DE60310562T2

DE60310562T2 - Verfahren zur verstärkung einer immunantwort von nukleinsäureimpfungen

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Publication number: DE60310562T2
Application number: DE60310562T
Authority: DE
Inventors: Lipoxen Technologies Limited Andrew David Bacon; Lipoxen Technologies Limited Peter Laing; Lipoxen Technologies Limited Gregory Gregoriadis; Lipoxen Techn. Ltd. Wilson R. Caparros-Wanderley
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2002-07-05
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-07-08
Also published as: CN1665529A; US9486510B2; US20050220858A1; US20120121690A1; ES2279127T3; EP1519745B1; US8828405B2; US7604803B2; US20100080844A1; CN100340289C; US20140341980A1; RU2311911C2; US8075896B2; DE60310562D1; US20170049702A1; AU2003244855A1; WO2004004758A1; RU2004137791A; EP1519745A1; JP2005535653A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur gleichzeitigen Abgabe einer Nucleinsäure und eines Proteins. Unter gleichzeitiger Abgabe ist eine Abgabe aus der gleichen Vesikel zu verstehen und es wird angenommen, dass dies zu einer Abgabe von beiden Bestandteilen an die gleiche Zelle führt. Die Zusammensetzungen eignen sich zur Erzeugung einer Immunantwort. Insbesondere kodiert die Nucleinsäure in funktioneller Weise für ein antigenes Protein oder einen Teil davon, dessen Sequenz homolog und vorzugsweise identisch mit der Sequenz eines "Assistorproteins" ist, das Bestandteil der Zusammensetzungen ist.
Protein-Antigene aus Pathogenen werden seit langem in Impfstoffen verwendet, die dazu bestimmt sind, neutralisierende Antikörper oder zellvermittelte Immunantworten im Empfänger, die spezifisch für das Antigen sind, hervorzurufen. Proteine erweisen sich jedoch im allgemeinen beim Hervorrufen bestimmter Typen von zellvermittelten Immunantworten nicht als günstig, insbesondere bei der Erzeugung von Effektor T-Zellen (einschließlich zytotoxischen T-Zellen), die eine erstrebenswerte Komponente der Antwort für eine große Anzahl von Impfstoffen darstellen (insbesondere bei solchen, die gegen intrazelluläre Pathogene oder Krebs-Antigene gerichtet sind). Neuerdings wurden Impfstoffe auf der Basis von bloßer DNA entwickelt, üblicherweise auf der Basis von Plasmid-DNA, die von E. coli erzeugt wird, jedoch geeignete Promotorsequenzen für die Expression in Säugetierzellen enthält. Diese letztgenannten Impfstoffe haben sich als hochwertig in Bezug auf die Erzeugung einer zellvermittelten Immunität (unter Beteiligung von Effektor T-Zellen, wie Interferon-γ sezernierenden, antigenspezifischen T-Zellen und antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen) erwiesen, jedoch als ungünstig in Bezug auf die Erzeugung von Antikörpern gegen das kodierte und exprimierte Antigen. Antikörper stellen wichtige Komponenten der schützenden Immunantwort für eine Vielzahl von Pathogenen dar, insbesondere von Bakterien und bestimmten Viren, wie Influenza-Viren. Zur Korrektur der Mängel von Impfstoffen auf DNA-Basis wurden verschiedene Abhilfemaßnahmen vorgeschlagen und untersucht, wie nachstehend ausgeführt wird.
Eine liposomale Zubereitung wird seit vielen Jahren eingesetzt, um die Immunogenizität von Impfstoffantigenen in der Proteinform zu verstärken. Eine liposomale Zubereitung wird in den letzten Jahren auch zur Zubereitung von DNA für Impfstoffzwecke eingesetzt. Es gibt Studien, bei denen die gleichzeitige Zubereitung von Plasmid-DNA zusammen mit Proteinen unter Verwendung von Liposomen beschrieben wird. Jedoch wurden bei diesen Studien über liposomale Kombinationszubereitungen von DNA und Protein im allgemeinen Plasmide, die für immunostimulatorische Cytokine oder andere, biologisch aktive Proteine, die sich vom Antigen selbst unterscheiden, verwendet. Die Einverleibung der Proteinform des Antigens selbst in eine Impfstoffzusammensetzung, die eine Nucleinsäure enthält, die zur Expression des Proteins in vivo konzipiert ist, erscheint unnötig. Wir kennen nur eine einzige Veröffentlichung, bei der Protein-Antigen als ein Additiv in der Zubereitung zusammen mit DNA verwendet wird (L. Alvarez-Lajonchere et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janiero, Bd. 97(1) (Januar 2002), S. 95-99). Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde von diesen Autoren keine Verstärkung der Antikörperantwort in gemeinsamen Zubereitungen aus der für das Antigen kodierenden DNA und ihrem verwandten (entsprechenden) Protein im Vergleich zu Immunisationen mit dem Protein allein festgestellt. Die von Alvarez-Lajonchere et al. verwendeten Zubereitungen umfassten Gemische der aktiven Nucleinsäure (ein Plasmid, das für das Kernantigen von Hepatitis-C-Virus kodiert) plus irrelevante Träger-DNA und Polyethylenglykol sowie das Protein. Im Anschluss an die Injektion diffundieren das Protein und die aktive DNA (die im Gemisch physikalisch nicht miteinander assoziiert waren) unabhängig voneinander und erreichen getrennt voneinander Antigen-präsentierende Zellen. Die negativen Befunde von Alvarez-Lajonchere stellen für den Fachmann ein Anzeichen dafür dar, dass eine Zubereitung des Proteins zusammen mit der verwandten DNA keinen vielversprechenden Weg zur Erzielung verbesserter Immunantworten darstellt, zumindest nicht von verbesserten Antikörper-Reaktionen.
In WO-A-99/30733 soll die Immunantwort auf einen Nucleinsäure-Impfstoff durch gleichzeitige Verabreichung eines verwandten Proteins verstärkt werden. Die beiden Komponenten müssen nicht in der gleichen Zusammensetzung verabreicht werden. Beide müssen lediglich während der Induktionsphase der Immunantwort verabreicht werden, wobei das Protein vorzugsweise maskiert oder zurückgehalten wird, bis die Nucleinsäure eine Grundimmunisierung durchgeführt hat. In einigen Beispielen umfasst ein Impfstoff bloße DNA und bloßes Protein-Antigen in Form eines physikalischen Gemisches. Bei anderen Beispielen wurde das Protein-Antigen für eine verzögerte Wirkstofffreisetzung in einer biologisch abbaubaren Polymer-Alaun-Zubereitung im Gemisch mit bloßer DNA zubereitet.
Gemäß WO-A-97/28818 sind Impfstoffe zur Abgabe einer Nucleinsäure und eines Protein-Antigens an ein Antigen präsentierende Zellen vorgesehen. Die Nucleinsäure kann das gleiche Protein exprimieren, das dem Protein-Antigen entspricht. Die Nucleinsäure und das Protein werden komplexiert, z. B. durch kovalente Konjugation. Der Komplex kann als ein synthetisches, virusartiges Teilchen zubereitet werden. Ferner wird vorgeschlagen, dass liposomale Systeme verwendet werden können, es finden sich jedoch keine Beispiele, wie sowohl Protein als auch Nucleinsäure in derartige Systeme einzuverleiben sind und die Beschreibung enthält auch keinerlei quantitative Ergebnisse über in vivo-Tests, sondern trifft Vorhersagen über Ergebnisse, die in der Praxis möglicherweise nicht eintreten, insbesondere Klasse II-Antworten
Es ist bekannt, dass nicht-kodierende Plasmid-DNA eine Immunoadjuvans-Wirkung besitzt, wenn sie zusammen mit Peptiden in liposomalen Vesikeln eingeschlossen wird (M. Gursel et al., Vaccine, Bd. 17 (1999), S. 1376-1383), und dass DNA mit CpG-Motiven eine Immunoadjuvans-Wirkung auf bloße DNA- und Peptid-Impfstoffe ausübt (D. M. Klinman et al., Vaccine, Bd. 17 (1999), S. 19-25).
Erfindungsgemäß haben wir jedoch die Vorstellung entwickelt, dass es bei physikalischer Assoziation einer Nucleinsäure, wie DNA, zusammen mit ihrem verwandten Protein und durch Einschließen dieser Bestandteile möglich sein sollte, dass die beiden Bestandteile im Bereich von ein Antigen präsentierenden Zellen einander erreichen, woraus sich die Prozessierung und Präsentation der erworbenen Proteinform des Antigens zusammen mit der Expression der DNA-kodierten Form des antigenen Proteins in der gleichen Zelle ergibt. Da die Antigen-Prozessierung von exprimierten Proteinen nach einem unterschiedlichen Weg und mit etwas unterschiedlicher Kinetik im Vergleich zu erworbenen Proteinen erfolgt, stellten wir uns vor, dass eine derartige gleichzeitige Abgabe von DNA in Assoziation mit ihrem verwandten Protein eine Möglichkeit für einen additiven oder synergistischen Effekt dieser beiden Arten der Antigen-Präsentation und für eine verbesserte Immunantwort eröffnen sollte. Wir haben nunmehr diese neue Hypothese mit vesikulären Zubereitungen von DNA und ihrem verwandten Protein, die für die Assoziation der DNA und des Proteins sorgen, getestet. Im Gegensatz zu Alvarez-Lajonchere et al. haben wir festgestellt, dass spezielle Impfstoffzusammensetzungen aus DNA in Assoziation (über Liposomen) mit ihrem verwandten Protein (mit der Bezeichnung "Assistorprotein") möglich sind, bei denen verstärkte Antikörperantworten im Anschluss an eine Immunisierung beobachtet werden (verglichen mit einer Immunisierung mit dem Protein allein oder mit der DNA allein). Wir haben festgestellt, dass dann, wenn die DNA und das Protein in getrennten Teilchen zubereitet werden und die Teilchen vermischt werden, keine Verstärkung der Antikörperbildung zu sehen ist. Diese Beobachtungen stimmen mit unserer Theorie der gleichzeitigen Abgabe von DNA und des Assistorproteins an die gleichen, ein Antigen präsentierende Zelle überein, obgleich wir uns bewusst sind, dass es möglicherweise andere theoretische Erklärungen gibt, die derzeit nicht auszuschließen sind.
Gregoriadis et al. beschreiben in Methods: A companion to methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, USA, Bd. 19(1) (September 1999), S. 156-162, das Einschließen eines Impfstoffes in Liposomen unter Anwendung des Verfahrens unter Dehydratisierung/Rehydratisierung. Beim Impfstoff kann es sich um ein inaktiviertes Virus oder um Bakterien oder alternativ um Plasmid-DNA handeln.
Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur gleichzeitigen Abgabe einer Nucleinsäure und eines Assistorproteins an eine Zelle bereit, wobei die Zusammensetzung Vesikel, die aus amphiphilen Komponenten gebildet sind, umfasst, wobei die Nucleinsäure in funktioneller Weise in einem tierischen Subjekt für ein antigenes Protein oder einen Teil davon kodiert, das mindestens ein Epitop mit dem Assistorprotein gemeinsam hat, wobei die Zusammensetzung die Nucleinsäure und das Assistorprotein in Assoziation jeweils mit den gleichen Vesikeln umfasst, wobei die Zusammensetzung Nucleinsäure und Protein in einem Gewichtsverhältnis von 1 000:1 bis 1:1 enthält.
Der Ausdruck "Assistorprotein" bezieht sich auf vollständige Proteine oder Fragmente von Proteinen, Proteinen eines einzigen Typs oder Proteinen unterschiedlicher Typen.
Das durch die Nucleinsäure kodierte antigene Protein stellt im allgemeinen das Protein von Interesse dar: d. h. das Zielantigen, gegen das in einem Subjekt eine günstige Immunantwort angestrebt wird. Das Assistorprotein ist im allgemeinen identisch mit der exprimierten Form eines durch eine Nucleinsäure kodierten, antigenen Proteins, d. h. des mit der Nucleinsäure verwandten Proteins. Das antigene Protein und/oder das Assistorprotein können jeweils (einzeln) die vollständige Sequenz des natürlich auftretenden Proteins aus der entsprechenden Quelle umfassen. Vorzugsweise kodiert die Nucleinsäure für das vollständige, natürlich vorkommende Protein-Antigen. Alternativ kann die Nucleinsäure nur für einen Teil des natürlichen Proteins kodieren, der mindestens eines der Epitope des Assistorproteins einschließt. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung handelt es sich beim Epitop um ein B-Zellepitop, das an der Oberfläche eines infektiösen Mittels in seiner natürlich auftretenden Form exponiert ist. Die Nucleinsäure kodiert möglicherweise nur für einen Teil des natürlichen Proteins, einschließlich mindestens eines der Epitope des natürlich auftretenden Mittels. Beim Mittel handelt es sich beispielsweise um einen Mikroorganismus, wie ein Bakterium, eine Hefe oder ein Virus. Gleichermaßen sollte das Assistorprotein Epitope enthalten, die sich von der entsprechenden Quelle ableiten und die (gemäß einer Ausführungsform) an der Oberfläche zugänglich sind, wenn sich die Quelle in ihrer natürlichen Umgebung befindet. Alternativ und in günstiger Weise haben das Antigen und das Assistorprotein ein oder mehr Epitope mit einem sezernierten toxischen Produkt eines Pathogens, wie Tetanus-Toxin, gemeinsam, die sich zur Neutralisation eines derartigen Toxins eignen. Gleichermaßen können das antigene Protein und das Assistorprotein ein oder mehr Epitope gemeinsam haben, die auch in einem sezernierten Produkt eines Pathogens, das von einem Toxin abweicht, vorliegen, z. B. das Interleukin 10-Analoge, das durch das Epstein-Barr-Virus kodiert und durch Zellen, die mit dem Epstein-Barr-Virus infiziert sind, sezerniert wird.
Wir haben zwei miteinander verwandte Theorien zur Erklärung des verbesserten Verhaltens der neuen Zusammensetzungen aufgestellt, die sich gegenseitig nicht ausschließen. Wir bezeichnen diese Theorien als die allgemeine und die spezifische Theorie (vergl. die nachstehenden Ausführungen).
1. Die allgemeine Theorie
Die allgemeine Theorie besagt, dass das verstärkte Leistungsvermögen des in entsprechender Weise gemeinsam zubereiteten Materials (wobei sowohl DNA als auch ihr verwandtes Protein mit einer einzigen Vesikel so assoziiert sind, dass Vesikel in einer Population sowohl DNA als auch Protein aufweisen) auf die Aufnahme sowohl der Nucleinsäure als auch von dessen verwandtem Protein (das Assistorprotein) durch die gleiche, ein Antigen präsentierende Zelle zurückführen ist (wobei es sich um eine klassische, ein Antigen präsentierende Zelle, wie eine Makrophagen- oder dendritische Zelle, oder eine B-Zelle handeln kann, die antigenspezifisch oder nicht-antigenspezifisch sein kann). Die gleichzeitige Abgabe der DNA und des verwandten Proteins davon an die gleiche Zelle ermöglicht eine synergistische Wechselwirkung bei der sich ergebenden Immunantwort, die nicht möglich wäre, wenn die DNA durch eine ein Antigen präsentierende Zelle aufzunehmen wäre und das Protein durch eine andere Zelle. (Früher beschriebene Zusammensetzungen sorgen nicht für die gleichzeitige Abgabe der DNA und von dessen verwandtem Protein an die gleiche, ein Antigen präsentierende Zelle oder erkennen die Bedeutung dieses Vorgangs nicht).
