DE60033851T2

DE60033851T2 - Biomoleküle mit multiplen anbindungsabschnitten zur bindung an eine substratoberfläche

Info

Publication number: DE60033851T2
Application number: DE60033851T
Authority: DE
Inventors: Markus Schweitzer; Norbert Windhab; John R. San Diego HAVENS; Thomas J. Onofrey; Charles H. Ramona GREEF; Daguang San Diego WANG
Original assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-08-12
Also published as: JP2003521680A; JP4731781B2; AU6769700A; EP1257695A4; DE60033851D1; CA2397091A1; EP1257695B1; US7186813B1; EP1257695A1; ATE356231T1; WO2001051689A1; KR20020065644A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Bindungschemien zum Binden von Biomolekülen an eine Substratoberfläche, die verzweigte Strukturen beinhaltet, zum Bereitstellen von Biomolekülen, die mehrere chemische Bindungseinheiten zum Binden der Biomoleküle an eine Substratoberfläche aufweisen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die folgende Beschreibung liefert eine Zusammenfassung erfindungsrelevanter Information. Es ist weder ein Zugeständnis, dass eine der hier bereitgestellten Informationen den Stand der Technik für die hier beanspruchte Erfindung darstellt, noch, dass eine der speziell oder vorbehaltlos zitierten Veröffentlichungen Stand der Technik für die Erfindung sind.
Die Immobilisierung von Oligonukleotiden an Substraten ist ein wichtiger und notwendiger Schritt für viele Anwendungen, wie die DNA-Chip-Technologie, Oberflächenplasmonresonanz-Experimente oder andere Biosensor-Anwendungen. Die Oligonukleotide werden herkömmlicherweise auf Substrate immobilisiert, und zwar durch Modifikation des 3'- oder 5'-Endes mit einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einem Amin, Thiol oder Aldehyd (kovalente Bindung) oder einer Gruppe, die stabile Komplexe bildet, beispielsweise Biotin, Phenylboronsäure usw. (nichtkovalente Bindung). Die modifizierten Oligonukleotide werden dann an die Stelle adressiert, an der eine Immobilisierung gewünscht ist, und mit einer geeigneten funktionellen Gruppe umgesetzt, wie einem Aldehyd, Maleimid, Hydrazid, usw. oder mit einem Bindungsmolekül komplexiert, wie Streptavidin, usw. Das Adressieren an bestimmte Stellen auf einem Substrat kann durch Spotting (Pin- oder Tropfen-Abscheidung), durch elektronische Adressierung oder durch eine Reihe anderer Verfahren erfolgen. In einigen anderen Fällen ist die Reaktion zur Immobilisierung langsam und erfordert eine lange (über Nacht) Inkubation der Oligonukleotide auf dem Substrat. Diese Immobilisierungsreaktionen können auch reversibel sein, was zur Freisetzung des Biomoleküls mit der Zeit führt.
In anderen Fällen wurden dendrimere Strukturen auf Biomolekülen beschrieben (beispielsweise WO99/10362, WO 96/19240 und WO 99/43287), aber die Verwendung dendrimerer Strukturen ist auf die Bereitstellung von Signalstellen gerichtet, wie zum Nachweisen, während das Biomolekül selbst einfach an ein beliebiges vorhandenes Substrat gebunden ist, mit Hilfe klassischer Mittel (beispielsweise DNA-Mikrochips; Beier, M. et al., Nucleic Acid Research, Oxford University Press Surrey, GB, Bd. 27, Nr. 9, 1999, S. 1970-1977). Mehrere mögliche Linker, die beispielsweise Oligonukleotide an eine Substratoberfläche binden, sind in US 5,830,655 offenbart.
Die vorliegende Erfindung beschreibt dagegen ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen mit Oligonukleotiden, die mehrere reaktive Hydrazidstellen enthalten. Der Vorteil dieses Ansatzes ist eine höhere Immobilisierungsrate, eine höhere Stabilität der Bindung, und das Potential zur Gewinnung größerer Mengen an immobilisiertem Oligonukleotid an der Substratoberfläche. Diese Gewinne sind unabhängig von dem für die Immobilisierung verwendeten Ansatz. Oligonukleotide mit mehreren Bindungsstellen können durch kovalente Bindungschemien erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zudem die Herstellung von Oligonukleotiden, die mehr als ein Hydrazid enthalten. Hydrazide sind nukleophile reaktive Gruppen, die für einen beliebigen Typ der Konjugationsreaktion verwendet werden können. Sie können beispielsweise mit elektrophilen Aldehyden reagieren, die Hydrazone bilden (die durch Reduktion weiter stabilsisiert werden können), und mit aktiven Estern, die stabile kovalente Bindungen bilden, siehe
18. Diese Chemie kann zur Bindung von Fluorophoren, Proteinen oder Peptid, Reportergruppen und anderen Oligomeren an Oligonukleotide verwendet werden. Die Reaktionen der Hydrazide können ebenfalls zur Immobilisierung der Biomoleküle an Substrate verwendet werden. Solche hydrazidmodifizierte Oligonukleotide wurden vorher nicht beschrieben.
Es gibt viele Vorteile dieser Erfindung im Schutzbereich dieser Beschreibung. Diese Erfindung nutzt z.B. eine kurze Reaktionszeit, ermöglicht Mehrfachbindungsstellen je gebundene Einheit, liefert Stabilität für einen relativ breiten pH-Wert-Bereich und schafft die Fähigkeit zur Bindung unter wasserfreien und wässrigen Bedingungen, wodurch ein verbessertes Verfahren zur Bindung von Molekülen an eine beliebige Festphasenoberfläche für einen anwendbaren Gebrauch bereitgestellt wird. Die Erfindung eignet sich zur Festphasensynthese und/oder Synthese kleiner Molekülbanken, wie Biomoleküle, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf DNA, RNA, PNA, p-RNA (Pyranosyl-RNA) und Peptide. Die Erfindung eignet sich auch für Analysetechniken, die ein immobilisiertes Reagenz erfordern, wie ohne Einschränkung Tests auf Hybridisierungs-Basis, Diagnostika, Gen-Sequenzidentifikation und dergleichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden Biomoleküle bereitgestellt mit einer Vielzahl von verzweigten oder dendrimeren Einheiten zum Anbinden von funktionellen oder reaktiven Hydrazideinheiten zum Binden an eine Substratoberfläche.
Die Verwendung von Oligonukleotiden mit mehreren reaktiven Hydrazid-Stellen in einem Oligonukleotid bietet signifikante Vorteile für dieses Immobilisierungsverfahren. Zuerst erhöht es die Geschwindigkeit des Immobilisierungsverfahrens. Ein Grund für diese Wirkung ist, dass die Wahrscheinlichkeit für einen anfänglichen Kontakt zwischen den Bindungspartnern durch Diffusion höher ist, wenn ein Oligonukleotid mehrere reaktive Stellen trägt. Das Oligonukleotid kann zudem über sekundäre und mehrere kovalente Bindungen immobilisiert werden, die nach der primären Bindung (oder zeitgleich damit) gebildet werden. Die Bildung dieser sekundären Bindungen ist dann ein intramolekulares Verfahren, das nach der intermolekularen primären Bindungsbildung kinetisch begünstigt ist. Dies ist ein weiterer Grund für die höhere Immobilisierungsrate.
Zweitens steigt die Gesamtstabilität der Bindung, wenn mehrere Bindungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Substrat gebildet werden, das unabhängig vom Ansatz ist, der zum Inkontaktbringen des Biomoleküls mit dem Substrat verwendet wird.
Einige der häufig angewendeten Immobilisierungs-Chemien für Oligonukleotide sind reversibel (beispielsweise die Bildung einer Schiff'schen Base zwischen Aminen und Aldehyden) und erfordern einen anschließenden Stabilisierungsschritt, beispielsweise durch Reduktion mit NaCNBH₃. Für diese reversiblen Reaktionen ist die Immobilisierung über mehrere Bindungen vorteilhaft, da sie zusammengefasst zu einer höheren Stabilität der Zwischenprodukte führt, die vor der Stabilisationsreaktion gebildet werden. In einigen Fällen ist die Zunahme der Stabilität so groß, dass die Stabilisierungsreaktion unnötig wird.
Drittens ermöglicht die Verwendung von Oligonukleotiden mit mehreren Bindungsstellen die Produktion von Substraten mit einer höheren Oligonukleotidladung. Gewöhnlich sind die reaktiven Stellen auf dem Substrat in großem Überschuss gegenüber den Oligonukleotiden, und die verbesserte Bindung aufgrund mehrerer Bindungseinheiten kann zur besseren Verwendung der verfügbaren Stellen auf dem Substrat führen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ermöglicht die Vielfachheit der reaktiven Hydrazideinheiten, die auf den Biomolekülen bereitgestellt werden, dass die Biomoleküle kovalent an die Substratoberfläche binden. In Bezug auf die kovalente Bindung wird eine Vielfachheit von reaktiven Hydrazidstrukturen verwendet. Solche Strukturen sind verzweigt, was eine größere Vielseitigkeit in Bezug auf das Ausmaß der möglichen verfügbaren Bindungseinheiten schafft. Somit sind nicht nur die Biomoleküle mit dendritischen Verzweigungsstrukturen versehen, sondern die reaktiven Bindungseinheiten selbst können ebenfalls verzweigt sein, so dass jede Verzweigung ein reaktives Hydrazidelement zur Verwendung bei der Bindung des Biomoleküls an einer Substratoberfläche hat.
Bei einer weiteren Ausführungsform schafft die Vielfachheit der Hydrazideinheiten auf dem Biomolekül ein Mittel, durch das Biomoleküle, die an eine Substratoberfläche gebunden sind und die einen elektronisch adressierbaren Mikrochip umfassen, vor einer versehentlichen Entfernung von der Bindungsstelle auf dem Mikrochip geschützt sind, die durch hohe Spannung und Strom verursacht wird, die von einer elektronischen Vorspannung der Mikrochipelektrode herrühren. Somit schafft das Mehrfachbindungsschema der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform die Bindung von Biomolekülen an das Substrat, das Stromdichten von mindestens 4 mA/cm² standhalten kann.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Zufügen reaktiver Hydrazideinheiten an die dendritischen Strukturen bereit, die derart an die Biomoleküle gebunden sind, dass die Zugabe in einem einzigen Reaktionsschritt erfolgen kann.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Substanz-Zusammensetzung bereit, die neue chemische Modifikationen von Oligonukleotiden umfasst, die mehrere Hydrazide und dadurch die Bausteine (beispielsweise Phosphoramidite) zur Erzeugung der modifizierten Oligonukleotide davon enthalten. Diese Hydrazide umfassen reaktive Gruppen und können zur Konjugation von Oligonukleotiden an Fluorophore oder andere kleine Moleküle, an Peptide, Proteine oder Antikörper oder an Substratoberflächen verwendet werden.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann das Bindungsschema für die Oberflächensynthese von Biomolekülen und analytische Anwendungen angewendet werden, die die Oberflächenimmobilisierung von Verbindungen erfordern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt/zeigen:
1 eine Schemazeichnung des klassischen Ansatzes zur Immobilisierung von Oligonukleotiden auf ebenen Substraten. Gewöhnlich wird eine einzelne reaktive Gruppe zur Bindung des Oligomers an die Substratoberfläche verwendet.
