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CN102007213B - 用于预防和/或逆转新发作的自身免疫性糖尿病的基于微球的组合物 - Google Patents

用于预防和/或逆转新发作的自身免疫性糖尿病的基于微球的组合物 Download PDF

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CN102007213B CN200980113547.XA CN200980113547A CN102007213B CN 102007213 B CN102007213 B CN 102007213B CN 200980113547 A CN200980113547 A CN 200980113547A CN 102007213 B CN102007213 B CN 102007213B
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Abstract

本发明提供了一种方法，所述方法包括使用反义手段在体内逆转和/或延迟自身免疫性糖尿病病症。将寡核苷酸靶向结合于原始转录本CD40、CD80、CD86及其组合。

Description

用于预防和/或逆转新发作的自身免疫性糖尿病的基于微球的组合物
关于政府权益的陈述
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)提供的资助号为R21 DK49835-01的政府资助下做出的。政府在本发明中享有一定权利。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2008年4月18日提交的美国临时专利申请No.61/046,034和2008年4月28日提交的美国临时专利申请No.61/048,246的优先权。每个上述申请的全部文本在此引为参考。
背景技术
总的来说，本公开涉及在NOD小鼠中预防和/或逆转自身免疫性糖尿病病症的反义方法。这包括通过注射用微球投送AS-寡核苷酸，以特别是在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中实现导致负调节活性的治疗效果。微球使用完全水性条件制造，其中微球包含一种或多种反义(AS)寡核苷酸。
微粒、微球和微囊是直径小于1毫米并可以小于100微米的固体或半固体粒子，其可以由各种不同材料形成，包括合成聚合物、蛋白和多糖。微球已经使用在许多不同应用中，主要是分离、诊断和药物投送。
可以使用许多不同技术从合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多糖来制造这些粒子，这些技术包括相分离、溶剂蒸发、乳化作用和喷雾干燥。一般来说，聚合物形成这些微球的支撑结构，并且目标药物掺入到聚合物结构中。用于形成微球的示例性聚合物包括在Ruiz的美国专利No.5,213,812、Reid等的美国专利No.5,417,986、Tice等的美国专利No.4,530,840、Tice等的美国专利No.4,897,268、Tice等的美国专利No.5,075,109、Singh等的美国专利No.5,102,872、Boyes等的美国专利No.5,384,133、Tice等的美国专利No.5,360,610以及南方研究所(SouthernResearch Institute)的欧洲专利申请公开号248,531中所描述的乳酸和乙醇酸的同聚物和共聚物(PLGA)；嵌段共聚物例如在Illum的美国专利No.4,904,479中描述的908和泊洛沙姆(poloxamer)407；以及在Cohen等的美国专利No.5,149,543中描述的聚磷腈。使用例如这些聚合物产生的微球表现出不良的负载效能，通常只能将少量百分比的目标药物掺入到聚合物结构中。因此，为了获得治疗效果，通常必须给药显著量的这些类型的微球。此外，这些聚合物典型是疏水的，对目标药物的溶解具有负面影响。在这种情况下典型使用的聚合物包括聚乳酸乙醇酸(PLGA)。
医学团体的目标是将核酸投送到动物中的细胞，用于治疗各种疾病包括糖尿病。在许多方法中，可以通过加入转染试剂将核酸相对高效地投送到培养物中的细胞(体外)。此外，在体内，内源性核酸酶的存在导致当核酸被投送到动物时核酸被高速降解。
除了保护核酸免于核酸酶消化之外，核酸投送载体必须表现出低毒性、必须被细胞有效摄取，并具有明确的、容易制造的制剂。正如在临床试验中显示的，用于投送的病毒载体可以在体内导致严重不利的、甚至是致命的免疫应答。此外，这种方法具有在体内具有诱变效应的可能性。通过将核酸复合在不同制剂的脂类复合物(例如脂质体或阳离子脂类复合物)中投送，可能具有毒性效应。核酸与各种聚合物或与肽的复合显示出不一致的结果，并且这些制剂的毒性还没有被解决。核酸也已被囊封在聚合物基质中用于投送，但在这些情况下粒子具有广泛的尺寸范围，并且用于治疗性应用的有效性还没有被证实。这些以前的方法可能产生与本文所需的目标相反的效应，包括刺激免疫系统。例如，当PLGA被掺入到粒子中时，免疫系统受到PLGA存在的刺激。
因此，对于解决核酸投送中的问题存在着需求，并且对于开发微球和用于制造微球的新方法存在着持续的需求。关于微球的详细情况、特别是关于它们的制备和性质的详细情况，可以在Scott等的美国专利No.6,458,387、Woiszwillo等的美国专利No.6,268,053、No.6,090,925、No.5,981,719和No.5,599,719以及Woiszwillo的美国专利No.5,578,709和Brown等的美国专利申请公开号No.2006/0024240中发现。这些以及本文中指明的所有参考文献在此引为参考。
发明概述
根据本公开，寡核苷酸作为微球投送。据信这样的投送方法阻止核酸酶接近微球中的核酸。进行反义(AS)寡核苷酸的微球投送是为了诱导树突状细胞耐受性，特别是在NOD小鼠模型中诱导树突状细胞耐受性。使用能使反义(AS)寡核苷酸掺入的水性条件来制造微球。这些微球被用于在NOD小鼠体内抑制基因表达和预防和/或逆转自身免疫性糖尿病病症。
在本公开的一个方面，合成了靶向CD40、CD80和CD86转录本的三种AS-寡核苷酸，制备了寡核苷酸混合物的水性溶液并将其与水性聚合物溶液合并。形成了含有寡核苷酸的微球，并通过注射将它们投送到NOD小鼠。
在本公开的一个方面，提供了用于在哺乳动物中逆转1型糖尿病的方法，所述方法包括给药微球组合物，其中组合物中的微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸。寡核苷酸可以选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3及其组合，或事实上是靶向CD40、CD80和CD86的任何其他寡核苷酸。
另一方面，提供了在哺乳动物中治疗或逆转1型糖尿病的方法，所述方法包括以有效治疗或逆转1型糖尿病的量给药含微球的组合物，所述微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7以及靶向并结合CD40、CD80和CD86原始转录本的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的修饰形式的多核苷酸序列。
本公开的另一方面涉及保护哺乳动物的胰腺β细胞免于自身免疫破坏的方法，所述方法包括将微球组合物注射到哺乳动物中，其中组合物中的微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸。
本发明的另一方面是用于保护哺乳动物的胰腺β细胞免于自身免疫破坏的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药有效保护胰腺β细胞的量的含微球组合物，所述微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7以及靶向并结合CD40、CD80和CD86原始转录本的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的修饰形式的多核苷酸序列。
