DE60224004T2

DE60224004T2 - Verwendung von il-18 hemmern zur behandlung und/oder prävention von herzkrankheiten

Info

Publication number: DE60224004T2
Application number: DE60224004T
Authority: DE
Inventors: Charles Boulder DINARELLO; Benjamin University City POMERANTZ; Leonid Denver REZNIKOV; Alden Littleton HARKEN; Yolande Chvatchko
Original assignee: Laboratoires Serono SA; Serono Laboratories UK Ltd
Current assignee: Merck Serono SA; Serono Laboratories UK Ltd
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2022-01-29
Also published as: ES2295332T3; EA006767B1; IL157024A; CA2435466A1; US20040234523A1; CY1107203T1; EE05534B1; UA80676C2; EA200300844A1; HUP0303306A2; IL157024A0; KR20030070143A; NO331083B1; EP1355668B1; ATE380558T1; ME00549B; EP1355668A1; EE200300328A; CZ305653B6; JP4860897B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich von Herzkreislauferkrankungen. Im Spezielleren betrifft sie die Verwendung eines Inhibitors von IL-18 zur Behandlung und/oder Verhinderung von Kardiomyopathie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Cytokin Interleukin 18 (IL-18) wurde ursprünglich beschrieben als ein Interferon-γ(IFN-γ)-Induktionsfaktor (Nakamura et al., 1989). Es ist ein frühes Signal in der Entwicklung von T-Lymphozyt-Helferzell Typ 1(TH1)-Antworten. IL-18 wirkt zusammen mit IL12, IL-2, Antigenen, Mitogenen und möglichen weiteren Faktoren zur Induktion der Produktion von IFN-γ. IL-18 verstärkt auch die Produktion von GM-CSF und IL-2, verstärkt Anti-CD3-induzierte T-Zell-Proliferation und erhöht Fas-vermittelte Abtötung durch natürliche Killerzellen.
Reifes IL-18 wird aus seinem Vorläufer durch das IL-1β-Konvertierungsenzym (ICE, Caspase-1) produziert.
Der IL-18-Rezeptor besteht aus mindestens zwei Komponenten, die in der Ligandenbindung zusammenarbeiten. Hoch- und Niederaffinitätsbindungsstellen für IL-18 wurden gefunden in Maus-IL-12-stimulierten T-Zellen (Yoshimoto et al., 1998), wodurch ein Mehrkettenrezeptorkomplex nahegelegt wird. Die Rezeptoruntereinheiten sind insoweit identifiziert worden, dass beide zu der IL-1-Rezeptorfamilie gehören (Parnet et al., 1996; Kim et al. 2001). Die Signalübertragung von IL-18 umfasst Aktivierung von NF-κB (DiDonato et al., 1997). Der IL-18-Rezeptorkomplex besteht aus zwei Rezeptorketten: einer Ligandenbindungskette, die als die IL18Rα-Kette bezeichnet wird und einer Signal-Übertragungskette, die als die IL-18Rβ-Kette bezeichnet wird. Die IL-18R-Kette wurde ursprünglich isoliert als ein Zelloberflächenprotein, das an radioaktiv markiertes IL-18 bindet; das Protein wurde gereinigt und seine Aminosäuresequenz zeigte Identität mit einem früher beschriebenen Orphan-Rezeptor, der als das mit IL-1R verwandte Protein (IL-1Rrp) bezeichnet wurde (Torigoe et al., 1997).
Kürzlich ist ein lösliches Protein mit einer hohen Affinität für IL-18 isoliert wurden aus humanem Urin und die humanen und Maus-cDNAs als auch das humane Gen wurden kloniert (Novick et al., 1999; WO 99/09063 ). Das Protein wurde als IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP) bezeichnet.
IL-18BP ist nicht die extrazelluläre Domäne von einem der bekannten IL18-Rezeptoren, sondern ein sekretiertes, natürlich zirkulierendes Protein. Es gehört zu einer neuen Familie von sekretierten Proteinen, weiterhin umfassend mehrere Pockenvirus-codierte Proteine (Novick et al., 1999). Urinäres als auch rekombinantes IL-18BP bindet spezifisch IL-18 mit einer hohen Affinität und moduliert die biologische Aktivität von IL-18.
Das IL-18BP-Gen wurde lokalisiert auf dem humanen Chromosom 11q13 und es wurde kein Exon gefunden, das für eine Transmembrandomäne in einer genomischen 8,3 kb-Sequenz codiert. Vier Spleißvarianten oder Isoformen von IL-18BP, erzeugt durch alternatives mRNA-Spleißen, sind bisher in Menschen gefunden worden. Sie wurden bezeichnet als IL-18BPa, b, c und d, wobei alle den gleichen N-Terminus aufweisen und sich unterscheiden im C-Terminus (Novick et al., 1999). Diese Isoformen variieren in ihrer Fähigkeit zum Binden von IL-18. Unter den vier genannten ist von den hIL-18BP-Isoformen a und c bekannt, dass sie eine neutralisierende Kapazität für IL-18 haben. Die humane IL-18BP-Isoform a kreuzreagiert mit Maus-IL-18.
Herzerkrankungen sind definiert als Störungen, die den Herzmuskel oder die Blutgefäße des Herzens beeinträchtigen (The Merck Manual Home Edition, www.merck.com). Eine Gefäßstörung ist eine Blutgefäßproblematik, wie etwa schlechter Kreislauf, verursacht durch Blockierung. Herzkrankheiten werden auch als kardiovaskuläre bzw. Herzgefäßstörungen bezeichnet.
Ischämische Herzkrankheit ist eine allgemeine Ursache von Herzversagen und ist die häufigste Todesursache in westlichen Gesellschaften. Sie ist üblicherweise zurückzuführen auf Koronararterienatherom. Myokardläsionen umfassen ischämische Fibrose und akuten Infarkt. Unter normalen Bedingungen ist der Blutfluss in Arterien eng abgestimmt mit dem Stoffwechselbedarf des Herzmuskels bzw. des Myokards. Ischämische Herzkrankheit resultiert daraus wenn die Blutversorgung unzureichend wird weil entweder die Blutversorgung an sich beeinträchtigt ist oder der Herzmuskel bzw. das Myokard hypertroph wird und größere Anforderung an die Blutversorgung stellt. Koronarblutfluss ist normalerweise unabhängig vom Aortadruck. Ein effizienter Autoregulationsmechanismus besteht zum Kontrollieren des Blutflusses durch das Koronargefäßbett.
Wenn sich eine Obstruktion in einer Hauptkoronararterie entwickelt, üblicherweise aufgrund von Aterosklerose oder Arteriosklerose, wird Koronarblutfluss anfangs aufrechterhalten, da periphärer Widerstand distal zur Obstruktion verringert wird. Wenn das Gefäßlumen mehr als 75% okkludiert ist, entwickelt sich Ischämie, insbesondere wenn die Koronarcollateralzirkulation gering entwickelt ist.
Der Herzmuskel ist extrem metabolisch aktiv und Mitochondrien bilden über 30% des Volumens der einzelnen Fasern. Aerober Metabolismus ist essenziell, da sehr wenige Reserven von hochenergetischen Phosphaten vorliegen. Herzmuskeltod tritt auf wenn Gewebeadenosintriphosphat(ATP)-Gehalte sehr gering sind und wenn aerobe Glykolyse praktisch aufhört. Wie bei anderen Geweben ist der genaue Grund des Todes unsicher, jedoch lethale Herzmuskelverletzungen sind mit Membranschädigung und dem plötzlichen Eintritt von Calcium in das Zellzytoplasma verbunden. Nach kurzen ischämischen Perioden kann Herzblutfluss wieder aufgebaut werden (Reperfusion). Jedoch nach einem kritischen Intervall ist Reperfusion unmöglich, möglicherweise als ein Ergebnis des Anschwellens von Kapillarendothelzellen.
Atherosklerose ist der Grund für die große Mehrheit der Koronararterienkrankheiten. Ischämische Herzkrankheit kann auch resultieren aus geringer Koronararterienperfusion. Schlaganfall, insbesondere als ein Ergebnis von Hämorraghie, ist ein häufiger Grund hierfür.
Wie oben angegeben, wird ischämische Herzkrankheit bewirkt durch eine Unausgewogenheit zwischen dem myokardialen Blutfluss und der metabolischen Anforderung des Myokards. Blutfluss kann weiterhin erniedrigt werden durch überlagernde Ereignisse, wie etwa Vasospasmus, Thrombose oder Kreislaufveränderungen, die zu Hypoperfusion führen.
Koronararterienperfusion hängt ab vom Druckunterschied zwischen der Ostia (Aortadiastolendruck) und Koronarsinus (rechter Arteriendruck). Koronarblutfluss wird reduziert während der Systole aufgrund von Venturi-Effekten an den Koronaröffnungen und Kompression von intramuskulären Arterien während Ventrikelkontraktion. Faktoren, die Koronarblutfluss verringern, umfassen erhöhten Aortadiastoldruck, erhöhten Intraventrikeldruck bzw. Herzkammerinnnendruck und Myokardkontraktion, Koronararterienstenose, Aortaklappenstenose und Regurgitation und erhöhten rechten Arteriendruck.
Thrombolytische Therapie mit Mitteln, wie etwa Streptokinase oder Gewebeplasminogenaktivator (TPA) wird häufig verwendet zum Lysieren eines unlängst gebildeten Thrombus. Eine solche Therapie mit Lyse des Thrombus kann Blutfluss in einer großen Vielzahl von Fällen wieder aufbauen. Dies hilft wesentliche Myokardverletzung zu verhindern wenn sie früh (weniger als etwa eine Stunde) im Ereignissfall erfolgt, und kann zumindest helfen, eine weitere Schädigung zu verringern.
Angina pectoris ist ein Symptomkomplex von ischämischer Herzkrankheit, gekennzeichnet durch paroxysmale Anfälle von Brustschmerz, üblicherweise substernal oder präcordial. Sie wird bewirkt durch Myokardischämie, die kurz vor der der Auslösung von Infarkt ist. Plötzlicher Herztod kann auftreten, was der unerwartete Tod aus kardialen Ursachen heraus ist, üblicherweise innerhalb einer Stunde nach einem kardialen Ereignis oder ohne das Auftreten von Symptomen. Es betrifft 300.000–400.000 Personen jährlich.
Andere Formen der Herzkrankheit umfassen Alkoholkardiomyopathie, Aortaklappenprolaps, Aortaklappenstenose, Arrythmien, kardiogenen Schock, kongenitale Herzkrankheit, dilatierte Kardiomyophathie, Herzanfall, Herzversagen, Herztumor, Herzklappenpulmonalstenose, hypertrophe Kardiomyopathie, idiopathische Kardiomyopathie, ischämische Herzkrankheit, ischämische Kardiomyopathie, Mitralregurgitation, Mitralklappenprolaps, peripartale Kardiomyopathie, stabile Angina.
