DE60032623T2

DE60032623T2 - Alkylamino-substituierte bicyclische heterocyclen als p38 protein-kinase-inhibitoren

Info

Publication number: DE60032623T2
Application number: DE60032623T
Authority: DE
Inventors: James Patrick Los Altos DUNN; David Michael San Jose GOLDSTEIN; William Harris; Ian Edward David Willington SMITH; Teresa Rosanne Saratoga WELCH
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-10-21
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: IL149230A0; KR100537241B1; AR026187A1; CO5251408A1; NO20021783L; WO2001029041A1; AU1137501A; BR0014973A; HRP20020327A2; JP4028236B2; CA2388140C; ES2277858T3; US6642241B1; TR200201058T2; EP1226144B1; JP2003512377A; EP1226144A1; CA2388140A1; PL357494A1; YU29202A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bicyclische Stickstoffheterocyclen. Insbesondere handelt die Erfindung von Alkylamino-substituierten Dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidinonderivaten, einem Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung, pharmazeutischen Präparaten, die diese enthalten und einem Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Präparate.
Bei Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAP) handelt es sich um eine Familie von Prolin spezifischen Serin/Threonin-Kinasen, die ihre Substrate durch duale Phosphorylierung aktivieren. Die Kinasen werden durch eine Vielfalt von Signalen, einschließlich ernährungsbedingtem und osmotischem Stress, UV-Licht, Wachstumsfaktoren, Endotoxin und Entzündungs-Zytokine aktiviert. Eine Gruppe von MAP-Kinasen ist die p38-Kinasegruppe, die verschiedene Isoformen (z.B. p38α, p39β und p38γ) einschließt. Die p38-Kinasen sind ebenso wie andere Kinasen für die Phosphorylierung und Aktivierung von Transkriptionsfaktoren verantwortlich und werden durch physischen und chemischen Stress, pro-Entzündungs-Zytokine und bakterielles Lipopolysaccharid aktiviert.
Als wesentlich wichtiger hat sich herausgestellt, dass die Produkte der p38-Phosphorylierung die Produktion von Entzündungs-Zytokinen, einschließlich TNF und IL-1 und Cyclooxygenase-2 vermitteln. Jedes dieser Zytokine ist mit zahlreichen Krankheitsstadien und Zuständen in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel ist TNF-α ein Zytokin, das in erster Linie durch aktivierte Monozyten und Makrophagen produziert wird. Es wurde vermutet, dass seine übermäßige oder ungeregelte Produktion eine kausale Rolle in der Pathogenese von rheumatoider Arthritis spielt. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass die Inhibierung der TNF Produktion eine breite Anwendung bei der Behandlung einer Entzündung, Colon irritabile, multipler Sklerose und Asthma aufweist.
TNF ist auch mit viralen Infektionen wie unter anderem HIV, Influenzavirus und Herpesvirus, einschließlich Herpes simplex Virustyp-1 (HSV-1), Herpes simplex Virustyp-2 (HSV-2), Cytomegalievirus (CMV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barrvirus, menschlichem Herpesvirus-6 (HHV-6), menschlichem Herpesvirus-7 (HHV-7), menschlichem Herpesvirus-8 (HHV-8), Pseudorabies und Rhinotracheitis in Zusammenhang gebracht worden.
Ebenso wird IL-1 durch aktivierte Monozyten und Makrophagen produziert und spielt eine Rolle in vielen pathophysiologischen Reaktionen, einschließlich rheumatoider Arthritis, Fieber und Reduktion der Knochenresorption. Die Inhibierung dieser Zytokine durch Inhibierung der p38-Kinase ist bei der Kontrolle, Abschwächung und Milderung vieler dieser Krankheitsstadien von Vorteil.
Die Verbindungen der Formel I und deren vorstehend erwähnte Salze sind Inhibitoren von Protein-Kinasen und zeigen in vivo gegenüber p38 eine überraschend wirksame Aktivität. Die Verbindungen der Formel I zeigen keine Aktivität gegenüber der T-Zellen Tyrosinkinase p56^lck bei Mengen unterhalb etwa 10 μM. Die Verbindungen können zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch pro-Entzündungs-Zytokine wie TNF und IL-1 vermittelt werden.
Wie hierin verwendet:

„Alkyl" bedeutet einen linearen gesättigten einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen oder einen verzweigten gesättigten einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, 2-Propyl, tert-Butyl, Pentyl und dergleichen.
„Alkylen" bedeutet einen linearen gesättigten zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen oder einen verzweigten gesättigten zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, z.B. Methylen, Ethylen, Propylen, 2-Methylpropylen, Pentylen und dergleichen.
„Alkenyl" bedeutet einen linearen einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen oder einen verzweigten einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, der mindestens eine Doppelbindung enthält, z.B. Ethenyl, Propenyl und dergleichen.
„Alkinyl" bedeutet einen linearen einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen oder einen verzweigten einwertigen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, der mindestens eine Dreifachbindung enthält, z.B. Ethinyl, Propinyl und dergleichen.
„Cycloalkyl" bezeichnet einen gesättigten einwertigen cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sieben Ringkohlenstoffatomen. Das Cycloalkyl kann gegebenenfalls unabhängig mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sein, ausgewählt aus Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Phenyl oder -C(O)R (wobei R Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Amino, monosubstituiertes Amino, disubstituiertes Amino, Hydroxy, Alkoxy oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist). Im Besonderen schließt der Begriff Cycloalkyl zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclohexyl, Phenylcyclohexyl, 4-Carboxycyclohexyl, 2-Carboxamidocyclohexyl, 2-Dimethylaminocarbonylcyclohexyl und dergleichen ein.
„Cycloalkenyl" bedeutet einen ungesättigten nichtaromatischen einwertigen cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sieben Ringkohlenstoffatomen. Repräsentative Beispiele schließen Cyclohexenyl und Cyclopentenyl ein.
„Cycloalkylalkyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkylenrest und R^b ein Cycloalkylrest ist, wie hier definiert, z.B. Cyclopropylmethyl, Cyclohexylpropyl, 3-Cyclohexyl-2-methylpropyl und dergleichen.
„Acyl" bedeutet einen Rest -C(O)R', wobei R' Alkyl, Halogenalkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl ist.
„Alkoxy", „Aryloxy", „Aralkyloxy" oder „Heteroaralkyloxy" bedeutet einen Rest -OR, wobei R ein Alkyl, Aryl, Aralkyl beziehungsweise Heteroaralkyl, wie hier definiert, ist, z.B. Methoxy, Phenoxy, Pyridin-2-ylmethyloxy, Benzyloxy und dergleichen.
„Halo" oder „Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod, vorzugsweise Fluor und Chlor.
„Halogenalkyl" bedeutet ein Alkyl, das mit einem oder mehreren gleichen oder verschiedenen Halogenatomen substituiert ist, z.B. -CH₂Cl, -CF₃, -CH₂CF₃, -CH₂CCl₃ und dergleichen und weiters jene Alkylreste wie Perfluoralkyl einschließt, in welchem alle Wasserstoffatome durch Fluoratome ersetzt sind.
„Hydroxyalkyl" bedeutet einen wie hier definierten Alkylrest, der mit einer oder mehreren, vorzugsweise einer, zwei oder drei Hydroxygruppen substituiert ist, mit der Maßgabe, dass dasselbe Kohlenstoffatom nicht mehr als eine Hydroxygruppe trägt. Repräsentative Beispiele schließen 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 1-(Hydroxymethyl)-2-methylpropyl, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxybutyl, 4-Hydroxybutyl, 2,3-Dihydroxypropyl, 1-(Hydroxymethyl)-2-hydroxyethyl, 2,3-Dihydroxybutyl, 3,4-Dihydroxybutyl und 2-(Hydroxymethyl)-3-hydroxypropyl, vorzugsweise 2-Hydroxyethyl, 2,3-Dihydroxypropyl und 1-(Hydroxymethyl)-2-hydroxyethyl ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Demgemäß wird wie hier verwendet der Begriff „Hydroxyalkyl" verwendet, um eine Untergruppe von Heteroalkylresten zu definieren.
„Monosubstituiertes Amino" bedeutet einen Rest -NHR, wobei R Alkyl, Heteroalkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Heteroaralkenyl, Heterocyclyl oder Heterocyclylalkyl ist, z.B. Methylamino, Ethylamino, Phenylamino, Benzylamino und dergleichen.
„Disubstituiertes Amino" bedeutet einen Rest -NRR', wobei R und R' unabhängig voneinander Alkyl, Heteroalkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Heteroaralkenyl, Heterocyclyl oder Heterocyclylalkyl sind, oder R und R' zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Heterocyclylring bilden. Repräsentative Beispiele schließen Dimethylamino, Methylethylamino, Di(1-methylethyl)amino, Piperazin-1-yl und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
„Aryl" bedeutet einen einwertigen monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 10 Ringatomen, welcher unabhängig mit einem oder mehreren Substituenten, vorzugsweise einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus Alkyl, Halogenalkyl, Heteroalkyl, Halogen, Nitro, Cyano, Methylendioxy, Ethylendioxy, Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiertem Phenyl, Heteroaryl, Halogenalkoxy, gegebenenfalls substituiertem Phenoxy, Heteroaryloxy, -COR (wobei R Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist), -(CR'R'')_n-COOR (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R Wasserstoff Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl ist) oder -(CR'R'')_n-CONR^aR^b (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R^a und R^b unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl sind oder R^a und R^b zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Heterocyclylring bilden). Im Besonderen schließt der Begriff Aryl Phenyl, 1-Naphthyl und 2-Naphthyl und die Derivate davon ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
„Aralkyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkylenrest und R^b ein Arylrest ist, wie hier definiert, z.B. Benzyl, Phenylethyl, 3-(3-Chlorphenyl)-2-methylpentyl und dergleichen.
„Aralkenyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkenylenrest und R^b ein Arylrest ist, wie hier definiert, z.B. 3-Phenyl-2-propenyl und dergleichen.
„Arylheteroalkyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Heteroalkylenrest und R^b ein Arylrest ist, wie hier definiert, z.B. 2-Hydroxy-2-phenylethyl, 2-Hydroxy-1-hydroxymethyl-2-phenylethyl und dergleichen.
„Gegebenenfalls substituiertes Phenyl" bedeutet einen Phenylring, welcher gegebenenfalls unabhängig mit einem oder mehreren Substituenten, vorzugsweise einem oder zwei Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus Alkyl, Halogenalkyl, Heteroalkyl, Halogen, Nitro, Cyano, Methylendioxy, Ethylendioxy, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, -COR (wobei R Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist), -(CR'R'')_n-COOR (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl ist) oder -(CR'R'')_n-CONR^aR^b (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R^a und R^b unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl sind oder R^a und R^b zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind einen Heterocyclylring bilden).
