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Die
Erfindung betrifft die in vivo Anwendung von Cyclopamin auf basale
Zellkarzinome (englisch: basal cell carcinomas) (BCC's), um einen therapeutischen
Effekt dadurch zu erzielen, dass gleichzeitig eine Differenzierung
der Tumorzellen, Apoptose und die Entfernung der Tumorzellen bewirkt
wird, wobei der Zustand der normalen Gewebezellen einschließlich der
undifferenzierten Zellen der normalen epidermalen Basalschicht und
der Haarfollikel aufrechterhalten wird. Die Induktion von Apoptose
durch Cyclopamin beruht auf einem nicht genotoxischen Mechanismus
und unterscheidet sich damit von der Bestrahlungstherapie und den meisten
anderen der momentan benutzten Krebschemotherapeutika, deren Wirkprinzip
auf einer Schädigung der
DNA beruht. Diese neuen in der Vergangenheit mit Krebschemotherapeutika
nicht erzielten Effekte bewirken, dass die Verwendung von Cyclopamin
bei der Krebsbehandlung, der Behandlung von BCC's und anderen Tumoren, die den hedgehog/smoothened
Signaltransduktionsweg für
die Proliferation und die Verhinderung von Apoptose verwenden, höchst wünschenswert
ist.
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Das
basale Zellkarzinom ist ein üblicher
Epitheltumor, der mit zunehmendem Alter häufiger auftritt. Die momentanen
Behandlungsmethoden für
BCC's beinhalten
die chirurgische Entfernung des Tumors unter Einschluss von normalem
Gewebe und, wenn operative Maßnahmen
nicht möglich
oder wünschenswert
sind, die Zerstörung
der Tumorzellen mittels ionisierender Strahlung oder anderer Mittel.
Obwohl Narben und Entstellungen als mögliche Nebenwirkungen auftreten
können,
können
chirurgische Entfernungen, die keine neoplastischen Zellen hinterlassen,
zur Heilung führen.
Das Prinzip der Strahlungstherapie beruht auf der Verursachung von
einem irreparablen hohen Ausmaß an
DNA-Schäden,
die wiederum den apoptotischen Tod der Tumorzellen auslösen. Dieses
Wirkprinzip der Strahlungstherapie, das heißt die Induktion von Apoptose
als sekundäres
Ereignis von DNA-Schädigung, ähnelt den
Wirkprinzipien vieler chemotherapeutischer Wirkstoffe, die momentan
bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Sowohl die Strahlungstherapie
als auch cytotoxische Krebschemotherapeutika können aber zusätzlich zu
den DNA-Schäden
in den Tumorzellen auch DNA-Schäden
in normalen Zellen von Patienten verursachen. Daher ist die Effektivität und Verwendbarkeit dieser
Behandlungsverfahren bei der Krebstherapie erheblichen Beschränkungen
unterworfen. Ein weiteres Dilemma bei der Verwendung von Strahlung
bzw. genotoxischen Krebschemotherapeutika ist die störende Tatsache,
dass Patienten, selbst dann wenn eine Heilung des Primärtumors
erzielt wird, ein merklich erhöhtes Risiko
bezüglich
der Entwicklung neuer Krebsarten als Folge der DNA-Schäden und
der resultierenden Mutationen, die während der Behandlung des Primärtumors
aufgetreten sind, aufweisen. Die selektive Induktion von Apoptose
in Tumorzellen durch nicht genotoxische Mittel ist daher für das Gebiet
der Krebstherapie höchst wünschenswert.
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BCC's weisen häufig inaktivierende
Mutationen des Gens patched auf, das für ein Transmembranprotein codiert,
das als Rezeptor für
hedgehog-Proteine fungiert. Letztere wurden ursprünglich aufgrund
ihres Effekts auf die Musterbildung von Geweben während der
Entwicklung identifiziert. In Abwesenheit einer Bindung des Liganden
hedgehog inhibiert das patched-Protein die durch ein anderes Transmembranprotein,
smoothened, beeinflusste intrazelluläre Signaltransduktion. Die
Bindung von hedgehog an patched hebt diese inhibitorische Wirkung
auf. Die durch das freigesetzte smoothened induzierte intrazelluläre Signaltransduktion
started dann eine Reihe von zellulären Ereignissen, die letztendlich
in Expressionsänderungen
der hedgehog-Zielgene und des zellulären Verhaltens resultiert.