Myokardinfarkt ist eine weitere Form ischämischer Herzkrankheit. Die Pathogenese kann okklusiven Intrakoronarthrombus, d. h. ein Thrombus, der über einem ulzerierten oder fissurierten stenotischem Belag liegt, umfassen. Okklusiver Intrakoronarthrombus bewirkt 90% transmurale akute Myokardinfarkte. Vasospasmus kann mit oder ohne Koronarartheriosklerose und möglicherweise in Assoziation mit Plättchenaggregation sein. Embolie kann ebenfalls bei Myokardinfarkt vorliegen.
Die gesamte morphologische Erscheinungsform eines Myokardfarktes kann variieren. Transmuraler Infarkt umfasst die gesamte Dicke der linken Ventrikel- bzw. Herzkammerwand vom Endokardium bis zum Epikardium. Subendokardialinfarkt umfasst multifokale Nekrosebereiche, die begrenzt sind auf das Innere 1/3–1/2 der linken Herzkammerwand. Myokardinfarktkomplikationen können Arrythmien und Leitungsdefekte, mit möglichen „plötzlichem Tod", Extension von Infarkt oder Re-Infarkt, kongestive Herzinsuffizienz (Lungenödem), kardiogenen Schock, Perikarditis, Muralthrombose, mit möglicher Embolisierung, Myokardwandbruch, mit möglicher Tamponade, Papillarmuskelbruch, mit möglicher Herzklappeninsuffizienz, Ventrikelaneurysmusbildung umfassen.
Myokardinfarkt (MI) ist definiert als eine ischämische Myokardnekrose, die üblicherweise aus abrupter Verringerung des Koronarblutflusses zu einem Segment des Myokards resultiert.
Bei > 90% der Patienten mit akutem MI okkludiert ein akuter Thrombus, häufig assoziiert mit Belagruptur, die Arterie (früher teilweise obstruiert durch einen Arteriosklerosebelag), die den beschädigten Bereich versorgt. Veränderte Plättchenfunktion, induziert durch endotheliale Veränderung in dem Arteriosklerosebelag trägt vermutlich zur Thrombogenese bei. Spontane Thrombolyse tritt bei etwa 2/3 der Patienten auf, sodass 24 h später thrombotische Okklusion in nur etwa 30% gefunden wird.
Myokardinfarkt wird manchmal durch Arterienembolisierung (d. h. bei Mitral- oder Aortastenose, infektiöser Endokarditis und marantischer Endokarditis) bewirkt. Von Myokardinfarkt wurde bei Patienten mit Koronarspasmus und ansonsten normalen Koronararterien berichtet. Kokain bewirkt intensive Koronararterienspasmen und Verbraucher können durch Kokain induzierte Angina oder durch Kokain induzierten Myokardinfarkt zeigen. Autopsiestuden und Koronarangiographie haben gezeigt, dass durch Kokain induzierte Koronarthrombose in normalen Koronararterien auftreten kann oder bereits zuvor bestehende Atherome überlagern kann.
Myokardinfarkt ist vorherrschend eine Krankheit des linken Ventrikels bzw. der linken Kammer, jedoch eine Beschädigung kann sich in das rechte Ventrikel (RV) oder die Atria erstrecken. Infarkt des rechten Ventrikels resultiert üblicherweise aus der Okklusion der rechten Koronar- oder einer dominanten linken Kranzarterie und ist gekennzeichnet durch einen hohen rechten Ventrikelfülldruck, häufig mit schwerwiegender Tricuspidalinsuffizienz und verringertem Herzminutenvolumen. Ein gewisses Ausmaß der Dysfunktion des rechten Ventrikels tritt bei etwa der Hälfte der Patienten mit einem Hinterwandinfarkt auf, wobei hämodynamische Anormalität in 10 bis 15% erzeugt wird.
Die Fähigkeit des Herzens seine Funktion als eine Pumpe fortzusetzen hängt direkt mit dem Ausmaß der Myokardschädigung zusammen.
Transmurale Infarkte umfassen die gesamte Dicke des Myokards vom Epikard bis zum Endokard und sind üblicherweise gekennzeichnet durch anormale Q-Wellen auf dem EKG. Nichttransmurale oder subendokardiale Infarkte erstrecken sich nicht über die Ventrikelwand bzw. Herzkammerwand und bewirken nur ST-Segment- und T-Wellen-Anormalitäten. Subendokardialinfarkte umfassen üblicherweise das innere 1/3 des Myokards, wo die Wandspannung am höchsten ist und der myokardiale Blutfluss am anfälligsten ist auf Kreislaufveränderungen. Sie können auch auf ausgedehnte Hypotonie folgen. Da die transmurale Tiefe von Nekrose nicht genau klinisch bestimmt werden kann, werden Infarkte besser klassifiziert durch EKG als durch Q-Welle und Nicht-Q-Welle. Das Volumen von zerstörtem Myokard kann abgeschätzt werden durch das Ausmaß und die Dauer der CK-Elevation.
Ischämische Kardiomyopathie ist eine andere Krankheit innerhalb der ischämischen Herzkrankheit. In diesem Zustand können verschiedene Myokardinfarkte auftreten, jedoch die Krankheit resultiert aus schwerer Koronararteriosklerose, die alle Hauptzweige umfasst. Das Ergebnis ist eine unzureichnede vaskuläre Versorgung, was zu Myozytverlust führt. Der Myozytverlust, gekoppelt mit Fibrose in der Form von interstitieller Kollagenabscheidung, führt zu erniedrigter Compliance, was zusammen mit der begleitenden Herzdillatation, zu einer Überladung verbleibender Myozyten führt. Dies hält den Prozess am Laufen, unter Kompensation durch Fortsetzen von Myozythypertrophie. Es kann ebenfalls eine Kompensation durch Hyperplasie als auch Hypertrophie vorliegen, was die enorme Größe (das 2- bis 3-fache der normalen Größe) des resultierenden Herzens erklären kann. Möglicherweise kann das Herz nicht mehr länger kompensieren und Herzversagen folgt auf Arrythmien und/oder ischämische Ereignisse. So ergibt sich klinisch langsames, progressives Herzversagen mit oder ohne eine Historie eines vorausgehenden Myokardinfarkts oder Anginaschmerz. Ischämische Kardiomyopathie ist für soviel wie etwa 40% der Sterblichkeit bei ischämischen Herzkrankheiten verantwortlich.
Während Ischämie als auch Reperfusion des Herzens werden zahlreiche endogene Mediatoren, wie etwa kleine Molekül-second messenger produziert, die die Myokardfunktion beeinträchtigen. Innerhalb von Minuten einer ischämischen Episode nimmt die Myokardkontraktionskraft ab und die Gesamtrückgewinnung von Kontraktionskraft ist weitgehend abhängig von der Dauer der ischämischen Periode (Daemen et al., 1999). Zum Beispiel ist während eines ischämischen Ereignissen Ca²⁺-Homeostase gestört, Sauerstoff-abgeleitete freie Radikale werden erzeugt und Stickoxid(NO)-Synthese und Freisetzung findet statt. Zusätzlich gibt es auch lokale Produktion von Cytokinen, insbesondere TNFα und IL-1β (Bolli, 1990). Im intakten Herz tragen diese Cytokine zu Ischämie-induzierter Myokarddysfunktion bei durch Induktion von Genexpression für induzierbare NO-Synthese (iNOS) (Daemen et al., 1999), Cyclooxygenase-2 (COX-2) und Phospholipase A2 als auch Gefäßanhaftungsmolekülen und mehreren Chemokinen. Als ein Ergebnis tritt unmittelbare Depression der Myokardkontraktionskraft auf, vermittelt durch kleine Molekül-Messenger, gefolgt durch Cytokin-vermittelte Neutrophilinfiltration, was weiter den Herzmuskel schädigt. Tierherzen, die untersucht wurden in der Abwesenheit von Blut oder Blutprodukten, entwickeln TNFα (Herskowitz et al., 1995) und IL-1β während einer ischämischen Herausforderung. Kardiomyozyten verlieren ebenfalls Kontraktionskraft aufgrund der Wirkung dieser endogenen Cytokine (Meldrum et al., 1998).
Das meiste der experimentellen Daten, die TNFα- und IL-1β-vermittelte Myokarddysfunktion betreffen, sind von Tierstudien abgeleitet. Jedoch humane Myokardgewebe, erhalten von Patienten, die elektive Kardiopulmonar-Bypass-Prozeduren erfahren, sind untersucht worden unter kontrollierten ex vivo-Bedingungen (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). In diesem experimentellen Modell werden humane atriale Trabekel suspendiert in einem blutfreien, physiologischen oxigenierten Pufferbad und dann einer Episode einer simultierten Ischämie ausgesetzt. Während dieser Zeit nimmt die Kontraktionskraft dramatisch ab; wenn das Gewebe erneut Sauerstoff ausgesetzt wird, kehrt Kontraktionskraft zurück, ist jedoch vermindert (60–70% Verringerung) und ein Beweis für Myokardschädigung wird beobachtet durch Freisetzung von Kreatinkinase (CK) (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). Wenn TNF-Bioaktivität spezifisch neutralisiert wird während Ischämie/Reperfusion (I/R) wird eine größere Wiederherstellung von Kontraktionskraft beobachtet, was nahelegt, dass endogene Myokard-TNF-Aktivität zur Kontraktionsdysfunktion, induziert durch das ischämische Ereignis, beiträgt (Cain et al., 1999).
Daemen et al. (1999) untersuchten Gewebeverletzung als eine Konsequenz von Ischämie, gefolgt von Reperfusion, unter Verwendung eines Mausmodells von Nierenischämie. Sie zeigten, dass Nieren-IL-18 mRNA-Hochregulation zusammenfällt mit Caspase-1-Aktivierung am Tag 1 nach Ischämie. IFN-γ und IL-12-mRNA wurden nachfolgend hochreguliert am Tag 6 nachfolgend auf Ischämie. Kombiniert, jedoch nicht getrennt, reduzierte in vivo-Neutralisierung von IFN-γ-induzierenden Cytokinen IL-12 und IL-18 IFN-gamma-abhängige MHC Klasse I und Klasse II Hochregulation zu einem ähnlichen Ausmaß wie IFN-γ-Neutralisierung. IL-18-Inhibitoren und ihre Beteiligung an Krankheiten sind im Stand der Technik beschrieben worden.
Zum Beispiel offenbart WO 98/24804 Interleukin-1β-konvertierendes Enzym(ICE)-Inhibitoren. Dieses Dokument gibt weiter an, dass ICE eine Rolle spielen kann im programmierten Zelltod oder bei Apoptose und dass eine therapeutische Anwendung der Inhibierung von Apoptose die Behandlung von Myokardinfarkt umfassen kann.
WO 01/58956 beschreibt Anti-IL-18-Antikörper. Unter vielen verschiedenen hypothetischen therapeutischen Anwendungen dieser Antikörper werden Herzversagen, Myokardinfarkt und Kardiomyopathie genannt.
WO 01/85201 betrifft die Verwendung von IL-18-Inhibitoren bei Arteriosklerose.
Seta et al., Heart 2000; 84: 668–669 beschreibt die Beteiligung von IL-18 bei akutem Myokardinfarkt und legt IL-18 nahe als ein Marker von Herzschädigung bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt.