„Heteroaryl" bedeutet einen einwertigen monocyclischen oder bicyclischen Rest aus 5 bis 12 Ringatomen mit mindestens einem aromatischen Ring, der ein, zwei oder drei Ringheteroatome ausgewählt aus N,O oder S enthält, wobei die restlichen Ringatome C-Atome sind, mit der Maßgabe, dass die Bindungsstelle des Heteroarylrestes am aromatischen Ring sein wird. Der Heteroarylring ist gegebenenfalls unabhängig mit einem oder mehreren Substituenten, vorzugsweise einem oder zwei Substituenten substituiert, ausgewählt aus Alkyl, Halogenalkyl, Heteroalkyl, Halogen, Nitro, Cyano, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, -COR (wobei R Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist), -(CR'R'')_n-COOR (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl ist) oder -(CR'R'')_n-CONR^aR^b (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R^a und R^b unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl sind oder R^a und R^b zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind einen Heterocyclylring bilden). Im Besonderen schließt der Begriff Heteroaryl Pyridyl, Furanyl, Thienyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Triazolyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Pyrimidinyl, Benzofuranyl, Tetrahydrobenzofuranyl, Isobenzofuranyl, Benzothiazolyl, Benzoisothiazolyl, Benzotriazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Benzoxazolyl, Chinolyl, Tetrahydrochinolinyl, Isochinolyl, Benzimidazolyl, Benzisoxazolyl oder Benzothienyl und die Derivate davon ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
„Heteroaralkyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkylenrest und R^b ein Heteroarylrest ist, wie hier definiert, z.B. Pyridin-3-ylmethyl, 3-(Benzofuran-2-yl)propyl und dergleichen.
„Heteroaralkenyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkenylenrest und R^b ein Heteroarylrest ist, wie hier definiert, z.B. 3-(Pyridin-3-yl)propen-2-yl und dergleichen.
„Heterocyclyl" bedeutet einen gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen cyclischen Rest mit 3 bis 8 Ringatomen, in welchem ein oder zwei Ringatome Heteroatome sind, ausgewählt aus NR (wobei R unabhängig Wasserstoff oder Alkyl ist), O oder S(O)_n (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), wobei die restlichen Ringatome C sind, wobei ein oder zwei C-Atome gegebenenfalls durch eine Carbonylgruppe ersetzt werden können. Der Heterocyclylring kann gegebenenfalls unabhängig mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sein, ausgewählt aus Alkyl, Halogenalkyl, Heteroalkyl, Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Amino, monosubstituiertem Amino, disubstituiertem Amino, -COR (wobei R Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist), -(CR'R'')_n-COOR (n ist eine ganze Zahl von 0 bis 5, R' und R'' sind unabhängig Wasserstoff oder Alkyl, und R ist Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl) oder -(CR'R'')_n-CONR^aR^b (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder Alkyl sind, und R^a und R^b unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylalkyl sind oder R^a und R^b zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind einen Heterocyclylring bilden). Im Besonderen schließt der Begriff Heterocycyl Tetrahydropyranyl, Piperidino, N-Methylpiperidin-3-yl, Piperazino, N-Methylpyrrolidin-3-yl, 3-Pyrrolidino, Morpholino, Thiomorpholino, Thiomorpholino-1-oxid, Thiomorpholino-1,1-dioxid, Pyrrolinyl, Imidazolinyl und die Derivate davon ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
„Heterocyclylalkyl" bedeutet einen Rest -R^aR^b, wobei R^a ein Alkylenrest. und R^b ein Heterocyclylrest ist, wie vorstehend definiert, z.B. Tetrahydropyran-2-ylmethyl, 4-Methylpiperazin-1-ylethyl, 3-Piperidinylmethyl und dergleichen.
„Heteroalkyl" bedeutet einen wie hier definierten Alkylrest mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus -OR^a, -NR^bR^c und -S(O)_nR^d (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist). R^a ist Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Carboxamido oder Mono- oder Dialkylcarbamoyl. R^b ist Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl. R^c ist Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylsulfonyl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Carboxamido oder Mono- oder Dialkylcarbamoyl. R^d ist Wasserstoff (mit der Maßgabe, dass n 0 ist), Alkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amino, monosubstituiertes Amino, disubstituiertes Amino oder Hydroxyalkyl. Repräsentative Beispiele schließen zum Beispiel 2-Methoxyethyl, Benzyloxymethyl, Thiophen-2-ylthiomethyl, 2-Hydroxyethyl und 2,3-Dihydroxypropyl ein.
„Heteroalkylen" bedeutet einen linearen gesättigten zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen oder einen verzweigten gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus -OR^a, -NR^bR^c und -S(O)_nR^d (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), wobei R^a, R^b, R^c und R^d wie hier für einen Heteroalkylrest definiert sind. Beispiele schließen 2-Hydroxyethan-1,1-diyl, 2-Hydroxypropan-1,1-diyl und dergleichen ein.
„Heterosubstituiertes Cycloalkyl" bedeutet einen Cycloalkylrest, wobei ein, zwei oder drei Wasserstoffatome durch Substituenten ersetzt sind, unabhängig ausgewählt aus Hydroxy, Alkoxy, Amino, monosubstituiertem Amino, disubstituiertem Amino oder -SO_nR (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist und R Wasserstoff (mit der Maßgabe, dass n 0 ist), Alkyl, Halogenalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amino, monosubstituiertes Amino, disubstituiertes Amino oder Hydroxyalkyl ist). Beispiele schließen 4-Hydroxycyclohexyl, 2-Aminocyclohexyl ein.
„Heteroalkylsubstituiertes Cycloalkyl" bedeutet einen Cycloalkylrest, wobei ein, zwei oder drei Wasserstoffatome unabhängig durch Heteroalkylreste ersetzt sind. Beispiele schließen 1-Hydroxymethylcyclopent-1-yl, 2-Hydroxymethylcyclohex-2-yl und dergleichen ein.
„Abgangsgruppe" hat die Bedeutung, die herkömmlich in der synthetischen, organischen Chemie damit verbunden wird, d.h. ein Atom oder eine Gruppe, die geeignet ist, durch ein Nukleophil ersetzt zu werden und schließt Halogen (wie Chlor, Brom, Iod), Alkansulfonyloxy, Arensulfonyloxy, Alkylcarbonyloxy (z.B. Acetoxy) Arylcarbonyloxy, Mesyloxy, Tosyloxy, Trifluormethansulfonyloxy, Aryloxy (z.B. 2,4-Dinitrophenoxy), Methoxy, N,O-Dimethylhydroxylamino und dergleichen ein.
„Pharmazeutisch verträglicher Exzipient" bedeutet einen Exzipienten, der bei der Herstellung eines Arzneimittels nützlich ist, das im Allgemeinen sicher, nicht giftig und weder biologisch noch sonst eine unerwünschte Wirkung aufweist und einen Exzipienten beinhaltet, der für die tierärztliche Verwendung wie auch menschliche pharmazeutische Verwendung verträglich ist. Ein „pharmazeutisch verträglicher Exzipient" wie in der Beschreibung und Ansprüchen verwendet, schließt sowohl einen als auch mehr als einen derartigen Exzipienten ein.
„Pharmazeutisch verträgliches Salz" einer Verbindung bedeutet ein Salz, das pharmazeutisch verträglich ist und das die gewünschte pharmakologische Wirkung der Ausgangsverbindung aufweist. Derartige Salze schließen: (1) Säureadditionssalze, die mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen gebildet werden; oder mit organischen Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Hexansäure, Cyclopentanpropionsäure, Glykolsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, 3-(4-Hydroxybenzoyl)benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 1,2-Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 4-Chlorbenzolsulfonsäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, 4-Toluolsulfonsäure, Kampfersulfonsäure, 4-Methylbicyclo[2,2,2]oct-2-en-1-carbonsäure, Glucoheptonsäure, 4,4'-Methylenbis-(3-hydroxy-2-en-1-carbonsäure), 3-Phenylpropionsäure, Trimethylessigsäure, tertiär-Butylessigsäure, Laurylschwefelsäure, Gluconsäure, Glutaminsäure, Hydroxynaphthoesäure, Salizylsäure, Stearinsäure, Muconsäure und dergleichen gebildet werden; oder (2) Salze, die gebildet werden, wenn ein in der Ausgangsverbindung vorhandenes, saures Proton, entweder durch ein Metallion, z.B. ein Alkalimetallion, ein Erdalkaliion oder ein Aluminiumion ersetzt wird; oder mit einer organischen Base wie Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethamin, N-Methylglucamin und dergleichen koordiniert, ein.
„Prodrug" bedeutet jede Verbindung, welche in vivo einen wirksamen Ausgangsarzneistoff gemäß der Formel (I) freisetzt, wenn ein derartiges Prodrug an einen Säuger verabreicht wird. Prodrugs einer Verbindung der Formel (I) werden durch Modifizierung von in der Verbindung der Formel (I) vorhandenen funktionellen Gruppen auf eine derartige Weise hergestellt, dass die Modifizierungen in vivo gespalten werden können, um die Ausgangsverbindung freizusetzen. Prodrugs schließen Verbindungen der Formel (I) ein, wobei ein Hydroxy, Amino, Sulfhydrylrest in einer Verbindung der Formel (I) an einen Rest gebunden ist, der in vivo gespalten werden kann, um den freien Hydroxyl-, Amino- beziehungsweise Sulfhydrylrest wieder herzustellen.

Beispiele für Prodrugs schließen Ester (z.B. Acetat-, Formiat- und Benzoatderivate) und Carbamate (z.B. N,N-Dimethylaminocarbonyl) von funktionellen Hydroxyresten in Verbindungen der Formel (I) und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

„Schutzgruppe" bezeichnet eine Gruppierung von Atomen, die, wenn sie an eine reaktive Gruppe in einem Molekül gebunden sind, deren Reaktivität maskiert, verringert oder unterdrückt. Beispiele für Schutzgruppen können in T.W. Green und P.G. Futs, Protective Groups in Organic Chemistry (Wiley, 2. Ausg., 1991) und Harrison und Harrison et al. Compendium of Synthetic Organic Methods, Vol. 1-8 (John Wiley und Söhne, 1971-1996) gefunden werden.
Repräsentative Aminoschutzgruppen schließen- Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl (CBZ), tert-Butoxycarbonyl (Boc), Trimethylsilyl (TMS), 2-Trimethylsilylethansulfonyl (SES), Trityl und substituierte Tritylgruppen, Allyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC) und dergleichen ein. Repräsentative Hydroxyschutzgruppen schließen jene, wobei die Hydroxygruppe entweder acyliert oder alkyliert wird wie Benzyl und Tritylether wie auch Alkylether, Tetrahydropyranylether, Trialkylsilylether und Allylether ein.
