DE60025850T2

DE60025850T2 - Verfahren zur erzeugung von oligonukleotiden, im besonderen zur detektion amplifizierter restriktionsfragmente, die durch aflp erhalten wurden

Info

Publication number: DE60025850T2
Application number: DE60025850T
Authority: DE
Inventors: Josephus Michael VAN EIJK; Cornelis Renω HOGERS; Leo Heijnen
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: WO2001049882A3; EP1242630B1; US7166429B2; US20030175729A1; DE60025850D1; AU3246601A; ATE317024T1; WO2001049882A2; EP1242630A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen und gegebenenfalls zum Nachweisen von Oligonucleotiden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Oligonucleotiden einer bekannten und vorgegebenen Länge, ausgehend von beliebigen DNAs, DNA-Fragmenten oder Gemischen von DNAs oder DNA-Fragmenten, wobei die Oligonucleotide spezifisch für die Ausgangs-DNA(s) oder das oder die Ausgangs-Fragment(e) sind und in geeigneter Weise unter Anwendung von Massenspektroskopie oder einer ähnlichen Nachweistechnik nachgewiesen werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweisen von amplifizierten Restriktionsfragmenten, die durch AFLP^R erhalten worden sind und/oder zum Analysieren eines Gemisches von amplifizierten Restriktionsfragmenten, die unter Anwendung von AFLP^R erhalten worden sind, verwendet werden.
Die selektive Restriktionsfragment-Amplifikation oder AFLP^R ist beispielsweise aus der europäischen Patentanmeldung 0 534 858 der Anmelderin bekannt. Im allgemeinen umfasst AFLP^R folgende Stufen:

(A) Verdauen einer Nucleinsäure, insbesondere einer DNA, mit einer oder mehreren spezifischen Restriktionsendonucleasen, um die DNA in eine entsprechende Reihe von Restriktionsfragmenten zu fragmentieren;
(B) Ligieren der auf diese Weise erhaltenen Restriktionsfragmente mit mindestens einem doppelsträngigen, synthetischen Oligonucleotid-Adapter, von dem ein Ende mit einem oder beiden Enden der Restriktionsfragmente kompatibel ist, um dadurch markierte Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA zu erzeugen;
(C) Kontaktieren der markierten Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen mit mindestens einem Oligonucleotid-Primer;
(D) Amplifizieren der markierten Restriktionsfragmente, die mit den Primern hybridisiert sind, durch PCR oder eine ähnliche Technik, um eine weitere Verlängerung der hybridisierten Primer entlang der Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA, mit der die Primer hybridisiert sind, herbeizuführen; und
(E) Identifizieren oder Gewinnen des auf diese Weise amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragments.

Gemäß dem Stand der Technik können die auf diese Weise amplifizierten DNA-Fragmente anschließend analysiert und/oder sichtbar gemacht werden, z. B. durch Gelelektrophorese. Dies liefert einen genetischen Fingerabdruck, der spezifische Banden zeigt, die den Restriktionsfragmenten entsprechen, die mit dem Adapter verknüpft worden sind, vom Primer erkannt worden sind und somit während der Amplifikationsstufe amplifiziert worden sind. Der auf diese Weise erhaltene Fingerabdruck liefert Informationen über das spezifische Restriktionsstellenmuster der Ausgangs-DNA und somit über den genetischen Aufbau des Organismus, aus dem die DNA abgeleitet worden ist.
AFLP^R kann somit herangezogen werden, um die DNA zu identifizieren und sie auf die Anwesenheit von spezifischen Restriktionsstellenmustern, Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) und/oder spezifische genetische Marker (sogenannte "AFLP-Marker") zu analysieren, die einen Hinweis auf das Vorliegen bestimmter Gene oder genetischer Merkmale geben können; oder sie können für ähnliche Zwecke verwendet werden, beispielsweise durch Vergleichen der Ergebnisse, die unter Verwendung von DNA-Proben bekannten Ursprungs oder bekannter Restriktionsmuster erhalten worden sind oder durch Vergleichen der darüber erhaltenen Daten.
Die bei AFLP^R verwendeten Primer sind so beschaffen, dass sie den Adapter erkennen und als Ausgangspunkt für die Polymerase-Kettenreaktion dienen können. Zu diesem Zweck müssen die Primer eine Nucleotidsequenz aufweisen, die mit (zumindestens einem Teil davon) der Nucleotidsequenz des oder der Adapter, die mit dem oder den Enden des zu amplifizierenden Restriktionsfragments ligiert sind, hybridisieren können. Die Primer können auch eine oder mehrere weitere Basen (als "selektive Basen" bezeichnet) am 3'-Ende ihrer Sequenz enthalten, um eine Hybridisierung mit einer oder mehreren beliebigen komplementären Basen an den entsprechenden Positionen im Adapter, der mit dem Restriktionsfragment ligiert ist, zu ermöglichen, d. h. neben dem oder den Adaptern und der oder den Restriktionsstellen. Da von sämtlichen Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten, die im Gemisch vorliegen, nur die Fragmente, die zu den selektiven Basen komplementäre Basen enthalten, anschließend in wirksamer Weise amplifiziert werden, verringert die Verwendung dieser "selektiven" Primer die Gesamtmenge an Banden im endgültigen Fingerabdruck, was den Fingerabdruck klarer und spezifischer macht. Ferner liefert die Verwendung von verschiedenen selektiven Primern im allgemeinen unterschiedliche Fingerabdrücke, die als Werkzeug zum Zweck der Identifikation oder Analyse verwendet werden können.
Da AFLP^R eine Amplifikation beider Stränge einer doppelsträngigen Ausgangs-DNA ergibt, ermöglicht AFLP^R in vorteilhafter Weise eine exponentielle Amplifikation des Fragments, d. h. theoretisch gemäß der Reihe 2, 4, 8, 16 und dergl. Ferner benötigt AFLP^R weder eine vorherige Kenntnis der zu analysierenden DNA-Sequenz noch eine vorherige Identifikation geeigneter Sonden und/oder die Konstruktion einer Genbibliothek aus der Ausgangs-DNA.
Bezüglich einer weiteren Beschreibung von AFLP^R, ihrer Vorteile, ihrer Ausführungsformen sowie der dabei verwendeten Techniken, Enzyme, Adapter, Primer und weiterer Verbindungen und Werkzeuge wird auf EP-0 534 858 verwiesen. Ferner werden in der nachstehenden Beschreibung die Definitionen, die sich im Abschnitt 5.1 von EP-0 534 858 finden, verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist.
