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DE60035211T2 - Mikrokugeln mit kontinuierlicher Freisetzung - Google Patents

Mikrokugeln mit kontinuierlicher Freisetzung Download PDF

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DE60035211T2
DE60035211T2 DE60035211T DE60035211T DE60035211T2 DE 60035211 T2 DE60035211 T2 DE 60035211T2 DE 60035211 T DE60035211 T DE 60035211T DE 60035211 T DE60035211 T DE 60035211T DE 60035211 T2 DE60035211 T2 DE 60035211T2
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DE
Germany
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microspheres
microsphere
polymer
derivatives
water
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DE60035211T
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Terrence L. Winchester SCOTT
Larry R. Newton BROWN
Frank J. Stoughton RISKE
Charles D. Westwood BLIZZARD
Julia Newton RASHBA-STEP
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Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
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Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Bildung und Verwendung von Retard-Mikrokugeln bzw. Mikrokugeln mit kontinuierlicher Freisetzung. Die Mikrokugeln sind porös und schließen eine Vielzahl von Kanalöffnungen ein, welche weniger als 1000 Angström im Durchmesser betragen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Mikroteilchen, Mikrokugeln und Mikrokapseln, welche hier gemeinsam als "Mikroteilchen" bezeichnet werden, stellen feste oder semifeste Teilchen dar, welche einen Durchmesser von weniger als einem Millimeter, weiter bevorzugt von weniger als 100 Mikrometer aufweisen, welche aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich synthetischen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden gebildet werden können. Mikroteilchen wurden in vielen verschiedenen Anwendungen, hauptsächlich Trennungen, Diagnostik und Arzneimittelabgabe, verwendet.
  • Die bekanntesten Beispiele für Mikroteilchen, welche für Trennungstechniken verwendet werden, stellen jene dar, welche aus Polymeren mit entweder synthetischem oder Proteinursprung gebildet werden, wie Polyacrylamid, Hydroxyapatit oder Agarose. Diese polymeren Mikropartikel werden allgemein verwendet, um Moleküle, wie Proteine, basierend auf dem Molekulargewicht und/oder der ionischen Ladung oder durch eine Interaktion mit Molekülen, welche chemisch an die Mikroteilchen gebunden sind, zu trennen.
  • Im diagnostischen Bereich werden Mikroteilchen häufig verwendet, um ein Enzym, ein Substrat für ein Enzym oder einen markierten Antikörper zu immobilisieren, welche anschließend entweder direkt oder indirekt mit einem Molekül, welches nachgewiesen werden soll, interagieren.
  • Im Bereich der kontrollierten Arzneimittelabgabe werden Moleküle für eine nachfolgende Freisetzung in Mikropartikel eingekapselt oder in eine monolithische Matrix eingeschlossen. Eine Anzahl verschiedener Techniken wird routinemäßig verwendet, um diese Mikroteilchen aus synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden herzustellen, einschließlich Phasentrennung, Lösungsmittelverdampfung, Emulgierung und Sprühtrocknung. Im Allgemeinen bilden die Polymere die Trägerstruktur dieser Mikrokugeln, und das Arzneimittel von Interesse wird in die Polymerstruktur eingeschlossen. Beispielhafte Polymere, welche für die Bildung von Mikrokugeln verwendet werden, schließen Homepolymere und Copolymere der Milchsäure und Glykolsäure (PLGA), wie in dem U.S. Pat. Nr. 5,213,812 an Ruiz, U.S. Pat. Nr. 5,417,986 an Reid et al., U.S. Pat. Nr. 4,530,840 an Tice et al., U.S. Pat. Nr. 4,897,268 an Tice et al., U.S. Pat Nr. 5,075,109 an Tice et al., U.S. Pat. Nr. 5,102,872 an Singh et al., U.S. Pat. Nr. 5,384,133 an Boyes et al., U.S. Pat. Nr. 5,360,610 an Tice et al. und der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 248,531 an Southern Research Institute beschrieben; Blockcopolymere, wie Tetronic 908 und Poloxamer 407, wie in dem U.S. Pat. Nr. 4,904,479 an Illum beschrieben; Biopolymere, wie hydrolysiertes Chitosan, wie in der WO 99/48479 beschrieben und Polyphosphazene, wie in dem U.S. Pat. Nr. 5,149,543 an Cohen et al. beschrieben, ein. Mikrokugeln, welche unter Verwendung von Polymeren, wie diesen, hergestellt werden, weisen eine schlechte Beladungseffizienz auf und sind häufig nur in der Lage, einen kleinen prozentualen Anteil des Arzneimittels von Interesse in die Polymerstruktur einzuschließen. Daher müssen häufig erhebliche Mengen von Mikrokugeln verabreicht werden, um eine therapeutische Wirkung zu erreichen.
  • Kugelförmige Perlen oder Teilchen waren seit vielen Jahren als Werkzeug für Biochemiker kommerziell verfügbar. Zum Beispiel erzeugen an Perlen konjugierte Antikörper relativ große Teilchen, welche für bestimmte Liganden spezifisch sind. Die großen Antikörper beschichteten Teilchen werden routinemäßig verwendet, um Rezeptoren auf der Oberfläche einer Zelle für eine zelluläre Aktivierung zu vernetzen, werden an eine feste Phase für eine Immunaffinitätsaufreinigung gebunden und können verwendet werden, um ein therapeutisches Mittel, welches langsam über die Zeit freigesetzt wird, unter Verwendung von gewebs- oder tumorspezifischen Antikörpern, welche an Teilchen konjugiert sind, um das Mittel zu der gewünschten Stelle zu leiten, abzugeben.
  • Das gängigste Verfahren zum kovalenten Binden eines Antikörpers an eine Festphasenmatrix liegt darin, eine Perle mit einem chemischen Konjugationsmittel zu derivatisieren und anschließend den Antikörper an die aktivierte Perle zu binden. Die Verwendung einer synthetischen polymeren Perle eher als eines Proteinmoleküls erlaubt die Verwendung von wesentlich härteren Derivatisierungsbedingungen, als viele Proteine aushalten können, ist relativ kostengünstig und ergibt häufig eine Verbindung, welche sich in einem weiten Bereich von Denaturierungsbedingungen als stabil erweist. Eine Anzahl von derivatisierten Perlen ist kommerziell verfügbar, alle mit verschiedenen Bestandteilen und Größen. Perlen, welche aus synthetischen Polymeren gebildet werden, wie Polyacrylamid, Polyacrylat, Polystyrol oder Latex, sind kommerziell von vielen Quellen verfügbar, wie Bio-Rad Laboratories (Richmond, Kalif.) und LKB Produkter (Stockholm, Schweden). Perlen, welche aus natürlichen Makromolekülen und Teilchen gebildet werden, wie Agarose, vernetzte Agarose, Globulin, Desoxyribosenukleinsäure und Liposome sind kommerziell von Quellen verfügbar, wie Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, N.J.) und IBF (Frankreich). Perlen, welche aus Copolymeren von Polyacrylamid und Agarose gebildet werden, sind kommerziell verfügbar von Quellen, wie IBF und Pharmacia. Magnetische Perlen sind kommerziell verfügbar von Quellen, wie Dynal Inc. (Great Neck, N.Y.).
  • Ein Nachteil der zur Zeit verfügbaren Mikroteilchen oder Perlen liegt darin, dass sie schwierig und teuer herzustellen sind. Mikroteilchen, welche mit diesen bekannten Verfahren hergestellt werden, weisen eine weite Teilchengrößenvertei lung auf, häufig fehlt ihnen die Einheitlichkeit und sie versagen, eine Langzeitfreisetzungskinetik aufzuweisen, wenn die Konzentration des aktiven Inhaltsstoffes hoch ist. Weiterhin werden die Polymere, welche in diesen bekannten Verfahren verwendet werden, in organischen Lösungsmitteln gelöst, um Mikrokugeln zu bilden. Die Mikrokugeln müssen daher in besonderen Einrichtungen hergestellt werden, welche entworfen wurden, um organische Lösungsmittel zu bearbeiten. Diese organischen Lösungsmittel können Proteine oder Peptide denaturieren, welche in den Mikroteilchen enthalten sind. Restliche organische Lösungsmittel könnten toxisch sein, wenn sie an Menschen oder Tiere verabreicht werden.
  • Zusätzlich liegen die verfügbaren Mikroteilchen selten in einer Größe vor, welche ausreichend klein ist, um durch die Öffnung mit der Größe einer Nadel zu passen, welche allgemein verwendet wird, um Therapeutika zu verabreichen, oder um für eine Verabreichung durch Inhalation geeignet zu sein. Zum Beispiel sind Mikroteilchen, welche unter Verwendung von Polylactatglycolsäure (PLGA für engl.: polylactic glycolic acid) hergestellt wurden, groß und weisen eine Tendenz zum Aggregieren auf. Ein Größenselektionsschritt, welcher zu einem Produktverlust führt, ist nötig, um Teilchen zu entfernen, die zu groß für eine Injektion sind. PLGA-Teilchen, welche eine geeignete Größe für eine Injektion aufweisen, müssen durch eine Nadel mit großem Gauge verabreicht werden, um sich der großen Teilchengröße anzupassen, was häufig Beschwerden beim Patienten verursacht.
  • Im Allgemeinen werden alle zur Zeit verfügbaren Mikrokugeln aktiviert, um ihre Inhaltsstoffe in wässrigen Medien freizusetzen, und müssen daher lyophilisiert werden, um eine vorzeitige Freisetzung zu verhindern. Zusätzlich weisen Teilchen, wie jene, welche unter Verwendung des PLGA-Systems hergestellt wurden, eine Freisetzungskinetik auf, welche sowohl auf Erosion als auch auf Diffusion basiert. In diesem Systemtyp wird ein anfänglicher Schub (burst) oder eine schnelle Freisetzung des Arzneimittels beobachtet. Diese Schubwirkung kann zu ungewollten Nebenwirkungen bei Patienten führen, denen die Teilchen verabreicht wurden.
  • Mikroteilchen, welche unter Verwendung von Lipiden hergestellt werden, um zielgerichtete Arzneimittel einzukapseln, sind zur Zeit verfügbar. Zum Beispiel können Lipide verwendet werden, welche in zweischichtigen Membranen angeordnet sind, welche mehrere wässrige Bereiche umgeben, um Teilchen zu bilden, um wasserlösliche Arzneimittel für eine nachfolgende Abgabe einzukapseln, wie in dem U.S. Pat. Nr. 5,422,120 an Sinil Kim beschrieben. Diese Teilchen sind im Allgemeinen größer als 10 μm in der Größe und für eine intraartikulare, intrathekale, subkutane und epidurale Verabreichung entworfen. Alternativ wurden Liposomen für eine intravenöse Abgabe von kleinen Molekülen verwendet. Liposomen stellen kugelförmige Teilchen dar, welche aus einer einzelnen oder mehreren Phospholipid- und Cholesterin-Doppelschicht(en) aufgebaut sind. Liposomen sind 30 μm oder größer in Größe und können eine Vielzahl von wasserlöslichen oder fettlöslichen Arzneimitteln tragen. Die Liposomentechnologie wurde durch Probleme behindert, einschließlich Reinheit der Lipidbestandteile, mögliche Toxizität, Vesikelheterogenität und Stabilität, übermäßige Aufnahme und Herstellungs- oder Haltbarkeitsschwierigkeiten.
  • Es gibt daher einen andauernden Bedarf für die Entwicklung von neuen Verfahren zur Herstellung von Mikroteilchen, insbesondere von jenen, welche an eine Verwendung im Trennungs-, diagnostischen und Arzneimittelabgabe-Bereich angepasst werden können. Vorzugsweise würden solche verbesserten Mikroteilchen die retardierte Freisetzung von aktiven Mitteln in einer vorhersagbaren, beständigen Weise erlauben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung löst diese und andere Aufgaben durch Bereitstellen von Verfahren und Zusammensetzungen für die retardierte Freisetzung von therapeutischen und/oder diagnostischen Mitteln in vivo und in vitro. Der Begriff "therapeutisches Mittel", so wie hier nachfolgend verwendet, beabsichtigt, klinische Mittel einzuschließen, welche in mikrokapsulärer Form verabreicht werden können, entweder hauptsächlich für eine Behandlung oder für eine Diagnose verwendet.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel bereitgestellt, welche eine glatte Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt. Die Kanalöffnungen weisen einen Durchmesser auf, welcher weniger als 1000 Angström beträgt, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung bestimmt wurde. Die erfindungsgemäßen Mikrokugeln schließen ein Makromolekül, vorzugsweise ein Protein oder eine Nukleinsäure und mindestens ein wasserlösliches Polymer ein. Im Allgemeinen werden die Mikrokugeln durch Inkontaktbringen der Makromoleküle mit mindestens einem wasserlöslichen Polymer unter wässrigen Bedingungen gebildet, um die Mikrokugeln zu bilden, und die Mikrokugeln werden anschließend entweder durch chemisches Vernetzen oder durch Aussetzen der Mikrokugeln gegenüber einer Energiequelle, vorzugsweise Hitze, oder beidem, bei einer Temperatur stabilisiert, welche zu Mikrokugeln führt, die resistent gegen physikalische und chemische Behandlungen, wie Ultraschallbehandlung und ätzende Lösungen, unter diesen Bedingungen sind. Obwohl nicht gewünscht wird, an irgendeine besondere Theorie oder einen Mechanismus gebunden zu werden, wird angenommen, dass sich die Mikrokugeln während des Mischschrittes bilden; solche anfänglich gebildeten Mikrokugeln sind jedoch vorübergehend und benötigen einen weiteren Schritt (z.B. Einschließen eines vernetzenden Mittels in das Gemisch und/oder durch Anwenden von Hitze oder einer anderen Energiequelle), um die vorübergehend gebildeten Mikrokugeln zu stabilisieren. Die besonderen Bedingungen zum Bilden typischer erfindungsgemäßer Mikrokugeln werden in den Beispielen beschrieben. In den bevorzugten Ausführungsformen wird die Bildungsreaktion in Abwesenheit vom Hinzufügen von Ölen oder organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Öl ist als eine Substanz definiert, die flüssiges Fett darstellt, welches in Wasser nicht löslich ist.
  • Der Proteinbestandteil der Mikrokugel kann ein Trägerprotein oder ein therapeutisches Protein (siehe z.B. Tabelle 1) sein. So wie hier verwendet, bezeichnet ein "Trägerprotein" ein Protein, welches ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 1500 aufweist und welches in einer dreidimensionalen Struktur vorkommt. Das Trägerprotein kann auch ein therapeutisches Protein sein, d.h. ein Protein, welches eine therapeutische Aktivität aufweist; im Allgemeinen wird jedoch der Begriff "Trägerprotein" in dieser Anmeldung verwendet werden, um ein Protein zu bezeichnen, welches die hauptsächliche Funktion aufweist, eine dreidimensionale Struktur für den Zweck der Mikrokugelbildung bereitzustellen, selbst wenn das Trägerprotein auch eine zweite Funktion als ein therapeutisches Mittel aufweisen kann. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt das Trägerprotein ein Albumin, insbesondere ein humanes Serumalbumin dar. Die erfindungsgemäßen Proteinmikrokugeln schließen gegebenenfalls weiterhin ein therapeutisches Mittel, wie ein Steroid (z.B. Östradiol, Testosteron, Prednisolon, Dexamethason, Hydrocortison, Lidocain-Base, Procain-Base) oder irgendein anderes solches chemisches Objekt ein, von welchem bekannt ist, dass es an das Protein, vorzugsweise Albumin, wie GCSF, oder Paclitaxel bindet. In noch anderen Ausführungsformen (unten diskutiert) schließen die erfindungsgemäßen Mikrokugeln weiterhin ein komplexierendes Mittel und weiter bevorzugt, ein therapeutisches Mittel (vorzugsweise ein Peptid) ein, welches mit dem komplexierenden Mittel über eine ionische oder nicht-ionische Interaktion verbunden ist. In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt das Protein, welches die Matrix umfasst, ein therapeutisches Protein dar (z.B. ein Hormon, wie Insulin oder humanes Wachstumshormon), und die Mikrokugel wird konstruiert und angeordnet, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Proteins in vivo bereitzustellen. Weiter bevorzugt wird die Mikrokugel konstruiert und angeordnet, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Mittels in der Abwesenheit eines wesentlichen Quellens der Mikrokugel bereitzustellen.
  • Überraschenderweise unterscheidet sich die Oberfläche der Mikrokugel vom Inneren. Ausführliches Waschen mit Wasser von gefriergebrochenen Mikrokugeln löst viel des Matrixmaterials der Mikrokugel, wobei eine dünne Schale übrig bleibt. Zusätzlich ist die Oberfläche der Mikrokugel glatt; die Kanal(Poren)öffnungen betragen weniger als 1000 Angström im Durchmesser, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung unter Verwendung z.B. der BET-Technologie zur Datenanalyse, bestimmt wurde.
  • Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mikrokugeln durch Mischen des Makromoleküls, vorzugsweise ein Protein oder eine Nukleinsäure, zusammen mit mindestens einem Wasserpolymer unter Bedingungen gebildet, welche dem wasserlöslichen Polymer erlauben, innerhalb spezifizierter oder bevorzugter Verhältnisse von Makromolekül zu wasserlöslichem Polymer Wasser aus dem Makromolekül zu entfernen ("dehydrieren"). So wie hier verwendet, bezeichnet ein erfindungsgemäßes "wasserlösliches Polymer" ein Polymer oder ein Gemisch aus Polymeren, welches in der Lage ist, Wasser aus dem Makromolekül zu entfernen oder das Makromolekül zu dehydrieren, oder anderweitig in der Lage ist, einen Volumenausschluss zu verursachen. Daher umfasst das bevorzugte Verfahren einen Volumenausschluss unter Verwendung eines vollständig wässrigen Systems, an dem kein Öl oder keine organischen Lösungsmittel beteiligt sind.
  • Geeignete wasserlösliche Polymere schließen lösliche gerade oder verzweigte Polymere ein, vorzugsweise jene, welche ein hohes Molekulargewicht aufweisen. Polymere können hoch wasserlöslich, mittelmäßig wasserlöslich oder schwach wasserlöslich (mehr als 2% Gew./Vol. wasserlöslich) vorliegen. Die bevorzugten wasserlöslichen Polymere sind wasserlöslich oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel löslich. Die wasserlöslichen Polymere können löslich gemacht werden, indem sie zuerst in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst werden und anschließend die Polymerlösung mit einem wässrigen Lösungsmittel vereinigt wird. In den insbesondere bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Polymere aus den wasserlöslichen Polymeren ausgewählt, welche in Tabelle 2 dargestellt sind. In bestimmten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Mikrokugeln aus Proteinen und wasserlöslichen Polymeren gebildet und enthalten von 40 bis weniger als 100 Gew.-% Protein. Das endgültige Mikrokugel-Produkt, welches unter Verwendung eines vernetzenden Mittels und/oder eines Aussetzens gegenüber einer Energiequelle, wie Hitze, stabilisiert wurde, quillt in der Anwesenheit von Wasser nicht wesentlich (d.h., es ist kein Hydrogel). In den insbesondere bevorzugten Ausführungsformen stellt das wasserlösliche Polymer ein Kohlenhydrat-basiertes Polymer dar. Daher umfasst die Mikrokugel in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen: (1) ein Protein, vorzugsweise Albumin und (2) ein Kohlenhydrat-basiertes wasserlösliches Polymer, vorzugsweise Hetastärke, wobei das Protein mindestens 40 Gew.-% und weniger als 100 Gew.-% der Mikrokugel darstellt. Vorzugsweise stellt das Kohlenhydrat-basierte Polymer mehr als 0 Gew.-% und weniger als oder gleich 30 Gew.-% der Mikrokugel dar. In diesen und anderen Ausführungsformen umfassen die Mikrokugeln vorzugsweise weiterhin ein aktives Mittel, vorzugsweise ein luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon oder ein Analoges davon. Im Allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Mikrokugeln, wenn sie mit einer Lösung des aktiven Mittels in Kontakt gebracht werden, in der Lage, mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% oder mindestens 98% des aktiven Mittels einzuschließen. Die das aktive Mittel enthaltenden Mikrokugeln werden weiterhin gegebenenfalls durch Inkontaktbringen der Mikrokugeln mit denselben Typen der vernetzenden Mittel und durch Verwenden derselben Typen von Bedingungen, welche hier für das anfängliche Stabilisieren der Mikrokugeln beschrieben wurden, stabilisiert.
  • Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche weiterhin ein komplexierendes Mittel einschließt, bereitgestellt. Die Mikrokugel gemäß diesem Aspekt schließt: (1) ein Makromolekül, wie ein Protein (z.B. Albumin, wie oben beschrieben), (2) mindestens ein wasserlösliches Polymer (z.B. Hetastärke (Hydroxyethylstärke), PEG/PVP) und (3) ein komplexierendes Mittel ein. So wie hier verwendet, bezeichnet ein komplexierendes Mittel ein Molekül, welches in der Lage ist, mit einem therapeutischen Mittel (unten diskutiert) zu interagieren, um ein Beladen, ein Zurückhalten und/oder anderweitiges Verzögern der Freisetzung des therapeutischen Mittels aus der Mikrokugel zu erleichtern (siehe z.B. Tabelle 3). Wie in allen Aspekten der Erfindung weisen diese Mikrokugeln eine glatte Oberfläche auf, welche eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, die weniger als 1000 Angström im Durchmesser betragen, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung bestimmt wurde, und welche vorzugsweise kein nachweisbares Öl oder organisches Lösungsmittel enthalten.
  • Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche weiterhin mindestens zwei komplexierende Mittel einschließt, bereitgestellt. Die Mikrokugel gemäß diesem Aspekt schließt: (1) ein Makromolekül, wie ein Trägerprotein (z.B. Albumin, wie oben beschrieben), (2) mindestens ein wasserlösliches Polymer (z.B. Hetastärke (Hydroxyethylstärke), PEG/PVP), (3) ein erstes komplexierendes Mittel, das ein anionisches Polysaccharid ist und (4) ein zweites komplexierendes Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium, Magnesium, Zink, Strontium, Barium, Mangan und Eisen, ein. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird in Beispiel 17 dargestellt. Calcium und Magnesium sind die bevorzugten zweiwertigen Metallkationen.
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein komplexierendes Mittel ein Molekül, welches in der Lage ist, mit einem therapeutischen Mittel (unten diskutiert) zu interagieren, um ein Beladen, Zurückhalten und/oder anderweitiges Verzögern der Freisetzung des therapeutischen Mittels aus der Mikrokugel zu erleichtern (siehe z.B. Tabelle 3). Wie in anderen Aspekten der Erfindung weisen diese Mikrokugeln vorzugsweise eine glatte Oberfläche auf, welche eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, die weniger als 1000 Angström im Durchmesser betragen, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung bestimmt wurde, und welche, weiter bevorzugt, kein nachweisbares Öl oder organisches Lösungsmittel enthalten.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Einschließen des/der komplexierenden Mittel/s ist, das/die komplexierende/n Mittel mit einem wasserlöslichen Polymer in wässriger Lösung zu vereinigen, anschließend das Makromolekül hinzuzufügen und die Mikrokugeln mit Hitze und/oder vernetzenden Mitteln zu stabilisieren.
  • Im Allgemeinen ist das komplexierende Mittel ein ionisches komplexierendes Mittel (d.h. das komplexierende Mittel ist zu einer ionischen Interaktion mit einem therapeutischen Mittel (unten diskutiert) fähig) oder ein nicht-ionisches komplexierendes Mittel (d.h. das komplexierende Mittel ist zu einer nicht-ionischen (z.B. hydro phoben, gemischt ionischen/nicht-ionischen) Interaktion mit einem therapeutischen Mittel oder mit einem anderen komplexierenden Mittel fähig). Beispielhafte komplexierende Mittel werden in Tabelle 3 bereitgestellt. Erfindungsgemäße ionische komplexierende Mittel werden weiterhin in anionische komplexierende Mittel (d.h., komplexierende Mittel, welche eine negative Ladung aufweisen, wie anionische Polysaccharide, z.B. Dextransulfat, Galacturonsäuren, Alginate, Mannuronsäure, Guluronsäure, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfate, Heparin, Chitin, Chitosan, Glycosaminoglycane, Proteoglycane) und kationische komplexierende Mittel (d.h. komplexierende Mittel, welche eine positive Ladung aufweisen) eingeteilt. Die bevorzugten erfindungsgemäßen komplexierenden Mittel sind anionische Polysaccharide und zweiwertige Metallkationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium und Magnesium.
  • In bestimmten Ausführungsformen, stellt das komplexierende Mittel ein anionisches komplexierendes Mittel dar, welches die Struktur der Formel I: POLY-[Y-]nX+ I.aufweist, wobei POLY eine Hauptkette des anionischen komplexierenden Mittels darstellt, welche gerade oder verzweigt sein kann,
    wobei Y- eine anionische Gruppe darstellt, z.B. Sulfate, Carboxyle, Phosphate, Nitrate, Carbonate und desgleichen, welche an irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Hauptkette gekoppelt sein kann,
    wobei X+ eine kationische Gruppe darstellt, welche z.B. ein Gegenion zu der anionischen Gruppe darstellt,
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10.000 ist, vorzugsweise von 5 bis 100 und weiter bevorzugt von 5 bis 1000 und noch weiter bevorzugt von 5 bis 10.000, und
    wobei die n Y--Gruppen gleich oder verschieden sein können, wenn n größer als 1 ist.
  • In noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen stellt das komplexierende Mittel ein kationisches komplexierendes Mittel dar, welches die Struktur der Formel II: POLY-[X+]n Y II.aufweist, wobei POLY eine Hauptkette des kationischen komplexierenden Mittels darstellt, welche gerade oder verzweigt sein kann,
    wobei X+ eine kationische Gruppe darstellt, z.B. eine Aminogruppe, welche an irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Hauptkette gekoppelt sein kann,
    wobei Y- eine anionische Gruppe darstellt, welche ein Gegenion zu der kationischen Gruppe darstellt,
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10.000 ist, vorzugsweise von 5 bis 100 und weiter bevorzugt von 5 bis 1000 und am meisten bevorzugt von 5 bis 10.000, und
    wobei die n X--Gruppen gleich oder verschieden sein können, wenn n größer als 1 ist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche weiterhin ein aktives Mittel einschließt, bereitgestellt (siehe z.B. Tabelle 4). Die Mikrokugeln, in welche das aktive Mittel geladen werden kann, können (ein) komplexierende(s) Mittel einschließen, um ein Beladen und/oder Modifizieren der Freisetzung des aktiven Mittels aus der Mikrokugel zu erleichtern. Alternativ kann das aktive Mittel in die oben beschriebenen Mikrokugeln geladen werden, welchen ein komplexierendes Mittel fehlt, z.B. können das erfindungsgemäße Protein und/oder die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Polymere mit dem aktiven Mittel inter agieren, um ein Beladen und/oder Modifizieren seiner Freisetzung aus der Mikrokugel zu erleichtern. Obwohl das aktive Mittel während der Herstellung der Mikrokugel in eine erfindungsgemäße Mikrokugel geladen werden kann, ist es im Allgemeinen bevorzugt, das aktive Mittel in eine fertiggestellte erfindungsgemäße Mikrokugel zu laden und weiter bevorzugt, das aktive Mittel in eine fertiggestellte Mikrokugel zu laden, welche (ein) komplexierende/s Mittel enthält, um ein Beladen und/oder eine retardierte Freisetzung des Mittels zu erleichtern. Im Gegensatz zu Hydrogel-Mikrokugeln, quellen die erfindungsgemäßen Mikrokugeln in Wasser nicht wesentlich, und die Mikrokugeln benötigen weiterhin keine Quellung, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Proteins und/oder physiologisch aktiven Mittels aus der Mikrokugel bereitzustellen.