2 ist eine schematische Zeichnung des Immobilisierungsansatzes der Erfindung, wobei das Biomolekül mehrere Bindungseinheiten hat, die an der kovalenten Bindung des Biomoleküls an das Substrat teilnehmen können;
3 eine eingehendere Ansicht von einem Beispiel eines Nukleinsäurestrangs, der an eine Vielfachheit von reaktiven Einheiten zum Binden an eine Substratoberfläche gebunden ist. In diesem Beispiel werden die chemischen Strukturen von verzweigten Phosphoramiditen in mehrfacher Weise zugefügt, so dass eine dendrimere Struktur erzeugt wird, die an das Biomolekül gebunden ist;
4 eine Reihe von chemischen Schritten zur Herstellung einer nicht beanspruchten Struktur mit einer dendrimeren Struktur, die Phenylboronsäure (PBA)-Bindungseinheiten enthält;
5A und B eine Reihe von chemischen Schritten zur Herstellung nicht beanspruchter chemischer Strukturen, die Oligonukleotid-Biomoleküle umfassen, die entweder vier (A) oder acht (B) Bindungseinheiten für eine nichtkovalente Bindung des Biomoleküls an eine Substratoberfläche haben;
6A-C die Syntheseschritte mittels Phosphoramiditen zur Herstellung von Biomolekülen mit mehreren reaktiven Stellen. Diese Einheiten enthalten Estergruppen, die während der Entfernung der Schutzgruppen der Oligonukleotide mit Hydrazin zu Hydraziden umgewandelt werden;
7 die chemischen Strukturen A und B, die Biomoleküle umfassen, die eine direkte Bindung von Hydrazideinheiten zur Verwendung bei der Immobilisierung des Biomoleküls durch eine kovalente Bindung an das Substrat haben;
8A-D chemische Synthesen zur Herstellung von Strukturen mit mehreren Hydrazideinheiten. In (A) wird ein verzweigtes Phosphoramidit an ein Oligonukleotid gefügt, das weiter mit einem bifunktionellen Phosphoramidit modifiziert ist, gefolgt von Entfernung der Schutzgruppe mit Diethylamin/CH₂Cl₂ und Hydrazin zur Erzeugung einer Bindungseinheit mit vier Hydrazidgruppen zum Binden eines Substrates. In (B) wird ein Reaktionsschema ähnlich wie in (A) bereitgestellt, was zu sechs Hydrazid-Bindungseinheiten führt. In (C) führt die aufeinanderfolgende Verwendung von zwei verschiedenen verzweigten Phosphoramiditen zu 16 Hydrazidbindungseinheiten je Biomolekül. In (D) wird ein verzweigtes Phosphoramidit in zwei Schritten verwendet, so dass man eine dendrimere Struktur erhält, gefolgt von einer Phosphoramidit- und Hydrazin-Behandlung, so dass 4 Hydrazid-Bindungseinheiten je Biomolekül erhalten werden;
9A-C drei Schemata, von denen A und B Schritte zur Herstellung eines neuen Phosphoramidits zum Einbau in ein Oligonukleotid-Biomolekül zeigen. 9C zeigt ein Schema, wobei das hydrazidmarkierte Oligonukleotid mit einem mit einem Ester aktivierten Monomer reagieren kann und zur Bildung eines Substrates zur Immobilisierung der Biomoleküle verwendet werden kann;
10A-C graphische Darstellungen von drei gesonderten HPLC-Spuren des Reaktionsgemischs zum Koppeln eines hydrazidmarkierten Oligonukleotids an ein aktiviertes Ester-Monomer, wie es in Schema 3 von
9 gezeigt ist;
11 ein Schaubild, das die Reaktionsgeschwindigkeiten für die Bindung von mehrfach markierten Biomolekülen zeigt. Die Hydrazid/N-Hydroxysuccinimidyl-(NHS)-Ester-Bindung erfolgte mit einer Rate, die messbar über derjenigen anderer kovalenter Bindungssysteme und nahe derjenigen der beiden nicht-kovalenten Systeme lag;
12 ein Schaubild, das zeigt, dass die kovalente Bindung des markierten Hydrazid-Oligonukleotids von der Menge des aktivierten Esters in der Substratoberfläche abhängt;
13 und 14 Schaubilder, die den Nutzen der kovalenten Bindung entweder für NHS- bzw. N-Hydroxysulfosuccinimidyl-(Sulfo-NHS)-Ester-modifizierte Substratoberflächen zeigen. Die Schaubilder zeigen die spezifische und nichtspezifische Fluoreszenzintensität von markierten Oligomeren, die über einen Bereich von angelegten Strömen an die Elektroden gebunden sind;
15 ein Schaubild, das zeigt, dass die mehrfache Bindung von Hydrazideinheiten einen höheren Nachweisgrad des Biomoleküls auf dem Substrat bereitstellt;
16 ein Schaubild, das die Ergebnisse eines elektrionschen Umkehr-Dot-Blots zeigt, bei dem die Hybridisierung nur an den Stellen beendet war, die ein hydrazid-modifiziertes Oligonukleotid (ATA5) enthielten. Die Einfangsonden wurden unter geeigneten elektrionschen Bedingungen speziell an Substrat gebunden, das aktivierten Ester enthielt. Die nichtspezifischen Fangvorgänge ohne ein Hydrazid reagieren nicht mit dem aktivierten Ester und sind daher für die Hybridisierung nicht verfügbar;
17 die Synthese eines hydrazidmodifizierten Oligonukleotids, die zwei verschiedenen Protokollen A und B folgt. In A wird das geschützte Hydrazid-Phosphoramidit zur Modifikation des Oligomers verwendet, deren Schutzgruppe dann entfernt wird. In B wird ein Esterphosphoramidit zur Modifikation des Oligomers verwendet, das dann mit dem Hydrazin umgesetzt wird;
18 eine schematische Darstellung der verschiedenen funktionellen Gruppen, die mit hydrazidmodifizierten Oligomeren umgesetzt werden können;
19 und 20 Beispiele für Hydrazid-Oligomere, die mit Aldehyden kondensieren;
21 die aufgezeichneten mittleren Fluoreszenzintensitäts-(MFI)-Werte für Oligomere, die mit 3, 4 und 8 Phenylboronsäuren pro Oligonukleotid markiert sind. Die gebundenen Oligomere wurden starken Waschbedingungen ausgesetzt, um die Stabilität des Bindungssystems zu überwachen;
22 eine schematische Darstellung des dynamischen Gleichgewichts und die Stabilität der dendrimeren Hydrazide auf die aldehydreiche Permeationsschicht. Das Oligomer, das mit vier Hydrazideinheiten gezeigt ist, wird elektrisch auf die aldehydreiche Permeationsschicht geladen, was zu mehrfachen Hydrazonbindungen führt. In diesem bestimmten Beispiel sind die Bindungen jeweils anfällig gegenüber Hydrolyse. Die mit der Verwendung von mehrfachen Bindungsstellen erzielte Stabilität ermöglicht die Hydrolyse einiger Hydrazone, wohingegen andere intakt bleiben. Das durch benachbarte Hydrazon-Bindungsstellen gebundene Hydrazid kann nicht diffundieren und wird daher in der aldehydreichen Permeationsschicht gehalten, die die Bindung wieder auffrischen kann;
23 ein Schaubild, das die Bindung dendrimerer Oligomere von 1, 2, 4 und 8 Hydraziden auf Glyoxyl-Agarose-Permeationsschichten zeigt, die über Hydrazon-Bindung(en) gekoppelt sind;
24 ein Schaubild der Bindung dendrimerer Oligomere an acetalmodifiziertem Hydrogel. Die Acetaleinheiten erfordern die Hydrolyse mit Säure zur Bildung von Aldehyden für kovalente Bindungsfähigkeiten;
25 die Verwendung und verbesserte Bindung von Hydrazid-Oligomeren an Surmodics 3D-Link^TM-Amin-Bindungsobjektträger in verschiedenen Konzentrationen. Die 25B zeigt die tatsächlichen Fluoreszenz-Photographien der an den Glas-Objektträger gebundenen Oligomere, ihre Bindungsgrade sind graphisch in der
25A gezeigt;
26 die nichtspezifischen Bindungsgrade an den in der 25 verwendeten Surmodics-Objektträger. Die 26B zeigt die tatsächlichen Fluoreszenz-Photographien der an den Glas-Objektträger gebundenen Oligomere, ihre Bindungsgrade sind graphisch in der 26A gezeigt;
27A den anwendbaren pH-Wert-Bereich, in dem die Hydrazid-Oligomere eine erfolgreiche Immobilisierung an einen festen Träger durchführen können, die 27B zeigt die verbesserte Empfindlichkeit eines Hydrazid-Oligomers gegenüber einem aminmodifizierten Standard-Oligomer, das bei niedrigeren Konzentrationen nachweisbar ist;
28 ein Beispiel, wie ein verzweigtes oder unverzweigtes Hydrazid-modifiziertes Oligomer leicht an ein alternatives Bindungssystem angepasst werden kann. Bei diesem bestimmten Beispiel wird ein verzweigtes Oligomer mit sechs Hydraziden mit p-Formylphenylboronsäure modifiziert, so dass eine verzweigte PBA-Bindungssonde bereitgestellt wird.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In Bezug auf die spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Biomoleküle bereitgestellt, die eine Vielzahl von Substratoberflächen-Bindungs-Hydrazideinheiten aufweisen.
Der Begriff "Biomolekül" steht für ein biologisch relevantes Molekül, das zum Zusammenbringen der Moleküleinheiten in einer Testprobe verwendet wird. Gewöhnlich umfassen diese zumindest teilweise Moleküle, wie Nukleinsäuren, einschließlich einer einzelnen Nukleinsäure, Oligonukleotide und Polynukleotide, DNAs, RNAs, CNAs (Cyclohexyl-Nukleinsäuren), p-MeNAs (Methyl- oder Methoxyphosphat-Nukleinsäuren), Proteine, Peptide, Enzyme und Antikörper, die an Hydrazideinheiten gebunden sind, zum Binden des Biomoleküls an eine Substratoberfläche. Die Biomoleküle umfassen auch unnatürliche oder synthetische Moleküle, die von natürlich vorkommenden Molekülen strukturell hergeleitet sind, wie Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) oder p-RNAs (Pyranosyl-RNAs), die an Hydrazideinheiten gebunden sind, zum Binden des Biomoleküls an eine Substratoberfläche. Mit solchen Hydrazideinheiten können die Biomoleküle auch als "derivatisierte Biomoleküle" bezeichnet werden. Solche Biomoleküle umfassen daher auch Oligonukleotide, die oxidierte Ribose enthalten, Amin-Terminationen, oder eine Einheit der gut bekannten Biokonjugat-Paare, wie beschrieben von Hermanson (Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques Copyright, 1996, Academic Press, San Diego, CA) und/oder alternative Nukleinsäurestrukturen, wie pRNAs (in Bezug auf pRNAs, wie beschrieben in der Parallel-Anmeldung 09/374,338, eingereicht am 13. August 1999). Die Bindung der Hydrazideinheiten an die Biomoleküle umfasst gewöhnlich eine kovalente Bindung.
Der Begriff "Polymer" bedeutet gewöhnlich Makromoleküle, die aus der aufeinander folgenden Bindung einer großen Zahl von kleineren Molekülen zusammengebaut werden, die gewöhnlich als Monomere bezeichnet werden, wie es dem Fachmann geläufig ist (für eine eingehendere Beschreibung siehe Odian, G. Principles of Polymerization, Third Edition Copyright 1991, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY). Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein homogenes Polymer aus einem einzelnen Monomertyp bestehen, wohingegen ein heterogenes Polymer aus mehr als einem Monomertypen bestehen kann. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Bildung eines Polymers eingeleitet werden durch thermische Zersetzung der Starter (beispielsweise AIBN, Benzoylperoxid), photolytische Spaltung von Initiatoren (beispielsweise UV-Initiation von Daracur 4265), Redoxreaktionen (beispielsweise Cer(IV)-sulfat), Ionisierungsstrahlung (beispielsweise α-, β-, γ- oder Röntgenstrahlen), Plasmaaktivierung (beispielsweise Argon, Stickstoff, Sauerstoff) oder elektrolytische Aktivierung mittels Tetrabutylammoniumperchlorat, wobei die Polymerisation nur über eine voreingestellte Stelle mit einem elektrischen Strom erfolgt (Samal, S.K.: Nayak, B., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Hrsg. 1988, 21, 1035).
Der Begriff "Bindungseinheit" bedeutet gewöhnlich eine beliebige chemische Einheit, die bei der Erzeugung einer Bindung von Biomolekülen, die mehrere reaktive Einheiten umfasst, an eine Substratoberfläche, verwendet wird. Die Tabelle 1 Bindungseinheiten stellt eine Liste der verwendeten Bindungseinheiten bereit, unter anderem Bindungseinheiten, die zusätzlich zu Hydrazideinheiten verwendet werden. Tabelle 1: Bindungseinheiten

Symbole: X = ein Biomolekül oder ein Substrat/fester Träger;
R, R₁, R₂, R₃ = organische Kohlenstoffeinheiten, wenn nicht anders angegeben.