Obgleich AFLP^R im allgemeinen weniger zeitaufwändig als andere Techniken auf Hybridisierungsbasis, wie ein Nachweis auf PCR-Basis, ist, leidet diese Technik immer noch an dem Nachteil, dass die amplifizierten Fragmente getrennt (d. h. durch (Gel)-elektrophorese) und sichtbar gemacht werden müssen (d. h. durch Erzeugung eines Fingerabdrucks). Diese Maßnahmen sind sehr aufwändig und zeitraubend und erfordern spezielle Vorrichtungen, z. B. eine Elektrophorese- und Autoradiographie-Ausrüstung. Anschließend müssen die Fingerabdrücke analysiert werden (heutzutage im allgemeinen durch "Einlesen" des Fingerabdrucks in einen Computer), um die polymorphen Banden zu identifizieren. Im allgemeinen erfordert dies ferner die Verwendung einer bekannten Referenzprobe, die man gleichzeitig auf einer parallelen Bahn des Gels laufen lässt.
Aufgrund dieser Faktoren kann AFLP^R nur in ausreichend ausgerüsteten Laboratorien durchgeführt werden. Auch wenn dies der Fall ist, kann es mehrere Tage dauern, bis Ergebnisse vorliegen, selbst wenn Routinetests gemäß bekannten Verfahrensweisen durchgeführt werden, z. B. an Spezies oder Individuen, deren Genom und/oder relevante AFLP^R-Marker im allgemeinen bekannt sind.
Ein erstes Ziel der Erfindung besteht daher in der Vereinfachung dieser Verfahrensweisen, d. h. in der Bereitstellung einer Technik zum Analysieren von Nucleinsäuresequenzen, bei der nicht mehr die Anwendung von (Gel)-elektrophorese und/oder Autoradiographie erforderlich ist.
Die Anwendung von massenspektroskopischen Techniken, z. B. des matrixgestützten Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeitverfahrens (MALDI-TOF; "matrix assisted laser desorption/ionisation time of flight") zum Nachweisen/Identifizieren von einzelsträngigen DNA-Fragmenten ist bekannt, beispielsweise aus WO-97/47766; WO-98/54571; WO-99/02728; WO-97/33000, sowie aus Griffin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 96 (1999), S. 6301–6306; Ross et al., Nature Biotechnology, Bd. 16 (1998), S. 1347–1351; und Berkenkamp et al., Science, Bd. 281 (1998), S. 260–262; und Wu et al., Anal. Chem., Bd. 66 (1994), S. 1637–1645.
Jedoch kann MALDI-TOF im allgemeinen nicht zum Identifizieren/Nachweisen der durch AFLP^R erhalten Restriktionsfragmente, d. h. in der vorstehenden Stufe (D) erhaltenen Fragmente, verwendet werden.
Der Grund hierfür ist, dass MALDI-TOF auf den Nachweis von einzelsträngigen (nachstehend als "ss" bezeichnet) Oligonucleotiden mit einer Länge von höchstens 100 und vorzugsweise von höchstens 30 Basen beschränkt ist, während die durch AFLP^R erzeugten amplifizierten Fragmente vorwiegend doppelsträngige (nachstehend als "ds" bezeichnet) DNA-Fragmente sind, die typischerweise eine Länge im Bereich von 50–1200 Basenpaaren aufweisen.
Massenspektroskopische Techniken werden zum Identifizieren/Nachweisen von Oligonucleotidsequenzen, die unter Anwendung der PCR-Amplifikation erzeugt worden sind, verwendet. Bei diesem Verfahren wird eine Ausgangs-DNA durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die spezifisch so konstruiert sind, dass sie mit der Ausgangs-DNA an einer Stelle/Sequenz hybridisiert, die sich in enger Nachbarschaft zu einem (Einzelnucleotid)-Polymorphismus (SNP) befindet und die eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease vom IIS-Typ enthält. Im Anschluss an die PCR wird die amplifizierte DNA mit der entsprechenden IIS-Restriktionsendonuclease geschnitten, um kleine ds-Oligonucleotidfragmente zu erzeugen, die in eine entsprechende ssDNA umgewandelt und durch Massenspektroskopie nachgewiesen werden. Eine derartige Technik unter Verwendung von ESI-MS wird beispielsweise von Laken et al., Nature Biotechnology, Bd. 16 (1998), S. 1352–1356, beschrieben.
Jedoch sind diese Techniken mit dem allgemeinen Nachteil von Techniken auf PCR-Basis insofern behaftet, als zumindest gewisse vorherige Kenntnisse über die zu analysierende Sequenz erforderlich sind, d. h. ausreichende Kenntnisse, um einen Primer bereitzustellen, der mit der Ausgangs-DNA hybridisieren kann.
Im Vergleich dazu, benötigt AFLP keine derartigen vorherigen Kenntnisse über die zu analysierende Sequenz. Somit besteht ein weiteres Ziel der Erfindung darin, ein Verfahren bereitzustellen, das die Vorteile von AFLP mit der Einfachheit und dem hohen Nachweis-Durchsatz, die mit MALDI-TOF oder einer ähnlichen Nachweistechnik erzielt werden können, vereinigt. Dieses Ziel wird durch das oder die nachstehend beschriebenen Verfahren erreicht.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen und Nachweisen eines Oligonucleotids, das spezifisch für eine Sequenz in einer ersten dsDNA ist, wobei die erste dsDNA mit einer Restriktionsendonuclease in einer Position in der ersten dsDNA geschnitten wird, die sich von der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease unterscheidet, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(a) Bereitstellung der ersten dsDNA; und
(b) Ligation der ersten dsDNA mit einer zweiten dsDNA unter Bereitstellung einer ligierten dsDNA, wobei die zweite dsDNA-Sequenz mindestens eine Erkennungsstelle für eine IIS-Restriktionsendonuclease umfasst und wobei sich die Erkennungsstelle in einer Position in der zweiten dsDNA befindet, die bewirkt, dass die IIS-Restriktionsendonuclease die erste dsDNA, die mit der zweiten dsDNA ligiert ist, schneidet;
(c) Amplifikation der verknüpften dsDNA;
(d) Restriktion der amplifizierten, ligierten dsDNA mit der mindestens einen Restriktionsendonuclease des IIS-Typs; und
(e) Nachweis von mindestens einer amplifizierten, IIS-geschnittenen dsDNA; wobei die Nachweisstufe (e) die folgenden Stufen umfasst:
(e1) Erzeugen mindestens einer ssDNA aus einem amplifizierten, ligierten dsDNA-Fragment, das in Stufe (d) erhalten worden ist; und
(e2) Nachweis der ssDNA durch Massenspektroskopie.