WO 01/03719 beschreibt Osteoprotegerin, ein Mitglied der Tumornekrosefaktorrezeptor-Superfamilie, und seine Beteiligung bei der Regulation des Knochenmetabolismus. Dieses Dokument betrifft ebenfalls die Kombinationstherapie mit einer Anzahl von Verbindungen, unter welchen IL-18-Inhibitoren und TNF-Inhibitoren genannt werden. Herzkrankheiten sind in diesem Dokument nicht genannt.
Jedoch wurde bisher nicht beschrieben, dass IL-18 eine Rolle bei der Kardiomyopathie spielt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein Inhibitor von IL-18 wesentlich die Kontraktionsfunktion des Herzens in einem Ischämie/Reperfusion-Modell von supra-fusioniertem humanem atrialem Myokard verbessert. Inhibierung von Caspase-1 (ICE) schwächte auch die Depression der Kontraktionskraft nach Ischämie und Reperfusion ab.
Darüber hinaus führte die Verabreichung von einem IL-18-Inhibitor in einem Mausmodell des Myokardinfarkts zu einer verbesserten Überlebensquote und signifikanter Verbesserung der Ventrikel- bzw. Kammerfunktion.
Diese Untersuchungen zeigen, dass Inhibitoren von IL-18 geeignet sind zur Behandlung oder Verhinderung von Myokarddysfunktion.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Inhibitors von IL-18 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhinderung von Kardiomyopathie.
Um einem gentherapeutischen Ansatz zur Bereitstellung des IL-18-Inhibitors für das erkrankte Gewebe oder die erkrankte Zelle zu entsprechen, betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung eines Expressionsvektors, umfassend die Codierungssequenz eines IL-18-Inhibitors, zur Behandlung und/oder Verhinderung von Kardiomyopathie.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung von IL-18BP auf Ischämie-induzierte Myokard kontraktionsdysfunktion.

(A) Kinetische Antwort auf ischämische Verletzung. Nachfolgend auf Äquilibration (eq) wurden Kontroll(Ctrl)-Trabekel suprafusioniert unter normoxischen Bedingungen während des gesamten Versuches. Trabekel wurden Ischämie/Reperfusion in der Abwesenheit oder bei Vorliegen von IL-18BP (5 μg/ml) unterzogen. Die vertikale Achsel zeigt die Prozent entwickelte Kraft im Vergleich mit dem Beginn des Versuches (Zeit null). Die Daten stammen von Trabekeln eines einzigen Patienten und sind repräsentativ für die Verfahren, die verwendet werden zum Berechnen der mittleren Veränderung der entwickelten Kraft bei 90 Minuten.
(B) Post-Ischämie-Entwicklungskraft, nachfolgend auf Neutralisierung von IL-18 mit 1 oder 5 μg/ml von IL-18BP. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere prozentuale Veränderung der entwickelten Kraft relativ zu Ctrl (Kontrolle) nachfolgend auf Abschluss der Reperfusion (90 Minuten). Die Zahlen in Klammern geben IL-18BP in μg/ml an. N = 6. * p < 0,01, im Vergleich mit I/R (Ischämie/Reperfusion).

2: zeigt den Myokard-IL-18-Proteingehalt. Trabekel wurden homogenisiert nachfolgend auf 90 Minuten Suprafusion unter normoxischen Bedingungen (Kontrolle) oder 45 Minuten nachfolgend auf 30 Minuten Ischämie (I/R). Trabekel von den gleichen Individuen wurden aufeinander abgestimmt. IL-18-Gehalte sind auf der vertikalen Achse in pg/ml angegeben. N = 4. * p < 0,01.
3: zeigt die Stationärszustand-IL-18- und IL-18BP-mRNA-Gehalte in Kontroll- und ischämischem atriellem Gewebe. Gehalte von IL-18- und IL-18BP-mRNA wurden bestimmt durch RT-PCR. Die Daten sind von einem von zwei beurteilten Individuen. A zeigt das Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel, worin die PCR-Produkte getrennt wurden, und B zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung der Menge von PCT-Produkt als Mehrfaches der Veränderung gegenüber der Kontrolle (GADPH).
4: zeigt die Wirkung von ICE-Inhibierung auf post-ischämische Entwicklungskraft. Ergebnisse sind angegeben als mittlere prozentuale Veränderung der Entwicklungskraft relativ zur Kontrolle (Crtl) nachfolgend auf Ischämie/Reperfusion (I/R). Die Zahlen in Klammern zeigen die Konzentration von ICEi in μg/ml. N = 7. * p < 0,01 im Vergleich mit I/R.
5: zeigt die Gewebekreatinkinase(CK)-Aktivität nachfolgend auf I/R. CK ist angegeben in Aktivitätseinheiten pro Milligramm Feuchtgewicht des Gewebes. Die experimentellen Bedingungen sind unter der horizontalen Achse angegeben. Ctrl und I/R, N = 6; IL-18BP (5 μg/ml), N = 5; ICEi (10 und 20 μg/ml), N = 5 jeweils; * p < 0,05, im Vergleich mit I/R.
6: zeigt die mittlere Veränderung der entwickelten Kraft relativ zur entwickelten Kraft nachfolgend auf die Äquilibrierungsperiode, eingestellt bei 100% (n = 5), von Trabekeln, inkubiert mit 10 μg/ml für 15 min, vor der Zugabe von TNFα (1 ng/ml). TNFα und IL-18BP wurden zu jedem Badaustausch zugegeben.
7: zeigt die temporäre Antwort von humanen atriellen Trabekeln auf IL-18 unter normoxischen Bedingungen. Reifes IL-18 (100 ng/ml) wurde zugegeben zu atriellen Trabekeln über die Versuchsperiode von 90 min. Die vertikale Achse gibt die mittlere prozentuale Veränderung der entwickelten Kraft von der Grundlinie aus an. Die Grundlinie wurde bestimmt am Ende der Äquilibrierungsperiode (nicht gezeigt). (n = 6). * P < 0,05, ** P < 0,001, im Vergleich mit der Kontrolle, beim gleichen Intervall und für den Rest der Experimentperiode.
8: zeigt die Beibehaltung der Myozellgewebe-Kreatinkinase-Aktivität nachfolgend auf Unterziehen I/R, TNFα (1 ng/ml) und TNFα (10 ng/ml) + IL- 18BP. Die CK-Aktivität ist ausgedrückt in Einheiten CK-Aktivität pro Milligramm Gewicht des feuchten Gewebes (n = 6).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass IL-18-Inhibitoren eine vorteilhafte Wirkung bei Herzkrankheiten zeigen, insbesondere bei ischämischen Herzkrankheiten. Wie in den unten folgenden Beispielen gezeigt, wurde von mehreren verschiedenen IL-18-Inhibitoren gezeigt, dass sie eine signifikante vorteilhafte Wirkung auf die post-ischämische Entwicklungskraft des Herzmuskels haben.
Zusätzlich hierzu wurde ein Inhibitor von IL-18 in einem in vivo-Modell des Myokardinfarktes getestet und führte zu einer erhöhten Überlebensquote und signifikant verbesserter Ventrikelfunktion.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines IL-18-Inhibitors zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und/oder Verhinderung von Kardiomyopathie.
Kardiomyopathie ist eine strukturelle oder funktionelle Anomalität des Ventrikelmyokards.
Der Ausdruck „Verhinderung" betrifft im Zusammenhang mit dieser Erfindung nicht nur eine komplette Verhinderung eines bestimmten Effektes, sondern auch eine teilweise oder wesentliche Verhinderung, Abschwächung, Reduktion, Linderung oder Abschwächung des Defektes vor oder früh beim Einsetzen der Krankheit.
Der Ausdruck „Behandlung" betrifft im Zusammenhang mit dieser Erfindung jeden vorteilhaften Effekt auf die Progression der Krankheit, einschließlich Abschwächung, Reduktion, Linderung oder Abschwächung der pathologischen Entwicklung nach Einsetzen der Krankheit.
Der Ausdruck „Inhibitor von IL-18" betrifft im Zusammenhang mit dieser Erfindung jedes beliebige Molekül, das IL-18-Produktion und/oder Wirkung auf eine solche Art moduliert, dass IL-18-Produktion und/oder -Wirkung abgeschwächt, reduziert oder teilweise, wesentlich oder vollständig verhindert oder blockiert wird.
Inhibitoren von IL-18-Wirkung können IL-18-Antikörper, wie etwa polyklonale oder monoklonale Antikörper, sein.
In der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor von IL-18 ausgewählt aus Inhibitoren von Caspase-1 (ICE), Antikörpern, die gegen IL-18 gerichtet sind, Antikörpern, die gegen die IL-18-Rezeptoruntereinheiten gerichtet sind und IL-18-Bindungsproteinen, Isoformen, Muteinen, fusionierten Proteinen, funktionellen Derivaten davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren.
Der Ausdruck „IL-18-Bindungsproteine" wird hier synonym verwendet mit „IL-18-Bindungsprotein" oder „IL18BP". Er umfasst IL-18-Bindungsproteine, wie in WO 99/09063 oder in Novick et al., 1999, definiert, einschließlich Spleißvarianten und/oder Isoformen von IL-18-Bindungsproteinen, wie definiert in Kim et al., 2000, die an IL-18 binden. Im Besonderen sind die humanen Isoformen a und c von IL-18BP gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Proteine, die geeignet sind gemäß der vorliegenden Erfindung, können glykosyliert oder nichtglykosyliert sein, sie können von natürlichen Quellen, wie etwa Urin, stammen, oder sie können vorzugsweise rekombinant produziert werden. Rekombinante Expression kann durchgeführt werden in prokaryontischen Expressionssystemen wie E. coli oder in eukaryontischen, und vorzugsweise in Säugerexpressionssystemen.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Muteine" Analoga eines IL-18BP oder Analoga eines viralen IL-18BP, worin einer oder mehrere der Aminosäurereste eines natürlichen IL-18BP oder viralen IL-18BP ersetzt ist (sind) durch verschiedene Aminosäurereste, oder deletiert ist (sind) oder ein oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt sind zu der natürlichen Sequenz eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP, ohne beträchtliche Veränderung der Aktivität des resultierenden Produkts im Vergleich mit dem Wildtyp-IL-18BP oder viralen IL-18BP. Diese Muteine werden hergestellt durch bekannte Synthese- und/oder durch Stellen-gerichtete Mutagenese-Techniken oder eine beliebige andere Technik, die hierfür geeignet ist.
Muteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die codiert werden durch eine Nukleinsäure, wie etwa DNA oder RNA, die hybridisiert an DNA oder RNA, welche für ein IL-18BP codiert oder ein virales IL-18BP codiert, gemäß der vorliegenden Erfindung, unter stringenten Bedingungen. Der Ausdruck „stringente Bedingungen" betrifft Hybridisierungs- und nachfolgende Waschbedingungen, die der Fachmann in der Technik herkömmlicherweise als „stringent" bezeichnet. Siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 und 6.4 (1987, 1992) und Sambrook et al., supra. Ohne Begrenzung, umfassen Beispiele stringenter Bedingungen Waschbedingungen von 12–20°C unter der berechneten Tm des Hybrids, das zu untersuchen ist, in z. B. 2 × SSC und 0,5% SDS für 5 Minuten, 2 × SSC und 0,1% SDS für 15 Minuten; 0,1 × SSC und 0,5% SDS bei 37°C für 30–60 Minuten und dann 0,1 × SSC und 0,5% SDS bei 68°C für 30–60 Minuten. Der Fachmann in der Technik versteht, dass stringente Bedingungen ebenfalls abhängen von der Länge der DNA-Sequenzen, Oligonukleotidsonden (wie etwa 10–40 Basen) oder gemischten Oligonukleotidsonden. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstelle von SSC zu verwenden. Siehe Ausubel, supra.