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein aktives Mittel ein Mittel, welches eine diagnostische oder therapeutische Aktivität aufweist. Demgemäß kann ein aktives Mittel eine nachweisbare Markierung (z.B. eine radioaktive Markierung) einschließen, welche zum Identifizieren der Orte des freigesetzten Mittels in vivo geeignet ist. Aktive Mittel schließen auch therapeutische Mittel ein, welche für das Behandeln einer Krankheit oder eines Zustandes geeignet sind. In bestimmten Ausführungsformen, sind die bevorzugten physiologisch aktiven Mittel Protein- oder Peptid-Mittel. Solche Protein- oder Peptid-Mittel können typischerweise, basierend auf der Aktivität des Mittels oder des Typs der Erkrankung oder des Zustandes, welcher behandelt werden soll, weiterhin in Kategorien eingeteilt werden. Die Kategorien der physiologisch aktiven Mittel, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Antibiotika, Hämatopoietika, antiinfektiöse Mittel, Antidemenzmittel, antivirale Mittel, Antitumormittel, Antipyretika, Analgetika, Antientzündungsmittel, Antiulcusmittel, antiallergische Mittel, Antidepressiva, psychotrope Mittel, Kardiotonika, antiarrhythmische Mittel, Vasodilatoren, Blutdruck senkende Mittel, wie Blutdruck senkende Diuretika, antidiabetische Mittel, Antikoagulanzien, Cholesterin senkende Mittel, therapeutische Mittel für Osteoporose, Hormone, Impfstoffe und so weiter (siehe z.B. Tabelle 4) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Das physiologisch aktive Peptid oder Protein, welches erfindungsgemäß verwendet wird, stellt ein Peptid dar, welches aus zwei oder mehr Aminosäuren aufgebaut ist. Vorzugsweise weist ein solches Peptid ein Molekulargewicht von mehr als 200, z.B. im Bereich von ungefähr 200 bis 200.000 auf. Der weiter bevorzugte Bereich des Molekulargewichts beträgt ungefähr 200 bis 100.000. Spezifischere Beispiele für physiologisch aktive Mittel, einschließlich Nicht-Protein-Mittel, welche in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, werden in der detaillierten Beschreibung der Erfindung bereitgestellt.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Bilden einer Mikrokugel bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: (1) Bilden eines wässrigen Gemisches, welches ein Makromolekül, vorzugsweise ein Protein oder eine Nukleinsäure, und ein wasserlösliches Polymer, vorzugsweise ein Kohlenhydratbasiertes Polymer, wie Hetastärke, enthält; (2) Ermöglichen, dass sich die Mikrokugeln in dem wässrigen Gemisch bilden; (3) Stabilisieren der Mikrokugeln, vorzugsweise durch Inkontaktbringen der Mikrokugeln mit einem vernetzenden Mittel und/oder Aussetzen der Mikrokugeln einer Energiequelle, vorzugsweise Hitze, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Mikrokugeln zu stabilisieren; wobei das Makromolekül in dem wässrigen Gemisch in einer Menge anwesend ist, die ausreicht, um eine Mikrokugel zu bilden, welche mindestens 40 Gew.-% und weniger als 100 Gew.-% des Makromoleküls enthält. Obwohl nicht gewünscht wird, an irgendeine besondere Theorie oder einen Mechanismus gebunden zu werden, wird angenommen, dass die Mikrokugeln sich während des Mischschritts bilden; solche anfänglich gebildeten Mikrokugeln sind jedoch vorübergehend und benötigen einen weiteren Schritt (z.B. Einschließen eines vernetzenden Mittels in das Gemisch und/oder durch Anwenden von Hitze oder einer anderen Energiequelle), um die vorübergehend gebildeten Mikrokugeln zu stabilisieren. Beispielhafte Verfahren des Herstellens der Mikrokugeln werden in den Beispielen bereitgestellt.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden eine pharmazeutische Zusammensetzung des Materials und ein Verfahren zum Herstellen der Zusam mensetzung bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen schließt die Zusammensetzung einen Behälter ein, welcher eine Einzeldosis der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten, welcher durch die retardierte Freisetzung eines aktiven Mittels aus den Mikrokugeln behandelbar ist. Die Anzahl der Mikrokugeln in der Einzeldosis ist abhängig von der Menge des aktiven Mittels, welches in jeder Mikrokugel anwesend ist und von dem Zeitraum über welchen eine retardierte Freisetzung gewünscht ist. Vorzugsweise wird die Einzeldosis ausgewählt, um die retardierte Freisetzung des aktiven Mittels über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis ungefähr 180 Tagen zu erreichen, wobei die Einzeldosis der Mikrokugeln ausgewählt wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil für die Behandlung des Zustandes zu erreichen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Spritze, welche irgendwelche der hier offenbarten Mikrokugeln enthält, bereitgestellt. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung eine Spritze einschließen, welche eine Einzeldosis der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten, welcher durch die retardierte Freisetzung des aktiven Mittels aus den Mikrokugeln behandelbar ist. Vorzugsweise ist eine Nadel mit der Spritze verbunden, wobei die Nadel eine Bohrungsgröße aufweist, welche 14 bis 30 Gauge beträgt.
  • Bemerkenswerterweise können die erfindungsgemäßen Mikrokugeln so hergestellt werden, dass sie einen Umfang aufweisen, welcher die Abgabe der Mikrokugeln unter Verwendung einer nadellosen Spritze (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427 ) erlaubt, wodurch die Entsorgungsprobleme ausgeschlossen werden, welche mit Nadeln verbunden sind, die als Abfallprodukte mit biologischer Gefährdung entsorgt werden müssen. Gemäß einem insbesondere bevorzugten Aspekt der Erfindung wird daher eine nadellose Spritze bereitgestellt, welche eine oder mehrere Dosen der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten. Die Mikrokugeln können so hergestellt werden, dass sie Qualitäten aufweisen, die geeignet sind, um über andere parenterale und nicht-parenterale Wege abgegeben zu werden, wie oral, buccal, intrathekal, nasal, pulmonal, transdermal, transmukosal und desgleichen.
  • Gemäß noch anderer erfindungsgemäßer Ausführungsformen werden Nukleinsäure enthaltende Mikrokugeln bereitgestellt. Die Nukleinsäure enthaltenden Mikrokugeln schließen: (1) eine Nukleinsäure (z.B. ein Plasmid, viralen Vektor, Oligonukleotid, eine RNA, Antisense und Missense Nukleinsäuren); (2) ein polykationisches Polymer (z.B. Polylysin) und (3) ein wasserlösliches Polymer (wie oben beschrieben) ein. Daher wird ein Verfahren zum Bilden der Nukleinsäure enthaltenden Mikrokugeln bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: (1) Vereinigen einer Nukleinsäure, eines polykationischen Polymers und eines wasserlöslichen Polymers in einer oder mehreren wässrigen Lösungen, um ein wässriges Gemisch zu bilden, welches eine Mono- oder Multiphase darstellen kann und (2) Aussetzen des wässrigen Gemisches einem vernetzenden Mittel und/oder einer Energiequelle unter Bedingungen (z.B. der Konzentration, Inkubationszeit), die ausreichen, um eine Mikrokugel zu stabilisieren. Beispielhafte Verfahren des Bildens der Nukleinsäure-Mikrokugeln werden in den Beispielen bereitgestellt.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unten detaillierter beschrieben werden. In dieser Offenbarung weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung auf, wie sie normalerweise vom Fachmann verstanden wird, an den sich diese Erfindung richtet, außer es wird anderweitig definiert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt eine Graphik dar, welche die komulativen bzw. kumulierten Prozente des radioaktiv markierten Polyethylenglycols (PEG) und des radioaktiv markierten bovinen Serumalbumins (BSA) zeigt, welche aus den Mikrokugeln freigesetzt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Das Symbol schwarzes Quadrat stellt PEG dar und das Symbol offenes Quadrat stellt BSA dar.
  • 2 stellt eine Graphik dar, welche die kumulativen Prozente des radioaktiv markierten bovinen Serumalbumins (BSA) zeigt, welches aus den Mikrokugeln freigesetzt wurde, welche mit drei verschiedenen Konzentrationen des Polymers hergestellt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Das Symbol graues Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 50% dar, das Symbol offenes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 40% dar, und das Symbol schwarzes Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% dar.
  • 3 stellt eine Graphik dar, welche die kumulativen Prozente des radioaktiv markierten Polyethylenglycols (PEG) zeigt, welche aus den Mikrokugeln freigesetzt wurden, welche mit drei verschiedenen Konzentrationen des Polymers hergestellt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Das Symbol offenes Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 50% dar, das Symbol schwarzes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 40% dar, und das Symbol offenes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% dar.
  • 4 stellt eine Graphik dar, welche die kumulativen Prozente des radioaktiv markierten bovinen Serumalbumins (BSA) zeigt, welches aus den Mikrokugeln freigesetzt wurde, welche mit drei verschiedenen Konzentrationen des Polymers bei verschiedenen Inkubationstemperaturen hergestellt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Das Symbol offenes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 58°C dar, das Symbol schwarzes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 70°C dar, das Symbol offener Kreis stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 40% und eine Inkubation bei 58°C dar, das Symbol schwarzer Kreis stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 40% und eine Inkubation bei 70°C dar, das Symbol offenes Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 50% und eine Inkubation bei 58°C dar, das Symbol schwarzes Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 50% und eine Inkubation bei 70°C dar, das Symbol helles "X" stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 37°C und 58°C dar, und das Symbol dunkles "X" stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 37°C und 70°C dar.
  • 5 stellt eine Graphik dar, welche die kumulativen Prozente des radioaktiv markierten Polyethylenglycols (PEG) zeigt, welches aus den Mikrokugeln freigesetzt wurde, welche mit drei verschiedenen Konzentrationen des Polymers bei verschiedenen Inkubationstemperaturen hergestellt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Die Symbole sind dieselben, wie die in 4 beschriebenen.
  • 6 stellt eine Graphik dar, welche die kumulativen Prozente des radioaktiv markierten Polyethylenglycols (PEG) zeigt, welche aus den Mikrokugeln freigesetzt wurden, welche mit drei verschiedenen Konzentrationen des Polymers bei einer Inkubationstemperatur einschließlich 58°C hergestellt wurden, gegenüber der Quadratwurzel der Zeit in Stunden. Das Symbol offenes Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 50% und eine Inkubation bei 58°C dar, das Symbol schwarzes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 40% und eine Inkubation bei 58°C dar, das Symbol graues Dreieck stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 37°C und 58°C dar, und das Symbol offenes Quadrat stellt eine Gesamt-Polymer-Konzentration von 25% und eine Inkubation bei 58°C dar.
  • 7 stellt ein Balken- bzw. Säulendiagramm dar, welches die Menge des durch die beta-Galactosidaseaktivität in Milliunits exprimierten Genprodukts zeigt, gegenüber der Mikrokugel-Bildung für nackte DNA, kationische Liposomen, welche DNA enthalten und DNA-Mikrokugeln.
  • 8 stellt eine Graphik der kumulativen Freisetzung in Prozent von Leuprolidacetat aus den Mikrokugeln über die Zeit in Tagen dar.
  • 9 stellt eine Graphik der kumulativen Freisetzung in Prozent von Nafarelinacetat gegenüber der Zeit in Stunden für drei Konzentrationen von Zinksulfat, welche während der Mikrokugel-Herstellung verwendet wurden, dar. Das Symbol Kreis stellt 0,01 M Zinksulfat dar, das Symbol Quadrat stellt 0,1 M Zinksulfat dar, und das Symbol Dreieck stellt 1 M Zinksulfat dar.
  • 10 zeigt die retardierte Freisetzung von Östradiol in vitro aus den erfindungsgemäßen Mikrokugeln.
  • 11 zeigt die retardierte Freisetzung von Östradiol in vivo (Serumkonzentrationen) aus den erfindungsgemäßen Mikrokugeln.
  • 12 zeigt die Wirksamkeit eines Diclofenac-Na-Einschlusses durch Anpassen der Inkubationsbedingungen.
  • 13 zeigt ein repräsentatives Größenverteilungsprofil für die erfindungsgemäßen Mikrokugeln.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen für die retardierte Freisetzung von therapeutischen und/oder diagnostischen Mitteln in vivo und/oder in vitro bereit. Die Mikrokugeln weisen im Allgemeinen eine einheitliche Größe und Form auf, wobei ihre Größe von ungefähr 0,5 Mikrometer bis ungefähr 20 Mikrometer, abhängig von den Herstellungsbedingungen, reicht. Die Eigenschaften der Mikrokugeln können während der Herstellung durch Manipulieren der Konzentration des wasserlöslichen Polymers, der Reaktionstemperatur, des pH-Werts, der Proteinkonzentration, des vernetzenden Mittels und/oder der Länge der Zeit, welche das Makromolekül dem vernetzenden Mittel und/oder der Energiequelle ausgesetzt ist, verändert werden.
  • Die Mikrokugeln sind für eine große Vielzahl von Trennungen, diagnostischen, therapeutischen, industriellen, kommerziellen, kosmetischen und Forschungs-Zwecken oder für irgendeinen Zweck, welcher das Einschließen und Stabilisieren eines aktiven Moleküls, Reaktionspartners oder Arzneimittels benötigt, geeignet.
  • Die erfindungsgemäßen Mikrokugeln sind daher für medizinische und diagnostische Anwendungen, wie Arzneimittelabgabe, Impfung, Gentherapie und histopathologische oder in vivo Gewebs- oder Tumordarstellung, geeignet. Demgemäß sind die Mikrokugeln für eine orale oder parenterale Verabreichung, eine mukosale Verabreichung, eine ophthalmische Verabreichung, eine intravenöse, subkutane, intraartikuläre oder intramuskuläre Injektion, eine Verabreichung durch Inhalation und eine topische Verabreichung geeignet.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche eine glatte Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, bereitgestellt. Jede Kanalöffnung weist einen Durchmesser auf, welcher weniger als 1000 Angström beträgt, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung unter Verwendung z.B. der BET-Methodik für die Datenanalyse bestimmt wurde.
  • Die Mikrokugeln werden durch Mischen oder Lösen von Makromolekülen mit einem wasserlöslichen Polymer oder einem Gemisch aus wasserlöslichen Polymeren, wie den geraden oder verzweigten Polymeren aus Tabelle 2, bei einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt des Makromoleküls hergestellt. Das Makromolekül- und Polymergemisch wird einem vernetzenden Mittel und/oder einer Energiequelle, wie Hitze, ausgesetzt, unter Bedingungen, welche ausreichen, die Mikrokugeln zu stabilisieren. Die Mikrokugeln werden anschließend von den nicht eingeschlossenen Reagenzien durch Trennverfahren, wie Filtration oder Zentrifugation, getrennt.
  • Im Allgemeinen machen das Makromolekül oder die Vereinigung der Makromoleküle mindestens 40 Gew.-% und weniger als 100 Gew.-% des endgültigen Gewichts jeder Mikrokugel aus. Vorzugsweise beträgt die Polymerkonzentration in der Mikrokugel mehr als 0 Gew.-% und weniger als oder gleich 30 Gew.-%. Die Typen der Makromoleküle, welche die Mikrokugeln bilden, schließen Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Viren oder Gemische davon ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Jede Mikrokugel ist aus Makromolekülen und Polymermolekülen aufgebaut, welche ineinandergewunden oder vermischt in der Mikrokugel vorliegen und im Allgemeinen homogen verteilt sind. Obwohl nicht gewünscht wird, an irgendeine besondere Theorie oder einen Mechanismus gebunden zu werden, wird angenommen, dass die innere Matrix wasserlöslich ist, und dass die innere Matrix, wenn sie gelöst wird, unter geeigneten Bedingungen durch die äußere Oberfläche diffundiert, wie detaillierter unten beschrieben wird. Die Mikrokugeln weisen eine enge Größenverteilung auf und weisen im Allgemeinen eine einheitliche Form auf. Die Größenverteilung ist auch durch Modifizieren der Bedingungen und Reagenzien, welche während des Herstellungsverfahrens verwendet werden, anpassbar, und kann mit der Freisetzungskinetik verbunden werden, wie unten beschrieben wird. Die Mikrokugeln weisen im Allgemeinen einen Durchmesser von weniger als 10 μm auf. Siehe 13 für eine repräsentative Größenverteilung der erfindungsgemäßen Mikrokugeln. Die einheitliche Form der Mikrokugeln ist im Wesentlichen kugelförmig, weshalb die Mikropartikel hier auch als "Mikrokugeln" bezeichnet werden.
  • Die äußere Oberfläche jeder Mikrokugel ist permeabel für Wasser und gelöste Makromoleküle und erlaubt nicht nur wässrigen Flüssigkeiten in die Mikrokugel einzudringen, sondern erlaubt auch dem gelösten Makromolekül und Polymer, die Mikrokugel zu verlassen. Die Mikrokugeln können hergestellt werden, um das Makromolekül und Polymer aus dem Inneren der Mikrokugel freizusetzen, wenn sie in ein geeignetes wässriges Medium, wie Körperflüssigkeiten oder einen physiologisch verträglichen Puffer, unter physiologischen Bedingungen über einen verlängerten Zeitraum gebracht werden, wodurch sie eine retardierte Freisetzung der Makromoleküle bereitstellen. Zusätzlich können die Mikrokugeln hergestellt werden, um das Makromolekül ohne einen anfänglichen Schub oder eine schnelle Freisetzung des Makromoleküls freizusetzen. Retardierte Freisetzung wird hier als Freisetzung von Makromolekülen über einen verlängerten Zeitraum definiert. Der Zeitraum, über welchen die Makromoleküle kontinuierlich aus der Mikrokugel freigesetzt werden, hängt von den Eigenschaften des Makromoleküls, welches freigesetzt wird, und den Parametern, welche verwendet werden, um die Mikrokugeln zu bilden, ab, ist aber in allen Fällen länger als der der freien Diffusion des Makromoleküls in Wasser. Mikrokugeln, welche pharmazeutische Verbindungen enthalten, können hergestellt werden, um die pharmazeutische Verbindung, wie oben beschrieben, mit dem Makromolekül und Polymer freizusetzen.
  • Wie oben in Kürze und detaillierter unten diskutiert, können die Eigenschaften der Mikrokugeln während der Herstellung durch Anpassen des Typs des Polymers, der Polymerkonzentration, der Polymerzusammensetzung, der Inkubationstemperatur, des pH-Werts, der Makromolekülkonzentration oder der Länge der Zeit, welche das Makromolekül der Energiequelle ausgesetzt ist, manipuliert werden.
  • Die Mikrokugeln können einem Menschen oder einem Tier durch orale oder parenterale Verabreichung, einschließlich intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Injektion, Verabreichung durch Inhalation, intraartikulärer Verabreichung, mukosaler Verabreichung, ophthalmischer Verabreichung und topischer Verabreichung verabreicht werden. Eine intravenöse Verabreichung schließt eine Katheterisierung oder Angioplastie ein. Eine Verabreichung kann für Zwecke, wie therapeutische und diagnostische Zwecke, wie unten diskutiert, gedacht sein.
  • Bildung der Mikrokugeln
  • Mikrokugeln werden durch Mischen von Makromolekülen in einem wässrigen Gemisch mit einem wasserlöslichen Polymer oder einem Gemisch aus Polymeren hergestellt, um die Mikrokugeln zu bilden, und nachfolgend werden die Mikrokugeln gegebenenfalls mit einem vernetzenden Mittel und/oder einer Energiequelle, vorzugsweise Hitze, unter Bedingungen, welche ausreichen, die Mikrokugeln zu stabilisieren, in Kontakt gebracht. Die Lösung ist vorzugsweise eine wässrige Lösung. Entweder wird die Makromolekül-Lösung zu dem Polymer hinzugefügt, oder die Polymer-Lösung wird zu der Makromolekül-Lösung hinzugefügt, um ein Entfernen von Wasser aus den oder eine Dehydrierung der Makromoleküle/n zu verursachen. Dieses Verfahren wird vom Fachmann auch als Volumenauschluss bezeichnet. Obwohl nicht gewünscht wird, an irgendeine besondere Theorie oder einen Mechanismus gebunden zu werden, wird angenommen, dass sich die Mikrokugeln während des Mischschrittes bilden; solche anfänglich gebildeten Mikrokugeln sind jedoch vorübergehend und benötigen einen weiteren Schritt (z.B. Einschließen eines vernetzenden Mittels in das Gemisch und/oder durch Anwenden von Hitze oder einer anderen Energiequelle), um die vorübergehend gebildeten Mikrokugeln zu stabilisieren.
  • Der pH-Wert der Makromolekül-Polymer-Lösung wird entweder vor, nach oder während des Mischens des Polymers mit dem Makromolekül auf einen pH-Wert nahe des isoelektrischen Punktes (pl) des Makromoleküls eingestellt, vorzugsweise innerhalb von 3 bis 4 pH-Wert-Einheiten des pl des Makromoleküls, am meisten bevorzugt innerhalb von 1,5 bis 2 pH-Wert-Einheiten des pl des Makromoleküls.
  • Die pH-Wert Einstellung kann durch Hinzufügen einer Säure, einer Base, entweder in Lösung oder in fester Form, oder eines Puffers oder einer anderen pH-Wert einstellenden Lösung oder eines Salzes zu entweder der Makromolekül-Lösung, der Polymer-Lösung oder zu dem Gemisch aus Makromolekül und Polymer, gemäß Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Polymer in einem Puffer gelöst, welcher einen pH-Wert nahe des pl des Makromoleküls aufweist, und anschließend wird die pH-Wert eingestellte Polymerlösung zu dem Makromolekül hinzugefügt, welches in einer wässrigen Lösung gelöst wurde. Der pH-Wert der endgültigen Lösung sollte nahe des pl des Makromoleküls bleiben.
  • Die Makromolekül- und Polymer-Lösung wird anschließend einem vernetzenden Mittel und/oder einer Energiequelle, wie Hitze, Strahlung oder Ionisation, alleine oder in Verbindung mit einer Ultraschallbehandlung, Vortexen, Mischen oder Rühren für eine vorbestimmte Zeitdauer ausgesetzt, um die Mikrokugeln zu stabilisieren. Die sich ergebenden Mikrokugeln werden anschließend von irgendwelchen nicht eingeschlossenen Bestandteilen, welche in der Lösung anwesend sind, durch physikalische Trennverfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, getrennt und können anschließend gewaschen werden.
  • Die Länge der Inkubationszeit ist abhängig von den jeweiligen Konzentrationen des Polymers und Makromoleküls und der Menge der Energie der Energiequelle. Die Mikrokugelstabilisierung kann unmittelbar nach dem Aussetzen gegenüber der Energiequelle beginnen. Vorzugsweise wird das Makromolekül- und Polymer-Gemisch bei einer höheren Temperatur als der Raumtemperatur für ungefähr zwischen 5 Minuten und 24 Stunden erhitzt. Am meisten bevorzugt werden das Polymer und die Makromoleküle durch Rühren oder Schütteln für 30 Minuten bei einer Temperatur zwischen ungefähr 37°C und 70°C gemischt.
  • Makromolekül
  • Das Makromolekül, welches die Mikrokugel bildet, ist irgendein Molekül, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist oder in der Lage ist, eine Tertiär- oder Quartärstruktur aufzuweisen. Am meisten bevorzugt ist das Makromolekül ein Biomolekül, wie ein Protein, einschließlich Enzymen und rekombinanten Proteinen, ein Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Kohlenhydrat- oder Polysaccharid-Protein-Konjugat, eine Nukleinsäure, ein Virus, ein Viruspartikel, ein Konjugat aus einem kleinen Molekül (wie ein Hapten) und einem Protein oder Gemische davon. Eine organische oder anorganische, natürliche oder synthetische pharmazeutische Verbindung, oder ein Arzneimittel kann in die Mikrokugeln durch Anheften des Arzneimittels an ein Makromolekül, wie ein Protein, und durch anschließendes Bilden der Mikrokugeln aus dem Makromolekül-Arzneimittel-Komplex oder -Konjugat eingeschlossen werden. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass eine Verbindung, welche nicht in der Lage ist, eine Tertiär- oder Quartärstruktur aufzuweisen, durch Einschließen oder Koppeln der Verbindung in/an ein Trägermolekül, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist in eine Mikrokugel gebracht werden kann. Es wird weiterhin vom Fachmann verstanden werden, dass das Makromolekül ein Teil eines Moleküls darstellen kann, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist, wie zum Beispiel ein Peptid, ein einzelsträn giges Segment eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls oder ein Viruspartikel. Es wird auch verstanden werden, dass der Begriff "Makromolekül" eine Vielzahl von Makromolekülen einschließt, und Vereinigungen verschiedener Makromoleküle, wie eine Vereinigung einer pharmazeutischen Verbindung und eines Affinitätsmoleküls zum Leiten der pharmazeutischen Verbindung zu einem Gewebe, Organ oder Tumor, welcher eine Behandlung benötigt, einschließt. Es wird weiterhin verstanden werden, dass ein Affinitätsmolekül entweder den Rezeptor-Teil oder den Liganden-Teil einer Rezeptor-Liganden-Interaktion darstellen kann. Beispiele von Liganden, welche mit anderen Biomolekülen interagieren schließen Viren, Bakterien, Polysaccharide oder Toxine ein, welche als Antigene wirken, um eine Immunantwort zu erzeugen, wenn sie einem Tier verabreicht werden und die Herstellung von Antikörpern verursachen.