Weitere Aspekte, Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
Die Verwendung von IIS-Restriktionsendonucleasen in einem Verfahren zur wiederholten und regenerativen DNA-Sequenzierung wurde beispielsweise von Jones, Biotechniques, Bd. 22 (1997), S. 938–946, beschrieben. Dieses Verfahren bedient sich der Ligation eines Adapters, der die Erkennungsdomäne für eine Restriktionsendonuclease der Klasse IIS enthält, und des Verdaus mit einer Restriktionsendonuclease der Klasse IIS, die die Erkennungsdomäne des Adapters erkennt. Dies erzeugt einen Satz von DNA-Matrizen, die jeweils aus einem kurzen Überhang zusammengesetzt sind, der sich in einem fixierten Abstand in Bezug auf ein Ende des ursprünglichen dsDNA-Fragments befindet. Nach dem Klasse-IIS-Verdau erfolgt die Sequenzierung eines Nucleotids in jedem Überhang durch eine matrizengerichtete Ligation während der wiederholten Adapterligation oder durch eine getrennte matrizengerichtete Polymerisation mit markierten ddNTPs. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung von zahlreichen dsDNA-Fragmenten.
US-5 710 000 beschreibt ein ähnliches Verfahren auf der Basis von IIS-Endonucleasen, wobei die spezifischen Oligonucleotide, die sich neben den Typ II-S-Restriktionsstellen befinden, unter Anwendung einer Kombinationsreihe, die sämtliche möglichen Permutationen der möglichen Nucleotide im Übergang der Restriktionsstelle exprimiert, identifiziert werden.
WO-94/16090 beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen von einzelsträngigen Nucieinsäuremolekülen basierend auf der Verwendung von 3' → 5'-Exonucleasen. Sears et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 24 (18) (1996), S. 3590–3592) beschreibt Restriktionsendonucleasen, die doppelsträngige DNA spezifisch an beiden Seiten der Erkennungssequenz spalten.
Insbesondere kann MALDI-TOF für den Nachweis in Stufe (e2) zusammen mit Chromatographietechniken und insbesondere zusammen mit Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) eingesetzt werden.
Figuren
1 bis 3 sind schematische Darstellungen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung von nachweisbaren Oligonucleotiden.
4 und 5 sind DNA-Fingerabdrücke, die in Beispiel 1 bzw. Beispiel 2 erhalten worden sind.
6 zeigt in schematischer Darstellung ein alternatives erfindungsgemäßes Verfahren zum Erzeugen von nachweisbaren Oligonucleotiden unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease vom IIS-Typ, die zum Schneiden von dsDNA an zwei Stellen, die sich von der Erkennungsstelle unterscheiden, befähigt ist.
7 zeigt AFLP-Reaktionen, die mit einem MseI-Adapter und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer GsuI-Stelle durchgeführt worden sind.
8 zeigt AFLP-Reaktionen, die mit einem MseI-Adapter und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer BsgI-Stelle durchgeführt worden sind.
9 zeigt AFLP-Reaktionen, die mit Matrizen, die mit dem BcgI-Restriktionsenzym hergestellt worden sind, durchgeführt worden sind.
Üblicherweise handelt es sich bei der ersten dsDNA um eine natürlich vorkommende DNA oder DNA-Fragment (einschließlich genomische DNA und/oder ein Fragment davon); eine cDNA oder ein cDNA-Fragment; und/oder eine amplifizierte DNA oder DNA-Fragment (obgleich vorzugsweise wie in der vorstehenden Stufe c) eine Amplifikationsstufe einen Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt). Somit kann die erste dsDNA oder das dsDNA-Fragment Teil eines Gemisches von derartigen dsDNAs oder dsDNA-Fragmenten sein.
Vorzugsweise handelt es sich, wie nachstehend erwähnt, bei der ersten dsDNA um ein Restriktionsfragment. Als solches kann es sich um einen Teil eines Gemisches von Restriktionsfragmenten, die durch Schneiden einer Ausgangs-DNA und insbesondere einer genomischen DNA oder cDNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen erhalten worden sind, handeln.
Wie nachstehend beschrieben, ist es ferner dann, wenn die Ausgangs-dsDNA oder das Ausgangs-dsDNA-Fragment Teil eines Gemisches oder einer Probe mit einem Gehalt an mehreren derartigen dsDNAs oder dsDNA-Fragmenten ist, möglich, unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens (z. B. gleichzeitig und/oder in einer einzigen Reaktion) Oligonucleotide aus nur einer einzigen (d. h. spezifischen) der im Gemisch oder der Probe vorhandenen dsDNAs oder dsDNA-Fragmente; aus mehreren der im Gemisch oder der Probe vorhandenen dsDNAs oder dsDNA-Fragmente; aus einer spezifischen Untergruppe der im Gemisch oder der Probe vorhandenen dsDNAs oder dsDNA-Fragmente; oder aus im wesentlichen sämtlichen im Gemisch vorhandenen dsDNAs oder dsDNA-Fragmenten zu erzeugen. In einem derartigen Fall kann es erfindungsgemäß möglich sein, jedes der Oligonucleotide, die spezifisch für jede der im ursprünglichen Gemisch oder in der ursprünglichen Probe vorhandenen dsDNAs oder dsDNA-Fragmente sind, getrennt/unabhängig nachzuweisen.
Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse einer derartigen Probe oder eines Gemisches herangezogen werden, z. B. zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer oder mehreren spezifischen dsDNAs und/oder zum Unterscheiden zwischen einer oder mehreren spezifischen dsDNAs, wobei es sich bei der einen oder den mehreren dsDNAs beispielsweise um ein oder mehr Restriktionsfragmente handeln kann, die einem oder mehreren genetischen Markern von Interesse entsprechen.