另一方面是在哺乳动物中减少胰腺的T-细胞介导的炎症和/或胰腺β细胞死亡的方法，所述方法包括向哺乳动物给药微球组合物，其中组合物中的微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，其中组合物的给药量在哺乳动物中有效缓解1型糖尿病的症状。在更明确情况下，组合物在1型糖尿病临床发作后给药。在可替选情况下，组合物在1型糖尿病临床发作前给药。在这些治疗性情况下，组合物的给药使哺乳动物中的血糖水平与给药前哺乳动物的血糖水平相比恢复正常。
另一方面是在哺乳动物中减少T-细胞介导的胰腺炎症和/或胰腺β细胞死亡的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药有效减少T-细胞介导的胰腺炎症或胰腺β细胞死亡的量的含微球组合物，所述组合物中的所述微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含选自SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7以及靶向并结合CD40、CD80和CD86原始转录本的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的修饰形式的多核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了在患有新发作或临床前自身免疫性糖尿病的哺乳动物中保护残留β细胞量的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药能够有效保护残留β细胞量的量的含微球组合物，其中组合物的给药将哺乳动物的β细胞量维持在糖尿病发作前存在的量的至少约15％，所述组合物中的所述微球包含与选自CD40、CD80和CD86原始转录本及其组合的原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：7以及靶向并结合CD40、CD80和CD86原始转录本的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的修饰形式的多核苷酸序列。
组合物的给药可以使哺乳动物的β细胞群体再生或停止β细胞群体的进一步恶化，或同时二者。
组合物可以任何形式给药，在某些示例性方面作为可注射形式给药。在特定方面，组合物与胰岛素组合给药。当使用组合疗法时，胰岛素可以在微球组合物给药之前、同时或之后给药。
在各种不同实施方案中，组合物中的微球包含反义寡核苷酸，其各自包含多核苷酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。在其他实施方案中，组合物中的微球包含反义寡核苷酸，其各自由多核苷酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7构成。在其他实施方案中，组合物中的微球包含与SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％或更高的多核苷酸序列同源性、并靶向和结合CD40、CD80和CD86原始转录本的反义寡核苷酸。
其他方面涉及在患有新发作或临床前自身免疫性糖尿病的对象中保护残留β细胞量的方法，所述方法包括向对象给药含微球组合物，所述微球包含与CD40、CD80和CD86原始转录本反义并靶向结合的寡核苷酸，其中组合物的给药将哺乳动物的β细胞量维持在糖尿病发作前存在的量的至少约15％。对象可以是人类对象。对象可以是人类儿童。治疗方法可以包括组合物的重复给药，并且重复给药增加了哺乳动物的β细胞量。
在具体的确定方法中，30％并且多至70％w/w的微球是寡核苷酸。这样的组合物典型地可以在微球组合物中包含1∶1∶1比例的反义CD40∶反义CD80∶反义CD86。
在其他实施方案中，提供了包含微球的药物组合物，所述微球包含反义寡核苷酸，其各自具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中提出的多核苷酸序列，与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7具有至少75％的多核苷酸序列同源性、并靶向和结合CD40、CD80和CD86原始转录本的多核苷酸序列，或靶向并结合CD40、CD80和CD86原始转录本的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的修饰形式。在这些实施方案的某些方面，微球包含各自与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％或更高的多核苷酸序列同源性、并靶向和结合CD40、CD80和CD86原始转录本的反义寡核苷酸。
本公开的这些以及其他方面、目的、特征和优点、包括各种不同组合，通过考察下面的详细描述将变得明显并被清楚地理解。
附图说明
在本说明的过程中，将参考随附的图，其中：
图1a和1b是AS-寡核苷酸和聚L-赖氨酸聚阳离子的微球的扫描电子显微照片。
图2a和2b是显示了本公开的微球制备物的性质的图。图2a是显示了微球制备物的粒径分布的图。图2b显示了微球制备物的表面电荷的图。
图3是微球的解聚(deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC层析图。
图4是图，显示了在用本公开的反义寡核苷酸微球(AS-MSP)多次治疗的NOD小鼠中与用乱序的(scrambled)寡核苷酸微球或单独用PBS介质治疗的动物相比对糖尿病的预防。
图5是图，显示了在用本公开的AS-MSP治疗一次的NOD小鼠中与用乱序的寡核苷酸微球或单独用PBS介质治疗的动物相比对糖尿病的预防。
图6a-6d是来自对照NOD小鼠的用苏木精和曙红染色(图6和c；H+E)染色或针对胰岛素染色(图6b和6d)的胰腺组织切片的光学显微照片。
图7a-7d是来自AS-MSP处理的NOD小鼠的用苏木精和曙红染色(图7a和c；H+E)染色或针对胰岛素染色(图7b和7d)的胰腺组织切片的光学显微照片。
图8显示了从用本公开的AS-MSP处理的小鼠或对照动物获得的T细胞的FACS分析。
图9显示了相对荧光强度(RFI)的图，证实了本公开的来自用AS-MSP治疗的动物并与脾细胞培养的T细胞的增殖。
图10显示了RFI的图，证实了在体外在同系的辐射过的脾细胞和卵清蛋白存在下，来自AS-MSP治疗过的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞的增殖。
图11显示了RFI的图，证实了在体外在同系的胰岛裂解物存在下，来自AS-MSP治疗过的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞增殖的抑制。
图12是来自用含反义或乱序寡核苷酸的微球治疗过的新发作糖尿病小鼠的血糖水平的图。
图13A显示了使用具有新发作糖尿病的小鼠进行的实验的时间线，图13B和13C是来自用AS-MSP或对照治疗过的新发作糖尿病小鼠的平均血糖水平的图。
图14A-C显示了NOD小鼠中1型糖尿病表型的逆转。这些图显示了在AS-MSP给药后，哺乳动物的血糖水平在15天内返回到正常(正常水平用虚线显示，约为200mg/dL)，并甚至在AS-MSP给药停止后(第30天)也保持在正常。
图15：显示了自身免疫性糖尿病的治疗性逆转的模型。
图16显示了人类树突状细胞(DC)对寡脱氧核苷酸(ODN)的摄取。图16A显示了被hDC摄取FITC标记的CD86 AS-寡核苷酸；图16B显示了AS-ODN治疗的hDC对DQ-卵清蛋白的摄取/加工；图16C通过LPS处理后DC实施方案的FACS显示了表型。
图17显示了来自最近给药破伤风加强疫苗的健康人类志愿者的T-细胞，在破伤风类毒素的存在下与自体AS-ODN处理过的源自外周血的DC共培养时的增殖。误差线表示来自同样个体细胞的三次独立共培养物的反应的平均值的标准误差。
图18显示了来自健康人类志愿者的T-细胞，在存在或不存在完整卵清蛋白作为标称抗原的情况下与自体AS-ODN处理过的源自外周血的DC共培养时的增殖。误差线表示来自三个独立志愿者的反应的平均值的标准误差。
图19显示了来自健康人类志愿者的T-细胞与同种异体AS-ODN处理过的源自外周血的DC或未处理的同种异体DC共培养时的增殖。误差线表示来自三个独立志愿者的反应的平均值的标准误差，其中DC供体保持相同。
图20显示了源自人类单核细胞的树突状细胞与ASO-MS温育后的蛋白表达。
图21显示了与人类ASO-MS培养后蛋白表达的降低百分率。
说明性实施方案的描述
