für Agarase II auf dem Chromosom hybridisiert, durchgeführt. 10 pmol von jedem Primer 17 und 18 sowie 10 ng chromosomale DNA von dem Wildtyp-Stamm NAB2-1-1 als Matrize wurden für die PCR in einem Reaktionssystem unter Verwendung von ExTaq (Takara Shuzo) verwendet. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 94°C für 1 Minute, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Das PCR-Produkt wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert, mit den Restriktionsenzymen EcoRI (Takara Shuzo) und BamHI (Takara Shuzo) doppelverdaut, und dann einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen. Der EcoRI-BamHI-Verdau wurde extrahiert und aufgereinigt. Ein Hybridplasmid unter Verwendung von pUC 18 wurde wie in Beispiel 10 beschrieben konstruiert und verwendet, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Das Hybridplasmid wurde als pNA101 bezeichnet. pNB 101 ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 27 bis 1089 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert.
Escherichia coli, das mit dem Plasmid pNA101 transformiert ist, wurde als Escherichia coli JM109/pNA101 bezeichnet und am 10. Januar 2001 (dem Datum der ursprünglichen Hinterlegung) am International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, RIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305–8566, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-7853 hinterlegt.
Die Transformante, in die pNA 101 eingebracht worden war, wurde Messungen von α-Agarase-Aktivitäten wie in Beispiel 10 beschrieben unterworfen, außer dass 10 mM Calciumchlorid in dem Zellaufbruchprodukt enthalten waren. Es wurde eine Aktivität für den Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das 15-fache höher als die des Wildtyp-Stamms NAB2-1-1.
Beispiel 13
Aktivität des Agarase II-Proteins mit Deletion
Ein modifiziertes Protein wurde mittels genetischer Manipulation wie unten beschrieben präpariert. Die α-Agarase-Aktivität des modifizierten Proteins wurde bestimmt.
Der Primer 19 (SEQ ID NO: 30) ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz entsprechend den Aminosäurezahlen 181 bis 188 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) bei den Nukleotidzahlen 19 bis 40 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI bei den Nukleotidzahlen 12 bis 17 aufweist.
Es wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 19 und Primer 18 (SEQ ID NO: 29) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Matrize durchgeführt. Das Produkt wurde an pUC 18 ligiert und es wurde eine Transformation von Escherichia coli JM109 wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt. Ein Hybridplasmid, das erhalten wurde, indem die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle bestätigt wurde, wurde als pNA201d bezeichnet. In dem Protein, das aus pNA201d exprimiert wurde, ist ein Teil bis zu der Aminosäurezahl 180 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert. Mit anderen Worten, pNA201d ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 181 bis 1089 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Nach der Induktion der Expression unter Verwendung von IPTG wurden Messungen der Aktivitäten wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, außer dass 10 mM Calciumchlorid in dem Zellzertrümmerungsprodukt enthalten war. α-Agarase-Aktivität wurde für den Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das 2-fache höher als die von NAB2-1-1.
Der Primer 20 (SEQ ID NO: 31) besitzt eine Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 318 bis 325 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) entspricht, bei den den Nukleotidzahlen 19 bis 40 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI bei den Nukleotidzahlen 12 bis 17. Es wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 20 und Primer 18 (SEQ ID NO: 29) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Matrize durchgeführt, um ein Hybridplasmid mit pUC18, pNA301d, zu konstruieren. Ein Protein, bei dem ein Peptid bis zu der Aminosäurezahl 317 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert ist, wurde in Escherichia coli JM109, bei dem pNA301d eingebracht worden war, exprimiert. Mit anderen Worten, pNA301d ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 318 bis 1089 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Messungen der Aktivitäten wurden wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, außer dass 10 mM Calciumchlorid in dem Zellzertrümmerungsprodukt enthalten war. α-Agarase-Aktivität wurde für den Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das 15-fache höher als die von NAB2-1-1. Weiter wurde ein Extrakt, der von einer Transformante stammte, bei der pNA301d eingebracht worden war, gegen einen Calcium-freien Puffer dialysiert (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (pH 7,2) enthielt) und dann mit einer Lösung mit Agarose bei einer Konzentration von 0,2% in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (pH 7,2) enthielt, umgesetzt. Als ein Ergebnis wurde eine Spaltungsaktivität ähnlich zu der, die bei Verwendung eines Puffers, der Calcium enthielt, festgestellt wurde, festgestellt.
Vergleichsbeispiel 14
Vergleich mit AgarACE-Enzym (Promega)
[Optimale Temperatur]
Die enzymologischen Eigenschaften von Agarase I wurden mit denen des AgarACE-Enzyms, einer β-Agarase, die von dem marinen Flavobakterium stammt und die von Promega verkauft wird, verglichen.
10 μl von Agarase I oder des AgarACE-Enzyms (Promega, entsprechend 0,29 Einheiten gemäß dem beiliegenden Datenblatt) wurden zu 40 μl 1,0% (w/v) NuSieve GTG Agarose gegeben, die durch Erhitzen in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,3) gelöst worden war (FMC). Das Gemisch wurde bei 45°C, 50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für 10 Minuten umgesetzt. Die Aktivitäten beider Enzyme wurden vorher gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Dann wurden die Enzyme zugegeben, so dass dieselben enzymatischen Aktivitäten in den entsprechenden Reaktionen vorhanden waren. Nach der Reaktion wurden die enzymatischen Aktivitäten wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet. Die maximale enzymatische Aktivität wurde als 100% festgesetzt und die Ergebnisse sind als relative Werte in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, ist die optimale Temperatur von Agarase I 50°C bis 65°C und die optimale Temperatur des AgarACE-Enzyms ist 45°C bis 50°C. Tabelle 3