Der Begriff "Lewis-Base" bedeutet gewöhnlich eine beliebige chemische Einheit, die ein Elektronenpaar an ein elektronendefizientes Zentrum abgeben kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lewis-Base spezieller als "Nukleophil" bezeichnet, wobei ein reaktives Zentrum ein Elektronenpaar an ein Kohlenstoffatom abgeben kann, was zu einer kovalenten Bindung zwischen dem reaktiven Zentrum und dem Kohlenstoff führt, wie es dem Fachmann geläufig ist. (Für eine umfassendere Definition siehe: Smith, M.B. Organic Synthesis Copyright 1994 McGraw Hill Inc., New York, NY oder ein beliebiges Fachbuch über organische Chemie).
Der Begriff "Lewis-Säure" bedeutet gewöhnlich eine elektronendefiziente chemische Einheit, die ein Elektronenpaar aufnehmen kann. "Elektrophil" steht gewöhnlich für den spezifischen Fall, bei dem die Lewis-Säure ein Kohlenstoff ist, wie es dem Fachmann geläufig ist (Für eine umfassende Definition siehe: Smith, M.B. Organic Synthesis Copyright 1994 McGraw Hill Inc., New York, NY oder ein beliebiges Fachbuch über organische Chemie). Eine Hydrazideinheit kann beispielsweise als Nukleophil wirken, das ein Elektronenpaar an das reaktive Kohlenstoffzentrum eines NHS-Esters abgeben kann, als Elektrophil, das eine kovalente Bindung an das Kohlenstoffzentrum bilden kann.
Der Begriff "verzweigte Bindungseinheit" steht gewöhnlich für eine chemische Spezies, die über eine spezifische reaktive Einheit an ein Biomolekül koppeln kann und auch zu einer weiteren Bindung an mehr als ein Molekül über alternative reaktive Zentren fähig ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine verzweigte Bindungseinheit ein Phosphoramidit, für das Beispiele in der Tabelle 2, Einträge 1 bis 4 gezeigt sind. In diesen Beispielen wirkt der Phosphor als reaktive Einheit, wohingegen die Ester der Einträge 1, 2 und 3 und der geschützten Alkohole 4 alternative reaktive Zentren bilden.
Der Begriff "verzweigte Bindungsstruktur" steht gewöhnlich für ein Biomolekül, das aus der Behandlung eines Biomoleküls mit einer verzweigten Bindungseinheit hervorgeht. Die alternativen reaktiven Zentren der verzweigten Bindungseinheit sind nun in der verzweigten Bindungsstruktur enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist als Beispiel eine verzweigte Bindungsstruktur durch Eintrag 5 der Tabelle 2 dargestellt, wobei das gezeigte Biomolekül das Ergebnis der Behandlung eines Biomoleküls mit einer verzweigten Bindungseinheit ist, insbesondere die Verbindung, die in Eintrag 4 von Tabelle 2 gezeigt ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die verzweigte Bindungsstruktur in einer homogenen Reihe kombiniert werden, in der ein Biomolekül mit einer verzweigten Bindungseinheit modifiziert ist, was wiederum durch die gleiche verzweigte Bindungseinheit durch die alternativen reaktiven Zentren der resultierenden verzweigten Bindungsstruktur modifiziert ist, so dass eine neue verzweigte Bindungsstruktur erzeugt wird. Diese Konstruktion größerer verzweigter Bindungsstrukturen mit Hilfe einer Reihe von Bindungen einer verzweigten Bindungseinheit kann weiter fortgesetzt werden, wie in der Tabelle 2, Einträge 6-8, gezeigt ist. Bei einer weiteren Ausführungsform können die verzweigten Bindungseinheiten in einer heterogenen Reihe kombiniert werden, in der ein Biomolekül mit einer verzweigten Bindungseinheit modifiziert ist, die wiederum durch eine andere verzweigte Bindungseinheit über die alternativen Reaktionszentren der anfänglichen verzweigten Bindungseinheit weiter modifiziert ist, so dass eine neue verzweigte Bindungsstruktur erzeugt wird. Diese Konstruktion größerer verzweigter Bindungseinheiten durch eine Reihe von Bindungen verzweigter Bindungseinheiten kann weiter fortgesetzt werden, wie in der Tabelle 2, Einträge 9 bis 12 gezeigt.
Tabelle 2: Verzweigte Bindungseinheiten und verzweigte Bindungsstrukturen
Der Begriff "Substrat" steht in der Regel für ein Material, dessen Oberfläche Einheiten enthält, mit denen die mehrfachen reaktiven Hydrazideinheiten der Biomoleküle koppeln können. Die Substrate können u.a. ein Glas-Objektträger, ein funktionalisierter Glas-Objektträger, eine chemisch aktivierte Mikrochip-Oberfläche, eine Oberfläche, die mit einer einzelnen oder mit mehreren Schichten reaktiver Moleküle bedeckt ist oder eine Oberfläche, die mit einem Polymer bedeckt ist, das Einheiten aufweist, mit denen die reaktiven Hydrazideinheiten der Biomoleküle reagieren können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Substratoberfäche eine Permeationsschicht eines elektronisch adressierbaren Mikrochips. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die funktionellen chemisch aktiven oder reaktiven Einheiten eines Substrates ausgewählt aus den in der Tabelle I aufgeführten funktionellen Gruppen (sind aber nicht darauf eingeschränkt).
Der Begriff "Vorstufe" steht im allgemeinen für eine reaktive Einheit, die mit der Behandlung von einer oder mehreren chemischen Reagenzien in eine alternative reaktive Einheit transformiert werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die drei Estereinheiten von 1d (Eintrag 3 von Tabelle 2) beispielsweise Vorstufen für die Hydrazide. Sie werden mit der Behandlung von Hydrazin an eine Hydrazideinheit transformiert.
Der Begriff "geschützt" steht gewöhnlich für die Blockierung der Reaktivität einer reaktiven Einheit mit einer oder mehreren Reagenzien, wohingegen eine chemische Reaktion in einer alternativen reaktiven Stelle der gleichen Verbindung durchgeführt werden kann, ohne Blockierung oder Komplikation von der anfänglichen reaktiven Einheit. Bei der Beendigung der Transformation an der alternativen reaktiven Stelle kann die Schutzgruppe der reaktiven Einheit entfernt werden, wobei das reaktive Zentrum deblockiert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine geschützte Einheit ein bestimmter Vorstufentyp. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist beispielsweise die Hydrazideinheit von 1a der 9A mit einer Trityl-Gruppe geschützt. Bei der Addition von 1a an ein Biomolekül wird die Tritylgruppe chemisch entfernt, wobei die Schutzgruppe an der Hydrazid-Funktionalität entfernt wird.
Der Begriff "aktivierbar" bedeutet in der Regel, eine beliebige funktionelle Gruppe, die eine Transformation zu einer reaktiven Einheit bei der Behandlung mit einer oder mehreren chemischen Reagenzien durchlaufen kann. Der Begriff "aktiviert" steht für eine funktionelle Gruppe, die eine solche Transformation zu einer reaktiven Einheit durchlaufen hat. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine aktivierbare Einheit eine geschützte Einheit oder eine Vorstufe sein. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die funktionelle Gruppe gewöhnlich als unreaktiv oder unfähig zur Bindung eines Substrates oder Biomoleküls angesehen. Bei der Behandlung mit einer oder mehreren chemischen Reagenzien wird die funktionelle Gruppe in eine Einheit transformiert, die an ein Substrat oder ein Biomolekül binden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden beispielsweise die Estergruppen der in der Tabelle 2, Einträge 1 bis 3, aufgeführten Verbindungen in Hydrazide mit der Behandlung mit Hydrazin umgewandelt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird beispielsweise ein Substrat, das Acetalgruppen enthält, im Allgemeinen als unreaktiv angesehen. Bei der Behandlung mit einer sauren Quelle werden die Acetale in Aldehyde umgewandelt, die an hydrazid-modifizierte Biomoleküle binden können.
Der Begriff "Mikroarray" bedeutet gewöhnlich eine geometrische Anordnung einer Mehrzahl von Stellen, die definierte Biomoleküle enthalten, wobei diese einzelnen Stellen auf lineare Abmessungen von 1 mm oder weniger eingeschränkt sind. Mikroarrays umfassen einen elektronisch adressierbaren Mikroarray, wie einen Array, der in US-Patent Nr. 5,632,957 als "APEX-Chip" bezeichnet ist.
Die 2 zeigt ein grundlegendes Schema für die Erfindung, wobei Biomoleküle an eine Substratoberfläche über eine Vielzahl von Hydrazideinheiten gebunden sind. Die Vielfache der Hydrazideinheiten können mit Hilfe der folgenden Verfahren auf einem Biomolekül bereitgestellt werden. Jeder dieser Ansätze ist kompatibel mit der Festphasen-Standardsynthese von Biomolekülen, die Oligonukleotide umfassen.
1. Herstellung der Oligonukleotide mit mehrfachen Bindungsstellen
1.1 Oligonukleotid-Synthese mit verzweigenden Phosphoramiditen:
Verzweigte Biomolekül-(beispielsweise Oligonukleotide)-Strukturen mit verzweigten Phosphoramaditen sind kommerziell erhältlich (Chemgenes, Ashland, MA; Glenn Research, Sterling, VA). Nach ein oder mehreren aufeinanderfolgenden Kopplungen dieser verzweigenden Amidite in der Festphasen-Oligonukleotid-Synthese (5A und B) werden Oligonukleotide mit zwei oder mehr endständigen Hydroxylgruppen erzeugt. Jeder andere Baustein, der Verzweigungen in das Oligonukleotid einbringt, kann hier auf ähnliche Weise angewendet werden. Diese Hydroxylgruppen können mit einem zweiten Typ Phosphoramidit umgesetzt werden, so dass die reaktive Gruppe (d.h. die Hydrazideinheit) für die Bindung des Biomoleküls an das Substrat erzeugt wird. Erfindungsgemäß können Phosphoramidite, die Hydrazide enthalten, in einer geschützten oder Vorstufenform (9A) verwendet werden. Das Ergebnis ist ein Oligonukleotid mit zwei oder mehr (vorzugsweise 2 bis 8) reaktiven Gruppen.
1.2 Direktes Einbringen von Synthons mit mehr als einer reaktiven Gruppe zur Bindung:
Alternativ können Biomoleküle mit mehreren Bindungsstellen erhalten werden durch Koppeln von speziellen Phosphoramiditen. Diese Amidite können in einer geschützten oder in Vorstufen-Form mehr als eine reaktive Hydrazid-Gruppe zur Immobilisierung am Substrat enthalten. Beispiele für solche Amidite sind in den 6A-C gezeigt.
1.3 Kombinierter Ansatz:
Ein dritter Ansatz für die Synthese von Biomolekülen mit mehrfachen reaktiven Hydrazid-Gruppen ist die Kombination der Kopplung der Verzweigungs-Amidite und Amidite mit mehreren reaktiven Hydrazid-Stellen (8A bis C).
Mit diesem Ansatz werden Biomoleküle mit einem angebundenen Hydrazid zur Bindung an eine Substratoberfläche über eine kovalente Bindung bereitgestellt. In dieser Ausführungsform können NHS- und Sulfo-NHS und andere Einheiten als Vorrichtung zum Aktivieren eines Substrates oder eines anderen Biomolekültyps und Kopplung an Biomoleküle oder sogar feste Oberflächen verwendet werden. Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung stellt eine solche Bindung eine neuartige Vorrichtung dar, wodurch die Biomolekül-Bindung ausgeführt werden kann und eine Beständigkeit gegenüber Schaden an gebundenen Biomolekülen schaffen kann, der durch die extremen Reaktionsbedingungen verursacht wird, die mit der elektronischen Adressierung eines elektronischen Mikrochips einhergeht. Somit erfüllt die Hydrazid-Chemie und das mehrfache Bindungsschema der vorliegenden Erfindung Anforderungen zur Überlebensfähigkeit in der Umgebung eines elektronischen Systems, wobei die Anforderungen einen Bedarf für die Wasserlöslichkeit des Biomoleküls, Stabilität des Biomoleküls gegenüber Wasser und seines Kopplungspaars auf dem Immobilisierungssubstrat und die Funktionalität gegenüber einem pH-wert von etwa 4 umfassen.