„Behandeln" oder „Behandlung" einer Krankheit beinhaltet: (1) Vorbeugen der Krankheit, d.h. Bewirken, dass sich die klinischen Symptome der Krankheit in einem Säuger, welcher der Krankheit ausgesetzt oder dafür anfällig sein kann, aber der jetzt noch keine Krankheitssymptome verspürt oder zeigt, nicht entwickeln; (2) Inhibierung der Krankheit, d.h. Hemmung oder Verringerung der Entwicklung der Krankheit oder ihrer klinischen Symptome; oder (3) Linderung der Krankheit, d.h. Bewirken einer Regression der Krankheit oder ihrer klinischen Symptome.
„Eine therapeutisch wirksame Menge" bedeutet die Menge an Verbindung, die, wenn sie an einen Säuger zum Behandeln einer Krankheit verabreicht wird, ausreichend ist, um eine derartige Behandlung der Krankheit zu bewirken. Die „therapeutisch wirksame Menge" wird variieren, abhängig von der Verbindung, der Krankheit und ihrer Schwere und dem Alter, Gewicht u.s.w. des zu behandelnden Säugers.

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel:
bereit, wobei
der tiefgestellte Index n eine ganze Zahl von 1 oder 2 ist;
R¹ C₁-C₆-Alkyl oder C₃-C₆-Cycloalkyl ist;
R² Halogen ist;
R³ Hydroxy-C₁-C₆-alkyl, C₁-C₆-Alkoxy-C₁-C₆-alkyl, -(C₁-C₆-Alkylen)-C(O)R³¹, 2-(N-Piperidinyl)ethyl oder 2-(N-(2-Pyrrolidinonyl))ethyl ist; und
R³¹ Hydroxy, Ethoxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Methyl oder Ethyl ist;
oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze.
In bevorzugten Ausführungsformen, in denen R¹ Alkyl ist, ist R¹ ein verzweigter Alkylrest, in welchem das Kohlenstoffatom, das an das Stickstoffatom gebunden ist, ein tetrahedrales Kohlenstoffatom ist, vorzugsweise mit 0 oder 1 gebundenen Wasserstoffatom. Stärker bevorzugt wird R¹ 2-Propyl, Cyclohexyl oder 1-Methylcyclohexyl, am stärksten bevorzugt 2-Methyl-2-propyl sein.
R² kann an den Phenylring an jeder der restlichen fünf Valenzen gebunden sein, die sonst durch Wasserstoff besetzt sind. Der tiefgestellte Index n ist eine ganze Zahl von 0 bis 3, der anzeigt, dass der Phenylring durch null bis drei Reste R², vorzugsweise durch 1 oder 2 Reste R² substituiert ist. In jenen Ausführungsformen, in welchen zwei oder drei Reste R² vorhanden sind, kann jeder unabhängig von dem/den anderen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet
-(R²)_n 2-Halogen oder 2,6-Dihalogen, stärker bevorzugt 2-Chlor oder 2,6-Dichlor.
In einer bevorzugten Ausführungsform von R³ handelt es sich bei den Hydroxy-C₁-C₆-alkyl- und C₁-C₆-Alkoxy-C₁-C₆-alkylresten um 2-Methoxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxy-2-propyl, 2-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-3-propyl, 1,3-Dihydroxy-2-propyl, 1,3- Dimethoxy-2-propyl, 1-Methoxy-2-(methoxymethyl)-3-propyl, 3,4-Dihydroxy-1-cyclopentyl; stärker bevorzugt 2,3-Dihydroxy-1-propyl und 2-Methoxyethyl.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Verbindungen schließt die vorliegende Erfindung alle pharmazeutisch verträglichen Salze jener Verbindungen zusammen mit den Prodrug-Formen der Verbindungen und alle Isomere entweder in einer reinen chiralen Form oder einem racemischen Gemisch oder anderen Form eines Gemischs ein.
Insbesondere wird eine Verbindung der Formel (I) ausgewählt aus 3-(2-Chlorphenyl)-1-ethoxycarbonylmethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, in besonders bevorzugten R³-Ausführungsformen ist R³ Heteroalkyl, stärker bevorzugt Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl. Besonders Hydroxyalkyl und Alkoxyalkylreste sind 2-Methoxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxy-2-propyl, 2-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-3-propyl, 1,3-Dihydroxy-2-propyl, 1,3-Dimethoxy-2-propyl, 1-Methoxy-2-(methoxymethyl)-3-propyl, 3,4-Dihydroxy-1-cyclopentyl, spezieller 2,3-Dihydroxy-1-propyl und 2-Methoxyethyl.
In einer anderen Gruppe von besonders bevorzugten R³-Ausführungsformen ist R³ Heterocyclylalkyl. Besondere Heterocyclylalkylreste schließen 2-(N-Piperidinyl)ethyl oder 2-(N-(2-Pyrrolidinonyl))ethyl ein.
In noch einer anderen Gruppe von besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R³-(Alkylen)-C(O)R³¹; wobei R³¹ Hydroxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Methyl und Ethyl ist. Stärker bevorzugt ist der Alkylenteil Methylen, Ethylen oder Propylen.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Verbindungen schließt die vorliegende Erfindung alle pharmazeutisch verträglichen Salze jener Verbindungen zusammen mit einer reinen chiralen Form oder einem racemischen Gemisch oder anderen Form eines Gemischs ein.
Noch weiter werden Kombinationen der bevorzugten Gruppen, die vorstehend für die Verbindungen der Formel (I) beschrieben werden, andere bevorzugte Ausführungsformen bilden. In einer Gruppe von besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R¹ Alkyl oder Cycloalkyl, R² ist Halogen, R³ ist Heteroalkyl oder -(Alkylen)-C(O)R³¹; und n ist 1 oder 2. In anderen Gruppen ist R¹ Alkyl oder Cycloalkyl, R² ist Halogen, R³ ist Heteroalkyl und n ist 1 oder 2; oder R¹ ist Alkyl oder Cycloalkyl, R² ist Halogen, R³ ist Heterocyclyl und n ist 1 oder 2; oder R¹ ist Alkyl oder Cycloalkyl, R² ist Halogen, R³ ist heterosubstituiertes Cycloalkyl und n ist 1 oder 2 oder R¹ ist Isopropyl, R² ist Halogen und n ist 1 oder 2.
Insbesondere wird eine Verbindung der Formel (I) ausgewählt aus
3-(2-Chlorphenyl)-1-ethoxycarbonylmethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-1-carboxymethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-methoxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-7-isopropylamino-1-(2-methylsulfonylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-hydroxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2S)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on,
3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2R)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on und
7-Isopropylamino-3-(2-chlorphenyl)-1-(2-piperidinylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on;
und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Verbindungen der Formel (I) bereit. Kurz gesagt umfassen die Verfahren entweder: (a) Behandeln einer Verbindung der Formel II
wobei n, R² und R³ die in Bezug auf die vorstehende Formel I angegebenen Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt,
und L eine Abgangsgruppe ist,
mit einem Amin der Formel III R¹-NH₂ (III)wobei R¹ die in Bezug auf die vorstehende Formel I angegebene Bedeutung hat, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt, und wo erforderlich, Entfernen der Schutzgruppe von allen geschützten reaktiven Gruppen
oder (b) Behandeln einer Verbindung der Formel IV
wobei R¹, n und R² die für Formel I angegebenen Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt,
mit einem Alkylierungsmittel der Formel V R³-X (V) wobei R³ die in Bezug auf die Formel I angegebene Bedeutung hat, und X eine Abgangsgruppe oder eine Hydroxygruppe ist, die während der Umsetzung aktiviert wird, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt, und wo erforderlich, Entfernen der Schutzgruppe von allen geschützten reaktiven Gruppen und gegebenenfalls Umwandeln einer Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch verträgliches Salz.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielfalt von Verfahren, unter Verwendung von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. In einer Ausführungsform werden zum Beispiel die Verbindungen unter Verwendung von Verfahren, die jenen in Schema 1 skizzierten ähnlich sind, hergestellt.
Schema 1
Behandeln einer Verbindung der Formel Ia mit einem primären Amin (R³-NH₂) liefert eine Verbindung der Formel Ib. Diese Umsetzung wird in geeigneter Weise in einem Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether (wie Tetrahydrofuran), einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, hauptsächlich Dichlormethan, einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff, einem Formamid oder einem niederen Alkanol durchgeführt. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise bei etwa –20 °C bis etwa 120 °C durchgeführt.
Reduktion einer Verbindung der Formel Ib liefert einen Alkohol der Formel Ic. Diese Reduktion wird typischerweise unter Verwendung von Lithiumaluminiumhydrid auf eine Art und Weise, die den Fachleuten bekannt ist (z.B. in einem Lösungsmittel, welches unter den Reduktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether, hauptsächlich Tetrahydrofuran, bei etwa –20 °C bis etwa 70 °C, vorzugsweise bei etwa 0 °C bis etwa Raumtemperatur) durchgeführt.
Oxidation eines Alkohols der Formel Ic in der nächsten Stufe liefert einen Carboxaldehyd der Formel Id. Die Oxidation wird typischerweise mit Mangandioxid durchgeführt, obwohl auch zahlreiche andere Verfahren verwendet werden können (siehe zum Beispiel ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 4. Aufl., März, John Wiley & Sons, New York (1992)). Abhängig vom verwendeten Oxidationsmittel wird die Umsetzung in geeigneter Weise in einem Lösungsmittel, welches unter den speziellen Oxidationsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, hauptsächlich Dichlormethan oder einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff durchgeführt. In geeigneter Weise wird die Oxidation bei etwa 0 °C bis etwa 60 °C durchgeführt.
Umsetzung eines Carboxaldehyds der Formel Id mit einem substituierten Anilin liefert eine Verbindung der Formel Ie. Diese Umsetzung kann in der Gegenwart einer Säure, z.B. einer aromatischen Sulfonsäure, vorzugsweise 4-Toluolsulfonsäure, unter azeotroper Entfernung des während der Umsetzung gebildeten Wassers durchgeführt werden. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise in einem Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem aromatischen Kohlenwasserstoff, hauptsächlich Toluol oder einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff und bei einer Temperatur von etwa 70 °C bis etwa 150 °C, hauptsächlich bei der Rückflusstemperatur des Lösungsmittels durchgeführt, um bei der erwähnten azeotropen Entfernung des Wassers mitzuhelfen.