Relative Aktivität (%)

45°C 50°C 55°C 60°C 65°C 70°C

Agarase I 89 97 100 100 100 95

AgarACE 100 98 84 25 11 0
[Thermostabilität]

10 μl von Agarase I oder des AgarACE-Enzyms (entsprechend 0,29 Einheiten gemäß dem beiliegenden Datenblatt) wurden bei 60°C oder 65°C für einen gegebenen Zeitraum inkubiert und dann zu 40 μl 1,0% (w/v) NuSieve GTG Agarose gegeben, die durch Erhitzen in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,3) gelöst worden war (FMC). Die Enzyme wurden so zugegeben, dass dieselben enzymatischen Aktivitäten in den entsprechenden Reaktionen wie oben beschrieben enthalten waren. Das Gemisch wurde bei 55°C für 10 Minuten (im Falle von Agarase I) oder 45°C für 10 Minuten (im Falle von AgarACE-Enzym) umgesetzt. Die enzymatischen Aktivitäten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet. Die Aktivität ohne Erhitzen wurde als 100% festgesetzt und die Ergebnisse sind als relative Werte in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, wurden fast 100% der Aktivität von Agarase I nach der Inkubation bei 65°C für 10 Minuten beibehalten, während das AgarACE-Enzym vollständig nach der Inkubation bei 65°C für 10 Minuten inaktiviert war. Tabelle 4

Verbleibende Aktivität (%)
Inkubationszeit (Minuten)	0	10	20	30
Agarase I
(60°C)	100	100	100	98
(65°C)	100	100	95	90
AgarACE
(60°C)	100	81	48	21
(65°C)	100	3	0	0

Beispiel 15
Veränderung der Thermostabilität des Enzyms durch Calcium
Escherichia coli JM109, das mit pNA101 (Beispiel 11) oder pNA301d (Beispiel 13) transformiert worden war, wurde in 2,5 ml LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums angeimpft und bei 37°C kultiviert, bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichte. Nach dieser Zeit wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 20°C für weitere 2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse zu induzieren. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 5 ml einer Zellzertrümmerungslösung (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM Calciumchlorid enthielt) suspendiert. Die Zellen wurden durch Sonifizierung zertrümmert. Ein Überstand wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die α-Agarase-Aktivität in dem Überstand wurde gemessen. Der Überstand wurde mit der Zellzertrümmerungslösung so verdünnt, dass dieselbe enzymatische Aktivität in einem Einheitsvolumen für jede Probe vorhanden war. Der so erhaltene Extrakt für jedes Enzym wurde über Nacht gegen Puffer A (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 10 mM Calciumchlorid enthielt), der Calcium enthielt, oder Puffer B (20 mM Tris-HCl (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (pH 7,2) enthielt), der kein Calcium enthielt, dialysiert. 20 μl der Enzymlösung wurden bei 55°C oder 50°C für 10 Minuten inkubiert und dann mit 180 μl einer Lösung mit Agarose bei einer Konzentration von 0,2% in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid enthielt, umgesetzt. Die verbleibende α-Agarase-Aktivität wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Native Agarase II, die von NAB2-1-1 erhalten worden war, wurde als eine Kontrolle verwendet. Tabelle 5

Verbleibende Aktivität (%)*

Behandlungstemperatur 50°C 55°C

Puffer A B A B

Native Agarase II 100 56 42 10

pNA101 100 60 45 15

pNA301d 100 58 70 12

* Die verbleibende Aktivität nach Behandlung bei 50°C in Puffer A wurde für jedes Enzym als 100 definiert.