Die Verfahren, durch die die hydrazidbindenden Einheiten zugeführt werden und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in den folgenden Beispielen bereitgestellt. Diese Beispiele zeigen eine stellenspezifische kovalente Bindung eines Biomoleküls, das ein Oligonukleotid umfasst, bei dem die Bindung mit elektronischer Konzentration eines hydrazidmodifizierten Oligos an N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-modifizierter Polyacrylamid-Permeationsschicht über einem elektronisch adressierbaren Mikroarray erfolgt. Die Hydrazideinheit des Oligomers verdrängt den NHS-Ester, der eine Bishydrazid-Bindung bildet. Diese Beispiele zeigen daher 1.) die Synthese des neuen Hydrazid-Phosphoramidits (beispielsweise Verbindung 1), wie in Beispiel 1 (9) gezeigt, und einen erfolgreichen Einbau dieser Amidite an synthetische Oligomere mittels Standard-Synthese-Verfahren; 2.) die Herstellung der N-Hydroxy- oder N-Hydroxysulfosuccinimidylmodifizierten Permeationsschicht; und 3.) eine zweischichtige Permeationsschicht über dem elektronisch adressierbaren Mikroarray, wobei die aktivierten Monomere nur in die obere Schicht eingebaut werden.
Wenn nicht anders angezeigt wurden alle Reaktionen magnetisch gerührt. Die Reagenzien wurden in analytischem Grad von Aldrich Chemical Company (Milwaukee WI) und die Lösungsmittel von Riedel erhalten. Die Säulenchromatographie erfolgt mittels Silicagel 60 (Merck, 230 bis 400 mesh). Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert. Die IR-Spektren werden auf einem Perkin Elmer Paragon 1000 FT-IR, ausgerüstet mit einer Graseby Specac 10500 ATR-Einheit gemessen. ¹H-NMR-Spektren werden bei 400 MHz aufgezeichnet; ¹³C-Spektren bei 100 MHz und ³¹P bei 162 MHz mit einem Bruker DRX 400 Spektrometer. Chemische ¹H-Verschiebungen werden in δ-Einheiten mittels TMS als internem Standard aufgezeichnet, und die Kopplungskonstanten werden in Hz-Einheiten aufgezeichnet. Die ESI-Massenspektren werden auf einem Finnigan LCQ-Instrument im negativen Ionisierungs-Modus aufgezeichnet.
Beispiel 1
Experiment 1.1 Synthese von N-Triphenylmethyl-6-hydroxycapronsäurehydrazid (Verbindung 5, 9A):
Zu einer Lösung von 6,2 g (20 mmol) Tritylhydrazin-hydrochlorid (3a) in 200 ml THF wurden 2,22 g (22 mmol, 1,1 Äq.) Triethylamin gegeben.
Die Lösung wurde 15 min bei Raumtemperatur (RT) gerührt, filtriert, konzentriert, so dass Verbindung 3 erhalten wurde, dann mit 2,29 g (20 mmol, 1 Äq.) ε-Caprolacton (Verbindung 4) behandelt. Das Gemisch wird für 5 Std. bei 65°C erhitzt, dann für 18 Std. auf RT abgekühlt. Der Niederschlag wurde gesammelt und aus Ethylacetat umkristallisiert, so dass 3,55 g (45%) eines weißen Pulvers erhalten wurden (Verbindung 5):
¹H-NMR 7,49-7,47 (m, 5H), 7,35-7,10 (m, 10H), 6,55 (d, J = 7,52, 1H), 5,55 (d, J = 7,25, 1H), 3,54 (t, J = 6,45, 2H), 1,87 (t, J = 7,25, 2H), 1,62 (bs, 1H), 1,57-1,34 (m, 4H), 1,27-1,11 (m, 2H).
Experiment 1.2 Synthese von 6-[(2-Cyanoethoxy)(diisopropylamino)-phosphanyloxy]-N'-tritylhexanohydrazid
(Verbindung 1a, 9A).
Zu einer Lösung von 3,0 g (7,7 mmol) N-Triphenylmethyl-6-hydroxycapronsäurehydrazid (Verbindung 5) in 50 ml trockenem Dichlormethan bei RT wurde langsam 4,0 g (31 mmol, 4 Äq.) N-Ethyldiisopropylamin und 2,01 g (8,5 mmol, 1,1 Äq.) Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (Verbindung 6) über 15 min gegeben. Nach beendeter Zugabe wurde die Reaktion 1 Std. gerührt, eingeengt, und chromatographisch aufgetrennt (Ethylacetat/n-Heptan 2/3 mit 0,2% Triethylamin), so dass 3,19 g (70%) 1a als blassgelber Schaum erhalten wurde.
¹H-NMR: 7,49-7,46 (m, 5H), 7,34-7,20 (m, 10H), 6,57 (d, J = 7,2, 1H), 5,57 (d, J = 7,5, 1H), 3,85-3,74 (m, 2H), 3,62-3,48 (m, 4H), 2,62-2,59 (m, 2H), 1,88-1,84 (m, 2H), 1,53-1,33 (m, 4H), 1,27-1,13 (m, 14H); ³¹P-NMR (CDCl₃) : δ = 147, 97.
Experiment 1.3 Herstellung von Ethyl-6-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]hexanoat (Verbindung 1b, 9B, Schema 2).
Zu einer Lösung von 1,65 g (10 mmol) Ethyl-6-hydroxyhexanoat (Verbindung 7) in 30 ml Dichlormethan bei RT werden langsam 5,17 g (40 mmol, 4 Äq.) N-Ethyldiisopropylamin und 2,6 g (11 mmol, 1,1 Äq.) Verbindung 6 über 15 min gegeben. Nach beendeter Zugabe wurde die Reaktion für 15 min weiter gerührt, eingeengt und chromatographisch aufgetrennt (Ethylacetat/n-Heptan 1/4 mit 0,2% Triethylamin), so dass 2,47 g (69%) Verbindung 1b als klares Öl erhalten wurden:
¹H-NMR 4,12 (q, J = 7,25, 2H), 3,90-3,77 (m, 2H), 3,75-3,55 (m, 4H), 2,64 (t, J = 6,44, 2H), 2,30 (t, J = 7,25, 2H), 1,69-1,59 (m, 4H), 1,44-1,34 (m, 2H), 1,25 (t, J = 7,25, 3H), 1,20-1,12 (m, 12H); ³¹P-NMR (CDCl₃) : δ = 148,01.
Experiment 1.4 Herstellung von Esterphosphoramidit:
Diethyl-5-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}isophthalat (Verbindung 1c 6B)
Zu einer Lösung von 1,29 g (5 mmol) Diethyl-5-(hydroxymethyl)isophthalat [252,27] (98%, Aldrich; CAS 181425-91-2) in 20 ml trockenem Dichlormethan bei RT werden 2,59 g (40 mmol, 4 Äq.) N-Ethyldiisopropylamin [129,25] und 1,3 g (11 mmol, 1,1 Äq.) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit [236,68] (Aldrich; CAS 8999270-1) über 15 min unter Rühren gegeben. Das Gemisch wurde eingeengt, und die Salze wurden mit 30 ml Ethylacetat/n-Heptan (2:3) gefällt. Das Hydrochloridpräzipitat wird filtriert; das Filtrat wird eingeengt und direkt auf eine Chromatographiesäule aufgetragen. Die Elution mit Ethylacetat/n-Heptan (1 : 4) mit wenigen Tropfen Triethylamin ergab 1,6 g (70%) 1c als farbloses Öl. Ca₂H₃₃N₂O₆P;
¹H-NMR 8,59 (m, 1H, arom.), 8,21 (m, 2H, arom.), 4,87-4,75 (m, 2H, CH₂ Cyanoethyl), 4,41 (q, J = 6,98 Hz, 4H, CH₂ Ethyl), 3,95-3,80 (m, 2H, 2 × CH I-Pr), 3,74-3,61 (m, 2H, CH₂ Cyanoethyl), 2,66 (t, J (P, H) = 6,45 Hz, 2H, OCH₂-arom.), 1,41 (t, J = 6H, 2 × CH₃ Ethyl), 1,23-1,20 (m, 12H, CH₃, I-Pr); ³¹P-NMR (CDCl₃) : δ = 149,94; ¹³C-NMR (CDCl₃) : δ = 165,8 (C=O), 140, 2 (C-CH₂-O-P), 132,1 (2 × C arom.), 131,1 (2 × C-H arom.), 129,7 (CH arom.), 117,6 (CN), 64,7 (P-O-CH₂-arom.), 61,4 (2 × CH₂ Ethyl), 58,6 (O-CH₂-CH₂-CN), 43,4 (2 × C-HI-Pr), 24,7 (4 × CH₃ I-Pr), 20,5 (O-CH₂-CH₂-CN), 14,4 (CH₃ Ethyl); HRMS 453,2156 ([M + H]⁺ C₂₂H₃₄N₂O₆P erfordert 453, 21545).
Experiment 1.5 Synthese von Dimethyl-3,3'-(2-{[(2-cyanethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}-2-{[2-(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}propan-1,3-diylbisoxy)dipropionat (Verbindung 1d 8B)
Zu einer Lösung von 300 mg (0,760 mmol) Tris-2,2,2-{[(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}ethanol (CAS 169744-28-9; (Coutts, S.; Jones, D. S.; Livingston, D. A.; Yu, L.: 1995, Chemically-defined nonpolymeric valency platform molecules and conjugates thereof, europäische Patentanmeldung EP 0642798A2 ) in 2 ml trockenem Dichlormethan bei RT werden zwei Tropfen einer 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in trockenem Acetonitril (Standard-Aktivator-Lösung aus der Festphasen-DNA-Synthese) und 274 mg (0,91 mmol; 1,1 Äq.) 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (Aldrich; CAS 102691-36-1) gegeben und bei RT gerührt, bis die DC einen vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials anzeigt (3 Std.). Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird durch Silicagelchromatographie gereinigt. Die Elution mit Ethylacetat/n-Heptan (2:3) mit wenigen Tropfen Triethylamin ergab 240 mg (53%) von 1d als farbloses Öl.
C₂₆H₄₇N₂O₁₁P ¹H-NMR (CDCl₃) : 3,88-3,71 (m, 2H, C-H), 3,68 (s, 9H, CH₃ Ester), 3,65 (t, J = 6,45 6H, 3 × CH₂-O), 3,62-3,47 (m, 4H, 2 × CH₂), 3,36 (s, 6H, 3 × C-CH₂-O), 2,63 (t, J = 7,25 Hz, 2H, C-CH₂-O-P), 2,54 (t, J = 6,45 Hz, 6H, -CH₂-COOR), 1,19-1,16 (m, 12H, CH₃iPr); ³¹P-NMR (CDCl₃) : δ = 148,6; HRMS: 595,2999 ([M + H]⁺ C₂₆H₄₈N₂O₁₁P erfordert 595,29957)
Experiment 1.6 Synthese von Oligonukleotiden mit tritylgeschützten Hydrazidamiditen (beispielsweise Verbindung 1; siehe ebenfalls 17A):
Oligonukleotide werden mittels Festphasenphosphoramiditchemie auf einem automatischen Oligonukleotid-Synthesegerät synthetisiert. Das Phosphoramidit mit dem geschützten Hydrazid wird als 0,1 M Lösung in Acetonitril aufgetragen und an die gewünschte Stelle in der Sequenz mit aktivierten Standard-Reagenzien und Kopplungszeiten gekoppelt.
Das CPG-gebundene Oligonukleotid (1 mmol) wird in einem 1,5 ml Teströhrchen untergebracht und mit 2,0 ml konz. NH₄OH behandelt. Nach 2 Std. bei 55°C wird die Ammoniaklösung entfernt und bis zur Trockne unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 1 ml Wasser gelöst und durch einen 0,45 μm Spritzenfilter filtriert. Das tritylgeschützte Hydrazid-Oligonukleotid wird durch Umkehrphasen-HPLC mit einer Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, Säule gereinigt (analytisch: 4 × 250 mm, Fluss = 1,0 ml/min, präparativ: 10 × 250, Fluss = 3,0 ml/min) mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert = 7,0 (TEAA) als Puffer A und 75% Acetonitril in Puffer A als Puffer B. Ein Gradient von 0% B bis 100% B in 100 min wird für analytische und präparative Trennungen verwendet. Die Fraktionen, die das Tritylon-Produkt enthielten, wurden gepoolt und bis zur Trockne eingedampft.