2. Die spezifische Theorie
Die spezifische Theorie besagt, dass am verstärkten Leistungsvermögen des in entsprechender Weise gemeinsam zubereiteten Materials (wobei sowohl die DNA als auch deren verwandte Protein innerhalb einer einzigen Vesikel assoziiert sind, so dass Vesikel einnerhalb einer Population sowohl DNA als auch Protein aufweisen), das Abzielen (durch ein Antigen in der Proteinform, das an der Oberfläche des Teilchens exponiert ist) der Vesikel auf antigenspezifische B- Zellen beteiligt ist, wodurch selektiv sowohl DNA als auch deren verwandtes Protein in einer zielgerichteten Art an die gleiche antigenspezifische B-Zelle abgegeben werden. Da die antigenspezifischen B-Zellen sich üblicherweise im Verlauf einer Immunantwort vermehren, ist es wahrscheinlich, dass diese sich vermehrenden Zellen bessere Ziele für die Transduktion durch die Nucleinsäure, die ebenfalls im Teilchen vorhanden ist, darstellen, als nicht-proliferierende Zellen. Wie im Fall der vorstehenden allgemeinen Theorie ermöglicht die gemeinsame Abgabe der DNA und ihres verwandten Proteins an die gleiche Zelle eine synergistische Wechselwirkung in der sich ergebenden Immunantwort, die nicht möglich wäre, wenn die DNA durch eine ein Antigen präsentierende Zelle (in diesem Fall eine antigenspezifische B-Zelle) und das Protein durch eine andere Zelle aufgenommen würde. In der spezifischen Form der Theorie werden die Teilchen durch die antigenspezifischen Rezeptoren (d. h. Oberflächenantikörper) von B-Zellen eingefangen und die Nucleinsäure plus ihr verwandtes Protein (das Assistorprotein) werden beide durch individuelle, antigenspezifische B-Zellen aufgenommen.
Die Wirksamkeit einer Immunisierung auf Nucleinsäurebasis wird durch den niederen Transduktionswirkungsgrad begrenzt, der in vivo mit bloßen Zubereitungen der für das Antigen kodierenden Nucleinsäure (z. B. bloße DNA) erreicht wird, so dass wenige Zellen die Nucleinsäure von Interesse aufnehmen und exprimieren. In der beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendeten wir vesikuläre, vorwiegend liposomale Zusammensetzungen, um in vivo einen Schutz der DNA vor Nucleasen zu erreichen und eine gemeinsame Zubereitung der DNA und ihres verwandten Proteins (des Assistorproteins) im gleichen Teilchen zu ermöglichen, obgleich es für den Leser klar sein sollte, dass auch andere vesikuläre Zusammensetzungen zur Erzielung einer Assoziation der DNA und ihres verwandten Proteins verwendet werden können, um die erforderlichen Eigenschaften der hier definierten gemeinsamen Abgabe zu erreichen.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfassen die Vesikel Liposomen, die aus liposomenbilddenden Materialien gebildet sind, d. h. aus Lipid-Doppelschichten gebildet sind. Die Vesikel können alternativ einschichtig sein. Liposomen können synthetische, amphiphile Komponenten umfassen, wie Moleküle vom Tensidtyp. Nicht-ionische Vesikel dieses Typs sind häufig als Niosomen bekannt. Möglicherweise enthalten die Vesikel keine Phospholipide, beruhen aber vorzugsweise im wesentlichen auf Phospholipiden.
Im Verlauf unserer eigenen Untersuchungen unter Verwendung von liposomalen Zusammensetzungen strebten wir es an, einen wirksamen Einschluss und/oder Assoziation von Protein und DNA in den gleichen liposomalen Teilchen zu erreichen. Wir stellten fest, dass die von uns zum Verpacken und zum Schutz von DNA gegen Nucleasen und für die DNA-Immunisierung entwickelten liposomalen Zusammensetzungen (wie in unserer früheren Anmeldung WO-A-98/10748 beschrieben) gleichzeitig auch zur gemeinsamen Verpackung von Protein und DNA sehr wirksam sind. Überraschenderweise konkurrieren unter den hier für die Zubereitung der Liposomen definierten Bedingungen die DNA und das Protein nicht miteinander um die Assoziation oder die Aufnahme im liposomalen Teilchen. Außerdem sind sie auch dazu befähigt, signifikante Mengen des Assistorproteins in der antigen aktiven Form an der Oberfläche des liposomalen Teilchens vorzuhalten. Wir nehmen an, dass das an der Oberflächen lokalisierte Protein-Antigen unserer neuen Zusammensetzung (das Assistorprotein) möglicherweise dazu befähigt ist, dass Liposomen oder Liposomenfragmente, die in vivo beim Abbau dieser Strukturen erzeugt werden, auf antigenspezifische B-Zellen gerichtet werden.
Obgleich liposomal zubereitete DNA auf Rezeptoren an Antigen-präsentierenden Zellen gerichtet werden können, z. B. indem man Liganden für zelluläre Rezeptoren von ein Antigen präsentierenden Zellen auf der Oberfläche von Liposomen anbringt (z. B. Mannosylreste oder Komplementproteine, wie C3d), wurde ein Antigen selbst bisher nicht als Zielvorrichtung in Impfstoffen auf Nucleinsäurebasis verwendet.
Die neuen Zusammensetzungen ermöglichen es, dass die ein Antigen präsentierenden Zellen gleichzeitig sowohl die aufgenommene Proteinform des Antigens (das Assistorprotein) als auch die aus ihrer verwandten entsprechenden Nucleinsäure exprimierte Form des Proteins präsentieren. Eine derartige Zusammensetzung ermöglicht einen neuartigen "Prime-Boost"-Effekt, wobei die unterschiedliche Kinetik der Präsentation des exprimierten antigenen Proteins und des Assistorproteins (die Maxima zu verschiedenen Zeitpunkten aufweisen) für eine länger anhaltende und "doppelt zuschlagende" Einwirkung der relevanten Immunzellen auf das Antigen sorgen. Im Gegensatz zu anderen "Prime-Boost"-Erscheinungen auf dem Gebiet der Nucleinsäure-Impfstoffe sorgen die neuen Zusammensetzungen für "Prime"- und "Boost"-Funktionen mit einer einzigen Dosis.
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der neuen Zusammensetzungen bezieht sich auf die unterschiedlichen Arten der Antigen-Präsentation der beiden Formen (die zugesetzte Form und die in vivo exprimierte Form des Proteins). Da aufgenommene und exprimierte Proteine durch zwei verschiedene Wege in den ein Antigen präsentierenden Zellen präsentiert werden (wobei der erste Weg zur Peptid-Präsentation über Klasse II-MHC führt und der letztgenannte Weg über Klasse I-MHC), sorgt die Erfindung für eine Immunantwort auf breiterer Basis unter Beteiligung der Stimulation von T-Helferzellen (auf Klasse II beschränkt), auf Klasse II beschränkte Effektor-T-Zellen und zytotoxische T-Zellen (auf Klasse I beschränkt). Die zelluläre Mikroumgebung, die durch die neuen Zusammensetzungen geschaffen wird (wobei sowohl die Klasse II- als auch die Klasse I-Präsentation auf der gleichen, ein Antigen präsentierenden Zelloberfläche erfolgen), ermöglicht Wechselwirkungen unter den verschiedenen T-Zelltypen, die sich mit der ein Antigen präsentierenden Zelle befassen. Da beide T-Zelltypen (auf Klasse I und Klasse II beschränkt) während der Wechselwirkung mit der gleichen, ein Antigen präsentierenden Zelle und durch Wechselwirkungen miteinander bei gleichzeitiger Anwesenheit an der ein Antigen präsentierenden Zelloberfläche stimuliert werden können, besitzt die neue Zubereitung mehrere theoretische Vorteile gegenüber früher beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen für die Nucleinsäure-Immunisierung. Wir beschreiben hier, dass die theoretischen Vorteile in der Praxis auf dem Niveau von Antikörperantworten gegen das Antigen bestätigt werden. Wir sagen jedoch voraus, dass sich für die Strategie mit der neuen Zubereitung weitere Vorteile auffinden lassen, und zwar in Bezug auf eine Stimulierung einer zellvermittelten Immunität (unter Einschluss von T-Helferzellen-Antworten und Effektor T-Zellen-Antworten unter Einschluss von zytotoxischen T-Zellen). Da Antikörperantworten auf Protein-Antigene hochgradig von T-Zellen abhängig sind, stellen die in der vorliegenden Anmeldung vorgelegten Daten einen starken Hinweis darauf dar, dass die neuen Zusammensetzungen bei der Stimulierung (zumindest) von T-Helferzellen-Antworten (auf (MHC Klasse-II beschränkt) wirksam sind. Die Tatsache, dass die neue Zubereitungsstrategie für die gleichzeitige Stimulierung von auf die Klasse II beschränkten Helferzellen und von auf die Klasse I beschränkten zytotoxischen Zellen auf der gleichen, ein Antigen präsentierenden Zelle sorgt, lässt ferner darauf schließen, dass die Strategie bei der Stimulierung von zytotoxischen T-Zellantworten wirksam ist. Somit bietet das Assistorprotein eine zusätzliche Hilfe für zytotoxische T-Zellanworten, d. h. es erhöht die Konzentration und/oder die Expressionsdauer von auf die MHC Klasse II beschränkten Peptidepitopen des durch T-Helferzellen erkannten Antigens an der Oberfläche der ein Antigen präsentierenden Zelle, wodurch die Gelegenheit für die T-Zellhilfe von zytotoxischen T-Zellantworten zur exprimierten Form für das über den Klasse I-MHC-Weg präsentierten Protein-Antigens verstärkt wird.
Eine Immunantwort erfordert ein Zusammenwirken von verschiedenen Zellen des Immunsystems, nämlich von ein Antigen präsentierenden Zellen (wie Makrophagen und dendritische Zellen, die als "klassische", ein Antigen präsentierende Zellen bekannt sind), T-Zellen (T-Lymphozyten) und B-Zellen (B-Lymphozyten). B-Zellen besitzen die Fähigkeit, den T-Zellen Antigene in einer Art und Weise zu präsentieren, die in verschiedener Hinsicht analog zur Präsentation durch herkömmliche, ein Antigen präsentierende Zellen ist. Während dieser B-Zellen-T-Zellen-Wechselwirkung erfahren die B-Zellen die "Hilfe", die sie zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern benötigen. Im Gegensatz zu klassischen, ein Antigen präsentierenden Zellen erweisen sich B-Zellen bei der Aufnahme von teilchenförmigen Antigenen aber nicht als leistungsfähig. Einige B-Zellen (d. h. solche, die für ein vorgegebenes Antigen spezifisch sind) erweisen sich aber als besonders leistungsfähig bei der Antigen-Präsentation, da sie zur Aufnahme und Konzentration kleiner Antigenteilchen (einschließlich Antigenmoleküle) über ihre antigenspezifischen Oberflächen-Immunoglobulin-Rezeptoren befähigt sind. Im Vergleich zu Antigen-unspezifischen B-Zellen erweisen sich Antigen-spezifische B-Zellen mindestens 1 000-fach wirksamer in ihrer Fähigkeit, ein Antigen den auf die Klasse II beschränkten T-Zellen zu präsentieren (A. Lanzavecchia, Antigenspecific interaction between T and B cells, Nature, Bd. 314 (11. bis 17. April 1985) (6011), S. 537-539). Antigenspezifische B-Zellen können daher wichtige Ziele für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen darstellen, da sie die Fähigkeit besitzen, Teilchen eines antigenen Proteins und ihrer assoziierten DNA aufzunehmen.
T-Zellen und B-Zellen erkennen Antigene auf unterschiedliche Weise. Diese unterschiedlichen Erkennungsarten haben Auswirkungen auf die unterschiedlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Um die vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung zu verstehen, ist es zunächst erforderlich, die Merkmale dieser unterschiedlichen Erkennungsarten zu würdigen. T-Zellen erkennen Peptidfragmente von Proteinen, die in Klasse II- oder Klasse I-MHC-Antigene an der Oberfläche von Zellen eingebettet sind, während B-Zellen (die letztlich Antikörper erzeugen) Oberflächenmerkmale des unfragmentierten Antigens (bei dem es sich vom Charakter her üblicherweise um ein Protein handelt) über antikörperähnliche Antigen-Rezeptoren an ihren Zelloberflächen erkennen. Die verschiedenen Erkennungsanforderungen von T-Zellen und B-Zellen spiegeln sich in der unterschiedlichen Natur ihrer Epitope wider. Während somit B-Zellen Oberflächenmerkmale eines Antigens oder eines Pathogens (B-Zellepitope) erkennen müssen, sind T-Zellepitope (die Peptide mit einer Länge von 8-12 Aminosäuren umfassen) nicht dazu verpflichtet, auf der Oberfläche ein Antigen zu präsentieren und sie können bei Betrachtung im Zusammenhang mit der dreidimensionalen Struktur des Antigens "intern" oder "extern" sein. Gemäß der "spezifischen Theorie" der vorliegenden Erfindung (gemäß der vorstehenden Definition) handelt es sich bei der besonders bevorzugten Position eines B-Zellepitops um die "Oberfläche" am Antigen oder Pathogen, was die Aufnahme und Stimulierung von Antigen-spezifischen B-Zellen durch eine in entsprechender Weise formulierte liposomale (Nucleinsäure + Protein)-Zusammensetzung erleichtert. Jedoch kann gemäß der allgemeinen Theorie der Erfindung (wonach Liposomen in einer Antigen-unspezifischen Weise durch ein Antigen präsentierende Zellen aufgenommen werden) ein Epitop (insbesondere ein T-Zellepitop) sich intern in der Struktur des Antigens befinden und es muss nicht an der Oberfläche des Antigens oder Mittels verfügbar oder exponiert sein.
Bei einem vorteilhaften Aufzeichnungsmaterial der Erfindung leiten sich sowohl das antigene Protein als auch das Assistorprotein von einem Oberflächenantigen eines viralen Proteins ab. Die Proteine können untereinander die gleichen Sequenzen aufweisen oder sie können mutiert sein, deletierte Bereiche aufweisen oder sie können mit anderen Polypeptiden fusioniert sein, vorausgesetzt, sie haben mindestens und vorzugsweise mehrere Epitope (B-Zellen oder T-Zellen) gemeinsam.
Die Bereiche des Proteins, die das antigene Protein und das Assistorprotein gemeinsam haben, können in Form ihrer Sequenzhomologien exprimiert werden. Es wird angenommen, dass die Proteine so beschaffen sein sollen, dass das Assistorprotein mindestens eine zusammenhängende Sequenz von mindestens 10 Resten mit mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 75% und insbesondere mindestens 90% Ähnlichkeit mit einer zusammenhängenden Sequenz der gleichen Länge des antigenen Proteins aufweist. Im allgemeinen weisen die entsprechenden zusammenhängenden Sequenzen eine Länge von mindestens 50 Resten auf und weisen eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 90% und vorzugsweise von mindestens 75% auf. Insbesondere weisen die zusammenhängenden Sequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 50%, vorzugsweise von mindestens 75% und insbesondere von mindestens 90% auf.