  • Geeignete Verbindungen oder Makromoleküle schließen BetaxololTM, DiclofenacTM, Doxorubicin, RifampinTM, Leuprolidacetat, luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH für engl.: luteinizing hormone releasing hormon), (D-Tryp6)-LHRH, Nafarelinacetat, Insulin, Natriuminsulin, Zinkinsulin, Protamin, Lysozym, alpha-Lactalbumin, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF für engl.: basic fibroblast growth factor), beta-Lactoglobulin, Trypsin, Kohlensäureanhydrase, Ovalbumin, bovines Serumalbumin (BSA), humanes Serumalbumin (HSA), Phosphorylase b, alkalische Phosphtase, beta-Galactosidase, IgG, Fibrinogen, Poly-L-Lysin, IgM, DNA, DesmopressinacetatTM, Wachstumshormon freisetzender Faktor (GHRF für engl.: growth hormon releasing factor), Somatostatin, Antid, Faktor VIII, G-CSF/GM-CSF, humanes Wachstumshormon (hGH für engl.: human growth hormon), beta-Interferon, Antithrombin III, alpha-Interferon, alpha-Interferon-2b ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Inkubationsbedingungen werden typischerweise durch Anpassen des pH-Wertes, der Temperatur, der Konzentration des Makromoleküls oder der Länge der Reaktion oder Inkubation optimiert, um annähernd 100% des Makromoleküls in das Reaktionsgemisch einzuschließen. Im Allgemeinen wird weniger Energie benötigt, um Mikrokugeln bei höheren Konzentrationen des Makromoleküls zu bilden.
  • Mikrokugeln, welche aus Nukleinsäuren zusammengesetzt sind, werden vorzugsweise zuerst durch Mischen der Nukleinsäure entweder mit einem Protein, wie bovinem Serumalbumin, oder, da Nukleinsäuren Anionen darstellen, durch das Hinzufügen eines Kations, wie Polylysin, welches sehr bei der Bildung der Mikrokugeln hilft, hergestellt.
  • Wie oben erwähnt wurde, kann ein kleines Molekül oder eine Verbindung, welche nicht in der Lage ist, eine Tertiär- und Quartärstruktur aufzuweisen, wie ein Peptid oder eine pharmazeutische Verbindung, durch Einschließen oder Koppeln der Verbindung in/an ein Trägermolekül, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist, in eine Mikrokugel gebracht werden. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Zum Beispiel können Mikrokugeln wie hier beschrieben unter Verwendung eines Makromoleküls gebildet werden, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist, wie ein Protein, und anschließend wird das kleine Molekül oder die Verbindung innerhalb und/oder auf der Oberfläche der Mikrokugel gebunden. Alternativ wird das kleine Molekül oder die Verbindung unter Verwendung hydrophober oder ionischer Interaktionen an das Makromolekül gebunden, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist, und anschließend werden die Mikrokugeln aus dem Makromolekül-kleines Molekül-Komplex unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens gebildet. Ein dritter Weg, um Mikrokugeln aus kleinen Molekülen herzustellen ist, Mikrokugeln in einer solchen Weise unter Verwendung eines Makromoleküls, welches eine Tertiär- und Quartärstruktur aufweist, herzustellen, dass die Mikrokugel eine Nettoladung aufweist, und anschließend ein kleines Molekül oder eine Verbindung, welche eine gegensätzliche Nettoladung aufweist, hinzuzufügen, sodass das kleine Molekül physikalisch von der Mikrokugel angezogen wird und an dieser anhaften bleibt, aber im Laufe der Zeit unter den geeigneten Bedingungen freigesetzt werden kann. Alternativ können verschiedene Typen nicht kovalenter Interaktionen, wie hydrophober oder Affini täts-Interaktionen verwendet werden, um eine Anheftung und eine nachfolgende Freisetzung von kleinen Molekülen zu erlauben.
  • Beim Herstellen von Mikrokugeln, welche Protein enthalten, kann ein Protein-Stabilisator, wie Glycerin, Fettsäuren, Zucker, wie Saccharose, Ionen, wie Zink, Natriumchlorid oder irgendwelche anderen Protein-Stabilisatoren, welche dem Fachmann bekannt sind, vor dem Hinzufügen der Polymere während der Mikrokugel-Bildung hinzugefügt werden, um eine Proteindenaturierung zu minimieren.
  • Markiertes Makromolekül
  • Vor dem Einschließen in eine Mikrokugel kann das Makromolekül mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden. Die verschiedenen Typen der Markierungen und Verfahren des Markierens von Proteinen und Nukleinsäuremolekülen sind dem Fachmann gut bekannt. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass eine magnetische Substanz, wie ein Metall, in die Definition des Begriffes Markierung eingeschlossen ist. Zum Beispiel kann das Makromolekül mit einer metallischen Substanz, wie einem Metall, markiert werden, sodass die Mikrokugeln in einer Lösung mit Hilfe eines magnetischen Gerätes von anderen Substanzen getrennt werden können.
  • Mehrere andere spezifische Markierungen oder Reportergruppen sind unten dargelegt. Zum Beispiel kann die Markierung eine radioaktive Markierung sein, wie [32]P, [3]H, [14]C, [35]S, [125]I oder [131]I, ist aber nicht darauf beschränkt. Eine [32]P-Markierung kann mit einem Konjugations-Reagens an ein Protein konjugiert werden oder in die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls durch Nick-Translation, Enden-Markierung oder Einschließen von markierten Nukleotiden eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann eine [3]H-, [14]C- oder [35]S-Markierung in eine Nukleotidsequenz durch Einschließen eines markierten Vorläufers oder durch chemische Modifikation eingeschlossen werden, während eine [125]I- oder [131]I-Markierung im Allgemeinen durch eine chemische Modifikation in eine Nukleotidsequenz eingeschlossen wird. Der Nachweis einer Markierung kann durch Verfah ren, wie Szintillationszählung, Gamma-Strahlen-Spektrometrie oder Autoradiographie stattfinden.
  • Die Markierung kann auch eine Massen- oder Kernmagnetische Resonanz (NMR für engl.: Nuclear Magnetic Resonance)-Markierung, wie zum Beispiel [13]C, [15]N oder [19]O, sein. Der Nachweis einer solchen Markierung kann durch Massenspektrometrie oder NMR stattfinden. Farbstoffe, chemolumineszente Mittel, biolumineszente Mittel und Fluorogene können auch verwendet werden, um das Makromolekül zu markieren. Beispiele für Farbstoffe, welche zum Markieren von Nukleinsäuren geeignet sind, schließen Ethidiumbromid, Acridin, Propidium und andere interkalierende Farbstoffe und 4',6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) oder andere Nukleinsäure-Farbstoffe ein. Beispiele für Fluorogene schließen Fluoreszein und Derivate, Phycoerythrin, Allophycocyanin, Phycocyanin, Rhodamin, Texas-Rot oder andere Fluorogene ein. Die Fluorogene werden im Allgemeinen durch eine chemische Modifikation angeheftet. Die Farbmarkierungen können mit einem Spektralphotometer nachgewiesen werden, und die Fluorogene können mit einem Fluoreszenzdetektor nachgewiesen werden.
  • Das Makromolekül kann auch mit einem Chromogen (Enzymsubstrat), um eine Enzym- oder Affinitäts-Markierung bereitzustellen, oder mit einem Enzym markiert werden. Alternativ kann das Makromolekül biotinyliert werden, sodass es in einer Biotin-Avidin-Reaktion verwendet werden kann, welche auch an eine Markierung, wie ein Enzym oder Fluorogen gekoppelt werden kann. Das Makromolekül kann mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen markiert werden, welche eine chromogene oder fluorogene Reaktion beim Hinzufügen eines Substrats ergeben.
  • Eine Markierung kann auch durch Einschließen irgendeiner modifizierten Base, Aminosäure oder eines Vorläufers, welche irgendeine Markierung enthalten, durch einen Einschluss einer modifizierten Base oder Aminosäure, welche eine chemische Gruppe enthalten, die mit spezifischen Antikörpern erkennbar ist, oder durch Nachweisen irgendeines gebundenen Antikörper-Komplexes mit verschiedenen Hilfsmitteln, einschließlich Immunfluoreszenz oder immun-enzymatischen Reaktionen, hergestellt werden. Solche Markierungen können durch Verwenden Enzym gekoppelter Immunassays (ELISA) oder durch Nachweisen eines Farbwechsels mit Hilfe eines Spektralphotometers nachgewiesen werden.
  • Beschichtete Mikrokugeln
  • Moleküle, welche sich von den Makromolekülen unterscheiden, aus denen die Mikrokugeln aufgebaut sind, können an die äußere Oberfläche der Mikrokugeln durch Verfahren angeheftet werden, welche dem Fachmann bekannt sind, um die Mikrokugeln zu "beschichten" oder zu "bedecken". Die Möglichkeit, Moleküle an die äußere Oberfläche der Mikrokugel anzuheften, ergibt sich aufgrund der hohen Konzentration des Makromoleküls in der Mikrokugel. Diese Moleküle werden für Zwecke angeheftet, wie um eine Zielausrichtung zu erleichtern, eine Rezeptorvermittlung zu verstärken und ein Entkommen vor Endocytose oder Abbau bereitzustellen. Zum Beispiel können Biomoleküle wie Phospholipide an die Oberfläche der Mikrokugel angeheftet werden, um eine Endocytose durch Endosomen zu verhindern; Rezeptoren, Antikörper oder Hormone können an die Oberfläche angeheftet werden, um eine Zielausrichtung der Mikrokugel auf das gewünschte Organ, Gewebe oder die Zellen des Körpers zu fördern oder zu erleichtern und Polysaccharide, wie Glucane, können an die äußere Oberfläche der Mikrokugel angeheftet werden, um die Aufnahme durch Makrophagen zu verstärken oder zu verhindern.
  • Zusätzlich können ein oder mehrere spaltbare Moleküle an die äußere Oberfläche der oder innerhalb der Mikrokugeln angeheftet werden. Die spaltbaren Moleküle werden so entworfen, dass die Mikrokugeln zuerst unter geeigneten biologischen Bedingungen zu einer vorbestimmten Stelle geleitet werden, und anschließend beim Aussetzen gegenüber einer Änderung der biologischen Bedingungen, wie einer pH-Wert-Änderung, die Moleküle gespalten werden, was eine Freisetzung der Mikrokugel von der Zielstelle verursacht. Auf diese Weise werden Mikrokugeln aufgrund der Anwesenheit der Moleküle, welche an die Oberfläche der Mikrokugeln angeheftet sind, an Zellen angeheftet oder von diesen aufgenommen. Wenn das Molekül gespalten wird, bleiben die Mikrokugeln in der gewünschten Position, wie innerhalb des Cytoplasmas oder des Kerns einer Zelle und sind frei, um die Makromoleküle, aus welchen die Mikrokugeln aufgebaut sind, freizusetzen. Dies ist insbesondere geeignet für eine Arzneimittelabgabe, in der die Mikrokugeln ein Arzneimittel enthalten, welches auf eine besondere Stelle, die eine Behandlung benötigt, ausgerichtet ist, und das Arzneimittel kann langsam an dieser Stelle freigesetzt werden. Die bevorzugte Stelle der Spaltung stellt eine Diester-Bindung dar.
  • Die Mikrokugeln können auch mit einem oder mehreren stabilisierenden Substanzen beschichtet werden, was insbesondere für eine Langzeitdeponierung bei parenteraler Verabreichung geeignet sein kann oder für eine orale Abgabe, indem eine Passage der Mikrokugeln durch den Magen oder Darm ohne Auflösung erlaubt wird. Zum Beispiel können Mikrokugeln, welche für eine orale Abgabe vorgesehen sind, mit einer Beschichtung aus einer Substanz, wie Muzin, stabilisiert werden, einem Mucopolysaccharide enthaltenden Sekret, welches von den Becherzellen des Darms, den Submaxillardrüsen und anderen Schleimdrüsenzellen hergestellt wird.
  • Zusätzlich können die Teilchen mit Verbindungen wie Fettsäuren oder Lipiden nicht kovalent beschichtet werden. Die Beschichtung kann durch Eintauchen in der gelösten Beschichtungssubstanz, durch Besprühen der Mikrokugeln mit der Substanz oder durch andere Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, auf die Mikrokugeln gebracht werden.
  • In bestimmten der bevorzugten Ausführungsformen schließen die erfindungsgemäßen Mikrokugeln ein Protein und mindestens ein wasserlösliches Polymer ein. Wie oben diskutiert, werden die Mikrokugeln durch Inkontaktbringen des Proteins mit mindestens einem wasserlöslichen Polymer unter wässrigen Bedingungen gebildet, um die Mikrokugeln zu bilden, und die Mikrokugeln werden anschließend entweder durch chemische Vernetzung oder durch Aussetzen der Mikrokugeln gegenüber einer Energiequelle, vorzugsweise Hitze, oder beidem, unter Bedingungen (z.B. Konzentration, Temperatur), welche zu Mikrokugeln führen, welche gegenüber physikalischen und chemischen Behandlungen, wie Ultraschallbehandlung und ätzenden Lösungen, resistent sind, stabilisiert. Die besonderen Bedingungen zum Bilden repräsentativer erfindungsgemäßer Mikrokugeln werden in den Beispielen beschrieben. In den bevorzugten Ausführungsformen wird die Bildungsreaktion in der Abwesenheit des Hinzufügens von Ölen oder organischen Lösungsmitteln durchgeführt.
  • Der Proteinbestandteil der Mikrokugel kann ein Trägerprotein oder ein therapeutisches Protein sein (siehe z.B. Tabelle 1), welches von ungefähr 40 bis weniger als 100% (Gew.-%) der Mikrokugel darstellt.
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein "Trägerprotein" ein Protein, welches ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 1500 aufweist und welches in einer dreidimensionalen Struktur vorliegt. Das Trägerprotein kann auch ein therapeutisches Protein sein, d.h. ein Protein, welches eine therapeutische Aktivität aufweist; im Allgemeinen wird in dieser Anmeldung jedoch der Begriff "Trägerprotein" verwendet werden, um ein Protein zu bezeichnen, welches eine Primärfunktion aufweist, eine dreidimensionale Struktur für den Zweck der Mikrokugelbildung bereitzustellen, selbst wenn das Trägerprotein auch eine Sekundärfunktion als ein therapeutisches Mittel aufweisen kann. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Trägerprotein Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin. Die erfindungsgemäßen Protein-Mikrokugeln schließen gegebenenfalls weiterhin ein therapeutisches Mittel ein, wie ein Steroid (z.B. Östradiol, Testosteron, Prednisolon, Dexamethason, Hydrokortison, Lidocain-Base, Procain-Base) oder irgendein anderes solches chemisches Objekt, von welchem bekannt ist, dass es an Albumin, wie GCSF, oder Paclitaxel bindet. In noch anderen Ausführungsformen (unten diskutiert) schließen die erfindungsgemäßen Mikrokugeln weiterhin ein komplexierendes Mittel (vorzugsweise ein ionisches komplexierendes Mittel) und, weiter bevorzugt, ein therapeutisches Mittel (vorzugsweise ein Peptid) ein, welches mit dem komplexierenden Mittel über eine ionische oder nicht-ionische Interaktion verbunden ist. In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt das Protein, welches die Matrix umfasst, ein therapeutisches Protein dar (z.B. ein Hormon, wie Insulin oder humanes Wachstumshormon), und die Mikrokugel wird konstruiert und angeordnet, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Proteins in vivo bereitzustellen. Weiter bevorzugt wird die Mikrokugel konstruiert und angeordnet, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Proteins in der Abwesenheit einer wesentlichen Quellung der Mikrokugel bereitzustellen. Tabelle 1. Proteine
    PROTEINE
    TRAGERPROTEINE ODER -MOLEKÜLE THERAPEUTISCHE PROTEINE ODER PEPTIDE ODER MOLEKÜLE
    Albumine (vorzugsweise humanes Serumalbumin), HAS, BSA, IgG, IgM, Insulin, hGH, Lysozym, alpha-Lactoglobulin, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, VEGF, Chymotrypsin, Trypsin, Kohlensäureanhydrase, Ovalbumin, Phosphorylase b, alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase, Fibrinogen, Poly-L-Lysin, DNA, Immunglobuline (z.B. Antikörper), Casein, Collagen, Sojaprotein und Gelatine. Insulin, humanes Wachstumshormon, GCSF, GMCSF, LHRH, VEGF, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), DNA, RNA, Asparaginase, tPA, Urokinase, Streptokinase, Interferon, Glucagon, ACTH, Oxytocon, Sekretin, Vasopressin und Levothyroxin.
  • Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mikrokugeln durch Mischen des Proteins zusammen mit mindestes einem wasserlöslichen Polymer unter geeigneten Bedingungen gebildet, welche vorzugsweise erlauben, dass das wasserlösliche Polymer Wasser aus dem Protein (siehe z.B. Tabelle 2) innerhalb spezifizierter oder bevorzugter Verhältnisse (Gew./Gew.) von Protein zu wasserlöslichem Polymer (die Verhältnisse reichen z.B. von ungefähr 1 Protein : 1 Polymer bis ungefähr 1 Protein: 1000 Polymer) entfernt ("dehydriert"). Das bevorzugte Verhältnis von Protein zu wasserlöslichem Polymer in der Mikrokugel-Bildungsreaktion liegt im Bereich von ungefähr 1 Protein : 5 Polymer bis ungefähr 1 Protein : 30 Polymer. Wie oben erwähnt, bezeichnet ein erfindungsgemäßes "wasserlösliches Polymer" ein Polymer oder ein Gemisch aus Polymeren, welches vorzugsweise in der Lage ist, mit dem Makromolekül (z.B. Protein oder anderes Molekül) zu interagieren, um einen Volumenausschluss zu verursachen. Daher schließt das bevorzugte Verfahren die Verwendung eines vollständig wässrigen Systems ein, an dem kein Öl oder keine organischen Lösungsmittel beteiligt sind.
  • Geeignete wasserlösliche Polymere schließen lösliche gerade oder verzweigte Polymere ein, vorzugsweise jene, welche ein hohes Molekulargewicht aufweisen. Polymere können hoch wasserlöslich, mittelmäßig wasserlöslich oder schwach wasserlöslich sein (mehr als 2% Gew./Vol. wasserlöslich). Die bevorzugten wasserlöslichen Polymere sind wasserlöslich oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel löslich. Die wasserlöslichen Polymere können gelöst werden, indem sie zuerst in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst werden, und anschließend die Polymerlösung mit einem wässrigen Lösungsmittel vereinigt wird. In den insbesondere bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Polymere aus wasserlöslichen Polymeren ausgewählt, welche in Tabelle 2 dargestellt sind. In den insbesondere bevorzugten Ausführungsformen ist das wasserlösliche Polymer ein Kohlenhydrat-basiertes Polymer.
  • Das bevorzugte Polymer ist Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol, Dextran, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer, Polyvinylalkohol, Stärke, Hetastärke oder Gemische davon, deren Eigenschaften unten detaillierter beschrieben werden. Das Polymer oder Polymergemisch kann gemäß den in dem U.S. Patent Nr. 5,525,519 an James E. Woiszwillo oder der PCT Patentanmeldung Nr. US93-00073 (internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/14110 ), angemeldet am 7. Jan. 1993 und veröffentlicht am 22. Jul. 1993 von James E. Woiszwillo, beide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen, dargestellten Verfahren hergestellt werden, in welchen das Polymer in Wasser oder einer wässrigen Lösung, wie einem Puffer, in einer Konzentration zwischen ungefähr 1 und 50 g/100 ml, abhängig vom Mole kulargewicht des Polymers, gelöst wird. Die bevorzugte Gesamt-Polymer-Konzentration in der Polymer-Lösung beträgt zwischen 10% und 80%, ausgedrückt als Gewicht/Volumenprozent. Die bevorzugte Konzentration von jedem Polymer in der Polymer-Lösung beträgt zwischen 5% und 50%. Wie oben diskutiert, kann der pH-Wert der Polymer-Lösung vor dem Vereinigen mit dem Makromolekül eingestellt werden, sodass das Hinzufügen des Polymers eine pH-Wert-Einstellung der Makromolekül-Lösung verursacht, am meisten bevorzugt innerhalb einer pH-Wert-Einheit des pl. Der pH-Wert kann während der Herstellung der Polymer-Lösung durch Herstellen des Polymers in einem Puffer, welcher einen vorbestimmten pH-Wert aufweist, eingestellt werden. Alternativ kann der pH-Wert nach der Herstellung der Polymer-Lösung mit einer Säure oder einer Base eingestellt werden.
  • Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer, auch als Poloxamer bekannt, wird von BASF (Parsippany, N.J.) verkauft und ist in einer Vielzahl von Formen mit verschiedenen relativen prozentualen Anteilen von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen innerhalb des Copolymers verfügbar.
  • PVP ist ein nicht ionogenes, hydrophiles Polymer, welches ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 10.000 bis 700.000 und die chemische Formel (C6H9NO)[n] aufweist. PVP ist auch als Poly[1-(2-oxo-1-pyrrolidinyl)ethylen], PovidonTM, PolyvidonTM, RP 143TM, KollidonTM, Peregal STTM, PeristonTM, PlasdoneTM, PlasmosanTM, ProtagentTM, SubtosanTM und VinisilTM bekannt. PVP ist nicht toxisch, hoch hygroskopisch und löst sich leicht in Wasser oder organischen Lösungsmitteln.
  • Polyethylenglycol (PEG), auch als Poly(oxyethylen)glycol bekannt, ist ein Kondensationspolymer aus Ethylenoxid und Wasser, welches die allgemeine chemische Formel HO(CH2CH2O)[n]H aufweist. Tabelle 2. Wasserlösliche Polymere
    WASSERLÖSLICHE POLYMERE
    1) Kohlenhydrat-basierte Polymere, wie Methylcelullose, Carboxymethylcellulosebasierte Polymere, Dextran, Polydextrose, derivatisierte Chitine, Chitosan und Stärke (einschließlich Hetastärke) und Derivate davon, 2) polyaliphatische Alkohole, wie Polyethylenoxid und Derivate davon, einschließlich Polyethylenglycol (PEG), PEG-Acrylate, Polyethylenimin, Polyvinylacetat und Derivate davon, 3) Poly(vinyl)polymere, wie Poly(vinyl)alkohol, Poly(vinyl)pyrrolidon, Poly(vinyl)phosphat, Poly(vinyl)phosphonsäure und Derivate davon, 4) Polyacrylsäuren und Derivate davon, 5) polyorganische Säuren, wie Polymaleinsäure und Derivate davon, 6) Polyaminosäuren, wie Polylysin und Polyiminosäuren, wie Polyiminothyrosin und Derivate davon, 7) Copolymere und Blockcopolymere, wie Poloxamer 407 oder Pluronic L-101 TM Polymer und Derivate davon, 8) tert-Polymere und Derivate davon, 9) Polyether, wie Poly(tetramethylenetherglycol) und Derivate davon, 10) natürlich vorkommende Polymere, wie Zein und Pullulan und Derivate davon, 11) Polyimide, wie Poly-n-tris(hydroxymethyl)methylmethacrylat und Derivate davon, 12) grenzflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylensorbitan und Derivate davon, 13) Polyester, wie Poly(ethylenglycol)(n)monomethylethermono(succinimidylsuccinat)ester und Derivate davon, 14) verzweigte und zyklische Polymere, wie verzweigtes PEG und Cyclodextrine und Derivate davon und 15) Polyaldehyde, wie Poly(perfluorpropylenoxid-b-perfluorformaldehyd) und Derivate davon.
  • Dextran ist ein Begriff, welcher für Polysaccharide verwendet wird, die von Bakterien hergestellt werden, welche auf einem Saccharosesubstrat wachsen. Native Dextrane, welche von Bakterien, wie Leuconostoc mesenteroides und Lactobacteria dextranicum hergestellt werden, weisen gewöhnlich ein hohes Molekulargewicht auf. Dextrane sind routinemäßig verfügbar und werden in injizierbarer Form als Plasmaexpander in Menschen verwendet.
  • Polyvinylalkohol (PVA) ist ein Polymer, welches durch Ersetzen der Acetatgruppen mit Hydroxylgruppen aus Polyvinylacetaten hergestellt wird und die Formel (CH2CHOH)[n] aufweist. Die meisten Polyvinylalkohole sind in Wasser löslich.
  • PEG, Dextran, PVA und PVP sind kommerziell von Chemieanbietern, wie der Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) verfügbar.
  • Am meisten bevorzugt ist das Polymer ein Polymergemisch, welches eine wässrige Lösung aus PVP, welches ein Molekulargewicht zwischen 10.000 und 360.000, am meisten bevorzugt 40.000 aufweist, und PEG, welches ein Molekulargewicht zwischen 200 und 35.000 aufweist, enthält. PVP, welches ein Molekulargewicht von 40.000 aufweist, und PEG, welches ein Molekulargewicht von 3500 aufweist, sind bevorzugt. Vorzugsweise wird das PVP in einem Acetat-Puffer gelöst, und PEG wird zu der wässrigen PVP-Lösung hinzugefügt. Die Konzentration von jedem Polymer beträgt vorzugsweise zwischen 1 und 40 g/100 ml, abhängig vom Molekulargewicht jeden Polymers. Gleiche Konzentrationen von PVP und PEG stellen im Allgemeinen das am meisten bevorzugte Polymer-Gemisch für die Bildung von Mikrokugeln bereit.
  • Ein alternativ bevorzugtes Polymer ist ein Dextran, welches ein Molekulargewicht von ungefähr 3000 bis 500.000 Dalton aufweist.
  • Das Volumen des Polymers, welches zu dem Makromolekül hinzugefügt wird, variiert abhängig von der Größe, der Menge und der Konzentration des Makromoleküls. Vorzugsweise werden zwei Volumina des Polymergemisches bei einer 5–50 Gesamt-Polymer-Konzentration zu einem Volumen einer Lösung hinzugefügt, welche das Makromolekül enthält. Das Polymer liegt während der Reaktion mit dem Makromolekül in einer flüssigen Phase vor.
  • In bestimmten der Ausführungsformen und insbesondere in den Ausführungsformen der Mikrokugeln, welche kein weiteres komplexierendes Mittel enthalten, ist das wasserlösliche Polymer vorzugsweise nicht PEG, PVP, Dextran, Nonylphenolethoxylate und/oder Polyvinylalkohol.