Jedes solche Mutein hat vorzugsweise eine Sequenz von Aminosäuren, die ausreichend duplikativ zu der eines IL-18BP ist oder ausreichend duplikativ zu einem viralen IL-18BP ist, um eine Aktivität aufzuweisen, die vergleichbar ist mit IL-18BP. Eine Aktivität von IL-18BP ist seine Fähigkeit zum Binden von IL-18. Solange das Mutein wesentliche Bindungsaktivität an IL-18 aufweist, kann es verwendet werden bei der Reinigung von IL-18, wie etwa mittels Affinitätschromatographie, und so betrachtet werden kann, dass es im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie IL-18BP aufweist. So kann mittels Routineversuch bestimmt werden, ob ein gegebenes Mutein im Wesentlichen die gleiche Aktivität aufweist wie IL-18BP, umfassend das Unterziehen eines Muteins z. B. einem einfachen Sandwich-Kompetitions-Assay zur Bestimmung ob es an ein geeignet markiertes IL-18 bindet, wie etwa durch Radioimmunoassay oder ELISA-Assay.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein beliebiges solches Mutein mindestens 40% Identität oder Homologie mit der Sequenz von entweder einem IL-18BP oder einem viral-codierten IL-18BP-Homologen, wie definiert in WO 99/09063 . Mehr bevorzugt hat es mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder am meisten bevorzugt mindestens 90% Identität oder Homologie damit.
Muteine von IL-18BP-Polypeptiden oder Muteine von viralen IL-18BPs, die verwendet werden können gemäß der vorliegenden Erfindung, oder dafür codierende Nukleinsäure, umfassen einen begrenzten Satz von im Wesentlichen korrespondierenden Sequenzen als Substitutionspeptide oder Polynukleotide, die routinemäßig durch den Fachmann in der Technik erhalten werden können ohne unnötige Versuche, basierend auf den Lehren und Anleitungen, die hier gegeben sind.
Bevorzugte Veränderungen für Muteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind die, die bekannt sind als „konservative" Substitutionen. Konservative Aminosäuresubstitutionen von IL-18BP-Polypeptiden oder -Proteinen oder viralen IL-18BPs können synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe umfassen, die ausreichend ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen, sodass Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls beibehalten wird (Grantham, 1974). Es ist klar, dass Insertion und Deletion von Aminosäuren auch durchgeführt werden können in den oben definierten Sequenzen ohne ihre Funktion zu verändern, insbesondere wenn die Insertionen oder Deletionen nur einige wenige Aminosäuren umfassen, z. B. unter dreißig, und vorzugsweise unter zehn, und Aminosäuren, die kritisch für eine funktionelle Konformation sind, z. B. Cysteinreste, nicht entfernen oder ersetzen. Proteine und Muteine, die durch solche Deletionen und/oder Insertionen produziert werden, sind im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Vorzugsweise sind synonyme Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle 1 definiert sind. Mehr bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle 2 definiert sind; und am meisten bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle 3 definiert sind.
TABELLE 1 Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren
TABELLE 2 Mehr bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren
TABELLE 3 Am meisten bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren
Beispiele der Produktion von Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, die verwendet werden können zum Erhalten von Muteinen von IL-18BP-Polypeptiden oder -Proteinen oder Muteinen von viralen IL-18BPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen beliebige bekannte Verfahrensschritte, wie etwa dargestellt in den US Patenten 4,959,314, 4,588,585 und 4,747,462 von Market al.; 5,116,943 von Koths et al., 4,965,195 von Namen et al.; 4,879,111 von Chong et al.; und 5,017,691 von Lee et al; und Lysin-substituierte Proteine, die im US Patent Nr. 4,904,584 (Shaw et al.) dargestellt sind.
Der Ausdruck „fusioniertes Protein" betrifft ein Polypeptid, umfassend ein IL-18BP oder ein virales IL-18BP oder ein Mutein oder Fragment davon, fusioniert mit einem anderen Protein, das z. B. eine verlängerte Verweilzeit in Körperfluiden hat. Ein IL-18BP oder ein virales IL-18BP kann daher fusioniert sein an ein anderes Protein, Polypeptid oder dgl., z. B. an ein Immunglobulin oder ein Fragment davon.
„Funktionelle Derivate" umfassen, wie hier verwendet, Derivate von IL-18BPs oder einem viralen IL-18BP und ihre Muteine und fusionierten Proteine, die hergestellt werden können aus den funktionellen Gruppen, die als Seitenketten auf den Resten oder den N- oder C-terminalen Gruppen auftreten, mittels in der Technik bekannter Mittel, und sind von der Erfindung umfasst, solange sie pharmazeutisch verträglich bleiben, d. h. sie nicht die Aktivität des Proteins zerstören, die im Wesentlichen ähnlich der Aktivität von IL-18BP oder viralen IL-18BPs ist, und nicht toxische Eigenschaften auf die Zusammensetzungen übertragen, die sie enthalten.
Diese Derivate können z. B. Polyethylenglykolseitenketten umfassen, die Antigenstellen maskieren können und die Verweilzeit von einem IL-18BP oder einem viralen IL-18BP in Körperfluiden ausdehnen können. Andere Derivate umfassen aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen, durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acylderivate von freien Aminogruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acylgruppen (z. B. Alkanoyl- oder carbocyclische Aroylgruppen) oder O-Acylderivate von freien Hydroxylgruppen (z. B. von denjenigen von Seryl- oder Threonylresten), gebildet mit Acylgruppen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Inhibitor von IL-18 ein Antikörper, der gegen IL-18 oder seinen Rezeptor, den IL-18R, gerichtet ist. Antikörper, die gegen eine der IL-18R-Untereinheiten, genannt IL-18Rα und β, gerichtet sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können polyklonal oder monoklonal, chimär, humanisiert oder sogar vollständig human sein. Rekombinante Antikörper und Fragmente davon sind gekennzeichnet durch Hochaffinitätsbindung an IL-18 oder IL-18R in vivo und geringe Toxizität. Die Antikörper, die in der Erfindung verwendet werden können, sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zum Behandeln von Patienten für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ausgezeichnete Regression oder Linderung des pathogenen Zustandes oder eines Symptoms oder einer Gruppe von Symptomen, die verbunden sind mit einem pathogenen Zustand, zu erreichen, und bei einer geringen Toxizität.
Neutralisierende Antikörper werden leicht entwickelt in Lebewesen, wie etwa Kaninchen, Ziege oder Maus, durch Immunisierung mit IL-18 oder IL18Rα oder β. Immunisierte Mäuse sind besonders geeignet zum Bereitstellen von Quellen für B-Zellen zur Herstellung von Hybridomen, die wiederum kultiviert werden, um große Mengen von monoklonalen Anti-IL-18-Antikörpern zu produzieren.
Chimäre Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, die gekennzeichnet durch zwei oder mehr Segmente oder Teile, die von verschiedenen Tierspezies abgeleitet sind. Im Allgemeinen ist die variable Region des chimären Antikörpers abgeleitet von einem nichthumanen Säugerantikörper, wie etwa monoklonalem Antikörper aus Maus, und die konstante Region eines Immunglobulins ist abgeleitet von einem humanen Immunglobulinmolekül. Vorzugsweise haben beide Regionen und die Kombination geringe Immunogenität, wie routinemäßig bestimmt (Elliott et al, 1994). Humanisierte Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, gebildet durch gentechnische Entwicklungen, worin die konstanten Regionen aus Maus ersetzt sind durch humane Gegenstücke, während die Antigenbindungsregionen aus Maus beibehalten werden. Der resultierende chimäre Maus-Human-Antikörper hat vorzugsweise verringerte Immunogenität und verbesserte Pharmakokinetika in Menschen (Knight et al., 1993).
So ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform IL-18- oder IL-18R-Antikörper ein humanisierter Antikörper. Bevorzugte Beispiele humanisierter Anti-IL-18-Antikörper sind z. B. in der europäischen Patentanmeldung EP 0 974 600 beschrieben.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper vollständig human. Die Technologie zum Produzieren humaner Antikörper ist im Detail z. B. beschrieben in WO 00/76310 , WO 99/53049 , US 6,162,963 oder AU 5,336,100 .
Ein Verfahren zur Herstellung von vollständig humanen Antikörpern besteht aus „Humanisierung" des humoralen Immunsystems aus Maus, d. h. Produktion von Mausstämmen, die in der Lage sind zum Produzieren von humanem Ig (Xenomäuse), durch die Einführung von humanen Immunglobulin(Ig)-loci in Mäuse, worin die endogenen Ig-Gene inaktiviert worden sind. Die Ig-loci sind komplex hinsichtlich sowohl ihrer physischen Struktur als auch der Genneuanordnung und Expressionsprozesse, die erforderlich sind, um letztendlich eine breite Immunantwort zu produzieren. Antikörperdiversität wird primär erzeugt durch kombinatorische Neuanordnung zwischen verschiedenen V-, D- und J-Genen, die in den Ig-loci vorliegen. Diese loci enthalten auch die dazwischen verteilten regulatorischen Elemente, die Antikörperexpression, Allelexklusion, Umschalten zwischen Klassen und Affinitätsreifung (Affinity maturation) steuern. Die Einführung von nicht neu angeordneten humanen Ig-Transgenen in Mäusen hat gezeigt, dass die Mausrekombinationsmaschinerie kompatibel ist mit humanen Genen. Darüber hinaus können Hybridome, die Antigen sekretieren, das spezifisch für hu-mAbs von verschiedenen Isotypen ist, erhalten werden können durch Xenomaus-Immunisierung mit Antigen.
Vollständig humane Antikörper und Verfahren zu ihrer Produktion sind in der Technik bekannt (Mendez et al (1997); Buggemann et al. (1991); Tomizuka et al., (2000) Patent WO 98/24893 ).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor von IL-18 ein IL-18BP oder eine Isoform, ein Mutein, fusioniertes Protein, funktionelles Derivat davon. Diese Isoformen, Muteine, fusionierten Proteine oder funktionellen Derivate behalten die biologische Aktivität von IL-18BP bei, insbesondere die Bindung an IL-18, und haben vorzugsweise im Wesentlichen mindestens eine Aktivität, die ähnlich IL-18BP ist. Idealerweise haben solche Proteine eine verstärkte biologische Aktivität im Vergleich mit unmodifiziertem IL-18BP.
Die Sequenzen von IL-18BP und seinen Spleißvarianten/Isoformen können aus WO 99/09063 oder aus Novick et al., 1999, als auch aus Kim et al., 2000, entnommen werden.