Die Sequenzähnlichkeit stellt jedoch nur einen Index der Strukturähnlichkeit dar und im Fall der "speziellen Theorie" (vorstehend definiert) ist es lediglich erforderlich, dass das Assistorprotein und das kodierte und exprimierte Protein ein einziges B-Zellepitop (definiert als erkannt durch einen einzigen Antikörper, der das Mittel erkennt) ohne jegliche Erfordernisse für die Sequenzhomologie gemeinsam haben.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich zur Erzeugung einer Immunantwort, die beispielsweise für die Resistenz gegen eine Infektion ausreicht, durch ein infektiöses Mittel. Das antigene Protein und das Assistorprotein leiten sich somit vorzugsweise von einer Quelle ab, bei der es sich um ein infektiöses Mittel handelt, z. B. um einen Mikroorganismus, wie ein Bakterium oder ein Virus. Geeigneterweise handelt es sich beim Virus um ein Virus, gegen das Immunantworten bekannt sind (oder als bekannt gelten), die zur Neutralisation oder Beseitigung des Virus befähigt sind, z. B. eines Hepatitis-Virus (wie Hepatitis B- oder C-Viren) oder eines Influenza-Virus (wie Influenza A- oder B-Viren). In geeigneter Weise kann es sich beim infektiösen Mittel um ein Bakterium handeln, z. B. um eine Streptokokke (wie Streptococcus pneumoniae oder ein Mitglied der Streptokokken der Gruppe A oder Gruppe B), oder um ein Mittel, das zur Verursachung von Meningitis befähigt ist, wie Meningokokken der Gruppen A, B und C oder Haemophilus influenzae, oder Organismen, die zur Verursachung von Ohreninfektionen bei Kindern befähigt sind, wie Moraxella cattharalis. In geeigneter Weise kann es sich beim Mittel um ein Mycobacterium, wie Mycobacterium tuberculosis, handeln. Geeigneterweise kann es sich beim Antigen auch um ein Wirtsprotein handeln, das in selektiver Weise an oder innerhalb von Krebszellen oder -geweben exprimiert wird, z. B. das karzinoembryonale Antigen, oder CD55 (ein Komplement-Kontrollprotein) oder ein Integrin oder ein anderer Macker des Tumorgefäßsystems. Beim Zielantigen dieser neuen Impfstoffzusammensetzung kann es sich auch um ein Wirtsprotein oder -peptid handeln, das neutralisiert oder beseitigt werden muss, z. B. ein schädlicher Autoantikörper, oder ein Peptid, wie das Amyloid-beta-peptid der Alzheimer-Krankheit in ihren verschiedenen Formen (A-beta 40 und A-beta 42).
Beim Zielantigen des Impfstoffes kann es sich auch um ein Kohlenhydrat handeln, z. B. um ein bakterielles Polysaccharid, wobei die exprimierte Form des Proteins und/oder des Assistorproteins die antigene Struktur des Kohlenhydrat-Antigens nachahmt. Geeignete Peptid-Nachahmerprodukte des Polysaccharids von Meningokokken der Gruppe B (D. M. Granoff und G. R. Moe, Molecular mimetics of meningococcal B epitopes, US-Patent 6 030 619) und des Streptokokken-Gruppe B-Polysaccharids wurden beschrieben. Derartige Peptide können als miteinander verkettete Formen exprimiert werden, wobei die Ausführungsformen der verschiedenen Peptidsequenzen des Kohlenhydratepitops miteinander auf dem DNA-Niveau verknüpft sind, um ein Polypeptid oder Protein, das Wiederholungsepitope einer unterschiedlichen Sequenz enthält, zu bilden.
Erfindungsgemäß ist es erstrebenswert, dass das oder die Zielepitope gegen die eine günstige Immunantwort angestrebt wird, dem oder den Epitopen entsprechen, die dem durch die DNA kodierten Protein und dem Assistorprotein gemeinsam sind. Die in situ-Position des oder der Zielepitope am Zielantigen kann für Antikörper zugänglich sein (z. B. neutralisierende Epitope des Influenza A-Hämagglutinins), jedoch können sie sich alternativ in geeigneter Weise auch im Innern des Mittels befinden (z. B. ein Wärmeschockprotein von Mycobacterium tuberculosis).
Das Assistorprotein ist zwar üblicherweise hochgradig ähnlich oder identisch mit dem von der Nucleinsäure kodierten Protein in der Zusammensetzung, es kann sich aber um ein vollständiges Virus (Virion) oder ein "gespaltenes" Viruspräparat handeln (z. B. um bekannte, mit einem Detergens lysierte Influenza-Virus-Präparate), vorausgesetzt, dass es ein Protein enthält, das mindestens ein und vorzugsweise mehrere) gemeinsame Epitope mit dem durch die Nucleinsäure kodierten Protein aufweist. Das Assistorprotein besteht im allgemeinen nicht aus einem lebensfähigen Virus, das zur Replikation in einem Wirtstier befähigt ist.
Erfindungsgemäß kann es sich bei der Nucleinsäure um RNA handeln, wobei es sich aber vorzugsweise um DNA und insbesondere um doppelsträngige DNA handelt. DNA, die in funktioneller Weise für ein Antigen kodiert, soll vorzugsweise einen Promotor und insbesondere Kontrollsequenzen enthalten. Geeigneterweise handelt es sich bei der DNA um Plasmid-DNA, die sich zweckmäßigerweise vom E. coli-C1-Plasmid ableitet, wobei es sich aber auch um eine lineare DNA handeln kann.
Es kann erfindungsgemäß erstrebenswert sein, eine Nucleinsäure aufzunehmen, die für mehr als ein Protein kodiert, und/oder ein oder mehr verschiedene Assistorproteine aufzunehmen. Für diese Ausführungsform ist es bevorzugt, dass eine einzige Vesikel eine mit ihr assoziierte Nucleinsäure aufweist, die für ein antigenes Protein kodiert, das gemäß den vorstehenden Angaben Epitope mit dem antigenen Protein oder Assistorprotein, die mit dem Teilchen assoziiert sind, gemeinsam hat. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung zwei oder mehr verschiedene Liposomentypen im Gemisch enthalten, z. B. ein Liposom, das eine Nucleinsäure umfasst, die für ein erstes antigenes Protein kodiert, zusammen mit einem ersten Assistorprotein, wobei das antigene Protein und das Assistorprotein gemäß den vorstehenden Angaben verwandt sind, und einen zweiten Liposomentyp, der eine Nucleinsäure umfasst, die für ein zweites antigenes Protein kodiert, in Assoziation mit einem zweiten Assistorprotein, das gemäß den vorstehenden Angaben mit dem zweiten antigenen Protein verwandt ist. Alternativ kann ein einziges Liposom zwei oder mehr verschiedene Nucleinsäuren enthalten, von denen eine für ein erstes antigenes Protein und die andere für ein zweites antigenes Protein kodiert (und dergl.), sowie ein erstes und ein zweites (und dergl.) Assistorprotein, wobei das erste und das zweite Assistorprotein mit dem entsprechenden ersten und zweiten antigenen Protein gemäß den vorstehenden Angaben verwandt sind. Die zwei oder mehr antigenen Proteine können Bestandteil des gleichen exprimierten Proteinmoleküls (d. h. eines Fusionsproteins) sein, das durch eine einzige Nucleinsäure kodiert wird. Alternativ können zwei oder mehr getrennte Nucleinsäurekomponenten, von denen jede für verschiedene Teile von einem einzigen antigenen Protein kodiert, (zusammen mit dem Protein) in einem einzigen Liposom enthalten sein. Eine vorteilhafte Zusammensetzung kann ferner einzelne, gemeinsam zubereitete DNAs und deren verwandte Proteine (Assistorproteine) umfassen, vorausgesetzt, dass jede DNA mit ihrem verwandten oder Assistorprotein im gleichen Liposom assoziiert ist.
Die gleiche Anordnung von Nucleinsäure und Protein kann in erfindungsgemäßen vesikulären Zusammensetzungen erzielt werden, die aus Nichtphospholipid-Komponenten gebildet sind.
Ausführungsformen, die mehr als ein antigenes Protein (gemäß den Ausführungen im vorstehenden Absatz) beinhalten, können von besonderem Wert sein, wenn die Zusammensetzung zur Erzeugung einer Immunantwort (im allgemeinen zur Impfung eines Subjekts) gegen ein infektiöses Mittel, das in mehreren infektiösen Stämmen vorliegen kann, zu verwenden ist. Diese erfindungsgemäße Ausführungsform ist dann von besonderem Wert, wenn es sich beim infektiösen Mittel um ein Virus, insbesondere ein Influenza-Virus, handelt. Somit können die durch die Nucleinsäure kodierten antigenen Proteine und ihre entsprechenden Assistorproteine von A- und B-Stämmen von Influenza-Virus abgeleitet sein. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zwei derzeit im Umlauf befindliche (oder vorhersehbare) Stämme von Influenza A plus einen derzeit im Umlauf befindlichen (oder vorhersehbaren Stamm) von Influenza B. Die Zusammensetzung umfasst in vorteilhafter Weise sämtliche sechs molekularen Einheiten, die mit einer einzigen Vesikel (z. B. einem liposomalen Partikel) assoziiert sind, so dass jedes Partikel mit sämtlichen drei Nucleinsäuren und sämtlichen drei Proteinen assoziiert ist. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform, die Influenza-Viren enthält, umfasst drei in getrennter Weise erzeugte vesikuläre Zubereitungen, die {Ai-Protein + Ai-DNA}; {Aii-Protein + Aii-DNA} und {B-Protein + B-DNA} (wobei geschwungene Klammern die Beladung einer individuellen Vesikel bedeuten) umfassen, wobei die Bestandteile miteinander in einer einzigen Dosis vermischt oder in drei separaten Dosen einem humanen oder tierischen Empfänger verabreicht werden.
Gemäß einer geeigneten Ausführungsform der Erfindung ist die Nucleinsäure zumindest teilweise und vorzugsweise im wesentlichen vollständig im intravesikulären Raum der Vesikel, üblicherweise der Liposomen, eingeschlossen. Beim Einschließen im intravesikulären Raum wird die Nucleinsäure in optimaler Weise gegen ihre Umgebung geschützt, sie kann aber dennoch an geeignete Zellen abgegeben werden, nachdem sie einem Subjekt verabreicht worden ist. Alternativ (aber weniger bevorzugt) kann die Nucleinsäure mit den Vesikeln komplexiert sein, d. h. vorwiegend auf der äußeren Oberfläche der Vesikel assoziiert sein. Eine derartige Anordnung bietet einen geringeren Grad des Schutzes während der Verabreichung und der Abgabe der Nucleinsäure, kann sich aber auch als wirksam erweisen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Assistorprotein vorzugsweise zumindest teilweise an der äußeren Oberfläche der Vesikel zugänglich. Dies ermöglicht die Aufnahme der Vesikel durch antigenspezifische B-Zellen und erleichtert im Anschluss an die Erzeugung von Antikörpern in frühen Stadien der Immunantwort gegen die Impfstoffzusammensetzung die Aufnahme von mit Antikörpern komplexierten Vesikeln durch ein Antigen präsentierende Zellen über Fc-gamma-Rezeptoren von hoher Affinität, die an der Oberfläche gebundenes, antigenspezifisches IgG an der Vesikeloberfläche erkennen. Gleichermaßen ermöglicht ein an der Oberfläche befindliches Antigen an einer liposomalen oder anderen Vesikel eine Komplementfixierung, was zur Aufnahme von Vesikeln und ihrer Fragmente durch Komplementrezeptoren an Antigen-präsentierenden Zellen und B-Zellen führt. Um diese Ergebnisse zu erreichen, kann das Protein lediglich mit der äußeren Oberfläche der Vesikel komplexiert sein (z. B. durch elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen in der Art eines extrinsischen Membranproteins) oder vorzugsweise in der Wand der Vesikel eingebettet sein (z. B. über eine transzweischichtige, hydrophobe Sequenz einer Polypeptidkette) und teilweise der extravesikulären Umgebung ausgesetzt sein. In beiden Fällen soll gemäß dieser Ausführungsform das Epitop von Interesse von der Außenseite der Vesikel aus zugänglich sein. Eine derartige Zugänglichkeit kann unter Durchführung von Bindungsexperimenten unter Verwendung von Antikörpern gegen das entsprechende Epitop bestimmt werden. Derartige Bindungsdaten, die die Oberflächenexposition nachweisen, werden in den beigefügten Figuren beschrieben, die sich auf unsere Arbeiten über die gleichzeitige Zubereitung von DNA und Protein für Influenza A-Virus beziehen.
Wenn die Vesikel liposomal ist, können die liposomenbildenden Komponenten, die zur Bildung der Liposomen eingesetzt werden, neutrale, zwitterionische, anionische und/oder kationische Lipidreste umfassen. Diese können in solchen relativen Mengen verwendet werden, dass sie dem Liposom eine Gesamtladung verleihen oder, was weniger bevorzugt ist, den Liposomen keine Gesamtladung verleihen. Es wurde festgestellt, dass unter Verwendung von Lipidkomponenten, die dem Liposom insgesamt eine positive Ladung verleihen, sich gute Ergebnisse erzielen lassen (vergl. den Datenteil dieser Anmeldung). Neben Komponenten, die als echte Lipide bezeichnet werden (unter Einschluss von Glyceriden und Cholesterin) können die liposomenbildenden Komponenten Nichtlipid-Komponenten umfassen (d. h. bei denen es sich um nicht natürlich auftretende Lipide handelt), wie nicht-ionische oder kationische oberflächenaktive Mittel.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die neue Zusammensetzung Liposomen, die aus liposomenbildenden Komponenten gebildet sind, unter Einschluss mindestens einer kationisch geladenen Komponente in einer solchen Menge, dass die Liposomen insgesamt eine positive Ladung aufweisen.
Bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform kann es sich bei der in das Liposom einverleibten kationischen Komponente um beliebige Produkte handeln, die in Liposomenpräparaten zur Verbesserung der Transfektionsrate durch Komplexbildung mit Polynucleotiden verwendet werden. Bei der Komponente kann es sich um eine Lipid- oder Nichtlipidverbindung handeln und sie kann synthetisch oder natürlich sein. Bevorzugte kationische Lipide sind 1,2-Bis-(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)-propan (DOTAP), 1,2-Bis-(hexadecyloxy)-3-trimethylaminopropan (BisHOP), N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-triethylammoniumchlorid (DOTMA) und weitere Lipide der in US-A-4 897 355 definierten Strukturformel I oder deren Esteranaloge.
Es handelt sich um folgende Strukturformel:
oder um ein optisches Isomeres davon, wobei Y1 und Y2 gleich oder verschieden sind und jeweils -O- oder O-C(O)- bedeuten, wobei das Carbonylkohlenstoffatom je nach Fall an R1 oder R2 gebunden sein kann; R1 und R2 unabhängig voneinander eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoffatome, Alkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Aryl- oder Aralkylreste mit 6 bis 11 Kohlenstoffatomen bedeuten; alternativ 2 oder 3 der Reste R3, R4 und R5 mit dem positiv geladenen Stickstoffatom unter Bildung einer cyclischen Struktur mit 5 bis 8 Atomen kombiniert sind, wobei es sich neben dem positiv geladenen Stickstoffatom bei den Atomen in der Strukturformel um Kohlenstoffatome handeln kann und die Atome ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom umfassen können; n einen Wert von 1 bis 8 hat; und X ein Anion bedeutet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um Zusammensetzungen, bei denen R1 und R2 individuell 0 bis 6 ungesättigte Positionen aufweisen und folgende Strukturformel vorliegt CH₃-(CH₂)_a-(CH=CH-CH₂)_b-(CH₂)_c- wobei die Summe von a und c 1 bis 23 beträgt; und b einen Wert von 0 bis 6 hat. Insbesondere handelt es sich bei jedem der Reste R1 und R2 um Oleyl. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um Zusammensetzungen, bei denen die langkettigen Alkylgruppen Fettsäuren darstellen, d. h. wobei Y1 und Y2 gleich sind und die Bedeutung -O-C(O)- haben.
