DE602004009818T2

DE602004009818T2 - Zusammensetzungen, die von melittin abgeleitet sind und peptide enthalten, und verfahren zur potenzierung von immunreaktionen gegen target-antigene

Info

Publication number: DE602004009818T2
Application number: DE602004009818T
Authority: DE
Inventors: Rinaldo Zurbriggen
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2024-11-06
Also published as: AU2004291277A1; WO2005049647A2; WO2005049647A3; CA2543072A1; DE602004009818D1; NO20062579L; US20050196383A1; EP1680446B1; ATE377023T1; EP1680446A2; US7538083B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunologie und der Vakzinologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein neues Adjuvans-System, das eine wirksame Immunantwort gegen Antigene nach Wahl erzeugt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der letzten Dekade sind große Fortschritte bei therapeutischen Ansätzen gemacht worden, die auf einer Vakzinierung gegen Antigene beruhen, die auf Tumorzellen und infektiösen Pathogenen vorhanden sind. Trotz der Fortschritte bei der Identifikation neuer Antigene und der Aufklärung von Mechanismen, die gezielte Immunantworten gegen derartige Antigene erlauben, sind noch etliche Herausforderungen zu lösen. Eine besondere Hürde ist die Erzeugung einer ausreichend starken Immunantwort, selbst nach der Identifikation neuer Antigene, da sich gezeigt hat, dass viele vielversprechende antigene Ziele nur schwach immunogen sind. Da solche schwachen Immunantworten wenig klinischen Nutzen bieten, ist die Entwicklung wirksamer Adjuvanzien, um die Immunogenität von Ziel-Antigenen zu verstärken, zu einem Ziel mit zunehmender therapeutischer Bedeutung geworden.
Immunisierungsstrategien, um CD8+ T-Zell-Antworten effizient zu primen, sind in den Fokus der Forschungsaktivität in der derzeitigen Vakzinologie gerückt. Kürzliche Fortschritte bei der Entwicklung wirksamer Adjuvanzien führten zu zwei alternativen Hauptansätzen, d. h. die Peptid- und DNA-basierten Vakzin-Zusammensetzungen.
Bei der genetischen Vakzinierung (Nukleinsäure, RNA oder DNA) handelt es sich bei dem verabreichten "Vakzin" um eine Plasmid-DNA, die Antigen-kodierende Sequenzen unter der Kontrolle heterologer Promotoren enthält, die zu einer Antigen-Expression in vivo und dessen immunogener Präsentation führen. Die Wirksamkeit zum spezifischen Primen einer TH1-begünstigenden Immunität macht die genetische Vakzinierung zu einem attraktiven Kandidaten für die prophylaktische oder therapeutische Immunisierung gegen intrazelluläre Pathogene und Krebs.
DNA-basierte Vakzine enthalten nicht-methylierte CpG-Motive, die angeborene Abwehrmechanismen des Wirtes stimulieren, indem sie die Produktion von TH1-ähnlichen pro inflammatorischen Cytokinen, Interferonen und Chemokinen triggern. (Gurunathan et al., 2000, Annu. Rev. Immunol. 18: 927–974). In ähnlicher Weise sind synthetische Oligonukleotide (ODN) mit CpG-Motiven wirksame Adjuvanzien, die ein Priming einer spezifischen TH1-Immunantwort gegen eine Vielzahl von Pathogenen ermöglichen (Krieg, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20: 709–760). Folglich handelt es sich bei CpG-enthaltenden ODN um attraktive Adjuvanzien zur Herstellung von Vakzinen, die die Schlüsselzellantwort des angeborenen oder spezifischen Immunsystem ausnutzen. Es wurde gezeigt, dass sie bei der spezifischen Immuntherapie von Krebs und Allergie in vorklinischen Modellen wirksam sind. Es wurde gezeigt, dass ODN-gestütztes Priming bezüglich der Stärke und der Langlebigkeit der CD8+ T-Zell-Immunität vielen alternativen Adjuvanzien überlegen ist. Trotz zahlreicher Methoden zur Verabreichung von ODNs, einschließlich der Injektion "nackter", in Liposomen eingeschlossener und Polymer-absorbierter DNA oder RNA, wurde die optimale Verabreichungsform von ODN als Adjuvans noch nicht gefunden.
Kind L. S. et al. ("Antigenic Adjuvant and Permeability Enhancing Properties of Melittin in Mice" (1981); Allergy, 36: 155–160) offenbaren, dass Melittin Eigenschaften als Adjuvans hat, dass es die Bildung von IgE in Mäusen ohne die Verwendung von Adjuvanzien induziert, als Adjuvans für Ovoalbumin in Mäusen wirkt und die vaskuläre Permeabilität verstärkt, die durch Antigen-Antikörper-Interaktionen in der Haut von Mäusen initiiert wird. Bramwell V. W. et al. ("Adjuvant Action of Melittin Following Intranasal Immunisation with Tetanus and Diphtheria Toxoids" (2003) Journal of Drug Targeting; 11: 525–530) offenbaren die Adjuvans-Wirkung von Melittin nach intranasaler Immunisierung mit Tetanus- und Diphtherie-Toxoiden. Es wurde gezeigt, dass Melittin Potenzial als ein neues mukosales Adjuvans für Antigene hat, die über den nasalen Weg verabreicht werden. Zhao Z. et al. („Immunogenicity of Dinitrocarboxyphenylated Melittin: the Influence of C-terminal Chain Shortening, N-terminal Substitution and Prolin Insertion At Positions 5 and 10." (1995), Journal of Peptide Science; Band 1: 140–148) offenbaren die Immunogenität von Melittin-Peptiden, denen die C-terminalen 6 Aminosäuren fehlen, gekoppelt an einen Dinitrocarboxyphenylrest und die Induktion von Antikörpern anti-Dncp durch den Melittin-Rest. Hoffmann P. et al. ("Induktion of an Epitope-specific Humoral Immune Response by Lipopeptide-hapten Conjugates: Enhancement of the Anti-melittin Response by a Synthetic T Helper (Th)-cell Epitope" (1997); FEMS-Immonology and Medical Microbiology; 17: 225–234) offenbaren Melittin und Melitthin-Fragmente, die die Aminosäuren 17–26 von Melittin umfassen und die Induktion von anti-Melittin-Antworten unter Verwendung von Lipopeptiden als Adjuvanzien.
Jedoch kann die Verabreichung sowohl von polykationischen Peptiden als auch von CpG-enthaltenden Oligonukleotiden trotz ihrer Versprechungen als wirksame Adjuvanzien toxische Wirkungen auf den Wirt ausüben, was ihre Nützlichkeit im klinischen Zusammenhang limitiert.
Es wäre daher wünschenswert, Adjuvans-Systeme zu entwickeln, die eine wirksame Immunstimulation zur Verfügung stellen, während sie das Risiko toxischer Nebenwirkungen reduzieren oder eliminieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Adjuvans-Systeme zur Verfügung, die das Risiko toxischer Nebeneffekte, die mit der Verwendung von bekannten Adjuvanzien verbunden sind, reduzieren, während sie eine wirksame Stimulation von Immunantworten gegen Ziel-Antigene bereitstellen. Diese neuen Adjuvans-Systeme basieren auf dem Gift der Honigbiene, Melittin (SEQ ID Nr. 12), oder spezifischen kationischen Peptiden, die von Melittin abgeleitet sind und in der Lage sind, starke Immunantworten gegen Ziel-Antigene hervorzurufen. Um ihre Immunogenität weiter zu verstärken, können diese optional mit synthetischen Oligonukleotiden (ODNs) kombiniert werden, denen immunstimulatorische Sequenzen, wie z. B. CpG-Motive, fehlen,
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein immunstimulatorisches Peptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2, 3 oder 11 umfasst; oder aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 11.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass ODNs, die keine immunstimulatorischen Sequenzen enthalten, verwendet werden können, um Immunantworten gegen Antigene zu verstärken, wenn diese mit von Melittin abgeleiteten Peptiden kombiniert werden, und die Risiken der Toxizität, die mit CpG-ODNs assoziiert sind eliminieren, und neue und sicherere therapeutische Ansätze ermöglichen.
Folglich ist die vorliegende Erfindung außerdem auf eine immunstimulatorische Zusammensetzung gerichtet, die ein immunstimulatorisches Peptid umfasst, das das Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst, und die weiterhin wenigstens ein Oligonukleotid umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das wenigstens eine Oligonukleotid ein nicht-CpG- Oligonukleotid. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das wenigstens eine Oligonukleotid mit dem immunstimulatorischen Peptid komplexiert oder mit dem immunstimulatorischen Peptid, einem Ziel-Antigen oder einer Fusion davon, kovalent verbunden.
Die Elimination der Notwendigkeit immunogener Sequenzen in den Oligonukleotiden, die verwendet werden, stellt einen klaren Vorteil des Adjuvans-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung dar, da es die Verwendung von nicht-toxischen DNA- und RNA-Sequenzen erlaubt, um die Immunreaktionen gegen spezifische Antigene zu stimulieren, ohne das Risiko einer systemischen Immunogenität und Toxizität für den Patienten.
Um die immunstimulatorische Wirkung von Melittin oder von Melittin-abgeleiteten Peptiden, die optional mit ODNs komplexiert sind, auf spezifische antigene Ziele zu richten, kann die Aminosäuresequenz eines Antigens von Interesse zu der Melittin-abgeleitetes Peptid/ODN-Mischung gegeben werden und an das Individuum verabreicht werden. Die genannten Ziel-Antigene können Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, kleine Moleküle und Nukleinsäuren umfassen, die spezifische B- und T-Zell-Antigene darstellen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein spezielles Beispiel für ein Antigen, das in den Beispielen erfolgreich verwendet wird, ist das Malaria-Antigen UK39 (siehe unten).
Folglich umfasst die vorliegende Erfindung außerdem eine immunstimulatorische Zusammensetzung, die Melittin oder von Melittin abgeleitete Peptide und die optionalen ODNs umfasst sowie weiterhin ein Ziel-Antigen umfasst.
Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung sind Fusionsproteine, die einen Teil der Aminosäuresequenz von Melittin umfassen, fusioniert mit einem Ziel-Antigen. In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung sind das immunstimulatorische Peptid und das Ziel-Antigen durch chemische Konjugation verbunden. In einer weiteren Ausführungsform sind das immunstimulatorische Peptid und das Ziel-Antigen durch eine Peptidbindung verbunden. Wenn sie fusioniert sind, können das Peptid und das Antigen durch Spacer-Aminosäuren oder Spacer-Gruppen separiert werden.
Um die immunstimulatorische Wirkung der Melittin oder der Melittin-abgeleiteten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung weiter zu potenzieren, können die Zusammensetzungen, die Melittin-abgeleitete immunstimulatorische Peptide, Ziel-Antigene und optional ODNs umfassen, weiterhin ein Liefer-Vehikel umfassen. Das Liefer-Vehikel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Liposomen, Virus-ähnlichen Partikeln und Virosomen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eines der immunstimulatorischen Peptide, Oligonukleotid, Ziel-Antigen-Peptide oder irgendeiner Fusion davon mit der Oberfläche von Liefer-Vehikeln verbunden.
Alternativ ist wenigstens eines der immunstimulatorischen Peptide, Oligonukleotid, Ziel-Antigen-Peptide oder irgendeiner Fusion davon in das Liefer-Vehikel eingekapselt.
Ebenfalls Teil der Erfindung ist eine Zusammensetzung, worin wenigstens eines der immunstimulatorischen Peptide, Oligonukleotid, Ziel-Antigen-Peptide oder irgendeiner Fusion davon in die Liefer-Vehikel eingekapselt ist und worin wenigstens eines der immunstimulatorischen Peptide, Oligonukleotid, Ziel-Antigen-Peptide oder irgendeiner Fusion davon mit der Oberfläche der Liefer-Vehikel verbunden ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die geeignet ist, um die cytotoxische Immunantwort durch Aktivierung von CD8+ Zellen zu triggern, ist eine immunogene Zusammensetzung, die ein von Melittin abgeleitetes Peptid zusammen mit einem Oligonukleotid und einem Ziel-Antigen eingekapselt in ein Virosom, umfasst.
Um die humorale Antwort auszulösen, umfasst die bevorzugte Zusammensetzung ein von Melittin abgeleitetes Peptid und ein Ziel-Antigen, gekoppelt an die Oberfläche eines Virosoms.
Ein Verfahren zum Potenzieren oder Hervorrufen einer Immunantwort, das den Schritt des Verabreichens einer der oben beschriebenen Zusammensetzungen an ein Individuum umfasst, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin von der vorliegenden Erfindung umfasst ist die Verwendung des immunstimulatorischen Peptides, das wenigstens eine Wiederholung der SEQ ID Nr. 1 umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Stimulieren oder Hervorrufen der Immunantwort gegen ein Antigen. In einer Ausführungsform umfasst das genannte Arzneimittel zum Stimulieren der Immunantwort zusätzlich wenigstens ein Oligonukleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das wenigstens eine Oligonukleotid ein nicht-CpG-Oligonukleotid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das genannte Arzneimittel zum Stimulieren der Immunantwort zusätzlich das genannte Antigen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt, dass die Adjuvans-Wirkung des von Melittin-abgeleiteten Peptids, kombiniert mit einem Antigen und einem Oligodeoxynukleotid, das kein CpG oder irgendwelche anderen immunstimulatorischen Motive hat, mit IRIVs als Liefer-Vehikel weiter synergetisch wirkt. C57BI/6-Mäuse wurden i. m. mit 100 μl PBS enthaltend: 100 μg pCI/Ovalbumin (OVA), 50 μg Cys-OVA257-64, 50 μg Cys-OVA257-64 + 30 μg ODN-1982, 50 μg Cys-Mel-OVA257-64 + 30 μg ODN-1982, Virosomen mit 50 μg Cys-Mel-OVA257-64 kreuzvernetzt mit der Oberfläche, Virosomen mit 50 μg Cys-Mel-OVA257-64 kreuzvernetzt mit der Oberfläche + 30 μg ODN-1982 oder als Kontrolle nur mit PBS injiziert. Milzzellen, die 12 Tage nach der Vakzinierung von den immunisierten Mäusen erhalten wurden, wurden in vitro mit dem OVA257-64 Peptid restimuliert. Es sind Durchschnittszahlen von Peptid-spezifischen IFNγ+ CD8+ T-Zellen/10⁶ T-Zellen ± SD gezeigt (3 Mäuse pro Gruppe).
2 zeigt, dass ein von Melittin-abgeleitetes Peptid (KRKRQKRKRQ; SEQ ID Nr. 2) eine signifikante Adjuvans-Aktivität zeigt, wenn es mit einem Ziel-Antigen (T4) und einem Oligodeoxynukleotid kombiniert wird. Bemerkenswerterweise hängt die Adjuvans-Aktivität des Melittin-abgeleiteten Peptids nicht von dem Vorhandensein von CpG-Motiven in dem Oligodeoxynukleotid ab. Die Adjuvans-Aktivität des Melittin-abgeleiteten Peptids wirkt folglich synergistisch, selbst mit Oligodeoxynukleotiden, denen jegliche immunstimulatorischen Sequenzen fehlen.
C57BL/6 (B6)-Mäuse wurden entweder nicht immunisiert (Gruppe 1) oder i. m. mit 35 nmol des Peptids alleine (Gruppe 2) oder gemischt mit Oligodeoxynukleotid (Gruppe 3) vakziniert, ohne CpG-Motive (A; NSS+ ODN-1982; SEQ ID Nr. 7), oder mit CpG-Motiven (B; ISS+ ODN-1826; SEQ ID Nr. 6). Milzzellen, die 12 Tage nach der Vakzinierung von immunisierten Mäusen erhalten wurden, wurden ex vivo mit dem T4-Peptid VVYDFLKCM (Kb/T404-412, SEQ ID Nr. 4) restimuliert. Es sind Durchschnittszahlen spezifischer IFNγ± CD8+ T-Zellen/10⁵ CD8+ T-Zellen ± SD (6 Mäuse pro Gruppe), deren Durchschnitt aus zwei unabhängigen Experimenten gebildet wurde, angegeben.
3 zeigt, dass die humorale Immunantwort (B-Zell-Immunität) gegen ein Antigen, das an die Oberfläche eines IRIV gekoppelt ist, weiter durch die Zugabe von Melittin (SEQ ID Nr. 12) verstärkt werden kann. Balb/c-Mäuse wurden mit 100 μl PBS enthaltend: das Malaria-Mimetikum UK39 (20 μg UK39) in Verbindung mit einem IRIV mit oder ohne 10 μg Melittin immunisiert. Für den UK39-ELISA wurden ELISA-Platten über Nacht bei 4°C mit 10 μg/ml UK39 in PBS beschichtet. Nach dem Waschen mit PBS 0,05% Tween20 wurden die Platten mit 5% Trockenmilch in PBS 2 Stunden bei 37°C geblockt. Maussera der Tage 1 und 35 wurden zunächst 1:10 verdünnt und in seriellen 1:2 Verdünnungen in PBS 0,05% Tween20 0,5% Trockenmilch titriert. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Platten gewaschen und mit Ziege α-Maus IgG HRP Ab (BD Bioscience) (1:5000 in PBS 0,05% Tween20 0,5% Trockenmilch) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden mit OPD-Substrat (OPD (O-Phenylendiamin-Tabletten, Fluka, Schweiz, 1 Tablette in 50 ml Citrat-Puffer +50 μl H₂O₂) für 30 Minuten entwickelt. Die Reaktion wurde mit 1 M H₂SO₄ gestoppt, und die Platten wurden bei 492 nm ausgelesen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Adjuvans-Systeme zur Verfügung, die auf einem Set von neuen Peptiden beruhen, die von dem Giftprotein der Honigbiene, Melittin (SEQ ID Nr. 12), abgeleitet sind, die in der Lage sind, eine starke Immunantwort gegen Ziel-Antigene nach Wahl hervorzurufen.
In Kombination mit Oligonukleotiden (ODNs), denen jegliche bekannten immunstimulatorischen Sequenzen wie z. B. CpG-Motive fehlen, kann die immunpotenzierende Wirkung der offenbarten Peptide synergistisch verstärkt werden, ohne das Risiko von toxischen Nebenwirkungen, die mit der Verwendung bekannter Adjuvanzien assoziiert sind.
Immunstimulatorische ODNs wurden zuvor als DNA-Vakzine verwendet, jedoch wurde bisher angenommen, dass ihre Immunogenität mit ihrer Sequenz korreliert, dass sie z. B. nicht-methylierte CpG-Motive umfassen, die von dem Immunsystem des Wirtes als fremd oder bakterieller oder viraler Herkunft erkannt werden und dadurch eine Immunantwort auslösen. Jedoch ist die Sequenz, die für diese Adjuvans-Wirkung verantwortlich ist, gleichzeitig für dessen Toxizität gegenüber dem Wirt verantwortlich. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass selbst in relativ geringen Dosen die Verabreichung von ODNs, die immunstimulatorische Motive enthalten, inflammatorische Reaktionen und Sepsis induzieren kann, die zu einem septischen Schock in dem Wirt führt, von denen keine der beiden eine akzeptable Nebenwirkung bei klinischen Anwendungen wäre.
Die unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die immunogene Wirkung ODNs, die keine immunstimulatorische Sequenzen enthalten, verwendet werden kann, um die Immunantworten gegen Antigene zu potenzieren, wenn diese mit Melittin-abgeleiteten Peptiden kombiniert werden, beseitigt die mit CpG-ODNs assoziierten Risiken der Toxizität und ermöglicht neue und sicherere therapeutische Ansätze. Folglich ist die Entdeckung, dass die synergistische immunstimulatorische Wirkung von Oligonukleotiden, die mit Melittin-ableitenden Peptiden komplexieren, nicht von dem Vorhandensein immunstimulatorischer CpG-Sequenzen abhängig ist, von großer Wichtigkeit.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das Fusionieren eines Beispiel-Antigens mit einem von Melittin abgeleiteten Peptid und das Binden von Oligonukleotiden daran wirksame Immunogene für CD8+ T(Killer-T)-Zellen erzeugt und dass Oligonukleotide, denen jegliche immunogene Sequenzen fehlen, synergistisch mit Melittin-abgeleiteten Peptiden interagieren können, um einen wirksamen Adjuvans-Effekt gegen ein Ziel-Antigen nach Wahl zu erzeugen. Die Elimination des Erfordernisses immunogener CpG-Sequenzen in den verwendeten Oligonukleotiden stellt einen klaren Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber bekannten Verfahren dar, da dies die Verwendung nicht-toxischer Nukleinsäuresequenzen erlaubt, um die Immunreaktionen gegen spezifische Antigene zu stimulieren, ohne das Risiko einer systemischen Immunogenität und Toxizität für den Patienten.