Die generellen Merkmale dieses hedgehog/smoothened-Signaltransduktionsweges,
der zuerst in Drosophila identifiziert wurde, sind in verschiedenen
Organismen von Drosophila bis Mensch konserviert. Der Signaltransduktionsweg
wird jedoch zunehmend komplexer in höheren Organismen (z.B. gibt
es beim Menschen mehrere Gene, die eine signifikante Ähnlichkeit
zu dem alleinigen patched-Gen von Drosophila aufweisen). Es ist
gezeigt worden, dass inaktivierende Mutationen des patched-Gens
eine konstitutive (ligandenfreie) Signalaktivität des hedgehog/smoothened-Signalwegs
bewirken. Die von Mutationen in patched und/oder in weiteren flussabwärts liegenden
Elementen des Signalwegs bewirkte Überaktivität des hedgehog/smoothened-Signalwegs
wird in allen BCC's
beobachtet. Das nevoide basale Zellkarzinomsyndrom (englisch: nevoid
basal cell carcinoma syndrome) (NBCCS) basiert auf einer haploiden
Insuffizienz von patched. Patienten mit NBCCS entwickeln mit zunehmendem
Alter wegen einer in allen Zellen bereits vorliegenden Mutation
von patched multiple BCC's.
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Cyclopamin,
ein Steroidalkaloid, hat die unten dargestellte chemische Formel:
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Natürlicherweise
wird es in der Lilie Veratrum californicum gefunden und kann aus
dieser und anderen Quellen durch Reinigung gewonnen werden. Eine
Inhibierung des hedgehog/smoothened-Signalwegs durch Cyclopamin
ist in Hühnerembryos
und in Mauskulturzellen nachgewiesen worden.
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Für topische
Anwendungen kann Cyclopamin in Ethanol oder anderen geeigneten Lösungsmitteln
gelöst
und mit einer geeigneten Basiscreme, -salbe oder -gel gemischt werden.
Cyclopamin kann auch in Hydrogelen oder anderen pharmazeutischen
Formen eingeschlossen werden, die eine kontrollierte Freisetzung
bewirken. Es kann auch auf Hautpflaster adsorbiert werden. Die Wirkungen,
die in den 1A bis 1D, 2A bis 2F, 3A bis 3G und 4A bis 4D gezeigt
werden, sind mit einem Cremepräparat
erzielt worden, das durch Mischung einer Cyclopaminlösung in
Alkohol mit einer Basiscreme erhalten wurde, wobei eine Endkonzentration
von 18 mM Cyclopamin in der Creme eingestellt wurde. Die verwendete Basiscreme
ist hauptsächlich
aus schwerem Paraffinöl
(10 Gew.-%), Vaseline (10 Gew.-%), Stearylalkohol (8 Gew.-%), Polyoxylstearat-40(3
Gew.-%) und Wasser (68 Gew.-%) gebildet, es kann aber auch eine
andere in geeigneter Weise formulierte Basiscreme verwendet werden.