Reduktion einer Verbindung der Formel Ie, um eine Verbindung der Formel If zu ergeben, kann unter Verwendung von zum Beispiel Natriumborhydrid, Lithiumaluminiumhydrid oder Natriumtriacetoxyborhydrid unter Bedingungen, die den Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Verbindung der Formel Ie nicht gereinigt, sondern vielmehr wird das Reaktionsgemisch, in welchem sie hergestellt wird, aufkonzentriert, und das erhaltene Konzentrat wird in einem Lösungsmittel aufgenommen, welches unter den Reduktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether, hauptsächlich Tetrahydrofuran oder einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder einem niederen Alkanol und dann mit einem vorstehend erwähnten Reduktionsmittel behandelt. Die Reduktion wird in geeigneter Weise bei etwa 0° C bis etwa 100 °C, vorzugsweise bei etwa 0-25 °C durchgeführt.
Cyclisierung einer Verbindung der Formel If liefert einen bicyclischen Stickstoffheterocyclus der Formel Ig. Die Cyclisierung kann durch Umsetzen von If mit Phosgen oder Trichlormethylchlorformiat (oder einem Phosgenäquivalent), in geeigneter Weise in der Gegenwart einer tertiären organischen Base, vorzugsweise einem Tri(niederalkyl)amin, hauptsächlich Triethylamin erfolgen. Insbesondere wird die Cyclisierung in einem Lösungsmittel durchgeführt, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether, hauptsächlich Tetrahydrofuran, einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise bei etwa –20 °C bis etwa 50 °C, vorzugsweise bei etwa 0 °C bis etwa Raumtemperatur durchgeführt.
Oxidation von Ig mit 3-Chlorperbenzoesäure liefert ein Sulfon (Ih), welches in eine Vielfalt von Zielverbindungen umgewandelt werden kann. Typischerweise wird die Oxidation von Ig in einem Lösungsmittel, welches unter den Oxidationsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, hauptsächlich Chloroform oder Dichlormethan und bei etwa –20 °C bis etwa 50 °C, vorzugsweise etwa 0 °C bis etwa Raumtemperatur durchgeführt.
Schließlich liefert die Behandlung von Ih mit einem Amin (R¹-NH₂) die Zielverbindungen der Formel I. Die Umsetzung kann in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise bei Temperaturen von etwa 0 °C bis etwa 200 °C, stärker bevorzugt etwa Raumtemperatur bis etwa 150 °C durchgeführt.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I durch Behandeln einer Verbindung der allgemeinen Formel Ii mit einem Amin (R¹-NH₂) bereit.
In Verbindung Ii haben die Symbole R², R³ und der tiefgestellte Index n die in Bezug auf die vorstehende Formel I angegebenen Bedeutungen. Der Buchstabe L stellt eine Abgangsgruppe dar, welche ein Halogen, ein niederer Alkansulfonylrest (z.B. Methansulfonyl oder Trifluormethansulfonyl) oder ein aromatischer Sulfonylrest (z.B. Benzolsulfonyl oder 4-Toluolsulfonyl) sein kann. Andere geeignete Abgangsgruppen sind den Fachleuten bekannt und können zum Beispiel in ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 4. Aufl., März, John Wiley & Sons, New York (1992) gefunden werden. Geeignete Amine (R¹-NH₂) sind jene, in welchen R¹ jeden der Reste R¹ darstellt, die für die Formel I erwähnt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der bicyclische Stickstoffheterocyclus hergestellt werden, und R³ kann bei einer späteren Synthesestufe eingeführt werden, wie in Schema 2 gezeigt.
Schema 2
Verbindung IIa, das Ausgangsmaterial in Schema 2, kann aus im Handel erhältlichem Ethyl-4-amino-2-mercaptopyrimidin-5-carboxylat hergestellt werden. Kurz gesagt liefert die Behandlung der Mercaptoverbindung mit einem geeigneten Alkylierungsmittel (RX) eine Verbindung der Formel Ib (R³ = H). Umwandlung von Ib (R³ = H) in IIa kann den in Schema I angegebenen Stufen folgen.
Eine Cyclisierung von IIa liefert einen bicyclischen Stickstoffheterocyclus der Formel IIb. Die Cyclisierung kann durch Umsetzen von IIa mit Phosgen oder Trichlormethylchlorformiat (oder einem Phosgenäquivalent), typischerweise in der Gegenwart einer tertiären organischen Base, vorzugsweise einem Tri(niederalkyl)amin, hauptsächlich Triethylamin erfolgen. Insbesondere wird die Cyclisierung in einem Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether, hauptsächlich Tetrahydrofuran, einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff durchgeführt. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise bei etwa –20 °C bis etwa 50 °C, vorzugsweise bei etwa 0 °C bis etwa Raumtemperatur durchgeführt.
Einführung eines Rests R³, um eine Verbindung der Formel IIc zu liefern; kann unter einer Vielfalt von Bedingungen ausgeführt werden. Zum Beispiel kann IIb mit einem Alkalimetallhydrid, hauptsächlich Natriumhydrid behandelt werden und nachfolgender Umsetzung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel R³-L, wobei R³ jede der vorstehenden Bedeutungen gemäß R³ hat, außer Wasserstoff, Aryl oder Heteroaryl, und L eine Abgangsgruppe (z.B. Halogen, Methansulfonat, Toluolsulfonat, Trifluormethansulfonat und dergleichen) darstellt. Die N-Substitution wird in geeigneter Weise in einem Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem Formamid, hauptsächlich N-Methylpyrrolidinon oder Dimethylformamid, einem offenkettigen oder cyclischen Ether oder einem gegebenenfalls halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoff durchgeführt. Die Umsetzung wird in geeigneter Weise bei etwa 50 °C bis etwa 200 °C, vorzugsweise bei etwa 50 °C bis etwa 150 °C durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform kann die Alkylierung mit einer anorganischen Base wie Kaliumcarbonat in einem Formamid-Lösungsmittel wie N-Methylpyrrolidinon und Temperaturen von etwa 0 °C bis etwa 25 °C durchgeführt werden.
Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren zur Einführung von R³ schließt eine Alkylierung des Pyrimidinonstickstoffs unter Mitsonobu-Bedingungen ein. In diesem Verfahren wird ein Alkohol der allgemeinen Formel R³-OH mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IIb in der Gegenwart zum Beispiel von Triphenylphosphin und Diethylazodicarboxylat oder Diphenylpyridylphosphin und t-Butylazodicarboxylat vereinigt (siehe Tetrahedron Lett., 40: 4497-4500 (1999). Die Alkylierung wird in geeigneter Weise in einem Lösungsmittel, welches unter den Reaktionsbedingungen inert ist, vorzugsweise einem offenkettigen oder cyclischen Ether, bei Temperaturen von etwa –20 °C bis etwa 100 °C, vorzugsweise bei etwa 0 °C bis etwa 30° C (oder Raumtemperatur) durchgeführt. Wie bei anderen Alkylierungsverfahren sind primäre und sekundäre Alkohole am besten für eine Umsetzung unter diesen Bedingungen geeignet.
Im Anschluss an die Einführung von R³ können wie vorstehend skizziert die Oxidations- und Verdrängungsschritte (um R¹-NH- einzuführen) ausgeführt werden, um die Zielverbindungen der Formel I zu liefern.
Auf alternativen Wegen kann IIb zuerst durch Alkylieren unter Mitsonobu-Bedingungen, um R³ einzuführen, in IId umgewandelt werden, gefolgt von einer Oxidation des Sulfids in das entsprechende Sulfon IId.
In noch anderen Ausführungsformen können die Verbindungen durch Umkehrung der Reihenfolge der Alkylierung- und Verdrängungsschritte, dadurch der in Schema 3 gezeigten Umkehrung der Reihenfolge der – R³ und -NH-R¹ Einführung, hergestellt werden.
Schema 3
Demgemäß kann eine Verbindung der Formel IIa zu IIb (wie anfänglich in Schema 2 gezeigt) cyclisiert werden. Oxidation von IIb zu IIIa liefert die Vorstufe für die späteren Verdrängungs- und Alkylierungsschritte. So liefert eine Behandlung von IIIa mit R¹-NH₂ unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen IIIb, welches unter Verwendung von R³-L (wobei L die vorstehend bekannte Bedeutung hat) oder R³-OH unter Mitsunobu-Bedingungen alkyliert werden kann, um die Zielverbindungen der Formel I zu liefern.
Einem Fachmann sollte es selbstverständlich sein, dass gewisse Änderungen an den vorstehenden Schemen beabsichtigt und innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind. Zum Beispiel werden gewisse Schritte das Schützen und Entfernung von Schutzgruppen von den reaktiven funktionellen Resten, die mit den speziellen Reaktionsbedingungen nicht kompatibel sind, zur Folge haben.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten und eine Verbindung der Formel I wie vorstehend beschrieben.
Die Verbindungen der Formel I und die pharmazeutisch verträglichen Salze von basischen Verbindungen der Formel I mit Säuren können als Medikamente, z.B. in Form von pharmazeutischen Präparaten verwendet werden. Die pharmazeutischen Präparate können enteral, z.B. oral in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Dragees, haben und weichen Gelatinekapseln, Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, nasal, z.B. in Form von Nasensprays oder rektal, z.B. in Form von Suppositorien verabreicht werden. Jedoch können sie auch parenteral, z.B. in Form von Injektionslösungen verabreicht werden.
Die Verbindungen der Formel I und deren vorstehend erwähnte pharmazeutisch verträgliche Salze können mit pharmazeutisch inerten, organischen oder anorganischen Trägern für die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten verarbeitet werden. Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talk, Stearinsäure oder ihre Salze und dergleichen können zum Beispiel als derartige Träger für Tabletten, überzogene Tabletten, Dragees und harte Gelatinekapseln verwendet werden. Geeignete Träger für weiche Gelatinekapseln sind zum Beispiel pflanzliche Öle, Wachse, Fette, halbfeste und flüssige Polyole und dergleichen; abhängig von der Natur des Wirkstoffs werden jedoch gewöhnlich im Falle von weichen Gelatinekapseln keine Träger benötigt. Geeignete Träger zur Herstellung von Lösungen und Sirupen sind zum Beispiel Wasser, Polyole, Saccharose, Invertzucker, Glucose und dergleichen. Geeignete Träger für Suppositorien sind zum Beispiel natürliche oder gehärtete Öle, Wachse, Fette, dickflüssige oder flüssige Polyole und dergleichen.
Die pharmazeutischen Präparate können auch Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Stabilisatoren, Netzmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, farbgebende Stoffe, Geschmackstoffe, Salze zur Variierung des osmotischen Drucks, Puffer, Maskierungsmittel oder Antioxidanzien enthalten. Sie können auch therapeutisch wertvolle Stoffe, andere als die Verbindungen der Formel I und deren vorstehend erwähnte pharmazeutisch verträgliche Salze enthalten.