Darüber hinaus repräsentieren die von Melittin abgeleiteten Peptide und Melittin selbst wirksame Immunogene, um die humorale Immunantwort (B-Zell-Antwort) gegen ein Ziel-Antigen hervorzurufen, optional gekoppelt an die Oberfläche eines Virosoms. Hierin kann das von Melittin abgeleitete Peptid außerdem direkt mit dem Antigen fusioniert werden. Im Gegensatz zu der cytotoxischen T-Zell-Immunität, wird die humorale Antikörper-basierte B-Zell-Immunität möglicherweise nicht weiter durch die Zugabe immunstimulatorischer Oligonukleotide verstärkt.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen bereit, die Melittin-abgeleitete Peptide umfassen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Sequenz KRKRQ (SEQ ID Nr. 1) und Wiederholungen davon (SEQ ID Nr. 2, 3, 11) und optional weiterhin Oligonukleotide umfassen, die kein(e) immunogene(s) Sequenz, Motiv oder Modifikation benötigen, um die immunstimulatorische Wirkung der Melittin-abgeleiteten Peptide synergistisch zu potenzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform rufen die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung die cytotoxische Immunität basierend auf CD8+ Zellen hervor, indem sie Melittin oder ein von Melittin abgeleitetes immunogenes Peptid, ein Ziel-Antigen eingeschlossen in ein Liefervehikel, vorzugsweise ein Virosom, und ein Oligonukleotid, vorzugsweise ein nicht-CpG-Oligonukleotid, umfassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dienen die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung dazu, die Antikörper-basierte B-Zell-Immunität auszulösen und umfassen folglich ein von Melittin abgeleitetes immunogenes Peptid und ein Antigen nach Wahl, gekoppelt an die Oberfläche eines Liefervehikels, vorzugsweise ein Virosom.
Man nimmt an, dass die Oligonukleotide an die Melittin-abgeleiteten immunogenen Peptide über elektrostatische Interaktionen zwischen dem negativ geladenen Phosphat-Rückgrad der Nukleinsäuren und den positiv geladenen Aminosäuren, die in den Peptiden vorhanden sind, binden. Daher werden keine chemischen Manipulationen neben einer einfachen Co-Inkubation benötigt, um die Peptide mit den ODNs zu komplexieren.
Um die immunstimulatorische Wirkung der von Melittin abgeleiteten Peptide, die optional mit ODNs komplexiert sind, auf spezifische antigene Ziele zu richten, kann die Aminosäuresequenz eines Antigens von Interesse zu der Mischung aus Melittin-abgeleitetem Peptid/ODN dazugegeben werden und dem Individuum verabreicht werden. Die genannten Antigene umfassen Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, die spezifische B- und T-Zell-Antigene darstellen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein Beispiel für ein Ziel-Antigen, das unter experimentellen Bedingungen erfolgreich getestet wurde, ist das Malaria-Mimetikum UK 39.
Anstatt sich auf die elektrostatischen Interaktionen zwischen den Melittin-abgeleiteten Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung und den ODNs zu verlassen, können die Peptide und Oligonukleotide kovalent verbunden werden, um Peptid-Oligonukleotid-Fusionsmoleküle zu erzeugen, die aus wenigstens einem ODN, gekoppelt an das Melittin-abgeleitete Peptid, das Ziel-Antigen oder eine Fusion von beiden, bestehen.
Um den immunstimulatorischen Effekt der immunogenen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung weiter zu potenzieren, können die Zusammensetzungen, die die Melittin-abgeleiteten Peptide, die Ziel-Antigen und ODNs umfassen, durch die hierin offenbarten Verfahren an die Oberfläche von Liefervehikel, wie z. B. Virosomen, gekoppelt werden. Alternativ können die von Melittin abgeleiteten Peptide, ODNs und Ziel-Antigen-Peptide durch hierin offenbarte Verfahren in die Liefervehikel eingekapselt werden. Als Alternative können die Melittin-abgeleiteten Peptide, ODNs und Ziel-Antigene sowohl in die Liefervehikel eingekapselt sein als auch an die Oberfläche von den Liefervehikeln gebunden sein.
Es sollte beachtet werden, dass auf Grundlage der vorliegenden Offenbarung ein Fachmann motiviert und in der Lage wäre, eine Vielzahl von Permutationen mit den Liefervehikel-Formulierungen der vorliegenden Erfindung durchzuführen, einschließlich der Bindung verschiedener Kombinationen von Melittin-abgeleiteten Peptiden, ODNs und/oder Ziel-Antigen mit der Oberfläche des Liefervehikels und denselben oder anderen Kombinationen eingekapselt innerhalb der Liefervehikel. Es wird verstanden, dass viele Variationen der oben beschriebenen Kombinationen hergestellt werden können, während diese innerhalb der Grenzen der Erfindung bleiben. Es ist die Intention der Erfinder, dass derartige Variationen von dem Bereich der Erfindung umfasst sind.
Die Melittin-abgeleiteten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können durch chemische Synthese hergestellt werden oder sie können natürlicher oder rekombinanter Herkunft sein. Melittin oder Melittin-abgeleitete Peptide können unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das für das Peptid kodiert, rekombinant hergestellt werden. Darüber hinaus können ihre Sequenzen modifizierte Sequenzen sein, solange sie die Fähigkeit behalten, die Immunantworten gegen hierin offenbarte Antigene zu stimulieren.
Eine "funktionelle Variante" oder "Variante" von Melittin oder einem Melittin-abgeleiteten Peptid ist ein Peptid, das eine oder mehrere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz von Melittin oder eines immunstimulatorischen Melittin-abgeleiteten Peptids enthält, während es die hierin offenbarte immunstimulatorische Wirkung behält. Umfasst eine funktionelle Variante von Melittin oder eines Melittin-abgeleiteten Peptids eine Aminosäuresubstitution, werden konservative Aminosäuresubstitutionen üblicherweise bevorzugt, d. h. Substitutionen, die eine Eigenschaft der ursprünglichen Aminosäure erhalten, wie z. B. die Ladung, Hydrophobizität, Konformation, usw. Beispiele konservativer Substitutionen von Aminosäuren schließen Substitutionen ein, die mit den Aminosäuren innerhalb der folgenden Gruppen gemacht werden: (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, H; (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; und (7) E, D.
Modifikationen, die funktionelle Varianten Melittin-abgeleiteter Peptide erzeugen, können durchgeführt werden, um die Peptid-Stabilität in einem Expressionssystem zu verstärken, um die Stabilität von Protein-Protein-Bindung, wie z. B. HLA-Peptidbindung zu verstärken, oder um die Avidität von Immunrezeptoren zu erhöhen. Wiederum kann ein jegliches Verfahren zum Herstellen modifizierter oder varianter Peptide verwendet werden, wie z. B. die Synthese der modifizierten oder varianten Peptide oder deren rekombinante Herstellung unter Verwendung eines mutierten Nukleinsäuremoleküls.
Die Identifikation zusätzlicher oder optimierter immunstimulatorischer Melittin-abgeleiteter Peptide kann außerdem den Schritt des Vergleichens der Stimulation von T- oder B-Zellen durch das Melittin-abgeleitete Peptid und die Stimulation von T- oder B-Zellen durch die funktionelle Variante als Bestimmung für die Wirksamkeit der Stimulation von Immun-Effektorzellen durch die funktionelle Variante umfassen. Durch Vergleichen des funktionell varianten Melittin-abgeleiteten Peptids mit einem bekannten Melittin-abgeleiteten Peptid, können Peptide mit erhöhter Immunzell-stimulatorischen Eigenschaften hergestellt werden.
Die einzelnen Melittin-abgeleiteten Peptide können außerdem ein oder mehrere Aminosäuren angefügt an eines der beiden oder beide Enden aufweisen. Folglich können z. B. Linker- oder Spacer-Aminosäuren an den N- oder C-Terminus der Peptide oder an beide Termini angefügt werden, um eine einfache Kopplung der Peptide an ein Liefervehikel, wie z. B. ein Virosom, zu erlauben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Fusionsproteine, die die vollständige Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Melittin-abgeleiteten Peptids, fusioniert mit einem Ziel-Antigen, oder die Verbindung beider durch chemische Konjugation (kovalent gebunden direkt über Seitenkettenbindungen oder über eine Linker- oder Spacer-Gruppe) umfassen. Sind sie fusioniert, kann das von Melittin abgeleitete Peptid und das Antigen durch Spacer-Aminosäuren separiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Melittin-abgeleiteten Peptide durch sequenzielle Anordnung von Aminosäuresequenzen der Melittin-abgeleiteten Peptide konstruiert. Folglich kann ein Fusionspeptid Multimere der Sequenz des Melittin-abgeleiteten Peptids enthalten, oder Varianten davon, verbunden mit einer antigenen Peptidsequenz nach Wahl. Derartige multiepitope Peptide können universelle T-Helfer-Peptidaminosequenzen in flankierender, verschachtelter oder überlappenden Anordnungen enthalten. Universelle T-Helfer-Epitope sind auf dem Gebiet wohlbekannt und können von dem HBV-Kern und -Oberflächenantigenen, Tetanustoxoid, Pseu domonas aeruginosa Toxin A, Beta-Galactosidase, Brucella abortus, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Influenzavirus Hämagglutinin und Nukleoprotein, Malaria circumsporozoit, Ovalbumin und anderen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, abgeleitet werden.