Die zweite dsDNA umfasst innerhalb ihrer Sequenz mindestens eine Erkennungsstelle für eine IIS-Restriktionsendonuclease. Unter einer IIS-(Restriktions)endonuclease ist hier eine Endonuclease zu verstehen, die eine dsDNA an einer Stelle/Position an der dsDNA, die sich von ihrer Erkennungsstelle unterscheidet, schneidet, und insbesondere ist darunter eine Endonuclease zu verstehen, die eine dsDNA in einem bestimmten "Abstand" von der Erkennungsstelle schneidet, üblicherweise in einem Abstand von 5 bis 30 Basenpaaren und vorzugsweise von mehr als 15 Basenpaaren von der Erkennungsstelle, wobei dieser "Abstand" als die Anzahl der Basenpaare definiert ist, die sich zwischen der "letzten" Base (Basenpaar) der Erkennungsstelle und dem "ersten" Basenpaar der Restriktionsstelle befinden.
Nachstehend sind einige nicht-beschränkende Beispiele für Endonucleasen vom Typ IIS zur erfindungsgemäßen Verwendung und ihre Erkennungsstellen in Tabelle 1 aufgeführt:
Tabelle 1
Weitere geeignete IIS-Restriktionsenzyme sind für den Fachmann ersichtlich und beispielsweise in US-A-5 658 736 und WO-98/48047 erwähnt. Hierzu gehören beispielsweise AceIII, AlwI, AlwXI, Alw26I, BbvI, BbvII, BbsI, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BinI, BsaI, BsgI, BsmAI, BsmFI, BspMI, EarI, EciI, Eco3II, Eco57I, Esp3I, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HinGUII, HphI, Ksp632I, MboII, MmeI, MnlI, NgoVIII, PleI, RleAI, SapI, SfaNI, TaqII und Tth111II.
Die zweite dsDNA weist üblicherweise eine bekannte und vorgegebene "Größe"/"Länge" auf (worunter die Gesamtzahl der Basenpaare/Nucleotide davon zu verstehen ist). Ferner ist die Position der IIS-Erkennungsstelle in der zweiten dsDNA üblicherweise bekannt und vorbestimmt und so beschaffen, dass in der ligierten DNA, die in Stufe b) erhalten wird, die Restriktionsstelle der IIS-Endonuclease in dem Teil der ligierten DNA liegt, der von der ersten dsDNA abgeleitet ist/diesem entspricht. Wenn dies der Fall ist, werden nach der Restriktionsstufe c) zwei IIS-geschnittene dsDNA-Fragmente erhalten, d. h. eines, das die zweite dsDNA (mit der IIS-Erkennungsstelle und einen Teil der ersten dsDNA (d. h. der sich in der ligierten dsDNA direkt neben der zweiten dsDNA befand) enthält; und eines, das den Rest der ersten dsDNA enthält. Von diesen beiden IIS-geschnittenen Fragmenten wird aus Gründen, die nachstehend näher erläutert werden, in Stufe e) vorzugsweise das Fragment, das die zweite dsDNA (eine dieser entsprechende Sequenz) umfasst, die die IIS-Erkennungsstelle einschließt, nachgewiesen. Insbesondere wird in Stufe e1) die mindestens eine ssDNA vorzugsweise aus dem Fragment erzeugt, das die zweite dsDNA (eine dieser entsprechende Sequenz), die anschließend nachgewiesen wird, umfasst.
Üblicherweise weist die zweite dsDNA eine Größe/Länge von bis zu 20–50 Basenpaaren und vorzugsweise zwischen 10 Basenpaaren und 40 Basenpaaren auf. Die zweite dsDNA weist ferner üblicherweise mindestens ein "Ende" auf, das ihre Ligation mit der ersten dsDNA ermöglicht, z. B. unter Anwendung herkömmlicher DNA-Ligationsverfahrensweisen, die üblicherweise von dem oder den Enden, die in der ersten dsDNA vorhanden sind, abhängen. Vorzugsweise befindet sich die IIS-Erkennungsstelle in einem "Abstand" vom Ende der zweiten dsDNA, die mit der ersten dsDNA zu ligieren ist (worunter die Anzahl an Basenpaaren/Nucleotiden zwischen der IIS-Erkennungsstelle und dem Ende der zweiten dsDNA zu verstehen ist), von bis zu 6–10 Basenpaaren und vorzugsweise zwischen 0 und 6 Basenpaaren, je nach der zu verwendenden IIS-Endonuclease.
Üblicherweise handelt es sich bei der zweiten dsDNA um eine synthetische Sequenz, obgleich die Erfindung nicht hierauf beschränkt ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die zweite dsDNA im wesentlichen einer herkömmlichen dsAFLP^R-Adaptersequenz und/oder wird in einer im wesentlichen analogen Weise hierzu verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine Amplifikationsstufe c), die vorzugsweise unter Verwendung mindestens eines Primers durchgeführt wird, der mit dem Teil der zweiten dsDNA hybridisieren kann, der eine Extension des Primers entlang der ligierten dsDNA erlaubt. Insbesondere enthält dieser Primer eine IIS-Restriktionsstelle, die sich so nahe wie möglich an seinem 3'-Primerende befindet, so dass nach Restriktion mit der entsprechenden IIS-Restriktionsendonuclease eine IIS-geschnittene dsDNA erhalten wird, die möglichst viele Nucleotide, die sich von der ersten dsDNA ableiten, enthält.
Ferner ist der Primer vorzugsweise so beschaffen, dass er mit 1–10 Basen und vorzugsweise 1–4 Basen der ersten dsDNA hybridisieren kann, die sich in der in Stufe b) erhaltenen ligierten dsDNA in unmittelbarer Nachbarschaft zu der Sequenz befinden, die von der zweiten dsDNA abgeleitet ist, so dass eine wirksame Amplifikation nur einer Untergruppe von ligierten dsDNA-Fragmenten ermöglicht wird, wenn diese in einem Gemisch mit einem Gehalt an zahlreichen solchen ligierten dsDNA-Fragmenten vorhanden sind.