根据需要，在本文中公开了本公开的详细实施方案；但是，应该理解，所公开的实施方案仅仅是本公开内容的示例，本公开内容可以以各种不同形式体现。因此，本文公开的具体详细描述不应被解释为限制性的，而是仅仅作为权利要求的基础，以及作为教导本领域技术人员以事实上任何适合方式多种多样地使用本公开内容的代表性基础。
I型糖尿病是自身免疫病症，其中胰腺、特别是产胰岛素的内分泌β细胞存在渐进性炎症。在发作前，炎症首先造成内分泌β细胞功能障碍。在人类自身免疫性(1型)糖尿病的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中单次注射微球制剂，显著延迟了疾病发作。尽管不希望束缚于任何具体理论，但据信在疾病发作前，微球通过注射位点处的驻留性和迁移性树突状细胞摄取，然后移动到最近的淋巴结中。也相信，在治疗过的受体中发生了在体外靶向推测的β细胞抗原的T-细胞增殖的降低。在用同系T-细胞和树突状细胞重建然后给药微球的免疫缺陷NOD-scid小鼠中，可能发生CD4+CD25+推测的调控性T细胞流行性的增加。因此，基于微球的治疗组合物可以调节树突状细胞活性并动员调控网络用于预防。
将阻止糖尿病发作的治疗方法是理想的。在临床发作后当显著数量的β细胞已被破坏时将阻止或逆转疾病的治疗组合物也将是理想的。在新发作糖尿病小鼠中重复给药使高血糖恢复正常并逆转了疾病。逆转典型是指使个体例如人类或其他哺乳动物表现出接近正常化的血糖水平。不希望束缚于任何特定理论，据信在“逆转”期间，抵御了诱导疾病的T-细胞炎症和细胞死亡。
一个实施方案通过配制和注射本文中描述的靶向CD40、CD80和CD86转录本的反义(AS)-寡核苷酸微球，逆转了自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病。针对转录本的反义寡核苷酸的具体实例公开在本文的实施例中。应该理解，可以设计有效结合CD40、CD80和CD86转录本以获得本文所述效应的其他反义寡核苷酸。还应该理解，这样的寡核苷酸可以包含本技术领域中已知的修饰，包括但不限于巯基化(thioation)、甲基化和甲氧基乙基化，并且这种修饰的位置和数量可以变化，以获得最适效果。这些寡核苷酸被设计用于诱导免疫耐受，导致在NOD小鼠模型中逆转产胰岛素β细胞的破坏。
也考虑到了寡核苷酸的修饰形式，包括具有至少一个修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。寡核苷酸的“修饰形式”包括但不限于修饰的核苷间键合和/或修饰的碱基。
在一个实施方案中，寡核苷酸全部或部分是肽核酸。其他修饰的核苷间键合包括至少一个硫代磷酸酯键合。其他修饰的寡核苷酸包括含有一个或多个通用碱基的寡核苷酸。“通用碱基”是指能够通过形成氢键代替用于与核酸中任一个A、C、G、T和U结合并且不使结构发生显著去稳定化的分子。
寡核苷酸的具体实例包括含有修饰骨架或非天然核苷间键合的寡核苷酸。具有修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸被认为包含在“寡核苷酸”的含义之内。
含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括例如具有正常的3′-5′键合的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它们的2′-5′连接类似物，以及具有颠倒的极性、其中一个或多个核苷酸间键合是3′到3′、5′到5′或2′到2′键合的类似物。还考虑到了具有颠倒的极性、在最3′核苷酸间键合处包含单个3′到3′键合、即可能是无碱基的(核苷酸失去碱基或用羟基代替它)单个颠倒的核苷残基的寡核苷酸。也考虑到了盐、混合的盐和游离酸形式。教导了上述含磷键合的制备的代表性美国专利包括美国专利No.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050，其公开内容在此引为参考。
其中不包含磷原子的修饰寡核苷酸骨架，具有由低级烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或杂烷基核苷间键合或一个或多个低级杂原子或杂环核苷间键合形成的骨架。这些包括具有吗啉代键合；硅氧烷键合、硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含链烯骨架；氨基磺酸酯骨架，亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。参见例如美国专利No.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，其公开内容在此以其全文引为参考。
在其他实施方案中，提供了寡核苷酸模拟物，其中核苷酸单元的一个或多个糖和/或一个或多个核苷酸间键合被“非天然存在”的基团取代。维持了寡核苷酸的碱基用于与靶多核苷酸杂交。在一个方面，本实施方案考虑到了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架代替。参见例如美国专利No.5,539,082、5,714,331和5,719,262以及Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500，其公开内容在此引为参考。
在其他实施方案中，提供了具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，和具有杂原子骨架并包括在美国专利Nos.5,489,677和5,602,240中描述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-的寡核苷。还考虑到了具有美国专利5,034,506中描述的具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸。
在各种不同形式中，在寡聚物中两个连续单体之间的键合由2到4个、理想为3个选自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R″)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O，S)-、-P(S)2-、-PO(R″)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-的基团/原子构成，其中RH选自氢和C1-4-烷基，R″选自C1-6-烷基和苯基。这种键合的说明性实例是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当用作与随后单体的键合时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(当用作与随后单体的键合时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(当用作与随后单体的键合时包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRHH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-以及-O-Si(R″)2-O-，在其中考虑到了-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-O-P(-O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3)-O-以及-O-PO(NHRN)-O-，其中RH选自氢和C1-4-烷基，R″选自C1-6-烷基和苯基。其他说明性实例在Mesmaeker等，Current Opinionin Structural Biology 1995，5，343-355以及Susan M.Freier和Karl-HeinzAltmann，Nucleic Acids Research，1997，vol 25，pp 4429-4443中给出。
寡核苷酸的其他修饰形式详细描述在美国专利申请No.20040219565中，其公开内容在此以其全文引为参考。