Zur Entfernung der Trityl-Schutzgruppe wird das Oligonukleotid mit 80% Essigsäure für 30 min bei RT behandelt. Die Säure wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in Wasser gelöst und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wird wieder getrocknet und erneut gelöst. Die analytische HPLC zeigt gewöhnlich ein einzelnes Produkt (in einigen Fällen als Doppel-Peak), das ohne Reinigung für weitere Reaktionen verwendet werden kann. Alternativ kann eine HPLC-Reinigung durchgeführt werden, wobei das vorstehend beschriebene Reinigungssystem verwendet wird.
Experiment 1.7 In-situ-Erzeugung der Hydrazid-Funktionalität-Synthese der Oligonukleotide mit Phosphoramiditen, die Vorstufenformen enthalten (beispielsweise Ester, wie Verbindung 1b 9B, Schema 2; siehe ebenfalls 17B).
Oligonukleotide werden mittels Festphasen-Phosphoramidit-Chemie auf einem automatischen Oligonukleotid-Synthesegerät synthetisiert. Das Phosphoramidit mit der Vorstufenform des Hydrazids wird als 0,1 M Lösung in Acetonitril aufgebracht und an die gewünschte Stelle in der Sequenz mittels Standard-Aktivierungsreagenzien und Kopplungszeiten gekoppelt. Die Verwendung eines Phosphoramidits, das eine Hydroxylgruppe, die mit einer säurelabilen Schutzgruppe markiert ist, sowie eine Hydrazid-Vorstufe enthält, ermöglicht das Einbringen des Hydrazids an einer beliebigen Stelle des Oligonukleotids, weil die Vorstufenform des Hydrazids gegenüber den Bedingungen der Oligonukleotid-Synthese stabil ist, wohingegen das reaktive Hydrazid nicht erzeugt wird, bis zur Inkubation mit Hydrazin.
Das CPG-gebundene Oligonukleotid (1 mmol) wird mit einer Lösung von 50 mg Diethylamin in 3,5 ml Dichlormethan behandelt. Nach Inkubation über Nacht (Lichtausschluss) wird der Überstand entfernt, und das substratgebundene Oligonukleotid wird mehrmals mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Zur Spaltung der Benzoyl- und Isobutyryl-Schutzgruppen für die Umwandlung des Esters am 5'-Ende des Oligonukleotids in ein Hydrazid, und zur Spaltung des Oligonukleotids vom Träger (17B), wird das CPG mit dem gebundenen Oligonukleotid mit 1 ml 24% Hydrazinhydrat behandelt. Nach 18 Std. unter konstantem Rühren bei 4°C ist die Reaktion beendet. Die Isolation des Oligonukleotids aus der Hydrazinlösung kann durch Umkehrphasenextraktion (beispielsweise Sep-Pak oder HPLC) erzielt werden.
Eine C18 Sep-Pak-Kartusche (0,5 g Waters, Nr. 20515) wird durch Spülen mit 10 ml Acetonitril und dann mit 10 ml 0,1 M Triethylammoniumbicarbonatpuffer pH-Wert 7,0 (TEAB) aktiviert. Die Hydrazin-Lösung wird mit dem 5fachen Volumen TEAB verdünnt und auf die Kartusche aufgetragen. Nach dem Binden des Oligonukleotids an die Sep-Pak-Säule wird das restliche Hydrazin mit 10 ml TEAB weggewaschen. Das Oligonukleotid wird dann mit TEAB/Acetonitril (1:2) von der Säule gewaschen. Die Oligonukleotid-enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Für die RP-HPLC-Charakterisierung und Reinigung des Produkts lassen sich die gleichen Bedingungen, wie in Protokoll 1 beschrieben, anwenden.
Andere Beispiele werden nachstehend bereitgestellt, wobei Oligomere so verarbeitet werden, dass sie an mehrere Bindungseinheiten der Erfindung gebunden werden. Die Oligonukleotide sind in der Reihenfolge ihrer jeweiligen Beschreibung in dieser Offenbarung nummeriert.
Beispiel 2
Experiment 2.1 Synthese nichtverzweigter Oligonukleotide
2.1.1 Oligonukleotid 9: Hydrazid-15mer: (1-TTT TTT TTT TTT TTT-3').
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1a beschrieben. Das Trityl-ON-Produkt eluiert bei 42,2 min unter den beschriebenen Bedingungen. Das Oligonukleotid 9 eluiert bei 25,6 min (Doppelpeak). LRMS (ESI): M berechn.: 4709,15, beob.: 4709,5.
2.1.2 Oligonukleotid 10: Hydrazid-19mer: (1-dGA TGA GCA GTT CTA CGT GG-3')
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1a beschrieben. Das Trityl-ON-Produkt eluiert bei 41,5 min unter den beschriebenen Bedingungen. Das Oligonukleotid 10 eluiert bei 25,1 min (Einzelpeak). HRMS (ESI): M berechn.: 6092 beob.: 6092.
2.1.3 In-situ-Erzeugung der Hydrazide (Oligonukleotid 11: Hydrazid-19mer (8-dGA TGA GCA GTT CTA CGT GG-Cy3)
Die Synthese des Oligonukleotids erfolgte wie zuvor beschrieben. Ein CPG-Träger, der mit Cy3-Farbstoff beladen war, wurde zum Markieren des Fluorophors am 3'-Ende des Oligonukleotids verwendet. Das CPG-gebundene Öligonukleotid wurde wie in Beispiel 1(E) oben beschrieben behandelt, und das Produkt wurde durch RP-HPLC gereinigt. Das Hydrazid-Oligonukleotid eluiert bei 31,8 min unter den in Beispiel 1(D) beschriebenen HPLC-Bedingungen. LRMS (ESI): M berechn.: 6599,7, beob.: 6598 ±2.
Experiment 2.2 Synthese von verzweigenden Oligonukleotiden.
Zur Einbringung mehrfacher Hydrazide in Oligonukleotide wurden verzweigende Phosphoramidite, Phosphoramidite mit mehr als einer Estergruppe, die in Hydrazide umgewandelt werden, sowie eine Kombination von beiden Ansätzen verwendet. Die flexible Strategie ermöglicht die Synthese von Oligonukleotiden, die definierte Anzahlen zwischen ein und bis zu mehreren (~40) Hydraziden tragen. Die Experimente hier sind beschrieben durch Verwendung von p-RNA und sind auf andere Oligonukleotide anwendbar, wie DNA.
Experiment 2.2.1 Synthese von p-RNA-Oligonukleotiden
Die Synthese von p-RNA-Oligonukleotiden erfolgt wie beschrieben in Miculka, C.; Windhab, N.; Brandstetter, T. Burdinski, G; PCT Patentanmeldung Nr. WO 99/15540 (1999) mit den folgenden Ausnahmen und Abwandlungen: Phosphoramidite von Pentopyranosylnukleosiden werden im Vakuum über KOH getrocknet und in trockenem Acetonitril gelöst, so dass eine 0,1 M Lösung erhalten wurde. Diese Lösung wird über frisch aktiviertem Molekularsieb (3 Å) für 3 Std. getrocknet, und dann für Festphasen-Oligonukleotid-Synthese auf einem PE Biosystems-Expedite 8905 DNA-Synthesegerät aufgetragen. Andere Phosphoramidite werden bei 0,1 M in trockenem Acetonitril gelöst und ohne weitere Behandlung verwendet. Für die p-RNA-Oligonukleotide, die einen Cy3-Farbstoff an dem 2'-Ende eines CPG-Träger-Custom, beladen mit monomethoxytritylgeschütztem Cy3 (CAS: 182873-80-9, AP-Biotech, Freiburg, Deutschland), tragen, wird eine 0,1 M Lösung von trockenem Pyridinium-hydrochlorid in trockenem Acetonitril als Aktivator verwendet. Die Detritylierungsdauer für Pentopyranosylnukleoside wird auf 10 min erhöht, und die Kopplungsdauer wird auf 25 min erhöht. Sämtliche anderen Reagenzien und Lösungen und Verfahren sind gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers.
Experiment 2.2.2 Entfernung der Schutzgruppe der p-RNA-Oligonukleotide:
Für die Spaltung der β-Cyanoethyl-Schutzgruppen wird das Oligonukleotid mit einer 1,5%igen (w/v)-Lösung von Diethylamin in Dichlormethan über Nacht bei RT (Lichtausschluss) behandelt. Der Überstand wird entfernt und das trägergebundene Oligonukleotid wird mehrmals mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Zur Spaltung der Benzoyl- und Isobutyryl-Schutzgruppen, zur Umwandlung der Ester am 5'-Ende des Oligonukleotids an die Hydrazide, und zur Spaltung des Oligonukleotids vom Träger wird das CPG mit dem gebundenen Oligonukleotid mit 1 ml 24% Hydrazinhydrat behandelt. Nach 18 Std. unter konstantem Rühren bei 4°C ist die Reaktion beendet. Die Isolation des Oligonukleotids von der Hydrazinlösung kann erzielt werden durch Umkehrphasen-Extraktion (beispielsweise Sep-Pak oder HPLC).
Eine C18-Sep-Pak-Kartusche (0,5 g Waters Nr. 20515) wird durch Spülen mit 10 ml Acetonitril und dann 10 ml 0,1 M Triethylammoniumbicarbonatpuffer pH-Wert 7,0 (TEAB) aktiviert. Die Hydrazinlösung wird mit dem 5fachen Volumen TEAB verdünnt und auf die Kartusche aufgetragen. Nach dem Binden des Oligonukleotids an die Sep-Pak-Säule wird das restliche Hydrazin mit 10 ml TEAB weg gewaschen. Das Oligonukleotid wird dann von der Säule mit TEAB/Acetonitril (1:2) eluiert. Die Oligonukleotid-haltigen Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockne verdampft. Die Charakterisierung und Reinigung der Produkte wird erzielt durch Umkehrphasen-HPLC mit einer Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, Säule (analytisch: 4 × 250 mm, Fluss = 1,0 ml/min; präparativ: 10 × 250, Fluss = 3,0 ml/min) mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert 7,0 (TEAA) als Puffer A und 75% Acetonitril in Puffer A als Puffer B. Ein Gradient von 0% B bis zu 100 B in 100 min (HPLC-Verfahren A) oder 30 min (HPLC-Verfahren B) wird für analytische und präparative Trennungen verwendet.
A. Oligonukleotid 12: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit 1 Hydrazid: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₁) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1b beschrieben.
B. Oligonukleotid 13: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit 3 Hydraziden: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₃) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1d beschrieben. Das Produkt eluiert bei 37,9 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen. LRMS (ESI): M berechn.: 3516,6, beob.: 3515.
C. Oligonukleotid 14: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit 4 Hydraziden: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₂)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1c beschrieben und mit dem symmetrischen verzweigenden Phosphoramidit (SBA, Clontech, Nr. 5252-2). Das Produkt eluiert bei 37,3 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen. LRMS (MALDI): M berechn.: 3784,7, beob. 3784.
D. Oligonukleotid 15: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit 8 Hydraziden: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₂)₄ (SBA)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1c beschrieben und mit dem symmetrischen verzweigenden Phosphoramidit (SBA, Clontech, Nr. 5252-2). Das Produkt eluiert bei 36,9 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen. LRMS (MALDI): M berechn.: 4661,1, beob. 4464.
E. Oligonukleotid 16: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit Spacer und 8 Hydraziden: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₂)₄ (SBA)₂ (SBA) (S18) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1c beschrieben und mit dem symmetrischen verzweigenden Phosphoramidit (SBA, Clontech, Nr. 5252-2) sowie mit dem Spacer 18 (518, Glen Research Nr. 10-1918-02). Das Produkt eluiert bei 38,7 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen.