Die optimale Cyclopaminkonzentration in einer pharmazeutischen Form
sowie die optimalen Dosierungs- und Anwendungsregime werden offensichtlich
von Faktoren, wie der spezifischen pharmazeutischen Form, der Lokalisation
und den Eigenschaften der den Tumor ent haltenden Haut (z.B. Dicke
der Epidermis) und der Tumorgröße beeinflusst;
die vorgenannten Faktoren können
jedoch unter Verwendung von bekannten publizierten Optimierungsverfahren
bestimmt werden. Das Dosierungs- und Anwendungsregime, das für die in 1A (BCC
auf der nasolabialen Falte, ~4 × 5
mm Oberfläche)
und 1C (BCC auf der Stirn, ~4 × 4 mm Oberfläche) gezeigten
Tumoren sah folgendermaßen aus:
10 ± 2 μ1 Creme wurden
viermal pro Tag, beginnend um ~9.00 Uhr morgens, alle ~3,5 Stunden
direkt auf das BCC mit Hilfe eines Stahlspatels aufgetragen. Über-Nacht-Anwendungen,
die bei diesem Regime angesichts des möglichen Verlusts an Creme durch Übertragen
von Creme vom Patienten an die Schlafbezüge vermieden wurde, können mittels
geeigneter Hautpflaster erfolgen. Die Aufrecht- bzw. Beibehaltung
von undifferenzierten Zellen in der normalen Epidermis und in Haarfollikeln
nach der Behandlung mit Cyclopamin, wie sie in dieser Erfindung
beschrieben wird, stellen Informationen bezüglich der tolerierbaren Dosismengen
für andere
Verabreichungswege zur Verfügung,
wie z.B. die direkte intratumorale Injektion einer wässrigen
Lösung oder
die systemische Verabreichung einer wässrigen Lösung oder von Cyclopamin enthaltenden
Liposomen.
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1A, 1B, 1C und 1D zeigen
eine schnelle klinische Regression des BCC's nach der Behandlung mit Cyclopamin.
Neben dem visuellen Verschwinden von verschiedenen Tumorgebieten
in weniger als 1 Woche von Cyclopaminbehandlung kommt es zu einem
Verlust des typischerweise durchsichtigen Erscheinungsbildes des
BCC's, wie aus einem
Vergleich der 1B mit 1A und
der 1D mit 1C erkennbar
ist.
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Die 2A bis 2F zeigen
das mikroskopische Erscheinungsbild der Tumorgebiete, an denen eine
chirurgische Entfernung unter Einschluss von normalem Gewebe am
5. und 6. Tag der Cyclopaminanwendung vorgenommen wurde. Zu diesem
Zeitpunkt hatte der BCC bereits die meisten Gewebeflächen aus der
Zeit vor der Behandlung verloren, verfügte aber immer noch über wenige
Bereiche, die, obwohl ihre Höhe bereits
merklich zurückgegangen
war, noch nicht komplett verschwunden waren und daher noch verbliebene Tumorzellen
für die
mikroskopische Analyse enthielten.
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Die 2A und 2B zeigen
an Gewebeschnitten die Hautbereiche, die den visuell nicht mehr erkennbaren
bzw. verschwundenen Tumorknötchen
entsprechen. Man erkennt, dass die ver schwundenen Tumore große zystische
Strukturen hinterlassen, die wenig Material und keine detektierbaren
Tumorzellen enthalten.
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Die 2C zeigt
das mikroskopische Erscheinungsbild eines Hautgebiets, das immer
noch erkennbares BCC in vivo enthält. Man erkennt, dass diese
Regionen verbliebene BCC's
enthalten, die große
Zysten im Tumorzentrum und kleinere zystische Strukturen verschiedener
Größen an der
Peripherie der verbleibenden BCC-Zellen aufweisen.
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Die 2D und 2E zeigen
das 1000-fach vergrößerte Erscheinungsbild
der inneren und der begrenzenden peripheren Regionen dieser verbliebenen
BCC's und zeigen
das Vorhandensein einer massiven apoptotischen Aktivität innerhalb
der verbleibenden BCC-Zellen, unabhängig von der jeweiligen Tumorregion. Diese
starken Vergrößerungen
zeigen eine stark erhöhte
Häufigkeit
von BCC-Zellen, die eine apoptotische Morphologie aufweisen, und
die Bildung von zystischen Strukturen als Folge der apoptotischen
Entfernung von Zellen, wie in 2D anhand
der unmittelbar bevorstehenden Vereinigung dreier kleinerer Zysten
zu einer größeren Zyste,
als Folge der Entfernung der apoptotischen Septalzellen, exemplifiziert
wird.