修饰的寡核苷酸也可以包含一个或多个取代的糖组成部分。在某些情况下，寡核苷酸在2′位置处包含下列基团之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。其他实施方案包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1到约10。其他寡核苷酸在2′位置处包含下列基团之一：C1到C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂开基团、报告基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸的药物动力学性质的基团、或用于改进寡核苷酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。在个方面修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也被称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基。其他修饰包括在下文的实施例中描述的2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，以及也在下文的实施例中描述的2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本技术领域中也称为2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟(2′-F)。2′-修饰可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在一个方面，2′-阿拉伯糖位修饰是2′-F。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其他位置上做出，例如在3′末端核苷酸上或2′-5′连接的寡核苷酸中的糖的3′位置，和5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如环丁基部分代替呋喃戊糖基的糖。参见例如美国专利No.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920，其公开内容在此以其全文引为参考。
在一个方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2′-羟基连接到糖环的3′或4′碳原子，从而形成了双环糖部分。在某些方面，键合是桥接2′氧原子与4′碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备描述在WO 98/39352和WO 99/14226中。
寡核苷酸也可以包括碱基修饰或取代。在本文中使用时，“未修饰的”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰碱基包括其他合成和天然碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他烷炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其他修饰碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰碱基也可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的碱基，例如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的碱基，在Kroschwitz，J.I主编的《聚合物科学和工程简明百科全书》858-859页(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages858-859，John Wiley & Sons，1990)中公开的碱基，由Englisch等在Angewandte Chemie国际版，1991，30，613中公开的碱基，以及由Sanghvi，Y.S.在《反义研究与应用》(第15章，Antisense Research andApplications，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.主编，CRC Press，1993)中公开的碱基。某些这些碱基可用于增加结合亲和性，并包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已被显示将核酸双链体的稳定性增加了0.6-1.2℃，并在某些方面与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合。参见美国专利No.3,687,808、美国专利No.4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121,5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096、5,750,692 and 5,681,941，其公开内容在此引为参考。
“修饰碱基”或其他类似术语是指能够与天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或与非天然存在的碱基配对的成分。在某些方面，修饰碱基提供了15、12、10、8、6、4或2℃或更低的Tm差异。示例性的修饰碱基描述在EP 1 072 679和WO97/12896中。
“核碱基”是指天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，以及非天然存在的核碱基例如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N′，N′-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-烷炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷，以及在Benner等的美国专利No.5,432,272和Susan M.Freier与Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，1997，vol.25，pp4429-4443中描述的“非天然存在的”核碱基。因此，术语“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环化合物，而且包括杂环类似物及其互变异构体。其他天然和非天然存在的核碱基包括在美国专利No.3,687,808(Merigan等)、Sanghvi的《反义研究与应用》第15章(AntisenseResearch and Applications，S.T.Crooke和B.Lebleu主编，CRC Press，1993)、Englisch等，Angewandte Chemie国际版，1991，30，613-722(参见特别是622和623页)，以及在《聚合物科学和工程简明百科全书》(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，J.I.Kroschwitz主编，John Wiley & Sons，1990，858-859页)、Cook，Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585-607中公开的核碱基，每个上述文献在此以其全文引为参考。术语“核苷碱基”或“碱基单元”还打算包括能够起到类似核碱基作用的化合物例如杂环化合物，包括在最经典的意义上不是核苷碱基但起到核苷碱基作用的某些“通用碱基”。作为通用碱基可以特别提到的是3-硝基吡咯、任选取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任选取代的次黄嘌呤。其他理想的通用碱基包括吡咯、二唑和三唑衍生物，包括本技术领域中已知的通用碱基。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸在一个碱基位置上被修饰。在其他方面，寡核苷酸在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多碱基位置处被修饰。本发明考虑了任何修饰，只要得到的寡核苷酸保持与其靶转录本结合的能力即可。
本发明考虑到的其他序列包括但不限于表1中提出的序列。
表1