Die vorliegende Erfindung zeigt ferner, dass die Kombination von Virosomen (IRIVs) als human-kompatible immunpotenzierende Liefermittel mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die Erzeugung wirksamer Immunantworten gegen Ziel-Antigene weiter potenziert. Folglich stellt die Erfindung neue Peptid-Adjuvanzien zur Verfügung, deren immunogene Wirksamkeit weiterhin durch deren Kombination mit einem immunpotenzierenden Liefersystem verstärkt werden kann. Während immunpotenzierende rekonstituierte Influenza-Virosomen (IRIVs) gut geeignet sind, stehen den Fachleuten auf dem Gebiet zahlreiche weitere Liefervehikel, wie z. B. Liposomen, Virus-ähnliche Partikel, Multiple-Antigen-Peptide (MAPs) und dergleichen zur Verfügung. IRIVs bestehen aus sphärischen, unilamellären Virus-ähnlichen Partikeln, die aus einer Mischung von Phospholipiden und Oberflächen-Glycoproteinen des Influenzavirus hergestellt werden, sie enthalten jedoch keine viralen Nukleinsäuren. Das Hämagglutinin-Membran-Glycoprotein des Influenzavirus spielt eine Schlüsselrolle bei der Wirkungsweise von IRIVs. Dieses Hauptantigen des Influenzavirus ist ein Membranfusion-induzierender Bestandteil, der die Lieferung des Antigens an immunkompetente Zellen ermöglicht. Es ist bekannt, dass IRIVs als effiziente und hocheffektive Mittel zum Verstärken der Immunantwort mit einem ausgezeichneten Sicherheitsprofil wirken.
Das IRIV-Liefersystem gemäß der Erfindung potenziert die Immunantwort, die durch die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung gegen Ziel-Antigene hervorgerufen werden, weiter. Wie Liposomen, können Virosomen verwendet werden, um therapeutische Substanzen an eine Vielzahl von Zellen und Geweben zu verabreichen; anders als Liposomen bieten Virosomen jedoch den Vorteil eines wirksamen Eintretens in die Zellen, gefolgt von der intrazellulären Freisetzung des virosomalen Inhalts, ausgelöst durch das virale Fusionsprotein. Darüber hinaus setzen Virosomen aufgrund des Einschlusses aktiver viraler Fusionsproteine in ihren Membranen ihre Inhalte direkt nach der Aufnahme durch die Zelle in das Cytoplasma frei, wodurch die Degradation der therapeutischen Substanz in der sauren Umgebung des Endosoms verhindert wird. IRIVs können darüber hinaus gleichzeitig mit mehreren verschiedenen B-Zell- und T-Zell-Epitopen beladen werden (Poltl-Frank et al., 1999, Clin. Exp. Immunol. 117: 496; Moreno et al., 1993, J. Immunol. 151: 489), einschließ lich universeller T-Helfer-Zell-Epitope (Kumar et al., 1992, J. Immunol. 148: 1499–1505) und weiterer, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Wie durch die hierin gezeigten Ergebnisse nachgewiesen, haben IRIVs ein großes Potential bei der Entwicklung kombinierter Vakzin/Adjuvans-Systemen. Darüber hinaus würde man erwarten, dass die IRIV-basierten Peptid-Vakzine sicher sind, da IRIV-basierte Protein-Vakzine in Menschen bereits sehr gute Sicherheitsprofile gezeigt haben (Glueck, 1999, Vakzine 17: 1782). Die aufeinander abgestimmte Wirkung des Peptid-Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung, kombiniert mit ODNs und einem antigenen Ziel, zusammen mit der Verwendung von IRIVs als effizientes human-kompatibles Liefersystem, stellt einen signifikanten Vorteil bei der Entwicklung sowohl von prophylaktischen als auch therapeutischen Vakzinen gegen eine große Vielzahl von Krankheiten dar.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Verabreichung der immunstimulatorischen Zusammensetzungen, wie z. B. die Melittin-abgeleiteten Peptide und Antigene in Kombination mit ODNs und Virosomen oder äquivalenten Liefervehikeln in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung. Ein derartiges Arzneimittel, Pro-Pharmakon oder Arzneimittel-Metabolit, das ein oder mehrere der Melittin-abgeleiteten Peptide und/oder Peptid-enthaltende Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung als Haupt- oder Teilbestandteil enthält, kann in einer großen Vielfalt von therapeutischen Dosierungsformen in den üblichen Trägern für die topische, orale, systemische, lokale und parenterale Verabreichung verabreicht werden. Folglich stellt die Erfindung Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung der Melittin-abgeleiteten Peptide, gelöst oder suspendiert in einem annehmbaren Trägerstoff, vorzugsweise einem wässrigen Träger, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, umfassen. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle, wohlbekannte Sterilisierungsmethoden sterilisiert werden oder sie können steril filtriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können so wie sie sind für die Verwendung abgepackt werden oder lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierten Herstellungen vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert werden. Die Zusammensetzungen können optional pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die benötigt werden, um in etwa den physiologischen Bedingungen zu entsprechen, wie z. B. Mittel zum Einstellen des pH und zum Puffern, Mittel zum Einstellen der Tonizität, Benetzungsmittel und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natri umlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, und viele andere, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Folglich könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intradermale Infusion so hergestellt werden, dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung enthält und 100 mg Peptid. Derzeitige Verfahren zum Herstellen parenteral verabreichbarer Verbindungen werden den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder offensichtlich sein und sind in größerem Detail z. B. in Remington beschrieben: The Science and Practice of Pharmacy ("Remington's Pharmaceutical Sciences") von Gennaro A. R., Herausgeber, 20. Aufl., 2000: Williams & Wilkins PA, USA, das hierin durch Referenz eingeschlossen ist.
Der Weg und die Prozedur der Verabreichung werden abhängig von dem Stadium oder der Schwere des behandelnden Zustandes variieren und müssen von dem sachkundigen Arzt bestimmt werden. Zum Beispiel können die Peptide und Peptid-enthaltenden Zusammensetzungen in oralen Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten, Kapseln (die jeweils Formulierungen zur zeitlich festgelegten Freisetzung und zur verzögerten Freisetzung umfassen), Pillen, Puder, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirup und Emulsionen, oder alternativ durch Injektion verabreicht werden. In ähnlicher Weise können sie außerdem in intravenöser Form (entweder durch Bolus oder Infusionsverfahren), intraperitonealer, subkutaner, topischer Form mit oder ohne Okklusion oder intramuskulärer Form verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Peptide und Peptid-enthaltenden Zusammensetzungen intradermal oder subkutan verabreicht. Sämtliche dieser Formen sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt.
Die tägliche Dosis der Melittin-abgeleiteten Peptide und Zusammensetzungen gemäß der Erfindung kann in einem Bereich von 0,001 bis 1000 mg pro Erwachsenem pro Tag liegen. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in der Form von Tabletten zur Verfügung gestellt, die zwischen 0,001 und 1000 mg enthalten, vorzugsweise 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 10,0, 20,0, 50,0, 100,0 Milligramm des aktiven Bestandteils zur symptomatischen Einstellung der Dosierung entsprechend den Zeichen und Symptomen des Patienten im Verlauf der Behandlung. Eine wirksame Menge eines Arzneimittels wird gewöhnlich mit einer Dosierungshöhe von etwa 0,0001 mg/kg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag bereitgestellt. Der Bereich liegt genauer im Bereich von etwa 0,0001 mg/kg bis 7 mg/kg Körpergewicht pro Tag.
Vorteilhafterweise können geeignete Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung als eine einzige Tagesdosis verabreicht werden, oder die tägliche Gesamtdosierung kann in getrennten Dosen, z. B. zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Darüber hinaus können die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere diejenigen, die Virosomen oder Liposomen enthalten, in intranasaler Form oder über transdermale Wege, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, verabreicht werden. Um in Form eines transdermalen Verabreichungssystems verabreicht zu werden, wird die Verabreichungsdosierung während der Dosierungsprozedur natürlich eher kontinuierlich als periodisch sein.
Die Melittin-abgeleiteten Peptide und Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die den aktiven Wirkstoff in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, der für die topische Verabreichung geeignet ist. Topische pharmazeutische Zusammensetzungen können z. B. in Form einer Lösung, Creme, Salbe, Gel, Lotion, Shampoo oder Aerosolformulierung vorliegen, die für das Auftragen auf die Haut geeignet ist. Diese topischen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, umfassen gewöhnlicherweise etwa 0,005% bis 5% Masseanteile der aktiven Verbindung in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff.
Die Dosierungsprozedur, die die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, wird in Übereinstimmung mit zahlreichen Faktoren, einschließlich z. B. der Spezies, dem Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, dem Stadium und der Schwere des zu behandelnden Zustandes und der einzelnen verwendeten Verbindung, ausgewählt. Ein durchschnittlicher Arzt kann die wirksame Menge des Arzneimittels, das benötigt wird, um das Fortschreiten eines bösartigen Tumors oder einer Infektionserkrankung zu verhindern, diesem entgegenzuwirken oder es zu stoppen, einfach bestimmen und verordnen. Eine optimale Präzision beim Erreichen einer Arzneimittelkonzentration in dem Bereich, der eine Effizienz entweder ohne Toxizität oder mit einer annehmbaren Toxizität erzielt, erfordert eine Prozedur, die auf den Kinetiken der Arzneimittelverfügbarkeit für die Zielorte beruht. Dieser Prozess beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Äqulilibriums und der Elimination des Arzneimittels und liegt innerhalb der Fähigkeit des erfahrenen Arztes.
In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können die hierin im Detail beschriebenen Verbindungen den aktiven Wirkstoff bilden und werden üblicherweise zusammen mit pharmazeutischen Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen verabreicht, die in geeigneter Weise unter Berücksichtigung der beabsichtigten Form der Verabreichung ausgewählt werden, d. h. orale Tabletten, Kapseln, Elixieren, Sirup und dergleichen, und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren. Zum Beispiel kann die aktive Wirkstoffkomponente für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel mit einem oralen, nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen kombiniert werden. Darüber hinaus können, wenn gewünscht oder notwendig, auch geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Aufschlussmittel und Färbemittel in die Mischung eingeschlossen werden. Geeignete Bindemittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie Glucose oder Beta-Lactose, Getreidesüßstoff, natürliche und synthetische Gummis, wie z. B. Akazie, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dergleichen. Gleitmittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, umfassen, ohne Beschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Aufschlussmittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.