F. Oligonukleotid 17: Cy3-markiertes p-RNA-Oligonukleotid mit 16 Hydraziden: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₂)₈ (SBA)₄ (SBA)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1c beschrieben und mit dem symmetrischen verzweigenden Phosphoramidit (SBA, Clontech, Nr. 5252-2). Das Produkt eluiert bei 38,7 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen.
G. Oligonukleotid 18: p-RNA-Oligonukleotid mit 4 Hydraziden (ohne Cy3-Farbstoff): p-RNA-Oligonukleotid-4'-(Hyd₂)₂ (SBA) TAG GCA TT-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie mit der Amidit-Verbindung 1c beschrieben. Das Produkt eluiert bei 12,75 min (HPLC-Verfahren B) unter den beschriebenen Bedingungen. LRMS (ESI): M berechn.: 3275,1, beob. 3275,4.
Experiment 2.3 Allgemeines Verfahren zur Umwandlung von Hydrazid-Oligonukleotiden in Boronat-Oligonukleotide
50 nmol Hydrazid-Oligonukleotid werden gelöst in 200 μl 10 mM Ammoniumacetatpuffer pH-Wert 4,0, und 15 Äquivalente 4-Formylphenylboronsäure (Aldrich Nr. C43, 196-6; CAS: 87199-17-5) je Hydrazid werden zugefügt. Für ein Oligonukleotid mit 4 Hydraziden werden beispielsweise 30 μl einer 0,1 M Lösung von 4-Formylphenylboronsäure in DMSO (3 μmol) verwendet. Das Gemisch wird 1 Std. bei RT inkubiert, 20 Äquivalente NaCNBH₃ pro 4-Formylphenylboronsäure werden zugegeben, und die Inkubation wird für eine weitere Std. bei Raumtemperatur fortgesetzt. Für das Oligonukleotid mit 4 Hydraziden sind beispielsweise 150 μl (150 μmol) einer 1M Lösung von NaCNBH₃ in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH-Wert 4,0 (6,3 mg, gelöst in 1 ml) erforderlich.
Die Entfernung von überschüssiger 4-Formylphenylboronsäure und Natriumcyanoborhydrid erfolgt mittels HPLC, Gelfiltration (Pharmacia PD-10-Säulen) oder Festphasenextraktion (Merck LiChrolute-Säulen). Für boronatmodifizierte Oligonukleotide ist es entscheidend eine am Ende verschlossene HPLC-Säule zu verwenden. Übliche Bedingungen sind 5 μm Phenomenex Luna Phenyl Hexyl-Säulen (analytisch: 4,6 × 250 mm, Fluss = 1,0 ml/min; präparativ: 10 × 250, Fluss = 3,0 ml/min) mittels 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert = 7,0 (TEAA) als Puffer A und 75% Acetonitril in Puffer A als Puffer B. Ein Gradient von 0% B bis 100% B in 100 min (HPLC-Verfahren A) oder 30 min (HPLC-Verfahren B) wird für analytische und präparative Trennungen verwendet. Die produkthaltigen Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockne verdampft.
A. Oligonukleotid 19: p-RNA-Oligonukleotid mit 1 Boronat: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 12 als Ausgangsmaterial.
B. Oligonukleotid 20: p-RNA-Oligonukleotid mit 3 Boronaten: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA)₃ TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 13 als Ausgangsmaterial.
C. Oligonukleotid 21: p-RNA-Oligonukleotid mit 4 Boronaten: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA)₄ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 14 als Ausgangsmaterial.
D. Oligonukleotid 22: p-RNA-Oligonukleotid mit 8 Boronaten: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA)₈ (SBA)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 15 als Ausgangsmaterial. Das Produkt eluiert bei 46,3 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen.
E. Oligonukleotid 23: p-RNA-Oligonukleotid mit Sparer 18 und 8 Boronaten: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA)₈ (SBA)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 16 als Ausgangsmaterial.
F. Oligonukleotid 24: p-RNA-Oligonukleotid mit 16 Boronaten: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA)₁₆ (SBA)₄ (SBA)₂ (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 17 als Ausgangsmaterial. Das Produkt eluiert bei 49,0 min (HPLC-Verfahren A) unter den beschriebenen Bedingungen.
G. Oligonukleotid 25: p-RNA-Oligonukleotid mit 1 Boronat: p-RNA-Oligonukleotid-4'-(PBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
Die Synthese und die Entfernung der Schutzgruppe erfolgte wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben mittels Oligonukleotid 18 als Ausgangsmaterial.
Beispiel 3: HPLC-Analyse
Beim Beenden der Synthese der Hydrazid-Oligonukleotide untersuchte der erste Satz an Experimenten die Lösungsreaktionskinetiken eines hydrazid-markierten Oligonukleotids mit einem NHS- oder Sulfo-NHS-Ester. Zu einer Lösung von 5 μl 132 μM Hydrazid ATA5 in 30 μl 50 mM Histidin wurden 5 μl 10 mM NHS-Acrylat gegeben. Die Lösung wurde bei RT für einen kurzen Zeitraum gerührt, und dann in ein HPLC-System injiziert. Die HPLC-Spur der Verbindungen in der Lösung zeigten die Mengen an Hydrazid ATA5 und N'-Acrylo-ATA5-dihydrazid, die in dem Reaktionsgemisch für eine bestimmte Reaktionszeit zugegen sind. Die Retentionszeiten des Ausgangs-ATA5-Hydrazids und des modifizierten ATA5-Hydrazids waren unterschiedlich und trennbar.
Die 10A-C zeigen drei gesonderte Spuren des Reaktionsgemischs. Die erste Spur (A) wurde erhalten von einem unmodifizierten ATA5-Hydrazid (A), und die dritte Spur (C) veranschaulicht ein vollständig modifiziertes ATA5-Hydrazid (B) nach einer Reaktionszeit von 5 min mit NHS-Acrylat. Die mittlere Spur (B) veranschaulicht eine unvollständige Modifikation, die nach 1 min in der Reaktion eingefangen wurde. Bei einem ungefähren Verbrauch von ATA5-Hydrazid wird eine Reaktionsgeschwindigkeit pseudoerster Ordnung von 1200 M^–1s^–1 bestimmt.
Der Vergleich dieser Rate mit anderen verwendeten Bindungssystemen ist in der 11 gezeigt. Die Reaktionsrate für einen NHS-Ester mit einem Hydrazid in einer wässrigen Umgebung veranschaulicht eine außergewöhnlich effiziente Reaktion. Der pH-Wert der Reaktion wurde darüber hinaus so verändert, dass die pH-Wert-Abhängigkeit der Hydrazid-Modifikation bestimmt wurde. Experimente wurden mit einem Puffersystem aus 50 mM Histidin durchgeführt, das mit HCl auf pH-Wert 6, 5,5, 5,0, 4,5 und 4 eingestellt war. Die Transformation wurde bis zu pH-Wert 4,5 fortgesetzt. Bei einem pH-Wert von 4 war das Hydrazid-Oligonukleotid jedoch unbeeinflusst, was keine Transformation anzeigt, und somit eine pH-Wert-Untergrenze von etwa 4,5 ausmacht.
Beispiel 4: Chip-Herstellung:
Mikroarray-enthaltende Chips werden 5 min unter Argon plasmagereinigt. Die Stelle 25-Chips mit 1 cm × 1 cm werden mittels Bedampfung silanisiert. Zur Mitte des Mikroarrays werden 0,10 μl einer 20%igen (bezogen auf die Masse) Lösung von 9:1 (Molverhältnis) Acrylamid/Bisacrylamid in 1:1 DMSO/H₂O mit 0,3% Daracur 4265 als UV-Starter zugegeben. Der Chip wird in einem Mikroreaktions-Formsystem untergebracht, an das die Mikroarray-Stelle an ein UV-Fenster gepresst wird, das einen quadratischen 4 μM-Hohlraum, 3 mm auf einer Seite, enthält. Die Lösung wird für 20 sec mit UV-Licht bestrahlt, aus dem Form-System entnommen und mit Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Die Vertiefung bildet eine quadratische Hydrogelschicht über dem Mikroarray. Überschüssige Polymerisation jenseits der Parameter der Form werden entfernt.
Zu der bestehenden Permeationsschicht werden 0,80 μl einer Lösung gegeben, die 20% (bezogen auf die Masse) Monomer-Konzentration NHS- oder Sulfo-NHS/Am/Bis 10/83/7 (Molverhältnis) enthält, und das vorhandene Polymer konnte 1 min sättigen. Der Chip wird auf das Mikroreaktions-Formsystem geladen und wie oben mit einer runden Form mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Vertiefungstiefe von 5 μm polymerisiert. Diese zweite Form umfasst die existierende quadratische Schicht vollständig und verläuft hinter diese. Die Bindung der zweiten Schicht erfolgt durch Interkalation von Polymerketten und Bindesilan. Die Chips werden mit Wasser gewaschen, mit Pressluft getrocknet und anschließend in den folgenden Experimenten untersucht.
Experiment 4.1: Aktivierte Esterkonzentration; markierte Fang-Adressierung.
Zu Chips, die mit der zweifachen Permeationsschicht wie oben beschrieben, modifiziert sind, und die 0, 1, 2 und 4% Sulfo-NHS enthalten, wurde elektronisch 500 Hydrazid-T12-BTR als spezifisch markierter Fang geladen, wohingegen 50 mM nM Biotin-T12-BTR als nichtspezifisch markierter Fang verwendet wurde. Sämtliche Lösungen wurden in 50 mM Histidin gepuffert. Die Fänge wurden bei einem Strom von 500 nA/Kissen für 120 Sekunden adressiert, und zwar 4 Kissen auf einmal. Jeder Chip wurde mit 1% SDS, 0,2 × STE und für 20 min in 1% SDS getränkt. Die Chips wurden für 1 sec aufgenommen und die durchschnittlichen MFI-Werte wurden aufgezeichnet.
Wie sich in der 12 ersehen lässt, hängt die kovalente Bindung des markierten Hydrazid-Oligonukleotids von der Menge des aktivierten Esters in der Permeationsschicht ab und steigt, wenn die Konzentration steigt. Die nichtspezifische Bindung eines biotinmarkierten Oligonukleotids ist ebenfalls recht niedrig, wodurch 40 MFI/s für das Experiment Bemittelt werden.
Experiment 4.2: Elektronische Bedingungen:
Zu Chips, die mit der zweifachen Permeationsschicht wie oben beschrieben modifiziert sind, und die 10% NHS oder Sulfo-NHS enthalten, wurde elektronisch 500 und 5 nM Hydrazid-T12-BTR als spezifisch markierter Fang geladen. 500 mM nM Biotin-T12-BTR wurde als nichtspezifisch markierter Fang verwendet. Sämtliche Lösungen wurden in 50 mM Histidin gepuffert. Die Fänge wurden bei Strömen von 400, 500, 600, 700 und 800 nA/kissen für 120 Sec, und zwar 3 Kissen auf einmal, adressiert. Nichtspezifische Fänge wurden bei 800 nA/Kissen geladen. Jeder Chip wurde mit 1% SDS, 0,2 × STE gewaschen und in 1% SDS für 20 min getränkt. Die Chips wurden für 1 sec aufgenommen, und die mittleren MFI-Werte wurden aufgezeichnet.
Wie sich aus 13 ersehen lässt, steigt die Bindung eines spezifischen Fangs an die NHS-modifizierte Permeationsschicht drastisch bei 600 nA, wohingegen die Sulfo-NHS-modifizierten Hydrogele einen etwas höheren Strom für eine maximale Bindung benötigten (14).
Experiment 4.3: Wirkung der mehrfachen Bindung
Zu Chips, die mit der zweifachen Permeationsschicht modifiziert waren, wie oben beschrieben, und die 10% NHS enthielten, wurden Cy3-markierte ATA5-Oligonukleotide mit 1, 2, 4 oder 8 Hydrazid-Einheiten geladen. Die vier Oligomere wurden bei 500 nM mit einem Strom von entweder 700 oder 800 nA/Kissen für 120 sec, gepuffert in 50 mM Histidin, elektronisch adressiert. Beim Beenden wurden die Chips gewaschen und die Bindungs-Mengen wurden gemessen.