  • Komplexierende Mittel
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche weiterhin ein komplexierendes Mittel einschließt, bereitgestellt. Wie hier verwendet, bezeichnet ein "komplexierendes Mittel" ein Molekül, welches in der Lage ist, ein Beladen, Zurückhalten und/oder anderweitiges Verzögern der Freisetzung des therapeutischen Mittels aus der Mikrokugel zu erleichtern (siehe z.B. Tabelle 3). In bestimmten Ausführungsformen schließt die Mikrokugel dieses Aspekts: (1) ein Makromolekül, wie ein Protein (z.B. Albumin, wie oben beschrieben), (2) mindestens ein wasserlösliches Polymer (z.B. Hetastärke, PEG/PVP, wie oben beschrieben) und (3) ein komplexierendes Mittel ein. Tabelle 3. Komplexierende Mittel
    KOMPLEXIERENDE MITTEL
    IONISCH ANDERE INTERAKTION
    POLYANIONISCH POLYKATIONISCH (einschließlich nicht-ionischer und gemischt ionischer und nichtionischer Interaktionen)
    Dextransulfat Polylysin Albumin
    Heparinsulfat Polyarginin IgG
    Heparansulfat Polyiminosäuren IgM
    Chondroitinsulfat Polyiminotyrosin hydrophobe Polymere
    Na-Polystyrolsulfonat Cholestyraminharz Silikon
    Carboxymethylcellulose Diethylaminoethyl Zein
    Polyasparaginsäure Cellulose Lignin
    Polyglutaminsäure Polycitrullin Fettsäuren
    Polyornithin Phospholipide
    Gelatine
    zweiwertige Kationen (z.B. Calcium, Magnesium, Zink)
  • In bestimmten insbesondere bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung schließen die Mikrokugeln: (1) ein Trägerprotein, (2) ein wasserlösliches Polymer, (3) ein erstes komplexierendes Mittel, welches ein polyanionisches Polysaccharid ist, wie Dextransulfat, Galacturonsäuren, Alginate, Mannuronsäure, Gu luronsäure, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfate, Heparin, Chitin, Chitosan, Glycosaminoglycane, Proteoglycane und kationische komplexierende Mittel (d.h. komplexierende Mittel, welche eine positive Ladung aufweisen) und (4) ein zweites komplexierendes Mittel, welches ein zweiwertiges Metallkation ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium, Magnesium, Zink, Strontium, Barium, Mangan und Eisen, ein. In den bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts stellt das Trägerprotein ein Albumin oder ein Immunglobulin oder ein anderes Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Trägerproteinen aus Tabelle 1 dar. Im Allgemeinen enthalten die Mikrokugeln dieses Aspekts der Erfindung von ungefähr 40 bis weniger als 100% Protein. In den bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts ist das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe, bestehend aus den wasserlöslichen Polymeren aus Tabelle 2, vorzugsweise einem Kohlenhydrat-basierten Polymer und weiter bevorzugt einer Hydroxyethylstärke, ausgewählt.
  • Wie in anderen Aspekten der Erfindung weisen diese Mikrokugeln vorzugsweise eine glatte Oberfläche auf, welche eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, die weniger als 1000 Angström betragen, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung bestimmt wurde, und enthalten vorzugsweise kein nachweisbares Öl oder organisches Lösungsmittel.
  • Ein bevorzugtes Verfahren des Einschließens eines/von ionischen komplexierenden Mittels/n liegt darin, den/die ionischen Komplexbildner mit einem wasserlöslichen Polymer in wässriger Lösung und dem Protein in wässriger Lösung zu vereinigen und die Mikrokugel mit Hitze oder mit vernetzenden Mitteln zu stabilisieren.
  • Im Allgemeinen stellt das komplexierende Mittel ein ionisches komplexierendes Mittel (d.h. das komplexierende Mittel ist zu einer ionischen Interaktion fähig) oder ein nicht-ionisches komplexierendes Mittel (d.h. das komplexierende Mittel ist zu einer nicht-ionischen (z.B. hydrophoben) Interaktion fähig) oder ein Mittel mit sowohl ionischen als auch nicht-ionischen Interaktionen (z.B. IgG) dar. Beispielhafte nicht-ionische komplexierende Mittel und ionische komplexierende Mittel, wie ani onische komplexierende Mittel (d.h. komplexierende Mittel, welche eine negative Ladung aufweisen) und kationische komplexierende Mittel (d.h. komplexierende Mittel, welche eine positive Ladung aufweisen) werden in Tabelle 3 bereitgestellt.
  • In bestimmten Ausführungsformen stellt das komplexierende Mittel ein anionisches komplexierendes Mittel dar, welches die Struktur der Formel I: POLY-[Y-]n X+ I.aufweist, wobei POLY eine Hauptkette des anionischen komplexierenden Mittels darstellt, welche gerade oder verzweigt sein kann,
    wobei Y- eine anionische Gruppe darstellt, z.B. Sulfate, Carboxyle, Phosphate, Nitrate, Carbonate und desgleichen, welche an irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Hauptkette gekoppelt sein kann,
    wobei X+ eine kationische Gruppe darstellt, welche z.B. ein Gegenion zu der anionischen Gruppe darstellt,
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10.000 ist, vorzugsweise von 5 bis 100 und weiter bevorzugt von 5 bis 1000 und noch weiter bevorzugt von 5 bis 10.000, und
    wobei die n Y--Gruppen gleich oder verschieden sein können, wenn n größer als 1 ist.
  • In noch anderen Ausführungsformen der Erfindung stellt das komplexierende Mittel ein kationisches komplexierendes Mittel dar, welches die Struktur der Formel II: POLY-[X+]n Y II.aufweist, wobei POLY eine Hauptkette des kationischen komplexierenden Mittels darstellt, welche gerade oder verzweigt sein kann,
    wobei X+ eine kationische Gruppe darstellt, z.B. eine Aminogruppe, welche an irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Hauptkette gekoppelt sein kann,
    wobei Y- eine anionische Gruppe darstellt, welche ein Gegenion zu der kationischen Gruppe darstellt,
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10.000 ist, vorzugsweise von 5 bis 100 und weiter bevorzugt von 5 bis 1000 und am meisten bevorzugt von 5 bis 10.000, und
    wobei die n X--Gruppen gleich oder verschieden sein können, wenn n größer als 1 ist.
  • Aktive Mittel
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Mikrokugel, welche weiterhin ein aktives Mittel einschließt, bereitgestellt. Beispielhafte Kategorien aktiver Mittel werden in Tabelle 4 bereitgestellt. Tabelle 4. Therapeutische Mittel: Kategorien
    THERAPEUTISCHE MITTEL – KATEGORIEN
    Hormone, Antibiotika und andere antiinfektiöse Mittel, Hämatopoietika, Thrombopoietika, Mittel, Antidemenzmittel, antivirale Mittel, Antitumormittel (chemotherapeutische Mittel), Antipyretika, Analgetika, Antientzündungsmittel, Antiulcusmittel, antiallergische Mittel, Antidepressiva, psychotrope Mittel, Kardiotonika, antiarrhythmische Mittel, Vasodilatoren, Blutdruck senkende Mittel, wie Blutdruck senkende Diuretika, antidiabetische Mittel, Antikoagulanzien, Cholesterin senkende Mittel, therapeutische Mittel für Osteoporose, Enyzme, Impfstoffe, immunologische Mittel und Hilfsstoffe, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Nukleotide und Nukleinsäuren; Kohlenhydrate und Polysaccharide; Viren und Virusteilchen; Konjugate oder Komplexe aus kleinen Molekülen und Proteinen oder Gemische davon und organische oder anorganische synthetische pharmazeutische Arzneimittel.
  • Die Mikrokugeln, in welche das aktive Mittel geladen werden kann, können ein komplexierendes Mittel einschließen, um die Beladung zu vereinfachen und/oder die Freisetzung des aktiven Mittels aus der Mikrokugel zu modifizieren. Alternativ kann das aktive Mittel in die oben beschriebenen Mikrokugeln, welchen ein komplexierendes Mittel fehlt, geladen werden, z.B. kann das Protein und/oder das erfindungsgemäße wasserlösliche Polymer mit dem aktiven Mittel interagieren, um das Beladen zu vereinfachen und/oder seine Freisetzung aus der Mikrokugel zu modifizieren. Obwohl das aktive Mittel in eine erfindungsgemäße Mikrokugel während der Herstellung der Mikrokugel geladen werden kann, ist es bevorzugt, das aktive Mittel in eine fertiggestellte erfindungsgemäße Mikrokugel zu laden und, weiter bevorzugt, das aktive Mittel in eine fertiggestellte Mikrokugel zu laden, welche (ein) komplexierende(s) Mittel enthält, um das Beladen und/oder die retardierte Freisetzung des Mittels zu vereinfachen. Im Gegensatz zu Hydrogel-Mikrokugeln, quellen die erfindungsgemäßen Mikrokugeln in Wasser nicht wesentlich, und die stabilisierten Mikrokugeln benötigen weiterhin keine Quellung, um eine retardierte Freisetzung des therapeutischen Proteins und/oder physiologisch aktiven Mittels aus der Mikrokugel bereitzustellen.
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein "aktives Mittel" ein Mittel, welches eine diagnostische oder therapeutische Aktivität aufweist. Demgemäß schließt ein aktives Mittel gegebenenfalls eine nachweisbare Markierung (z.B. eine radioaktive Markierung) ein, welche geeignet zum Identifizieren der Positionen des freigesetzten Mittels in vivo ist. Aktive Mittel schließen auch therapeutische Mittel ein, welche zum Behandeln einer Erkrankung oder eines Zustandes geeignet sind. In bestimmten Ausführungsformen sind die bevorzugten physiologischen aktiven Mittel Protein- oder Peptidmittel. Solche Protein- oder Peptid-Mittel können typischerweise weiterhin in Kategorien eingeteilt werden, basierend auf der Aktivität des Mittels oder des Typs der Erkrankung oder des Zustandes, welcher behandelt wird. Das physiologisch aktive Mittel, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt die Kategorien der Antibiotika, hämatopoietischen Mittel, antinfektiösen Mittel, Antidemenzmittel, antiviralen Mittel, Antitumormittel, Antipyretika, A nalgetika, Antientzündungsmittel, Antiulcusmittel, antiallergischen Mittel, Antidepressiva, psychotropen Mittel, Kardiotonika, antiarrhythmischen Mittel, Vasodilatoren, Blutdruck senkenden Mittel, wie Blutdruck senkende Diuretika, antidiabetischen Mittel, Antikoagulanzien, Cholesterin senkenden Mittel, therapeutischen Mittel für Osteoporose, Hormone, Impfstoffe und so weiter (siehe z.B. Tabelle 4) ein, aber ist nicht darauf beschränkt. Obwohl spezifische Beispiele aktiver Mittel (z.B. Peptid und Nicht-Peptid-Mittel) zur erfindungsgemäßen Verwendung unten erwähnt werden, bedeutet dies nicht, dass andere Peptid- oder Nicht-Peptid-Mittel ausgeschlossen sind. Diese aktiven Mittel können natürlich vorkommende, rekombinant oder chemisch synthetisierte Substanzen sein.
  • Die erfindungsgemäßen physiologisch aktiven Mittel schließen Protein- oder Peptid-Mittel, sowie Nicht-Protein- oder Nicht-Peptid-Mittel ein. Zur Vereinfachung der Diskussion werden solche Protein- oder Peptid-Mittel hier zusammengenommen als Peptid-Mittel bezeichnet, Nicht-Protein- und Nicht-Peptid-Mittel sollen hier zusammengenommen als Nicht-Peptid-Mittel bezeichnet werden. Beispielhafte Nicht-Peptid-Mittel schließen die folgenden, nicht beschränkenden, Kategorien von Mitteln ein: a) Nukleotide und Nukleinsäuren, b) Kohlenhydrate und Polysaccharide, c) Viren und Virusteilchen, d) Konjugate oder Komplexe aus kleinen Molekülen und Proteinen oder Gemische davon und e) organische oder anorganische natürliche oder synthetische pharmazeutische Arzneimittel. Eine weitere Beschreibung dieser und anderer Mittel, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, ist in den U.S. Patenten Nr. 5,482,706 , 5,514,670 und 4,357,259 beschrieben, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Die bevorzugten physiologisch aktiven Peptid-Mittel schließen Peptidhormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Faktoren, welche auf das kardiovaskuläre System wirken, Faktoren, welche auf das zentrale und periphere Nervensystem wirken, Faktoren, welche auf humorale Elektrolyten und hämale organische Substanzen wirken, Faktoren, welche auf den Knochen und das Skelett wirken, Faktoren, welche auf das Gastrointestinalsystem wirken, Faktoren, welche auf das Immunsys tem wirken, Faktoren, welche auf das respiratorische System wirken, Faktoren, welche auf die Geschlechtsorgane wirken und Enzyme ein.
  • Beispielhafte Hormone schließen Insulin, Wachstumshormon, Parathyroidhormon, luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LH-RH), adrenokortikotropes Hormon (ACTH), Amylin, Oxytocin, luteinisierendes Hormon, (D-Tryp6)-LHRH, Nafarelinacetat, Leuprolidacetat, Follikel stimulierendes Hormon, Glucagon, Prostaglandine, PGE1, PGE2 und andere Faktoren, welche auf die Geschlechtsorgane wirken und ihre Derivate, Analoge und Kongenere ein. Als Analoge des LH-RH können solche bekannte Substanzen erwähnt werden, wie jene, welche in den U.S. Pat. Nr. 4,008,209 , 4,086,219 , 4,124,577 , 4,317,815 und 5,110,904 beschrieben sind.
  • Beispielhafte Antibiotika schließen Tetracyclin, Aminoglycoside, Penicilline, Cephalosporine, Sulfonamid-Arzneimittel, Chloramphenicolnatriumsuccinat, Erythromycin, Vancomycin, Lincomycin, Clindamycin, Nystatin, Amphotericin B, Amantidin, Idoxuridin, p-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Rifampin, Antinomycin D, Mithramycin, Daunomycin, Adriamycin, Bleomycin, Vinblastin, Vincristin, Procarbazin, Imidazolcarboxamid ein.
  • Beispielhafte hämatopoietische oder thrombopoietische Faktoren schließen neben anderen Erythropoietin, Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Granulocyten-Makrophagen-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), eine Leukozyten-Proliferationsfaktorpräparation (Leucoprol, Morinaga Milk), Thrombopoietin, Blutplättchen-Proliferations-stimulierenden Faktor, Megakaryozyten-Proliferations(stimulierenden)-Faktor und Faktor VIII ein.
  • Beispielhafte Antidemenzmittel schließen Selegelen ein.
  • Beispielhafte antivirale Mittel schließen Amantidin und Proteaseinhibitoren ein.
  • Beispielhafte Antitumormittel schließen Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol und Methotrexat ein. Beispielhafte Antipyretika und Analgetika schließen Aspirin, Motrin, Ibuprofin, Naprosyn, Indocin und Acetaminophen ein.
  • Beispielhafte Antientzündungsmittel schließeb NSAIDS, Aspirin, Steroide, Dexamethason, Hydrokortison, Prednisolon und Diclofenac-Na ein.
  • Beispielhafte Antiulcusmittel schließen Famotidin, Cimetidin, Nizatidin, Ranitidin und Sucralfat ein.
  • Beispielhafte antiallergische Mittel schließen Antihistamine, Diphenydramin, Loratadin und Chlorpheniramin ein.
  • Beispielhafte Antidepressiva und pyschotrope Mittel schließen Lithium, Amitryptalin, trizyklische Antidepressiva, Fluoxetin, Prozac und Paroxetin ein.
  • Beispielhafte Kardiotonika schließen Digoxin ein.
  • Beispielhafte antiarrhythmische Mittel schließen Metoprolol und Procainamid ein.
  • Beispielhafte Vasodilatoren schließen Nitroglycerin, Nifedipin und Isosorbiddinitrat ein.
  • Beispielhafte Diuretika schließen Hydrochlorthiazid und Furosemid ein.
  • Beispielhafte Blutdruck senkende Mittel schließen Captopril, Nifedipin und Atenolol ein.
  • Beispielhafte antidiabetische Mittel schließen Glucozid, Chloropropamid, Metformin und Insulin ein.
  • Beispielhafte Antikoagulanzien schließen Warfarin, Heparin und Hirudin ein.
  • Beispielhafte Cholesterin senkende Mittel schließen Lovastatin, Cholestyamin und Clofibrat ein.
  • Beispielhafte therapeutische Mittel zum Behandeln von Osteoporose und andere Faktoren, welche auf den Knochen und das Skelett wirken, schließen Calcium, Alendronat, Knochen-GLa-Peptid, Parathyroidhormon und seine aktiven Fragmente (Osteostatin, Endocrinology, 129 324, 1991), Histon-H4 verwandtes Knochenbildungs- und Proliferationspeptid (OGP, The EMBO Journal 11, 1867, 1992) und ihre Muteine, Derivate und Analoge davon ein.
  • Beispielhafte Enzyme und Enzymcofaktoren schließen: Pankrease, L-Asparaginase, Hyaluronidase, Chymotrypsin, Trypsin, tPA, Streptokinase, Urokinase, Pankreatin, Collagenase, Trypsinogen, Chymotrypsinogen, Plasminogen, Streptokinase, Adenylcyclase und Superoxiddismutase (SOD) ein.
  • Beispielhafte Impfstoffe schließen Hepatitis B, MMR (Masern, Mumps und Röteln) und Polio Impfstoffe ein.
  • Beispielhafte immunologische Adjuvantien schließen: Freund'sches Adjuvans, Muramyldipeptide, Concanavalin A, BCG und Levamisol ein.
  • Beispielhafte Cytokine schließen Lymphokine, Monokine, hämatopoietische Faktoren und so weiter ein. Lymphokine und Cytokine, welche für den erfindungsgemäßen Gebrauch geeignet sind, schließen Interferone (z.B. Interferon-alpha, -beta und -gamma), Interleukine (z.B. Interleukin 2 bis 11) und so weiter ein. Monokine, welche für den erfindungsgemäßen Gebrauch geeignet sind, schließen Interleukin-1, Tumor-Nekrose-Faktoren (z.B. TNF-alpha und -beta), malignen Leukozyten-Inhibitionsfaktor (LIF) und so weiter ein.
  • Beispielhafte Wachstumsfaktoren (GF für engl.: growth factor) schließen Nervenwachstumsfaktoren (NGF, NGF-2/NT-3), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF für engl.: platelet-derived cell growth factor), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) und so weiter ein.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf das kardiovaskuläre System wirken, schließen Faktoren ein, welche den Blutdruck, die Arteriosklerose, usw. kontrollieren, wie Endotheline, Endothelininhibitoren, Endothelinantagonisten, welche in den EP 436189 , 457195 , 496452 und 528312 , JP [Offenlegung] Nr. H-3-94692/1991 und 130299/1991 beschrieben sind, Endothelin herstellende Enzyminhibitoren Vasopressin, Renin, Angiotensin I, Angiotensin II, Angiotensin III, Angiotensin I Inhibitor, Angiotensin II Rezeptorantagonist, atriales natriuretisches Peptid (ANP), antiarrhythmisches Peptid und so weiter.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf das zentrale und periphere Nervensystem wirken, schließen Opioid-Peptide (z.B. Enkephaline, Endorphine), neurotropen Faktor (NTF), Calcitonin-Gen verwandtes Peptide (CGRP für engl.: calcitonin generelated peptide), Schilddrüsenhormon freisetzendes Hormon (TRH für engl.: thyroid hormone releasing hormone), Salze und Derivate von TRH [ JP [Offenlegung] Nr. 50-121273/1975 ( U.S. Pat. Nr. 3,959,247 ), JP [Offenlegung] Nr. 52-116465/1977 ( U.S. Pat. Nr. 4,100,152 )], Neurotensin und so weiter ein.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf das Gastrointestinalsystem wirken, schließen Sekretin und Gastrin ein.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf humorale Elektrolyte und hämale organische Substanzen wirken, schließen Faktoren ein, welche die Hämagglutination, den Cholesterin-Plasmaspiegel oder die Metallionenkonzentrationen regulieren, wie Calcitonin, Apoprotein E und Hirudin. Laminin und intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM 1) stellen beispielhafte Zelladhäsionsfaktoren dar.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf die Niere und die Harnorgane wirken, schließen Substanzen ein, welche die Funktion der Niere regulieren, wie Gehirnabgeleitetes-natriuretisches Peptid (BNP für engt.: brain-derived natriuretic Peptide), Urotensin und so weiter.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf die Sinnesorgane wirken, schließen Faktoren ein, welche die Sensitivität der verschiedenen Organe kontrollieren, wie Substanz P.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf das Immunsystem wirken, schließen Faktoren ein, welche Entzündung und maligne Neoplasmen kontrollieren, und Faktoren, welche infektiöse Mikroorganismen angreifen, wie chemotaktische Peptide und Bradykinine.
  • Beispielhafte Faktoren, welche auf das respiratorische System wirken, schließen Faktoren ein, welche mit asthmatischen Antworten verbunden sind.
  • Auch eingeschlossen sind natürlich vorkommende, chemisch synthetisierte oder rekombinante Peptide oder Proteine, welche als Antigene wirken können, wie Zedernpollen und Ambrosienpollen. Diese Faktoren werden in den erfindungsgemäßen Formulierungen entweder unabhängig, gekoppelt an Haptene oder zusammen mit einem Adjuvans verabreicht.
  • Mikrokugelbildung, Stabilisierung und Charakterisierung
  • Das Verfahren zum Bilden der erfindungsgemäßen Mikrokugeln umfasst: (1) Vereinigen in einer oder mehreren wässrigen Lösungen, von einem Makromolekül, wie einem Protein, einem wasserlöslichen Polymer (z.B. ein Kohlenhydratbasiertes Polymer) und (einem) komplexierenden Mittel/n, um ein wässriges Gemisch (entweder als ein Ein- oder Multiphasensystem) zu bilden und, vorzugsweise, (2) Aussetzen des wässrigen Gemisches einem vernetzenden Mittel (z.B. EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylcarbodiimid]) und/oder einer Energiequelle, für eine Zeit, welche ausreicht, um eine Mikrokugel zu bilden, insbesondere eine Mikrokugel, welche eine glatte Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, die weniger als 1000 Angström im Durchmesser betragen, wie durch Gasadsorptionstechnik zur Poren-Größenmessung bestimmt wurde. Beispielhafte Verfahren zum Herstellen der Mikrokugel werden in den Beispielen bereitgestellt.
  • Die insbesondere bevorzugten Ausführungsformen stellen Mikrokugeln dar, welche:
    • (1) ein Trägerprotein,
    • (2) ein wasserlösliches Polymer,
    • (3) ein erstes komplexierendes Mittel, das ein polyanionisches Polysaccharid ist, und
    • (4) ein zweites komplexierendes Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation, vorzugsweise Calcium oder Magnesium, ist, einschließen. Aktive Mittel, wie therapeutische Mittel oder diagnostische Mittel können in diese Mikrokugeln, ihrer Bildung nachfolgend, eingeführt werden. Das bevorzugte Verfahren zum Bilden dieser insbesondere bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst: (1) in einer oder mehreren wässrigen Lösungen im Wesentlichen gleichzeitiges Vereinigen des Trägerproteins, des wasserlöslichen Polymers, des ersten komplexierenden Mittels und des zweiten komplexierenden Mittels, um ein wässriges Gemisch zu bilden, und (2) Ermöglichen, dass sich die Mikrokugeln bilden. Gegebenenfalls können die Mikrokugeln weiterhin einem vernetzenden Mittel ausgesetzt werden, um die Mikrokugeln weiter zu stabilisieren. Mit "im Wesentlichen gleichzeitig" ist gemeint, dass das zweite komplexierende Mittel (vorzugsweise Calcium oder Magnesium) innerhalb von ungefähr 30 Minuten vom Hinzufügen der anderen bildenden Bestandteile hinzugefügt wird. Die Anmelder haben entdeckt bzw. herausgefunden, dass das Hinzufügen von Calcium oder Magnesium zu dem wässrigen Gemisch, welches kein im Wesentlichen gleichzeitiges Hinzufügen darstellt, eher zur Bildung von Aggregaten und anderen amorphen Teilchenformen führt, als zu den kugelförmigen Mikrokugeln, welche gebildet werden, wenn das Calcium oder Magnesium im Wesentlichen gleichzeitig mit den anderen Bestandteilen während des Bildungsverfahrens der Mikrokugel vereinigt wird.
  • Mikrokugeln können durch Inkubieren der gebildeten Mikrokugeln in Anwesenheit eines vernetzenden Mittels und/oder einer Energiequelle (z.B. Hitze) für eine vorbestimmte Zeitdauer stabilisiert werden. Beispielhafte vernetzende Mittel schließen Dialdehyde, Amine, mehrwertige Ionen, multifunktionale Moleklüle, welche eine Affinität für spezifische reaktive Gruppen an dem Makromolekül, welches vernetzt werden soll, aufweisen, N-substituierte Maleimide, bifunktionale Alkylhalogenide, Arylhalogenide, Isocyanate, aliphatische oder aromatische Dicarbonsäuren, aliphatische oder aromatische Disulfonsäuren, bifunktionale Imidoester und Vinylsulfone ein. Zusätzliche vernetzende Mittel und Verfahren, um dieselben zu verwenden, um eine Mikrokugel zu stabilisieren, sind in der U.S. 5,578,709 , erteilt an K. Woiszwillo, beschrieben, deren gesamter Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die bevorzugte Energiequelle ist Hitze. Es wird jedoch vom Fachmann verstanden werden, dass andere Energiequellen Hitze, Strahlung und Ionisation, alleine oder in Verbindung mit Ultraschallbehandlung, Vortexen, Mischen oder Rühren, einschließen. Die Mikrokugelbildung und/oder -stabilisierung kann unmittelbar beim Aussetzen gegenüber der Energiequelle auftreten oder kann ein verlängertes Aussetzen gegenüber der Energiequelle benötigen, abhängig von den Eigenschaften der Bestandteile und Bedingungen. Vorzugsweise wird das Makromolekül-Polymer-Lösungsgemisch in einem Wasserbad bei einer Temperatur von mehr als oder genau 37°C und weniger als oder genau 90°C für zwischen ungefähr 5 Minuten und 2 Stunden inkubiert. Am meisten bevorzugt wird das Gemisch für 5–30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 50°C und 90°C inkubiert. Es sollte erwähnt werden, dass Mikrokugeln bei Verwendung einer höheren Makromolekülkonzentration bei niedrigeren Temperaturen gebildet werden können. Die maximale Inkubationstemperatur wird durch die Eigenschaften des Makromoleküls und die endgültige Funktion der Mikrokugel bestimmt. Zum Beispiel wird für eine Mikrokugel, in welcher das Makromolekül ein Protein ist, eine Temperatur von weniger als ungefähr 70°C bevorzugt, um die Proteinaktivität zu erhalten.
  • Die gebildeten Mikrokugeln werden von den nicht eingeschlossenen Bestandteilen des Inkubationsgemisches mit gängigen Trennverfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, getrennt. Vorzugsweise wird das Inkubationsgemisch zentrifugiert, sodass die Mikrokugeln am Boden des Zentrifugenröhrchens sedimentieren und die nicht eingeschlossenen Bestandteile im Überstand verbleiben, welcher anschließend durch Dekantieren entfernt wird. Alternativ wird eine Suspension, welche gebildete Mikrokugeln enthält, gefiltert, sodass die Mikrokugeln auf dem Filter zurückbleiben und die nicht eingeschlossenen Bestandteile durch den Filter fließen.
  • Eine weitere Aufreinigung der Mikrokugeln wird durch Waschen in einem geeigneten Volumen einer Waschlösung erreicht. Die bevorzugte Waschlösung ist ein Puffer, am meisten bevorzugt eine nichtionische wässrige Lösung oder eine nichtionische wässrige Lösung, welche wasserlösliche Polymere enthält. Wiederholte Waschschritte können wenn nötig verwendet werden, und die Mikrokugeln können aus der Waschlösung wie oben beschrieben getrennt werden.