1型糖尿病在NOD小鼠以及人类中表现为胰腺产胰岛素β细胞的自身免疫性破坏。在临床发作时，人类典型具有10-20％或更少的剩余β细胞量。任何这种备用剩余量可以导致剩余的胰岛素水平足够调节葡萄糖水平。此外，β细胞破坏的逆转可以导致β细胞群的部分再生。提供了本公开的含有寡核苷酸的微粒以干扰β细胞的自身免疫性破坏。
应该认识到，树突状细胞(DC)可以被活化成在所有组织中发现并存在于皮肤下的强有力的抗原呈递细胞。这些抗原呈递树突状细胞通过活化特别是淋巴结中的T-细胞，起到免疫应答、包括自身免疫性应答的引发剂的作用。尽管不希望束缚于理论，但据信CD40、CD80和CD86对于自身免疫性应答来说是重要的，这些分子的下调据认为促进了自身免疫应答性降低。此外，作为应答性降低降低的结果，某些细胞因子例如干扰素和白介素减少。
在用于在小鼠中治疗自身免疫性糖尿病的微球的制造中，可以将一种、两种或三种AS-寡核苷酸溶解在水性溶液中，并与水溶性聚合物和聚阳离子组合。溶液典型地在约60-70℃下温育，冷却到约23℃，并除去过量聚合物。
核酸典型地占微球的约30到约100重量百分比之间，并具有不超过约50微米、典型不超过约20微米并可以不超过约10微米的平均粒径。典型情况下它们的制备如下。制备寡核苷酸的水性溶液或寡核苷酸。当制备含有三种寡核苷酸的微球时，将来自三种寡核苷酸溶液的等份试样组合。每种溶液含有这三种寡核苷酸类型中的一种。最终的含寡核苷酸溶液典型地含有约10mg/ml的寡核苷酸。
在具体实例中，微球制剂包含65％、70％、75％、80％、85％、90％w/w或更高的寡核苷酸载量。在这样的实施方案中，组合物具有6-10％w/w的聚L-赖氨酸含量，此外微球的水分含量可变并可以为约4％。在一个方面，寡核苷酸以1∶1∶1的反义CD40∶反义CD80∶反义CD86的比存在。本发明考虑到的其他制剂将包含推测的自身抗原。它们包括但不限于完整的人类胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)和胰岛瘤相关蛋白-2(IA-2)。
将这些与10mg/ml聚阳离子储液的等份试样合并。聚阳离子的实例是聚赖氨酸和聚鸟氨酸。其他包括聚乙烯亚胺(PEI)、醇溶谷蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚精氨酸、乙烯胺和带正电荷多糖的衍生物例如带正电荷壳聚糖及其组合。聚阳离子溶液可以采用约1∶1到约4∶1的聚阳离子∶寡核苷酸体积比。常用的聚阳离子包括聚L-赖氨酸·HBr(高达70,000道尔顿，可以从Bachem获得)和聚L-鸟氨酸·HBr(例如11,900道尔顿，可以从Sigma获得)。
也制备聚合物溶液。它们可以起到相分离增强剂的作用。适合的聚合物的实例包括直链或支链聚合物、共聚物和嵌段共聚物。这些聚合物可以是水溶性、半水溶性、与水混溶或可溶于与水混溶溶剂中的。聚合物的实例包括可药用添加剂例如各种不同分子量的聚乙二醇例如PEG 200、PEG 300、PEG 3350、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000等，以及各种不同分子量的泊洛沙姆例如泊洛沙姆188和Pluronic F127或Pluronic F68。常用的聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。另一种聚合物是羟乙基淀粉。其他两亲性聚合物也可以单独或组合使用。相分离增强剂也可以是非聚合物例如丙二醇与乙醇的混合物。
在典型的实施方案中，可以制备聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液，并与其他溶液合并。加热、冷却、离心和洗涤多次提供了水性悬液，其典型情况下被冷冻或冷冻干燥，以形成含有寡核苷酸和聚阳离子的微球的干粉。
微球适合于通过可注射途径体内投送，包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鞘内、硬膜外、动脉内、关节内等。可以实施的其他投送途径包括例如局部、口部、直肠、鼻部、肺部、阴道、颊、舌下、透皮、透黏膜、眼部或眼内。出于本公开的目的，有利的是可用注射器投送的途径。因此，在一个方面，可以将微粒或微球吸入注射器，并通过细针头进行注射。适合的投送途径是使用细孔针头注射，包括皮下、眼部等。术语“细孔针头”是指至少20号尺寸、典型在约22号到约30号之间或更高号数的针头。在一种情况下，细孔针头至少与24号一样细、至少与26号一样细和至少与28号一样细。
在一个方面，微粒或微球能够以每ml被注射的组合物至少但不限于约10μg寡核苷酸的浓度注射。例如，约150到约500mg寡核苷酸可以在不超过约1ml、对于许多应用来说一般小于约2ml的投送体积中注射。剂量可以在一天内分成2或3或多剂，或单次每日剂量给药。
在各种不同方面，微粒或微球能够以每ml被注射的组合物至少但不限于约0.01到约1000mg的浓度注射。在其他方面，微粒或微球能够以每ml被注射的组合物至少约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、25、30、35、40、45或50mg或更高的浓度注射。在相关方面，微粒或微球能够以每ml被注射的组合物至少约55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000mg的浓度注射。
注射投送在正常的注射时期内进行。典型情况下，这种时期是不超过约20秒或更短的时间，但不限于此。
不受任何具体理论的束缚，据信本文示例的含有反义寡核苷酸的微球下调细胞表面分子CD40、CD80和CD86。注射微球，据信树突状细胞主动摄取寡核苷酸微球。这些寡核苷酸抑制细胞表面细胞分子CD40、CD80和CD86在树突状细胞中的表达。在NOD小鼠中，在发生后给药这些反义寡核苷酸微球，有效地逆转了糖尿病。
下面的实施例说明了本公开的某些特点和优点，以便对本公开进行进一步说明。实施例不被当作限制性的或限定了本公开内容。
实施例
实施例1
合成了三种靶向CD40、CD80和CD86原始转录本的AS-寡核苷酸。在本实施例中使用的AS-寡核苷酸如下，其中星号表示骨架中巯基化的位点：
Seq ID 1：CD 40-AS：5′C*AC*AG*CC*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*CA*T*GC*AG*GG*C*A-3′
Seq ID 2：CD80-AS：5′-G*GG*AA*AG*CC*AG*GA*AT*CT*AG*AG*CC*AA*TGG*A-3′
Seq ID 3：CD86-AS：5′-T*GG*GT*GC*TT*CC*GT*AA*GT*TC*TG*A*AC*AC*G*T*C_3′
通过将三种各含有一种寡核苷酸类型的寡核苷酸溶液的等份试样合并，形成三种类型寡核苷酸的10mg/ml溶液，制备了寡核苷酸化合物的水性溶液。制备了聚L-赖氨酸·HBr在去离子水中的10mg/ml溶液(聚L-赖氨酸·HBr高达70,000道尔顿，由Bachem，King of Prussia，PA制造)。将聚L-赖氨酸·HBr以1∶1的体积比添加到寡核苷酸溶液中。将混合物轻柔地涡旋混合。以2∶1的体积比加入25％聚合物溶液，该溶液在1M pH5.5的乙酸钠(Spectrum，Gardena，CA)中含有12.5％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，40,000道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3,350道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，所述体积比如下：0.75ml AS-寡核苷酸，0.75ml聚L-赖氨酸·HBr，3.0mlPEG/PVP，总体积为4.50ml。
将批料在70℃温育30分钟，然后冷却到23℃。在冷却后，溶液变得浑浊并形成了微球。然后将悬液离心，除去过量PEG/PVP。通过将得到的沉淀重新悬浮在去离子水中，然后离心并除去上清液，对得到的沉淀进行洗涤。洗涤过程重复三次。将水性悬液冷冻并冷冻干燥，形成含有寡核苷酸和聚L-赖氨酸的微球的干粉。