Medikamente, welche eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer basischen Verbindung der Formel I mit einer Säure in Verbindung mit einem kompatiblen pharmazeutischen Trägermaterial enthalten, sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Medikamenten bereit, die zur Behandlung von p38 vermittelten Krankheiten oder Zuständen nützlich sind. Das Verfahren umfasst das Bringen einer oder mehrerer dieser Verbindungen oder Salze und, falls gewünscht, eines oder mehrerer anderer therapeutisch wertvoller Stoffe in eine galenische Verabreichungsform zusammen mit einem kompatiblen pharmazeutischen Träger.
Wie früher erwähnt, können die Verbindungen der Formel I und deren vorstehend erwähnte pharmazeutisch verträgliche Salze entsprechend der Erfindung als therapeutische Wirkstoffe, hauptsächlich als entzündungshemmende Mittel oder zur Prävention von Transplantatabstoßung im Anschluss an eine Transplantationsoperation verwendet werden. Die Dosierung kann innerhalb großer Bereiche variieren und wird natürlich an die individuellen Erfordernisse in jedem speziellen Fall angepasst werden. Im Allgemeinen sollte im Falle einer Verabreichung an Erwachsene eine passende Tagesdosierung etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,5 mg/kg bis etwa 5 mg/kg betragen. Die Tagesdosierung kann als eine Einzeldosis oder in Teildosen verabreicht werden, und außerdem kann die obere Dosierungsgrenze, auf die früher hingewiesen wurde, überschritten werden, werdn festgestellt wird, dass dies erforderlich ist.
Schließlich ist auch die Verwendung der Verbindungen der Formel I und deren vorstehend erwähnten pharmazeutisch verträglichen Salze zur Herstellung von Medikamenten, hauptsächlich bei der Behandlung oder Prophylaxe von entzündlichen, immunologischen, onkologischen, bronchopulmonalen, dermatologischen und kardiovaskulären Störungen, bei der Behandlung von Asthma, Störungen des Zentralnervensystems oder diabetischen Komplikationen oder zur Prävention einer Transplantatabstoßung im Anschluss an eine Transplantationsoperation ein Gegenstand der Erfindung.
Die Verbindungen der Formel I würden zur Behandlung jeder Störung oder Krankheitsstadiums in einem Menschen oder einem anderen Säuger, welches durch übermäßige oder nicht regulierte TNF und/oder IL-1 oder p38-Kinaseproduktion durch einen derartigen Säuger verschlimmert oder verursacht wird, nützlich, aber nicht darauf beschränkt sein. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Zytokin vermittelten Krankheit bereit, welches die Verabreichung einer wirksamen Zytokin beeinträchtigenden Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Tautomers davon umfasst.
Verbindungen der Formel I würden zur Behandlung einer Entzündung in einer Versuchsperson und zur Verwendung als Antipyretika zur Behandlung von Fieber nützlich, aber nicht darauf beschränkt sein. Erfindungsmäßige Verbindungen würden nützlich sein, Arthritis, einschließlich aber nicht beschränkt auf rheumatoide Arthritis, Spondylarthropathien, Gichtarthritis, Osteoarthrose, systemischen Lupus erythematodes und juvenile Arthritis, Osteoarthrose, Gichtarthritis und andere arthritische Zustände zu behandeln. Derartige Verbindungen würden zur Behandlung von pulmonalen Störungen oder Lungenentzündung, einschließlich akutem Lungenversagen (ARDS), Lungensarkoidose, Asthma, Silikose und chronisch entzündlicher Erkrankung der Lunge nützlich sein. Die Verbindungen sind auch zur Behandlung von viralen und bakteriellen Infektionen, einschließlich Sepsis, septischem Schock, Gram-negativer Sepsis, Malaria, Meningitis, Kachexie neben einer Infektion oder Malignom, Kachexie neben einem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS), AIDS, ARC (AIDS verwandter Komplex), Pneumonie und Herpesvirus nützlich. Die Verbindungen sind auch zur Behandlung von Knochenresorptionserkrankungen wie Osteoporose, Endotoxinschock, toxischem Schocksyndrom, Reperfusionsschaden, Autoimmunerkrankung, einschließlich Transplantat-Wirt-Reaktion und Homotransplantationsabstoßungen, kardiovaskulären Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose, Thrombose, Stauungsherzinsuffizienz und kardialem Reperfusionsschaden, renalem Reperfusionsschaden, Lebererkrankung und Nephritis und Myalgien aufgrund einer Infektion nützlich.
Die Verbindungen sind auch zur Behandlung von Influenza, multipler Sklerose, Krebs, Diabetes, systemischem Lupus erythematodes (SLE), Hautkrankheiten wie Psoriasis, Ekzem, Verbrennungen, Dermatitis, Keloidbildung und Narbengewebebildung nützlich.
Erfindungsmäßige Verbindungen würden auch nützlich sein, gastrointestinale Zustände wie entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn, Gastritis, Reizdarm und Colitis ulcerosa zu behandeln. Die Verbindungen würden auch bei der Behandlung von Augenerkrankungen wie Retinitis, Retinopathien, Uveitis, okularer Photophobie und einer akuten Verletzung des Augengewebes nützlich sein. Erfindungsmäßige Verbindungen würden auch zur Behandlung von Angiogenese, einschließlich Neoplasie; Metastase; ophthalmologischen Zustände wie Hornhauttransplantatabstoßung, Augenrevaskularisierung, Netzhautrevaskularisierung, einschließlich Revaskularisierung in Folge einer Verletzung oder Infektion, diabetischer Retinose, retrolentaler Fibroplasie und neovaskulärem Glaukom; ulzerösen Erkrankungen wie Magengeschwür; pathologisch, aber nicht malignen Zuständen wie Hämangiome, einschließlich infantiler Hämangiome, Angiofibrom des Nasenrachenraums und aseptischer Knochennekrose; diabetischer Nephropathie und Myokardiopathie; und Störungen des weiblichen Fortpflanzungssystems wie Endometriose nützlich sein. Die erfindungsmäßigen Verbindungen können auch zur Unterbindung der Produktion von Cyclooxygenase-2 nützlich sein, und es wird auch angenommen, dass die Verbindungen dieser Erfindung bei der Prävention und Behandlung von Krebs, insbesondere Dickdarmkrebs nützlich sind. Es wird auch angenommen, dass die Verbindungen dieser Erfindung bei der Prävention und Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich sind.
Abgesehen davon, dass sie bei der menschlichen Behandlung nützlich sind, sind diese Verbindungen auch zur tierärztlichen Behandlung von Haustieren, exotischen Tieren und Nutztieren, einschließlich Säugetieren, Nagetieren und dergleichen nützlich. Stärker bevorzugte Tiere schließen Pferde; Hunde und Katzen ein.
Die vorliegenden Verbindungen können auch in Co-Therapien teilweise oder vollständig an Stelle von anderen herkömmlichen entzündungshemmenden Mitteln wie zusammen mit Steroiden, Cyclooxygenase-2 Inhibitoren, NSAIDs, DMARDS, immunosuppressiven Mitteln, 5-Lipoxygenase-Inhibitoren, LTB₄-Antagonisten und LTA₄-Hydrolase Inhibitoren verwendet werden.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „TNF-vermittelte Störung" jede und alle Störungen und Krankheitsstadien, in welchen TNF eine Rolle spielt, entweder durch Kontrolle von TNF selbst oder durch TNF, das die Freisetzung anderer Monokine wie, aber nicht beschränkt auf IL-1, IL-6 oder IL-8 bewirkt. Ein Krankheitsstadium, in welchem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist und dessen Produktion oder Wirkung als Reaktion auf TNF erschwert oder sezerniert wird, würde deshalb als TNF-vermittelte Störung betrachtet werden.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „p38-vermittelte Störung" jede und alle Störungen und Krankheitsstadien, in welchen p38 eine Rolle spielt, entweder durch Kontrolle von p38 selbst oder durch p38, das die Freisetzung eines anderen Faktors wie, aber nicht beschränkt auf IL-1, IL-6 oder IL-8 bewirkt. Ein Krankheitsstadium, in welchem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist und dessen Produktion oder Wirkung als Reaktion auf p38 erschwert oder sezerniert wird, würde deshalb als p38-vermittelte Störung betrachtet werden.
Weil TNF-β eine nahe strukturelle Homologie mit TNF-α (auch als Cachectin bekannt) aufweist, und weil jedes ähnliche biologische Reaktionen verursacht und an denselben zellulären Rezeptor bindet, wird die Synthese sowohl von TNF-α als auch TNF-β durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung inhibiert und werden hier, wenn nicht speziell anders beschrieben, so zusammen als „TNF" bezeichnet.
BEISPIELE
Wenn nicht anders angegeben, werden in den nachstehenden Beispielen die Temperaturen in Grad Celsius (°C) angegeben; Arbeiten wurden bei Raum- oder Umgebungstemperatur (typischerweise einem Bereich von etwa 18-25 °C durchgeführt; Verdampfen des Lösungsmittels wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter verringertem Druck (typischerweise, 4,5-30 mmHg) mit einer Badtemperatur bis zu 60 °C durchgeführt; den Rektionsverläufen wurde typischerweise mittels DC gefolgt, und die Reaktionszeiten werden nur zur Erläuterung angegeben; Schmelzpunkte sind nicht korrigiert; Produkte zeigen zufrieden stellende ¹H-NMR und/oder mikroanalytische Daten; Ausbeuten werden nur zur Erläuterung angegeben; und die nachstehenden herkömmlichen Abkürzungen werden auch verwendet: Schmp. (Schmelzpunkt), L (Liter), mL (Milliliter), mmol (Millimol), g (Gramm), mg (Milligramm), min (Minuten) und h (Stunden))
DEAD steht für Diethylazodicarboxylat
DIAD steht für Diisopropylazodicarboxylat
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von 3-(2-Chlorphenyl)-1-ethoxycarbonylmethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on und 3-(2-Chlorphenyl)-1-carboxymethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on beginnend mit 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on.
1.1 Alkylierung des Pyrimidinons
Sulfid 1a, 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, (1,5 g, 3,92 mmol, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben) wurde in Dimethylformamid (15 mL) gelöst, und Natriumhydrid (60%, 0,172 g, 4,31 mmol) wurde zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde für zwanzig Minuten gerührt, dann wurde Ethylbromacetat (0,87 mL, 7,84 mmol) zugegeben. Nach 3 Std. wurde die Umsetzung mit Wasser gequenscht und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden fünfmal mit Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 30:70 Aceton/Hexan gereinigt, um 1,283 g des Esters 1b zu ergeben.