Alternativ können kationische Lipide der allgemeinen Strukturformel I oder der allgemeinen Strukturformel II gemäß US-A-5 459 127 verwendet werden.
Zu weiteren geeigneten kationischen Verbindungen gehören die Nichtlipidkomponenten Stearylamin und 3β-[N,N',N'-(Dimethylaminoethan)-carbamyl]-cholesterin (DC-Chol) (eine Lipidkomponente) oder Analoge davon.
Die Liposomen enthalten neben kationischen Komponenten im allgemeinen auch nicht-ionische und/oder zwitterionische Komponenten, die Lipide umfassen, bei denen es sich um Phospholipide oder andere Lipide, die keine Phosphorylgruppen enthalten, handeln kann. Vorzugsweise umfassen die Lipide Phospholipide, wie natürliche oder synthetische Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylserine, bei denen die langkettigen Alkylgruppen, die über Ester- oder Etherbindungen verbunden sein können, gesättigt oder ungesättigt sein können. Vorzugsweise sind die Acylgruppen von Glyceridlipiden ungesättigt. Die Komponenten können Nichtlipidkomponenten umfassen, z. B. nicht-ionische Tenside, wie Sorbitanmonoester von Fettsäuren und/oder ethoxylierte Fettsäuren oder andere Analoge, wie ethoxylierte Lanoline.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Liposomen fusogene Lipide umfassen, bei denen es sich üblicherweise um Phosphatidylethanolamine handelt, bei denen die Acylgruppen ungesättigt sind. Cholesterin kann enthalten sein, obgleich es die Liposomen für eine angemessene Abgabe des Polynucleotids in Zielzellen zu stabil macht.
Die Menge der kationischen Komponente liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 50% der Gesamtmolzahl der liposomenbildenden Komponenten, insbesondere im Bereich von 10 bis 25 Mol-%.
Eine Vesikelzusammensetzung liegt im allgemeinen in Form einer wässrigen Suspension vor, z. B. in einem physiologischen Puffer. Alternativ kann es sich um eine getrocknete Zusammensetzung, die zur Rehydratisierung vorgesehen ist, handeln.
Bei der Zusammensetzung handelt es sich vorzugsweise um einen Impfstoff, der für eine Verabreichung auf subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intradermalem, nasalem, oralem, anderweitig mukosalem oder pulmonalem Wege geeignet ist.
Die Vesikel können nach beliebigen, allgemein angewandten Techniken zur Vesikelbildung hergestellt werden. Bei den Vesikeln kann es sich um multilamellare oder unilamellare Vesikel handeln und sie können relativ groß (Vesikeldurchmesser im Bereich von 300 nm bis 5 000 nm; vorzugsweise weniger als 2 000 nm, vorzugsweise mit durchschnittlichen Durchmessern im Bereich von 500-1 000 nm) oder klein sein (Vesikeldurchmesser im Bereich von 100 nm bis 400 nm, vorzugsweise mit durchschnittlichen Durchmessern im Bereich von 200 bis 300 nm). Vorzugsweise weist die Vesikel einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 500 nm auf und vorzugsweise liegen im wesentlichen sämtliche Durchmesser unter 2 000 nm.
Obgleich eine erfindungsgemäße liposomale Zusammensetzung durch herkömmliche Verfahren zur Liposomenbildung gebildet werden kann, z. B. durch Dispergieren der liposomenbildenden Materialien aus einem Film in ein Suspendiermedium, das die Nucleinsäure und das Protein enthält, wonach sich eine oder mehrere Stufen zur Größeneinstellung anschließen, oder alternativ durch gleichzeitiges Lösen von liposomenbildenden Materialien und Nucleinsäure und/oder Assistorprotein in einem gemeinsamen Lösungsmittel, wonach sich eine Liposomenbildungsstufe, die die Zugabe einer wässrigen Flüssigkeit umfasst, oder eine Beladung mit Nucleinsäure und/oder Assistorprotein durch die Wände von vorgeformten Liposomen anschließt, wobei man sich einer einengenden Gradientenelektroporation oder einer elektrophoretischen Technik bedient und wobei bei einem bevorzugten Verfahren eine Technik unter Dehydratisierung/Rehydratisierung angewandt wird.
Mehrere geeignete Verfahren zur Herstellung von liposomalen Zubereitungen sind im Buch/Kapitel von Christopher J. Kirby und Gregory Gregoriadis beschrieben: ISBN 0-471-14828-8 Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Hrsg. Edith Mathiowitz, erschienen Juli 1999 bei Wiley, Kapitel "L" für Liposomen. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) multilamellare Liposomen, die durch das "Schüttelverfahren von Hand" hergestellt werden; Dehydratisierungs/Rehydratisierungs-Vesikel (das in den vorliegenden Beispielen eingesetzte Verfahren, das sehr wirkungsvoll ist); und die einfache Hydratisierung von in Lösungsmitteln solubilisierten Lipiden. Die gleichzeitige Anwesenheit von DNA und Protein bei diesen Verfahren führt zu unterschiedlichen Graden des gleichzeitigen Einfangens und anderer Formen der Assoziation von beiden Einheiten mit den Liposomen. Ferner kann Calciumphosphat zur gemeinsamen Ausfällung von DNA und Protein verwendet werden, wodurch man eine Version einer "gemeinsamen Zubereitung von Protein und DNA" gemäß unserer in WO-A-01/41739 beschriebenen Erfindung erhält.
Ein weiteres günstiges Verfahren zur Bildung von assoziierter DNA und ihres verwandten Proteins ist das von Judith Senior und Gregory Gregoriadis veröffentlichte Verfahren (Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 1003 (1989), S. 58-62). Hierbei handelt es sich um eine Variante des Dehydratisierungs-Rehydratisierungs-Verfahren, wobei die "Assistorprotein"-Komponente der vorliegenden Erfindung durch kovalente Konjugation an der Oberfläche von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) eingebaut werden kann. Derartige SUV werden sodann lyophilisiert und anschließend gemäß Senior und Gregoriadis (a.a.O.) in einer Lösung der für das Antigen kodierenden DNA rehydratisiert. Die erhaltenen multilamellaren Vesikel weisen den Großteil der Proteinbeladung auf der Oberfläche der liposomalen Teilchen auf, was eine vorteilhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bildung einer liposomalen Zusammensetzung umfasst die folgenden Stufen:

a) das Bereitstellen einer wässrigen Suspension von kleinen, unilamellaren Vesikeln (SUV), die aus liposomenbildenden Materialien gebildet sind;
b) das Kontaktieren der wässrigen Suspension von SUVs mit Nucleinsäure, die funktionell für ein antigenes Protein kodiert, zur Bildung einer SUV-Nucleinsäure-Suspension;
c) das Dehydratisieren der SUV-Nucleinsäure-Suspension zur Bereitstellung eines dehydratisierten Gemisches; und
d) das Rehydratisieren des dehydratisierten Gemisches in einem wässrigen Resuspendiermedium zur Bildung einer Suspension von nucleinsäurehaltigen Liposomen,

Das Dehydratisierungs-Rehydratisierungs-Verfahren führt dazu, dass Nucleinsäure im intravesikulären Raum der gebildeten Liposomen eingeschlossen wird. Zusätzlich kann eine geringe Menge an der Außenseite der Liposomen verbleiben. Das Assistorprotein kann bei verschiedenen Stufen des Verfahrens zugesetzt werden. Es kann mit der wässrigen Suspension von SUVs vor, während oder nach Stufe b und vor Stufe c in Kontakt gebracht werden. Das Assistorprotein wird gemeinsam mit der Nucleinsäure im intravesikulären Raum der Liposomen eingeschlossen.
Bei einem alternativen Verfahren liegt das Assistorprotein während der Rehydratisierungsstufe im Resuspendiermedium vor. Bei dieser Ausführungsform ist es wahrscheinlich, dass mindestens ein Teil des Proteins an der äußeren Oberfläche der Liposomen exponiert ist. Bei einem alternativen Verfahren kann das Protein mit der wässrigen Suspension von nucleinsäurehaltigen Liposomen in Kontakt gebracht werden. Diese Ausführungsform führt dazu, dass im wesentlichen das gesamte Protein mit der äußeren Oberfläche der Liposomen assoziiert ist.
Um den Grad des Einbaus des Proteins zu erhöhen, wobei immer noch eine Exposition von Epitopen an der äußeren Liposomenoberfläche ermöglicht wird, kann es bei einigen Ausführungsformen erstrebenswert sein, das Assistorprotein mit einem lipophilen Rest zu konjugieren, der sich zur Einbettung in die Liposomenwand eignet, z. B. mit einem Fettsäureacylrest. Die Konjugation kann einen Teil des Herstellungsverfahrens für das Assistorprotein umfassen. Alternativ kann das Assistorprotein chemisch mit einer Komponente des Liposoms nach Durchführung von Stufe d konjugiert werden.
Wenn die liposomenbildenden Materialien kationische Reste umfassen, so dass insgesamt eine kationische Ladung auf den Liposomen vorliegt, kann eine angemessene elektrostatische Anziehung zwischen den positiv geladenen Liposomen und dem Assistorprotein vorliegen, wobei dieses insgesamt eine negative Ladung unter den Umgebungsbedingungen aufweist, so dass ein hydrophobes Protein erforderlich ist und eine Komplexbildung des Proteins eine ausreichend starke Assoziation ergibt.
Vorzugsweise umfassen die liposomenbildenden Materialien mindestens 5 Mol-% einer kationischen Verbindung.
Erfindungsgemäß liegt das Gewichtsverhältnis von Nucleinsäure zu Assistorprotein vorzugsweise im Bereich von 1 000:1 bis 1:1 und insbesondere liegt das Verhältnis in einem Bereich von 5:1 bis 30:1.
Das Gewichtsverhältnis von Nucleinsäure zu liposomenbildenden Materialien liegt vorzugsweise im Bereich von 1:00 bis 1:1 000 und insbesondere im Bereich von 1:100 bis 1:300.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren weisen die in Stufe a) verwendeten liposomalen Teilchen vorzugsweise Größen im Bereich von 30 nm bis 5 000 nm auf, wobei insbesondere im wesentlichen sämtliche Liposomen Durchmesser von weniger als 1 000 nm besitzen. Das Verfahren führt zu Produktliposomen mit Teilchengrößen im Bereich von 200 nm bis 5 000 nm und vorzugsweise im Bereich von 300 nm bis 2 000 nm. Sofern erforderlich, kann das Verfahren ein Merkmal zur Größenkontrolle beinhalten. Dies kann den Einbau von Komponenten in das Resuspendiermedium beinhalten, die die Liposomengröße steuern (z. B. Zucker, wie in WO-A-01/56548 beschrieben). Alternativ kann die Größenkontrolle eine zusätzliche Stufe im Anschluss an die Stufe d beinhalten, bei der die Suspension einer Mikrofluidisierung, einer Passage durch Filter oder einer Homogenisierung unterworfen wird. Eine Ultraschallbehandlung stellt für diesen Zweck eine weniger bevorzugte, jedoch mögliche Option dar, die aber unvermeidlicherweise zu einem gewissen Grad an DNA-Fragmentierung führt.
Nach Durchführung des Verfahrens ist es bevorzugt, dass die als Produkt gebildeten Liposomen, die sowohl Nucleinsäure als auch Protein umfassen, einer Reinigungsstufe unterzogen werden, bei der nicht-eingefangene Nucleinsäure oder Assistorprotein oder andere Komponenten aus der Produktsuspension entfernt werden. Derartige Reinigungsverfahren können Zentrifugationen, eine Filtration, eine Passage durch eine poröse Membran von definierter Porengröße, eine Gel-Ausschlusschromatographie, z. B. eine Größen-Ausschlusschromatographie, bei der Vesikel im Hohlraumvolumen auftreten, umfassen.
Wir haben festgestellt, dass die vorliegende Erfindung in Bezug auf die Erzeugung einer Immunantwort bei Verabreichung an ein Subjekt hochgradig wirksam ist, insbesondere in Bezug auf eine verbesserte Antikörper-Reaktion. Wir nehmen an, dass die erfindungsgemäß erreichte Verbesserung im Grund darauf zurückzuführen ist, dass die Nucleinsäure und das Assistorprotein gleichzeitig auf die gleichen, ein Antigen präsentierenden Zellen abzielen (möglicherweise unter Einschluss von antigenspezifischen B-Zellen), so dass im Anschluss an eine Begegnung mit einer in geeigneter Weise zubereiteten Vesikel eine individuelle, ein Antigen präsentierende Zelle sowohl die Nucleinsäure als auch dessen verwandtes Protein aufnimmt. Im Fall von Influenza-Hämagglutinin beobachten wir, dass eine getrennte Zubereitung von Nucleinsäure (DNA, die für Hämagglutinin kodiert) und von dessen verwandtem Protein (Hämagglutinin-Protein), hier in der Form eines vollständigen, inaktivierten Virusproteins, das frei von Nucleinsäure ist, in getrennten liposomalen Kompartimenten oder Populationen unter anschließendem Vermischen und gemeinsamer Verabreichung in vivo nicht zu der synergistischen Wirkung einer gemeinsamen Zubereitung der DNA und ihrem verwandten Protein in den gleichen liposomalen Partikeln führt, so dass jedes Liposom sowohl DNA als auch deren verwandtes Protein enthält.
Diese Daten stützen unsere Hypothese, dass die Synergie von DNA mit ihrem verwandten Protein in Bezug auf die Herbeiführung einer Immunantwort (in diesem Fall gegen das Influenza-Hämagglutinin) die geeignete Zubereitung erforderlich macht, die es ermöglicht, dass sowohl die DNA als auch deren verwandtes Protein gemeinsam auf die gleiche, ein Antigen präsentierende Zelle abzielen.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der beigefügten Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Hämagglutinin in kationischen Liposomen
Materialien und Methoden
Lipide
Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und 1,2-Dioleoyl-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen. Sämtliche Lipide wurden in Lösung in Chloroform, das mit Stickstoff gespült worden war, bei -20°C gelagert.
DNA
Plasmid-pCI-OVA (Ref. DNA-OVA) (zur Verfügung gestellt von Dr. T. Nagata, Hamamatsu University School of Medicine, Japan) enthält Hühnerei-Albumin-Protein (Ovalbumin, OVA) (A. Yoshida, T. Nagata, M. Uchijima, T. Higashi, Y. Koide, Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immune response, Vaccine, Bd. 18 (2000), S. 1725-1729). CDNA ist an der EcoRI-Stelle des pCI-Plasmids (Promega, Madison, WI), strangabwärts von der CMV-Enhancer/Promotor-Region kloniert. Das Plasmid p1.I7/SichHA (Ref. DNA-HA) wurde von Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) zur Verfügung gestellt (P. Johnson et al., J. Gen. Virol., (2000), S. 1737-1745). Es enthält HA von Influenza A/Sichuan/2/87 von voller Länge. Beide Plasmide für die Dosierung wurden gewerblich von Aldevron (Fargo, USA) erzeugt und enthielten <100 Endotoxin-Einheiten (EU)/mg DNA, wobei kein Restprotein nachweisbar war.
Proteine
Influenza A/Sichuan/2/87, vollständig inaktiviertes Virusprotein (an einem Saccharosegradienten gereinigt, Hauptprotein HA, Ref. Antigen-HA) wurde von NIBSC, UK, erhalten. Ovalbumin (Qualität VI, Ref. Antigen OVA) wurde von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen.