图1a和1b显示了1∶1的聚L-赖氨酸∶寡核苷酸比例的微球在两种不同放大倍数下的扫描电子显微照片(SEM)。制造的微球尺寸为0.5-4μm，平均粒径约为2.5μm。图2a显示了通过激光散射所显示的按照本公开制造的一种微球制备物的粒径分布。图2b显示了通过光散射确定的微球制备物的表面电荷(ζ电位)。图3显示了反相(RP)HPLC方法，用于对解聚后微球的反义寡核苷酸组分进行载量定量和完整性评估。微球使用CD86、CD40、CD80寡核苷酸和聚L-赖氨酸(PLL；MW30-70kD)配制。然后使用聚L-天冬氨酸(PAA)将DNA寡核苷酸从PLL竞争性置换出来，将微球解聚。PAA被选为在260nm处无吸收并且不干扰寡核苷酸在260nm处定量的聚氨基酸试剂。在RP-HPLC谱图例如图3中，每个峰下的面积与微球中装载的每种寡核苷酸的量成正比。如图3中所示，峰高表明每种寡核苷酸在微球中大约相等的载量。微球中的寡核苷酸的载量被计算为约65％到约80％重量比。图3还显示寡核苷酸的完整性没有受到微球配制过程的影响，正如解聚后峰的狭窄分布所表明的。
实施例2
在本实施例中，显示了覆盖本公开的保护性方面的试验的结果。如图4中所示，在5-8周龄的NOD小鼠中单次给药AS-MSP延迟了糖尿病发作。对两组NOD雌性小鼠(5-8周龄)进行配制在本公开的微球中的反义寡核苷酸(AS-MSP)的单次皮下注射。注射的制剂的量被认为含有50μg的每种反义寡核苷酸(反义CD40、反义CD80和反义CD86)的1∶1∶1的混合物。其他组的小鼠用乱序序列的微球(SCR-MSP)或PBS介质(对照NOD)进行注射。通过尾静脉穿刺每周测量血糖。在两次连续的读数＞280-300mg/dL后，被证实为糖尿病。图4显示了两个独立治疗的组群的累计存活率。
图5显示了在5-8周龄NOD小鼠中多次给药AS-MSP预防了糖尿病发作。对NOD雌性小鼠(5-8周龄)进行配制在本公开的微球中的反义寡核苷酸的8次连续的单次皮下注射(每周一次)。注射(50μg的每种反义寡核苷酸的1∶1∶1的混合物或乱序寡核苷酸)每周进行一次，共8周，并在第13周停止。其他组的小鼠用乱序序列的微球(SCR-MSP)或PBS介质(对照NOD)进行注射。图4显示了被治疗动物的累计存活率。
图6a和6b显示了来自没有接受治疗并因此自然发展出自体免疫的小鼠(糖尿病NOD小鼠)的胰腺组织切片，用苏木精和曙红染色(H+E；图6a)染色或针对胰岛素染色(图6b)。图6c和6d显示了来自用SCR-MSP制剂治疗(注射与用特异性AS-MSP治疗的组平行开始)的小鼠的胰腺组织的切片。这些切片也用苏木精和曙红染色(H+E；图6c)染色或针对胰岛素染色(图6d)。SCR-MSP小鼠都发展出糖尿病。
图7a和7b显示了来自在小于8周龄时(预防模型)治疗和用本公开的反义微球治疗的小鼠的胰腺组织的切片，用苏木精和曙红染色(H+E；图7a)或针对胰岛素染色(图7b)。
如图8中所示，来自AS-MSP治疗的NOD小鼠的T-细胞显示出Foxp3+CD25+推测的Treg细胞的流行性的增加。图8A显示了用于FACS分析的门控。图8B显示了从脾脏富集的Foxp3+CD25+T-细胞的百分率，图8C显示了从ASMSP无糖尿病组群随机选择的ASMSP治疗的无糖尿病小鼠或来自用乱序序列微球(SCR-MSP)治疗或用PBS介质治疗的动物的合并的淋巴结的Foxp3+CD25+T-细胞的百分率。
图9显示了来自ASMSP治疗的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞在与同系脾细胞共培养时的增殖。通过富集柱获得了来自ASMSP治疗的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞，并与来自Balb/c、C57BL6或同系无糖尿病NOD小鼠(10周龄)的γ-射线辐照过的脾细胞共培养。在使用Cyquant试剂后4天测量增殖。Sp1是指同系的辐照过的脾细胞。
正如图10中所示，来自ASMSP处理过的无糖尿病的NOD小鼠的T-细胞，在体外在存在同系的辐照过的脾细胞和卵清蛋白的情况下增殖。T-细胞从ASMSP无糖尿病组群随机选择的ASMSP处理过的无糖尿病小鼠的脾脏或合并的淋巴结富集。
图11显示，来自ASMSP处理过的无糖尿病的NOD小鼠的T-细胞，在体外在存在同系胰岛裂解物的情况下表现出受抑制的增殖。T-细胞从如图4所述的ASMSP无糖尿病组群随机选择的ASMSP处理过的无糖尿病小鼠的脾脏或合并的淋巴结富集。辐照过的NOD脾细胞(来自无糖尿病的10周龄NOD小鼠)被用作抗原呈递细胞，平行培养物用NIT-1裂解物(1μg/孔)(或PBS介质)冲击。
糖尿病抑制疗法最终应用在人类试验中的主要顾虑是治疗方法的抗原特异性(以及因此细胞特异性)以及治疗是否提供了整体并且非特异性的抑制。为了解决这些问题，将从图4中显示的组群随机选择的无糖尿病小鼠实施安乐死，以确定脾脏和淋巴结T-细胞针对同种异体抗原、标称抗原(采用完整的卵清蛋白的形式)和采用源自NOD的胰岛瘤细胞系NIT-1的细胞裂解液形式的针对同系β细胞衍生抗原的增殖。尽管胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)是具有机械论和目的论关联的可行的候选自身抗原，但引发自身抗原的本质仍不清楚。然而，可以合理地认为它应该存在于β细胞中。因此，使用源自于NOD胰岛瘤的NIT-1细胞系作为β细胞抗原的来源，与来自AS-MSP处理过的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞共培养，以确定抗原特异性低应答性的可能性。从这些研究看到，T-细胞针对标称和同种异体抗原的增殖得以维持，而在与NIT-1细胞裂解液的共培养物中存在T-细胞增殖低下。
此外，在确定共培养上清液中的细胞因子分布情况中，我们观察到了即使在存在NIT-1裂解液的情况下，来自AS-MSP处理过的无糖尿病NOD小鼠的T-细胞的TNF-α生产的显著降低。尽管在来自AS-MSP处理过的小鼠的T-细胞共培养物中IFNγ的生产略微降低，但它在统计学上不能与来自PBS处理的小鼠的T-细胞在存在NIT-1裂解液情况下的共培养物区分开。最后，测定方法不能在上清液中检测到IL-4、IL-10或TGFβ的存在。
实施例3
也测试了反义寡核苷酸微球在早期发作的NOD小鼠中逆转糖尿病症状的能力。这些实验的时间线显示在图13A中。通过测试血糖水平并鉴定血糖水平高于400mg/dL的动物，选择了具有早期发作的NOD小鼠。对所选的动物给药胰岛素颗粒使血糖水平恢复到低于300mg/dL的正常值。取消胰岛素，并开始一系列微球的肠胃外注射。对6只动物每周两次用含有CD40、CD80和CD86反义寡核苷酸的微球进行注射。另外10只动物用含有寡核苷酸与不针对CD40、CD80和/或CD86的乱序序列的混合物的微球进行注射。对于两组动物来说，每次注射在100微升注射液中包含50μg在微球中的寡核苷酸。乱序组中的两只动物由于身体状况不佳在实验结束前被安乐死。在注射方案开始后，每周两次取样测定血糖水平。动物在实验过程中未禁食。结果作图在图12中，其中指示符号(1)表示开始设立胰岛素颗粒，指示符号(2)表示取消胰岛素颗粒并开始每周两次MSP注射。值得注意的是，在图12中报告的最大血糖值是700mg/dL，对应于所用仪表的最大读数，因此应该理解为700mg/dL数据点表示血糖读数为700mg/dL或更高。接受含有CD40、CD80、CD86反义寡核苷酸混合物的微球(ASMSP1到ASMSP6)的组中的所有动物，与接受具有乱序寡核苷酸的微球(SCRMSP1到SCRMSP10)的动物相比，显示出明显较低的葡萄糖水平。此外，在该ASMSP组的6只动物中的4只显示出低于400mg/dL的血糖水平，该值典型地被当作糖尿病发作的阈值指标。
在图13A中显示了实验的时间线。对每个组的平均未禁食血糖(图13B)和平均禁食血糖水平进行了作图(图13C)(+/-SEM)。在一些小鼠中，如图13A中所示取消了ASMSP给药。如图13B和13C所示，在新发作糖尿病NOD雌性小鼠中多轮AS-MSP给药改善了血糖水平，并且即使在AS-MSP取消后，相对于未治疗动物(对照)、用PBS治疗的动物或用乱序寡核苷酸(SCR-MSP)微球治疗的动物，导致稳定的禁食下正常血糖。
图7c和7d显示了来自在糖尿病发作后用反义制剂治疗的NOD小鼠的胰腺组织切片，并显示了疾病的逆转。切片用苏木精和曙红染色(H+E；图7c)或针对胰岛素染色(图7d)。
三种不同的AS-寡核苷酸可以按照本文公开的方法掺入到微球中，这样的微球可用作组合物，通过免疫调控性树突状细胞的诱导来预防和/或逆转新发作的自身免疫性糖尿病。事实上，单次注射组合物延迟了疾病发作，重复给药到新发作糖尿病小鼠中使高血糖恢复正常，表明了疾病的逆转。在这些研究中，每日给药胰岛素直到血糖下降到低于300mg/dL。然后停止胰岛素并随后皮下给药AS-MSP。在示例性剂量方案中，对动物给药每kg体重2mg AS-MP，每周两次，共3-4周。对无糖尿病NOD小鼠进行监测。