Funktionelle Derivate von IL-18BP können konjugiert werden an Polymere, um die Eigenschaften des Proteins, wie etwa die Stabilität, Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit, Toleranz durch den humanen Körper oder Immunogenität, zu verbessern. Um dieses Ziel zu erreichen kann IL-18BP z. B. gebunden werden an Polyethylenglykol (PEG). PEGylierung kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, die z. B. in WO 92/13095 beschrieben sind.
Daher sind in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Inhibitoren von IL-18 und im Besonderen IL-18BP, PEGyliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Inhibitor von IL-18 eine Immunglobulinfusion, d. h. der Inhibitor von IL-18 ist ein fusioniertes Protein, umfassend das Gesamte oder einen Teil eines IL-18-Bindungsproteins, das an das Gesamte oder einen Teil eines Immunglobulins fusioniert ist. Verfahren zum Herstellen von Immunglobulinfusionsproteinen sind in der Technik allgemein bekannt, wie etwa z. B. diejenigen, die beschrieben sind in WO 01/03737 . Der Fachmann in der Technik wird verstehen, dass das resultierende Fusionsprotein der Erfindung die biologische Aktivität von IL-18BP beibehält, im Besonderen die Bindung an IL-18. Die Fusion kann direkt oder über ein kurzes Linkerpeptid erfolgen, das so kurz wie etwa 1 bis 3 Aminosäurereste in der Länge oder länger sein kann, z. B. 13 bis 20 Aminosäurereste in der Länge. Der Linker kann z. B. ein Tripeptid mit der Sequenz E-F-M (Glu-Phe-Met) oder eine 13-Aminosäurelinkersequenz, umfassend Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, die eingeführt ist zwischen der IL-18BP-Sequenz und der Immunglobulinsequenz, umfassen. Das resultierende Fusionsprotein hat verbesserte Eigenschaften, wie etwa ausgedehnte Verweilzeit in Körperfluiden (Halbwertszeit), erhöhte spezifische Aktivität, erhöhten Expressionsgrad, oder die Reinigung des Fusionsproteins ist erleichtert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist IL-18BP fusioniert an die konstante Region eines Ig-Moleküls. Vorzugsweise ist es fusioniert an schwere Kette-Regionen, wie etwa z. B. die CH2- und CH3-Domänen von humanem IgG1. Die Erzeugung von spezifischen Fusionsproteinen, die IL-18BP und einen Teil eines Immunglobulins umfassen, ist z. B. beschrieben in Beispiel 11 von WO 99/09063 . Andere Isoformen von Ig-Molekülen sind ebenfalls geeignet zur Erzeugung von Fusionsproteinen entsprechend der vorliegenden Erfindung, wie etwa die Isoformen IgG₂ oder IgG₄ oder andere Ig-Klassen, wie IgM oder IgA zum Beipsiel. Fusionsproteine können monomer oder multimer, hetero- oder homomultimer sein.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Inhibitor von IL-18 in Kombination mit einem TNF-Antagonisten verwendet. TNF-Antagonisten üben ihre Aktivität auf verschiedenen Wegen aus. Erstens können Antagonisten an das TNF-Molekül an sich binden oder das TNF-Molekül an sich maskieren, mit ausreichend Affinität und Spezifität, um teilweise oder wesentlich das TNF-Epitop oder die TNF-Epitope, die für TNF-Rezeptorbindung verantwortlich sind, zu neutralisieren (hier nachfolgend bezeichnet als „Maskierungsantagonisten"). Ein maskierender Antagonist kann z. B. ein Antikörper sein, der gegen TNF gerichtet ist.
Alternativ können TNF-Antagonisten den TNF-Signalweg inhibieren, der aktiviert wird durch den Zelloberflächenrezeptor nach TNF-Bindung (hier nachfolgend bezeichnet als „Signalantagonisten"). Beide Gruppen von Antagonisten sind geeignet, entweder alleine oder zusammen, in Kombination mit einem IL-18-Inibitor, bei der Therapie oder Verhinderung von Herzkrankheiten.
TNF-Antagonisten werden leicht identifiziert und beurteilt durch Routinescreening von Kandidaten auf ihre Wirkung auf die Aktivität von nativem TNF auf suszeptible Zelllinien in vitro, z. B. humane B-Zellen, worin TNF Proliferation und Immunglobulinsekretion bewirkt. Der Assay enthält eine TNF-Formulierung bei verschiedenen Verdünnungen von Kandidaten-Antagonist, z. B. vom 0,1- bis 100-fachen der molaren im Assay verwendeten TNF-Menge, und Kontrollen mit keinem TNF oder nur Antagonist (Tucci et al., 1992).
Maskierende Antagonisten sind die bevorzugten TNF-Antagonisten, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind. Unter den maskierenden Antagonisten sind diejenigen Polypeptide, die TNF mit hoher Affinität binden und geringe Immunogenität zeigen, bevorzugt. Lösliche TNF-Rezeptormoleküle und neutralisierende Antikörper für TNF sind besonders bevorzugt. Zum Beispiel sind löslicher TNF-RI und TNF-RII geeignet in der vorliegenden Erfindung. Verkürzte (truncated) Formen dieser Rezeptoren, umfassend die extrazellulären Domänen der Rezeptoren oder funktionelle Teile davon, sind im Spezielleren bevorzugte Antagonisten gemäß der vorliegenden Erfindung. Verkürzte lösliche TNF-Rezeptoren des Typs I und Typs II sind in EP914431 z. B. beschrieben.
Verkürzte Formen der TNF-Rezeptoren sind löslich und sind nachgewiesen worden in Urin und Serum als 30 kDa- und 40 kDa-TNF-Inhibierungsbindungsproteine, die als TBPI bzw. TBPII bezeichnet werden (Engelmann et al., 1990). Die simultane, sequenzielle oder separate Verwendung von IL-18-Inhibitor mit dem TNF-Antagonisten ist gemäß der Erfindung bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist humaner löslicher TNF-RI (TBPI) der gemäß der Erfindung zu verwendende TNF-Antagonist. Die neutralen und rekombinanten löslichen TNF-Rezeptormoleküle und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den europäischen Patenten EP 308 378 , EP 398 327 und EP 433 900 beschrieben worden.
Derivate, Fragmente, Regionen und biologisch aktive Teile der Rezeptormoleküle gleichen funktionell den Rezeptormolekülen, die ebenfalls verwendet werden können in der vorliegenden Erfindung. Ein solches biologisch aktives Äquivalent oder Derivat des Rezeptormoleküls betrifft den Teil des Polypeptids oder der Sequenz, die für das Rezeptormolekül codiert, der (das) eine ausreichende Größe aufweist und in der Lage ist zum Binden von TNF mit einer solchen Affinität, dass die Wechselwirkung mit dem Membran-gebundenen-TNF-Rezeptor inhibiert oder blockiert ist.
Der IL-18-Inhibitor kann simultan, sequenziell oder separat mit dem TNF-Inhibitor verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Medikament weiterhin bekannte Mittel umfassen, die verwendet werden zur Behandlung von Herzkrankheiten, wie etwa Nitrate, z. B. Nitroglycerin, Diuretika, ACE-Inhibitoren, Digitalis, Beta-Blocker oder Calciumblocker, in Kombination mit einem IL-18-Inhibitor. Die aktiven Komponenten können gleichzeitig, sequenziell oder separat verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor von IL-18 in einer Menge von etwa 0,001 bis 100 mg/kg oder etwa 1 bis 10 mg/kg oder 2 bis 5 mg/kg verwendet.
Der IL-18-Inhibitor gemäß der Erfindung wird vorzugsweise systemisch und vorzugsweise subkutan oder intramuskulär verabreicht.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Expressionsvektors, umfassend die codierende Sequenz bzw. Codierungssequenz eines Inhibitors von IL-18, ausgewählt aus Antikörpern gegen IL-18, Antikörper gegen eine der IL-18-Rezeptoruntereinheiten und IL-18-Bindungsproteine oder Isoformen, Muteine, fusionierten Proteine davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung und/oder Behandlung von Kardiomyopathie. So wird ein Gentherapieansatz vorgesehen zum Zuführen des IL-18-Inhibitors zu der Stelle, an welcher er erforderlich ist. Zum Behandeln und/oder Verhindern einer Herzkrankheit kann der Gentherapievektor, der die Sequenz eines Inhibitors von IL-18 umfasst, z. B. direkt in das erkrankte Gewebe injiziert werden, wobei Probleme vermieden werden, die mit systemischer Verabreichung von Gentherapievektoren verbunden sind, wie etwa Verdünnung der Vektoren, Erreichen und Zielrichten der Targetzellen oder Gewebe und Nebenwirkungen.
Die Verwendung eines Vektors zum Induzieren und/oder Verstärken der endogenen Produktion eines Inhibitors von IL-18 in einer Zelle, die normalerweise still ist bei der Expression eines IL-18-Inhibitors oder Mengen des Inhibitors exprimiert, die nicht ausreichend sind, worin der Inhibitor von IL-18 ausgewählt ist aus IL-18-Bindungsproteinen oder Isoformen davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren, sind ebenfalls gemäß der Erfindung vorgesehen. Der Vektor kann regulatorische Sequenzen umfassen, die funktionell sind in den Zellen, die gewünscht sind zum Exprimieren des Inhibitors oder IL-18. Solche regulatorischen Sequenzen können z. B. Promotoren oder Enhancer bzw. Verstärker sein. Die regulatorische Sequenz kann dann eingebaut werden in den rechten Locus des Genoms durch homologe Rekombination, wobei die regulatorische Sequenz operativ mit dem Gen verbunden wird, dessen Expression induziert oder verstärkt werden muss. Die Technik wird üblicherweise bezeichnet als „endogene Genaktivierung (EGA)" und ist z. B. in WO 91/09955 beschrieben.
Der Fachmann in der Technik wird verstehen, dass es ebenfalls möglich ist IL-18-Expression direkt abzuschalten, ohne die Verwendung eines Inhibitors von IL-18, mit der gleichen Technik. Um dies zu tun kann ein Negativregulationselement, wie etwa ein Stillschaltelement, in den Genlocus von IL-18 eingebaut werden, was zur Herabregulation oder Verhinderung von IL-18-Expression führt. Der Fachmann in der Technik wird verstehen, dass eine solche Herabregulation oder Stillschaltung der IL-18-Expression die gleiche Wirkung hat wie die Verwendung eines IL-18-Inhibitors zum Verhindern und/oder Behandeln einer Krankheit.
Der IL-18-Inhibitor, der gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, kann vorzugsweise verabreicht werden als pharmazeutische Zusammensetzung, optional in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Inhibitors.
IL-18BP und seine Isoformen, Muteine, fusionierten Proteine, funktionellen Derivate, aktiven Fraktionen oder im Kreislauf permutierten Derivate, wie oben beschrieben, sind die bevorzugten aktiven Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Die Definition von „pharmazeutisch verträglich" soll jeden Träger, der die Effizienz der biologischen Aktivität des aktiven Bestandteils nicht beeinträchtigt und der nicht toxisch für den Wirt ist, an welchen er verabreicht wird, bedeuten. Für parenterale Verabreichung kann (können) das (die) aktive(n) Protein(e) z. B. formuliert werden in einer Einheitsdosisform zur Injektion in Vehikeln, wie etwa Kochsalzlösung, Dextroselösung, Serumalbumin- und Ringerscher Lösung.