Die aufgezeichneten MFI/s-Werte sind in der 15 gezeigt. Ein Vergleich der Anzahl der Hydrazid-Einheiten, die bei gegebenen gleichen Strömen zur Bindung pro Oligomer erhältlich sind, zeigt ein erhöhtes Bindungsausmaß mit dem Zuwachs der Hydrazide am Oligomer an.
Beispiel 4.4: Elektronische Umkehr-Dot-Blot-Hybridisierung
Zu Chips, die mit der zweifachen Permeationsschicht, wie oben beschrieben, modifiziert sind, und die 15% NHS enthalten, wurde ein Octa-Hydrazid ATA5-Oligomer mit einer Cy3-Markierung als spezifischer Fang geladen. Der spezifische Fang wurde bei 500 nM mit einem Strom von entweder 600 oder 700 nA/Kissen für 120s, gepuffert in 50 mM Histidin, geladen. Die elektronische Hybridisierung erfolgte mit 5 nM RCA5-T12-Cy5 als spezifisches Ziel, wohingegen eine Lösung von 5 nM RCA4-Cy5 als nichtspezifisches Ziel verwendet wurde. Die Ziele wurden bei 400 nA/Kissen für 60 sec geladen, die Chips wurden gemäß dem Standard-Protokoll gewaschen und aufgenommen.
Die in der 16 gezeigten Daten zeigen eindeutig die Hybridisierung des spezifischen Ziels, vorzugsweise an das nichtspezifische Ziel. Es sollte auch beachtet werden, dass in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Daten der Anstieg des Stroms von 600 bis 700 nA für die elektronische Beladung des Fangs zu einem Anstieg der Hybridisierung führt.
Beispiel 5: Synthese von Biomolekülen mit nichtkovalenten Bindungseinheiten
Die 4 und 5A und B zeigen die Synthesen der Oligonukleotide, die mehrere Bindungseinheiten enthalten. In der 4 ist die Oligonukleotid-Synthese gezeigt, wobei ein einziges verzweigtes Phosphoramidit mit zwei PBAs zugefügt wird. Die 5A und B zeigen zwei Verzweigungen mit vier PBAs bzw. drei Verzweigungen mit 8 PBAs. Die gezeigten Synthesen wurden auf einem ABI394-DNA-Synthesegerät durchgeführt. Die schrittweise Kopplungsausbeute des verzweigten Phosphoramidits ähnelte den regelmäßigen Nukleotid-Phosphoramiditen, zu etwa 96 bis 98%. Das PBA-Phosphoramidit wurde im letzten Schritt zugeführt. Die Spaltung der Oligonukleotide von dem festen Träger und die Entfernung der Schutzgruppen waren genauso wie bei der Handhabung der regelmäßigen Oligonukleotide, wie es dem Fachmann geläufig ist.
Die PBA-haltigen verzweigten Oligonukleotide wurden gereinigt und durch HPLC analysiert. Die HPLC des PBA-haltigen Oligonukleotids zeigte einen breiteren Peak als die eines regelmäßigen Oligonukleotids.
Experiment 5.1: Elektronische Beladung der Biomoleküle über nichtkovalente Bindungseinheiten.
20 nM nichtverzweigte und verzweigte PBA-haltige ATA5-Fangsonden wurden elektronisch auf Hydrogel-Substrate geladen. Die Fangsonden wurden in 50 mM Histidin, und zwar 10 Kissen auf einmal für 120 sec geladen. 20 nM RCAS-BTR wurde passiv für 5 min geladen. Die Substrate wurden gewaschen und aufgenommen. Die Analyse zeigt, dass verzweigte und unverzweigte Fangsonden bei Bedarf an die Permeationsschicht immobilisiert wurden.
Experiment 5.2: Stabilität von elektronisch geladenen Biomolekülen über nichtkovalente Bindungseinheiten.
Die Oligonukleotide 20, 21, und 22 (p-RNAs mit 3, 4 und 8 PBA-Bindungsstellen) wurden elektronisch an SHA-modifizierte Hydrogel-Chips adressiert. Bei der Beendigung wurden anfängliche Bilder nach einem vorher beschriebenen Standard-Waschverfahren aufgezeichnet. Die Chip-Arrays wurden dann regelmäßig mit wiederholten Spülungen mit 10 μl 50 mM Histidin gespült. Die Bilder wurden nach 5 Waschvorgängen aufgezeichnet. Die in der 21 gezeigten Ergebnisse enthalten 2 Eigenschaften. In erster Linie sind die aufgezeichneten Signale für die Dendrimere höherer Ordnung, die mehr Bindungsstellen pro Oligonukleotid aufweisen, erheblich höher. Das Signal ist zudem ziemlich stabil über einen Zeitraum von 25 Waschzyklen, was die verbesserte Stabilität der Verwendung dendrimerer Bindungssysteme anzeigt. Das Oligonukleotid 22 hat etwa 14% seines anfänglichen Signals verloren, wohingegen die Oligonukleotide 20 und 21 um 25 bzw. 35% gesenkt sind.
Beispiel 6: Kovalente Bindung über mehrfache Hydrazon-Bildung
Zuvor wurden Oligonukleotide, die mit einem einzelnen Amin oder Hydrazid modifiziert waren, elektronisch auf aldehydmodifizierte Hydrogele geladen. Die Wechselwirkung eines Aldehyds mit einem Amin oder einem Hydrazid führt zur Bildung eines Imins (Kohlenstoff mit einer Doppelbindung an Stickstoff) bzw. einem Hydrazon. Diese Einheiten sind unter wässrigen Bedingungen reversibel und erfordern eine zusätzliche Reduktion mit NaBH₃CN, so dass eine stabile irreversible kovalente Bindung erzeugt wird. Tatsächlich führte die elektronische Konzentration eines Oligomers, das ein einzelnes Hydrazid enthält, zur Bindung des Oligomers an die Oberfläche über die Hydrazon-Bildung. Die Eliminierung des Reduktionsschrittes führte zur einer leicht hydrolysierten und instabilen Bindung, wobei das gebundene Oligonukleotid leicht wegdiffundierte. Die Verwendung der dendrimeren Hydrazide ergab ein Mittel der kovalenten Bindung über eine etwas instabile Bindung, die keine weitere Reduktion erfordert; vorausgesetzt es gibt eine signifikante Anzahl von gebildeten Hydrazonen je Oligonukleotid. Die reversible Hydrazon-Bildung kann mit einigen Bindungsstellen erfolgen, wohingegen andere intakt bleiben (22). Das Hydrazid kann nicht diffundieren, und kann sich, in einer aldehydreichen Umgebung gefangen, leicht umformen. Dieses Gleichgewicht profitiert von der gesteigerten Zahl an Bindungsstellen je Oligonukleotid und vorausgesetzt, dass nicht alle Bindungen auf einmal hydrolysieren, wird vorgeschlagen, ein stabiles Bindungssystem zu verwenden. Aldehydreiche Permeationsschichten können direkt hergestellt werden, wie in Glyoxylagarose, oder können aus einer acetalmodifizierten Permeationsschicht erhalten werden. Im letzteren Fall wird die Acetaleinheit leicht in Gegenwart einer Säure hydrolysiert, so dass ein Aldehyd erhalten wird. Das Acetal dient als eine Schutzgruppe, die die Aldehydfunktionalität bewahrt, bis die Aktivierung gewünscht ist. Die Hydrolyse kann durch Einwirkung einer sauren Lösung für 1 Std. oder durch Einwirkung eines schwachen elektronischen Stroms, gepuffert in einer verdünnten Salzlösung, beendet werden. Letzteres Verfahren stellt eine stellenspezifische Hydrolyse bereit, indem man den Vorteil der an der Kathode entstandenen Säure ausnutzt.
Experiment 6.1: Dendrimere Hydrazid-Oligomere, die an Glyoxylagarose gebunden sind.
Standard-25-Stellen-Chips wurden mit Glyoxyl-Agarose (FMC, Princeton, NJ)) spinbeschichtet. Mit 500 nM Hydrazid Cy3-markierte Oligonukleotide mit 1, 2, 4 und 8 Hydraziden wurden elektronisch bei 500 nA/Kissen jeweils für 2 min, gepuffert in 50 mM Histidin, geladen. Die Chips wurden je nach dem erstellten Verfahren gewaschen und aufgenommen. Die aufgezeichneten MFI/s-Werte sind in der 23 gezeigt. Die Oligonukleotide mit ein oder zwei Hydraziden waren ziemlich instabil und ergaben wie erwartet wenig oder keine nachweisbare Fluoreszenz jenseits dem Hintergrundrauschen. Die Oligonukleotide mit einer höheren Zahl an Hydraziden können eine stabile kovalente Bindung bilden.
Experiment 6.2: Dendrimere Hydrazid-Oligomere, gebunden an acetalmodifizierte Hydrogele; Entfernung der Schutzgruppe und kovalente Bindung.
Standard-25-Arraystellen-Mikrochips wurden mit einem Einzelschichthydrogel, bestehend aus Acrylamid, Bisacrylamid und Vinylacetal in einem 15:2:3-Verhältnis, modifiziert. Ausgewählte Stellen wurden einem Strom von 300 nA/Kissen für 2 min in einer 50 mM NaCl-Lösung ausgesetzt, so dass die Acetalfunktionalität, die die Aldehyde freigibt, hydrolysiert wird. Dendrimere Hydrazid-Oligomere mit 8 Hydraziden je Oligonukleotid wurden elektronisch bei 500 nA/Kissen für 2 min, gepuffert in 50 mM Histidin, in aktivierte und nicht aktivierte Kissen geladen. Ein nichtspezifisches Oligonukleotid wurde auf acetal- und aldehydmodifizierte Stellen elektrisch geladen. Nach einem Standard-Waschzyklus wurden die Chips aufgenommen. Die aufgezeichneten MFI/s-Daten sind in der 24 gezeigt.
Wie aus der 24 ersichtlich weisen Kissen, die elektronisch aktiviert wurden, und dann mit einem dendrimer markierten Oligomer elektrisch geladen wurden, das höchste Fluoreszenzsignal auf. Interessanterweise zeigen solche Kissen, die nicht voradressiert wurden und als Acetale verblieben, eine gewisse Bindung von hydrazidmodifizierten Oligomeren auf. Man nimmt an, dass der zum Konzentrieren des Oligomers angelegte elektronische Strom genug Säure erzeugte, dass die Pufferkapazität von Histidin lokal übertroffen wurde, und er konnte daher eine signifikante Menge an Acetaleinheiten hydrolysieren.
Beispiel 7: Kopplung von Hydrazid-Oligonukleotiden an andere Moleküle als Substrat-Oberflächen.
Experiment 7.1 Reaktion von Hydrazid-15mer 9 mit Benzyloxyacetaldehyd; 19.
10 μmol Hydrazid Oligonukleotid 9 werden in 60 μl 10 mM Ammoniumacetatpuffer (pH-Wert 4,0) gelöst. 1 Tropfen Benzyloxyacetaldehyd (CAS: 6065-87-3; C9H10O2 [150.1760] Aldrich Nr. 38, 218-3) wird zugegeben, und das Gemisch kann 1 Std. bei RT stehen bleiben. Das Lösungsmittel und überschüssiges Aldehyd werden im Vakuum entfernt, und das Produkt wird durch HPLC analysiert (Säule: Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, 4 × 250 mm; Puffer A = 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert = 7,0, Puffer B = 75% Acetonitril in Puffer A; Fluss = 1,0 ml/min; Gradient: 0% B bis 100% B in 100 min). Die Retentionszeit des Produktes ist 30,7 min, Oligonukleotid 9 eluiert bei 25,5 min.
Experiment 7.2 Konjugationsreaktion von Oligonukleotid 10 mit einem Peptid, 20.