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Die 2F zeigt,
dass mit Placebocreme (das heißt
einem Cremepräparat,
das mit Ausnahme des fehlenden Cyclopamins identisch zu der Cyclopamincreme
ist) behandelte BCC's
im Gegensatz hierzu die typischen neoplastischen BCC-Zellen und
keine detektierbare apoptotische Aktivität zeigen.
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Es
ist bekannt, dass apoptotische Zellen durch Makrophagen und durch
benachbarte Zellen in normalen Geweben entfernt werden. Es ist auch
bekannt, dass die Quantifizierung der apoptotischen Aktivität durch morphologische
Kriterien von Hematoxylen-Eosin-gefärbten Schnitten zu einer Unterschätzung der
apoptotischen Aktivität
führt.
Trotz dieser Umstände
zeigen die quantitativen Daten der Tabelle I eine innerhalb der
verbleibenden BCC-Zellen durch Cyclopamin verursachte, stark erhöhte apoptotische
Aktivität.
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Der
Verlust der Durchsichtigkeit der mit Cyclopamin behandelten BCC's legt die faszinierende
Möglichkeit
einer Differenzierung der BCC's
unter dem Einfluss von Cyclopamin nahe. Diese Möglichkeit, die durch immunohistochemische
Analysen der BCC's überprüft werden
kann, ist im Fall der vorliegenden Erfindung tatsächlich gegeben.
In der normalen Epidermis geht die Differenzierung der Zellen der
Basalschicht zu den Zellen der höheren
Schicht mit einem Verlust der Markierbarkeit mit dem monoklonalen
Antikörper
Ber-Ep4 einher. Ber-Ep4 erkennt ebenfalls BCC-Zellen und ist ein
bekannter Marker für
diese Neoplasmen. Die 3A, 3B und
die quantitativen Daten der Tabelle I zeigen, dass keine der verbleibenden
peripheren oder inneren Zellen der mit Cyclopamin behandelten BCC's durch Ber-Ep4 markiert
werden, wohingegen Ber-Ep4 alle begrenzenden peripheren Zellen und über 90%
der inneren Zellen der mit Placebo behandelten BCC's markiert. Die durch
den Einfluss von Cyclopamin bewirkte Differenzierung der BCC's, die für andere
Wirkstoffe bisher nicht bekannt ist, ist höchst ungewöhnlich, weil die gemäß immunohistochemischer
Kriterien erzielte Differenzierung in vivo und in allen Zellen von
unabhängiger
Bedeutung bei der Behandlung von Krebs ist.
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Ein
anderer Differenzierungsmarker, Ulex Europaeus lectin type 1, erkennt
normalerweise nicht BCC's oder
die Zellen der Basalschicht der normalen Epidermis, sondern markiert
die differenzierten Zellen der oberen Schicht. Die 3C zeigt
die heterogene Markierung der verbleibenden Zellen der mit Cyclopamin
behandelten BCC's
mit diesem Lektin und zeigt die Differenzierung einiger der BCC-Zellen über den
Differenzierungsschritt, wie er durch Ber-Ep4 nachgewiesen wird, hinaus, bis hin
zu dem Differenzierungsgrad, der durch Ulex Europaeus lectin type
1 nachgewiesen wird.
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p53
ist der Hauptregulator der zellulären Antwort auf DNA-Schäden. Es
ist bekannt, dass die Menge dieses Proteins nach Behandlung von
Zellen mit genotoxischen Agenzien im Zellkern ansteigt. Wenn die DNA-Schäden über einen
gewissen Grenzwert ansteigen, bewirkt p53 den apoptotischen Tod
der Zellen. Die Strahlungstherapie bei Krebs und die momentan üblichen
genotoxischen Krebschemotherapeutika wirken hauptsächlich aufgrund
dieses Mechanismus, das heißt
der Induktion von Apoptose als sekundäres Ereignis nach der Beschädigung von
DNA. Der monoklonale Antikörper
DO-7 kann sowohl an normale als auch an „missense" (das heißt nicht funktionale) mutierte
Formen von p53 binden. Man weiß,
dass dieser Antikörper auch
in der Lage ist, einen Anstieg von p53 als Folge der Behandlung
mit DNA schädigenden
Agenzien nachzuweisen.