Jedoch umfasst die Erfindung (ohne Beschränkung hierauf) im allgemeinen die Verwendung von beliebigen Primern, die eine Extension entlang der ligierten dsDNA ermöglichen. Beispielsweise umfasst die Erfindung auch die Verwendung eines Primers, der mit der Sequenz der zweiten dsDNA hybridisieren kann, d. h. die in der ligierten dsDNA, die als Matrize für die Extensionsreaktion verwendet wird, vorhanden ist, so dass bei Hybridisierung das 3'-Ende des Primers noch einige Basen von der Restriktionsstelle (z. B. die der ersten dsDNA entsprechende Sequenz) entfernt ist.
Wie nachstehend beschrieben, entspricht ein derartiger Primer im wesentlichen einem AFLP^R-Primer und in seiner bevorzugten Ausführungsform einem selektiven AFLP^R-Primer. Wie bei selektiven AFLP^R-Primern ist es nicht wesentlich, welche "selektiven Nucleotide" verwendet werden (d. h. die spezifischen Nucleotide (deren Sequenz), die im Primer vorhanden sind, der mit den von der ersten dsDNA abgeleiteten Basen/Nucleotiden zu hybridisieren ist), sofern eine selektive Amplifikation (zumindest in gewissem Umfang) erzielt wird, d. h. eine Amplifikation von nur einer Untergruppe sämtlicher ligierter dsDNA(s), die in der Probe oder dem Gemisch vorhanden sind. Jedoch werden wie bei herkömmlichem AFLP die selektiven Nucleotide vorzugsweise vorher bestimmt.
Nachstehend wird die Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf die nicht-beschränkende 1 beschrieben, die in schematischer Weise das erfindungsgemäße Verfahren darstellt.
In der Stufe b) wird eine erste dsDNA (1) mit einer zweiten dsDNA (2) mit einem Gehalt an einer IIS-Erkennungsstelle (3) ligiert. Die auf diese Weise erhaltene ligierte dsDNA (4) wird in Stufe (c) mit der entsprechenden IIS-Restriktionsendonuclease geschnitten, die die ligierte dsDNA (4) an einer Restriktionsstelle (5) schneidet, die in dem Teil der ligierten dsDNA (4) liegt, die von der ersten dsDNA (1) abgeleitet ist. Die Position der Restriktionsstelle (5) relativ zur Erkennungsstelle (3) (d. h. der "Abstand" zwischen diesen Stellen) wird im wesentlichen durch die verwendete IIS-Restriktionsendonuclease festgelegt.
Bei der Restriktion werden zwei IIS-geschnittene dsDNA-Fragmente erhalten, die in 1 mit (6) und (7) bezeichnet sind. Eines dieser Fragmente, das in 1 mit (6) bezeichnet ist, umfasst die ursprüngliche zweite dsDNA mit der IIS- Restriktionsstelle und einen Teil der ersten dsDNA, während das andere Fragment, das in 1 mit (7) bezeichnet ist, den Rest der ursprünglichen ersten dsDNA umfasst.
Es ist ersichtlich, dass die gesamte "Länge"/"Größe" des Fragments (6) durch die Länge der zweiten dsDNA (2), durch die Position der darin enthaltenen IIS-Erkennungsstelle (3) und durch den "Abstand" von der IIS-Erkennungsstelle (3), in dem die IIS-Restriktionsendonuclease die ligierte dsDNA (4) schneidet, d. h. der Position von Stelle (5), festgelegt wird. Daher lässt sich unter Verwendung einer zweiten dsDNA (2) von bekannter und vorgegebener Länge und mit einer bekannten und vorgegebenen Position der IIS-Erkennungsstelle (3) ein IIS-geschnittenes dsDNA-Fragment (6) von bekannter und vorgegebener Länge erhalten, dessen Masse (bezüglich ähnlicher Fragmente (6), die mit der gleichen zweiten dsDNA und unter Verwendung der gleichen IIS-Restriktionsendonuclease erzeugt werden) im wesentlichen durch die Nucleotide/Basen aus der ersten dsDNA (1), die im IIS-geschnittenen Fragment (6) vorhanden sind, festgelegt wird. Somit stellen die Masse und/oder die Nucleotidsequenz der IIS-geschnittenen Fragmente (6) ein Anzeichen für die erste dsDNA (1) dar oder sind für diese charakteristisch.
Vorzugsweise leiten sich von den Nucleotiden/Basenpaaren, die in dem oder den auf diese Weise erhaltenen IIS-geschnittenen dsDNA-Fragmenten (6) enthalten sind, mindestens 8 Nucleotide/Basenpaare, vorzugsweise mindestens 10 Nucleotide/Basenpaare und insbesondere eine bis zur maximalen Anzahl der mit der verwendeten Restriktionsendonuclease erzielbaren Basenpaare/Nucleotide von der ersten dsDNA ab. Dies erhöht den oder die Unterschiede in der Masse zwischen verschiedenen, IIS-geschnittenen dsDNA-Fragmenten (6), die aus der Ausgangs-DNA unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das die Auflösung/Empfindlichkeit verbessert, erzeugt worden sind.
Das IIS-geschnittene Fragment (6) kann anschließend nachgewiesen werden, beispielsweise durch ein Nachweisverfahren auf der Grundlage (von Unterschieden) des Molekulargewichts/Molekülmasse und/oder der Nucleotidsequenz. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dies durchgeführt, indem man mindestens ein ssDNA-Fragment (8) aus dem IIS-geschnittenen Fragment (6) erzeugt, d. h. in Stufe d), und diese ssDNA-Fragmente (8) durch Massenspektroskopie oder eine ähnliche Technik, vorzugsweise durch MALDI-TOF, nachweist. Zu diesem Zweck soll die Länge/Größe des aus dem dsDNA-Fragment (6) erzeugten ssDNA-Fragments (8) so beschaffen sein, dass sich das Fragment zum Nachweis durch MALDI-TOF eignet, d. h. innerhalb des allgemeinen Bereiches von bis zu 10–100 Nucleotiden und vorzugsweise von 1 bis 40 Nucleotiden.