1.2 Oxidation des Benzylsulfids
Ester 1b (0,600 g, 1,28 mmol) wurde in Chloroform (15 mL) gelöst, und 3-Chlorperoxybenzoesäure (50%, 0,883 g, 2,56 mmol) wurde bei Raumtemperatur zugegeben. Das Gemisch wurde für 2 Std. gerührt, dann dreimal mit 10% (w/w) wässrigem Natriumsulfit, einmal mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und einmal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um 0,670 g Benzylsulfon 1c zu liefern.
1.3 Verdrängung des Sulfons
Benzylsulfon 1c (0,520 g, 1,04 mmol) und Isopropylamin (0,18 mL, 2,08 mmol) wurden vereinigt und für eine Stunde auf 90-100 °C erhitzt. Das Rekationsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Gemisch wurde mittels Säulenchromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 18:1 CH₂Cl₂/MeOH gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden vereinigt und aufkonzentriert, um 0,366 g 1d, 3-(2-Chlorphenyl)-1-ethoxycarbonylmethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on zu liefern (MS: MH⁺ = 404, Schmp. 188,8-191,4 °C).
1.4 Verseifung des Ethylesters
Zu einer Lösung von 1d (0,266 g, 0,66 mmol) in MeOH (10 mL) wurde Natriumhydroxid (0,026 g, 0,66 mmol) und Wasser (3 mL) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 Std. gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert und mit Ethylacetat verrieben, dann wieder in MeOH gelöst und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit Ether verrieben, filtriert und getrocknet, um 0,225 g 1e, 3-(2-Chlorphenyl)-1-carboxymethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on zu ergeben (MS: MH⁺ = 376, Schmp. 172,0-188,0 °C).
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von 3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-methoxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, in welchem eine Alkylierung unter Mitsunobu-Bedingungen durchgeführt wird.
Zu einer Lösung von Pyrimidinon 2a (0,500 g, 1,57 mmol, hergestellt durch Behandlung von 7-Benzylsulfonyl-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on mit Isopropylamin unter Bedingungen wie vorstehend in 1.3) in THF (20 mL) wurde Triphenylphosphin (0,413 g, 1,57 mol) und 2-Methoxyethanol (0,12 mL, 1,57 mmol) gegeben.
Das Gemisch wurde auf 0 °C abgekühlt, und DIAD (0,31 mL, 1,57 mmol) wurde zugegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und ließ für 12 Std. rühren. Zusätzliche Portionen 2-Methoxyethanol (0,12 mL, 1,57 mmol), Triphenylphosphin (0,413 g, 1,57 mmol) und DIAD (0,31 mL, 1,57 mmol) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde für weitere 12 Std. bei Raumtemperatur gerührt, dann auf 55-60 °C erhitzt. Nach 2 Std. wurde das Gemisch im Vakuum aufkonzentriert, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 1:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt. Die Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden vereinigt und zu einem Öl aufkonzentriert, welches wieder in Ethylacetat gelöst wurde. Salzsäure (1,0M/Et₂O, 0,6 mL) wurde zugegeben, um das Salz zu liefern. Das Gemisch wurde für 12 Stunden gerührt, dann im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über Trockeneis mit Ether verrieben, und man ließ ihn langsam auf Raumtemperatur erwärmen, während das Gemisch für 12 Std. gerührt wurde. Der Feststoff wurde filtriert, um 0,139 g des Hydrochloridsalzes der Titelverbindung 2b zu ergeben (MS: MH⁺= 376, Schmp. 126,0-131,6 °C).
Beispiel 3
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von 3-(2-Chlorphenyl)-7-isopropylamino-1-(2-methylsulfonylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on.
3.1 „Mitsunobu" Alkylierung des Pyrimidinons
Benzylsulfid 1a (500 mg, 1,31 mmol) wurde in 2 mL THF mit 2-(Methylthio)ethanol (114 μL, 1,31 mmol), Triphenylphosphin (343 mg, 1,31 mmol) und DEAD (0,21 mL, 1,31 mmol) aufgenommen. Das Gemisch wurde für 4 Tage bei RT gerührt, im Vakuum eingedampft und mittels Chromatographie über Kieselgel mit 5-20% Aceton/Hexanen als Elutionsmittel gereinigt, um 3a (529 mg, 1,16 mmol, 88%) zu liefern.
3.2 Oxidation des Benzylsulfids
Oxidation von 3a wurde unter Verwendung von m-CPBA (1,19 g, 5,8 mmol) in CH₂Cl₂ unter Rühren für 5 Std. bei RT ausgeführt. Die Umsetzung wurde mit 10% Na₂SO₃ (aq., 50 mL) gequenscht und dreimal mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit gesätt. NaHCO₃ gewaschen und im Vakuum aufkonzentriert, um 3b zu liefern, welches ohne Reinigung verwendet wurde.
3.3 Verdrängung des Sulfons
Das Rohprodukt 3b wurde in Isopropylamin (5 mL, 58 mmol) aufgenommen und für 2 Tage unverdünnt bei RT gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert und mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 10-50% Aceton/Hexanen als Elutionsmittel gereinigt, um 3c (287 mg, 0,732 mmol, 63% von 3a, 56% von 1a) zu liefern. Das gereinigte Produkt wurde in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 Äquivalent HCl/Et₂O behandelt, um das HCl-Salz von 3c auszufällen (MS: MH⁺ = 424).
Beispiel 4
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von 3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-hydroxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on.
4.1 „Mitsunobu" Alkylierung des Pyrimidinons
Benzylsulfid 1a (500 mg, 1,31 mmol) wurde in 7 mL DMF aufgenommen und mit Triisopropylsilyl geschütztem Iodethanol (555 mg, 1,57 mmol, hergestellt gemäß den in J. Am. Chem. Soc., 112(10), 4078-9 (1990) und J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1(6), 1417-23 (1998) beschriebenen Verfahren) behandelt und auf 0 °C abgekühlt. Natriumhydrid (60% in Öl, 63 mg, 1,57 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde von 0 °C auf 30 °C erwärmt, dann über Nacht bei 30 °C gerührt. Zusätzliche 63 mg 60% Natriumhydrid wurden zugegeben. Nach weiteren 6 Std. wurde die Umsetzung durch Zugabe von 10 mL Wasser gequenscht. Das so erhaltene Gemisch wurde mit EtOAc und CH₂Cl₂ extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet, im Vakuum aufkonzentriert und mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 10-20% Aceton/Hexanen als Elutionsmittel gereinigt, um 4a (430 mg, 0,738 mmol, 56%) zu liefern.
4.2 Oxidation des Benzylsulfids
Die Oxidation von 4a wurde mit m-CPBA (500 mg, 2,46 mmol) in CH₂Cl₂ ausgeführt. Nach Quenschen der Umsetzung mit Na₂SO₃ (aq.) wurde das Rohprodukt 4b mit CH₂Cl₂ extrahiert, mit gesätt. NaHCO₃ gewaschen, im Vakuum aufkonzentriert und ohne Reinigung verwendet.
4.3 Verdrängung des Sulfons
Das rohe Benzylsulfon 4b wurde in 3 mL CH₂Cl₂, das Isopropylamin (1 mL, 11,7 mmol) enthielt, aufgenommen, über Nacht bei 80 °C gerührt, im Vakuum aufkonzentriert und mittels Chromatographie über Kieselgel mit 5-20% Aceton/Hexanen als Elutionsmittel gereinigt, um 4c (281 mg, 0,542 mmol, 73% von 4a) zu liefern.
4.4 Entfernung der Schutzgruppe von der Hydroxygruppe
Entfernung der Schutzgruppe von 4c wurde mit Tetrabutylammoniumfluorid (0,54 mL 1M/THF, 0,542 mmol) in THF unter Rühren für 4 h bei RT ausgeführt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingedampft und unter Verwendung von Chromatographie über Kieselgel mit 10-40% Aceton/Hexanen als Elutionsmittel gereinigt, um 4d (179 mg, 0,495 mmol) zu liefern. Das gereinigte Produkt wurde in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 Äquivalent HCl/Et₂O behandelt, um das HCl-Salz von 4d auszufällen (MS: MH⁺ = 362). Beispiel 5 (Referenzbeispiel) 4-Amino-2-benzylthiopyrimidin-5-carboxaldehyd

a) 272 g (4,0 mol) Natriumethoxid (Lancaster) wurden in 1 L Ethanol eingerührt und mit 304 g (4,0 mol) Thioharnstoff (Avocado) behandelt. 676 g (4,0 mol) Ethylethoxymethylencyanoacetat (Avocado) wurden zugegeben und das Gemisch für 8 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen über Nacht auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch aufeinander folgend mit 2 L Wasser und 400 mL Essigsäure behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Suspension filtriert. Der Feststoff wurde mit drei 500 mL Portionen Wasser, zwei 500 mL Portionen Aceton und 500 mL Diethylether gewaschen. Das Produkt wurde getrocknet, um 473,3 g (60%) 4-Amino-5-carbethoxypyrimidin-2-thiol als cremefarbenen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von >250 °C zu ergeben.
b) Eine gerührte Suspension von 473 g (2,377 mol) 4-Amino-5-carbethoxypyrimidin-2-thiol in 3,5 L Ethanol wurde mit 180,4 g (1,307 mol) Kaliumcarbonat und 447,1 g (2,615 mol) Benzylbromid behandelt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt, dann ließ man es sich über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen. Die Suspension wurde filtriert und der Feststoff mit zwei 500 mL Portionen Ethanol, 2 L Wasser und zwei 500 mL Portionen Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum bei 50 °C über Phosphorpentoxid getrocknet, um 416 g (61%) Ethyl-4-amino-2-benzylthiopyrimidin-5-carboxylat als cremefarbenen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 117-118 °C zu ergeben.
c) Eine Lösung von 462,4 g (1,6 mol) Ethyl-4-amino-2-benzylthiopyrimidin-5-carboxylat in 2,3 L sieb-getrocknetem Tetrahydrofuran wurde unter einer Stickstoffatmosphäre langsam unter Rühren zu 1,6 L (1,6 mol) einer 1M Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran unter Eiskühlung gegeben. Die Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit zugegeben, um eine Temperatur von 18-20 °C beizubehalten. Nach Abschluss der Zugabe wurde das Gemisch auf 60 °C erhitzt und vorsichtig während 1,5 Stunden mit 60,8 mL Wasser behandelt. 60,8 mL 15% wässriges Natriumhydroxid wurden während 30 Minuten zugegeben, gefolgt von 182,5 mL Wasser während 30 Minuten. Die Suspension wurde über Nacht bei 60 °C gerührt, dann im noch heißen Zustand durch eine Hyflo-Filterhilfe filtriert und der Feststoff mit zwei 1 L Portionen Tetrahydrofuran gewaschen. Eindampfen des Filtrats zur Trockene ergab 392,5 g (99%) 4-Amino-2-benzylthiopyrimidin-5-methanol als fast weißen Feststoff, welcher in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
d) Eine Suspension von 392,5 g (1,59 mol) 4-Amino-2-benzylthiopyrimidin-5-methanol in 7,75 L Dichlormethan wurde unter einer Stickstoffatmosphäre mit 1,382 kg (15,9 mol) aktiviertem Mangandioxid (Acros) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, dann durch eine Hyflo-Filterhilfe filtriert. Der Feststoff wurde mit drei 1 L Portionen Dichlormethan gewaschen und die vereinigten Filtrate eingedampft, um 340,5 g (88%) 4-Amino-2-benzylthiopyrimidin-5-carboxaldehyd als blassgelben Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 136-139 °C zu ergeben.