在图14A-C中，证实了向NOD小鼠给药AS-MSP使所述小鼠的血糖水平回复正常，并且所述血糖水平的正常化维持延长的时间。如图14B和14C中所示，AS-MSP在胰岛素给药停止后0-30天之间给药。到胰岛素停止后第15天血糖水平返回到正常，并维持在正常水平直到监测期结束(第55天)。
图15中显示的图，显示了自身免疫性糖尿病的治疗性逆转的影响。如果微球治疗在图15中显示的新发作“蜜月期”时给药，预计将保留有10-20％的仍有功能的β细胞，从而导致了糖尿病的控制并减少了患者对胰岛素的依赖性。
应该理解，已经描述的本公开的实施方案是对本公开原理的一些应用的说明。本领域技术人员可以做出大量修改而不背离本公开的真实精神和范围。本文中描述的各种不同特点可以任何组合使用，不限于在本文中具体概述的明确组合。
实施例4
在下面描述的研究中使用了下述人类反义序列：
h-CD40 AS：5′ACT GGG CGC CCG AGC GAG GCC TCT GCTGAC 3′(SEQ ID NO：4)
h-CD80 AS：5′TTG CTC ACG TAG AAG ACC CTC CCA GTGATG 3′(SEQ ID NO：5)
h-CD86 AS：5′AAG GAG TAT TTG CGA GCT CCC CGT ACCTCC 3′(SEQ ID NO：6)
NH-CD80 AS：5′TTG CTC ACG TAG AAG ACC CTC CAG TGATG 3′(SEQ ID NO：7)
通过血液的Ficoll-Hypaque离心，在板上将黏附性细胞从非黏附性细胞中分离，随后将黏附性细胞在含有GM-CSF/IL-4的AIM V培养基中繁殖(Thornton等，2000，J Immunol 164：183-190；Thornton等，1998，JExp Med 188：287-296；Medarova等，2005，Diabetes 54：1780-1788；Petrovsky等，2003，Cancer Res 63：1936-1942；Gmyr等，2001，CellTransplant 10：109-121)，从外周血获得了人类DC并用于所有下面概述的实验。从DC繁殖过程中收获的非黏附性细胞在CD3柱上筛选后，富集了T-细胞。所有细胞从健康的志愿者获得。
ODN被人类DC的摄取：正如通过PI/Annexin V染色、细胞表面CD86、CD80、CD40和II类MHC表达和DQ卵清蛋白TM的摄取/加工所评估的，人类DC快速(在5小时内)吸收荧光NF-κB和AS-ODN而不改变细胞存活力和功能。图16A显示了在添加到培养基(3.3μM终浓度)后24小时内被人类DC摄取的FITC标记的CD86反义寡核苷酸。DC的不成熟性与它们对外部提供粒子的吞噬作用和内体/溶酶体加工的能力相关。图16B证明了AS-ODN DC能够摄取外部提供的蛋白(DQ-卵清蛋白)，并且更重要的是，它们的荧光表明抗原在内吞性区室内加工(完整的DQ-卵清蛋白不发荧光，但加工后的发荧光)。同时，AS-ODN处理过的DC(所有三种反义寡核苷酸的混合物)显示出强烈抑制的CD86和CD80细胞表面水平，而ICAM-1或对抗原呈递来说重要的I类和II类HLA没有任何变化，即使在用脂多糖(LPS)刺激；一种急剧增加CD80和CD86的细胞表面水平的处理的情况下。首先，将1x105个人类DC用AS-ODN混合物处理(每种寡核苷酸终浓度为3.3μM)24小时的时间，然后用LPS(10μg/mL)或PBS介质再处理24小时。然后将细胞用所示荧光抗体或同种型对照进行染色。然后进行FACS分析(图16C)。
对疫苗接种和标称抗原的应答：用AS-ODN(SEQ ID NO 4、6和7)处理过的源自人类PBMC的树突状细胞表现出同系T-细胞的正常活化，并且在与破伤风类毒素共培养物中的同系T-细胞中(其中T-细胞从最近接种过疫苗的个体获得)表现出同系T-细胞的正常活化；图17。此外，当AS-OND DC用标称抗原卵清蛋白冲击时，刺激了正常的T-细胞应答，图18。在两种测定方法中，与使用未处理的DC作为刺激物的共培养物进行了比较。当比例为1∶1的DC∶T-细胞由1x104个细胞组成时，建立起共培养物。在共培养的第5天通过CyQuant试剂测量增殖。在共培养期间提供了终浓度为5μg/mL的外源抗原(破伤风类毒素或完整卵清蛋白)。
对同种异体抗原的应答：在图19中，显示了AS-ODN DC已经为培养物中的同种异体T-细胞提供了较弱的增殖刺激。在与AS-ODN DC的共培养物中，与与对照DC作为刺激物的共培养物相比，T-细胞的增殖降低。当比例为1∶1的DC∶T-细胞由1x104个细胞组成时，建立起共培养物。在共培养的第5天通过CyQuant试剂测量增殖。
在体外在As-ODN处理的DC中的详细DC表型评估：表2和3(下文)通过FACS测量证明了在来自两位健康志愿者的样品中，用CD40、CD80和CD86反义ODN制备的DC对LPS刺激的DC成熟化的阻止效应(辅助刺激蛋白的上调)。
从两位健康志愿者获得了白细胞并用于产生对照DC或AS-ODNDC(来自两位志愿者的每位)。然后，使用LPS(脂多糖)将DC活化至成熟，以通过FACS分析观察是否存在CD40、CD80、CD86的上调。在对照DC中，LPS刺激表面处的CD40、CD80、CD86上调，但是在AS-ODN DC中不能。这证实了，即使在通常上调它们在表面上的表达的强有力成熟信号(LPS)存在的情况下，AS-ODN抑制CD40、CD80、CD86的表达。数据提供在表2和3中。
表2
条件 CD标志物 阳性细胞％(M1)
对照-无寡核苷酸或LPS CD86 56.50
对照-无寡核苷酸或LPS CD80 8.50
对照-无寡核苷酸或LPS CD40 5.10
仅有LPS CD86 59.20
仅有LPS CD80 37.10
仅有LPS CD40 20.50
寡核苷酸+LPS CD86 34.80
寡核苷酸+LPS CD80 14.80
寡核苷酸+LPS CD40 5.50
表3
条件 CD标志物 阳性细胞％(M1)
对照-无寡核苷酸或LPS CD86 59.90
对照-无寡核苷酸或LPS CD80 18.60
对照-无寡核苷酸或LPS CD40 7.00
仅有LPS CD86 63.00
仅有LPS CD80 51.50
仅有LPS CD40 33.10
寡核苷酸+LPS CD86 48.90
寡核苷酸+LPS CD80 33.10
寡核苷酸+LPS CD40 11.40
实施例5
如下所述制造了含有与人类CD40、CD80和CD86辅助刺激分子互补的反义寡核苷酸序列(如实施例4中所述)的微球：
将水性溶液中的约6.0mg聚L-赖氨酸在15ml锥形管中在水浴中加热到70℃。将水性溶液中的6.9mg CD40、CD80和CD86反义寡核苷酸(实施例4中描述的SEQ ID NO.4、6和7)的混合物在15ml锥形管中在水浴中加热到70℃。将12.5％-PEG/12.5％PVP溶液也在水浴中加热到70℃。将聚L-赖氨酸吸取到反义寡核苷酸溶液中。通过用移液器头简单旋转，将得到的悬液混合。接下来，将管快速放回70℃水浴并温育5分钟。然后将PEG/PVP溶液加入到ASO/PLL溶液中。这通过用移液器头简单旋转进行混合。
然后将管快速放回70℃水浴并温育5到10分钟。接下来，将制剂以1℃/分钟的冷却速度冷却到4℃。然后将样品在冰上用水洗涤。
然后将样品在4℃下以4750rpm离心10-30分钟。然后除去上清液，并将微球用等体积的4℃的H2O重新悬浮。然后通过4℃下以4750rpm离心5-10分钟、除去上清液并重新悬浮微球的离心、洗涤和重新悬浮过程，将微球再洗涤3次，并用等体积的4℃的H2O重新悬浮。
在第4次离心步骤后，将微球重新悬浮至每ml约10mg的浓度。然后将样品在干冰上或-80℃冰箱中冷冻30分钟。最后，在约24小时的时期内将样品冷冻干燥至干燥。
实施例6
如下所述生产了用于动物毒理学研究的1克规模的批料：
微球(MS)制剂：下面描述的用于反义寡核苷酸微球(ASO MS)的典型生产方法使用了实施例4中所述的反义分子(SEQ ID NO.4、6和7)。使用三份起始ASO浓度为2.3mg/ml的2L生产等份试样(13.8g)生产了10g量的反义寡核苷酸(ASO)生产批料。