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Die 3D, 3E und
quantitativen Daten der Tabelle 1 zeigen, dass sowohl die DO-7 Markierungsintensität als auch
die Häufigkeit
an markierten Zellen in mit Cyclopamin behan delten BCC's im Vergleich zu
mit Placebo behandelten BCC's
merkbar reduziert ist. Dies bedeutet, dass Cyclopamin keinen Anstieg,
sondern vielmehr einen Abfall der p53 Menge in Zellkernen von mit
Cyclopamin behandelten BCC-Zellen bewirkt. Da bekannt ist, dass
die Expression von p53 in epidermalen Zellen als Folge der Differenzierung
sinkt, ist die verringerte DO-7 Markierung von mit Cyclopamin behandelten
BCC's wahrscheinlich
die Folge der Cyclopamin-induzierten Differenzierung von BCC-Zellen.
In jedem Fall bedeutet die massive apoptotische Aktivität in mit
Cyclopamin behandelten Zellen, die trotz der merklich reduzierten
p53 Expression beobachtet wird, dass die Cyclopamin-induzierte Apoptose
in diesen Tumorzellen die Folge eines nicht genotoxischen Mechanismus ist.
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Es
ist bekannt, dass die Arretierung der Proliferation von BCC's mit ihrer Retraktion
aus dem Stroma einhergeht. Obwohl die Retraktion aus dem Stroma
auch artifiziell durch unsaubere Fixierung und Verarbeitung der
Gewebe verursacht sein kann, kann durch Einhalten publizierter technischer
Details sichergestellt werden, dass solche Artefakte vermieden werden.
Wie in den 3F und 3G gezeigt
wird, werden mit Cyclopamin aber nicht mit Placebo behandelte BCC's konsistent aus
dem Stroma retrahiert. Die Behandlung von BCC's mit Cyclopamin scheint daher ebenfalls
mit einer Arretierung der Proliferation einherzugehen.
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4A bis 4D zeigen
die Ber-Ep4 Markierung des normalen Hautgewebes, das auf und um
die mit Cyclopamin behandelten BCC's gefunden wird. Aus den 4A, 4B und 4C erkennt
man, dass verschiedene mit Cyclopamin behandelte epidermale Gebiete
ein normales Markierungsmuster mit Ber-Ep4 zeigen, das heißt, dass
eine Markierung der Zellen der basalen Schicht beobachtet wird.
In ähnlicher Weise
zeigt 4D eine normale Ber-Ep4 Markierung
eines mit Cyclopamin behandelten Haarfollikels. Dies bedeutet, dass
die undifferenzierten Zellen der normalen Epidermis und von Haarfollikeln
ihren Zustand aufrechterhalten, obwohl sie mit dem gleichen Behandlungsregime
und Cyclopamindosismengen wie die BCC's behandelt wurden.
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Die
Verursachung einer hoch effizienten Differenzierung und Apoptose
von Tumorzellen in vivo durch Cyclopamin in Dosismengen, die gleichzeitig
den Zustand von undifferenzierten Gewebezellen aufrechterhalten,
stellen bisher unbekannte Leistungen dar, die zusammen mit dem nicht
genotoxischen Wirkmechanismus von Cyclopamin die Verwendung von
Cyclopamin nicht nur bei der Behandlung von BCC's nahe legen, sondern auch zur Behandlung von
solchen internen Tumoren, die den hedgehog/smoothened Signalweg
zur Proliferation und zur Verhinderung von Apoptose und/oder Differenzierung
benutzen.