Beispiel 6 (Referenzbeispiel) 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on 6.1 Herstellung von 5-(2-Chlorphenyl)aminomethyl-4-amino-2-benzylthiopyrimidin
Ein Gemisch aus 5 g (20,4 mmol) 4-Amino-2-benzylthiopyrimidin-5-carboxaldehyd, 2,25 mL (21,4 mmol) 2-Chloranilin und 0,1 g (0,5 mmol) 4-Toluolsulfonsäure Monohydrat in 60 mL Toluol wurde für 3 Stunden mit azeotroper Entfernung des Wassers unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf 0 °C abgekühlt, und der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und wurde mit Hexanen gewaschen und luftgetrocknet. Dieser Feststoff wurde dann in 100 mL THF gelöst und das Reaktionsgemisch auf 0 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (0,735 g, 18,8 mmol) wurde in kleinen Portionen über 45 Minuten zugegeben. Als die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch für weitere 15 Minuten gerührt und aufeinander folgend vorsichtig mit 0,8 mL H₂O, 0,8 mL 15% aq. NaOH und dann 2,4 mL H₂O behandelt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt, durch Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum aufkonzentriert. Der Feststoff wurde mit Diethylether gerührt, filtriert und luftgetrocknet, um 6,1 g 5-(2-Chlorphenyl)aminomethyl-4-amino-2-benzylthiopyrimidin als weißen Feststoff zu ergeben.
6.2 Herstellung von 3-(2-Chlorphenyl)-7-benzylthio-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on
Zu einer gerührten auf –10 °C abgekühlten Lösung von 4,3 g (12,1 mmol) 5-(2-Chlorphenyl)aminomethyl-4-amino-2-benzylthiopyrimidin in 100 mL Tetrahydrofuran wurden 3,1 mL (22,2 mmol) Triethylamin gegeben. Diese Lösung wurde dann tropfenweise mit einer Lösung von 6,15 mL Phosgen (20% Lösung in Toluol; 11,8 mmol) behandelt. Nach 30 minütigem Rühren wurde zusätzlich 1,0 mL Triethylamin (7,1 mmol) zugegeben, gefolgt von 2,0 mL Phosgen (20% Lösung in Toluol; 3,8 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt, mit 0,5 mL H₂O behandelt und für 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert, und die Stammlösung wurde aufkonzentriert und mit Dichlormethan gerührt. Das Produkt wurde dann durch Vakuumfiltration gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 3,83 g 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on als weißen Feststoff zu ergeben.
Beispiel 7 (Referenzbeispiel) 7-Benzylsulfonyl-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on
Eine Suspension von 1 g (2,61 mmol) 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on in 10 mL Dichlormethan wurde in Eis abgekühlt und mit 1,29 g (5,23 mmol) 70% 3-Chlorperbenzoesäure behandelt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann mit 25 mL 10% aq. Na₂S₂O₃ behandelt und für 30 Minuten rühren lassen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 mL Dichlormethan verdünnt, und die Phasen wurden getrennt. Die organische Phase wurde mit 10% aq. K₂CO₃, Kochsalzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Eine Konzentration des Filtrats unter verringertem Druck ergab 0,73 g 7-Benzylsulfonyl-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on als weißen Feststoff.
Beispiel 8
3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2S)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on
Stufe 1
Ein Gemisch aus 1,0 g (2,6 mmol) 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 1,5 g (5,2 mmol) L-α,β-Isopropylidenglycerol-γ-tosylat und 1,44 g (10,4 mmol) Kaliumcarbonat wurde in DMF (20 ml) gerührt und unter einer Stickstoffatmosphäre auf 80° erhitzt. Nach 16 h wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, in eine Kochsalzlösung geschüttet, mit Ethylacetat extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde unter Vakuum aufkonzentriert, mittels Flashchromatographie (Eluieren mit 40% EtOAc/Hexan) gereinigt, um 1,1 g Isopropylidenketaladdukt als Öl zu ergeben, (MS: MH⁺ = 496).
Stufe 2
Zu einer Lösung von 1,2 g (2,4 mmol) des vorstehend hergestellten Isopropylidenketaladdukts in Methylenchlorid (25 ml), die unter einer Stickstoffatmosphäre in einem Eis- Wasserbad abgekühlt wurde, wurden portionsweise 1,8 g (9,6 mmol) m-Chlorperbenzoesäure gegeben. Die so erhaltene Suspension wurde gerührt, und man ließ sie sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 16 h wurde das Reaktionsgemisch in einem Eis- Wasserbad abgekühlt, und eine 10% wässrige Lösung von Natriumbisulfit (50 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert, und die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (Gradientenelution: 60-100% Ethylacetat/Hexan) gereinigt. Das Sulfonprodukt (0,73 g) wurde als Schaum isoliert, (MS: MH⁺ = 529).
Stufe 3
Eine Lösung von 0,7 g (1,3 mmol) des vorstehend hergestellten Sulfons in 10 mL Isopropylamin wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 40 °C erhitzt. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, zur Trockene aufkonzentriert und mittels Flashchromatographie (Elution mit 60% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um 0,42 g Isopropylaminaddukt als Schaum zu ergeben.
Stufe 4
Zu einer Lösung von 0,4 g (0,93 mmol) des vorstehend hergestellten Isopropylaminaddukts in Methanol (15 ml) und Wasser (7 ml) wurden 0,05 g p-Toluolsulfonsäure gegeben, und das Gemisch wurde auf 50° erhitzt. Nach 16 h wurde das Methanol unter verringertem Druck entfernt, und die so erhaltene wässrige Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden mit einer 5% wässrigen Natriumbicarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet, aufkonzentriert und mittels Flashchromatographie (Gradientenelution: 40-100% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um 0,2 g des Produkts 3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2S)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on zu ergeben (MS: M⁺ = 391, Schmp. 130,8-134,7).
Beispiel 9
3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2R)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido-[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on
Stufe 1
Ein Gemisch aus 1,0 g (2,6 mmol) 7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 1,5 g (5,2 mmol) D-α,β-Isopropylidenglycerol-γ-tosylat und 1,44 g (10,4 mmol) Kaliumcarbonat wurde in DMF (25 ml) gerührt und unter einer Stickstoffatmosphäre auf 80° erhitzt. Nach 16 h wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, in eine Kochsalzlösung geschüttet, mit Ethylacetat extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde unter Vakuum aufkonzentriert, mittels Flashchromatographie (Eluieren mit 40% EtOAc/Hexan) gereinigt, um 1,2 g Isopropylidenketaladdukt als ein Öl zu ergeben.
Stufe 2
Zu einer Lösung von 1,2 g (2,4 mmol) des vorstehend hergestellten Isopropylidenketaladdukts in Methylenchlorid (30 ml), die unter einer Stickstoffatmosphäre in einem Eis-Wasserbad abgekühlt wurde, wurden portionsweise 1,1 g (5,6 mmol) m-Chlorperbenzoesäure gegeben. Die so erhaltene Suspension wurde gerührt, und man ließ sie sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 6 h wurde das Reaktionsgemisch in einem Eis-Wasserbad abgekühlt, und eine 10% wässrige Lösung von Natriumbisulfit (50 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt, und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert, und die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie (Gradientenelution: Ethylacetat – 10% Methanol/Ethylacetat) gereinigt. Das Sulfonprodukt (1,1 g) wurde als Schaum isoliert, (MS: MH⁺ = 529).
Stufe 3
Eine Lösung von 0,22 g (0,42 mmol) des vorstehend hergestellten Sulfons in 5 mL Isopropylamin wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 40° erhitzt. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, zur Trockene aufkonzentriert und mittels Flashchromatographie (Elution mit Ethylacetat) gereinigt, um 0,088 g des Produkts 3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2R)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on als Schaum zu ergeben, (MS: MH⁺ = 392).
Beispiel 10
7-Isopropylamino-3-(2-chlorphenyl)-1-(2-piperidinylethyl)-3,4-dihydropyrimido-[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on
7-Benzylthio-3-(2-chlorphenyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on (500 mg, 1,31 mmol) wurde in 2 mL THF mit 1-Piperidinethanol (0,173 mL, 1,31 mmol), Triphenylphosphin (343 mg, 1,31 mmol) und DEAD (0,21 mL, 1,31 mmol) aufgenommen und für 4 Tage bei RT gerührt, dann mittels Chromatographie über Kieselgel mit 2-5% Methanol/Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um 350 mg des N-(2-Piperidinylethyl)-Addukts zu liefern.
Die Oxidation des Sulfids wurde unter Verwendung von m-CPBA (0,201 g, 0,708 mmol) in Dichlormethan für 1 Std. unter Rühren bei RT ausgeführt. Die Umsetzung wurde mit 0,5 mL 25% wässrigem Natriumsulfit gequenscht und es wurde mit Dichlormethan extrahiert. Das Extrakt wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um das Sulfoxid zu liefern, welches ohne Reinigung verwendet wurde.
Das rohe Sulfoxid wurde in 5 mL Isopropylamin aufgenommen und über Nacht bei 40 °C, dann für 4 Tage bei 80 °C gerührt. Das Gemisch wurde mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 1-10% Methanol/Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Amin (48 mg, 0,112 mmol) zu liefern. Das gereinigte Produkt wurde in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 Äquivalent HCl/Et₂O behandelt, um das HCl-Salz von 7-Isopropylamino-3-(2-chlorphenyl)-1-(2-piperidinylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on auszufällen.
Beispiel 11
In vitro p38 MAP Kinase Inhibierungsassay
Dieses Beispiel erläutert ein in vitro p38 (MAP) Kinase Assay, das zur Bewertung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich ist.