  • Wie oben erwähnt, können die Eigenschaften der Mikrokugeln durch Manipulieren der Inkubationsbedingungen verändert werden. Zum Beispiel kann die Freisetzungskinetik der Mikrokugeln durch Anheben der Reaktionstemperatur oder Ausweiten der Länge der Reaktionszeit während der Mikrokugelbildung verlangsamt werden. Die Freisetzungskinetik wird auch durch Auswählen unterschiedlicher Polymere, unterschiedlicher Konzentrationen der Polymere oder unterschiedlicher Verhältnisse der Polymere, welche bei der Bildung der Mikrokugeln verwendet werden, manipuliert.
  • Die Größe, Form und Freisetzungskinetik der Mikrokugel kann auch durch Anpassen der Bedingungen der Mikrokugelbildung kontrolliert werden. Zum Beispiel können die Bedingungen der Teilchenbildung optimiert werden, um kleinere oder größere Teilchen herzustellen, oder die Gesamtinkubationszeit oder Inkubations temperatur kann angehoben werden, was zu Teilchen führt, welche eine verlängerte Freisetzungskinetik aufweisen.
  • Nukleinsäure-Mikrokugeln
  • Gemäß noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Mikrokugeln, in welchen das Makromolekül eine Nukleinsäure ist, bereitgestellt. Die Nukleinsäure enthaltenden Mikrokugeln schließen: (1) eine Nukleinsäure (z.B. ein Plasmid, viralen Vektor, Oligonukleotid, eine RNA, Antisense und Missense Nukleinsäuren), (2) (ein) polykationische/s Polymer/e (z.B. Polylysin) und (3) ein wasserlösliches Polymer (wie oben beschrieben) ein. Gemäß einem verwandten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zum Bilden der Nukleinsäure enthaltenden Mikrokugeln bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: (1) Vereinigen in einer oder mehreren wässrigen Lösungen, von (einer) Nukleinsäure/n, (einem) polykationischem/n Polymer/en und (einem) wasserlöslichen Polymer/en, um ein wässriges Gemisch zu bilden und (2) Aussetzen des wässrigen Gemisches einem vernetzenden Mittel und/oder einer Energiequelle für eine Zeit, welche ausreicht, um eine Mikrokugel zu bilden. Beispielhafte Verfahren zum Bilden der Nukleinsäure-Mikrokugeln werden in den Beispielen bereitgestellt.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung des Materials und ein Verfahren zum Herstellen derselben bereitgestellt. Die Zusammensetzung schließt einen Behälter ein, welcher eine Einzeldosis der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten, der durch die retardierte Freisetzung eines aktiven Mittels aus den Mikrokugeln behandelbar ist. Die Anzahl der Mikrokugeln in der Einzeldosis ist abhängig von der Menge des aktiven Mittels, welches in jeder Mikrokugel anwesend ist, und des Zeitraumes über welchen die retardierte Freisetzung gewünscht ist. Vorzugsweise wird die Einzeldosis ausgewählt, um die retardierte Freisetzung des aktiven Mittels über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis ungefähr 180 Tagen mit dem gewünschten Freisetzungsprofil zu erreichen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Spritze enthaltende Zusammensetzung bereitgestellt. Die Zusammensetzung schließt eine Spritze ein, welche eine Einzeldosis der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten, welcher durch die retardierte Freisetzung des aktiven Mittels aus den Mikrokugeln behandelbar ist, und eine an die Spritze angebrachte Nadel, wobei die Nadel eine Bohrungsgröße aufweist, welche von 14 bis 30 Gauge beträgt.
  • Bemerkenswerterweise können die bevorzugten erfindungsgemäßen Mikrokugeln so hergestellt werden, dass sie einen Umfang aufweisen, welcher die Abgabe der Mikrokugeln unter Verwendung einer nadellosen Spritze (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427 ) erlauben, wodurch die Entsorgungsprobleme, welche mit Nadeln verbunden sind, die als Abfallprodukte mit biologischer Gefährdung entsorgt werden müssen, ausgeschlossen werden. Gemäß einem insbesondere bevorzugten Aspekt der Erfindung wird daher eine nadellose Spritze bereitgestellt, welche eine oder mehrere Dosen der Mikrokugeln enthält, welche ein aktives Mittel zum Behandeln eines Zustandes enthalten. Die Mikrokugeln können so hergestellt werden, dass sie Qualitäten aufweisen, die geeignet sind, um über andere parenterale und nicht parenterale Wege abgegeben zu werden, wie oral, buccal, intrathekal, nasal, pulmonal, transdermal, transmukosal und desgleichen.
  • Anwendungen
  • Zusammenfassend können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen betrachtet werden, verschiedene Bestandteile, wie in den Tabellen beispielhaft dargestellt, unter Bedingungen zu vereinigen, um Mikrokugeln zu bilden, welche vorzugsweise wünschenswerte glatte Oberflächen-Eigenschaften aufweisen, die quantifizierbar sind, bezüglich eines Bestimmens, ob sich die Mikrokugeln gebildet haben (z.B. durch visuellen Nachweis) und bezüglich eines Bestimmens des Durchmessers der Kanalöffnungen der Mikrokugeln. In einem bestimmten ihres breitesten Aspekts sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen daher auf Mikrokugeln gerichtet, welche die erforderlichen Kanalöffnungsdimensionen aufweisen und ein Makromolekül (vorzugsweise ein Protein der Tabelle 1) und ein wasserlösliches Polymer (vorzugsweise ein Polymer der Tabelle 2) umfassen. In noch einem anderen Aspekt umfassen die Mikrokugeln ein Makromolekül (vorzugsweise ein Protein der Tabelle 1), ein wasserlösliches Polymer (vorzugsweise ein Polymer der Tabelle 2) und ein komplexierendes Mittel (vorzugsweise der Tabelle 3). In den insbesondere bevorzugten Ausführungsformen schließen die Mikrokugeln: (1) ein Trägerprotein, (2) ein wasserlösliches Polymer, (3) ein erstes komplexierendes Mittel, das ein polyanionisches Polysaccharid ist und (4) ein zweites komplexierendes Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium und Magnesium, ein. In noch weiteren Aspekten ist die Erfindung auf irgendeinen dieser Aspekte gerichtet, worin die Mikrokugeln weiterhin ein therapeutisches Mittel (vorzugsweise der Tabelle 4) umfassen. In bestimmten Ausführungsformen dieser Aspekte wird/werden daher (ein) Protein/e der Tabelle 1 mit (einem) wasserlöslichen Polymer/en der Tabelle 2 und (einem) aktiven Mittel/n der Tabelle 4 vereinigt. In noch anderen Ausführungsformen dieser Aspekte wird/werden (eine) Nukleinsäure/n mit (einem) Polykation/en der Tabelle 3, (einem) wasserlöslichen Polymer/en der Tabelle 2 und gegebenenfalls (einem) therapeutischen Mittel/n der Tabelle 4 vereinigt. Demgemäß stellen die erfindungsgemäßen Verfahren verschiedene Mikrokugeln bereit, welche für verschiedene therapeutische und diagnostische Anwendungen durch Auswählen der geeigneten Kombination der Mittel zum Erreichen des therapeutischen oder diagnostischen Ziels entworfen werden können.
  • Wenn sie therapeutisch verwendet werden, werden die erfindungsgemäßen Mikrokugeln in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Im Allgemeinen bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge die Menge des aktiven Mittels, welche nötig ist, um das Fortschreiten des besonderen zu behandelnden Zustands zu verzögern, dessen Progression zu inhibieren oder ihn insgesamt anzuhalten. Im Allgemeinen wird eine therapeutisch wirksame Menge mit dem Alter, Zustand und Geschlecht des Patienten, sowie der Natur und dem Ausmaß der Erkrankung in dem Patienten variieren, welche alle vom Fachmann bestimmt werden können. Die Dosierung kann durch den einzelnen Arzt oder Tierarzt angepasst werden, insbesondere im Fall irgendeiner Komplikation. Eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Mittels variiert typischerweise von 0,01 mg/kg bis ungefähr 1000 mg/kg, vorzugsweise von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 200 mg/kg und am meisten bevorzugt von ungefähr 0,2 mg/kg bis ungefähr 20 mg/kg, in einer oder mehreren Dosis-Verabreichungen täglich, für ein oder mehrere Tage, wöchentlich, monatlich, alle zwei oder drei Monate und so weiter.
  • Die Mikrokugeln können alleine oder in Kombination mit anderen Arzneimitteltherapien als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann die Mikrokugeln in Kombination mit irgendwelchen physiologisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Standardträgern, welche im Stand der Technik bekannt sind, einschließen. Die Zusammensetzungen sollten steril sein und eine therapeutisch wirksame Menge der Mikrokugel in einer Gewichts- oder Volumeneinheit enthalten, welche für eine Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger" bedeutet, so wie hier verwendet, einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder einkapselnde Substanzen, welche für eine Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Tier geeignet sind. Der Begriff "Träger" bezeichnet einen organischen oder anorganischen Inhaltsstoff, natürlich oder synthetisch, mit welchem der aktive Inhaltsstoff vereinigt wird, um die Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind auch in der Lage, mit den erfindungsgemäßen Molekülen und mit jedem anderen zusammen in einer Weise gemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit erheblich beeinträchtigen würde. Pharmazeutisch verträglich bedeutet weiterhin ein nicht toxisches Material, welches mit einem biologischen System, wie einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe oder einem Organismus kompatibel ist. Die Eigenschaften des Trägers werden vom Weg der Verabreichung abhängen. Physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Träger schließen Verdünnungsmittel, Füllmittel, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Trockenmittel, Füllmittel, Treibmittel, Säuerungsmittel, Beschichtungsmittel, Lösungsvermittler und andere Materialien ein, welche im Stand der Technik gut bekannt sind. Trägerformulierungen, welche für orale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre, usw. Verabreichungen geeignet sind, können in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA gefunden werden.
  • Eine Vielzahl von Verabreichungswegen ist verfügbar. Die ausgewählte besondere Art wird natürlich von dem ausgewählten besonderen Arzneimittel, der Schwere des zu behandelnden Zustandes und der Dosierung, welche für eine therapeutische Wirksamkeit benötigt wird, abhängen. Allgemein gesprochen können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung irgendeiner Art der Verabreichung angewendet werden, welche medizinisch verträglich ist, was irgendeine Art bedeutet, welche wirksame Spiegel der aktiven Verbindungen herstellt, ohne klinisch unverträgliche nachteilige Wirkungen zu verursachen. Solche Arten der Verabreichung schließen orale, rektale, topische, nasale, intradermale oder parenterale Wege ein. Der Begriff "parenteral" schließt subkutan, intravenös, intramuskulär oder Infusion ein. Eine orale Verabreichung wird für eine prophylaktische Behandlung aufgrund der Einfachheit für den Patienten, sowie für den Dosierungsplan bevorzugt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in geeigneter Weise in Form von Dosierungseinheiten dargereicht werden und können durch irgendeine der im Stand der Technik gut bekannten Verfahren der Pharmazie hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, die Mikrokugel in Verbindung mit einem Träger zu bringen, welcher einen oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen dadurch hergestellt, dass die Mikrokugeln einheitlich und eng in Verbindung mit einem flüssigen Träger, einem fein zerteilten festen Träger oder beidem gebracht werden und anschließend, wenn nötig, das Produkt geformt wird.
  • Präparationen für eine parenterale Verabreichung schließen sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Zusätzliche Beispiele für Lösungsmittel schließen Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat, ein. Wässrige Träger schließen Wasser, Salze und Pufferlösungen, wie Salzlösung und gepufferte Medien, alkoholische/wässrige Lösungen und Emulsionen oder Suspensionen ein. Parenterale Träger schließen Natriumchlorid-Lösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Lactat oder fette Öle ein. Intravenöse Träger schließen Flüssigkeits- und Nährstoffergänzungslösungen, Elektrolytergänzungslösungen (wie jene, welche auf Ringer-Dextrose basieren) und desgleichen ein. Konservierungsstoffe und andere Zusatzstoffe können ebenfalls anwesend sein, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Chelatbildner und inerte Gase und desgleichen. Im Allgemeinen können die Mikrokugeln dem Patienten (irgendeinem Säugetierempfänger) unter Verwendung derselben Weisen der Verabreichung verabreicht werden, welche derzeit für eine Mikroteilchentherapie bei Menschen verwendet werden.
  • Die Mikrokugeln sind für eine weite Vielzahl von Trennungen, diagnostischen, therapeutischen, industriellen, kommerziellen, kosmetischen und Forschungszwecken geeignet, wie unten detaillierter beschrieben wird. Für Zwecke der in vivo-Diagnostik können die Mikrokugeln zum Beispiel ein Makromolekül einschließen, wie ein Immunglobulin oder Zellrezeptor, welcher mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist. Das Verabreichen der markierten Mikrokugel an einen Patienten erzeugt ein Darstellungsmittel für die Diagnose einer Proliferationsstörung, wie Krebs, oder ein Werkzeug für die Überprüfung des Erfolges eines therapeutischen Mittels beim Reduzieren der Proliferation einer besonders ungünstigen Zelle oder eines Organismus.
  • Für eine in vitro-Diagnose werden Mikrokugeln, welche ein Makromolekül, wie ein Immunglobulin, Zellrezeptor oder eine Oligonukleotid-Sonde, welche spezifisch für die Zelle oder den Organismus, welche/r untersucht wird, enthalten, mit einer Testprobe vereinigt, die Mikrokugeln werden von irgendwelchen nicht gebundenen Bestandteilen der Probe getrennt, und gebundene Moleküle werden mit gängigen Verfahren nachgewiesen.
  • Die Mikrokugeln sind als therapeutische Mittel geeignet und können die Verwendung von alternativen Wegen der Verabreichung ermöglichen, wenn die Mikrokugeln ein therapeutisches Arzneimittel einschließen und an einen Patienten für eine langsame Freisetzung oder zielgerichtete Abgabe des Arzneimittels zur Stelle, welche eine Therapie benötigt, verabreicht werden. Die Mikrokugeln sind auch als therapeutische oder prophylaktische Mittel geeignet, wenn die Mikrokugeln ein Makromolekül einschließen, welches selber ein therapeutisches oder prophylaktisches Mittel darstellt, wie ein Enzym oder Immunglobulin. Die langsame Freisetzung solcher therapeutischen Mittel ist insbesondere für therapeutische Proteine oder Peptide geeignet, welche eine kurze Halbwertszeit aufweisen und welche durch eine Injektion verabreicht werden müssen.
  • Die Mikrokugeln sind auch für die Aufreinigung von Molekülen aus einem Komplex-Gemisch, wie einem Reagens für den Nachweis oder die Quantifizierung eines spezifischen Moleküls oder für die Herstellung von Molekülen, wie Antikörpern, geeignet. Zum Beispiel können Mikrokugeln, welche ein Makromolekül, wie ein Immunglobulin enthalten, an eine Chromatographiesäule angeheftet werden und in einer Immunaffinitäts-Chromatographie verwendet werden, um einen Liganden aus einem Komplex-Gemisch zu trennen. Alternativ können Mikrokugeln, welche ein markiertes Makromolekül oder ein Gemisch aus markierten Makromolekülen, welche spezifisch für verschiedene Zellen oder Biomoleküle sind, wie Zellrezeptoren, einschließen, verwendet werden, um Änderungen in der Anzahl der Zellen oder Biomoleküle in Antwort auf eine besondere Testbedingung unter Verwendung von Techniken, wie Durchflusscytometrie, nachzuweisen.
  • Weiterhin können die Mikrokugeln als Adjuvantien für die Impfstoffherstellung verwendet werden, wobei Antigen enthaltende Mikrokugeln in ein Versuchstier, wie eine Maus oder eine Ratte, injiziert werden, um eine verstärkte Immunantwort für die Herstellung von Antikörpern auf das Antigen auszulösen.
  • Zusätzliche kommerzielle Verwendungen schließen Reinigungsformulierungen, wie die Bildung von Enzymteilchen als Zusatz für Detergenzien, Kosmetika, wie die Bildung von Collagenteilchen, welche in einer Lotion oder Creme suspendiert werden sollen, Tinte und Farbe ein.
  • In Vitro-Diagnose
  • In vitro-Assays: Die hier beschriebenen Mikrokugeln sind als Festphasenteilchen in einem Assay, wie einem Enzym gekoppelten Immunadsorptionsassay, Dot-Blot oder Western-Blot, für den Nachweis eines besonderen Ziels, wie einer Zelle, eines Biomoleküls oder eines Arzneimittels in einer biologischen Probe geeignet. Die für diese Verwendung entworfenen Mikrokugeln sind aus Affinitätsmolekülen aufgebaut, welche spezifisch für das Zielmolekül sind. Das Makromolekül stellt zum Beispiel ein Immunglobulin, einen Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde dar und wird an ein Teströhrchen oder eine Mikrotiterplatte gebunden.
  • Zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines Zielmoleküls von Interesse wird eine Probe mit einer Lösung, welche die Mikrokugeln enthält, vereinigt, die Makromoleküle auf den Mikrokugeln werden mit den Zielmolekülen umgesetzt, die Mikrokugeln werden von irgendwelchen nicht gebundenen Bestandteilen der Probe getrennt, und die Mikrokugeln, welche gebundene Moleküle enthalten, werden mit gängigen Verfahren nachgewiesen. Fluoreszent gefärbte Mikrokugeln sind insbesondere für eine Durchflusscytometrie-Analyse gemäß Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, gut geeignet.
  • Histopathologie: Die hier beschriebenen Mikrokugeln sind als sichtbare Sonden oder Marker der Pathologie in einer histologischen Probe geeignet. Die Makromoleküle der für diese Verwendung entworfenen Mikrokugeln sind spezifisch für Biomoleküle, welche während eines besonderen pathologischen Zustandes exprimiert werden und werden mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Zum Beispiel stellt das Makromolekül ein Immunglobulin, einen Zellrezeptor oder eine Oli gonukleotidsonde dar, welche spezifisch für eine abnormale Zelle, wie eine schnell proliferierende Zelle, oder einen pathologischen Organismus, zum Beispiel ein Virus, sind.
  • Zum Nachweis eines pathogenen Zustands wird eine histologische Probe mit einer Lösung, welche die Mikrokugeln enthält, vereinigt, die markierten Makromoleküle auf den Mikrokugeln werden mit dem Zielmolekül von Interesse umgesetzt, und gebundene Mikrokugeln werden durch Nachweisen der Markierung gemäß Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, nachgewiesen.
  • In Vivo-Diagnose-Darstellung
  • Die hier beschriebenen Mikrokugeln sind als darstellende Mittel für eine in vivo-Ortung eines bestimmten Moleküls, Zelltyps oder eines pathologischen Zustands in einer ähnlichen Weise geeignet, wie die oben beschriebene mit Bezug auf die Verwendung der Mikrokugeln in der Histopathologie. Die Makromoleküle auf den für diese Verwendung entworfenen Mikrokugeln sind spezifisch für Moleküle, welche von einer besonderen Zelle oder einem pathologischen Organismus exprimiert werden und werden mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Das Makromolekül stellt zum Beispiel ein Immunglobulin, einen Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde dar, welche spezifisch für eine Tumorzelle oder einen pathologischen Organismus, wie ein Virus, sind.
  • Die Mikrokugeln werden entweder verwendet, um einen pathologischen Zustand nachzuweisen oder um den Erfolg einer Therapie, wie einer Chemotherapie oder einer Operation zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Größe eines abnormalen Gewebetumors abgenommen hat oder dass er vollständig herausgeschnitten wurde. Für diese Verwendung erhält ein Patient eine Verabreichung einer Mikrokugel-Lösung, vorzugsweise intravenös, den markierten Makromolekülen auf den Mikrokugeln wird eine ausreichende Menge Zeit gelassen, um das betroffene Organ oder die Region des Körpers zu orten, das Makromolekül wird mit einem Zielmolekül, welches von der Zelle oder dem Organismus, welcher untersucht wird, umgesetzt, und gebundene Mikrokugeln werden durch Nachweisen der Markierung mit gängigen Darstellungstechniken, welche dem Fachmann gut bekannt sind, wie Röntgen, nachgewiesen.
  • Arzneimittelabgabe-Systeme
  • Die Mikrokugeln sind für eine Therapie oder Prophylaxe geeignet, wenn das Makromolekül ein therapeutisches Mittel oder eine pharmazeutische Verbindung darstellt, welche an einen Patienten abgegeben wird und langsam von den Mikrokugeln über die Zeit freigesetzt wird. Diese Mikrokugeln sind inbesondere für eine langsame Freisetzung von Arzneimitteln mit kurzen biologischen Halbwertszeiten, wie Proteinen oder Peptiden, geeignet. Wenn die pharmazeutische Verbindung nicht in ein Teilchen gebracht werden kann, dann wird sie an einen Träger, wie Albumin, komplexgebunden, und der Träger-pharmazeutische Verbindung-Komplex wird in eine Mikrokugel gebracht. Die Mikrokugel kann entweder eine langsame Freisetzung des Mittels überall im Körper bereitstellen, oder die Mikrokugel kann ein Affinitätsmolekül, welches spezifisch für ein Zielgewebe oder Tumor ist, einschließen und kann in einen Patienten für eine gerichtete langsame Freisetzung des therapeutischen Mittels, wie ein Antitumor-, antivirales, antibakterielles, Antiparasiten- oder antiarthritisches Mittel, Cytokin, Hormon oder Insulin, direkt an die Stelle, welche eine Therapie benötigt, injiziert werden. Wie oben diskutiert, kann das Affinitätsmolekül spaltbar sein.
  • Mikrokugeln, welche aus antigenen Proteinen oder Polysaccharid-Protein-Konjugaten aufgebaut sind, die in der Lage sind, eine Immunantwort zu provozieren, sind insbesondere geeignet für eine Verwendung als Impfstoffe.
  • Die Mikrokugeln sind auch als Träger für eine Gentherapie oder die Herstellung von "genetischen Impfstoffen" geeignet, wenn sie aus Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, aufgebaut sind, welche entweder in die DNA des Patienten eingeschlossen werden oder in eine Zielzelle transfiziert werden, um ein gewünschtes Protein herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, welche Kernproteine von Viren, wie Influenza oder humanes Immundefizienzvirus HIV kodieren, als Mikrokugeln für die Expression eines antigenen Proteins bereitgestellt werden. Dies ist vorteilhaft, da neue Impfstoffe nicht so häufig entwickelt werden müssen, weil virale Kernproteine in einem viel geringeren Ausmaß mutieren als die Zelloberflächenantigene, welche derzeit in Impfstoffen verwendet werden. Die Nukleinsäure-Mikrokugeln werden an Säugetierzellen in ziemlich derselben Weise abgegeben, wie nackte DNA abgegeben wird. Die gewünschte Nukleinsäuresequenz wird in einen Vektor, wie eine Plasmid-DNA, eingefügt, mit einem Promotor, wie dem SV40-Promotor oder dem Cytomegalovirus-Promotor, und kann gegebenenfalls ein Reportergen, wie beta-Galactosidase einschließen. Die Nukleinsäure wird vorzugsweise mit einem Trägerprotein und/oder einem Kation, wie Polylysin, vereinigt, um die wie oben beschriebene Teilchenbildung zu erleichtern. Die Mikrokugeln werden anschließend direkt dem Patienten verabreicht oder werden in Säugetierzellen transfiziert, welche anschließend dem Patienten, der eine Therapie oder Prophylaxe benötigt, verabreicht werden. Die Nukleinsäure-Mikrokugeln können eine Substanz, wie Chlorochin, einschließen, welche den Nukleinsäuren erlaubt, aus den cytoplasmatischen Kompartimenten in das Cytoplasma zu gelangen, sodass sie einfacher von der Zelle transkribiert und translatiert werden können. Zusätzlich können die Mikrokugeln mit einer Substanz beschichtet werden, welche die Wirksamkeit der Translation verstärkt, oder sie können mit einer Substanz beschichtet werden, um eine zellspezifische Zielausrichtung der Mikrokugeln bereitzustellen.
  • Forschungsanwendungen
  • Die Mikrokugeln sind als Forschungswerkzeuge für die Aufreinigung eines Biomoleküls aus einem Komplexgemisch, als ein Reagens für den Nachweis oder die Quantifizierung eines Biomoleküls oder für die Herstellung von Biomolekülen, wie Antikörpern, geeignet.
  • Zum Beispiel werden Mikrokugeln, welche aus einem Makromolekül, wie einem Immunglobulin, aufgebaut sind, an eine Chromatographiesäule angeheftet und in einer Immunaffinitätschromatographie verwendet, um einen Liganden aus einem Komplexgemisch zu trennen. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass eine Mikrokugel für die Verwendung in einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zuerst an eine nicht komprimierbare Kugel oder Perle der festen Phase angeheftet werden sollte, sodass die Säulenfüllung unter Druck ihre starre Struktur beibehält.
  • Alternativ werden Mikrokugeln, welche ein markiertes Makromolekül oder ein Gemisch aus markierten Makromolekülen einschließen, welche spezifisch für verschiedene Zellen oder Zellrezeptoren sind, verwendet, um Änderungen in der Anzahl von Zellen oder Zelloberflächenrezeptoren in Antwort auf eine besondere Testbedingung unter Verwendung von Techniken, wie der Durchflusscytometrie, nachzuweisen.
  • Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele umfassender verstanden werden. Diese Beispiele beabsichtigen jedoch lediglich, die Ausführungsformen der Erfindung darzustellen und sollen nicht so ausgelegt werden, dass sie den Schutzumfang der Erfindung beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Herstellung von Mikrokugeln, welche ein pharmazeutisches Mittel enthalten
  • Humanes Serumalbumin (HSA)-Mikrokugeln, welche für eine Verwendung als Arzneimittelabgabe-Träger geeignet sind, wurden hergestellt.
  • Herstellung von Rifampicin TM-HSA-Mikrokugeln
  • Carbonyldiimidazol (124 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) wurde zu einer Lösung aus 50 mg des Antibiotikums Rifampicin TM (3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]rifamycin, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in 2 ml Dimethylformamid (DMF) hinzugefügt. Das sich ergebende Gemisch wurde für vier Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Ein Gemisch aus 1 ml humanem Serumalbumin (HSA, 25%, Armour Pharmaceutical Co., Collegeville, Pa.) und 2 ml deionisiertem Wasser wurde zu dem Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. 14 ml einer Polymer-Lösung, welche 25% PVP (40.000 Dalton) und 25% PEG (3.350 Dalton) in 0,1 M NaOAc, pH-Wert 4, enthielt, wurde zu dem Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur, für 30 Minuten bei 37°C und für 30 Minuten bei 58°C inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und in 20 ml Wasser resuspendiert. Der prozentuale Anteil des HSA, welcher in die Teilchen eingeschlossen wurde, betrug 74% (untersucht mit dem BCA TM-Proteinassay (Pierce, Rockford, III.)). Der prozentuale Anteil des Rifampicin TM, welcher in die Teilchen eingeschlossen wurde, betrug mehr als 6,8%. Die mittlere Größe der Teilchen wurde unter Verwendung eines Coulter TM-Zellsortierers bestimmt, 68 nm im Durchmesser zu betragen.