Beispiel 16
Aktivität von Agarase II-Protein mit Deletion
Ein modifiziertes Protein wurde mittels genetischer Manipulation wie unten beschrieben präpariert. Die α-Agarase-Aktivität des modifizierten Proteins wurde bestimmt.
Der Primer 21 (SEQ ID NO: 34) besitzt eine Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 290 bis 297 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) entspricht, bei den Nukleotidzahlen 19 bis 40 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI bei den Nukleotidzahlen 12 bis 17.
Eine PCR wurde unter Verwendung von Primer 21 und Primer 18 (SEQ ID NO: 29) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Matrize durchgeführt. Das Produkt wurde an pUC 18 ligiert und eine Transformation von Escherichia coliJM109 wurde wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt. Ein Hybridplasmid, das erhalten wurde, indem die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle bestätigt wurde, wurde als pNA401d bezeichnet. In dem Protein, das aus pNA401d exprimiert wurde, ist ein Teil bis zu der Aminosäurezahl 289 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert. Mit anderen Worten, pNA401d ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 290 bis 1089 in der Aminosäuresequenz von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Escherichia coli JM109, das mit pNA301d, das in Beispiel 13 erhalten wurde, oder mit pNA401d, das wie oben beschrieben erhalten wurde, transformiert worden war, wurde in 2,5 ml LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums angeimpft und bei 37°C kultiviert, bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichte. Zu dieser Zeit wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 20°C für weitere 2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse zu induzieren. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 5 ml einer Zellzertrümmerungslösung (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 10 mM Calciumchlorid enthielt) suspendiert.
Die Zellen wurden durch Sonifizierung zertrümmert. Ein Überstand wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die α-Agarase-Aktivität in dem Überstand wurde gemessen. Der Überstand wurde mit der Zellzertrümmerungslösung so verdünnt, dass dieselbe enzymatische Aktivität in einem Einheitsvolumen für jede Probe enthalten war. 20 μl der Enzymlösung wurden bei 55°C oder 60°C für 10 Minuten inkubiert und dann mit 180 μl einer Lösung mit Agarose bei einer Konzentration von 0,2% in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid enthielt, umgesetzt. Die verbleibende α-Agarase-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Thermostabilität des Produkts von pNA401d gleich oder höher als die von pNA301d ist.
Native Agarase II, die von NAB2-1-1 erhalten worden war, wurde als eine Kontrolle verwendet. Tabelle 6

Verbleibende Aktivität (%)*

Behandlungstemperatur 55°C 60°C

Native Agarase II 42 0

pNA301d 70 31

pNA401d 79 39

* Die verbleibende Aktivität nach der Behandlung bei 50°C wurde für jedes Enzym als 100 definiert.