Herstellung von Liposomen-Zusammensetzungen
Kurz zusammengefasst, kleine, unilamillare Vesikel (SUV) wurden aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPE) und 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) (Molverhältnis 4:2:1) unter Ultraschallbehandlung hergestellt und mit DNA oder Protein allein oder mit DNA und Protein zusammen vermischt (Tabelle 1). Die Zubereitungen wurden im Dreifachversuch (2 Fläschchen für die Dosierung (Grundbehandlung und Auffrischung) und 1 Fläschchen für Berechnungen des prozentualen Einschlusses auf der Grundlage von radioaktiv markiertem Tracer (HA und OVA, DNA und Protein), die den Materialien zugesetzt wurden) hergestellt und über Nacht gefriergetrocknet (gemäß G. Gregoriadis, R. Saffie und S. L. Hart, High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, Bd. 3(6) (1996), S. 467-475; und C. Kirby, G. Gregoriadis, Dehydration-rehydration vesicles (DRV): a new method for high yield drug entrapment in liposomes, Biotechnology, Bd. 2 (1994), S. 979-984. Nach Rehydratisierung unter kontrollierten Bedingungen wurden die erzeugten dehydratisierten-rehydratisierten Vesikel (DRV-Liposomen) durch Zentrifugation gewaschen, um nicht-einverleibte Materialien zu entfernen. Die gewaschenen Pellets wurden in PBS auf das erforderliche Dosisvolumen resuspendiert. Der Einbau von DNA und/oder Protein in die Liposomen wurde auf der Grundlage der Radioaktivität von ³⁵S (für DNA) und ¹²⁵I (für Protein), die in den suspendierten Pellets festgestellt wurde, bestimmt. Die Liposomen wurden der Mikroelektrophorese und der Photonen-Korrelationsspektroskopie (PCS) bei 25°C in einem Malvern Zetasizer 3000-Gerät unterzogen, um ihr zeta-Potential (ZP) bzw. ihren durchschnittlichen z-Durchmesser zu bestimmen. Tabelle 1
Tierversuche
Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (Harlan, UK) wurden durch subkutane Injektion unter Verabreichung eines Dosisvolumens von 0,2 ml immunisiert (Tabelle 2). Die endgültigen Dosismengen wurden auf der Grundlage des prozentualen Materials (DNA, Protein oder beides), das eingeschlossen worden war, (aus Radioaktivitäts-Zählfläschchen) berechnet. Negative Kontrollmäuse erhielten entsprechende PBS-Dosen. Mäuse erhielten zwei Dosen des Antigens an den Tagen 0 und 28. Blutproben wurden aus der Schwanzvene an den Tagen 16, 28 und 42 nach der ersten Injektion entnommen.
Zubereitungen für den Abfang-ELISA-Test
Zubereitungen zur Immunisierung (Tabelle 2) wurden durch Abfang-ELISA (enzymgebundener Immunoadsorbenstest) auf HA (A/Sichuan)-Antigenizität getestet. Zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung einer 1:2 000-Verdünnung von Schaf-anti-A/Sichuan-HA-Referenzserum (NIBSC) in Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6) beschichtet. Nach Entfernen der Schaf-Antikörper-Lösung wurden die Vertiefungen mit 200 μl 10% (Gew./Vol.) FCS (fötales Kälberserum) in PBS beschichtet. Nach 2 Stunden bei 37°C wurde die Blockierungslösung entfernt und seriell verdünnte (2-fach) Zubereitungen (vergl. Tabelle 2) wurden in die Vertiefungen gegeben (50 μl Probe/Vertiefung). Die Zubereitungen wurden in PBS und Triton X100 (Tx-100) verdünnt, das zur Lysis von liposomalen Zubereitungen mit dem Ziel, eingeschlossene Materialien festzustellen, geeignet ist; (5) G. Gregoriadis, Brenda McCormack, Mia Obrenovic, Roghieh Saffie, Brahim Zadi, und Yvonne Perrie, Vaccine entrapment in liposomes, Methods, Bd. 19 (1999), S. 156-162). Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit Verdünnungen eines murinen, spezifischen (Influenza A/Sichuan) Antiserums in einer Verdünnung von 1/5 000 (50 μl Probe/Vertiefung) überschichtet. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung einer Lösung von o-Phenylendiamin (Sigma, Fast OPD) als Substrat überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (3M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption (OD) der einzelnen Vertiefungen bei 490 nm wurde bestimmt.
ELISA-Seren
Aus Blutentnahmen erhaltene Seren wurden 20-fach in PBS verdünnt und bis zum ELISA-Test bei -20°C aufbewahrt. Zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung einer 1:1 000-Verdünnung von Schaf-anti A/Sichuan-HA-Referenzserum (NIBSC, UK) in Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6) beschichtet. Nach Entfernen der Schaf-Antikörper-Lösung wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2% (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 2 Stunden bei 37°C wurde die Blockierungslösung entfernt und vollständiges, inaktiviertes Influenza A/Sichuan/2/87-Virusprotein (mit einem Saccharosegradienten gereinigt, Hauptprotein HA) in einer Menge von 2,5 μg/ml (in PBS) wurde in die Vertiefungen gegeben (50 μl Probe/Vertiefung). Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 (Handelsbezeichnung) gewaschen und mit Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (Blutentnahmen von Einzeltieren oder Serumpools von Gruppen) überschichtet, beginnend mit einer Verdünnung von 1/100 (50 μl Probe/Vertiefung). Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung einer Substratlösung von o-Phenylendiamin (Sigma, Fast OPD) überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (3M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption der einzelnen Vertiefungen bei OD 490 nm wurde bestimmt. Die Antikörperreaktion wurde als die reziproke Serumverdünnung angegeben, die zur Erzielung eines OD-Werts von 0,200 (Endpunktsverdünnung) erforderlich war. Die Serokonversionskriterien wurden aus negativen Kontrolltieren (Tabelle 3, Gruppe 1.12-Reaktionen), x2 negative Kontrolle (OD etwa 0,2 Einheiten) gewonnen. Tabelle 2 Dosiszubereitungen
Ergebnisse
Die Daten zeigen, dass die Zusammensetzungen zu einem hochgradig wirksamen gemeinsamen Einschluss von DNA und Protein führen, wobei die Anwesenheit von Protein nur einen untergeordneten negativen Einfluss auf die Wirksamkeit des Einschlusses von DNA ausübt und umgekehrt.
Die Bestimmung von Zubereitungen auf HA-Antigenizität (Influenza A/Sichuan-Stamm) ist in 1 angegeben. Das OD 490 nm-Signal ist proportional zum HA-Antigen. Die Serumantikörper-Ergebnisse für die 12 Gruppen (Tabelle 2) sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Ergebnisse sind ferner in 2 (Tag 16), 3 (Tag 28) und 4 (Tag 42, Tag 15 nach der zweiten Dosis) dargestellt.
Diskussion
Die Bestimmung der Zubereitungen (Tabelle 2) auf HA-Antigenizität durch Abfang-ELISA (1) wurde an Zubereitungen in Abwesenheit und Gegenwart von Triton X100 (TX100), eines Liposomen-Aufbrechmittels durchgeführt (Anmerkung: die negativen Gruppen 1.3, 1.4, 1.7, 1.10 und 1.12 dienen als negative Kontrollen für den Test, da diese Zubereitungen kein HA-Protein enthalten). Die in Abwesenheit von TX100 getesteten Zubereitungen zeigen leicht nachweisbares HA-Antigen in HA enthaltenden Zubereitungen, bei denen das Protein nicht mit Liposomen zubereitet ist (Gruppen 1.8, 1.9, 1.10), wobei ein geringes positives HA-Antigen-Signal, das bei den Zubereitungen 1.1 und 1.2 nachweisbar ist, vermutlich durch Oberflächenexposition von HA-Antigen erzeugt wird, das durch in diesem Test verwendete Antikörper gebunden werden kann. In Gegenwart von TX100 wird ein wesentlich größeres positives Signal für die Liposomengruppen 1.1 und 1.2 erhalten, was einen Nachweis von vorher enthaltenem Antigen (vergl. ohne TX100) in der liposomalen Zubereitung anzeigt. Dagegen kann in den Zubereitungen 1.5 und 1.6, die beide durch Liposomen eingeschlossenes HA-Antigen in Abwesenheit von DNA enthalten (vergl. 1.1 und 1.2) eine geringe HA-Antigenizität festgestellt werden.
Die im Anschluss an die Immunisierung mit den Zubereitungen erzeugte Immunantwort (Tabelle 2) wurde durch Messung der anti-Influenza (Hauptprotein HA)-Antikörper-Antwort bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst und ferner in den 2, 3 und 4 dargestellt. Die Zubereitung 1.1, die aus HA-DNA und Protein, die in der gleichen liposomalen Zubereitung gemeinsam abgegeben wurden, bestand, erzeugt eine stärkere Reaktion als alle übrigen Zubereitungen bei den einzelnen getesteten Blutserumproben (Tag 16, Tag 28 und Tag 42 (15 Tage nach der zweiten Dosis)). Die Reaktion auf diese gemeinsam abgegebene Zubereitung ist in Bezug auf Größe (OD 490 nm, 1/100 Verdünnungsserum und Titer) und Anzahl der Tiere, die bei jeder Blutentnahme sich als seropositiv erwiesen, am größten.
Die Zubereitungen 1.2 und 1.3, die ebenfalls aus gemeinsam abgegebenem Protein und DNA in der gleichen liposomalen Zubereitung bestehen, erzeugen keine so erhebliche Reaktion wie die Zubereitung 1.1. Die Zubereitungen 1.2 und 1.3 bestehen aus Protein und DNA, die nicht miteinander verwandt sind.
Die Zubereitung 1.6 gibt insofern einen weiteren Hinweis auf die Erfindung, als in Bezug auf Protein- und DNA-Produkt, das den Tieren verabreicht wird, die Zubereitung 1.1 gleichwertig mit der von 1.6 ist. Jedoch werden in der Zubereitung 1.1 die Produkte gemeinsam im gleichen liposomalen Vehikel abgegeben, während in der Zubereitung 1.6 die DNA und das Protein in getrennten liposomalen Vehikeln abgegeben werden. Wie vorstehend ausgeführt, ist die Immunantwort auf die Zubereitung 1.1 erheblich größer als auf die Zubereitung 1.6.
Die Antwort auf HA-DNA enthaltende Zubereitungen, ausgenommen 1.1, (Zubereitungen 1.3, 1.4, 1.7 und 1.10) ist im wesentlichen so beschaffen, dass diese keine Immunantwort erzeugen, jedoch kann diese Antwort dosisbezogen sein, da P. Johnson et al., J. Gen. Virol., (2000), 1737-1745, über eine positive Reaktion auf dieses Plasmid im Anschluss an eine Immunisierung (nicht eingeschlossen) berichten.
Der Adjuvanseffekt von Liposomen für ein in liposomalen Zubereitungen abgegebenes Protein (Zubereitung 1.5 gegenüber Zubereitung 1.11), der früher beschrieben wurde (G. Gregoriadis, L. Tan, E. T. Ben-Ahmeida, R. Jennings, Vaccine, Bd. 10(11) (1992), S. 747-753) ist bei der 15 Tage nach der zweiten Dosis entnommenen Blutprobe nur schwach erkennbar. Auch hier können Unterschiede in der Dosierung und im Immunisierungsschema für unterschiedliche experimentelle Ergebnisse verantwortlich sein. Die Immunoadjuvanswirkung von Plasmid-DNA in Liposomen, über die früher berichtet wurde (M. Gursel et al., Vaccine, Bd. 17 (1999), S. 1376-1383) zeigt sich ebenfalls im Unterschied in den Reaktionen auf die Zubereitungen 1.2 und 1.5. Jedoch übersteigt der synergistische Effekt einer gemeinsamen Zubereitung von Hämagglutinin-Protein mit seinem entsprechenden (verwandten) Plasmid bei weitem jeglichen Effekt, der den bekannten Immunoadjuvanseffekten von DNA zuzuschreiben ist, wie sie von Klinman (D. Klinman et al., Vaccine, Bd. 19 (1999), S. 25, 19-26) für CpG-Motive festgestellt wurde.
Während die vorgelegten Ergebnisse im Anschluss an eine subkutane Verabreichung der liposomalen Zubereitung erhalten werden, sollte der vorgeschlagene Wirkungsmechanismus allgemein und spezifisch (plus Antigen-Kinetikeigenschaften) bei alternativen Verabreichungswegen wirksam sein: intravenös, intramuskulär, intradermal, nasal/pulmonal und oral und dergl. Tatsächlich wurden Liposomen auf diesen Wegen in erfolgreicher Weise eingesetzt, um sowohl Proteine als auch DNA zu verabreichen und eine Immunantwort zu erzeugen.
Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass die vorliegende Erfindung hochgradig wirksam bezüglich der Erzeugung einer Immunantwort bei Verabreichung an ein Subjekt ist. Die Antwort beinhaltet eine Antikörper-Reaktion. Die Verbesserung, die erfindungsgemäß erzielt wird, betrifft eine Zusammensetzung von liposomenbildenden Materialien und in Assoziation mit den Liposomen eine Nucleinsäure, die in funktioneller Weise für ein antigenes Protein und ein gleichzeitig abgegebenes Protein kodiert, wobei das gleichzeitig abgegebene Protein Epitope mit dem antigenen Protein gemeinsam hat.
Beispiel 2
Mannose-Ziel-Hepatitis B-Impfstoff
Materialien und Methoden
Lipide
Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und 1,2-Dioleoyl-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen. N-[2-(2-{2-[2-(2,3-Bisoctadec-9-enyloxypropoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethoxy)-ethyl]-3-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyltetrahydropyran-2-ylsulfanyl)-propionamid (nachstehend ist die Formel angegeben (DOGP4αMan), wurde freundlicherweise von Prof. Francis Schuber (Université Louis Pasteur Strasbourg I, Faculté de Pharmacie, 74, Route du Rhin, BP 24 67401 Illkirch Graffenstaden) zur Verfügung gestellt. Sämtliche Lipide wurden in Chloroform, das mit Stickstoff gespült worden war, bei -20°C gelagert.

C₅₆H₁₀₇NO₁₂S
Genaue Masse: 1017,75
Molekulargewicht: 1018,51
C 66,04; H 10,59; N 1,38; O 18,85; S 3,15

DNA
Plasmid-pRc/CMV-HBs(S) (oder einfach pCMV-S) exprimiert das Hepatitis B-Oberflächenantigen (kleines oder S-Protein) unter der Kontrolle des unmittelbar frühen CMV-Promotors (H. L. Davis, M. L. Michel, R. G. Whalen, DNA-based immunisation for Hepatitis B induces continuous secretion of antigen and high levels of circulating antibody, Human Molecular Genetics, Bd. 2 (1993), S. 1847-1851). Beim Plasmid für die Dosierung handelte es sich um ein handelsübliches Produkt der Fa. Aldevron (Fargo, USA). Es enthielt <100 Endotoxin-Einheiten (EU)/mg DNA ohne nachweisbares Restprotein.
Proteine
Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) – rekombinantes Protein, Reinheit: >95% gemäß SDS-PAGE, gereinigt aus Hefe (Hansenula polymorpha, bezogen von der Fa. Aldevron, Fargo, USA, Charge 05/00 HBsAg).