  • Herstellung von Virazol TM-HSA-Mikrokugeln
  • Carbonyldiimidazol (100 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) wurde zu einer Lösung aus 36 mg des antiviralen Arzneimittels Virazol Registered TM (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif.) in 0,2 ml Dimethylformamid (DMF) hinzugefügt. Das sich ergebende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für vier Stunden stehen gelassen. Ein Gemisch aus 0,2 ml humanem Serumalbumin (HSA) (25 %, Armour Pharmaceutical, Co., Collegeville, Pa.) und 0,4 ml deionisiertem Wasser wurde zu dem Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur, für 30 Minuten bei 37°C und für 30 Minuten bei 58°C inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und in 20 ml Wasser resuspendiert. Der prozentuale Anteil des HSA, welcher in die Teilchen eingeschlossen wurde, betrug 61% (untersucht mit dem BOA TM-Proteinassay (Pierce, Rockford, III.)). Der prozentuale Anteil des Virazol Registered TM, welcher in die Partikel eingeschlossen wurde, betrug 10%.
  • Beispiel 2: Anheften von Polysaccharid an die äußere Oberfläche von Protein-Mikrokugeln
  • Das Polysaccharid PRP-AH wurde an die äußere Oberfläche von zwei verschiedenen Protein-Mikrokugeln gekoppelt.
  • Ein Adipinsäuredihydrazid-Derivat (AH) des Polyribosylribitolphosphats (PRP) von Haemophilus influenza Typ b (Hib), einem der Hauptverursacherorganismen der bakteriellen Meningitis, als PRP-AH bezeichnet, wurde durch Koppeln von PRP an Adipinsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in der Anwesenheit von Cyanogenbromid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) hergestellt (das PRP wurde von dem Massachusetts Public Health Biologic Laborstory (Jamaica Plain, Mass.) erhalten).
  • Koppeln von PRP-AH an Ovalbumin-Mikrokugeln
  • Ovalbumin-Mikrokugeln wurden durch Hinzufügen von Ovalbumin (1%, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) zu einer Polymerlösung, welche 25% PVP (40.000 Dalton) und 25% PEG (3.500 Dalton) enthielt, hergestellt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur, 30 Minuten bei 37° und 30 Minuten bei 58°C inkubiert, was die Bildung der Mikrokugeln verursachte. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren gesammelt. Der mittlere Durchmesser der Teilchen wurde bestimmt, ungefähr 0,068 μm zu betragen. Die Ovalbumin-Teilchen (1,5 mg) in 1 M MES-Puffer, pH-Wert 5,0 (0,1 ml) wurden mit dem PRP-AH (1,5 mg) vereinigt. Nachfolgend wurden 2,79 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden gemischt. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und dreimal mit 1 M MES-Puffer, pH-Wert 5,0 (400 mu I) gewaschen. Die Ausbeute des PRP wurde mit dem Anthron freien Polysaccharid- Assay, welcher in METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, Band II, Williams, C.A. und Chase, M. W. (Hrsg.), 1968, S. 288-289, Academic Press, NY beschrieben wird, bestimmt, 25% zu betragen. Der Proteingehalt wurde mit dem BCA TM-Proteinassay (Pierce, Rockford, III.) bestimmt, 55% zu betragen. Das Verhältnis von PRP zu Protein betrug 0,46. Der mittlere Durchmesser der sich ergebenden Teilchen betrug 0,067 μm.
  • Die Rückgewinnung von freiem Polysaccharid und die Beladung von Polysaccharid auf die Teilchen (das Polysaccharid:Ovalbumin-Verhältnis) war abhängig vom Ausgangsverhältnis von Polysaccharid zu Ovalbuminteilchen. Wenn das Verhältnis von Polysaccharid zu Ovalbuminteilchen angehoben wurde, sank die Rückgewinnung des freien Polysaccharids und die Beladung von Polysaccharid auf die Teilchen stieg an, wie in Beispieltabelle 1 unten gezeigt ist. BEISPIELTABELLE 1: Polysaccharid Rückgewinnung und Beladung auf Ovalbumin-Mikrokugeln
    Ausgangsverhältnis von Polysaccharid: Teilchen Polysaccharid Rückgewinnung (%) Beladung von Polysaccharid
    1:1 25 0,46
    1:2 30 0,29
    1:4 66 0,21
    1:8 94 0,14
  • Koppeln von PRP-AH an Tetanus-Toxid-Mikrokugeln
  • Tetanus-Toxoid (27 mg/ml, erhalten von dem Massachusetts Public Health Biologic Laborstory (Jamaica Plain, Mass.)) wurde mit zwei Volumina einer Polymerlösung, pH-Wert 5,0, welche 25% PVP (40.000 Dalton) und 25% PEG (3.500 Dalton) enthielt, vereinigt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur, 30 Minuten bei 37°C und 30 Minuten bei 58°C inkubiert, was die Bildung der Mikrokugeln verursachte. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren gesammelt. Der mittlere Durchmesser der Teilchen wurde bestimmt, ungefähr 0,082 μm zu betragen.
  • Die Tetanus-Toxoid-Teilchen (0,825 mg) in 1 M MES-Puffer, pH-Wert 5,0 (0,1 ml) wurden mit dem PRP-AH (1,5 mg) vereinigt. Nachfolgend wurden 2,79 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden gemischt. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und dreimal mit 1 M MES-Puffer, pH-Wert 5,0 (400 mu I) gewaschen. Die Ausbeute des PRP wurde mit dem Anthron freien Polysaccharid-Assay, welcher in METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, Band II, Williams, C.A. und Chase, M. W. (Hrsg.), 1968, S. 288-289, Academic Press, NY beschrieben wird, bestimmt, 16% zu betragen. Der Proteingehalt wurde mit dem BOA TM-Proteinassay (Pierce, Rockford, III.) bestimmt, 99% zu betragen. Das Verhältnis von PRP zu Protein betrug 0,1. Der mittlere Durchmesser der sich ergebenden Teilchen betrug 0,080 μm.
  • Beispiel 3: Freisetzung von radioaktiv markiertem Protein und Polymer aus Mikrokugeln
  • Mikrokugeln wurden unter Verwendung von radioaktiv markiertem Protein (bovinem Serumalbumin, BSA) und radioaktiv markiertem Polymer (PEG) hergestellt. Die Freisetzung der Radioaktivität wurde als eine Funktion der Zeit gemessen.
  • Die Mikrokugeln wurden durch Vereinigen von radioaktiv markiertem Protein (10 mg/ml [14]C-BSA, NEN, Boston, Mass.) mit zwei Volumina einer Polymer-Lösung, pH-Wert 5,0, welche 25% PVP (40.000 Dalton) und 25% [3]H-PEG (3.500 Dalton, NEN, Boston, Mass.) enthielt, hergestellt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C, 30 Minuten bei 58°C und 30 Minuten bei 70°C inkubiert, was die Bildung der Mikrokugeln verursachte. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren gesammelt.
  • Das Protein und das Polymer wurden durch Hinzufügen von 500 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) und durch Inkubieren des Gemisches bei 37°C langsam aus den Mikrokugeln freigesetzt, während es unter Verwendung eines Nutator TM Schütteltisches leicht geschüttelt wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Teilchen durch Zentrifugieren bei 8000 rpm für 10 Minuten präzipitiert, der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt, und die Radioaktivität wurde durch Hinzufügen flüssiger Szintilliationsflüssigkeit und Zählen in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler untersucht. Die Teilchen wurden anschließend in 500 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) resuspendiert und bis zum nächsten Zeitpunkt unter leichtem Schütteln wieder auf 37°C gebracht. Die Freisetzungskinetik des radioaktiv markierten Proteins und Polymers während einer Inkubation bei 37°C ist in 1 gezeigt.
  • Mikrokugeln wurden wie oben beschrieben hergestellt und auf eine Freisetzung untersucht, jedoch wurden drei verschiedene Konzentrationen des Polymers verwendet, und die Mikrokugeln wurden durch eine Inkubation bei 58°C gebildet. In der ersten Präparation wurden 25% PEG und 25% PVP verwendet. In der zweiten Präparation wurden 20% PEG und 20% PVP verwendet. In der dritten Präparation wurden 12,5% PEG und 12,5% PVP verwendet. Die Freisetzungskinetik des radioaktiv markierten Proteins ist in 2 gezeigt. Die Freisetzungskinetik des radioaktiv markierten Polymers ist in 3 gezeigt.
  • Mikrokugeln wurden wiederum wie oben beschrieben hergestellt und auf eine Freisetzung untersucht, jedoch wurden drei verschiedene Konzentrationen des Polymers verwendet, und die Mikrokugeln wurden durch eine Inkubation bei 58°C, 70°C, bei beiden, 37°C und 58°C und bei beiden, 37°C und 70°C, gebildet. Die Freisetzungskinetik des radioaktiv markierten Proteins ist in 4 gezeigt. Die Freisetzungskinetik des radioaktiv markierten Polymers ist in 5 gezeigt. Die Freisetzung des radioaktiv markierten PEG als eine Funktion der Polymerkonzentration ist in 6 gezeigt.
  • Beispiel 4: Bildung von DNA enthaltenden Mikrokugeln
  • DNA enthaltende Mikrokugeln wurden hergestellt und in Fibroblastenzellen transfiziert. Die Mikrokugeln wurden auf die Transfektionswirksamkeit und die Proteinexpression untersucht.
  • Ein 0,025 ml Aliquot einer 1 mg/ml Lösung einer Plasmid-DNA (pCMV beta Gal, Promega, Milwaukee, Wis.) wurde mit 0,025 ml einer 5,0 mg/ml Lösung Poly-L-Lysin, welches ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 1 kDa bis 40 kDa aufwies (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), komplexgebunden.
  • Zu dem Plasmid-DNA-Poly-L-Lysin-Komplex wurden, während des Vortexens, 0,1 ml einer Lösung aus 25% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon (mittleres Molekulargewicht 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) und 25% (Gewicht/Volumen) Polyethylengylcol (mittleres Molekulargewicht 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) in 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5, hinzugefügt.
  • Das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten und anschließend bei 70°C für 30 Minuten inkubiert. DNA enthaltende Mikrokugeln wurden gebildet. Das Gemisch wurde bei 17.500 × g für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde abgesaugt, und die Teilchen wurden dreimal mit 0,3 ml 10% Glycerol (Volumen/Volumen) in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Mikrokugeln wurden in 0,050 ml deionisiertem Wasser resuspendiert. Die DNA enthaltenden Mikrokugeln wurden auf NIH3T3 Fibroblastenzellen gebracht und bis zu 24 Stunden inkubiert, um eine Mikrokugelaufnahme durch die Zellen zu erlauben. Die Aufnahme wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS/Ca[2+] + Mg[2+]-frei) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.) und dem Hinzufügen von Dulbecco's Minimal Essential Media (DMEM, GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.) beendet.
  • Die Aufnahme und die Expression der pCMV-beta-Gal-DNA wurde auf die Wirksamkeit der Transfektion und die Menge des exprimierten beta-Galactosidase Enzyms untersucht. Die Wirksamkeit der Transfektion wurde durch Fixieren der Zellen und Farbentwicklung mit dem beta-Galactosidase Enzymsubstrat X-Gal (5- Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid, GIBCO-BAL, Gaithersburg, Md.) bestimmt. Die Menge des exprimierten beta-Galactosidase Enzyms wurde durch Lysieren der transfizierten Zellen und Messen der Gesamtenzymaktivität mit dem beta-Galactosidase Enzymsubstrat CPRG (Chlorphenolrot-beta-D-galactopyranosid, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) bestimmt.
  • Ergebnisse: Die Menge des exprimierten beta-Galactosidase Enzyms aus lysierten Zellen, welche unter Verwendung von entweder: 1) nackter DNA (kein Hinzufügen), 2) kationischen Liposomen plus DNA oder 3) DNA enthaltenden Mikrokugeln transifiziert wurden, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, ist in 7 gezeigt.
  • Beispiel 5: Bildung von Leuprolidacetat enthaltenden Mikrokugeln
  • Mikrokugeln, welche Leuoprolidacetat-Peptid und humanes Serumalbumin enthielten, wurden hergestellt. Leuprolidacetat ist ein generisches Analogon des luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons, welches ein Peptid darstellt, das hauptsächlich zur Behandlung von Prostatakrebs verwendet wird.
  • Ein 0,010 ml Aliquot einer Lösung aus 10–100 mg/ml Leuprolidacetat in Wasser (LHRH, TAP Pharmaceuticals, Deerfield, III.) wurde zu 0,168 ml einer 2–10% (Gewicht/Volumen) Lösung Dextransulfat in Wasser (mittleres Molekulargewicht 500 kDa) hinzugefügt, und die Lösung wurde sorgfältig gemischt. Zu der Leuprolid/Dextran-Lösung wurden ein 0,856 ml Aliquot einer Lösung hinzugefügt, welche 25% (Gewicht/Volumen) Polyethylenglycol, welches ein mittleres Molekulargewicht von 3,35 kDa (Spectrum, Gardena, Calif.) aufwies, und 25% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon, welches ein mittleres Molekulargewicht von 40 kDa aufwies, in einer wässrigen Lösung aus 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5, enthielt. Die sich ergebende Lösung wurde sorgfältig gemischt und für bis zu 30 Minuten stehen gelassen. Ein 0,25 ml Aliquot einer 20% (Gewicht/Volumen) Lösung aus humanem Serumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in Wasser wurde anschließend zu der Lösung hinzugefügt. Die endgültige Lösung wurde sorgfältig gemischt und für einen Zeitraum zwischen 30 Minuten und 3 Stunden in ein Wasserbad bei zwischen 70°C und 90°C gebracht. Die Mikrokugeln wurden gebildet.
  • Die Mikrokugeln wurden durch Zentrifugieren bei 17,5 K × g für 10 Minuten gesammelt, in 0,5 ml dH2O gewaschen und wiederum durch Zentrifugieren gesammelt.
  • Sterile Teilchen wurden unter Verwendung des vorhergehenden Verfahrens und durch steril filtrieren aller Lösungen vor der Verwendung und dem Durchführen aller Handhabungen offener Gefäße in einem Sterilbankabzug für Gewebekulturen hergestellt.
  • Eine in vitro-Freisetzung von Leuprolidacetat wurde durch Zentrifugieren der Mikrokugeln und durch Resuspendieren in einem Phosphat gepufferten Salzlösungsfreisetzungsmedium gemessen. Die Freisetzungskinetik ist in 8 gezeigt.
  • Die Mikrokugeln waren aus ungefähr 10% Leuprolidacetat, 50% humanem Serumalbumin, 20% Dextransulfat und 20% Polyethylenglycol/Polyvinylpyrrolidon aufgebaut.
  • Es wurden ähnliche Teilchen hergestellt, welche auch Zinksulfat oder Caprylsäure enthielten, welche beide die Freisetzung des Proteins und Peptids aus den Mikrokugeln verlangsamten.
  • Beispiel 6: Herstellung von bovines Serumalbumin-Mikrokugeln unter Verwendung von Polyethylenglycol und Poloxamer 407
  • Bovines Serumalbumin-Mikrokugeln wurden unter Verwendung eines Polymergemisches aus Polyethylenglycol und Poloxamer 407 hergestellt. 1,25 Gramm Polyethylenglycol (MW 3550, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) und Poloxamer 407 (BASF, Parsippany, N.J.) wurden in 100 ml eines 0,1 N Natriumacetat- Puffers, pH-Wert 5,5, gelöst, um eine 12,5% Lösung herzustellen. Eine Lösung aus 10 mg/ml bovinem Serumalbumin (BSA, Fraction V, Sigma Chemical Co.) wurde in dH2O gelöst. Ein 400 ml Aliquot der BSA-Lösung wurde mit 800 ml der Polymerlösung vereinigt. Das Gemisch wurde gevortext. Eine klare Lösung bildete sich. Die Lösung wurde für 30 Minuten auf 70°C erhitzt. Eine Teilchenbildung wurde durch die Anwesenheit einer milchig weißen Suspension beobachtet.
  • Die restliche Polymerlösung wurde durch Zentrifugieren bei 12.500 rpm für 10 Minuten und anschließendem Dekantieren des Lösungsmittels entfernt. Zwei Waschschritte und Zentrifugationsschritte mit 10% Ethanol in Wasser wurden durchgeführt, um zusätzliches restliches Polymer zu entfernen.
  • Beispiel 7: Herstellung von bovines Serumalbumin-Mikrokugeln unter Verwendung von Dextran
  • Bovines Serumalbumin-Mikrokugeln wurden unter Verwendung von Dextran hergestellt.
  • 12,5 Gramm Dextran (MW 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) wurden in 100 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0, gelöst, um eine 12,5% Lösung herzustellen. Bovines Serumalbumin (BSA, Sigma Chemical Co.) wurde in dH2O mit einer Kozentration von 10 mg/ml gelöst. Ein 400 ml Aliquot der BSA-Lösung wurde in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gebracht. Ein 800 ml Aliquot der Dextran-Polymer-Lösung wurde zu der BSA-Lösung hinzugefügt. Die Lösung wurde gevortext. Es bildete sich eine klare Lösung. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde für 30 Minuten in ein 70°C Wasserbad gebracht. Es wurde eine milchig weiße Suspension beobachtet, welche die Mikrokugelbildung anzeigte.
  • Die restliche Dextran-Polymer-Lösung wurde durch Zentrifugieren bei 12.500 rpm für 10 Minuten und anschließendem Dekantieren des Lösungsmittels entfernt. Zwei Waschschritte und Zentrifugationsschritte mit 10% Ethanol in Wasser wurden durchgeführt, um zusätzliches restliches Polymer zu entfernen. Rasterelektro nenmikroskopische Aufnahmen ließen die Bildung von Submikrometer großen Mikrokugeln erkennen, welche häufig in einer kettenähnlichen Struktur angeordnet waren.
  • Beispiel 8: Herstellung von bovines Serumalbumin-Mikrokugeln unter Verwendung von Eudragit Registered TM E100
  • Bovines Serumalbumin-Mikrokugeln wurden unter Verwendung von Eudragit ® E100-Polymer hergestellt. Dieses Polymer ist in einem organischen Lösungsmittel löslich, welches mit Wasser mischbar ist.
  • Eudragit® E100-Polymer (Rohm, Malden, Mass.) wurde in einer 1:1-Lösung aus 0,1 M Natriumacetat-Puffer (pH-Wert, 5,0) und Ethanol gelöst. Der endgültige pH-Wert der Lösung betrug 6,5. Ein 400 ml Aliquot einer 10 mg/ml Lösung aus bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) wurde mit 800 ml der Eudragit® E100-Polymer-Lösung vereinigt. Es bildete sich keine klare Lösung. Die BSA/Polymer-Lösung wurde für 30 Minuten in einem 70°C Wasserbad inkubiert. Es wurde eine milchig weiße Suspension beobachtet, welche eine Mikrokugelbildung angezeigte. Die Teilchen wurden durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 8000 rpm und Dekantieren der Flüssigkeit gesammelt.
  • Beispiel 9: Herstellung von Insulin-Mikrokugeln unter Verwendung von Dextran
  • Insulin-Mikrokugeln wurden unter Verwendung von Dextran-Polymer hergestellt.
  • Eine 20% (Gewicht/Gewicht) Lösung Dextran-Polymer (MW 500.000 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) wurde in Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,0, gelöst. 1,9 ml dH2O wurden zu 20,5 mg Insulin (Sigma Chemical Co.) hinzugefügt. 100 ml 0,2 M HCl wurden hinzugefügt, um das Insulin zu lösen. Ein 400 ml Aliquot der Insulinlösung wurde in ein Teströhrchen gebracht. Ein 800 ml Aliquot der Dextranlösung wurde zu der Insulinlösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde gevortext. Das Gemisch wurde beim Hinzufügen der Dextranlösung trüb. Die Röhrchen wur den auf eine Endtemperatur von entweder 70°C oder 90°C erhitzt, um Insulin-Mikrokugeln zu bilden. Die Mikrokugeln wurden bei 10.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, und die Flüssigkeit wurde dekantiert, um restliches Polymer zu entfernen. Die Mikrokugeln wurden mit 10% Ethanol in Wasser gewaschen.
  • Die Mikrokugeln wurden in eine Phosphat gepufferte Salzlösung, pH-Wert 7,4, gebracht, um die Lösungseigenschaften zu bestimmen. Die Insulinteilchen, welche bei einer Endtemperatur von 90°C gebildet wurden, lösten sich nicht in der Phosphat gepufferten Salzlösung, während die Insulinteilchen, welche bei einer Endtemperatur von 70°C gebildet wurden, sich innerhalb von 15 Minuten lösten. Die Stabilität der Insulinteilchen kann daher durch Variieren der Inkubationstemperatur, welche während der Teilchenbildung verwendet wird, angepasst werden.
  • Beispiel 10: Herstellung von Mikrokugeln unter Verwendung verschiedener Polymere
  • Humanes Serumalbumin-Mikrokugeln wurden unter Verwendung von neun verschiedenen Polymeren oder Gemischen aus Polymeren hergestellt.
  • Verfahren: Eine Proteinlösung (1–5% humanes Serumalbumin, pH-Wert 4,5–5,5 oder bovines Serumalbumin) in einem Puffer wurde hergestellt. Die folgenden Polymerlösungen wurden hergestellt: Polyethylenglycol/Polyvinylpyrrolidon (3 kDa PEG/40 kDa PEG in einem 1:1 Gemisch), Hetastärke (500 kDa), Pluronic L-101TM-Polymer, Dextran (3–500 kDa), Dextransulfat (3–500 kDa), Polyvinylpyrrolidon (10–360 kDa), Polyethylenglycol/Polyvinylpyrrolidon mit Inulin (einem Polysaccharid), Polyethylenglycol/Polyvinylpyrrolidon mit Pluronic L-101TMPolymer, Dextran mit Pluronic L-101TM-Polymer. Ungefähr ein Volumen der Proteinlösung wurde mit zwei Volumina der Polymerlösung gemischt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 70°C bis 90°C für 30 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend in ein Eisbad gebracht. Mikrokugelbildung wurde beobachtet.
  • Die Mikrokugeln wurden zentrifugiert bis sie in einem Pellet verdichtet waren, der Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde zweimal in einer 10% Ethanol in Wasser-Lösung gewaschen, um die restliche Polymerlösung zu entfernen. Die Mikrokugeln wurden anschließend dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die Mikrokugeln wurden unmittelbar verwendet oder getestet oder wurden für eine nachfolgende Verwendung lyophilisiert.
  • Beobachtungen: Mikrokugeln, die unter Verwendung von Polymeren hergestellt wurden, die ein höheres Molekulargewicht oder eine höhere Konzentration der Polymere aufwiesen, stellen ein stärker viskoses Medium bereit, welches eine einheitlichere Größenverteilung der Mikrokugeln herstellte. Das Einschließen eines grenzflächenaktiven Mittels, wie Pluronic L-101TM-Polymer, oder das Mischen während der Mikrokugelbildung beeinflusste die Mikrokugelgröße. Ein Anstieg der Proteinkonzentration während der Mikrokugelbildung verursachte einen Anstieg des Einschließens von Protein in die Mikrokugeln. Ein Anstieg der Polymergröße verursachte im Allgemeinen einen Anstieg des Proteineinschlusses in die Mikrokugeln. Die Verwendung von verschiedenen Polymeren beeinflusste die Freisetzungskinetik. Zum Beispiel setzten bovines Serumalbumin (BSA)-Mikrokugeln, welche unter Verwendung von Dextran hergestellt wurden ungefähr 15% weniger BSA frei, als Mikrokugeln, welche unter Verwendung von PEG/PVP hergestellt wurden. Die Freisetzung von Polysaccharid aus Protein-Polysaccharid-Mikrokugeln, wie die Freisetzung von [3]H-Inulin aus humanes Serumalbumin/Inulin-Mikrokugeln fand jedoch schneller statt, wenn Dextran eher als PEG/PVP verwendet wurde.
  • Beispiel 11: Herstellung von Protein-Mikrokugeln, welche Nafarelinacetat enthielten, unter Verwendung verschiedener Polymere
  • Protein-Mikrokugeln, welche das Arzneimittel Nafarelinacetat enthielten, wurden hergestellt.
  • Nafarelinacetat ist für die Behandlung von Endometriose, frühzeitiger Pubertät und Prostatakrebs geeignet.
  • Verfahren: Humanes Serumalbumin-Mikrokugeln wurden, wie oben in Beispiel 10 beschrieben, unter Verwendung von neun verschiedenen Polymeren oder Gemischen aus Polymeren hergestellt. Nafarelinacetat (Roche Laboratories, Nutley, N.J.) wurde in deionisiertem Wasser gelöst, um eine 10 mg/ml Lösung herzustellen.
  • Zu 1 mg Nafarelinacetat wurden 10 mg der humanes Serumalbumin-Mikrokugeln hinzugefügt. Das Gemisch wurde gevortext und für 16 Stunden bei 4°C gemischt. Eine 3 M Ammoniumsulfatlösung wurde zu dem Gemisch bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M hinzugefügt und gevortext und für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur gemischt. Eine 1 M Zinksulfatlösung wurde bis zu einer Endkonzentration von entweder 0,01 M, 0,1 M oder 1 M hinzugefügt und gevortext und für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gemischt.
  • Das Gemisch wurde zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Pellet wurde in deionisiertem Wasser dreimal resuspendiert, um die Mikrokugeln zu waschen.
  • Beobachtungen: Das Hinzufügen von Zinksulfat reduzierte die Geschwindigkeit der Freisetzung von Nafarelinacetat aus humanes Serumalbumin-Mikrokugeln. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
  • Beispiel 12: Herstellung von Doxorubicin/Albumin-Mikrokugeln
  • Humanes Serumalbumin-Mikrokugeln, welche das chemotherapeutische Arzneimittel Doxorubicin enthielten, wurden hergestellt.
  • Zu 1 ml einer Lösung aus 250 mg/ml humanem Serumalbumin (Sigma, St. Louis, Mo.) in dH2O wurden 0,05 ml einer 5 mg/ml-Lösung Doxorubicin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in dH2O hinzugefügt, die vereinigte Lösung wurde gemischt und bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu der oben genannten Lösung wurden 3,0 ml einer Lösung aus 200 mg/ml Dextransulfat (MW 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in dH2O hinzugefügt, und die sich ergebende Lösung wurde gemischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde anschließend bei 70°C für 30 Minuten inkubiert, wonach 1,0 ml 3,0 M Natriumacetat, pH-Wert 5,0, hinzugefügt wurden und die sich ergebende Lösung gemischt wurde. Die Lösung wurde anschließend bei 90°C für 30 Minuten inkubiert. Mikrokugeln wurden gebildet. Die Mikrokugeln wurden zweimal mit 5,0 ml dH2O gewaschen.