Die aktiven Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung können einem Individuum auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungsroute umfasst intradermale, transdermale (z. B. in Formulierungen mit langsamer Freisetzung), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, intracraniale, epidurale, topikale und intranasale Routen. Jede beliebige andere therapeutisch effiziente Verabreichungsroute kann verwendet werden, z. B. Absorption durch Epithel- oder Endothelgewebe oder durch Gentherapie, worin ein DNA-Molekül, das für das aktive Mittel codiert, dem Patienten verabreicht wird (z. B. über einen Vektor), was bewirkt, dass der aktive Bestandteil in vivo exprimiert und sekretiert wird. Zusätzlich kann (können) das (die) Protein(e) gemäß der Erfindung zusammen verabreicht werden mit anderen Komponenten biologisch aktiver Mittel, wie etwa pharmazeutisch verträgliche oberflächenaktive Mittel, Exzipienten, Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel.
Zur parenteralen (z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär) Verabreichung kann (können) das (die) aktive(n) Protein(e) formuliert werden als eine Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophylisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Vehikel bzw. Träger (z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextroselösung) und Additiven, die Isotonizität (z. B. Mannitol) oder chemische Stabilität (z. B. Konservierungsmittel und Puffer) beibehalten. Die Formulierung wird sterilisiert durch allgemein verwendete Techniken.
Die Bioverfügbarkeit des (der) aktiven Proteins (Proteine) gemäß der Erfindung kann auch verbessert werden durch Verwendung von Konjugationsprozessen, die die Halbwertszeit des Moleküls im menschlichen Körper erhöhen, z. B. Binden des Moleküls an Polyethylenglykol, wie z. B. in der PCT-Patentanmeldung WO 92/13095 beschrieben.
Die therapeutisch wirksamen Mengen des (der) aktiven Proteins (Proteine) werden eine Funktion vieler Variablen sein, einschließlich des Typs des Antagonisten, der Affinität des Antagonisten für IL-18, jeglicher restlichen cytotoxischen Aktivität, die durch den Antagonisten gezeigt wird, die Route der Verabreichung, den klinischen Zustand des Patienten (einschließlich der Wunsch des Beibehaltens eines nichttoxischen Grades endogener IL-18-Aktivität).
Eine „therapeutisch effektive Menge bzw. therapeutisch wirksame Menge" ist so, dass bei Verabreichung der IL-18-Inhibitor zur Inhibierung der biologischen Aktivität von IL-18 führt. Die als Einzel- oder Mehrfachdosis einem Individuum verabreichte Dosis wird in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren variieren, einschließlich IL-18-Inhibitor-Pharmakokinetikeigenschaften, Verabreichungsweg, Patientenzustände und Charakteristika (Geschlecht, Alter, Körpergewicht, Gesundheit, Größe), Ausmaß der Symptome, gleichzeitige Behandlungen, Häufigkeit der Behandlung und gewünschte Wirkung. Die Einstellung und Veränderung von etablierten Dosisbereichen sind klar im Bereich der Fähigkeit des Fachmanns in der Technik, wie auch in vitro- und in vivo-Verfahren zum Bestimmen der Inhibierung von IL-18 in einem Individuum.
Gemäß der Erfindung wird der Inhibitor von IL-18 in einer Menge von etwa 0,001 bis 100 mg/kg oder etwa 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht oder etwa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht oder etwa 1 bis 3 mg/kg Körpergewicht oder etwa 2 mg/kg Körpergewicht verwendet.
Die Verabreichungsroute, die gemäß der Erfindung bevorzugt ist, ist Verabreichung durch die subkutane Route. Intramuskuläre Verabreichung ist weiterhin bevorzugt gemäß der Erfindung. Zum direkten Verabreichen des IL-18-Inhibitors an die Stelle seiner Wirkung ist es ebenfalls bevorzugt, ihn topisch zu verabreichen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird der Inhibitor von IL-18 täglich oder jeden zweiten Tag verabreicht.
Die täglichen Dosen werden üblicherweise in aufgeteilten Dosen oder in einer Depotfreisetzungsform verabreicht, welche effektiv sind zum Erhalten der gewünschten Ergebnisse. Zweite oder nachfolgende Verabreichungen können in einer Dosis erfolgen, die die gleiche ist, geringer als oder größer als die ursprüngliche oder vorausgehende Dosis ist, die dem Individuum verabreicht wurde. Eine zweite oder nachfolgende Verabreichung kann während des oder vor dem Auftreten der Krankheit verabreicht werden.
Gemäß der Erfindung kann der IL-18-Inhibitor prophylaktisch oder therapeutisch einem Individuum vor, gleichzeitig oder nachfolgend auf andere therapeutische Behandlungen oder Mittel (z. B. Mehrfacharzneimittelbehandlungen) in einer therapeutisch wirksamen Menge, im Besonderen mit einem TNF-Inhibitor und/oder anderen Herzschutzmitteln, verabreicht werden. Aktive Mittel, die gleichzeitig mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden, können in den gleichen oder verschiedenen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Mischen einer wirksamen Menge eines IL-18-Inhibitors und/oder eines TNF-Antagonisten mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung einer Herzkrankheit, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines IL-18-Inhibitors, optional in Kombination mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines TNF-Antagonisten, an einen Patienten, der dessen bedarf.
BEISPIELE
Beispiel 1: Inhibierung von IL-18 verringert myokardiale ischämische Dysfunktion in vitro
Material und Verfahren
Reagenzien
IL-18BPa-Isoform wurde exprimiert mit einem N-terminalen (His)₆-tag in chinesischen Zwerghamster-Ovarzellen und bis zur Homogenität gereinigt. Die Fähigkeit von IL-18-BPa-(His)₆ zum Neutralisieren von IL-18 ist beschrieben worden (Kim et al., 2000). Der ICE-Inhibitor (ICEi) Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (YVAD) wurde von Alexis Biochemicals (San Diego) bezogen und mit 10 mg/ml in DMSO solubilisiert. Der ICEi wurde verdünnt in Tyrodescher Lösung bevor er verwendet wurde. Auf humanen periphären mononuklearen Blutzellen verringert der ICEi Endotoxin-induzierte Sekretion von reifem IL-1β um 92%, gemäß Messung durch ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).
Isolierte Atriumtrabekel
Patienten, die eine ausgewählte Koronararterienbypassoperation mit einem Pumpenoxygenator erfahren, erfordern das Einführen einer Kanüle in das rechte Atrium. Zu dieser Zeit wird ein kleines Segment des rechten Atriumappendix routinemäßig herausgeschnitten und verworfen. Trabekel wurden von diesem verworfenem Gewebe erhalten. Humanes Atriumgewebe wurde in oxygenierter modifizierter Tyrodescher Pufferlösung bei 4°C angeordnet. Modifizierte Tyrodesche Lösung wurde täglich hergestellt mit entionisiertem destilliertem Wasser und enthielt 5,0 mmol/Liter D-Glucose, 2,0 mmol/Liter CaCl₂, 118,0 mmol/Liter NaCl, 4,0 mmol/Liter KCl, 1,2 mmol/Liter MgSO₄·7H₂O, 25,0 mmol/Liter NaHCO₃ und 1,2 mmol/Liter NaH₂PO₄. Die substratfreie Tyrodesche Lösung enthielt 7 mmol/Liter Cholinchlorid, um Osmolarität beizubehalten. Wenn es nicht anders angegeben ist, wurden Chemikalien und Reagenzien von Sigma erhalten. Zwei bis vier Trabekel (4–7 mm lang und < 1,0 mm Durchmesser) wurden an einem Kraftwandler befestigt und in ein erwärmtes (37°C) 30 ml-Bad aus modifizierter Tyrodescher Lösung eingetaucht; ein 92,5% O₂/7,5% CO₂-Gemisch wurde während Normoxie durchgeperlt. Dieses Gasgemisch lieferte einen O₂-Partialdruck von > 350 mmHg (1 mmHg = 133 Pa), einen Partialdruck von CO₂ von 36–40 mmHg und einen pH-Wert von 7,35–7,45. Jeder Parameter wurde routinemäßig überprüft mit einem automatischen Blutgasanalysator. Die Organbadtemperatur wurde bei 37°C während des Versuches gehalten. Während simulierter Ischämie wurde das Gasgemisch auf 92,5% N₂/7,5% CO₂ umgestellt. Das Gemisch erzeugte einen O₂-Partialdruck von < 50 mmHg. Die Pufferlösung wurde alle 20 min ausgetauscht, ausgenommen während der 30 min Periode simulierter Ischämie.
Versuchsausgestaltung
Trabekel wurden äquilibriert für 90 min, um die Bezugslinienstreckkraft auf 1.000 mg zu erhöhen und Stabilisierung der entwickelten Kraft zu erlauben. Trabekel, die dabei versagten mehr als 250 mg entwickelte Kraft zu erzeugen, wurden aus der Studie ausgeschlossen. Während der 90 min Äquilibrierung wurde eine Schrittsteuerung mit Platinelektroden (Radnoti Glass, Monrovia, CA) zur Feldstimulierung durchgeführt. Die Elektroden wurden auf jeder Seite des Trabekels angeordnet, stimuliert (Grass SD9 Stimulator, Warwick, RI) mit 6 ms-Pulsen bei einer Spannung von 20% über dem Schwellenwert und mit 1 Hz abgeschritten während Normoxie und mit 3 Hz während Ischämie. Kontraktionen wurden durch Kraftwandler beobachtet (Grass FT03) und aufgezeichnet mit einem computergesteuerten Vorverstärker und Digitalisierer (MacLab Quad Bridge, MacLab/8e, AD Instruments, Milford, MA) und kontinuierlich mit einem Macintosh-Rechner beobachtet.
Nach Äquilibrierung wurden Trabekel von einem einzelnen Patienten unter drei Versuchsbedingungen untersucht: Kontrollbedingungen bestanden aus 90 min normoxischer Suprafusion; I/R bestand aus 30 min simulierter Ischämie, gefolgt von 45 min Reperfusion; und der dritte Zustand bestand aus einer Anticytokinintervention. Im letzteren Fall wurde das Anticytokin zu dem Suprafusionsbad unmittelbar vor Einsetzen von Ischämie gegeben und lag über die 45 min Reperfusion vor.
Beibehaltene Trabekel CK-Aktivität
Endreperfusiongewebe (90 min)-CK-Aktivität wurde wie beschrieben bestimmt (Kaplan et al., 1993). Gewebe wurden homogenisiert in 100 Vol eiskaltem isotonischen Extraktionspuffer (Cleveland et al., 1997, Kaplan et al., 1993). Der Assay wurde mit einem CK-Kit (Sigma) unter Verwendung eines automatischen Spektrophotometers durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Einheiten CK-Aktivität pro mg (Feuchtgewicht des Gewebes) angegeben.