Herstellung einer Liposomen-Zusammensetzung
Kurz zusammengefasst, kleine, unilamellare Vesikel (SUV) wurden aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPE), 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) und N-[2-(2-{2-[2-(2,3-Bisoctadec-9-enyloxypropoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethoxy)-ethyl]-3-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyltetrahydropyran-2-ylsulfanyl)-propionamid) (DOGP4αMan) (Molverhältnis 4:2:1:1 unter Ultraschallbehandlung hergestellt und mit DNA und Protein oder mit DNA und Protein zusammen vermischt (Tabelle 4). Zubereitungen wurden in 2 Fläschchen für die Dosierung (Grundimmunisierung und Auffrischung) zubereitet, wobei jedes Fläschchen radioaktiv markierten Tracer (DNA- und Proteinmaterialien) enthielt, die den einzuschließenden Materialien zugesetzt worden waren (zur Berechnung des prozentualen Einschlusses). Die Produkte wurden über Nacht gemäß den Angaben von G. Gregoriadis, R. Saffie und S. L. Hart, High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, Bd. 3(6) (1996), S. 467-475; und C. Kirby, G. Gregoriadis, Dehydration-rehydration vesicles (DRV): a new method for high yield drug entrapment in liposomes, Biotechnology, Bd. 2 (1994), S. 979-984) gefriergetrocknet. Vor dem Einfrieren (vor dem Gefriertrocknungsvorgang) wurde jedes Fläschchen mit Saccharose in einem Verhältnis von Lipid zu Saccharose (Gew./Gew.) von 1:3 versetzt und bei 20°C wurde eine Lösung hergestellt (Z. Brahim und G. Gregoriadis, A novel method for high-yield entrapment of solutes into small liposomes, J. Liposome Research, Bd. 100(1) (2000), S. 73-80). Nach Rehydratisierung unter kontrollierten Bedingungen wurden die erzeugten dehydratisierten-rehydratisierten Vesikel (DRV-Liposomen) in PBS auf das erforderliche Dosisvolumen verdünnt. Ein Volumen (~25%) von jedem Fläschchen wurde im Anschluss an die Rehydratisierung durch Zentrifugation gewaschen, um nicht-eingebaute Materialien zu entfernen. Der prozentuale Einbau von DNA und/oder Protein in die liposomale Zubereitung wurde auf der Basis der Radioaktivität von ³⁵S (für DNA) und ¹²⁵I (für Protein), die in den suspendierten Pellets festgestellt wurde, ermittelt. Die Liposomen wurden der Mikroelektrophorese und der Photonen-Korrelationsspektroskopie (PCS) bei 25°C in einem Malvern Zetasizer 3000-Gerät unterzogen, um ihr zeta-Potential (ZP) bzw. ihren durchschnittlichen z-Durchmesser zu bestimmen. Tabelle 4
Tierversuche
Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (Harlan, UK) wurden durch subkutane Injektion in einem Dosisvolumen von 0,2 ml immunisiert. Die letztendlichen Dosismengen sind in Tabelle 5 angegeben. Mäuse erhielten 2 Dosen des Antigens an den Tagen 0 und 28, wobei Blutproben aus der Schwanzvene am Tag 28 (nach 1 Dosis) und am Tag 56 (nach 2 Dosen) in Bezug auf die erste Injektion gewonnen wurden. Tabelle 5
Seren-ELISA
Aus Blutproben erhaltene Seren wurden in PBS verdünnt und bis zum Test durch ELISA (enzymgebundener Immunoadsorbenstest) bei -20°C aufbewahrt. Zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung rekombinantem Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Protein in einer Menge von 2,5 μg/ml (Aldevron, Fargo, USA, Charge 05/00 HBsAg) in 0,1M Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht wurden die Vertiefungen 4-mal mit PBS/Tween 20^R (PBST) gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2% (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 2 Stunden bei 37°C wurde die Blockierlösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (individuelle Blutproben von Tieren) überschichtet, beginnend mit einer Verdünnung von 1/100 (50 μl Probe/Vertiefung). Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Pierce) als Substrat überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (2M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption (OD) der einzelnen Vertiefungen bei 450 nm wurde bestimmt.
Ergebnisse
Die physikalischen Eigenschaften (% eingefangenes Produkt (DNA und/oder Protein), Teilchengröße und Oberflächenpotential (zeta)) sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Tabelle 6

ND = nicht bestimmt

Die Antikörper-Reaktionen (Serum-ELISA) sind als Mittelwerte (n = 5 Tiere/Gruppe) des OD-Signals ± SEM bei der getesteten Log₁₀-Serumverdünnung angegeben. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt, wo die gesamten Ig-Ergebnisse 28 Tage nach der ersten HbsAG-Dosis gezeigt sind, sowie in 6, wo die gesamten Ig-Ergebnisse 28 Tage nach der zweiten Dosis gezeigt sind.
Diskussion
Die Verwendung von Mannose-Ligand-Ziel-Liposomen als Abgabeträger für DNA und Protein zur Induktion einer Immunantwort wurde in der Literatur beschrieben (S. Kawakami, A. Sato, M. Nishikawa, F. Yamashita, M. Hashida, Gene Ther., Bd. 7(4) (2000), S. 292-299 (DNA) und N. Latif, B. K, Bachhawat, Immunol. Lett., Bd. 8(2) (1984), S. 75-78 (Protein). Außerdem wurde die allgemeine Eignung der durch den Mannose-Rezeptor vermittelten Aufnahme von Antigen(s) (Proteinen) durch ein Antigen präsentierende Zellen als eine leistungsfähige Komponente bei der Induktion einer Immunantwort erkannt (A. Lanzavecchia. Curr. Opin. Immunol., Bd. 8 (1996), S. 348-354). Die Verwendung von Mannose-Ligand-Ziel-Liposomen zur gemeinsamen Abgabe sowohl von DNA als auch von Protein innerhalb des gleichen Abgabeträgers (und wahrscheinlich zur gleichen Zielzelle) wurde nicht beschrieben.
Die im Anschluss an eine Immunisierung mit Zubereitungen erzeugte Immunantwort (Tabellen 4 und 5) wurde durch Messung der anti-Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Antikörperantwort bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 5 und 6 dargestellt. Die Zubereitung 2.1, die sowohl aus HA-DNA als auch Protein bestand, erzeugt bei gemeinsamer Abgabe in der gleichen liposomalen Zubereitung eine stärkere Reaktion als sämtliche übrigen Zubereitungen bei den einzelnen getesteten Blutserumproben (Tag 28 und Tag 56 (28 Tage nach der zweiten Dosis)). Die Reaktion ist für diese gemeinsam abgegebene Zubereitung größer, angegeben als Betrag sowohl der OD 450 nm-Serumverdünnung als auch des Titers (Endpunktablesung OD 0,3 Einheiten).
Was die Reaktion auf DNA enthaltende Zubereitungen betrifft (ausgenommen 2.1), erzeugt die Zubereitung 2.3 eine Immunantwort, die mit veröffentlichten Ergebnissen (G. Gregoriadis. Pharm. Res., Bd. 15 (5) (1998), S. 661-670) unter Verwendung des gleichen DNA-Produkts (in einer Dosis von 10 μg DNA) im gleichen liposomalen Vehikel (PC:DOPE:DOTAP) ohne die Mannose-Lipid-Komponente (DOGP4αMan) übereinstimmt. Die Immunoadjuvanswirkung des Plasmids DNA in Liposomen wurde früher beschrieben (M. Gursel et al., Vaccine, Bd. 17 (1999), S. 1376-1383), und zwar unter Verwendung der gleichen DNA (nicht-kodierend, ISS-Kapazitätskontrolle) und der Proteinprodukte, wie sie hier beschrieben werden. Die berichtete Adjuvanswirkung der DNA-Komponente wird in dieser Literaturstelle für die Zubereitung mit gemeinsamem Einschluss von Antigen und p-DNA als mäßig mit einem etwa 3-fachen Titer (Ergebnisse nach 2 Dosen) beschrieben. Das in 6 dargestellte ähnliche Ergebnis bei Verwendung einer kodierenden (HBsAg) DNA-Komponente (Zubereitung 2.1) zeigt eine 30-fache Zunahme der Reaktion (vergl. Zubereitung 2.2). Somit übersteigt die synergistische Wirkung der gemeinsamen Zubereitung aus HBsAg-Protein mit ihrem entsprechenden (verwandten) Plasmid jegliche Wirkung, die den Immunoadjuvanswirkungen von DNA zuzuschreiben sind, die etwa nur 3-fach sind, wie die von Gursel oder Klinman (D. Klinman et al., Vaccine, Bd. 19 (1999), S. 25, 19-26) für CpG-Motive allein beobachteten Wirkungen.
Zusammenfassend stellten wir fest, dass die vorliegende Erfindung hochgradig wirksam in Bezug auf eine Erzeugung einer Immunantwort bei Verabreichung an ein Subjekt ist. Die Reaktion beinhaltet eine Antikörperantwort. An der erfindungsgemäß erzielten Verbesserung ist eine Zusammensetzung von liposomenbildenden Materialien unter Einschluss einer mannosylierten Lipidkomponente beteiligt, wobei mit den Liposomen eine Nucleinsäure, die in funktioneller Weise für ein antigenes Protein kodiert, und ein gemeinsam abgegebenes Protein assoziiert ist, wobei das gemeinsam abgegebene Protein Epitope mit dem antigenen Protein gemeinsam hat.
Beispiel 3
Schutz vor einer Belastung durch Influenza-Virus
Materialien und Methoden
Lipide
Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und 1,2-Dioleoyl-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen. Sämtliche Lipide wurden in Lösung Chloroform, das mit Stickstoff gespült worden war, bei -20°C aufbewahrt.
DNA
p1.18/PR8-HA (Ref. DNA-HA) wurde von Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) bereitgestellt. Es enthielt HA von voller Länge aus Influenza-A/Puerto Rico/8/34. Beim Plasmid für die Dosierung handelte es sich um ein Handelsprodukt der Fa. Aldevron (Fargo, USA). Es enthielt <100 Endotoxin-Einheiten (EU)/mg DNA ohne nachweisbares Restprotein.
Proteine
Vollständiges inaktiviertes Virusprotein von Influenza A/Puerto Rico/8/34 (mit einem Saccharosegradienten gereinigt, Hauptprotein HA, Ref. Antigen-HA) wurde von NIBSC, UK, bezogen.
Herstellung einer Liposomenzusammensetzung
Kurz zusammengefasst, kleine unilamellare Vesikel (SUV) wurden aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPE) und 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) (Molverhältnis 4:2:1) durch Ultraschallbehandlung hergestellt und mit DNA (Ref. DNA-HA) und Protein (Ref. Antigen-HA) vermischt (vergl. Tabelle 7). Zubereitungen wurden im Vierfachversuch (2 Fläschchen für die Dosierung (Grundimmunisierung und Auffrischung) und 2 Fläschchen für die prozentualen Einschlussberechnungen auf der Grundlage eines radioaktiv markierten Tracers (HA; DNA und Protein), der den eingeschlossenen Materialien zugesetzt wurde) hergestellt und über Nacht gefriergetrocknet (vergl. G. Gregoriadis, R. Saffie und S. L. Hart, High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting. Bd. 3(6) (1996), S. 467-475, und C. Kirby, G. Gregoriadis, Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes, Biotechnology, Bd. 2 (1994), S. 979-984). Im Anschluss an die Rehydratisierung unter kontrollierten Bedingungen wurden die erzeugten dehydratisierten-rehydratisierten Vesikel (DRV-Liposomen) durch Zentrifugation gewaschen, um nicht-eingebaute Materialien zu entfernen. Die gewaschenen Pellets wurden in PBS auf das erforderliche Dosisvolumen resuspendiert. Der DNA- und/oder Proteineinbau wurde auf der Basis der in den suspendierten Pellets gewonnenen ³⁵S-Radioaktivität (für DNA) und ¹²⁵I-Radioaktivität (für Protein) bestimmt. Die Liposomen wurden der Mikroelektrophorese und Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) bei 25°C in einem Malvern Zetasizer 3000-Gerät zur Bestimmung ihres zeta-Potentials (ZP) bzw. ihres durchschnittlichen z-Durchmessers unterzogen.
Tierversuche
Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (Harlan, UK) wurden durch subkutane Injektion bei Verabreichung eines Dosisvolumens von 0,2 ml immunisiert. Die endgültigen Dosismengen sind in Tabelle 7 zusammengestellt. Mäuse erhielten 2 Dosen an den Tagen 0 und 28, wobei Blutproben aus der Schwanzvene am Tag 21 (nach 1 Dosis) und am Tag 42 (nach 2 Dosen), bezogen auf die erste Injektion, gewonnen wurden. Tabelle 7
Belastung mit lebendem Influenza-Virus
Mäuse wurden am Tag 57, bezogen auf die erste Immunisierung, mit etwa 10 MID₅₀ (50% Maus-Infektionsdosis) in PBS mit 2% (Gew./Vol.) BSA eines an Mäuse angepassten lebenden Influenza-Virus (A/Puerto Rico/8/34) im National Institute of Biological Standards and Controls, UK (NIBSC), belastet. Das Virus wurde nicht-betäubten Mäusen in Volumina von 50 μl bilateral durch intranasale Instillation verabreicht. In täglichen Abständen nach der Belastung wurden nasale Waschungen unter Verwendung von 0,5 ml PBS mit 2% (Gew./Vol.) BSA pro Maus durchgeführt. Das Vorliegen von abgestoßenem Influenza-Virus in den nasalen Waschproben wurde sofort nach der Probennahme bestimmt. Die nasalen Waschproben wurden in serumfreiem, essentiellem Eagle-Minimalmedium auf mit TPCK-Trypsin behandelten, konfluenten Monolayers von MDCK-Zellen in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen. Nach 3-tägiger Inkubation bei 35°C wurde die Anwesenheit von Virus in jeder Vertiefung durch Inkubation von 50 μl Überstand mit einem gleichen Volumen an 0,7 (Gew./Vol.) Truthahn-Erythrozyten bestimmt. In Bezug auf das Virus positive Proben erzeugten eine sichtbare Hämagglutination (klar sichtbarer Agglutinationsflecken).
Serum-ELISA
Aus Blutproben erhaltene Seren wurden in PBS verdünnt und bis zum Test durch ELISA (enzymgebundener Immunoadsorbenstest) bei -20°C aufbewahrt. Zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht mit 50 μl/Vertiefung Influenza HAPR8-Antigen (20 μg/ml) in PBS beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Zellen 4-mal mit PBS/Tween 20^R (PBST) gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2 (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 2 Stunden bei 37°C wurde die Blockierungslösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (individuelle Blutentnahmen von Tieren) überschichtet, wobei mit einer Verdünnung von 1/100 (50 μl Probe/Vertiefung) begonnen wurde. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Pierce) als Substrat überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung einer Stopplösung (2M Schwefelsäure) gestoppt. Die Absorption der einzelnen Vertiefungen bei 450 nm wurde bestimmt.
Ergebnisse
Die liposomalen physikalischen Eigenschaften (% Produkt-(DNA und/oder Protein)-Einschluss, Teilchengröße und Oberflächenpotential (zeta)) sind in Tabelle 8 zusammengestellt. Tabelle 8

ND = nicht bestimmt

Die Antikörper-Reaktionen (Serum-ELISA) sind als Mittelwerte (n = 5 Tiere/Gruppe) des OD-Signals ± SEM bei der getesteten Log₁₀-Serumverdünnung angegeben. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt, die die Reaktion nach 1 Dosis zeigt, sowie in 8, die die Ergebnisse nach 2 Dosen zeigt.