  • Beispiel 13: Einschließen von LHRH in Dextransulfat/Albumin-Mikrokugeln
  • Luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon wurde in Mikrokugeln eingeschlossen, welche aus humanem Serumalbumin und Dextransulfat-Mikrokugeln aufgebaut waren.
  • Zu 0,168 ml einer 10% (Gewicht/Volumen) Lösung Dextransulfat (mittleres MW 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in dH2O wurden 0,25 ml einer 20% (Gewicht/Volumen) Lösung aus humanem Serumalbumin (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) in dH2O hinzugefügt. Die Lösung wurde sorgfältig gemischt, und 0,856 ml einer Lösung aus 25% (Gewicht/Volumen) Polyethylenglycol (mittleres MW 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) und 25% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon (mittleres MW 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) in einer wässrigen Lösung aus 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5, wurden hinzugefügt.
  • Die sich ergebende Lösung wurde sorgfältig gemischt und in ein Wasserbad bei einer Temperatur zwischen 70°C und 90°C für zwischen 30 Minuten und 3 Stunden gebracht. Mikrokugeln wurden gebildet. Die Mikrokugeln wurden durch Zentrifugieren bei 17,5 K × g für 10 Minuten gesammelt, zum Waschen in 0,5 ml dH2O resuspendiert und wieder durch Zentrifugieren gesammelt. Die Mikrokugeln wurden in 0,3 ml einer Lösung aus 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5 resuspendiert. Ein 0,01 ml Aliquot einer 10 mg/ml Lösung aus luteinisierendes Hormon freiset zendem Hormon (LHRH, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in dH2O wurde hinzugefügt und für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, damit das LHRH-Peptid an die Mikrokugeln binden konnte. Nach der 16-stündigen Bindungsinkubation wurde das nicht gebundene LHRH-Peptid durch zwei Zyklen von Waschschritten mit dH2O und Sammeln durch Zentrifugieren entfernt. Die Ausbeute des LHRH-Einschlusses betrug typischerweise 83 bis 90%.
  • Beispiel 14: Einschließen von Östradiol in ProMaxx®-Mikrokugeln
  • Humanes Serumalbumin-Mikrokugeln wurden durch Vereinigen von 12,5 Gew.-% Polyethylenglycol und 12,5 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon in 50 mM Natriumacetat-Puffer bei pH-Wert 5,3 und 1% (Gew./Vol.) humanem Serumalbumin, in einer wässrigen Lösung gelöst, gebildet. Die Lösung wurde für 30 Minuten auf 70°C gebracht. Die Mikrokugeln wurden gebildet und aus der Lösung präzipitiert. Die Mikrokugel-Suspension wurde dreimal in deionisiertem Wasser gewaschen. Östradiol wurde anschließend in humanes Serumalbumin-Mikrokugeln in 3 verschiedenen gewichtsprozentualen Beladungen geladen. Das Östradiol wurde in Ethylalkohol gelöst und in der Anwesenheit von den Albumin-Mikrokugeln inkubiert. Die Affinität von Östradiol für Albumin mit Hilfe von hydrophoben Interaktionen führte zu der Möglichkeit, Östradiol in verschiedenen gewichtsprozentualen Beladungen zu laden. Die 10 Gew.-% Östradiol enthaltenden Mikrokugeln enthielten 1 mg Östraldiol und 8,33 mg humanes Serumalbumin (HSA). Die 49 Gew.-% Östradiol enthaltenden Mikrokugeln enthielten 8,15 mg Östradiol und 8,33 mg HSA. Die 77 Gew.-% Östradiol enthaltenden Mikrokugeln enthielten 27,68 mg Östradiol und 8,33 mg HSA.
  • Die Mikrokugeln wurden in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bei pH-Wert 7,4 freigesetzt.
  • Alle Proben wurden bei 20 rpm bei 37°C geschwenkt, um ein konstantes Mischen sicherzustellen. Ein (1) ml PBS wurde zu den Mikrokugeln hinzugefügt, welche sich in standard Polypropylen-Zentrifugenröhrchen befanden. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Röhrchen zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und der 1 ml des Freisetzungsmediums wurde in ein Probenröhrchen gebracht. Jede 1 ml Probe wurde in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in 200 μl Ethanol resuspendiert. Das freigesetzte Östradiol wurde mit einer HPLC gemessen.
  • Die retardierte Freisetzung von Östradiol ist in 10 gezeigt.
  • Die retardierte Freisetzung von Östradiol wurde auch in vivo gezeigt. Die Mikrokugeln wurden in fünf Hunde injiziert, und die sich ergebenden Serumkonzentrationen wurden mit einem Radioimmunassay für Östradiol bestimmt. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die drei Gruppen, jeweils aus fünf Hunden bestehend, schlossen eine Östradiolkontrolle ein, welche die niedrigsten Konzentrationen und die kürzeste Halbwertszeit in vivo ergab. ProMaxx®, welches die Albumin-Mikrokugeln, welche mit Östradiol beladen waren, darstellt, ergab erheblich höhere Östradiolkonzentrationen im Plasma mit einer wesentlich längeren Halbwertszeit. Und wenn die Östradiol-Mikrokugeln chemisch mit EDC (Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid) stabilisiert wurden, wurden höhere retardierte Plasmaspiegel und verlängerte Halbwertszeiten von Östradiol über einen Zeitraum von 43 Tagen beobachtet.
  • Beispiel 15: Einschließen von Diclofenac-Na in ProMaxx®-Mikrokugeln
  • Bovines Serumalbumin-Mikrokugeln wurden durch Vereinigen von 12,5 Gew.-% Polyethylengylcol und 12,5 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon in 50 mM Natriumacetat-Puffer bei pH-Wert 5,3 und bovinem Serumalbumin, in einer wässrigen Lösung gelöst, gebildet. Die Lösung wurde für 30 Minuten auf 70°C gebracht. Die Mikrokugeln bildeten sich und wurden aus der Lösung präzipitiert. Die Mikrokugel-Suspension wurde dreimal in deionisiertem Wasser gewaschen.
  • Das nicht-steroidale Antientzündungsarzneimittel Diclofenac-Na wurde durch Manipulieren des Grades der Ionisation von Diclofenac-Na durch Verändern des pH-Wertes der Inkubationslösungen an Albumin-Mikrokugeln gebunden. Die Wirk samkeit des Diclofenac-Na-Einschließens konnte auf 65% Einschluss durch Anpassen der Inkubationsbedingungen auf einen pH-Wert, wie in 12 gezeigt, optimiert werden.
  • Beispiel 16: Bildung von Leuprolidacetat enthaltenden Mikrokugeln
  • Leuprolidacetat stellt ein Analogon des luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons dar.
  • Eine wässrige Lösung aus Albumin (z.B. humanes, bovines, Maus oder Rattenserumalbumin) wird zu einer wässrigen Lösung aus einem anionischen komplexierenden Mittel (Dextransulfat mit einem Molekulargewicht (MW) von 10 kDa bis 500 kDa oder Heparin oder Heparansulfat oder Polyglutamin- oder Polyasparaginsäuren) mit oder ohne einer wässrigen Lösung aus zweiwertigen Kationen (Calcium oder Magnesium oder Zink) bei Umgebungstemperatur hinzugefügt, und das sich ergebende Gemisch wird für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 3 Stunden bewegt. Zu diesem Gemisch wird anschließend eine wässrige Lösung des Polymers hinzugefügt (entweder Polyethylenglycol (PEG) mit einem MW von 3,5 bis 40 kDa, Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem MW von 6 bis 40 kDa oder Gemische aus beiden, PEG und PVP, oder Stärke oder Hydroxyethylstärke mit einem MW von 500 kDa). Die Konzentration des Albumins im endgültigen Gemisch beträgt 5–30 g/l, die des ionischen komplexierenden Mittels beträgt 5–30 g/l, die des zweiwertigen Kations beträgt 0–30 g/l und die Polymerkonzentration beträgt 100 g/l bis 400 g/l. Das Gemisch wird bei Umgebungstemperatur für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 6 Stunden bewegt. Die Temperatur des Gemisches wird anschließend über einen Zeitraum von 5 Minuten bis 3 Stunden auf eine Temperatur zwischen 37°C und 50°C angehoben. Die Mikrokugeln werden einer Stabilisierung durch das Hinzufügen eines chemischen Stabilisators (EDC oder ein anderes Verbindungsmittel) oder durch thermisches Stabilisieren durch Erhitzen auf eine Temperatur zwischen 70°C bis 100°C über einen Zeitraum von 0,5 bis 6 Stunden unterzogen. Das Gemisch wird dem Stabilisator für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 16 Stunden unterzogen oder die Temperatur wird für ein thermisches Stabilisieren für 10 Minuten bis 6 Stunden auf dem Endwert gehalten. Die Mikrokugeln werden anschließend gesammelt und von den nicht eingeschlossenen Bestandteilen des Reaktionsgemisches durch Filtrieren oder Zentrifugieren mit nachfolgendem Waschen oder durch Diafiltration getrennt. Das Einschließen von Leuprolidacetat in die Mikrokugeln wird durch Hinzufügen einer wässrigen Lösung der Leuprolidlösung zu einer wässrigen Suspension der Mikrokugeln bewirkt. Die Konzentrationen der Mikrokugeln betragen 1–50 g/l, die des Leuprolidacetats betragen 1–100 g/l in einem wässrigen Medium aus 0–100 mM Puffer bei einem pH-Wert zwischen 2,5 und 10,0. Nach der Inkubation des Leuprolidacetats mit der Mikrokugel-Suspension für 5 Minuten bis 8 Stunden bei 5–50°C werden die Peptid enthaltenden Mikrokugeln mit den oben beschriebenen Verfahren zum Entfernen von nicht gebundenem Peptid gewaschen. Die Peptid enthaltenden Mikrokugeln werden in einigen Fällen einer weiteren Stabilisierung durch ein wiederholtes Aussetzen gegenüber chemischen Stabilisatoren, wie oben beschrieben, ausgesetzt und anschließend gewaschen, um nicht gebundenes Peptid zu entfernen. Die endgültigen Peptid enthaltenden Mikrokugeln werden anschließend entweder in Wasser resuspendiert oder lyophilisiert. Die pharmazeutische Wirksamkeit wird unter Verwendung eines pharmakodynamischen Rattenmodells zur Testosteron-Suppression über Zeiträume von 7 bis 180 Tagen bestimmt. Die Leuprolidacetat enthaltenden Mikrokugeln, welche gemäß dem oben genannten Verfahren hergestellt wurden, wurden in Ratten injiziert, und das Leuprolidacetat wurde im Serum für 7 bis 120 Tage nachgewiesen. Das Testosteron im Rattenserum wurde in so mit Leuprolidacetat enthaltenden Mikrokugeln injizierten Ratten für 7 bis 120 Tage unterdrückt. Diese Ergebnisse belegen die retardierte Freisetzung von physiologisch aktivem Leuprolidacetat über diesen Zeitraum.
  • Beispiel 17: Beispiele für Calcium enthaltende ProMaxx-Mikrokugeln
  • Das folgende Beispiel stellt spezifische Bedingungen für das Bilden bevorzugter erfindungsgemäßer Mikrokugeln dar. Es soll verstanden werden, dass die Konzentrationen, Zeiten und pH-Werte innerhalb einer angemessenen experimentellen Größenordnung variieren können und dennoch zu Mikrokugeln führen, welche die unten beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Wie in der detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben, ist es bevorzugt, dass das zweiwertige Metall (vorzugsweise Calcium oder Magnesium) während des Bildungsverfahrens hinzugefügt wird, und dass ein solches Hinzufügen des Metalls innerhalb 30 Minuten des Hinzufügens der anderen Bestandteile, welche für die Bildung der Mikrokugeln verwendet werden, stattfindet. Weitere Details in Bezug auf das Verfahren der Mikrokugelbildung werden unten bereitgestellt.
  • Zu 1 Volumen einer 25% (Gew./Vol.) Lösung Dextransulfat (mittleres MW 500 kDa) werden ungefähr 2 Volumina einer 25% (Gew./Vol.) Lösung Albumin (humanes) hinzugefügt, und das Gemisch wird für mindestens 5 min sorgfältig gerührt. In dieses Gemisch werden ungefähr 6 Volumina einer 36% (Gewicht/Volumen) Lösung Hetastärke in wässrigem 63 mM Na-Acetat sorgfältig eingerührt, und zu dieser Hetastärkelösung wird Wasser hinzugefügt, während das sorgfältige Rühren fortgesetzt wird. Die sich ergebende Lösung wird für mindestens 5 min sorgfältig gerührt, wobei das Dextransulfat-Albumin-Gemisch langsam zu ihr hinzugefügt wird. Zu diesem Gemisch wird ein geeignetes Volumen einer 1,5 M Lösung CaCl2, ZnCl2 oder MgCl2 hinzugefügt, um ein endgültiges Gemisch herzustellen, welches 25 mM oder 100 mM Metallkationen enthält. Dieses Gemisch wird konstant sorgfältig gerührt. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird anschließend über einen Zeitraum von 50–60 min auf eine Endtemperatur von 60–90°C angehoben. Die Temperatur des Gemisches wird für 30–120 min bei 60–90°C gehalten, wobei ein gleiches Volumen einer 25 mM Lösung MES-Na+ (N-Morpholinethansulfonsäure) bei Raumtemperatur, bei pH-Wert 6,0 ± 0,5 hinzugefügt wird, während das Rühren fortgesetzt wird. Die gebildeten Mikrokugeln werden anschließend gegen 1 Vol. 25 mM MES, pH-Wert 6,0 ± 0,5, diafiltriert. Die Mikrokugeln werden anschließend konzentriert und gegen 9 Volumina 25 mM MES, pH-Wert 6,0 ± 0,5, bei Raumtemperatur diafiltriert. Die Beladung und die Diafiltration werden im Fall von Zn2+ enthaltenden Mikrokugeln bei pH-Wert 4,5 ± 0,5 ausgeführt. Die Mikrokugeln werden durch Diafiltration konzentriert. Zu dieser Mikrokugel-Suspension, welche 17,1 g Albumin (humanes) enthält, wird eine Lösung aus 3,43 g Leuprolidacetat in 25 mM MES, pH-Wert 6,0, mit einer Ge schwindigkeit von 0,4 Litern pro min hinzugefügt. Das Hinzufügen der Leuprolidlösung wird gefolgt von dem Hinzufügen der MES-Lösung zu der Leuprolidacetat-Mikrokugel-Suspension. Die Suspension wird für 15 min bei Raumtemperatur gemischt, wobei die Suspension durch Diafiltration konzentriert wird. Zu dieser Suspension wird eine Lösung aus 17,14 g EDC ((3,3-Ethyldimethylaminopropyl)carbodiimid) in 25 mM MES, pH-Wert 6,0 ± 0,5 mit 0,4 Litern pro min hinzugefügt. Die Suspension wird unter Rühren für 180 min bei Raumtemperatur inkubiert, dem folgend wird sie gegen 10 Vol. destilliertes Wasser diafiltriert und durch Diafiltration konzentriert. Der Leuprolidacetatgehalt der Suspension wird bestimmt, wobei eine 50% (Gew./Vol.) Lösung Saccharose in Wasser hinzugefügt wird, und so verdünnt wird, dass die Endsuspension ungefähr 3,75–4,025 mg/ml Leuprolidacetat in 5% (Gew./Vol.) Saccharose beträgt. Diese Gesamtsuspension wird anschließend mit 2,0 ml pro Röhrchen abgefüllt und lyophilisiert.
  • (1) Physikalische Eigenschaften
  • Ladungseigenschaften – Die Mg2+ und Ca2+ enthaltenden Mikrokugeln banden das Arzneimittel in hoher Ausbeute (> 90%), während die Zn2+ enthaltenden Mikrokugeln das Arzneimittel mit weniger als 70% Ausbeute banden.
  • (2) In Vitro-Freisetzung
  • Die Mg2+ und Ca2+ enthaltenden Mikrokugeln wiesen ähnliche Freisetzungsgeschwindigkeiten des Leuprolids auf, welche nicht mit der Konzentration des Metallkations variierten, welches während der Mikrokugelherstellung anwesend war. Bei 25 mM Zn2+ war die Freisetzungsgeschwindigkeit ähnlich zu der der Ca2+ und Mg2+ enthaltenden Mikrokugeln, aber bei 100 mM Zn2+ war das Ausmaß der anfänglichen "Schub"-Phase größer.
  • (3) In Vivo-Leistungsmerkmale
  • In Ratten unterdrückten die Ca2+ und Mg2+ enthaltenden Mikrokugeln bei identischer Dosierung des Arzneimittels das Serumtestosteron für mindestens 4 Wochen auf Spiegel von Kastrierten. Die Zn2+ enthaltenden Mikrokugeln unterdrückten in dem Rattenmodell das Testosteron nicht mal für drei Wochen.

Claims (23)

  1. Mikrokugel, umfassend: (1) ein Trägerprotein; (2) ein wasserlösliches Polymer; (3) ein erstes komplexierendes Mittel, das ein polyanionisches Polysaccharid ist; und (4) ein zweites komplexierendes Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium und Magnesium, wobei eine Mikrokugel ausgenommen ist, bei der das Trägerprotein Albumin ist, das wasserlösliche Polymer Polyethylenglycol (PEG), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Gemische der beiden, Stärke oder Hydroxyethylstärke ist, das erste komplexierende Mittel, das ein polyanionisches Polysaccharid ist, Dextransulfat, Heparin oder Heparinsulfat ist und das zweite komplexierende Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation ist, Calcium oder Magnesium ist.
  2. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das Trägerprotein ein Albumin oder ein Immunglobulin ist.
  3. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Trägerproteinen nach Tabelle 1.
  4. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrokugel von 40 bis weniger als 100% Protein enthält.
  5. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das wasserlösliche Polymer ein Kohlenhy drat-basiertes Polymer ist.
  6. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das wasserlösliche Polymer eine Hydroxyethylstärke ist.
  7. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den wasserlöslichen Polymeren nach Tabelle 2, vorzugsweise ein Kohlenhydrat-basiertes Polymer und mehr bevorzugt Hetastärke.
  8. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das polyanionische Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dextransulfat, Galacturonsäure, Alginate, Mannuronsäure, Guluronsäure, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfaten, Heparin, Chitin, Chitosan, Glycosaminoglycanen, Proteoglycanen und kationischen komplexierenden Mitteln (d.h. komplexierende Mittel mit einer positiven Ladung).
  9. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das polyanionische Polysaccharid Dextransulfat ist.
  10. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das zweiwertige Metallkation Calcium ist.
  11. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei das zweiwertige Metallkation Magnesium ist.
  12. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei die Mikrokugel eine glatte Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl von Kanalöffnungen einschließt, wobei jede der Kanalöffnungen einen Durchmesser von weniger als 1000 Angström aufweist.
  13. Mikrokugel nach Anspruch 1, wobei die Mikrokugel kein nachweisbares Öl oder organisches Lösungsmittel enthält.
  14. Mikrokugel nach Anspruch 1, weiter umfassend ein therapeutisches Mittel.
  15. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus aktiven Mitteln nach Tabelle 4, vorzugsweise luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LH-RH), oder ein Analog davon, vorzugsweise Leuprolid.
  16. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Makromolekül Albumin ist, vorzugsweise humanes Serumalbumin, und das wasserlösliche Polymer ein Kohlenhydrat-basiertes Polymer, vorzugsweise Hetastärke, ist.
  17. Mikrokugel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend ein komplexierendes Mittel, vorzugsweise Dextransulfat, und ein aktives Mittel, vorzugsweise Leuprolidacetat.
  18. Spritze, enthaltend eine Einzeldosis von Mikrokugeln nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Spritze vorzugsweise weiter eine Nadel einschließt, die eine Bohrungsgröße von 14 bis 30 Gauge aufweist.
  19. Verfahren zum Herstellen einer Mikrokugel nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend: (1) Bilden eines wäßrigen Gemischs, enthaltend: (a) ein Trägerprotein; (b) ein wasserlösliches Polymer; (c) ein erstes komplexierendes Mittel, das ein polyanionisches Polysaccharid ist; und (d) ein zweites komplexierendes Mittel, das ein zweiwertiges Metallkation, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Calcium und Magnesium, ist; (2) Ermöglichen, daß die Mikrokugeln ein wäßriges Gemisch bilden; und (3) Stabilisieren der Mikrokugeln, vorzugsweise durch Inkontaktbringen der Mikrokugeln mit einem vernetzenden Mittel und/oder Aussetzen der Mikroku geln einer Energiequelle, vorzugsweise Hitze, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Mikrokugeln zu stabilisieren.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Bilden des wäßrigen Gemischs durch das im wesentlichen gleichzeitige Kombinieren des Trägerproteins, des wasserlöslichen Polymers, des ersten komplexierenden Mittels und des zweiten komplexierenden Mittels durchgeführt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, weiter umfassend den Schritt: (4) Inkontaktbringen der Mikrokugel mit einer Lösung eines aktiven Mittels, vorzugsweise eines aktiven Mittels nach Tabelle 4, mehr bevorzugt eines luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons oder eines Analogs davon und am meisten bevorzugt Leuprolid, um das aktive Mittel in die Mikrokugel einzuschließen.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Schritt des Inkontaktbringens der Mikrokugel mit der Lösung des aktiven Mittels in einer Einbauausbeute von mindestens 60%, mehr bevorzugt mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% oder mindestens 98% des aktiven Mittels resultiert.
  23. Verfahren nach Anspruch 19, 20 oder 21, weiter umfassend den Schritt: (5) Stabilisieren der Mikrokugeln, vorzugsweise durch Inkontaktbringen der Mikrokugeln mit einem vernetzenden Mittel unter Bedingungen, die ausreichen, um die Mikrokugel zu stabilisieren.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014013751A1 (de) 2014-09-22 2016-03-24 Justus-Liebig-Universität Giessen Pulmonale Arzneimittelformulierung mit verzögerter Freisetzung

Families Citing this family (186)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662409B2 (en) 1998-09-25 2010-02-16 Gel-Del Technologies, Inc. Protein matrix materials, devices and methods of making and using thereof
US6458387B1 (en) * 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
US6706034B1 (en) * 1999-12-30 2004-03-16 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Process for agent retention in biological tissues
ES2253375T3 (es) 2000-04-19 2006-06-01 Genentech, Inc. Formulaciones de liberacion sostenida.
US7527807B2 (en) * 2000-06-21 2009-05-05 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the oral absorption of antimicrobials
CA2419115C (en) * 2000-08-15 2011-03-08 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microparticles, and method and apparatus for forming same
EP1335661B1 (de) 2000-10-27 2009-05-06 Baxter Healthcare S.A. Herstellung von mikrokügelchen
US20050048126A1 (en) 2000-12-22 2005-03-03 Barrett Rabinow Formulation to render an antimicrobial drug potent against organisms normally considered to be resistant to the drug
US20030072807A1 (en) * 2000-12-22 2003-04-17 Wong Joseph Chung-Tak Solid particulate antifungal compositions for pharmaceutical use
US9700866B2 (en) 2000-12-22 2017-07-11 Baxter International Inc. Surfactant systems for delivery of organic compounds
US20030096013A1 (en) * 2000-12-22 2003-05-22 Jane Werling Preparation of submicron sized particles with polymorph control
US20040022862A1 (en) * 2000-12-22 2004-02-05 Kipp James E. Method for preparing small particles
US7833525B2 (en) * 2000-12-28 2010-11-16 Bhami Shenoy Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US9080146B2 (en) 2001-01-11 2015-07-14 Celonova Biosciences, Inc. Substrates containing polyphosphazene as matrices and substrates containing polyphosphazene with a micro-structured surface
JP4460892B2 (ja) * 2001-06-21 2010-05-12 ジェネンテック インコーポレイテッド 徐放性組成物
IL159475A0 (en) * 2001-06-21 2004-06-01 Altus Biologics Inc Spherical protein particles, compositions containing the same and methods for the production thereof
US20080026068A1 (en) * 2001-08-16 2008-01-31 Baxter Healthcare S.A. Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
DE60226613D1 (de) * 2001-08-16 2008-06-26 Baxter Int Darreichungsformen welche mikropartikel und treibgas enthalten
IL160570A0 (en) 2001-09-26 2004-07-25 Baxter Int Preparation of submicron sized nanoparticles via dispersion and solvent or liquid phase removal
US8101209B2 (en) * 2001-10-09 2012-01-24 Flamel Technologies Microparticulate oral galenical form for the delayed and controlled release of pharmaceutical active principles
WO2003049771A1 (fr) * 2001-12-11 2003-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Capsules alimentaires
US20040033265A1 (en) * 2001-12-31 2004-02-19 Industrial Technology Research Institute Composite matrix containing chitosan derivatives and a process for making the same
WO2003075892A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Novartis Ag Pharmaceutical microparticles
KR100508911B1 (ko) * 2002-05-09 2005-08-18 주식회사 펩트론 서방성 단백질 약물 제형 및 이의 제조방법
US7819908B2 (en) * 2002-06-17 2010-10-26 Aeris Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing lung volume
US20040047855A1 (en) * 2002-06-17 2004-03-11 Bistech, Inc., A Delaware Corporation Compositions and methods for reducing lung volume
AU2003279070A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-23 Acusphere Inc Sustained release porous microparticles for inhalation
DE10306604A1 (de) * 2003-02-18 2004-08-26 Goldschmidt Ag Kosmetische Zubereitungen mit Wirkstoffen in Mikrokapseln
US6960345B2 (en) * 2003-03-06 2005-11-01 Incell Corporation, Llc Oral vaccinia formulation
US8986736B2 (en) * 2003-06-24 2015-03-24 Baxter International Inc. Method for delivering particulate drugs to tissues
US9044381B2 (en) * 2003-06-24 2015-06-02 Baxter International Inc. Method for delivering drugs to the brain
FI20045223A (fi) * 2004-06-15 2005-12-16 Bioretec Oy Monitoiminen biohajoava komposiitti ja kirurginen implantti, joka käsittää mainitun komposiitin
US20050142205A1 (en) * 2003-07-18 2005-06-30 Julia Rashba-Step Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
SG135204A1 (en) * 2003-07-18 2007-09-28 Baxter Int Methods for fabrication, uses and compositions of small spherical particles prepared by controlled phase separation
US20070092452A1 (en) * 2003-07-18 2007-04-26 Julia Rashba-Step Methods for fabrication, uses, compositions of inhalable spherical particles
AU2004258971A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-03 Baxter Healthcare S.A. Small spherical particles of low molecular weight organic molecules and methods of preparation and use thereof
JP2007533634A (ja) * 2003-09-30 2007-11-22 アキュスフィア， インコーポレイテッド 注射、経口、または局所用の徐放性医薬製剤
AU2004285553B2 (en) * 2003-10-31 2009-12-10 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Nanoparticles for drug delivery
CA2545653C (en) * 2003-11-21 2014-07-08 Anp Technologies, Inc. Asymmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US7309500B2 (en) * 2003-12-04 2007-12-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microparticles
US20050186183A1 (en) * 2003-12-08 2005-08-25 Deangelo Joseph Stabilized products, processes and devices for preparing same
CA2548822C (en) * 2003-12-08 2015-08-11 Gel-Del Technologies, Inc. Mucoadhesive drug delivery devices and methods of making and using thereof
JP2007519725A (ja) * 2004-01-29 2007-07-19 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 中枢神経系への増加した送達のための抗レトロウイルス因子のナノ懸濁物
JP2008500281A (ja) 2004-02-11 2008-01-10 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アミリンファミリーペプチドおよびそれらを作成し使用するための方法
US7780873B2 (en) * 2004-02-23 2010-08-24 Texas A&M University System Bioactive complexes compositions and methods of use thereof
US8628690B2 (en) * 2004-02-23 2014-01-14 The Texas A&M University System Nanoemulsion compositions and methods of use thereof
US7399744B2 (en) * 2004-03-04 2008-07-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for affecting body composition
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
CN103393601A (zh) 2004-05-12 2013-11-20 巴克斯特国际公司 含有蛋白并在高浓度蛋白下显示可注射性的微球体
CA2566199C (en) 2004-05-12 2013-10-22 Baxter International Inc. Delivery of as-oligonucleotide microspheres to induce dendritic cell tolerance for the treatment of autoimmune type 1 diabetes
JP2007537284A (ja) 2004-05-12 2007-12-20 バクスター インターナショナル インコーポレイテッド 核酸マイクロスフェア、その生成および送達
EP1763576A2 (de) * 2004-06-15 2007-03-21 Baxter International Inc. Ex-vivo anwendung von festen micropartikeln mit therapeutischen mitteln
US7270305B2 (en) * 2004-06-15 2007-09-18 The Boeing Company Aircraft leading edge apparatuses and corresponding methods
EP2319526A1 (de) 2004-06-17 2011-05-11 Thrasos Therapeutics, Inc. TDF-ähnliche Verbindungen und deren Analogal
US7901711B1 (en) * 2006-04-17 2011-03-08 Gp Medical, Inc. Nanoparticles for protein/peptide delivery and delivery means thereof
US20210299056A9 (en) 2004-10-25 2021-09-30 Varian Medical Systems, Inc. Color-Coded Polymeric Particles of Predetermined Size for Therapeutic and/or Diagnostic Applications and Related Methods
EP1804773B1 (de) 2004-10-25 2011-03-30 CeloNova BioSciences Germany GmbH Beladbare polyphosphazenhaltige teilchen für therapeutische und/oder diagnostische anwendungen sowie herstellungs- und verwendungsverfahren dafür
US9114162B2 (en) 2004-10-25 2015-08-25 Celonova Biosciences, Inc. Loadable polymeric particles for enhanced imaging in clinical applications and methods of preparing and using the same
US9107850B2 (en) 2004-10-25 2015-08-18 Celonova Biosciences, Inc. Color-coded and sized loadable polymeric particles for therapeutic and/or diagnostic applications and methods of preparing and using the same
US7748343B2 (en) 2004-11-22 2010-07-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Electrohydrodynamic spraying system
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
MY139088A (en) 2005-02-21 2009-08-28 Lg Life Sciences Ltd Sustained release composition of protein drug
FR2883750B1 (fr) * 2005-04-04 2009-07-31 Virbac Sa Sa Compositions topiques et leurs utilisations
AU2006264574B2 (en) * 2005-04-15 2012-09-27 Interface Biologics Inc. Methods and compositions for the delivery of biologically active agents
AU2006241145B2 (en) * 2005-04-27 2011-04-28 Baxter Healthcare S. A. Surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
WO2006118948A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
DE602006019709D1 (de) 2005-05-02 2011-03-03 Anp Technologies Inc
MX2008001468A (es) * 2005-06-30 2008-04-07 Sod Conseils Rech Applic Composiciones farmaceuticas del peptido similar al glucagon-1.