RNA-Isolierung und reverse Transkription-gekoppelte PCR
Frische Tabekel wurden homogenisiert in Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati) und Gesamt-RNA wurde isoliert mit Chloroformextraktion und Isopropanolpräzipitation. Die RNA wurde solubilisiert in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser, DNase-behandelt und quantifiziert unter Verwendung von GeneQuant (Amersham Pharmacia Biotech). cDNA-Verfahren sind beschrieben worden (Reznikov et al., 2000). Für jede PCR wurde die folgende Abfolge verwendet: Vorerwärmen bei 95°C für 15 min, dann Zyklen von 94°C für 40 s, 55°C für 45 s und 72°C für 1 min, mit einer finalen Extensionsphase bei 72°C für 10 min. Die optimale Anzahl von Zyklen wurde als 35 bestimmt. Die Primer für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und humanes IL-18 (Reznikov et al., 2000) und für humanes IL-18BPa (Kim et al., 2000) sind beschrieben worden. Die PCR-Produkte wurden getrennt auf einem 1,5% Agarosegel, enthaltend 0,5 × TBE (50 mM Tris/45 mM Borsäure/0,5 mM EDTA, pH-Wert 8,3) mit Ethidiumbromid bei 0,5 mg/ml, sichtbar gemacht durch UV-Bestrahlung und fotografiert. Densitometrie wurde auf dem Negativbild durchgeführt (IMAGEQUANT Software, Molecular Dynamics) und die relative Absorption der IL-18- und IL-18BP-PCR-Produkte wurde gegen die Absorption korrigiert, die für GAPDH erhalten wird.
IL-18-Bestimmungen
Frische Trabekel wurden wie oben für CK-Messungen beschrieben, homogenisiert. IL-18 wurde mit Flüssigphasenelektrochemilumineszenz (ECL, Igen, Gaithersburg, MD) analysiert. Maus-Anti-Human-IL-18 mAb (R & D Systems) wurde mit Ruthenium (Igen) markiert. Zusätzlich wurde Affinitäts-gereinigter Ziege-Anti-Human-IL-18-Antikörper (R & D) markiert mit Biotin (Igen). Der biotinylierte Antikörper wurde auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in PBS (pH-Wert 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 0,5% Tween-20 und 0,01% Azid (ECL-Puffer) verdünnt. Pro Assayröhrchen wurden 25 μl des biotinylierten Antikörpers bei Raumtemperatur durch heftiges Schütteln vorinkubiert mit 25 μl Streptavidinbeschichteten paramagnetischen Kügelchen (Dynal, Great Neck, NY), bei 1 μg/μl für 30 min. Zu testende Proben (25 μl) oder Standards wurden zu den Röhrchen gegeben, gefolgt von 25 μl ruthenyliertem Antikörper (Endkonzentration, 1 μg/μl, verdünnt in ECL-Puffer). Die Röhrchen wurden dann für 24 h geschüttelt. Die Reaktion wurde gequencht durch die Zugabe von 200 μl PBS pro Röhrchen und das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde bestimmt mit einem Origen Analysator (Igen). Die Nachweisgrenze für IL-18 ist 16 pg/ml.
Konfokal-Mikroskopie
Humanes Atriumgewebe, das während Insertion der Kanüle des Pumpenoxygenators erhalten wurde, wurde in einer 1 cm-Plastikhalterung (Meldrum et al., 1998) angeordnet, eingebettet und eingefroren in Gewebegefriermedium (Triangle Biomedical Sciences, Durhman, NC), auf Isopentan gekühlt mit Trockeneis. Gefrorene Sektionen (5 μm) wurden auf einem Leica CM 1850 Cryostat (Leica, Deerfield, IL) geschnitten. Die Objektträger wurden für 10 min in 4% Paraformaldehyd fixiert, luftgetrocknet und inkubiert für 20 min in PBS, supplementiert mit 10% normalem Ziege-Serum. Sektionen wurden inkubiert in 1:100-Verdünnung von Kaninchen-Anti-Human-IL-18-Antikörper (Peprotech, Rocky Hill, NJ) oder nicht-immunem Kaninchen-IgG bei 1 μg/ml als negative Kontrolle. Die Antikörper wurden in PBS, enthaltend 1% BSA-Puffer, verdünnt. Nach einer Übernachtinkubation bei 4°C wurden die Sektionen dreimal mit 0,5% BSA in PBS gewaschen. Die Sektionen wurden dann mit einem zweiten Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert an Alexa488 (Molecular Probes), für 60 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Kerne wurden blau gefärbt mit Bisbenzimid (Sigma) bei 1 μg/100 ml. Nach Färbung wurden Sektionen gewaschen und untersucht mit dem Leica DM RXA (Leica) Konfokallaserscanningsystem und analysiert mit SLIDEBOOK Software für Macintosh (Intelligent Imaging Innovations, Denver).
Statistische Analyse
Daten wurden angegeben als das Mittel ± mittlerer Standardfehler. Mittlere Veränderungen der entwickelten Kraft wurden relativ zum Kontrollwert bei 90 min für jedes Patientengewebe berechnet. Statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen Gruppen wurden bestimmt durch faktorielle ANOVA mit Bonferroni-Dunn post hoc-Analyse. Statistische Analysen wurden durchgeführt mit STAT-VIEW 4.51-Software (Abacus Concepts, Calabasas, CA).
Ergebnisse
Die Wirkung der Neutralisierung von endogenem IL-18 mit IL-18BP auf postischämisch entwickelte Kraft
1A zeigt die kinetische Antwort von Trabekeln auf I/R-Verletzung. Die finalen 15 min Äquilibrierung sind gezeigt und auf 100% am Beginn der Versuchsperiode normalisiert. Kontroll-Trabekel werden suprafusioniert unter normoxischen Bedingungen während des Versuches. Wie gezeigt, gibt es eine Verringerung (10%) der Entwicklungskraft in den Kontroll-Trabekeln. Trabekel, die Ischämie unterliegen, zeigen eine rasche Abnahme der Kontraktionsfunktion; bei Reperfusion kehrt die Kontraktionskraft auf ungefähr 25% der entwickelten Kontrollkraft zurück. Im Gegensatz hierzu kehrten Trabekel, die Ischämie ausgesetzt wurden, jedoch in der Gegenwart von IL-18BP, auf 55% der von der Kontrolle entwickelten Kraft zurück. Zum Beurteilen der I/R-Antwort von Herzgeweben von verschiedenen Patienten wurde der Grad der entwickelten Kraft in den Kontrolltrabekeln bei 90 min auf 100% für die Probe jedes Patienten gesetzt und die relative prozentuale Veränderung der entwickelten Kraft für die Experimentgruppen wurde berechnet.
Wie in 1B gezeigt, wurde die postischämisch entwickelte Kraft in unbehandelten Trabekeln (I/R) auf ein Mittel von 35% der Kontrolle verringert. Jedoch in der Gegenwart von IL-18BP wurde diese Verringerung auf ein Mittel von 66,2% der Kontrolle abgeschwächt bei 1 μg/ml bzw. 76% der Kontrolle bei 5 μg/ml. Diese Ergebnisse legen nahe, dass I/R zur Freisetzung von biologisch aktivem IL-18 nach Prozessieren des endogenen Vorläufer IL-18 durch ICE führt. Daher wurde IL-18 gemessen in frisch erhaltenem Attriumgewebe. Wie in 2 gezeigt, lag Basal-IL-18 in Trabekeln, erhalten vor der Insertion der Pumpen-Oxygenatorkanüle in das rechte Atrium, vor. Nach 90 min Äquilibration, 30 min Ischämie und 45 min Reoxygenierung wurden Trabekel homogenisiert und IL-18-Gehalte bestimmt. Es gab eine 4,5-fache Erhöhung von IL-18 in dem Gewebe nach I/R (2).
Stationärszustands-mRNA-Gehalte für IL-18 und IL-18BP wurden ebenfalls in diesen Geweben bestimmt. Wir beobachteten Basalgenexpression für IL-18 und IL-18BP in den frisch erhaltenen präischämischen Atriumhomogenaten (3A, B). Ähnlich zur Erhöhung von IL-18-Protein, induzierte I/R eine weitere Erhöhung der Stationärszustands-IL18-mRNA-Gehalte (4,7-fache Erhöhung). IL-18BP-Genexpression wurde auch in frisch erhaltenem Atriumgewebe beobachtet und erhöhte sich nur moderat (1,3-fach) nach I/R.
Lokalisierung von IL-18 im humanem Myokard
Da IL-18-Protein, gemäß Messung durch ECL, und IL-18-mRNA in frisch erhaltenen Myokardhomogenaten vorliegen, wurde histochemisches Färben verwendet zum Bestimmen der Lokalisierung von IL-18. Atriumgewebe wurde unmittelbar vor Insertion der Pumpenoxygenatorkanüle erhalten und wurde unmittelbar schnellgefroren (nicht gezeigt). IL-18 wurde beobachtet in residenten myokardinalen Makrophagen und innerhalb der vaskulären Endothelzellen. Das IL-18 in Makrophagen und Endothelzellen liegt vor bevor eine beliebige Operations-bezogene Ischämie stattfindet und liegt vor in der Abwesenheit eines Kontakts mit beliebigen fremden Oberflächen. Die Lokalisierung von IL-18 in residenten Makrophagen und Endothelzellen ist übereinstimmend mit früheren Studien von konstitutiv vorgebildetem Vorläufer-IL-18 in frisch erhaltenen humanen periphären Monozyten von gesunden Individuen (Puren et al., 1999). Daher kann geschlossen werden, dass vorgeformtes Vorläufer-IL-18 im Myokard von Patienten vorliegt, die für Koronararterienbypass bei ischämischer Herzkrankheit vorgesehen sind.
Der Effekt von ICE-Inhibierung auf postischämisch entwickelte Kraft
Da IL-18BP effektiv Ischämie-induzierte myokardiale Dysfunktion abschwächte, stellten wir die Hypothese auf, dass Inhibierung der Umwandlung von vorgeformtem Vorläufer-IL-18 in reifes IL-18 ebenfalls Ischämie-induzierte myokardiale Dysfunktion abschwächen würde. Daher wurde der spezifische ICE-Inhibitor YVAD zu dem Suprafusionsbad vor dem Einsetzen von Ischämie zugegeben. ICE-Inhibierung durch die Zugabe von YVAD wurde fortgesetzt während der ischämischen Dauer und während Reperfusion. YVAD-vermittelte Inhibierung von ICE resultierte in Abschwächung von Ischämie-induzierter Myokarddysfunktion, wie gezeigt durch die Verbesserung der Kontraktionsfunktion von 35% der Kontrolle in I/R auf 60% bei 10 μg/ml und 75,8% bei 20 μg/ml (4). Diese Ergebnisse bestätigen, dass biologisch aktives IL-18 in humanem Myokard das Ergebnis der Spaltung von vorgebildetem Vorläufer IL-18 durch ICE ist. Zusätzlich legen diese Ergebnisse nahe, dass myokardiale Ischämie latente ICE aktivieren kann.