Die Ergebnisse der Belastung mit dem lebenden Virus sind in Tabelle 9 als prozentualer Anteil von Tieren (n = 15 belastete Tiere)/Gruppe angegeben, die ein nachweisbares Virus in den erhaltenen nasalen Waschproben aufwiesen. Tabelle 9
Diskussion
Die im Anschluss an eine Immunisierung mit Zubereitungen (Tabelle 7) erzeugte Immunantwort wurde durch Messung der anti-Influenza-Reaktion (A/PR8-Stamm-spezifisch) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 dargestellt. Die Gruppe (Zubereitung) 3.1, die aus gleichzeitig abgegebenem HA-DNA und Protein in der gleichen liposomalen Zubereitung bestand, erzeugte eine stärkere Reaktion als sämtliche übrigen Gruppen (Zubereitungen) bei den jeweils getesteten Blutserumproben (Tag 21 und Tag 42 (Tag 14 nach der zweiten Dosis)). Die Reaktion für diese Gruppe mit der Zubereitung unter gleichzeitiger Abgabe (3.1.1) ist in Bezug auf die Größe sowohl von OD 450 nm-Serumverdünnung und Titer (Endpunktablesung OD 0,3 Einheiten) größer.
Was die Reaktion auf die Beladungskomponenten betrifft, erzeugt das Gemisch aus HA-DNA und Protein (Gruppe 3.3) übereinstimmend eine schwächere Immunantwort als die gleichen Beladungskomponenten bei gemeinsamer Abgabe (Gruppe 3.1). Tatsächlich erzeugt die Verwendung einer gleichen DNA-Beladung) bei der 10 μg DNA-Dosis) mit einer verringerten Protein-Beladung (0,5 μg Protein-Dosis) im gleichen liposomalen Vehikel (Gruppe 3.2) eine gleichwertige Serum-Ig-Immunantwort wie das Gemisch aus HA-DNA und Protein bei einer 3-fach höheren Beladung mit der Proteinkomponente (Gruppe 3.3). Die Gruppe 3.4 rief keinerlei spezifische anti-Ig-Influenza-Reaktion hervor, jedoch erhielt diese Gruppe keine immunogenen Komponenten (nur PBS), so dass dieses Ergebnis den Erwartungen entsprach.
Die Ergebnisse der Belastung mit dem lebenden Virus liefern einen Hinweis, ob die in Mäusen in Reaktion auf eine Immunisierung mit den Zubereitungen induzierte Immunantwort für einen Schutz der Tiere gegen eine Virusinfektion angemessen ist. Die Gruppe 3.4 dient als negative Kontrolle, da diese im wesentlichen "naiven" Tiere das normale Profil der Virusinfektion im Anschluss an die Belastung widerspiegeln. In dieser Gruppe (3.4) sind sämtliche Tiere am Tag 4 mit dem Virus infiziert, wobei durchschnittlich 68% (über 5 Tage hinweg) der Tiere infiziert sind (SEM 18%). Die Gruppe 3.3, die aus den gemischten Beladungskomponenten HA-DNA und Protein bestand, die nicht gemeinsam in liposomaler Weise abgegeben wurden, induzierte zwar eine anti-Influenza-Reaktion (7), zeigte aber keine signifikante Verringerung (relativ zu Gruppe 3.4) im prozentualen Anteil der Tiere, die mit dem Virus infiziert waren, wobei durchschnittlich 37% (über 5 Tage hinweg) der Tiere infiziert waren (SEM 10%). Die Gruppe (Zubereitung) 3.1, die aus HA-DNA und Protein bei gemeinsamer Abgabe in der gleichen liposomalen Zubereitung bestand, erzeugte eine stärkere Antikörper-Reaktion (7 und 8) als sämtliche übrigen Gruppen (Zubereitungen) und zeigte eine signifikante (relativ zu Gruppe 3.4) (p<0,05) Verringerung des prozentualen Anteils der Tiere, die mit dem Virus infiziert waren, wobei der prozentuale Mittelwert (über 5 Tage hinweg) nur 7% infizierte Tiere betrug (SEM 6%).
Zusammenfassend stellten wir fest, dass die vorliegende Erfindung in Bezug auf die Erzeugung einer Immunantwort hochgradig wirksam ist, da es möglich ist, ein Individuum vor einer Infektion mit einem infektiösen Organismus, das dem Subjekt verabreicht wird, zu schützen. Die Reaktion beinhaltet eine Antikörper-Reaktion. An der erfindungsgemäß erzielten Verbesserung ist eine Zusammensetzung von liposomenbildenden Materialien beteiligt, wobei eine Beladung mit einer Nucleinsäure, die funktionell für ein antigenes Protein kodiert, und einem gemeinsam abgegebenen Protein vorliegt, wobei das gemeinsam abgegebene Protein Epitope mit dem antigenen Protein gemeinsam hat.
Beispiel 4
Multivalenter Influenza-Impfstoff
Materialien und Methoden
Lipide
Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und 1,2-Dioleoyl-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen. Sämtliche Lipide wurden in Lösung in Chloroform, das mit Stickstoff gespült worden war, bei -20°C gelagert.
DNA
Die Plasmide pl17/HA-Sichuan und pl.18/PR8-HA wurden von Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) zur Verfügung gestellt. Sie enthalten die HA-Sequenz von voller Länge aus Influenza A/Sichuan/2/87 bzw. Influenza A/Puerto Rico/8/34. Plasmide für die Dosierung wurden gewerblich von der Fa. Aldevron (Fargo, USA) erzeugt und enthielten <100 Endotoxin-Einheiten (EU)/mg DNA ohne nachweisbares Restprotein.
Proteine
Vollständiges inaktiviertes Virus-Protein Influenza A/Sichuan/2/87 und Influenza A/Puerto Rico/8/34 (mit einem Saccharosegradienten gereinigt, Hauptprotein HA, Ref. Antigen HA) wurden von NIBSC, UK, erhalten.
Herstellung einer Liposomen-Zusammensetzung
Kurz zusammengefasst, kleine unilamellare Vesikel (SUV) wurden aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPE) und 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP) (Molverhältnis 4:2:1) durch Ultraschallbehandlung hergestellt und entweder mit pl17/HA-Sichuan-DNA und Influenza A/Sichuan/2/87-Virus-Protein oder pl.18/PR8-HA-DNA und Influenza A/Puerto Rico/8/34-Virus-Protein vermischt (vergl. Tabelle 10). Die Zubereitungen wurden im Doppelversuch (ein Fläschchen für die Dosierung und ein Fläschchen für die Berechnung des prozentualen Einschlusses, bezogen auf einen radioaktiv markierten Tracer (HA/DNA und Protein), die den eingeschlossenen Materialien zugefügt wurden) hergestellt und über Nacht gefriergetrocknet (G. Gregoriadis, R. Saffie und S. L. Hart, High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, Bd. 3(6) (1996), S. 467-475, und C. Kirby, G. Gregoriadis, Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes, Biotechnology, Bd. 2 (1994), S. 979-984). Nach der Rehydratisierung unter kontrollierten Bedingungen wurden die erzeugten dehydratisierten-rehydratisierten Vesikel (DRV-Liposomen) durch Zentrifugation gewaschen, um nicht-eingebaute DNA zu entfernen. Die gewaschenen Pellets wurden in PBS auf das erforderliche Dosisvolumen resuspendiert. Der DNA- und/oder Protein-Einbau wurde auf der Grundlage der ³⁵S-Radioaktivität (für DNA) und der ¹²⁵I-Radioaktivität (für Protein), die in den suspendierten Pellets festgestellt wurde, bestimmt. Die Liposomen wurden der Mikroelektrophorese und der Photonen-Korrelationsspektroskopie (PCS) bei 25°C in einem Malvern Zetasizer 3000-Gerät unterzogen, um ihr zeta-Potential (ZP) bzw. ihren durchschnittlichen z-Durchmesser zu bestimmen.
Tierversuche
Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (Harlan, UK) wurden durch subkutane Injektion bei einer Verabreichungsdosis von 0,2 ml immunisiert. Die endgültigen Dosismengen sind in Tabelle 10 zusammengestellt. Die Mäuse erhielten eine Dosis am Tag 0, wobei Blutproben aus der Schwanzvene an den Tagen 14 und 28 entnommen wurden. Die liposomale Zusammensetzung für die Gruppe 4.3 bestand in einem Gemisch aus den Zusammensetzungen für die Gruppen 4.1 und 4.2, wobei das Vermischen unmittelbar vor der Verabreichung erfolgte. Tabelle 10
Serum-ELISA
Aus Blutproben erhaltene Seren wurden in PBS verdünnt und bis zum Test durch ELISA (enzymgebundener Immunoadsorbenstest) bei -20°C aufbewahrt. Zwei verschiedene Verfahren wurden je nach dem nachgewiesenen Proteinsubstrat eingesetzt.
Für HA-PR8 wurden zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 50 μl/Vertiefung Influenza HA-PR8-Antigen (20 μg/ml) in PBS beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Vertiefungen 4-mal mit PBS/Tween 20^R (PBST) gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2% (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde die Blockierungslösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (Blutproben von Einzeltieren) überschichtet, wobei mit einer Verdünnung von 1:100 begonnen wurde. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung einer Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Pierce) als Substrat überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (2M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption der einzelnen Vertiefungen bei 450 nm wurde bestimmt.
Für HA-Sichuan wurden zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 50 μl/Vertiefung einer 1/2 000-Verdünnung von anti-HA-Sichuan-Schafserum (NIBSC-Standardreagenz) in 0,1M Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6 beschichtet). Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Vertiefungen 4-mal mit PBS/Tween 20^R (PBST) gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2% (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde die Blockierungslösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung HA-Sichuan-Antigen (5 μg/ml) in PBS überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde die Antigenlösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (Blutproben von einzelnen Tieren) überschichtet, wobei mit einer Verdünnung von 1/100 begonnen wurde. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung einer Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Pierce), als Substrat überschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (2M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption (OD) der einzelnen Vertiefungen wurde bei 450 nm bestimmt.
Ergebnisse
Die liposomalen physikalischen Eigenschaften (% Produkteinschluss (DNA und/oder Protein), Teilchengröße und Oberflächenpotential (zeta)) sind in Tabelle 11 zusammengestellt. Tabelle 11
Die Antikörper-Reaktionen (Serum-ELISA) sind als Mittelwerte (n = 5 Tiere/Gruppe) des OD-Signals ± SEM bei der getesteten Log₁₀- Serumverdünnung angegeben. Die Ergebnisse sind in den 9a-d wiedergegeben.
Diskussion
Die im Anschluss an eine Immunisierung mit den Zubereitungen (Tabelle 10) erzeugte Immunantwort wurde durch Messung von spezifischen Antikörper-Reaktionen gegen anti-Influenza-HA-PR8- und -HA-Sichuan-Stamm bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 9a-d wiedergegeben.
Am Tag 14 wurde eine klare Antikörper-Reaktion auf die Influenza-Antigene bei sämtlichen experimentellen Gruppen mit Ausnahme der Zubereitung 4.4 (PBS) nachgewiesen. Eine Immunisierung mit der Zubereitung 4.3, die aus HA-DNA und Proteinen für Influenza Sichuan und Influenza Puerto Rico 8 bestand, induzierte gleichwertige Antikörpertiter innerhalb des Mittelwerts des Standardfehlers (SEM) gegen jeden der Stämme, entsprechend den Werten, die nach Immunisierung mit der Zubereitung 4.1 (Influenza Sichuan-DNA und -Protein) oder Zubereitung 4.2 (Influenza Puerto Rico 8) induziert wurden.
Am Tag 28 ergab sich eine ausgeprägte Zunahme der Antikörper-Reaktion auf das Influenza-Antigen, verglichen mit Tag 14. Ferner erzeugte eine Immunisierung mit der Zubereitung 4.3, die aus HA-DNA und Proteinen für Influenza Sichuan und Influenza Puerto Rico 8 bestand, wieder gleichwertige Antikörpertiter innerhalb des SEM-Werts gegen den Influenza Sichuan-Stamm, verglichen mit den nach Immunisierung mit der Zubereitung 4.1 (Influenza Sichuan-DNA und Protein) induzierten Titern. Im Gegensatz dazu induzierte eine Immunisierung mit der Zubereitung 4.3, die aus HA-DNA und Proteinen sowohl für Influenza Sichuan als auch für Influenza Puerto Rico 8 bestand, Antikörpertiter gegen den Influenza Puerto Rico 8-Stamm unterhalb der Titer, die nach Immunisierung mit 4.2 (Influenza Puerto Rico 8) induziert wurden, und zwar bei zwei getesteten Verdünnungspunkten.
Zusammenfassend stellen wir fest, dass die vorliegende Erfindung bei multivalenter Abgabe (z. B. gegen mehrere Stämme) hochgradig in Bezug auf eine Induktion von Antikörper-Reaktionen gegen verschiedene, in der Zubereitung vorhandene Stämme wirksam ist. Die Antikörper-Reaktion entwickelt sich rasch (antigenspezifische Antikörpertiter >1 000 nach nur 14 Tagen nach einer einzigen Immunisierung) und kann auf dem gleichen Niveau liegen, wie die Reaktion, die erfindungsgemäß bei Abgabe nur von DNA- und Protein-Komponenten eines einzigen Stammes (z. B. monovalente Zubereitungen) induziert wird. Selbst in Fällen, bei denen eine Immunisierung mit einer multivalenten Zubereitung eine geringere Antikörper-Reaktion auf einen der Stämme, verglichen mit der durch die gleichwertige monovalente Zubereitung induzierten Reaktion, induziert, ist das Niveau dieser Reaktion erneut hoch (Titer >1 000) und steigt mit der Zeit an. Daher besteht die durch die vorliegende Erfindung und durch dieses Experiment beispielhaft belegte Verbesserung in der Fähigkeit zur Induktion einer klaren Antikörper-Reaktion gegen mehrere unterschiedliche antigene Stämme im Anschluss an eine einzige Immunisierung mit einer Zubereitung, die DNA und Protein-Antigene von allen diesen Stämmen enthält.
Beispiel 5
Einschlussgrade von DNA und Protein und Liposomengrößen
Das in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Verfahren zur Zubereitung von Liposomen wurde dazu herangezogen, Hepatitis B-Oberflächenantigen und für dieses Antigen kodierende Plasmid-DNA in verschiedenen Proteinkonzentrationen (in Tabelle 12 angegeben) einzuschließen. Die prozentualen Einschlusswerte sind in Tabelle 12 angegeben und Tabelle 13 zeigt die durchschnittliche Größe und das zeta-Potential der Liposomen. Tabelle 12 Einschluss von HbsAg-Protein und/oder für HbsAg kodierende DNA in Liposomen
Tabelle 12 zeigt, dass der Einschluss von DNA hochgradig wirksam war, während der des HbsAg-Proteins weniger wirksam war. Die Anwesenheit von Plasmid-DNA hatte einen mäßigen negativen Einfluss auf den Wirkungsgrad des Einschlusses von Protein. Wenn jedoch Protein und DNA miteinander eingeschlossen wurden, ergab sich kein negativer Einfluss auf den Einschluss von DNA. Diese Daten zeigen, dass der wirksame gemeinsame Einschluss von DNA und Protein in diesen liposomalen Zubereitungen nicht für das Influenza-A-Hämagglutinin einzigartig oder für beliebige andere Plasmide einzigartig ist. Es ist wahrscheinlich, dass dann, wenn dieser wirksame Einschluss von DNA und Protein eine allgemeine Eigenschaft dieser liposomalen Zusammensetzungen ist, eine Anwendung auf praktisch beliebige Kombinationen von Plasmid-DNA und Protein-Antigen möglich ist. Tabelle 13 Durchschnittliche z-Größe (nm) & zeta-Potential (mV) für in HBsAg-Zubereitungen verwendete Liposomen
Aus diesen Daten über liposomale Zubereitungen und aus den Ergebnissen der Beispiele 2, 3 und 4 ist ersichtlich, dass der Größenbereich sich für eine Aufnahme durch klassische, ein Antigen präsentierende Zellen, wie Makrophagen und dendritische Zellen, eignet. Die Aufnahme von Materialien aus diesen Liposomen durch B-Zellen erfordert wahrscheinlich einen bestimmten Grad der Fragmentierung oder des Abbaus in vivo oder die Entwicklung von Liposomen einer geringeren Größe innerhalb der heterogenen Population der Liposomenzubereitung.