US20090062909A1 (en) 2005-07-15 2009-03-05 Micell Technologies, Inc. Stent with polymer coating containing amorphous rapamycin
AU2006270221B2 (en) 2005-07-15 2012-01-19 Micell Technologies, Inc. Polymer coatings containing drug powder of controlled morphology
PT2497780E (pt) 2005-09-20 2015-08-20 Thrasos Innovation Inc Compostos relacionados com tdf e seus análogos
US7855279B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7846445B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1929073A4 (de) * 2005-09-27 2010-03-10 Amunix Inc Proteinöse arzneimittel und ihre verwendung
US20090099031A1 (en) * 2005-09-27 2009-04-16 Stemmer Willem P Genetic package and uses thereof
KR100720056B1 (ko) * 2005-10-06 2007-05-18 (주) 차바이오텍 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어의제조 및 이의 신경분화로의 이용 방법
GB2430881B (en) 2005-10-06 2010-10-13 Ntnu Technology Transfer As Oligoelectrolyte polyols for the treatment of mucosal hyperviscosity
WO2007076701A1 (en) 2005-12-30 2007-07-12 Zensun (Shanghai) Science & Technology Limited Extended release of neuregulin for improved cardiac function
US20070190163A1 (en) 2006-01-24 2007-08-16 Malaknov Michael P Technology for preparation of macromolecular microspheres
US8852625B2 (en) 2006-04-26 2014-10-07 Micell Technologies, Inc. Coatings containing multiple drugs
WO2007130873A2 (en) * 2006-04-28 2007-11-15 Regents Of The University Of Minnesota Liver-specific nanocapsules and methods of using
EP2029740B1 (de) * 2006-05-31 2012-06-20 Genzyme Corporation Verwendung von polysacchariden zur förderung enzymatischer aktivität
US20070281031A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Guohan Yang Microparticles and methods for production thereof
JP5670634B2 (ja) * 2006-07-13 2015-02-18 アッパートン リミティド タンパク質性物質の粒子の製造方法
US20080102128A1 (en) * 2006-07-28 2008-05-01 Flamel Technologies, Inc. Modified-release microparticles based on amphiphilic copolymer and on active principles(s) and pharmaceutical formulations comprising them
AU2007281737B2 (en) 2006-08-04 2013-09-19 Baxter Healthcare S.A. Microsphere-based composition for preventing and/or reversing new-onset autoimmune diabetes
AU2007284759B2 (en) 2006-08-09 2010-10-28 Intarcia Therapeutics, Inc. Osmotic delivery systems and piston assemblies
WO2008060786A2 (en) * 2006-10-06 2008-05-22 Baxter International Inc. Microencapsules containing surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
KR100784134B1 (ko) * 2006-10-09 2007-12-12 주식회사 대웅 상피세포성장인자를 함유하는 안정한 구내염 치료용 액상조성물
US11426494B2 (en) 2007-01-08 2022-08-30 MT Acquisition Holdings LLC Stents having biodegradable layers
WO2008086369A1 (en) 2007-01-08 2008-07-17 Micell Technologies, Inc. Stents having biodegradable layers
CA2688736C (en) * 2007-04-10 2017-07-04 Saint Simeon Lda Novel compositions containing lysozyme and c-1/c-4 polysaccharides and use thereof in oral care, cosmetology and dermatology, contraception, urology and gynecology
GB0707096D0 (en) 2007-04-12 2007-05-23 Ntnu Technology Transfer As Method
US8808747B2 (en) * 2007-04-17 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleic acid microparticles for pulmonary delivery
US8530463B2 (en) * 2007-05-07 2013-09-10 Hale Biopharma Ventures Llc Multimodal particulate formulations
CA2723470C (en) * 2007-05-07 2013-12-03 Hale Biopharma Ventures, Llc Nasal administration of benzodiazepines
US8426467B2 (en) 2007-05-22 2013-04-23 Baxter International Inc. Colored esmolol concentrate
US8722736B2 (en) 2007-05-22 2014-05-13 Baxter International Inc. Multi-dose concentrate esmolol with benzyl alcohol
WO2008157514A2 (en) * 2007-06-14 2008-12-24 Genesegues, Inc. Metal ion-treated biocompatible polymers useful for nanoparticles
US20090029347A1 (en) * 2007-07-27 2009-01-29 Thornthwaite Jerry T Method for Identifying Multiple Analytes Using Flow Cytometry
KR100845009B1 (ko) * 2007-08-07 2008-07-08 한국생명공학연구원 전하를 띠는 물질이 고착된 다공성 고분자 입자 및 그제조방법
BRPI0815416A2 (pt) * 2007-08-15 2014-10-21 Amunix Inc Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos
AU2008325219A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Puretech Ventures Methods, kits, and compositions for administering pharmaceutical compounds
IL188647A0 (en) 2008-01-08 2008-11-03 Orina Gribova Adaptable structured drug and supplements administration system (for oral and/or transdermal applications)
WO2009102467A2 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
WO2009111638A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Baxter International Inc. Compositions and methods for drug delivery
EP2271347B1 (de) 2008-03-28 2016-05-11 Hale Biopharma Ventures, Llc Verabreichung von benzodiazepin-zusammensetzungen
EP3360586B1 (de) 2008-04-17 2024-03-06 Micell Technologies, Inc. Stents mit biologisch abbaubaren schichten
CN102007213B (zh) 2008-04-18 2014-08-06 巴克斯特国际公司 用于预防和/或逆转新发作的自身免疫性糖尿病的基于微球的组合物
RU2499592C2 (ru) 2008-04-21 2013-11-27 Отономи, Инк. Фармацевтическая композиция для лечения ушных заболеваний
JP2011528275A (ja) 2008-07-17 2011-11-17 ミセル テクノロジーズ，インク． 薬物送達医療デバイス
WO2011009096A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
US8784870B2 (en) 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
CA2731769C (en) 2008-07-21 2013-09-10 Otonomy, Inc. Controlled-release otic structure modulating and innate immune system modulating compositions and methods for the treatment of otic disorders
US8323615B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing multi-phasic dispersions
US8323685B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
US20100047292A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Baxter International Inc. Methods of processing microparticles and compositions produced thereby
US8367427B2 (en) 2008-08-20 2013-02-05 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
KR101760953B1 (ko) 2008-09-04 2017-07-24 아밀린 파마슈티칼스, 엘엘씨. 비-수성 담체를 이용한 서방성 제형물
EP2161030A1 (de) * 2008-09-09 2010-03-10 Rijksuniversiteit te Groningen Oxytozinformulierungen und ihre Verwendungen
DK2379096T3 (da) 2008-12-19 2019-11-25 Baxalta GmbH TFPI-inhibitorer og fremgangsmåder til anvendelse
ES2319158B1 (es) 2008-12-23 2010-01-26 Grifols, S.A Composicion de microparticulas biocompatibles de acido alginico para la liberacion controlada de principios activos por via intravenosa.
PT2393828T (pt) 2009-02-03 2017-01-18 Amunix Operating Inc Polipéptidos recombinantes estendidos e composições que compreendem os mesmos
GB0904941D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Ntnu Technology Transfer As Composition
GB0904942D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Ntnu Technology Transfer As Composition
EP2413847A4 (de) 2009-04-01 2013-11-27 Micell Technologies Inc Beschichtete stents
EP2419058B1 (de) 2009-04-17 2018-02-28 Micell Technologies, Inc. Stents mit gesteuerter elution
US10952965B2 (en) * 2009-05-15 2021-03-23 Baxter International Inc. Compositions and methods for drug delivery
SG10201403918RA (en) 2009-07-09 2014-10-30 Oshadi Drug Administration Ltd Matrix carrier compositions, methods and uses
CN102741275B (zh) 2009-08-24 2016-08-03 阿穆尼克斯运营公司 凝血因子ix组合物及其制备和使用方法
KR20150006083A (ko) 2009-09-28 2015-01-15 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 실질 항정상태 약물 전달의 신속 확립 및/또는 종결
WO2011053675A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Cns Therapeutics, Inc. Improved neurturin molecules
WO2011088229A2 (en) 2010-01-13 2011-07-21 The Regents Of The University Of Michigan Active self-healing biomaterial system
WO2011097103A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Micell Technologies, Inc. Stent and stent delivery system with improved deliverability
DK2547355T3 (en) 2010-03-19 2017-03-20 Baxalta GmbH TFPI INHIBITORS AND METHODS OF USE
WO2011119487A2 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for stabilizing protein-containing formulations
CA2794328C (en) * 2010-03-29 2018-01-16 Evonik Degussa Corporation Compositions and methods for improved retention of a pharmaceutical composition at a local administration site
US10232092B2 (en) 2010-04-22 2019-03-19 Micell Technologies, Inc. Stents and other devices having extracellular matrix coating
EP2593039B1 (de) 2010-07-16 2022-11-30 Micell Technologies, Inc. Medizinische wirkstofffreisetzungsvorrichtung
WO2012078649A1 (en) 2010-12-06 2012-06-14 Follica, Inc. Methods for treating baldness and promoting hair growth
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
ES2784192T3 (es) 2011-03-04 2020-09-23 Inst Nat Sante Rech Med Partículas que contienen un factor de crecimiento y usos de las mismas
CA2836251C (en) * 2011-05-18 2017-07-04 Matrivax, Inc. Protein matrix vaccine compositions including polycations
EP4085899A1 (de) 2011-06-14 2022-11-09 Neurelis, Inc. Verabreichung von benzodiazepin
CA2841360A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
US10188772B2 (en) 2011-10-18 2019-01-29 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
CN102516778A (zh) * 2011-11-29 2012-06-27 上海交通大学 一种基于谷物蛋白的、用于大规模培养细胞的微载体，制备方法及用途
US9603906B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Inhalable liquid formulations of DNase I
SI2822577T1 (sl) 2012-02-15 2019-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Rekombinantni proteini faktorja VIII
WO2013122617A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
CA2867363C (en) 2012-03-21 2023-02-28 Baxter International Inc. Tfpi inhibitors and methods of use
WO2014005103A2 (en) 2012-06-28 2014-01-03 Ansun Biopharma, Inc. Microparticle formulations for delivery to the lower and central respiratory tract and methods of manufacture
US9730885B2 (en) 2012-07-12 2017-08-15 Mallinckrodt Llc Extended release, abuse deterrent pharmaceutical compositions
CN102885710B (zh) * 2012-10-22 2014-10-22 西安雅芝生物科技有限公司 一种载有活性成分的海藻酸钠/壳聚糖/胶原复合微球及其制备方法
EP2967803B1 (de) 2013-03-12 2023-12-27 Micell Technologies, Inc. Bioabsorbierbare biomedizinische implantate
CN103285375A (zh) * 2013-05-09 2013-09-11 中国药科大学 藻蓝蛋白微球制剂及其制备方法
WO2014186532A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Micell Technologies, Inc. Bioabsorbable biomedical implants
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
TW201618783A (zh) 2014-08-07 2016-06-01 艾森塔製藥公司 以布魯頓(Bruton)氏酪胺酸激酶(BTK)佔據和BTK再合成速率為基礎之治療癌症、免疫和自體免疫疾病及發炎性疾病之方法
CN104225607B (zh) * 2014-08-25 2017-05-03 华南理工大学 玉米醇溶蛋白微球的制备方法及制备用超声内置透析装置
AU2015311857A1 (en) 2014-09-03 2017-03-23 Genesegues, Inc. Therapeutic nanoparticles and related compositions, methods and systems
WO2016040266A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 Battelle Memorial Institute Enzyme formulation and method for degradation
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
US20170304459A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
US10925639B2 (en) 2015-06-03 2021-02-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
AU2016298307A1 (en) 2015-07-28 2018-02-15 Otonomy, Inc. TrkB or TrkC agonist compositions and methods for the treatment of OTIC conditions
CA2994547A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
KR20240037175A (ko) 2016-05-16 2024-03-21 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 글루카곤-수용체 선택적 폴리펩티드 및 이들의 이용 방법
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
EP3478269A4 (de) 2016-06-29 2020-04-08 Otonomy, Inc. Triclyceridformulierungen für das ohr und verwendungen davon
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
US10835580B2 (en) 2017-01-03 2020-11-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Methods comprising continuous administration of a GLP-1 receptor agonist and co-administration of a drug
HRP20220438T1 (hr) 2017-01-31 2022-06-10 Veru Inc. Pripravci i postupci za dugotrajno oslobađanje antagonista ganadotropin oslobađajućeg hormona (gnrh)
WO2019140012A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Otonomy, Inc. Growth factor otic formulations
CN110115776A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 沈阳药科大学 一种具有抗菌活性的可吸收淀粉微球止血粉及其应用
EP3773770B1 (de) * 2018-04-13 2023-11-29 University of Virginia Patent Foundation Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung und verwendung von nichtimmunogenen, schnell glühenden, mikroporösen, geglühten partikelhydrogelen
CN112512555A (zh) 2018-05-18 2021-03-16 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 治疗血友病a的方法
CN108853595B (zh) * 2018-06-28 2021-04-27 高鼎精细化工(昆山)有限公司 一种磷酸钙修饰的交联玻尿酸微球的制备方法
CN108969470B (zh) * 2018-07-11 2020-07-14 清华大学 缓释药物纳米纤维及其制备方法
EP3886816B1 (de) * 2018-11-29 2023-09-13 Insigna Inc. Östradiolbenzoat als sterilisierungsmittel
CN109364029A (zh) * 2018-12-04 2019-02-22 临沂大学 一种白藜芦醇微球及其制备方法
WO2020115283A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
WO2020114615A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
GB201906835D0 (en) * 2019-05-15 2019-06-26 Ucb Biopharma Sprl Dry microparticles
US20230158125A1 (en) 2020-04-20 2023-05-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Pulmonary Administration of ACE2 Polypeptides

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL289785A (de) * 1962-11-29
DE2010115A1 (de) * 1970-03-04 1971-09-16 Farbenfabriken Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur Herstellung von Mikrogranulaten
JPS523342B2 (de) * 1972-01-26 1977-01-27
US4083831A (en) * 1976-04-09 1978-04-11 Armstrong Cork Company Process for the preparation of granular urethane-urea polymers
US4389330A (en) * 1980-10-06 1983-06-21 Stolle Research And Development Corporation Microencapsulation process
US4530840A (en) * 1982-07-29 1985-07-23 The Stolle Research And Development Corporation Injectable, long-acting microparticle formulation for the delivery of anti-inflammatory agents
US4612008A (en) * 1983-05-11 1986-09-16 Alza Corporation Osmotic device with dual thermodynamic activity
JPS60100516A (ja) * 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US4818542A (en) * 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US4744933A (en) 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5417986A (en) * 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
JP2551756B2 (ja) * 1985-05-07 1996-11-06 武田薬品工業株式会社 ポリオキシカルボン酸エステルおよびその製造法
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
GB8601100D0 (en) * 1986-01-17 1986-02-19 Cosmas Damian Ltd Drug delivery system
US5160745A (en) 1986-05-16 1992-11-03 The University Of Kentucky Research Foundation Biodegradable microspheres as a carrier for macromolecules
NZ221411A (en) * 1986-08-11 1989-10-27 Innovata Biomed Ltd Pharmaceutical compositions containing microcapsules and a surfactant
US5075109A (en) * 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4861627A (en) * 1987-05-01 1989-08-29 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of multiwall polymeric microcapsules
US4897268A (en) * 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5422120A (en) * 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
FR2634121B1 (fr) 1988-07-13 1992-05-07 Imedex Procede de preparation de microparticules de collagene et produits obtenus
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5213788A (en) * 1988-09-29 1993-05-25 Ranney David F Physically and chemically stabilized polyatomic clusters for magnetic resonance image and spectral enhancement
US5008116A (en) 1988-11-14 1991-04-16 Frederick Cahn Immunostimulatory microsphere
JP2582186B2 (ja) * 1989-05-04 1997-02-19 サウザン リサーチ インスティチュート カプセル封じ法及びその製品
MY107937A (en) * 1990-02-13 1996-06-29 Takeda Chemical Industries Ltd Prolonged release microcapsules.
GB9004950D0 (en) * 1990-03-06 1990-05-02 Kelco Int Ltd Controlled release formulation
ATE226091T1 (de) * 1990-05-16 2002-11-15 Southern Res Inst Mikrokapseln mit gesteuerter freigabe sowie deren verwendung zur stimulierung des nervenfaserwachstums
GB9016885D0 (en) * 1990-08-01 1990-09-12 Scras Sustained release pharmaceutical compositions
US5149543A (en) * 1990-10-05 1992-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Ionically cross-linked polymeric microcapsules
WO1992014449A1 (en) * 1991-02-20 1992-09-03 Nova Pharmaceutical Corporation Controlled release microparticulate delivery system for proteins
US5330768A (en) * 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
US5173454A (en) * 1992-01-09 1992-12-22 Corning Incorporated Nanocrystalline materials
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
US5912015A (en) * 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
JP2651320B2 (ja) * 1992-07-16 1997-09-10 田辺製薬株式会社 徐放性マイクロスフェア製剤の製造方法
JP3277342B2 (ja) * 1992-09-02 2002-04-22 武田薬品工業株式会社 徐放性マイクロカプセルの製造法
EP0595030A3 (de) * 1992-10-01 1995-06-07 Tanabe Seiyaku Co Mehrkern-Mikrosphären mit verzögerter Wirkstoffabgabe und Verfahren zu deren Herstellung.
WO1994012158A1 (en) * 1992-12-02 1994-06-09 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Controlled release growth hormone containing microspheres
US5578709A (en) * 1993-03-09 1996-11-26 Middlesex Sciences, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production
US5981719A (en) * 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6090925A (en) * 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5543158A (en) * 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
KR950007873A (ko) 1993-09-20 1995-04-15 후꾸하라 요시하루 생리 활성 물질 지속 방출형의 의약 제제
JP4619457B2 (ja) * 1993-11-18 2011-01-26 シルテックス、メディカル、リミテッド 徐放性製剤
EP2275089A1 (de) * 1993-11-19 2011-01-19 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Herstellung biologisch abbaubarer Mikropartikel, die einen biologisch aktiven Stoff enthalten
US5650173A (en) * 1993-11-19 1997-07-22 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Preparation of biodegradable microparticles containing a biologically active agent
US5783214A (en) * 1994-06-13 1998-07-21 Buford Biomedical, Inc. Bio-erodible matrix for the controlled release of medicinals
US5603955A (en) * 1994-07-18 1997-02-18 University Of Cincinnati Enhanced loading of solutes into polymer gels
US5595760A (en) 1994-09-02 1997-01-21 Delab Sustained release of peptides from pharmaceutical compositions
US6387399B1 (en) * 1994-12-02 2002-05-14 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Microencapsulated bioactive agents and method of making
JPH08225454A (ja) 1995-02-23 1996-09-03 Chugai Pharmaceut Co Ltd マイクロスフェア製剤
US6265389B1 (en) * 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
SE505146C2 (sv) * 1995-10-19 1997-06-30 Biogram Ab Partiklar för fördröjd frisättning
US6270795B1 (en) * 1995-11-09 2001-08-07 Microbiological Research Authority Method of making microencapsulated DNA for vaccination and gene therapy
CA2192782C (en) * 1995-12-15 2008-10-14 Nobuyuki Takechi Production of microspheres
AU3739697A (en) * 1996-07-09 1998-02-02 Johns Hopkins University, The Gene delivery system
US6395302B1 (en) * 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
US5945126A (en) * 1997-02-13 1999-08-31 Oakwood Laboratories L.L.C. Continuous microsphere process
US6656508B2 (en) * 1997-04-17 2003-12-02 Amgen Inc. Sustained-release alginate gels
US20020039594A1 (en) * 1997-05-13 2002-04-04 Evan C. Unger Solid porous matrices and methods of making and using the same
CN1271277A (zh) * 1997-07-18 2000-10-25 因菲米德有限公司 用于生物活性物质控释的生物可降解的大分子的单体
US5989463A (en) * 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) * 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US20010007853A1 (en) * 1998-01-08 2001-07-12 Dimarchi Richard Dennis Method for administering monomeric insulin analogs
US6475995B1 (en) * 1998-01-16 2002-11-05 The Johns Hopkins University Oral delivery of nucleic acid vaccines by particulate complexes
DE19813010A1 (de) 1998-03-25 1999-10-14 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Mikrokapseln mit verzögertem Release
US6395253B2 (en) * 1998-04-23 2002-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microspheres containing condensed polyanionic bioactive agents and methods for their production
US6270802B1 (en) * 1998-10-28 2001-08-07 Oakwood Laboratories L.L.C. Method and apparatus for formulating microspheres and microcapsules
CA2352362C (en) * 1998-11-30 2009-02-17 Nanosphere, Inc. Nanoparticles with polymer shells
US6194006B1 (en) * 1998-12-30 2001-02-27 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Preparation of microparticles having a selected release profile
US6395300B1 (en) * 1999-05-27 2002-05-28 Acusphere, Inc. Porous drug matrices and methods of manufacture thereof
DE69910987T2 (de) 1999-06-14 2004-05-19 Baxter International Inc., Deerfield Mikrosphären mit verzögerter Wirkstoffabgabe
US6458387B1 (en) * 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
FR2809309B1 (fr) * 2000-05-23 2004-06-11 Mainelab Microspheres a liberation prolongee pour administration injectable
KR100392501B1 (ko) * 2000-06-28 2003-07-22 동국제약 주식회사 다중 에멀젼법에 의한 서방출성 미립구의 제조방법
US6471995B1 (en) * 2000-09-27 2002-10-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Ii Apparatus and method for preparing microparticles using liquid-liquid extraction
US6475468B2 (en) * 2001-02-15 2002-11-05 Aeropharm Technology Incorporated Modulated release particles for aerosol delivery
US6896905B2 (en) * 2001-02-15 2005-05-24 Rohm And Haas Company Porous particles, their aqueous dispersions, and method of preparation
DE60226613D1 (de) * 2001-08-16 2008-06-26 Baxter Int Darreichungsformen welche mikropartikel und treibgas enthalten
US20040014698A1 (en) * 2002-07-18 2004-01-22 Gonzalo Hortelano Oral administration of therapeutic agent coupled to transporting agent
SG135204A1 (en) * 2003-07-18 2007-09-28 Baxter Int Methods for fabrication, uses and compositions of small spherical particles prepared by controlled phase separation
AU2004258971A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-03 Baxter Healthcare S.A. Small spherical particles of low molecular weight organic molecules and methods of preparation and use thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014013751A1 (de) 2014-09-22 2016-03-24 Justus-Liebig-Universität Giessen Pulmonale Arzneimittelformulierung mit verzögerter Freisetzung

Also Published As

Publication number Publication date
EP1837018A1 (de) 2007-09-26
WO2001028524A1 (en) 2001-04-26
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ATE458474T1 (de) 2010-03-15
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DE60035211D1 (de) 2007-07-26
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ES2341578T3 (es) 2010-06-22
EP1223917A1 (de) 2002-07-24
US6458387B1 (en) 2002-10-01
DE60043910D1 (de) 2010-04-08
AU1198001A (en) 2001-04-30
EP1223917B1 (de) 2007-06-13

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