Zweckmäßigerweise kann die Größe der erhaltenen ssDNA-Fragmente (8) bestimmt werden (und wird auch tatsächlich so bestimmt), indem man in geeigneter Weise die zweite dsDNA (2) (deren Größe/Länge) auswählt, und zwar so, dass das IIS-geschnittene dsDNA-Fragment (8) eine solche Größe aufweist, dass sich nach Trennung der Stränge direkt ssDNA-Fragmente (8) von geeigneter Länge/Größe ergeben. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass als Teil der Stufen, durch die das ssDNA-Fragment (8) aus dem dsDNA-Fragment (6), erzeugt wird, die Länge/Größe des erhaltenen ssDNA-Fragments (8) weiter verringert wird, d. h. verglichen mit der Länge/Größe des dsDNA-Fragments (6) wodurch man beispielsweise ein ssDNA-Fragment (8) von einer für den Nachweis durch MALDI-TOF geeigneten Länge aus einem größeren dsDNA-Fragment (6) erhält; mit der Maßgabe, dass das erhaltene ssDNA-Fragment (8) für die erste dsDNA (1) noch spezifisch/charakteristisch ist.
Das oder die Fragmente und insbesondere das oder die ssDNA-Fragmente (8) können anschließend unter Anwendung einer massenspektroskopischen Technik nachgewiesen werden, und insbesondere unter Anwendung einer massenspektroskopischen Technik die sich zum Nachweis von Nucleinsäuren eignet.
Im allgemeinen beinhaltet eine derartige Technik eine Ionisationsstufe und eine Nachweisstufe. Die Ionisationsstufe kann beispielsweise durch Elektronenspray-Ionisation (ESI) oder durch matrixgestützte Laser-Desorptionsionisation (MALDI) durchgeführt werden. Die Nachweisstufe kann beispielsweise unter Verwendung einer Ionenfalle (IT) von Flugzeit (TOF) (time-of-flight) oder von Quadrupol- oder Fourier-Transformations-Ionencyclotronresonanz (FTICR) durchgeführt werden. Eine beliebige geeignete Kombination einer derartigen Ionisation und einer derartigen Nachweistechnik können herangezogen werden, worunter ESI-Quadrupol, ESI-FTICR und MALDI-TOF die gebräuchlichsten sind. Erfindungsgemäß wird die Anwendung von MALDI-TOF besonders bevorzugt.
Die Massenspektroskopie kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden. Das erhaltene Spektrum kann auf an sich bekannte Weise analysiert werden.
Bezüglich einer weiteren Beschreibung der vorstehenden und anderer geeigneten massensspektroskopischen Techniken und ihrer Anwendung bei der Analyse von Nucleinsäuresequenzen wird unter anderem auf WO-97/47766, WO 99/02728 und WO-97/33000 Bezug genommen.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass massenspektroskopische Markierungen nicht erforderlich sind, obgleich diese vom Schutzumfang der Erfindung nicht ausgenommen sind.
Jedoch ist in Bezug auf den Nachweis der IIS-geschnittenen Fragmente, die in der vorstehenden Stufe (d) erhalten worden sind, d. h. aus Fragment (6) und/oder (7) in 1, darauf hinzuweisen, dass die vorstehenden Ausführungen eine nicht-beschränkende, bevorzugte Ausführungsform darstellen und dass andere Wege zum Nachweisen/Analysieren der IIS-geschnittenen Fragmente möglich sind.
Beispielsweise ist es anstelle der Erzeugung einer ssDNA (8) aus dem IIS-geschnittenen dsDNA-Fragment (6) auch möglich, direkt ein dsDNA-Fragment (6) nachzuweisen. Ferner ist es möglich, das IIS-geschnittene dsDNA-Fragment (7) und/oder eine daraus erzeugte ssDNA nachzuweisen (in 1 nicht dargestellt).
Da ferner im erfindungsgemäßen Verfahren Nachweistechniken auf der Basis von Massenspektroskopie (MS) und insbesondere MALDI-TOF eingesetzt werden, ist es möglich, andere Nachweistechniken, wie chromatographische Techniken, z. B. HPLC- oder gaschromatographische (GC) Techniken oder eine geeignete Kombination aus chromatographischen und massenspektroskopischen Techniken, wie GC-MS, anzuwenden.
Die bevorzugten Techniken, gemäß denen sich das oder die ssDNA-Fragmente (8) aus dem IIS-geschnittenen dsDNA-Fragment (6) erhalten lassen, werden nachstehend weiter erörtert.
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform und Anwendungsmöglichkeit näher erläutert, d. h. in Bezug auf den Nachweis von Restriktionsfragmenten und insbesondere in Bezug auf eine Kombination aus Amplifikation und Nachweis von Restriktionsfragmenten unter Anwendung der AFLP^R-Methodik. Gemäß diesem Aspekt handelt es sich bei der ersten dsDNA (1) um ein Restriktionsfragment, das üblicherweise in einem Gemisch von Restriktionsfragmenten vorhanden ist und beispielsweise auf die nachstehend angegebene Weise erzeugt worden ist. Die zweite dsDNA (2), die die IIS-Restriktionsstelle enthält, entspricht einem AFLP^R-Adapter, d. h. sie ist so konzipiert, dass sie eine IIS-Erkennungsstelle in ihrer Sequenz aufweist.
Ferner umfasst bei diesem Aspekt der Erfindung das Verfahren der vorstehenden Stufen a) bis e) eine Amplifikationsstufe c). Zweckmäßigerweise verwendet man für die Zwecke dieser Amplifikation den AFLP^R-Adapter, der die IIS-Erkennungsstelle enthält, und entsprechende AFLP^R-Primer. Somit wird erfindungsgemäß der Adapter sowohl zur Bereitstellung einer geeigneten IIS-Erkennungsstelle als auch zur Bereitstellung der Amplifikation der Restriktionsfragmente verwendet.
Dies hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren in zweckmäßiger Weise als eine herkömmliche AFLP^R-Reaktion/Amplifikation durchgeführt werden kann, d. h. im wesentlichen gemäß den Stufen (A) bis (D) der vorerwähnten Druckschrift EP-0 534 858 oder gemäß einem anderen, an sich bekannten AFLP^R-Verfahren, bei dem die Stufen (A) bis (D) im wesentlichen den Stufen a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen. Hierfür besteht die einzige Anpassung, die im Vergleich zur herkömmlichen AFLP^R-Methodik erforderlich ist, in der Verwendung eines Adapters, der eine IIS-Erkennungsstelle enthält und in der Art und Weise, wie es für AFLP^R-Adapter an sich bekannt ist, weiter eingesetzt werden kann.