Die flüssigen Formen können in geeigneter Weise aromatisiert sein, Suspensions- oder Dispersionsmittel, wie z. B. synthetische und natürliche Gummis, z. B. Tragant, Akazie, Methylcellulose und dergleichen. Weitere Dispersionsmittel, die verwendet werden können, sind Glycerin und dergleichen. Für die parenterale Verabreichung werden sterile Suspensionen und Lösungen gewünscht. Isotone Herstellungen, die im Allgemeinen geeignete Konservierungsstoffe enthalten, werden verwendet, wenn eine intravenöse Verabreichung gewünscht wird. Topische Herstellungen, die die aktive Arzneimittelverbindung enthalten, können mit zahlreichen Trägermaterialien, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, wie z. B. Alkoholen, Aloe Vera Gel, Allatoin, Glycerin, Vitamin-A- oder Vitamin-E-Ölen, Mineralölen, PPG2 Myristoyl Propionat und dergleichen, vermischt werden, um z. B. alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen und Shampoos in Creme- oder Gel-Formulierungen zu bilden.
Die Melittin-abgeleiteten Peptide, deren Zusammensetzungen oder deren Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung können an eine Klasse biodegradierbarer Polymere gekoppelt werden, die geeignet sind, um die kontrollierte Freisetzung eines Arzneimittels zu erreichen, z. B. Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyortho ester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate, und kreuzvernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen. Im Allgemeinen können Individuen eine intradermale Injektion einer wirksamen Menge der Melittin-abgeleiteten Peptide und Zusammensetzungen entweder in Kombination mit Liefervektoren, wie z. B. Virosomen oder für sich allein erhalten. Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können außerdem in der Form von Liposomen-Liefersystemen, wie z. B. kleinen unilamellären Vesikeln, großen unilamellären Vesikeln und multilamellären Vesikeln, verabreicht werden. Liposomen können aus einer Vielzahl von Verbindungen hergestellt werden, einschließlich z. B. Cholesterol, Stearylamin und verschiedenen Phosphatidylcholinen.
Anfangsdosen können Boosterdosen folgen, in Übereinstimmung mit Immunisierungsprotokollen, die auf dem Gebiet Standard sind. Die immunstimulatorische Wirkung der Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiter verstärkt werden, indem irgendeine der oben genannten Zusammensetzungen von Melittin-abgeleiteten Peptiden, einschließlich ihrer Kombination mit Virosomen, mit einer weiteren, die Immunantwort potenzierenden Verbindung kombiniert werden. Die Immunantwort potenzierende Verbindungen werden entweder als Adjuvanzien oder Zytokine klassifiziert. Zusätzliche Adjuvanzien können die immunologische Antwort weiter verstärken, indem sie ein Reservoir an Antigen (extrazellulär oder in Macrophagen) zur Verfügung stellen, Macrophagen aktivieren und spezifische Sets an Lymphocyten stimulieren. Adjuvanzien verschiedener Art sind auf dem Gebiet wohlbekannt; spezifische Beispiele umfassen Freund's, Alum, Mycobakterien, wie z. B. BCG und M. Vaccae, Quil-Saponin-Mischungen, wie z. B. QS-21 (SmithKline, Beecham) und verschiedene Öl/Wasser-Emulsionen (z. B. IDEC-AF). Ebenfalls nützlich in Vakzinierungs-Protokollen sind Cytokine aufgrund ihrer Lymphocyten-stimulatorischen Eigenschaften. Viele Cytokine, die für derartige Zwecke geeignet sind, werden dem Fachmann auf diesem Gebiet bekanntsein, einschließlich Interleukin-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF und viele andere.
Wenn sie verabreicht werden, werden die therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch annehmbaren Herstellungen verabreicht. Derartige Herstellungen können routinemäßig pharmazeutisch annehmbare Konzentrationen an Salz, Puffermitteln, Konservierungsmitteln, kompatiblen Trägerstoffen, zusätzlichen immunpotenzierenden Agenzien, wie z. B. Adjuvanzien und Cytokinen, und optional weitere therapeutische Mittel enthalten. Die Herstellungen gemäß der Erfindung werden in wirksamen Mengen verabreicht. Im Allgemeinen gelten Dosen von Immunogenen im Bereich von 1 Nanogramm/Kilogramm bis 100 Milligramm/Kilogramm als wirksam, abhängig von der Art der Verabreichung. Man nimmt an, dass der bevorzugte Bereich zwischen 500 Nanogramm und 500 Mikrogramm pro Kilogramm liegt. Die absolute Menge wird von verschiedenen Faktoren abhängig sein, einschließlich der für die Verabreichung ausgewählten Zusammensetzung, ob die Verabreichung in Einzeldosen oder mehreren Dosen erfolgt und individuellen Patientendaten, einschließlich Alter, physischem Zustand, Größe, Gewicht und Stadium der Erkrankung. Diese Faktoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und können durch bloße Routine-Experimentierung behandelt werden.
In dem Falle der Behandlung von Krebs handelt es sich bei der gewünschten Antwort um das Inhibieren des Fortschreiten des Krebses und möglicherweise um ein Induzieren der Regression des primären Tumors und potenzieller Metastasen. In dem Falle der Behandlung einer Infektionskrankheit handelt es sich bei der gewünschten Antwort um die Kontrolle der Infektion und/oder Clearance des infektiösen Erregers aus dem System. In dem Fall der Prophylaxe handelt es sich bei der gewünschten Antwort um eine protektive Immunität gegenüber dem Agens, wie mittels sekundärer Immunantworten auf eine Exposition gegenüber dem Agens oder dessen Antigens gemessen wird. Diese gewünschten Antworten können mittels Routineverfahren überwacht werden oder können in Übereinstimmung mit den hierin behandelten diagnostischen Verfahren gemäß der Erfindung beobachtet werden. Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Umfang durch die spezifischen hierin beschriebenen Ausführungsformen nicht beschränkt. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hierin beschriebenen den Fachleuten auf dem Gebiet anhand der vorangehenden Beschreibung ebenso wie anhand der Beispiele offensichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass derartige Modifikationen unter den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
DEFINITIONEN
Hierin beschriebene Aminosäuren und Aminosäurereste können in Übereinstimmung mit dem allgemein anerkannten Dreibuchstaben-Code bezeichnet sein, auf den Lehrbücher verweisen, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind (Stryer, Biochemistry, 4. Aufl., Freeman and Co., New York, 1995 und Creighton, Proteins, 2. Aufl. Freeman and Co. New York, 1993).
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe "Peptid" und "Polypeptid" austauschbar und in ihrer breitesten Bedeutung verwendet, um eine Verbindung von zwei oder mehreren Aminosäureresten oder Aminosäure-Analoga zu bezeichnen. Die Aminosäurereste können durch Peptidbindungen verbunden sein oder alternativ durch andere Bindungen, z. B. Ester, Ether usw. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Aminosäure" oder "Aminosäurerest" entweder natürliche und/oder nichtnatürliche oder synthetische Aminosäuren, einschließlich sowohl deren D- oder L-enantiomeren Formen sowie Aminosäure-Analoga.
Mit "von Melittin abgeleitetes Peptid" bzw. "Melittin-abgeleitetes Peptid" ist eine Aminosäuresequenz gemeint, die von dem Protein Melittin (SEQ ID Nr. 12) abgeleitet ist, einem Bestandteil des Giftes der Honigbiene, und insbesondere die KRKRQ Sequenz (SEQ ID Nr. 1) aus dem C-terminalen Bereich von Melittin. Diese Sequenz kann weiter multimerisiert in Wiederholungen vorliegen, wie z. B. als Dimer KRKRQKRKRQ (SEQ ID Nr. 2) oder als Trimer KRKRQKRKRQKRKRQ (SEQ ID Nr. 3) usw. Die einzelnen Aminosäuren der Melittin-abgeleiteten Peptide können außerdem konservativ mit Aminosäuren äquivalenter Größe, Ladung und/oder Polarität substituiert sein. Darüber hinaus können geeignete Linker-Aminosäuren an beide Enden der Melittin-abgeleiteten Peptide angefügt sein, um deren Einschluss in Liefervehikel und/oder deren Fusion mit Ziel-Antigenen zu erleichtern.
Ein "Ziel-Antigen", wie hierin verwendet, ist ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat oder allgemeiner ein immunogenes Molekül, das z. B. von einem Pathogen oder einer malignen Zelle abgeleitet ist, gegen das eine Immunantwort gewünscht wird, und dessen Immunogenität durch die hierin offenbarten Adjuvanzien verstärkt oder potenziert werden kann. Ziel-Antigene von Interesse umfassen Tumor-spezifische und Tumor-assoziierte Antigene, ebenso wie Antigene von bakteriellen, viralen und anderen infektiösen Organismen, die alle auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
Der Begriff "ODN", wie hierin verwendet, bezieht sich auf sämtliche Oligonukleotid-Moleküle, einschließlich sowohl Oligodeoxyribonukleotid- und Oligoribonukleotid-Molekülen. Die ODNs können ein Phosphodiester-modifiziertes Rückgrat haben, um die Stabilität zu verbessern. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass ODNs jeglicher Sequenz verwendet werden können, um wirksame Immunantworten hervorzurufen, wodurch das Erfordernis nach nicht-methylierter DNA, CpG-Motiven oder anderen Sequenzen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie immunogen sind, die ein inhärentes Risiko für Toxizität in sich tragen und folglich eine chemische Modifikation vor der klinischen Verwendung erfordern würden, umgangen wird. Die Länge der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten ODNs kann im Bereich von etwa 10 bis etwa 60 Nukleotiden liegen, obwohl sowohl kürzere als auch längere ODNs für das Adjuvans-System gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sein können.
Der Begriff "Epitop", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenigen Teile eines Moleküls, die von T-Zell- und/oder B-Zell-Rezeptoren erkannt werden.
Der Begriff "Adjuvans" bezieht sich auf eine Substanz, die sich von dem Ziel-Antigen unterscheidet, und die in der Lage ist, die Immun-Effektorzell-Aktivierung zu verstärken oder zu potenzieren.