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BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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1A, 1B, 1C, 1D:
Schnelle Regression von mit Cyclopamin behandelten BCC's, wie sie durch
verschwundene Tumorregionen (durch Pfeile angezeigt) die merkbar
reduzierte Höhe
der Hautoberfläche
und einen Verlust an Durchsichtigkeit in weniger als einer Woche
angezeigt werden. 1A: BCC, auf der linken nasolabialen
Falte lokalisiert, vor der Behandlung. 1B: gleicher
BCC, am fünften
Tag einer topischen Cyclopaminbehandlung. 1C: BCC,
auf der Stirn lokalisiert, vor der Behandlung. 1D:
Gleicher BCC am sechsten Tag einer topischen Cyclopaminbehandlung.
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2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F:
Das mikroskopische Erscheinungsbild von mit Cyclopamin und mit Placebo
behandelten BCC's,
das einen massiven Cyclopamin-induzierten apoptotischen Tod, die
Entfernung der Tumorzellen und das Verschwinden der Tumorknötchen zeigt,
wodurch zystische Leerräume
ohne Tumorzellen zurückgelassen
werden. Hautbereiche, die den Positionen der BCC's vor der Behandlung entsprechen, wurden
am fünften
und sechsten Tag der Cyclopaminbehandlung chirurgisch zusammen mit
normalem Gewebe entfernt und einer üblichen Fixierung, Sektionierung
und Hematoxylen-Eosinfärbung
für die
mikroskopische Analyse unterworfen. 2A: Große Zyste
in der Dermis, die der Position eines verschwundenen Tumorknötchens entspricht
und keine verbleibenden Tumorzellen aufweist. 2B: Ähnliche
Zysten in einer anderen Hautgegend, die BCC's vor, aber nicht nach der Behandlung
mit Cyclopamin enthielt. 2C: Ansicht
bei niedriger Leistung einer Fläche
des BCC's, der in 1D gezeigt
ist, wobei verbliebene Zellen und die Bildung einer großen Zyste
durch die Verbindung mehrerer kleiner Zysten zwischen diesen Zellen
erkennbar ist. 2D: Eine Hochleistungsansicht
aus einer inneren Region des gleichen verbliebenen BCC's, der in 2C gezeigt
ist, wobei die Ansicht eine stark erhöhte Häufigkeit von apoptotischen Zellen
und die Bildung sowie die Vergrößerung von
Zysten durch die apoptotische Entfernung der BCC-Zellen zeigt. 2E: Hochleistungsansicht
einer peripheren Region des gleichen verbliebenen BCC's, der in 2C gezeigt
ist, wobei die Abbildung auch eine stark erhöhte Häufigkeit der apoptotischen
Zellen und die Bildung von Zysten durch die apoptotische Entfernung
von BCC-Zellen zeigt. 2F: Hochleistungsansicht der
inneren Fläche
eines mit Placebo behandelten BCC's, der typische neoplastische Zellen
dieses Tumors und die Abwesenheit von Apoptose zeigt. Die ursprünglichen
Vergrößerungen
sind 100-fach für 2A, 2B, 2C und
1000-fach für 2D, 2E, 2F.