4,4 nmol Oligonukleotid 10 werden in 60 μl 10 mM Ammoniumacetatpuffer (pH-Wert 4,0) gelöst. 44 nmol (10 Äq.) Antischmerz-Hydrochlorid (CAS: 37682-72-7; C27H44N10O6·2HCl; [677.6304]; Calbio Nr. F 178220) in 15 μl Puffer werden zugeführt und 3 Std. bei RT gerührt. Das Zwischenprodukt wird mit NaBH₃CN (100 Äq.) für 1 Std. bei RT reduziert. Das Produkt wird durch HPLC isoliert (Säule: Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, 4 × 250 mm; Puffer A = 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert 7,0, Puffer B = 75% Acetonitril in Puffer A; Fluss = 1,0 ml/min; Gradient: 10% B bis 85% B in 60 min). Die Retentionszeit des Produktes (Oligonukleotid-Peptid-Konjugat) beträgt 16,5 min, Oligonukleotid 10 eluiert bei 13,9 min. MS (ESI): Beredin.: 6680,6; beob.: 6679, 6)
Beispiel 8: Passive Anwendung von hydrazidmodifizierten Biomolekülen auf Objektträgeroberflächen
Für die Bindung der hydrazidmodifizierten Oligonukleotide an kommerziell erhältliche Objektträger wurde eine Reihe von p-RNA-Oligonukleotiden mit 1 bis 16 Hydraziden verwendet. Zusammen mit den Oligonukleotiden 12, 13 und 14 wurden Oligomere mit 3 und 6 Hydraziden, hergestellt aus 1d, verwendet. Zusätzlich wurde ein Oligomer mit Aminende (hergestellt mit 5'-Amino-Modifikator C6; Glenn Research) und ein Oligonukleotid ohne Modifikation als unspezifische Kontrollen verwendet. Alle Oligomere sind mit Cy3 am 2'-Ende markiert und behalten die gleiche Nukleotidsequenz.
Experiment 8.1: Bindung an Surmodics 3D Link^TM-Amin-Bindungs-Objektträger.
Oligonukleotide werden in 3D-Link^TM-Druck-Puffer (Surmodics, Inc., Eden Prairie, Minnesota) bei pH-Wert = 8,5 mit Konzentrationen im Bereich zwischen 10 μM und 100 nM gelöst. Aus jeder Lösung wurden 0,5 μl direkt auf die Objektträgeroberfläche aufgetragen und bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Kammer über einer gesättigten NaCl-Lösung über Nacht im Dunkeln inkubiert. Die Objektträger werden dann für 15 min bei 50°C mit 3D Link^TM Blocking-Puffer behandelt, um die nicht umgesetzten Oberflächenstellen zu blockieren. Die Objektträger wurden zweimal mit Wasser gewaschen, gefolgt von einem 30 min Waschvorgang mit 0,2% SDS bei 50°C und anschließend zwei Waschschritten mit Wasser und dann an der Luft getrocknet. Die Fluoreszenz-Erfassung wurde auf einem Pharmacis-Scanner mit 20 sec Integrationszeiten durchgeführt. Die Bilder und die Intensitätsprofile sind in der 25 gezeigt.
Das unspezifische Oligonukleotid ergab ein Signal zwischen 10 × 10³ und 25 × 10³ relative Einheiten bei 10 μM. Die Intensität des Signals ähnelt demjenigen, das für ein Oligonukleotid beobachtet wurde, das eine einzelne Aminogruppe enthielt. Das hydrazidmodifizierte Oligonukleotid ergab dagegen eine viel höhere Ladung von 35 bis 40 × 10³ Fluoreszenzeinheiten. Zudem hat das hydrazidmodifizierte Oligonukleotid ein höheres Fluoreszenzsignal bei niedrigeren Konzentrationen, mit einer unteren Nachweisgrenze von 1,25 μM, wie verglichen mit dem aminmodifizierten Oligomer, das eine untere Nachweisgrenze von 5 μM aufweist.
Experiment 8.2: Bindung an SuperAldehyd-Objektträger.
Die Oligonukleotide werden entweder in Surmodics 3D Link^TM-Druckpuffer bei pH-Wert = 8,5 mit Konzentrationen im Bereich von 10 μM bis 100 nM oder in 10 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH-Wert = 4,0 gelöst. Aus jeder Lösung, werden 0,5 μM auf die Oberfläche von SuperAldehyd-Objektträgern (Telechem International, Inc. Sunnyvale, CA) aufgetragen und über Nacht bei RT inkubiert. Die Objektträger werden dann zweimal mit 0,2% SDS behandelt und viermal mit Wasser gewaschen (jeweils 2 min). Die Oberfläche wurde dann mit einer Lösung von 0,3% NaBH₃CN in PBS-Puffer, pH-Wert = 7 mit 133 ml Ethanol zum Eliminieren der Blasenbildung behandelt. Danach folgten drei 1 min Waschvorgänge mit 0,2% SDS und Wasser. Die Fluoreszenz-Erfassung erfolgte auf einem Pharmacis-Scanner mit 20 s Integrationszeiten. Die Bilder und die Intensitätsprofile sind in der 26 gezeigt.
Die 26 zeigt, dass das Hydrazid-Oligonukleotid sowohl bei pH-Wert = 8,5 als auch bei 4,0 eine viel höhere Signalintensität im Vergleich zu dem Oligomer mit Amin-Ende liefert und es durch die Änderung im pH-Wert unbeeinflusst ist. Bei gleichen Konzentrationen liefert das hydrazidmodifizierte Oligomer darüber hinaus eine viel höhere Signalintensität als die aminmodifizierten Oligomere. Die Amin-Oligonukleotide sind unter 2,5 μM nicht länger nachweisbar, wohingegen die Hydrazid-Oligomere bei nur 1,25 μM erfasst werden.

Claims

Verfahren zum Binden von Biomolekülen an ein Substrat, umfassend: a. Bereitstellen eines Biomoleküls; b. Zusammenbringen des Biomoleküls mit einer verzweigten Bindungseinheit, so dass eine verzweigte Bindungsstruktur erhalten wird, umfassend mehrere Hydrazideinheiten, wobei die Bindungsstruktur an die Bindungseinheiten in dem Substrat koppeln kann; c. Zusammenbringen der Hydrazideinheiten der Bindungsstruktur mit Bindungseinheiten, die in dem Substrat enthalten sind, so dass eine gekoppelte substratbindende Struktur erhalten wird; wobei das Biomolekül kovalent an das Substrat gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verzweigte Bindungsstruktur die Aktivierung eines geschützten Hydrazids oder einer Hydrazid-Vorstufe vor der Bildung der gekoppelten substratbindenden Struktur erfordert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein aktiviertes Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Substrat in Kontakt mit einem elektrisch adressierbaren Mikrochip ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Substrat ein aktivierter Glas-Objektträger ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Glassubstrat ein Glas-Objektträger ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Bindungseinheit eines Substrates eine Lewis-Säure oder ein Elektrophil umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine Lewis-Säure oder ein Elektrophil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Epoxid, Aziridin, Vinyl, Aldehyd, Keton, Acetal, Disulfid, Carbonsäure, Amid, Brom- oder Iodacetamid, N-Hydroxysuccinimidylester, Sulfo-N-hydroxysuccinimidylester, Azlacton, Isocyanat, Thioisocyanat, Phenylboronsäure, Phosphoramidit und Carbonat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verzweigte Bindungseinheit ein Phosphoramidit ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Phosphoramidit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Diethyl-3-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]glutarat; Diethyl-5-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}isophthalat; Dimethyl-3,3'-(2-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}-2-{[2-(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}propan-1,3-diylbisoxy)dipropionat; Ethyl-6-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]hexanoat; und 6-[(2-Cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]-N'-tritylhexanohydrazid.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die verzweigte Bindungseinheit eine verzweigte Bindungsstruktur bildet, die mehrere aktivierte Hydrazideinheiten zum Binden eines Substrates umfasst.
Verfahren zum Binden eines Hydrazids an ein Biomolekül, umfassend: a. Koppeln eines Biomoleküls an ein verzweigtes Phosphoramidit, umfassend ein geschütztes Hydrazid oder eine Hydrazid-Vorstufe und b. Zusammenbringen des geschützten Hydrazids oder einer Hydrazidvorstufe mit mindestens einem Reagenz zur Umwandlung der geschützten oder Vorstufenform in eine Hydrazideinheit.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Phosphoramidit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Diethyl-3-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]glutarat; Diethyl-5-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}isophthalat; Dimethyl-3,3'-(2-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}-2-{[2-(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}propan-1,3-diylbisoxy)dipropionat; Ethyl-6-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]hexanoat; und 6-[(2-Cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]-N'-tritylhexanohydrazid.
Substanz-Zusammensetzung eines Phosphoramidits, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Diethyl-3-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]glutarat; Diethyl-5-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}isophthalat; Dimethyl-3,3'-(2-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}-2-{[2-(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}propan-1,3-diylbisoxy)dipropionat; Ethyl-6-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]hexanoat; und 6-[(2-Cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]-N'-tritylhexanohydrazid.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Biomoleküle zuerst aktiviert werden und dann an Substrate gebunden werden, umfassend Bindungseinheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aldehyden, Ketonen, Estern, aktivierten Estern, Acetalen, Halogenacetamiden, und Alkylhalogeniden.
Verfahren zum Aktivieren eines Biomoleküls nach Anspruch 16, wobei die Biomoleküle mit geschützten Hydraziden oder Hydrazid-Vorstufen zuerst in Hydrazide umgewandelt werden und dann mit einem Reagenz behandelt werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Formylphenylboronsäure, 3-Formylphenylboronsäure und 4-Formylphenylboronsäure.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das aktivierte Biomolekül reduziert ist.
Verfahren zur Herstellung von hydrazidhaltigen Oligonukleotiden, umfassend: a. Koppeln eines Oligonukleotids an eine verzweigte Bindungseinheit, umfassend mindestens eine Vorstufenform einer Hydrazideinheit; und b. Zusammenbringen der Vorstufenform mit mindestens einem Reagenz zur Umwandlung der Vorstufenform in eine Hydrazideinheit.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Vorstufenform einer Hydrazideinheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aldehyden, Ketonen, Estern, Carbonsäuren, aktivierten Estern, Acetalen, Halogenacetamiden, Alkylhalogeniden und Tritylhydrazid.
Verwendung von Biomolekülen, die verzweigte Bindungsstrukturen mit mehreren Hydrazideinheiten enthalten, zur Bindung der Biomoleküle an eine Substratoberfläche, die aktive Ester auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip enthält.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die aktiven Ester ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Azlactonen, N-Hydroxysuccinimidylestern und Sulfo-N-hydroxysuccinimidylestern.
Verwendung von Biomolekülen, die verzweigte Bindungsstrukturen mit mehreren Hydrazideinheiten enthalten, zur Bindung der Biomoleküle an eine Substratoberfläche, die Aldehyde auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip enthält.
Verwendung von Biomolekülen, die verzweigte Bindungsstrukturen mit mehreren Hydrazideinheiten enthalten, zur Bindung der Biomoleküle an eine Substratoberfläche, die Ketone auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip enthält.
Mikroarray, an dem Biomoleküle gebunden sind, die jeweils über eine Vielzahl von Bindungseinheiten an dem Mikroarray gebunden sind, wobei die an dem Biomolekül über eine verzweigte Bindungsstruktur gekoppelten Bindungseinheiten ein Hydrazid umfassen.
Mikroarray nach Anspruch 25, wobei der Array eine Dichte von gebundenen Biomolekülen von mehr als 103 Biomolekülen pro μm² des Arrays hat.
Verbindung, umfassend eine verzweigte Bindungsstruktur, wobei die verzweigte Bindungsstruktur aus der Behandlung eines Biomoleküls mit einer verzweigten Bindungseinheit hervorgeht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Diethyl-5-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}isophthalat; Diethyl-3-[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]glutarat; und Dimethyl-3,3'-(2-{[(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphanyloxy]methyl}-2-{[2(methoxycarbonyl)ethoxy]methyl}propan-1,3-diylbisoxy)dipropionat; und wobei die Estergruppen der verzweigten Bindungseinheiten in Hydrazidgruppen umgewandelt werden.
Verbindung nach Anspruch 27, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer einzelnen Nukleinsäure, Oligonukleotiden, Polynukleotiden, DNAs, RNAs, Proteinen, Peptiden, Enzymen, Antikörpern, CNAs (Cyclohexyl-Nukleinsäuren), p-MeNAs (Methyl- oder Methoxyphosphat-Nukleinsäuren), Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) und Pyranosyl-RNAs (P-RNAs).