Der Begriff "Adjuvans-System" wird hierin verwendet, um die Kombination verschiedener immunstimulatorischer Peptide, wie z. B. die Melittin-abgeleiteten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, mit Ziel-Antigenen und Oligonukleotiden, um die immunstimulatorische Wirkung zu potenzieren, die jeder Bestandteil des Systems ausüben würde, wenn er alleine verwendet werden würde, ebenso wie ihre Kombination mit einem geeigneten Liefersystem, wie z. B. Virosomen, welche die immunstimulatorische Wirkung der Zusammensetzungen weiter verstärken können, zu bezeichnen.
Der Begriff "Potenzieren" oder "Immunpotenzieren" wird hierin verwendet, um eine Adjuvans-Wirkung oder verstärkende Wirkung auf Immunfunktionen zu bezeichnen, die durch Stimulation von Immun-Effektorzellen auftreten können und zu der Zerstörung oder Clearance Antigen-tragender Pathogene oder Malignitäten und/oder zu Immunität dagegen führen kann.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine "funktionale Variante" oder "Variante" eines Melittin-abgeleiteten Peptids ein Peptid, das ein oder mehrere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz eines immunstimulatorischen Melittin-abgeleiteten Peptids enthält, während es die hierin offenbarte immunstimulatorische Wirkung beibehält.
Mit "Verabreichung" oder "verabreichen" ist das Bereitstellen einer oder mehrerer Peptide oder Peptid-enthaltenden Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als Arzneimittel, Pro-Pharmakon oder Arzneimittel-Metabolite an ein Individuum, das diese benötigt, gemeint.
Eine "wirksame Menge" ist diejenige Menge einer pharmazeutischen Herstellung, die allein oder zusammen mit weiteren Dosen die gewünschte Antwort stimuliert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispielen werden zur Verfügung gestellt, um die Wirksamkeit der beanspruchten Erfindung zu demonstrieren, sollten jedoch nicht als den Umfang der Erfindung limittierend aufgefasst werden. Soweit spezielle Materialien erwähnt werden, dient dies lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung und sollte nicht als die Erfindung beschränkend aufgefasst werden. Soweit nicht anders angegeben, werden biochemische und molekular-biologische Methoden verwendet, wie diejenigen, die in Voet, Biochemistry, Wiley, 1990; Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman, 1995; Bodanszky, Peptide Chemistry. A Practical Textbook, 2. Aufl., Springer-Verlag, Berlin, 1993; Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; Ausubel et al. (Herausg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2000 dargestellt. Der Fachmann auf dem Gebiet kann äquivalente Mittel oder Reaktanten ohne das Ausüben seiner erfinderischen Fähigkeiten und ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen, entwickeln.
Es wird verstanden, dass zahlreiche Variationen der Zusammensetzungen und ihren beschriebenen Verfahren durchgeführt werden können, während man innerhalb der Grenzen der vorliegenden Erfindung bleibt.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt, dass ein Melittin-abgeleitetes Peptid (mel, KRKRQKRKRQ, SEQ ID Nr. 2) nicht von dem Vorhandensein von CpG-Sequenzen in dem ODN abhängig ist, um dessen vollständige Adjuvans-Aktivität zu zeigen. Die Fusion eines Beispiel-Antigens (hier T4 Peptid) mit dem Melittin-abgeleiteten Peptid und das Binden eines ODNs an diese erzeugt potente Immunogene für CD8+ T-Zellen. Das genannte Beispiel-Ziel-Antigen, hier das von SV40 abgeleitete T4-Peptid T404-417 VVYDFLKCMVYNIP (SEQ ID Nr. 5) wurde mit einer duplizierten Aminosäuresequenz fusioniert, die von Melittin abgeleitet ist (KRKRQKRKRQ, SEQ ID Nr. 2). B6-Mäuse wurden i. m. mit 35 nmol dieser Peptide allein (Gruppe 2) oder gemischt mit ODN (Gruppe 3), mit CpG-Motiven (A; NSS+ ODN-1982) oder ohne CpG-Motive (B; ISS+ ODN-1826), vakziniert (1). Milzzellen, die von den immunisierten Mäusen 12 Tage nach der Vakzinierung erhalten wurden, wurden ex vivo mit dem T4-Peptid VVYDFLKCM (SEQ ID Nr. 4) (Kb/T404-412) restimuliert. Durchschnittliche An zahlen spezifischer IFNγ± CD8+ T-Zellen/10⁵ CD8+ T-Zellen ± SD (von 6 Mäusen pro Gruppe), gemittelt aus zwei unabhängigen Experimenten, sind gezeigt.
C57BL/6JBom (B6)-Mäuse (H-2b) wurden gezüchtet und unter Pathogen-freien Standardbedingungen in der Tierkolonie der Universität Ulm (Ulm, Deutschland) gehalten. Männliche/weibliche Mäuse wurden im Alter von 12 bis 16 Wochen verwendet. ODN-Vakzine, CpG-enthaltendes ODN-1826 (TCCATGACGTTTCCTGACGTT; ISS-1826, SEQ ID Nr. 6) und dessen Kontrolle ODN-1982 (TCCAGGACTTCTCTCAGGTT; NSS-1982, SEQ ID Nr. 7) wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) erhalten. Die ODNs wurden mit Phosphorthioat-Rückgrätern synthetisiert und zu einer 10 mg/ml Stammlösung in Wasser gelöst. Die synthetischen Peptide, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, wurden von Jerini BioTools (Berlin, Deutschland) erhalten und mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Wasser oder DMSO gelöst. Soweit angegeben, wurden die ODNs für 30 Minuten mit Peptiden in PBS pH 7,4 inkubiert. 50 μl der genannten PBS-Lösung wurden i. m. in jeden Musculus tibialis anterior injiziert (oder 100 μl s. c. in die Basis des Schwanzes). Zur Bestimmung der Frequenzen von CD8+ T-Zellen der Milz wurden Milzzellen (1 × 10⁷/ml) für 1 Stunde in RPMI-1640 Medium mit 1 μg/ml der angegebenen Antigen-spezifischen oder nicht-spezifischen Kontrollpeptiden inkubiert. Danach wurde 5 μg/ml Brefeldin A (BFA) (Kat. Nr. 15870; Sigma) dazugegeben, und die Kulturen wurden für weitere 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurde geerntet, und die Oberfläche wurde mit PE-konjugiertem anti-CD8 mAb (Kat. Nr. 01045B; Pharmingen) gefärbt. Auf der Oberfläche gefärbte Zellen wurden mit 2% (w/v) Paraformaldehyd in PBS vor der intrazellulären Färbung von IFNγ fixiert. Fixierte Zellen wurden in Permeabilisierungs-Puffer 8 (HBSS, 0,5% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) Saponin, 0,05% (w/v) Natriumazid) resuspendiert und mit FITC-konjugiertem anti-IFNγ mAb (Kat. Nr. 55441; Pharmingen) für 30 Minuten bei RT inkubiert und zweimal in Permeabilisierungs-Puffer gewaschen. Gefärbte Zellen wurden in PBS resuspendiert, der 0,3%, (w/v) BSA und 0,1% (w/v) Natriumazid zugesetzt war. Die Anzahl an CD8+ IFNγ+ T-Zellen pro 10⁵ CD8+ T-Zellen der Milz wurde mittels Durchfluss-Cytometrie (flow cytometry FCM)-Analysen bestimmt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt, wie die immunstimulatorischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung, die Melittin-abgeleitete Peptide und Ziel-Antigene enthalten, mit der Oberfläche von Virosomen gekoppelt werden können. Chemikalien: Octaethylenglycol mono-(n-dodecyl)ether (OEG, C12E8) wurde von Fluka erworben. Phosphatidylcholin (PC) aus dem Ei wurde von Lipoid (Cham, Schweiz) erhalten. Phosphatidylethanolamin (PE) wurde von R. Berchtold erhalten (Biochemical Laboratory, Universität Bern, Schweiz). N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimidester (GMBS) wurde von Pierce erworben (Kat. Nr. 22309). Peptide wurden von Bachem erworben (Bubendorf, Schweiz). Bio-Beads SM2 und Bio-Gel A-15m stammten von den Bio-Rad Laboratorien (Glattbrugg, Schweiz).
Peptid-tragende Influenza-Virosomen (IRIVs) wurden hergestellt, indem zunächst der Cys-Terminus des Peptides mit PE über GMBS kreuzvernetzt wurde. Kurz beschrieben wurden 10 mg PE in 200 μl Chloroform/Methanol 9:1 und 5 μl Triethylamin (99%) resuspendiert, bevor 1,7 mg GMBS dazugegeben wurden. Die Mischung wurde bei RT für 1 Stunde bei leichtem Schütteln inkubiert und anschließend auf einer Savant SpeedVac Konzentrator-Zentrifuge bei RT konzentriert. Das Pellet wurde in 2 ml 100 mM OEG in PBS (OEG-PBS) resuspendiert, und 6 mg Cys-Mel (CKRKRQKRKRQ, SEQ ID Nr. 11) wurden dazugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei RT wurde es mit 4 mg Influenza A/Singapore und 32 mg PC in 2 ml OEG-PBS resuspendiert. Die Mischung wurde für 1 Minute mit Ultraschall behandelt und für 1 Stunde bei 100 000 × g bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde steril filtriert, und OEG wurde durch Inkubation mit 180 mg feuchten SM2 Bio-Beads einmal für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Schütteln und dreimal für 30 Minuten mit 90 mg SM2 Bio-Beads entfernt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von IRIVs mit eingekapselten Molekülen: IRIV wurden im Wesentlichen wie von Zurbriggen et al. beschrieben (Zurbriggen et al., 2000, Prog. Lipid Res. 39: 3–18), hergestellt. Kurz beschrieben wurden 32 mg Ei-PC und 8 mg PE in 2 ml PBS, enthaltend 100 mM OEG (PBS/OEG), gelöst. Influenza A/Singapore wurde wie beschrieben gereinigt (Skehel und Schild, 1971, Virology 44: 396–408). Influenzavirus entsprechend 4 mg Hämagglutinin (HA) wurde bei 100 000 × g für 1 Stunde zentrifugiert, und das Pellet wurde in 1 ml PBS/OEG gelöst. Um Antigen- und/oder Melittin-IRIV herzustellen, wurden 4 mg Peptid in 1 ml PBS/OEG gelöst. Die Phospholipide, die gelöste Viruslösung und die Peptid- und ODN-Lösungen wurden gemischt und für 1 Minute mit Ultraschall behandelt. Diese Mischung wurde bei 100 000 × g für 1 Stunde zentrifugiert, und der Überstand wurde steril filtriert (0,22 μm). Die Virosomen wurden anschließend durch Entfernen des Detergens unter Verwendung von 1,23 g feuchten SM2 Bio-Beads für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Schütteln und dreimal für 30 Minuten mit 0,6 g SM2 Bio-Beads gebildet. Die Größenbestimmung der IRIV wurde mittels Lichtstreuung unter Verwendung eines Zetasizer 1000HS-Gerätes (Malvern Instruments, UK) durchgeführt. Für die Quantifizierung des eingekapselten Antigens und/oder Melittins, wurde eine Fraktion der homogenen IRIVs auf einer Sephadex G50 Coarse Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences, Schweiz) geladen und von dem nicht-eingekapselten Peptid getrennt. Die Peptid-Quantifizierung wurde auf einem Äkta Explorer 10 (Amersham Biosciences, Schweiz) unter Verwendung einer CC 125/4.6 Nucleosil 100-5 C8 reverse Phase-Säule (Macherey-Nagel, Schweiz) durchgeführt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt ein alternatives Verfahren zum Verkapseln von Molekülen in IRIVs. Chemikalien: 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (PG) wurde von Sigma (Buchs, Schweiz) erworben.