Beispiel 6
Nicht-phospholipidische Zubereitungen
Vehikelmaterialien
Die Materialien 1-Monopalmitoyl-rac-glycerin (C16:0) (Monopal), Cholesterin (CHOL) und 3-beta-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterin (DC-Chol) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co., UK, bezogen. Sämtliche Materialien wurden in Chloroform, das mit Stickstoff gespült worden war, bei -20°C aufbewahrt.
DNA
Das Plasmid pCI-OVA (Ref. DNA-OVA) (freundlicherweise von Dr. T. Nagata, Hamamatsu University School of Medicine, Japan, zur Verfügung gestellt) enthält das Hühnerei-Albuminprotein (Ovalbumin, OVA) (A. Yoshida, T. Nagata, M. Uchijima, T. Higashi, Y. Koide, Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immune response, Vaccine, Bd. 18 (2000), S. 1725-1729). cDNA ist an der EcoRI-Stelle des pCI-Plasmids (Promega, Madison, WI) strangabwärts von der CMV-Enhancer/Promotor-Region kloniert. Das Plasmid pl.18/PR8-HA (Ref. DNA-HA) wurde von Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) zur Verfügung gestellt. Es enthielt HA von voller Länge aus Influenza A/Puerto Rico/8/34. Das Plasmid für die Dosierung wurde gewerblich von der Fa. Aldevron (Fargo, USA) erzeugt und enthielt <100 Endotoxin-Einheiten (EU)/mg DNA ohne nachweisbares Restprotein.
Proteine
Vollständiges, inaktiviertes Virus-Protein von Influenza A/Puerto Rico/8/34 (mit einem Saccharosegradienten gereinigt, Hauptprotein HA, Ref. Antigen-HA) wurde von NIBSC, UK, erhalten.
Herstellung der Zusammensetzungen
Abgabesystem-Vehikel wurden aus Monopal, Chol und DC-Chol (Molverhältnis 4:2:1) durch Filmtrocknung unter Vakuum hergestellt. Der erhaltene Film wurde mit Wasser durch 1-stündiges Schütteln bei 60°C hydratisiert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit DNA (Ref. DNA-HA oder DNA-OVA) und/oder Protein (Ref. Antigen-HA) vermischt (vergl. Tabelle 14). Die Zubereitungen wurden im Vierfachversuch hergestellt, 2 Fläschchen für die Dosierung (Grundimmunisierung und Auffrischung) und 2 Fläschchen für die Berechnung des prozentualen Einschlusses, bezogen auf radioaktiv markierten Tracer (DNA und Protein), die den eingeschlossenen Materialien zugesetzt und über Nacht gefriergetrocknet wurden, wie von G. Gregoriadis, R. Saffie und S. L. Hart, High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, Bd. 3(6) (1996), S, 467-475, und C. Kirby, G. Gregoriadis, Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes, Biotechnology, Bd. 2 (1994), S. 979-984, beschrieben. Im Anschluss an die Rehydratisierung unter kontrollierten Bedingungen wurden die erzeugten dehydratisierten-rehydratisierten Vesikel (DRV) durch Zentrifugation zur Entfernung von nicht eingebauter DNA gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden in PBS auf das erforderliche Dosisvolumen resuspendiert. Der Einbau von DNA und/oder Protein wurde auf der Grundlage der ³⁵S-Radioaktivität (für DNA) und der ¹²⁵I-Radioaktivität (für Protein), die in den suspendierten Pellets festgestellt wurde, bestimmt. Die Vehikel wurden der Mikroelektrophorese und der Laserbeugung bei 25°C in einem Malvern Zetasizer 3000-Gerät und einem Malvern-Mastersizer-Gerät unterzogen, um ihr zeta-Potential (ZP) bzw. ihren durchschnittlichen z-Durchmesser zu bestimmen.
Tierversuche
Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (Harlan, UK) wurden durch subkutane Injektion unter Verabreichung eines Dosisvolumens von 0,2 ml immunisiert. Die endgültigen Dosismengen sind in Tabelle 14 zusammengestellt. Die Mäuse erhielten zwei Dosen an den Tagen 0 und 28, wobei Blutproben aus der Schwanzvene am Tag 21 (nach 1 Dosis) und 42 (nach 2 Dosen), bezogen auf die erste Injektion, entnommen wurden. Tabelle 14
In den Zusammensetzungen der Gruppen 6.1 und 6.2 wurden die DNA und das Protein gemeinsam eingeschlossen. In der Zusammensetzung der Gruppe 6.3 wurden die DNA und das Protein getrennt eingeschlossen und vermischt, d. h. es handelte sich um ein Gemisch aus 6.4 und 6.5. In der Gruppe 6.6 war das Protein nicht eingeschlossen.
Serum-ELISA
Aus Blutproben erhaltene Seren wurden in PBS verdünnt und bis zum Test durch ELISA (enzymgebundener Immunoadsorbenstest) bei -20°C aufbewahrt. Zertifizierte chemische Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht mit 50 μl/Vertiefung Influenza-HA-PR8-Antigen (20 μg/ml) in PBS beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Vertiefungen 4-mal mit PBS/Tween 20^R (PBST) gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 μl 2% (Gew./Vol.) BSA in PBS beschichtet. Nach 2 Stunden bei 37°C wurde die Blockierlösung entfernt und die Vertiefungen wurden 4-mal mit PBST gewaschen und mit Verdünnungen der verschiedenen experimentellen Seren (Blutproben von einzelnen Tieren) überschichtet, wobei mit einer Verdünnung von 1/100 begonnen wurde (50 ml Probe/Vertiefung). Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung Kaninchen-anti-Maus-Ig-HRP-konjugiertem Serum (Dako) überschichtet. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 4-mal mit PBST gewaschen und mit 50 μl/Vertiefung einer Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Pierce) als Substrat beschichtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung Stopplösung (2M Schwefelsäure) gestoppt und die Absorption (OD) jeder Vertiefung bei 450 nm wurde bestimmt.
Ergebnisse
Die physikalischen Eigenschaften der Träger (% Produkt (DNA und/oder Protein)-Einschluss, Teilchengröße und Oberflächenpotential (zeta)) sind in Tabelle 15 zusammengestellt. Tabelle 15

ND = nicht bestimmt

Die Antikörper-Reaktionen der einzelnen Tiere (n = 5/Gruppe) (Serum ELISA) sind als reziproke Serumverdünnungen angegeben, die zum Erreichen eines OD-Werts von 0,270 erforderlich waren (Endpunktverdünnung, ~x2 normaler Mäuseserum-OD-Wert bei 1/100 getesteter Verdünnung). Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
Diskussion
Die im Anschluss an eine Immunisierung mit den Zubereitungen (Tabelle 14) erzeugte Immunantwort wurde durch Messung der anti-Influenza-Reaktion (A/PR8-Stamm-spezifisch) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. Die Gruppe (Zubereitung) 6.1, die aus HA-DNA und Protein bei gemeinsamer Abgabe im gleichen Abgabeträger bestand, erzeugt eine stärkere Reaktion als sämtliche anderen Gruppen, ausgenommen Gruppe 6.2.
Die Ergebnisse zeigen folgendes: die Abgabe von HA-Protein bietet keinen Vorteil gegenüber der Abgabe von Protein allein (Gruppe 6.4 gegenüber Gruppe 6.6); die Abgabe von HA-DNA allein erzeugt keine signifikante Antikörper-Reaktion (Gruppe 6.5), wobei tatsächlich bei 4 von 5 Tieren keine Reaktion induziert wird, die größer als die Nachweisgrenze des Tests ist (1/100 Serumverdünnung); die gemischte Abgabe von HA-DNA und Protein in getrennten Trägern (Gruppe 6.3) bietet keinen Vorteil gegenüber der Verabreichung von Protein allein oder der Verabreichung von Protein mit Träger (Gruppen 6.6 und 6.4); und die gemeinsame Abgabe von HA-Protein mit einer DNA-Komponente (HA oder OVA, Gruppen 6.1 und 6.2) erzeugt eine signifikant höhere anti-HA-Reaktion als ein Gemisch der Abgabematerialien oder die allein abgegebenen Materialien (Gruppen 6.3, 6.4, 6.5 bzw. 6.6).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die vorstehende Beobachtung sowohl auf die "verwandte" als auch auf die "irrelevante" DNA-Komponente anwendbar. Die getestete Reaktion des Immunsystems ist auf Antikörper-Reaktionen beschränkt. Eine zellulär vermittelte Immunantwort (T-Helferzellen, CTL und dergl.) wurde nicht geprüft. Somit kann nicht auf eine Gleichwertigkeit von Immunantworten auf "verwandte" und "irrelevante" DNA-Gruppen (Gruppen 6.1 und 6.2) geschlossen werden. Tatsächlich wurde festgestellt, dass eine Immunisierung mit HA-DNA allein (Plasmid DNA encoding influenza virus haemagglutinin induces Thl cells and protection against respiratory infection despite its limited ability to generate antibody responses, P. A. Johnson, M. A. Conway, J. Daly, C. Nicolson, J. Robertson, K. H. Mills, J. Gen. Virol., Bd. 81 (Juli 2000) (Pt 7), S. 1737-1745) einen Schutz gegen Influenza-Belastung in Abwesenheit von Antikörper-Reaktionen somit auf alleiniger Grundlage einer zellulär vermittelten Immunantwort bietet. Da die Gruppe 6.1 mit "verwandter" gemeinsamer Abgabe HA-DNA als Wirkstoff der Zubereitung aufweist und die "irrelevante" Gruppe 6.2 keine HA-DNA als Wirkstoff der Zubereitung enthält, ist die Annahme nicht unvernünftig, dass möglicherweise die Gruppe 6.1 eine zusätzliche zellulär vermittelte Immunantwort induziert, die nicht gemessen wurde.
Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass die vorliegende Erfindung hochgradig wirksam in Bezug auf die Erzeugung einer Immunantwort ist. Diese Antwort beinhaltet eine Antikörper-Reaktion. An der erfindungsgemäß erzielten Verbesserung ist eine Zusammensetzung aus einem Abgabeträger ohne Phospholipidkomponenten beteiligt, die eine Beladung mit einer Nucleinsäure, die funktionell für ein antigenes Protein kodiert, und ein gleichzeitig abgegebenes Protein abgibt.

Claims

Zusammensetzung zur gleichzeitigen Abgabe einer Nucleinsäure und eines Assistorproteins an eine Zelle, umfassend Vesikel, die aus amphiphilen Komponenten gebildet sind, wobei die Nucleinsäure in funktioneller Weise in einem tierischen Subjekt für ein antigenes Protein oder einen Teil davon kodiert, das mindestens ein Epitop mit dem Assistorprotein gemeinsam hat, wobei die Zusammensetzung die Nucleinsäure und das Assistorprotein in Assoziation jeweils mit den gleichen Vesikeln umfasst, wobei die Zusammensetzung Nucleinsäure und Protein in einem Gewichtsverhältnis von 1000:1 bis 1:1 enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Vesikeln um Liposomen handelt, die aus liposomenbildenden Materialien gebildet sind, und die Nucleinsäure und das Assistorprotein mit den Liposomen assoziiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der die Nucleinsäure im intravesikulären Raum des Liposoms eingeschlossen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, bei der das Assistorprotein an der äußeren Oberfläche der Liposomen zugänglich ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die amphiphilen Komponenten mindestens eine kationisch geladene Komponente in einer solchen Menge umfasst, dass die Vesikel insgesamt eine positive Ladung aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei der die kationische Komponente aus 1,2-Bis-(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)-propan (DOTAP), 1,2-Bis-(hexadecycloxy)-3-trimethylaminopropan (BisHOP), β-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-triethylammoniumchlorid (DOTMA) und 3β-(N,N-Dimethylaminoethan)-carbamylchlolesterin (DC-CHOL) ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Nucleinsäure mehr als ein Molekül umfasst, die jeweils für ein verschiedenes antigenes Protein kodieren, und wobei das Assistorprotein entsprechende Proteine umfasst, die die Epitope mit jedem derartigen antigenen Protein gemeinsam haben.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei der die Nucleinsäuremoleküle mit der gleichen Vesikel assoziiert sind.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das antigene Protein und das Assistorprotein sich von einem Virus, vorzugsweise von Influenzavirus, ableiten.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der es sich bei der Nucleinsäure um DNA und vorzugsweise um Plasmid-DNA handelt.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der es sich um einen Impfstoff handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, geeignet für die subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, nasale, orale, mukosale oder pulmonale Verabreichung.
Verwendung von Vesikeln, die aus amphiphilen Komponenten gebildet sind, wobei die Nucleinsäure in funktioneller Weise für ein antigenes Protein oder einen Teil davon kodiert, das mindestens ein Epitop mit dem Assistorprotein gemeinsam hat, wobei die Zusammensetzung der Nucleinsäure und das Assistorprotein in Assoziation mit jeweils den gleichen Vesikeln in einem Gewichtsverhältnis im Bereich von 1000:1 bis 1:1 umfasst, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort bei einem Tier durch Verabreichung der Zusammensetzung an das Tier.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 12 handelt.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Immunantwort eine Antikörper-Antwort umfasst, die spezifisch für das antigene Protein und/oder Assistorprotein ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Immunantwort die Stimulation von zytotoxischen T-Lymphozyten umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, die Immunität gegen eine Infektion durch ein infektiöses Agens, vorzugsweise ein Virus, verleiht.
Verfahren zur Bildung einer liposomalen Zusammensetzung, umfassend die folgenden Stufen: (a) das Bereitstellen einer wässrigen Suspension von kleinen, unilamellaren Vesikeln (SUVs), die aus liposomenbildenden Materialien gebildet sind; (b) das Kontaktieren der wässrigen Suspension von SUVs mit Nucleinsäure, die funktionell in einem tierischen Subjekt für ein antigenes Protein kodiert, zur Bildung einer SUV-Nucleinsäure-Suspension; (c) das Dehydratisieren der SUV-Nucleinsäure-Suspension zur Bereitstellung eines dehydratisierten Gemisches; und (d) das Rehydratisieren des dehydratisierten Gemisches in einem wässrigen Resuspendiermedium zur Bildung einer Suspension von nucleinsäurehaltigen Liposomen, unter Einschluss einer Stufe des Einführens eines Assistorproteins, das mindestens ein Epitop mit dem antigenen Protein gemeinsam hat, wobei die nucleinsäurehaltigen Liposomen mit dem Assistorprotein assoziiert sind und wobei das Gewichtsverhältnis von Nucleinsäure zu Assistorprotein im Bereich von 1000:1 bis 1:1 liegt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Assistorprotein mit der wässrigen Suspension von SUVs vor, während oder nach der Stufe b und vor der Stufe c kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Assistorprotein im Resuspendiermedium vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei der die liposomenbildenden Materialien mindestens ein Phospholipid und mindestens ein Sterol umfassen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Materialien mindestens eine kationische Verbindung umfassen und die Liposomen insgesamt eine kationische Ladung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22 wobei das Gewichtsverhältnis von Nucleinsäure zu liposomenbildenden Materialien im Bereich von 1:100 bis 1:1000 und vorzugsweise von 1:100 bis 1:300 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei das Gewichtsverhältnis von Nucleinsäure zu Assistorprotein im Bereich von 30:1 bis 5:1 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei die Dehydratisierung durch Gefriertrocknung erfolgt.