Anschließend wird der Nachweis der amplifizierten Restriktionsfragmente (Stufe (E) des Verfahrens von EP-0 534 858) gemäß dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, d. h. gemäß den vorstehenden Stufen d) und e). Im wesentlichen bedeutet dies, dass das amplifizierte Gemisch von Restriktionsfragmenten mit der geeigneten IIS-Restriktionsendonuclease behandelt wird, wonach die amplifizierten ds-Restriktionsfragmente in ss-Fragmente umgewandelt werden, die anschließend beispielsweise unter Anwendung von MALDI-TOF nachgewiesen werden können. Somit ersetzen die erfindungsgemäßen Stufen d) und e) die Gelelektrophorese und Autoradiographie bei herkömmlichem AFLP^R.
Da ferner die AFLP^R-Amplifikation selbst in an sich bekannter Weise vorgenommen werden kann, können erfindungsgemäß sämtliche Vorteile von AFLP^R sowie sämtliche Ausführungsformen von AFLP^R ausgenützt werden. Beispielsweise kann wie bei herkömmlichem AFLP^R die Amplifikationsstufe c), d. h. die Stufe (D) von EP-0 534 858, unter Verwendung von selektiven Primern durchgeführt werden, um selektiv nur eine Untergruppe sämtlicher Restriktionsfragmente, die im Ausgangsgemisch vorhanden sind, zu amplifizieren, wodurch die Gesamtzahl von erhaltenen amplifizierten Fragmenten verringert wird.
Was den Nachweis des oder der amplifizierten Fragmente betrifft, kann die Erfindung speziell zum Nachweis von einem oder mehreren (Oligonucleotiden, entsprechend den) Restriktionsfragmenten verwendet werden, die üblicherweise einem oder mehreren AFLP^R-Markern von Interesse entsprechen, wodurch direkt Informationen über die Anwesenheit oder Abwesenheit des oder der Marker im Ausgangsgemisch bereitgestellt werden.
Alternativ oder gleichzeitig kann die Erfindung auch zur Erzeugung und zum Nachweis eines Satzes von Oligonucleotiden eingesetzt werden, die sämtlichen Restriktionsfragmenten entsprechen, die (selektiv) aus dem ursprünglichen Restriktionsfragmentgemisch amplifiziert worden sind. Somit kann beispielsweise ein Muster von Peaks in einem Massenspektrum, das jedem dieser Oligonucleotide entspricht, bereitgestellt werden. Ein derartiges Muster ergibt (repräsentiert) eine Art von "Fingerabdruck" für das Ausgangsgemisch – vergleichbar mit einem Muster von Banden, die durch Gelelektrophorese erhalten worden sind – wobei dieses Muster analysiert, weiter verarbeitet und/oder zur Bildung einer Datenbank gespeichert/zusammengestellt werden kann, wie es beispielsweise im wesentlichen für herkömmliche genetische Fingerabdrücke bekannt ist.
Die Beschreibung betrifft auch die Ergebnisse und/oder Daten, die durch Analyse einer Nucleinsäure oder eines Nucleinsäuregemisches gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Diese Ergebnisse oder Daten können beispielsweise in Form einer Graphik, einer Abbildung, einer Bewertung, eines Satzes von Zahlen, eines Massenspektrums, eines Chromatogramms, von digitalen oder analogen Daten oder in einer anderen geeigneten Form vorliegen. Sie können gegebenenfalls in einem geeigneten Datenträger, einschließlich Papier, photographische Filme, Computerdateien, Datenbanken und dergl., gespeichert werden. Diese Daten können in der Form, wie sie direkt aus der MS-Einrichtung erhalten worden sind, vorliegen oder sie können weiter verarbeitet worden sein, z. B. unter Verwendung eines geeigneten Computer-Algorithmus.
Somit betrifft die Erfindung gemäß diesem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur Durchführung von AFLP^R, das die Stufen (A) bis (E) aus der vorerwähnten Druckschrift EP-0 534 858 umfasst, wobei die in Stufe (D) erhaltenen amplifizierten Fragmente in der Stufe (E) durch eine massenspektroskopische Technik, insbesondere durch MALDI-TOF, oder durch eine geeignete Kombination davon mit einer chromatographischen Technik, z. B. Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), wie Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS), identifiziert werden. Vorzugsweise wird MALDI-TOF eingesetzt.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von AFLP^R, das die Stufen (A) bis (E) von EP-0 534 858 umfasst, wobei die in Stufe (D) erhaltenen amplifizierten Fragmente in Stufe (E) identifiziert werden, indem man mindestens eine ssDNA aus mindestens einem der amplifizierten Fragmente erzeugt, wonach die ssDNA über ein Nachweisverfahren, das auf der Länge, Größe und Masse der ssDNA beruht, identifiziert/nachgewiesen wird. Gemäß diesem Aspekt kann die ssDNA unter Anwendung einer massenspektroskopischen Technik, insbesondere MALDI-TOF, identifiziert werden.
Alternativ kann die ssDNA unter Anwendung anderer Techniken, die auf der Nucleotidsequenz des oder der nachzuweisenden Fragmente beruhen, nachgewiesen werden, da dadurch die Auflösung bzw. das Auflösungsvermögen möglicherweise verbessert wird. Eine derartige Nachweistechnik auf Sequenzbasis kann (ferner) eine Unterscheidung zwischen Oligonucleotiden ermöglichen, die die gleiche Molekülmasse (z. B. insofern, als sie die gleiche Anzahl jeweils der Nucleotide A, T, G oder C enthalten), aber unterschiedliche Sequenzen (z. B. insofern, als die Sequenz der Nucleotide A, T, G und/oder C unterschiedlich ist, insbesondere in dem Fall der Oligonucleotide, die sich von der ersten dsDNA ableiten) aufweisen.
Die Beschreibung betrifft auch die Verwendung eines Adapters, der mindestens eine Erkennungsstelle (eine hierfür entsprechende Sequenz) für mindestens eine Restriktionsendonuclease des IIS-Typs enthält, bei AFLP^R; und/oder die Verwendung eines Primers, der mindestens eine Erkennungsstelle (eine hierfür entsprechende Sequenz) für mindestens eine Restriktionsendonuclease des IIS-Typs enthält, bei AFLP^R.