Herstellung großer unilamellärer Vesikel (large unilamellar vesicles, LUVs): 36,4 μmol (27,95 mg) PC und 15,6 μmol (10,75 mg) PG (molares Verhältnis 70:30) wurden in Methanol/Chloroform (2:1) gelöst. Das Lösemittel wurde durch Verwendung eines Rotationsverdampfers (Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik, Schweiz) bei 40°C mit einem graduellen Vakuum von 30–10 kPa entfernt. Für Antigen- und/oder Melittin-Liposomen mit hydrophobem Antigen und/oder Melittin, wurden 2–3,5 mg Antigen und/oder Melittin in Methanol gelöst und zu der Phospholipidmischung gegeben, bevor das Lösemittel entfernt wurde. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit 500 μl PBS hydriert. Für Antigen- und/oder Melittin-Liposomen mit hydrophilem Antigen und/oder Melittin wurde der getrocknete Lipidfilm mit 350 μl PBS, enthaltend 2–3,5 mg Peptid, das zu verkapseln war, hydriert. Vor der Extrusion wurde das Volumen auf 500 μl mit PBS eingestellt. Die Liposomendispersion wurde zehnmal über Polycarbonat-Membranen (Nucleopore Track-Etch Membran, 0,1 μm bzw. 0,2 μm, Whatman, UK) mit einem 1,5 ml Lipex Extruder (Northern Lipids, Kanada) extrudiert. Die Größenbestimmung der extrudierten Liposomen wurde mittels Lichtstreuung unter Verwendung eines Zetasizer 1000HS-Gerätes (Malvern Instruments, UK) durchgeführt. Für die Quantifizierung des eingekapselten Antigens und/oder Melittins, wurde eine Fraktion der homogenen Liposomen auf eine Sephadex G50 Coarse Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences, Schweiz) geladen und von dem nicht-eingekapselten Peptid getrennt. Die Antigen- und/oder Melittin-Quantifizierung wurde auf einen Äkta Explorer 10 (Amersham Bios ciences, Schweiz) unter Verwendung einer CC 125/4.6 Nucleosil 100-5 C8 reverse Phase-Säule (Macherey-Nagel, Schweiz) durchgeführt.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung chimärer Proteoliposomen.
Viren: Influenzaviren des rekombinanten X-31 Stammes und des A/PR/8/34 (PR8) Stammes, die in der Allantoishöhle embryonierter Eier propagiert wurden (Gerhard, J. Exp. Med. 144: 985–995, 1976), wurden von Berna Biotech (Bern, Schweiz) erhalten. Chemikalien: N-(4,4-Difluor-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Bodipy 530/550-DHPE) und Lissamine^TM Rhodamin B 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz (Rh-DHPE) stammten von Molecular Probes Europe (Leiden, Niederlande).
Für die Herstellung chimärer IRIVs wurden 4 mg gereinigtes Influenza A/Singapore und X-31 Hämagglutinin für 1 Stunde bei 100000 × g zentrifugiert und das Pellet wurde in 1,33 ml OEG/PBS gelöst. 32 mg PC, 6 mg PE und das PE-Antigen/Adjuvans wurden in einem Gesamtvolumen von 2,66 ml PBS-OEG gelöst. Die Phospholipide und die Hämagglutinin-Lösung wurden gemischt und für 1 Minute mit Ultraschall behandelt. Diese Lösung wurde anschließend für 1 Stunde bei 100000 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde steril filtriert (0,22 μm). Die Virosomen wurden anschließend durch Entfernen des Detergens, wie in Beispiel 2 angegeben, gebildet.
Herstellung chimärer Proteoliposomen: Chimäre Virosomen (600 μl in PBS) wurden mit 200 μl PC/PG LUVs bei 15°C in PBS unter konstantem Rühren inkubiert. Um die Fusion auszulösen, wurde der pH mit 15 μl 1 M HCl auf etwa 4,5 eingestellt. Nach der Inkubation für 30 Minuten wurde die Mischung mit 15 μl 1 M NaOH neutralisiert, und die Fusionsprodukte wurden zehnmal durch 0,2 μm Polycarbonat-Membranen, wie in Beispiel 4 beschrieben, extrudiert. Für die in vitro Fusionsmessungen mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FREI) wurde das folgende Assay entwickelt: 0,75 mol% Bodipy530/550-DHPE und 0,25 mol% Rh-DHPE wurden in LUVs, die aus PC/PG (70:30) bestehen, inkorporiert. Fluoreszenzmessungen wurden bei verschiedenen Temperaturen zwischen 4°C und 42°C in 5 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5, 100 mM NaCl, in einem Endvolumen von 0,8 ml in 2,5 ml PMMa Mikro-Küvetten (VWR, Schweiz) unter konstantem Rühren durchgeführt. Typischerweise wurde 1 μl markierte Liposomen (0,3 mmol Phospholipid) mit 5–50 μl Virosomen gemischt, und die Fusion wurde durch Zugabe von 3,75–7 μl 1 M HCl, was zu einem pH von etwa 4,5 führte, ausgelöst. Die Zunahme der Fluoreszenz wurde kontinuierlich bei Exitations- und Emissions-Wellenlängen von 530 nm bzw. 550 nm, mit einem Exitationsspalt von 2,5 nm und einem Emissionsspalt von 15 nm aufgenommen. Die Messungen wurden mit einem LS 55 Lumineszenz-Spektrometer (Perkin Elmer Instruments, USA) durchgeführt, das mit einem thermostatischen Küvetten-Halter und einer Magnetrührer-Vorrichtung ausgestattet ist. Die maximale Fluoreszenz bei unendlicher Probenverdünnung wurde nach Zugabe von Triton X-100 (0,5% (v/v) Endkonzentration) erreicht.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zum Herstellen von IRIVs, die Antigen/mel/ODN auf der Oberfläche enthalten. IRIVs mit Antigen und mel auf ihren Oberflächen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. ODN wurde nach Entfernen des Detergens zu diesen IRIVs dazugegeben und für 30 Minuten bei RT unter Schütteln inkubiert, um eine elektrostatische Bindung an das mel-Peptid zu erlauben.
Beispiel 7
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zum Herstellen von IRIVs mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN. Das allgemeine Verfahren zum Herstellen von IRIVs mit Antigen und mel, das verkapselt ist, ist in Beispiel 3 dargelegt. Um IRIVs mit verkapseltem Antigen/mel und ODN herzustellen, wurden ODNs zu der Peptidmischung in OEG/PBS dazugegeben, um die Bildung des mel/ODN-Komplexes zu erlauben, bevor die Phospholipide, die Lösung mit gelöstem Virus und die Peptid/ODN-Lösung gemischt wurden und für 1 Minute mit Ultraschall behandelt wurden. Die endgültige Herstellung von IRIVs wurde wie in Beispiel 3 erklärt, durchgeführt.
Ein alternatives Verfahren zum Herstellen von IRIVs mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN beruht auf Beispiel 4. Für Antigen- und Melittin-Liposomen mit hydrophobem Antigen, wurden 2–3,5 mg Antigen und Melittin in Methanol gelöst und zu der Phospholipid-Mischung gegeben, bevor das Lösemittel entfernt wurde. Der getrocknete Lipidfilm wurde mit 500 μl PBS, enthaltend das ODN, hydriert. Für Antigen- und Melittin-Liposomen mit hydrophilem Antigen, wurde der getrocknete Lipidfilm mit 350 μl PBS, enthaltend 2–3,5 mg Peptid, mel und ODN, was zu verkapseln war, hydriert. Die endgültige Herstellung von LUVs bzw. chimären IRIVs wurde wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 8
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zum Herstellen von IRIVs, die Antigen/mel/ODN auf der Oberfläche enthalten und Antigen/mel/ODN in denselben IRIVs verkapselt enthalten. IRIVs mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN und Antigen/mel/ODN auf der Oberfläche wurden hergestellt, indem die in den Beispielen 6 und 7 erklärten Verfahren kombiniert wurden. Antigen und mel gekoppelt an PE wurden wie in Beispiel 2 dargestellt, hergestellt. Zusätzlich wurden Antigen, mel und ODN in OEG/PBS, wie in Beispiel 7 erklärt, gelöst (Abschnitt 1). Die Phospholipide, die Lösung mit gelöstem Virus, die Peptid-gekoppelten Phospholipide und die Peptid/ODN-Lösung wurden gemischt und für 1 Minute mit Ultraschall behandelt. Die endgültige Herstellung von IRIVs wurde durchgeführt, indem das in Beispiel 6 beschriebene Vorgehen befolgt wurde.