Weiter wurde ein Überstand durch Zentrifugation nach Induktion mit IPTG bei 37°C über Nacht gesammelt, gefolgt von einer Zertrümmerung der Zellen durch Sonifizierung, wie oben beschrieben. Der Proteingehalt des Überstandes wurde quantifiziert. Der Überstand wurde einer SDS-PAGE ausgesetzt, so dass dieselbe Menge von Protein geladen wurde. Zusätzlich wurde das nach Sammeln des Überstandes erhaltene Präzipitat in der Zellzertrümmerungslösung suspendiert und einer SDS-PAGE auf ähnliche Weise ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die Menge des Proteins von Interesse in dem Überstand, der unter Verwendung von pNA401d erhalten wurde, bei der Induktion höher war als die Menge des Proteins von Inte resse in dem Überstand, der unter Verwendung des nativen Typs oder pNA301d erhalten wurde. Daher wurde gezeigt, dass die mutante α-Agarase, die durch Induktion von Escherichia coli JM109, das mit pNA401d transformiert worden war, exprimiert wurde, leicht gelöst werden konnte.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Erfindung stellt eine neue Agarase bereit. Die optimale Temperatur der erfindungsgemäßen Agarase ist höher als die einer konventionellen Agarase und die Agarase ist hervorragend thermostabil. Daher kann sie für Reaktionen bei einer hohen Temperatur verwendet werden. Daher ist die erfindungsgemäße Agarase hervorragend wirksam, weil sie Reaktionen in der Gegenwart von Agarose bei einer hohen Konzentration ohne Erstarren ermöglicht.
Es ist möglich, Agarooligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden und mit 3,6-Anhydro-L-Galaktose an deren reduzierenden Enden (z. B. Agarobiose und Agarotetraose) direkt aus Agarose unter Verwendung der erfindungsgemäßen Agarase effizient herzustellen.
Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Agarase hergestellten Agarooligosaccharide besitzen physiologische Aktivitäten, wie z. B. Apoptose-induzierende Aktivität, karzinostatische Aktivität, verschiedene Antioxidanzien-Aktivitäten, immunregulatorische Aktivität und antiallergene Aktivität. Daher sind sie auf den Gebieten von pharmazeutischen Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln und Getränken verwendbar.
Die Erfindung offenbart zum ersten Mal die Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz der Agarase. Daher ist es möglich, ein Gen bereitzustellen, das für ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität kodiert. Die Erfindung stellt auch ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Agarase-Aktivität durch genetische Manipulation unter Verwendung dieses Gens bereit.
Weiter wird der Zusatz von Agarose zu einem Medium zur Induktion der Herstellung der Agarase in dem Herstellungsverfahren durch genetische Manipulation unter Verwendung dieses Gens nicht benötigt. Daher kann bei der Kultivierung viel Arbeit erspart werden und das Enzym ist leicht aufzureinigen.
Zusätzlich kann, basierend auf der durch die Erfindung bereitgestellten Information über das Agarase-Gen, ein rekombinantes Polypeptid, das durch das Gen kodiert wird, ein Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid oder ein Fragment davon bindet, sowie eine Sonde oder ein Primer, die/der spezifisch an die Agarase hybridisiert, bereitgestellt werden. Sequenzprotokoll – freier Text

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Agarase, die eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (i) einer Aminosäuresequenz, die aus 772 Resten von der Aminosäurezahl 318 bis zu der Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht, (ii) einer Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 und (iii) einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 hybridisierbar ist, wobei die Agarase eine Aktivität zur Hydrolyse einer alpha-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose aufweist.
Agarase gemäß Anspruch 1, die aus einem Mikroorganismus NAB2-1-1, wie hinterlegt unter FERM BP-7855, erhältlich ist.
Gen, das für die in Anspruch 1 definierte Agarase kodiert.
Gen gemäß Anspruch 3, das aus einem Mikroorganismus NAB2-1-1, wie hinterlegt unter FERM BP-7855, erhältlich ist.
Gen gemäß Anspruch 3, das eine Nukleotidsequenz enthält, die aus 2316 Nukleotiden von der Nukleotidzahl 952 bis zu der Nukleotidzahl 3267 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21 besteht.
Gen, das mit dem in Anspruch 5 definierten Gen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für eine Agarase mit einer Aktivität zur Hydrolyse einer alpha-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose kodiert.
Rekombinantes DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Gen, das für eine Agarase kodiert, die eine Aminosäuresequenz enthält, die aus 772 Resten von der Aminosäurezahl 318 bis zu der Aminosäurezahl 1089 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 besteht, (b) einem Gen, das mit dem in Anspruch 5 definierten Gen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für eine Agarase mit einer Aktivität zur Hydrolyse einer alpha-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose kodiert, und (c) einem Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens 70% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 aufweist, und für eine Agarase mit einer Aktivität zur Hydrolyse einer alpha-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anydro-L-Galactose und D-Galactose kodiert.
Isolierte transformierte Zelle, die das in Anspruch 7 definierte rekombinante DNA-Molekül trägt.
Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 1 definierten Agarase, wobei das Verfahren ein Kultivieren eines Mikroorganismus NAB2-1-1, wie hinterlegt unter FERM BP-7855, und ein Gewinnen der Agarase aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Agarase, wobei das Verfahren ein Kultivieren der in Anspruch 8 definierten transformierten Zelle und ein Gewinnen einer Agarase aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids, wobei das Verfahren ein Spalten von Agarose mit der in Anspruch 1 definierten Agarase und ein Gewinnen eines Agarooligosaccharids aus dem Spaltprodukt umfasst.
Verfahren zum Verbessern der Thermostabilität der in Anspruch 1 definierten Agarase, wobei das Verfahren ein Deletieren eines Polypeptids, das bis zu 30% der Agarase ausgehend von dem N-Terminus ausmacht, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei ein Polypeptid, das bis zu 30% einer Agarase mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23 ausgehend von dem N-Terminus ausmacht, deletiert wird.