Aufrecherhaltung von Zelllebensfähigkeit
Intrazelluläre Gehalte von CK wurden verwendet zum Beurteilen des Ausmaßes der Zelllebensfähigkeit nach I/R. In diesem Assay ist umso höher der CK-Wert ist, umso größer die Anzahl lebensfähiger Zellen. Jede der Anticytokininterventionen führte zur Aufrechterhaltung von Zelllebensfähigkeit. Wie in 5 gezeigt, erhöhten IL-18BP und ICE-Inhibierung (10 und 20 μg/ml), intrazelluläre CK-Gehalte nach I/R von 1.399 auf 5.921, 5.675, 6.624 bzw. 4.662 Einheiten CK-Aktivität pro mg (feuchtes Gewebe). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Inhibierung von I/R Aktivierung von IL-18 induzierte und myozelluläre Lebensfähigkeit in diesem ex vivo-Modell aufrechterhält.
Effekt der Neutralisierung von TNFα-induzierter Myokardfunktion
Wie in 6 gezeigt, wurde die entwickelte Kraft (DF) von Trabekeln um 18% verringert nach 90 Minuten aussetzen an exogenes TNFα. Neuralisierung von exogenem IL-18 auf die Kontraktionsfunktion in humanem Myokard, das exogenem TNFα ausgesetzt wird, durch Inkubation mit IL-18BP für zehn Minuten vor der Zugabe von TNFα, reduzierte die Größenordnung des Abfalls der entwickelten Kraft (DF), siehe 6. Nach 90 Minuten hatte die entwickelte Kraft in der Kontrollgruppe um 18% abgenommen, während in den TNFα-ausgesetzten Trabekeln sie um 58% im Vergleich zur Kontrolle zunahm. Jedoch in TNFα-ausgesetzten Trabekeln mit IL-18BP fiel die entwickelte Kraft um nur 30% im Vergleich zur Kontrolle ab. Diese Daten legen nahe, dass direkte Wirkungen von TNFα auf Myokardkontraktionsdepression zumindest zum Teil vermittelt werden durch biologisch aktives endogenes IL-18.
Wirkung von exogenem IL-18 auf die entwickelte Kraft
Als nächstes wurde die direkte Wirkung von exogenem IL-18 auf die Myokardkontraktionsfunktion bestimmt. IL-18 wurde zu suprafusionierten Trabekeln nach 90 Minuten Äquilibrierung und bei jedem Badaustausch gegeben. Wie in 7 gezeigt, führt IL-18 zu einer langsamen aber progressiven Abnahme der Entwicklungskraft während der Versuchsdauer. Nach 90 Minuten kontinuierlichem Aussetzen an IL-18 war die entwickelte Kraft um 42% erniedrigt. Diese Daten zeigen, dass exogenes IL-18, ähnlich TNFα, als ein Myokarddepressionsmittel wirkt.
Interessanterweise ist IL-18 kein so potentes Myokarddepressionsmittel wie TNFα.
Aufrechterhaltung von Zelllebensfähigkeit
Caspasen sind häufig assoziiert mit Apoptose. Zum Beurteilen der Zelllebensfähigkeit in Trabekeln, die TNFα ausgesetzt sind, wurde intrazelluläre Gewebekreatinkinase (CK) gemessen. In diesem Assay zeigen hohe CK-Gehalte lebensfähige Zellen an. Wie in 8 dargestellt, enthielten Kontrolltrabekel, die 90 Minuten normoxische Superfusion eingingen, 6801 ± 276 Einheiten CK-Aktivität pro Milligramm feuchtem Gewebe. Im Gegensatz hierzu zeigten Trabekel, die einer 30/45 Minuten I/R-Verletzung oder 90 Minuten TNFα-Aussetzung unterzogen wurden, erniedrigte Gehalte von aufrechterhaltenem CK von 1774 ± 181 bzw. 3246 ± 217 Einheiten/mg. Trabekel, die TNFα in der Gegenwart von IL-18BP ausgesetzt wurden, enthielten 5605 ± 212 Einheiten/mg Gewebe. Interessanterweise hatten Trabekel, die mit TNFα behandelt wurden, im Vergleich mit I/R-Trabekeln größere aufrechterhaltene CK-Gehalte. Dies war eine unerwartete Entdeckung, da die Größenordnung der Entwicklungskraft am Ende der Versuchsdauer ähnlich für I/R und TNFα war.
Beispiel 3: IL-18BP schützt vor Myokardinfarkt IL-18BP in vivo-Verfahren
In vivo-intramuskulärer Elektrotransfer von Maus-IL18BP-
Expressionsplasmid
C57BL/6-Mäuse erhielten in einem 3-Wochen-Intervall 3 Injektionen mit einem Expressionsplasmid, enthaltend die cDNA für IL-18BP (genannt pcDNA3-IL18BP, beschrieben in WO 01/85201 ). Die Kontrollmäuse erhielten eine Injektion mit dem leeren Kontrollplasmid. Maus-IL-18BP-Isoform d cDNA, isoliert wie beschrieben (Hinterlegungsnummer Nr. Q9ZOM9) (Kim et al., 2000) wurde subkloniert in die EcoR1/Not1-Stellen von Säugerzellexpressionsvektor pcDNA3 unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors (Invitrogen). Das Kontrollplasmid war ein ähnliches Konstrukt ohne therapeutische cDNA. Die Kontrollgruppe umfasste 31 Mäuse, die Versuchsgruppe, die IL-18BP erhält, umfasste 27 Mäuse.
Das IL-18BP- oder Kontrollexpressionsplasmid (60 μg) wurde injiziert in beide Tibialcranialmuskeln der anästhesierten Maus, wie zuvor beschrieben (Mallat et al., 1999). Kurz gesagt, wurden transkutane elektrische Pulse (8 elektrische Quadratwellenpulse von 200 V/cm, 20 msec Dauer bei 2 Hz) bereitgestellt durch einen PS-15 Elektropulsator (Genetronics, Frankreich), unter Verwendung von zwei Edelstahlplattenelektroden, angeordnet in einem Abstand voneinander von 4,2 bis 5,3 mm, an jeder Seite des Beines.
Induktion von Infarkt im linken Ventrikel
Vierundzwanzig Stunden nach Verabreichung des IL-18BP-Plasmids oder des leeren Plasmids wurden die Mäuse anästhesiert durch IP-Injektion von Xyalzin und Ketamin, beatmet und einer Thoractomie unterzogen. Die linke Hauptkoronararterie wurde dann permanent abgebunden unter Verwendung einer 8-O-Prolennaht, zum Induzieren eines Myokardinfarkts, wonach der Brustkorb geschlossen wurde und man ließ die Tiere sich aus der Anästhesie erholen. Präoperative Mortalität war weniger als 20%. Postoperative Mortalität war 48% in der Kontrollgruppe und 26% in der Versuchsgruppe und trat nahezu ausschließlich 4–5 Tage nach Ligatur auf.
Sieben Tage nach Ligatur wurden die Mäuse erneut anästhesiert und die Abmessungen des linken Ventrikels (LV) wurden beurteilt durch Echokardiographie im Zustand eines geschlossenen Brustkorbs, unter Verwendung eines ATL HDI 5000 Echokardiographen. Anteilige LV Verkürzung wurde berechnet aus den gemessenen Enddiastolen- und Endsystolen-Durchmessern. Am Ende der Echokardiographiemessung wurde das Herz entnommen, fixiert und später in Sektionen geschnitten. Histologische Sektionen wurden dann gefärbt mit Sirius-Rot zur Bestimmung des Infarktausmaßes.
Ergebnisse
Der Diastolen-Durchmesser des linken Ventrikelsystems sieben Tage nach Ligatur war in den überlebenden Mäusen wie folgt:
0,53 + 0,01 mm (n = 20) in Mäusen, die mit IL-18BP behandelt wurden gegenüber 0,59 + 0,01 mm in Kontrollmäusen (n = 16), p < 0,01.
Der Systolen-Durchmesser des linken Ventrikels sieben Tage nach Ligatur war in den überlebenden Mäusen wie folgt:
0,45 + 0,02 in Mäusen, die mit IL-18BP behandelt wurden gegenüber 0,52 + 0,02 in Kontrollmäusen, p < 0,01.
Anteiliges Verkützen des linken Ventrikels: 15 + 1% in Mäusen, die mit IL-18BP behandelt wurden gegenüber 11 + 1% in Kontrollmäusen, p < 0,01.
Schlussfolgerung: IL-18BP verringert die Mortalität von Mäusen nach Myokardinfarkt, induziert durch totale Koronarligatur des linken Ventrikels, um 50%. Zusätzlich hierzu wurde die Funktion des linken Ventrikels signifikant verbessert, wie gezeigt durch verringerte Systolen- und Diastolen-Durchmesser des linken Ventrikels.
REFERENZEN

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Claims

Verwendung eines Inhibitors von IL-18 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhinderung von Kardiomyopathie, worin der Inhibitor von IL-18 ausgewählt ist aus einem Inhibitor von Caspase-1 (ICE), Antikörpern gegen IL-18, Antikörpern gegen eine beliebige der IL-18-Rezeptoruntereinheiten und IL-18-Bindungsproteine, oder Isoformen, Muteinen, fusionierten Proteinen oder funktionellen Derivaten davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor von IL-18 ein Antikörper ist, der gegen IL-18 gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor von IL-18 ein Antikörper ist, der gegen den IL-18-Rezeptor α gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor von IL-18 ein Antikörper ist, der gegen den IL-18-Rezeptor 11 gerichtet ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Antikörper ein humanisierter oder humaner Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der ICE-Inhibitor Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (YVAD) ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor von IL-18 ein IL-18-Bindungsprotein oder eine Isoform, ein Mutein, fusioniertes Protein oder ein funktionelles Derivat davon ist, welches die biologische Aktivität von IL-18 inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 7, worin der IL-18-Inhibitor an einer oder mehreren Stellen glykosyliert ist.
Verwendung nach Anspruch 7 und 8, worin das fusionierte Protein eine Immunglobulin(IG)fusion umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin das funktionelle Derivat mindestens einen Rest umfasst, der gebunden ist an eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die als eine oder mehrere Seitenketten auf den Aminosäureresten auftreten.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Rest ein Polyethylenrest ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament weiterhin einen Tumor-Nekrosefaktor(TNF)-Antagonisten umfasst.
Verwendung nach Anspruch 12, worin der Inhibitor von IL-18 gleichzeitig, sequentiell oder getrennt mit dem TNF-Antagonisten verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin der TNF-Antagonist TBPI und/oder TBPII ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Inhibitor von IL-18 in einer Konzentration im Bereich zwischen etwa 0,001 bis 100 mg/kg oder etwa 1 bis 10 mg/kg oder 2 bis 5 mg/kg verwendet wird.
Verwendung eines Expressionsvektors, umfassend die codierende Sequenz eines Inhibitors von IL-18 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Kardiomyopathie, worin der Inhibitor von IL-18 ausgewählt ist aus Antikörpern gegen IL-18, Antikörpern gegen eine beliebige der II-18-Rezeptoruntereinheiten und IL-18-Bindungsproteine oder Isoformen, Muteine, fusionierte Proteine davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren.
Verwendung eines Expressionsvektors zum Induzieren und/oder Verstärken der endogenen Produktion eines Inhibitors von IL-18 in einer Zelle bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Kardiomyopathie, worin der Inhibitor von IL-18 ausgewählt ist aus IL-18-Bindungsproteinen oder Isoformen davon, die die biologische Aktivität von IL-18 inhibieren.