Dieser Abschnitt beschreibt ein alternatives Verfahren zum Herstellen von IRIVs mit Antigen/mel/ODN auf deren Oberfläche und eingekapseltem Antigen/mel/ODN in denselben IRIVs. Die Herstellung von Liposomen (LUVs) mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN ist in Beispiel 7 (Abschnitt 2) erklärt. Die Herstellung von chimären IRIVs mit Influenza A/Singapore und X-31 Hämagglutinin mit Antigen/mel auf deren Oberfläche ist in Beispiel 5 dargelegt. Die Fusion von Liposomen mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN mit chimären IRIVs mit Antigen/mel auf deren Oberfläche unter Bedingungen, die in Beispiel 5 dargelegt sind, führte zu IRIVs mit eingekapseltem Antigen/mel/ODN und Antigen/mel auf der Oberfläche. Die endgültige Herstellung von IRIVs wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 durchgeführt.
Beispiel 9
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zum Herstellen von IRIVs, die Antigen/mel-ODN auf der Oberfläche enthalten, von IRIVs mit eingekapseltem Antigen/mel-ODN bzw. von IRIVs, die Antigen/mel-ODN auf der Oberfläche und in demselben IRIV eingekapselt enthalten, wobei der mel/ODN-Komplex kovalent verbunden ist. Die Peptid-ODN-Kreuzvernetzung wurde mit einer biochemischen Standardmethode, wie z. B. Formaldehyd-Kreuzvernetzung (1% v/v) erreicht (Solomon et al., 1988, Cell 53: 937–947; Dedon et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1729–1733). Der Mel-ODN-Komplex wurde kreuzvernetzt und separat gereinigt und anschließend wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben, verwendet.
Beispiel 10
Dieses Beispiel zeigt, wie die Adjuvans-Wirkung des Melittin-Peptids weiter durch die Kombination mit IRIVs potenziert wird.
Herstellung von Vakzinen: Die Peptide OVA257-64: SIINFEKL (SEQ ID Nr. 8), Cys-OVA257-64: CSIINFEKL (SEQ ID Nr. 9) und Cys-Mel-OVA257-64: CKRKRQKRKRQSIINFEKL (SEQ ID Nr. 10) wurden von Bachem (Bubendorf, Schweiz) erhalten. Der pCI/Ovalbumin (OVA) Expressionsvektor wurde von R. Schirmbeck (Ulm, Deutschland) zur Verfügung gestellt, und ODN-1982 (TCCAGGACTTCTCTCAGGTT, SEQ ID Nr. 7) wurde von Microsynth (Schweiz) erhalten.
Peptid-tragende IRIVs wurden hergestellt, indem zunächst der Cys-Terminus des Cys-Mel-OVA-Peptids über GMBS mit PE kreuzvernetzt wurde. Kurz beschrieben wurden 10 mg PE in 200 μl Chloroform/Methanol 9:1 resuspendiert und 5 μl Triethylamin (99%) und 1,7 mg GMBS wurden dazugegeben. Die Mischung wurde bei RT für 1 Stunde bei leichter Bewegung inkubiert und anschließend auf einer SpeedVac-Konzentrator-Zentrifuge bei RT konzentriert. Das Pellet wurde in 2 ml OEG/PBS resuspendiert, und 6 mg Cys-Mel-OVA wurden dazugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei RT wurde es mit 4 mg Influenza A/Singapore und 32 mg PC, resuspendiert in 2 ml OEG/PBS, gemischt. Die Mischung wurde für 1 Minute mit Ultraschall behandelt und für 1 Stunde bei 100000 × g bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde steril filtriert und das OEG wurde durch vier Inkubationen mit Bio-Beads (1 Stunde, 15 Minuten, 30 Minuten, 30 Minuten bei RT) entfernt.
C57BI/6-Mäuse wurden i. m. mit 100 μl PPS enthaltend:

1) 100 μg pCI/OVA
2) 50 μg Cys-OVA257-64
3) 50 μg Cys-OVA257-64 + 30 μg ODN-1982
4) 50 μg Cys-Mel-OVA257-64
5) 50 μg Cys-Mel-OVA257-64 + 30 μg ODN-1982
6) IRIV mit 50 μg Cys-Mel-OVA257-64, kreuzvernetzt mit der Oberfläche
7) IRIV mit 50 μg Cys-Mel-OVA257-64, kreuzvernetzt mit der Oberfläche + 30 μg ODN-1982
8) – nur PBS-Puffer

Intrazelluläre IFNγ-Färbung: 14 Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse geopfert und die Splenocyten wurden isoliert. Nach Lyse der roten Blutzellen mit Lyse-Puffer (8,34 g NH4Cl, 0,037 g EDTA, 1 g NaHCO3 pro l H2O), wurden die Milzzellen in RPMI-1640 Medium mit 0,3% (w/v) BSA, 20 U/ml humanem rekombinantem IL-2, 5 μg/ml Brefeldin A und mit oder ohne 0,25 μg/ml OVA 257–64 Peptid für 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, mit 1 μg/ml anti-Maus CD16/CD32 mAb (Pharmingen) für 10 Minuten bei 4°C präinkubiert und mit FITC-konjugiertem anti-Maus CD8 mAb (Pharmingen) für 30 Minuten bei 4°C Oberflächen-gefärbt. Oberflächen-gefärbte Zellen wurden fixiert und mit CytoFix/CytoPerm (Pharmingen) in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers fixiert. Permeabilisierte Zellen wurden mit PE-konjugiertem anti-Maus IFNγ mAb (Pharmingen) für 30 Minuten bei 4°C gefärbt. Gefärbte Zellen wurden in PBS resuspendiert und mittels Durchfluss-Cytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson) analysiert.
Beispiel 11
Dieses Beispiel zeigt die Adjuvans-Wirkung von Melittin, wenn es mit einem Ziel-Antigen kombiniert wird, das an die Oberfläche eines Virosomen gekoppelt ist.
Herstellung von Vakzinen: UK39 Malaria-Mimetikum und Melittin wurden von Bachem (Bubendorf, Schweiz) erworben.
UK39 IRIV: 4 mg UK39, 4 mg Influenza A/Singapore, 32 mg Phosphatidylcholin (PC) und 8 mg Phosphatidylethanolamin (PE) wurden in 4 ml 100 mM OEG in PBS (OEG-PBS) resuspendiert, für 1 Minute mit Ultraschall behandelt und für 1 Stunde bei 100000 × g bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wurde steril filtriert, und OEG wurde durch vier Inkubationen mit Bio-Beads (1 Stunde, 15 Minuten, 30 Minuten, 30 Minuten bei RT) entfernt.
Balb/c-Mäuse wurden mit 100 μl PBS enthaltend:

1) UK39 IRIV (20 μg UK39) oder
2) UK39 IRIV (20 μg UK39) + 10 μg Melittin

UK39 ELISA: ELISA-Platten wurden über Nacht bei 4°C mit 10 μg/ml UK39 in PBS beschichtet. Nach dem Waschen mit PBS 0,05% Tween20 wurden die Platten mit 5% Trockenmilch in PBS 2 Stunden bei 37°C geblockt. Maus-Sera der Tage 21 und 35 wurden zunächst 1:10 verdünnt und in seriellen 1:2-Verdünnungen in PBS 0,05% Tween20 0,5% Trockenmilch titriert. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten gewaschen und mit Ziege-α-Maus IgG HRP Ab (BD Bioscience) (1:5000 in PBS 0,05% Tween20 0,5% Trockenmilch) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden mit OPD-Substrat (OPD (O-Phenylendiamin-Tabletten, Fluka, Schweiz, 1 Tablette in 50 ml Citrat-Puffer +50 μl H₂O₂) für 30 Minuten entwickelt. Die Reaktion wurde mit 1 M H₂SO₄ gestoppt, und die Platten wurden bei 492 nm ausgelesen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein immunstimulatorisches Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 11.
Ein immunstimulatorisches Peptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, 3 oder 11 umfasst.
Eine immunstimulatorische Zusammensetzung, die das Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst und weiterhin wenigstens ein Oligonukleotid umfasst.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, worin das wenigstens eine Oligonukleotid ein nicht-CpG Oligonukleotid ist.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 oder 4, worin das wenigstens eine Oligonukleotid mit dem immunstimulatorischen Peptid komplexiert ist.
Eine immunstimulatorische Zusammensetzung, die die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5 umfasst und weiterhin ein Ziel-Antigen umfasst.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin das wenigstens eine Oligonukleotid kovalent mit dem immunstimulatorischen Peptid oder dem Ziel-Antigen verbunden ist.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, worin das immunstimulatorische Peptid und das Ziel-Antigen fusioniert sind.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, worin das immunstimulatorische Peptid und das Ziel-Antigen durch chemische Konjugation miteinander verbunden sind.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, die weiterhin ein Liefer-Vehikel umfasst.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, worin das Liefer-Vehikel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Liposomen, Virus-ähnlichen Partikeln und Virosomen.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 oder 11, worin wenigstens eines ausgewählt aus dem immunstimulatorischen Peptid, dem Ziel-Antigen und dem Oligonukleotid, in das Liefer-Vehikel eingekapselt ist.
Die immunstimulatorische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, worin wenigstens eines ausgewählt aus dem immunstimulatorischen Peptid, dem Ziel-Antigen und dem Oligonukleotid mit der Oberfläche des Liefer-Vehikels verbunden ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Potenzieren einer Immunantwort gegen ein Ziel-Antigen.
Verwendung des immunstimulatorischen Peptids gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Stimulieren oder zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Ziel-Antigen.
Verwendung des immunstimulatorischen Peptids gemäß Anspruch 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Stimulieren oder zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Ziel-Antigen.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung zum Stimulieren der Immunantwort zusätzlich wenigstens ein Oligonukleotid umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 17, worin das wenigstens eine Oligonukleotid ein nicht-CpG-Oligonukleotid ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, worin die genannte pharmazeutische Zusammensetzung zum Stimulieren der Immunantwort zusätzlich das genannte Ziel-Antigen umfasst.