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3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G:
Immunohistochemische Analysen von Cyclopamin- und Placebo-behandelten
BCC's, die die Differenzierung
aller verbliebenen BCC-Zellen unter dem Einfluss von Cyclopamin
und die verringerte p53-Expression in BCC's nach der Behandlung mit Cyclopamin
zeigen. 3A und 3B: Abwesenheit
einer Färbung
mit dem monoklonalen Antikörper
Ber-Ep4 in allen verbliebenen Zellen des Cyclopamin-behandelten
BCC's (3A)
im Gegensatz zu der starken Färbung
in dem Placebo-behandelten BCC (3B), was
zeigt, dass alle verbliebenen Zellen in den Cyclopamin-behandelten
BCC's bis in das
Stadium, das durch Ber-Ep4 nachgewiesen werden kann, differenziert
sind bzw. darüber
hinaus. Ber-Ep4 ist ein bekannter Differenzierungsmarker, der BCC-Zellen
sowie undifferenzierte Zellen der normalen epidermalen Basalschicht
sowie von Haarfollikeln, aber nicht die differenzierten Zellen der oberen
Schicht der normalen Epidermis, anfärbt. 3C: Heterogene
Markierung der verbliebenen Zellen von Cyclopamin-behandelten BCC's mit Ulex Europaeus
lectin type 1, was eine Differenzierung einiger der BCC-Zellen,
zu dem Schritt anzeigt, der durch dieses Lektin nachgewiesen werden
kann. Das Lektin markiert normalerweise nicht BCC's oder die Zellen
der Basalschicht der normalen Epidermis; er markiert aber die differenzierenden
Zellen der oberen Schicht. 3D und 3E:
Verminderte p53-Detektion, die durch den monoklonalen Antikörper DO-7
in Cyclopamin-behandelten BCC's
(3D) im Vergleich zu Placebo-behandelten BCC's (3E)
nachgewiesen wird. Es ist bekannt, dass die Expression von p53 als
Folge der Differenzierung der epidermalen Basalzellen und der Differenzierung
von kultivierten Keratinozyten abfällt. Es ist ebenfalls allgemein
bekannt, dass die Menge an p53, die durch DO-7 detektierbar ist,
in Zellen ansteigt, wenn diese mit DNA-schädigenden Agenzien behandelt
werden. 3F und 3G: Die
konsistente Retraktion von BCC's
aus dem Stroma. Es ist bekannt, dass diese Eigenschaft mit der Arretierung
der Tumorzellproliferation einhergeht. Die Retraktion wird in Cyclopamin-behandelten
(3F, Pfeile zeigen den Retraktionsraum), aber nicht
in Placebo-behandelten (3G) Tumoren beobachtet (der
Unterschied von Cyclopamin- und Placebo-behandelten BCC's im Hinblick auf
die Retraktion aus dem Stroma wird auch in 3D, 2C versus 3B, 3E beobachtet).
Die ursprünglichen
Vergrößerungen
sind 400-fach für 3A, 3B, 3D, 3E und
1000-fach für 3C und
100-fach für 3F, 3G.
Alle immunohistochemischen Markierungen wurden mit Peroxidase-konjugiertem
Streptavidin, das an biotinylierte sekundäre Antikörper bindet, durchgeführt; die
Markierung wird durch eine braune Färbung angezeigt. Die Schnitte
in 3F und 3G sind
mit Periodic Acid-Schiff und Alcian blue gefärbt.
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4A,
4B,
4C,
4D:
Normales Markierungsmuster von Cyclopamin-behandelter normaler Haut
mit Ber-Ep4, was zeigt, dass die undifferenzierten Zellen der normalen
Epidermis und von Haarfollikeln ihren Zustand aufrechterhalten,
obwohl sie dem gleichen Behandlungsregime und den gleichen Cyclopamindosen
wie die BCC's ausgesetzt
wurden.
4A: Ber-Ep4 Markierung von Cyclopamin-behandelten Zellen
der epidermalen Basalschicht.
4B und
4C:
Hochleistungsansichten von verschiedenen Gebieten der Cyclopamin-behandelten
Epidermis, die die Ber-Ep4 Markierung der Basalzellen zeigen.
4D: Hochleistungsansicht
eines Cyclopamin-behandelten Haarfollikels, das dennoch eine normale
Markierung mit Ber-Ep4 zeigt. Die ursprünglichen Vergrößerungen
betrugen 400-fach für
4A und
1000-fach für
4B,
4C,
4D.
Die immunohistochemischen Nachweisverfahren waren die gleichen wie
in
3A und
3B; die
Markierung wird durch eine braune Färbung angezeigt. Tabelle
1:
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Es
sind die Durchschnittswerte ± Standardabweichungen
von mindestens 16 zufällig
ausgewählten Hochleistungsfeldern
(1000-fach) der Gewebeschnitte von jeder Tumorgruppe dar gestellt.
P < 0,001 für die Placebo-
versus Cyclopamin-behandelten Tumoren für alle Parameter, das heißt sowohl
für die
begrenzenden peripheren und die nicht begrenzenden (inneren) Tumorgebiete.