Die p-38 MAP-Kinase Inhibitoraktivität der Verbindungen dieser Erfindung wurde in vitro durch Messung des γ-Phosphattransfers von γ-³³P-ATP zu Myelin Basic Protein (MBP) durch p-38 Kinase unter Verwendung einer geringfügigen Abwandlung des in Ahn et al., J. Biol. Chem. 266: 4220-4227 (1991) beschriebenen Verfahrens bestimmt.
Die phosphorylierte Form der rekombianten p38 MAP-Kinase wurde mit SEK-1 und MEKK in E. Coli (siehe Khokhlatchev et al., J. Biol. Chem. 272: 11057-11062 (1997)) exprimiert und dann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Nickel-Säule gereinigt.
Die phosphorylierte p38 MAP-Kinase wurde in Kinasepuffer (20 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH 7,2, 25 mM (3-Glycerinphosphat, 5 mM Ethylenglycerin-bis(beta aminoethylether)-N,N,N'N'-tetraessigsäure, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM Dithiothreitol, 40 mM Magnesiumchlorid) verdünnt. Die in DMSO gelöste Testverbindung oder nur DMSO (Kontrolle) wurde zugegeben, und die Proben wurden für 10 min. bei 30 °C inkubiert. Die Kinasereaktion wurde durch Zugabe eines Substratcocktails, der MBP und γ-³³P-ATP enthielt, initiiert. Nach Inkubation für zusätzliche 20 min. bei 30 °C wurde die Umsetzung durch Zugabe von 0,75% Phosphorsäure abgebrochen. Das phosphorylierte MBP wurde dann von dem restlichen γ-³³P-ATP unter Verwendung einer Phosphocellulosemembran (Millipore, Bedford, MA) abgetrennt und unter Verwendung eines Szintillationszählers (Packard, Meriden, CT) quantifiziert.
Die p-38 Inhibitoraktivitäten (als IC₅₀ ausgedrückt, die Konzentration, die 50% Inhibierung des untersuchten p-38 Enzyms verursacht) der erfindungsmäßigen Verbindungen, die in den Beispielen 1-4 beschrieben wurden, betrugen weniger als 10 μM.
Beispiel 12
In vitro TNF Inhibierungsassay
Dieses Beispiel erläutert ein in vitro Assay, um die Inhibierung der LPS induzierten TNF-α Produktion in THP1 Zellen abzuschätzen.
Die Fähigkeit der Verbindungen dieser Erfindung die TNF-α Freisetzung zu inhibieren, wurde unter Verwendung einer geringfügigen Abwandlung der in Blifeld et al., Transplantation, 51: 498-503 (1991) beschriebenen Verfahren bestimmt.
(a) Einführung der TNF Biosynthese:
THP-1 Zellen wurden in einem Kulturmedium [RPMI (Gibco-BRL, Gailthersburg, MD), das 15% fötales Rinderserum, 0,02 mM 2-Mercaptoethanol enthielt] bei einer Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen/mL suspendiert und dann auf eine Platte mit 96 Vertiefungen (0,2 mL Aliquote in jeder Vertiefung) aufgebracht. Die Testverbindungen wurden in DMSO gelöst und dann mit dem Kulturmedium verdünnt, so dass die endgültige DMSO Konzentration 5% betrug. Fünfundzwanzig μL Aliquote der Testlösung oder nur Medium mit DMSO (Kontrolle) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden bei 37 °C für 30 min. inkubiert. LPS (Sigma, St.
Louis, MO) wurde zu den Vertiefungen bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 μg/ml gegeben, und die Zellen wurden für zusätzliche 2 h inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Kultur-Flüssigkeitsüberstände gesammelt, und die Menge an vorhandenem TNF-α wurde unter Verwendung eines nachstehend beschriebenen ELISA-Assays bestimmt.
(b) ELISA Assay:
Die Menge an vorhandenem, menschlichem TNF-α wurde durch ein spezifisches Trapping ELISA Assay unter Verwendung von zwei anti-TNF-α Antikörper (2TNF-H12 und 2TNF-H34), wie in Reimund, J. M. et al., GUT. Vol. 39 (5), 684-689 (1996) beschrieben, bestimmt.
Polystyrol-Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 50 μL Antikörper 2TNF-H12 in PBS (10 μg/mL) pro Vertiefung bestrichen und in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und dann mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur deaktiviert und mit 0,1% BSA (Rinderserum Albumin) in PBS gewaschen.
TNF Standards wurden von einer Vorratslösung von menschlichem rekombinantem TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) hergestellt. Die Konzentration der Standards in dem Assay begann bei 10 ng/mL, gefolgt von 6 halblogarithmischen Serienverdünnungen.
Fünfundzwanzig μL Aliquote der vorstehenden Kultur-Flüssigkeitsüberstände oder TNF Standards oder nur Medium (Kontrolle) wurden mit 25 μL Aliquote des biotinylierten monoklonalen Antikörpers 2TNF-H34 (2 μg/mL in PBS, das 0,1% BSA enthielt) gemischt und dann zu jeder Vertiefung gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter sanftem Schütteln inkubiert und dann 3-mal mit 0,1% BSA in PBS gewaschen. 50 μL Peroxidase-Streptavidinlösung (Zymed, S. San Francisco, CA), die 0,416 μg/mL Peroxidase-Streptavidin und 0,1% BSA in PBS enthielt, wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Proben wurden für eine zusätzliche Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann 4-mal mit 0,1 % BSA in PBS gewaschen. Fünfzig μL O-Phenylendiaminlösung (1 μg/mL O-Phenylendiamin und 0,03% Wasserstoffperoxid in 0,2M Citratpuffer pH 4,5) wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und die Proben wurden bei Raumtemperatur für 30 min. im Dunkeln inkubiert. Optische Dichte der Probe und der Referenz wurden bei 450 nm beziehungsweise 650 nm abgelesen. TNF-α wurden von einer grafischen Darstellung, die die optische Dichte bei 450 nm mit der verwendeten Konzentration in Zusammenhang bringt, bestimmt.
Der IC₅₀ Wert wurde als Konzentration der Testverbindung definiert, entsprechend der halben maximalen Reduktion in der 450 nm Absorption.
Beispiel 13
Dieses Beispiel erläutert ein in vivo Assay, um die Inhibierung der LPS induzierter TNF-α Produktion in Mäusen (oder Ratten) abzuschätzen.
Die Fähigkeit der Verbindungen dieser Erfindung die TNF-α Freisetzung in vivo zu inhibieren, wurde unter Verwendung einer geringfügigen Abwandlung der in Zanetti et al., J. Immunol., 148: 1890 (1992) und Sekut et al., J. Lab. Clin. Med., 124: 813 (1994) beschriebenen Verfahren bestimmt.
Weibliche BALB/c Mäuse, die 18-21 Gramm wogen (Charles River, Hollister, CA), wurden für eine Woche akklimatisiert. Gruppen, die aus jeweils 8 Mäusen bestanden, wurden entweder mit den Testverbindungen, die in einem wässrigen Vehikel suspendiert oder gelöst waren, das 0,9% Natriumchlorid, 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose, 0,4% Polysorbat 80, 0,9% Benzylalkohol (CMC Vehikel) enthielt oder nur Vehikel (Kontrollgruppe) oral dosiert. Nach 30 min. wurden den Mäusen intraperitoneal 20 μg LPS (Sigma, St. Louis, MO) injiziert. Nach 1,5 h wurden die Mäuse durch CO₂ Inhalation geopfert, und das Blut wurde durch Herzpunktion geerntet. Das Blut wurde durch Zentrifugieren bei 15 600 xG für 5 min. geklärt, und die Seren wurden zu sauberen Röhrchen transferiert und bei –20 °C bis zur TNF-α Analyse mittels ELISA Assay, dem Herstellerprotokoll (Biosource International, Camarillo, CA) folgend, eingefroren.

Claims

Verbindung ausgewählt aus Verbindungen der Formel I:
wobei der tiefgestellte Index n eine ganze Zahl 1 oder 2 ist; R¹ C₁-C₆-Alkyl oder C₃-C₆-Cycloalkyl ist; R² Halogen ist; R³ Hydroxy-C₁-C₆-alkyl, C₁-C₆-Alkoxy-C₁-C₆-alkyl, -(C₁-C₆-Alkylene)-C(O)R³¹, 2-(N-Piperidinyl)ethyl oder 2-(N-(2-Pyrrolidinonyl))ethyl ist; und R³¹ Hydroxy, Ethoxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Methyl oder Ethyl ist; oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei -(R²)_n 2-Halogen oder 2,6-Dihalogen ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R¹ Isopropyl ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus 3-(2-Chlorphenyl)-1-ethoxycarbonylmethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 3-(2-Chlorphenyl)-1-carboxymethyl-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-methoxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 3-(2-Chlorphenyl)-1-(2-hydroxyethyl)-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5- d]pyrimidin-2(1H)-on, 3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2S)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, 3-(2-Chlorphenyl)-1-[(2R)-2,3-dihydroxyethyl]-7-isopropylamino-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on, und 7-Isopropylamino-3-(2-chlorphenyl)-1-(2-piperidinylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on; und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: Behandeln einer Verbindung der Formel II
wobei n, R² und R³ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt, und L eine Abgangsgruppe ist, mit einem Amin der Formel III R¹-NH₂ (III)wobei R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, mit der Maßgabe, dass jedwede vorhandene beeinträchtigende reaktive Gruppe gegebenenfalls in geschützter Form vorliegt, und wo erforderlich, Entfernen der Schutzgruppe von der in dem Reaktionsprodukt vorhandenen geschützten reaktiven Gruppe und gegebenenfalls Umwandeln einer Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch verträgliches Salz.
Arzneimittel, umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, und einen kompatiblen pharmazeutischen Träger.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4 zur Verwendung als ein therapeutisches Mittel.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4 zur Verwendung als ein therapeutisches Mittel bei der Behandlung oder Prophylaxe einer p38 vermittelten Krankheit.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Arthritis, Morbus Crohn, Reizdarm, akutem Lungenversagen (ARDS) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend das Bringen einer oder mehrerer Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1-4, oder einem Salz davon, und, falls gewünscht, eines oder mehrerer anderer therapeutisch wertvoller Stoffe in eine galenische Verabreichungsform zusammen mit einem kompatiblen pharmazeutischen Träger.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Arthritis, Morbus Crohn, Reizdarm, akutem Lungenversagen (ARDS) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung.
Verbindung gemäß Anspruch 1, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 5.
3-(2-Chlorphenyl)-7-isopropylamino-1-(2-methylsulfonylethyl)-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-2(1H)-on und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.