2L批次使用了3L开口不锈钢(SS)容器。将聚L-赖氨酸(PLL)溶液和无核酸酶的水加入到无菌的1000ml瓶中并加热到70℃。向无菌的250ml瓶中加入ASO混合物，并加热到70℃。向3L容器加入PEG/PVP溶液并加热到70℃。向热的PLL/水混合物加入ASO混合物并形成ASO/PLL复合物。将复合物在70℃保持5分钟，然后加入到含有PEG/PVP的3L容器中，同时使用无菌平叶片提升器进行搅拌。将溶液在70℃保持10分钟。将整个制剂以～0.9℃/min的速度从70℃冷却到2℃。转移悬液进行聚合物移除和洗涤。
聚合物移除/洗涤：所有开放操作在层流罩超静台中进行。将ASO-MS悬液转移到4个500mL的预先灭菌的聚丙烯锥形瓶中。将瓶在4℃以3700rpm(3200g离心力)离心30分钟。将上清液倾出，向瓶中加回预冷(4℃)的0.2μm过滤过的USP水(与除去的上清液体积相同)。通过手动摇动瓶和使用冷水超声，将沉淀重新悬浮。将该过程再重复3次，使用10分钟代替60分钟的离心时间。最后的重新悬浮在～500mL过滤过的USP水中进行，并将全部体积加入到冷冻干燥盘中。
冷冻干燥：最后干燥成干粉通过冷冻干燥来进行。将ASO-MS在消毒的10″x16″不锈钢盘(每批1个)中大批冷冻干燥。将所有3份批料在SP Industries(FTS)冷冻干燥机FD-165的架子上在-40℃冷冻。然后将批料加回到冷冻干燥机并冷冻干燥3天。使用的循环包括-40℃4小时的冷冻步骤、-10℃48.5小时的第一个干燥步骤、缓慢升温到20℃2小时的第二个干燥步骤、缓慢降温到-5℃的保持步骤、然后缓慢升温到20℃的最终保持步骤。在此时，冷冻干燥机用0.2μm过滤过的净室空气回填，并将托盘转移到层流罩超静台进行收获。
收获/包装：将ASO-MS收获在100mL的高压蒸汽灭菌过的玻璃瓶中并盖上盖子。将总共24份等份试样取样到10mL或20mL(根据药剂载量)的高压蒸汽灭菌过的玻璃小瓶中并盖上盖子，用于剂量范围研究。取样其他材料用于分析测试、生物负荷、内毒素和其他应用。所有收获和取样在层流罩超静台中使用预先灭菌或消毒的元件进行。
重新悬浮介质制备：将甘氨酸粉末溶解在USP水中。ASO-MS将设计成在剂量给药时重新悬浮在介质中。
材料：只要有可能就使用USP级原材料。两种溶液、即活性ASO混合物和用于洗涤的过滤过的USP水，在生产前制备。配制如下两种溶液：1)12.5％聚乙二醇(PEG)，12.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.1M乙酸钠，pH 5.6和2)15mg/ml聚L-赖氨酸。将两种溶液在层流罩超静台中通过0.2μm滤器过滤到高压蒸汽灭菌过的瓶中。通过将各种ASO粉末(HuCD40、HuCD80和HuCD86)重新悬浮在无核酸酶的水中，并测定浓度制备了活性ASO混合物。将各种ASO溶液以等摩尔比例混合，并稀释到2.7mM的浓度(27.45mg/ml)。
环境/过程清洁：ASO MS产物在ISO 8(级别100,000)净室中生产。维持容许的最高过程密闭度。任何需要暴露于环境的过程操作在净室中的层流罩超静台中进行。HVAC系统和使用仪器的校准和检定将保持最新。用于净室和相关工具的预防性维护程序按照确立的步骤进行。执行净室的日常清洁和消毒，并在工作期间全副着手术衣。
接触产品的设备和部件在购买时是无菌的，或在实验室高压蒸气灭菌器中在121℃下消毒≥30分钟，或使用氢氧化钠和USP纯化水消毒。在可能时使用一次性无菌部件。不接触产品的表面使用70％异丙醇和Spor-Klenz冷灭菌剂消毒。
样品(测试和/或对照)描述：进行了下面的测试(下文表4)以对材料表征。
表4
测试 方法 靶技术规格
身份(3种ASO) IPRP-HPLC 33±6％(每种ASO)
测定(总ASO) UV分光光度法 0.65-0.78mg/mg
测定PLL 氨基酸分析 0.22-0.30mg/mg
PEG 3350含量 RP-HPLC/ELSD ＜10μg/mg
PVP K30含量 RP-HPLC/ELSD ＜10μg/mg
水分含量 Karl Fischer 报告
钠含量 原子吸收 ＜10μg/mg
粒径分布 激光衍射-Sympatec V501-5微米
粒径分布 飞行时间-Aerosizer粒度仪 报告
粒径/形态 SEM 报告
生物载荷 USP<85> 报告
最终毒素 USP<61> 报告
实施例7
进行了附加的临床前研究以便证明微球-AS-ODN(包含实施例4中描述的反义序列SEQ ID NO.4、6和7)在非人类灵长动物中无毒性，以及证实胰腺淋巴结运输和积累微球中放射性标记或带荧光标签的寡核苷酸。
初始实验使用了Invitrogen的可商购荧光团，其被认为与本文公开的微球(MSP)行为一致。从表现出MSP积累的研究对象分离脾脏和淋巴结，以鉴定摄取它们的细胞类型以及它们的功能容量。
来自这些实验的结果显示，微球-AS-ODN是无毒的，并且在淋巴结、胰腺、肾脏和肝脏中观察到了MSP的积累。这种MSP的积累令人吃惊地至少部分反映了在使用小鼠的类似实验中观察到的积累。
实施例8
ASO-MS靶的蛋白击落。通过Ficoll梯度离心，单核细胞黏附于塑料上，并将细胞在IL-4和GM-CSF存在下分化7天，产生了源自于单核细胞的树突状细胞。7天后，向细胞加入人类ASO-MS(终浓度-20μg/ml，序列显示在实施例4中描述的SEQ ID NO.4、6和7中)或单独的培养基。将细胞培养7-14天，然后收集用于通过流式细胞术进行分析。将细胞与针对人类CD80、人类CD86和人类CD40的抗体或相应的同种型对照在4℃下温育30分钟，然后用PBS/FCS缓冲液洗涤。将细胞重新悬浮在PBS/FCS缓冲液中，并在FACSCalibur流式细胞仪上分析。FACSCalibur每日使用来自BD Bioscience公司的Calibrite珠子进行校正。数据在CellQuest软件上进行分析，以获得对每种蛋白阳性的细胞的百分数。数据呈现为每组中阳性细胞的平均百分数(图20)或与对照/未处理细胞相比降低的百分数(图21)+/-标准偏差(数据在Excel 2007中计算)。在7-14天的时期之间在不同的培养的两天分析了来自两个不同供体的细胞。

Claims (10)

1.含微球的药物组合物，所述微球包含：
(i)反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:4，或者靶向并结合人类CD40原始转录本的SEQ ID NO:4的修饰形式，
(ii)反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:6，或者靶向并结合人类CD86原始转录本的SEQ ID NO:6的修饰形式，以及
(iii)反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:7，或者靶向并结合人类CD80原始转录本的SEQ ID NO:7的修饰形式。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物作为可注射形式给药。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物被配制成用于重复给药。
4.权利要求1的药物组合物，其中至少70%w/w的所述微球是反义寡核苷酸。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述组合物中每种反义寡核苷酸的比是1：1：1的CD40反义：CD80反义：CD86反义。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物包含各自由SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的多核苷酸序列构成的反义寡核苷酸。
7.权利要求1-6任一项的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在人类中治疗1型糖尿病，或者用于保护人类的胰腺β细胞。
8.权利要求1-6任一项的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在人类中逆转1型糖尿病。
9.权利要求7或8的应用，其中所述药物在1型糖尿病临床发作前或临床发作后给药。
10.权利要求7或8的应用，其中所述药物被配制用于与胰岛素组合给药，其中胰岛素在所述药物给药之前、同时或之后给药。
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