Die Beschreibung betrifft ferner die Anwendung von Massenspektroskopie und insbesondere von MALDI-TOF beim Nachweis/Identifizierung von unter Anwendung von AFLP^R erzeugten amplifizierten Restriktionsfragmenten.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung betrifft die Anwendung einer chromatographischen Technik, z. B. von Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC); oder einer geeigneten Kombination einer chromatographischen Technik und einer massenspektroskopischen Technik, z. B. Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS) beim Nachweis/Identifizierung von unter Anwendung von AFLP^R erzeugten amplifizierten Restriktionsfragmenten.
Vorzugsweise wird gemäß diesen Aspekten die massenspektroskopische Technik oder die kombinierte chromatographische/massenspektroskopische Technik auf ssDNA-Fragmente, die aus den amplifizierten dsDNA-Restriktionsfragmenten erzeugt worden sind, angewandt.
Bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform auf der Basis von AFLP handelt es sich bei der ersten dsDNA um ein Restriktionsfragment, das in einem Gemisch von Restriktionsfragmenten vorhanden ist, das vorzugsweise durch Schneiden einer Ausgangs-DNA mit mindestens einem "häufig schneidenden" Restriktionsenzym und mindestens einem "selten schneidenden" Restriktionsenzym erhalten worden ist, wobei diesbezüglich unter anderem auf EP-A-0 534 858 und EP-A-721 987 verwiesen wird.
Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente werden mit AFLP^R-Adaptern mit einem Gehalt an einer IIS-Erkennungsstelle verknüpft. Im übrigen sind diese Adapter im wesentlichen gleichwertig mit herkömmlichen AFLP^R-Adaptern und werden auf die gleiche Weise verwendet. Um jedoch schließlich ssDNA-Fragmente einer Größe bereitzustellen, die sich besonders zum Nachweis durch MALDI-TOF eignet, sollten die Adapter eine Länge von vorzugsweise mindestens 40 Basenpaaren aufweisen.
Ferner soll sich die IIS-Erkennungsstelle in einer Position befinden, die sich zumindest innerhalb von 10 Basenpaaren vom Ende des Adapters, das mit dem Restriktionsfragment verbunden ist, befindet, und zwar in Abhängigkeit von der verwendeten IIS-Endonuclease. Wie vorstehend ausgeführt, dient dies zur Gewährleistung der Tatsache, dass dann, wenn die amplifizierten Restriktionsfragmente mit der IIS-Endonuclease geschnitten werden (d. h. in der Stufe d) der Erfindung) die Stelle, an der das amplifizierte Fragment geschnitten ist, in dem Teil des amplifizierten Fragments liegt, das sich vom ursprünglichen Restriktionsfragment ableitet.
Wenn ferner die Restriktionsfragmente mit einem häufig schneidenden Enzym und einem selten schneidenden Enzym erzeugt werden, ist der Adapter mit der IIS-Erkennungsstelle vorzugsweise mit dem Ende des Restriktionsfragments, das durch das häufig schneidende Enzym erzeugt worden ist, verbunden, was im allgemeinen letztlich zu einer nachweisbaren ssDNA mit einem Gehalt an weiteren zwei Basen, die sich vom Restriktionsfragment ableiten, führt.
Nach Ligation der Adapter wird das Gemisch amplifiziert, d. h. unter Verwendung von Primern, die mit der Adaptersequenz (oder mindestens einem Teil davon) in der Weise hybridisieren können, dass eine Erweiterung des Primers entlang des Restriktionsfragments (Matrize) ermöglicht wird. Wie vorstehend erwähnt, werden diese Stufen im wesentlichen gemäß den bekannten AFLP^R-Verfahren durchgeführt, wobei diesbezüglich erneut unter anderem auf EP-A-0 534 858 verwiesen wird.
Vorzugsweise kann die Amplifikation (wie es aus der herkömmlichen AFLP^R-Methodik bekannt ist) mehrere Amplifikationsstufen umfassen. Ferner beinhaltet vorzugsweise mindestens eine Amplifikationsstufe die Verwendung von selektiven AFLP^R-Primern, z. B. von +1- bis +6-Primern. Beispielsweise kann eine Kombination einer nicht-selektiven Präamplifikation und einer selektiven +2/+3-Amplifikation herangezogen werden, wobei die geringste Anzahl von selektiven Nucleotiden vorzugsweise im Primer mit der Erkennungssequenz der IIS-Restriktionsendonuclease enthalten ist.
Das auf diese Weise erhaltene amplifizierte Gemisch von Fragmenten wird sodann erfindungsgemäß analysiert, d. h. gemäß den vorstehenden Stufen d) und e). Zu diesem Zweck wird in einer ersten Stufe das amplifizierte Gemisch mit der IIS-Endonuclease geschnitten. Dies ergibt im allgemeinen zwei Typen von IIS-geschnittenen Fragmenten, d. h. Fragmente, die den Adapter und einen Teil des ursprünglichen Restriktionsfragments umfassen; und Fragmente, die den Rest des ursprünglichen Restriktionsfragments umfassen (es ist darauf hinzuweisen, dass aufgrund der Tatsache, dass bei AFLP^R Adapter an beiden Seiten eines Restriktionsfragments gebunden sind, die Erfindung (für jedes amplifizierte Fragment) zwei IIS-geschnittene Fragmente mit einem Gehalt an einem Adapter (dies sich jeweils von einem Ende des amplifizierten Fragments ableiten) und ein IIS-geschnittenes Fragment, das den Rest des ursprünglichen Restriktionsfragments umfasst, liefern kann). Zu diesem Zweck können die AFLP-Adapter Erkennungsstellen von gleichen oder unterschiedlichen IIS-Restriktionsendonucleasen enthalten, wobei im Fall von verschiedenen IIS-Erkennungsstellen in den jeweiligen Adaptern eine anschließende Restriktion mit der oder den entsprechenden Typ-IIS-Restriktionsendonucleasen getrennt oder gleichzeitig durchgeführt werden kann.
Die IIS-geschnittenen Fragmente werden anschließend nachgewiesen. Wie beim vorstehend dargelegten allgemeinen Verfahren wird dies gemäß den Stufen e1) und e2) vorgenommen, d. h. durch Erzeugung von mindestens einem ssDNA-Fragment, das mindestens einem der dsDNA-IIS-geschnittenen Fragmente entspricht. Auch dieses ssDNA-Fragment ist wiederum von dem oder den IIS-geschnittenen Fragmenten, die die Adaptersequenz enthalten, abgeleitet. Einige bevorzugte, jedoch nicht-beschränkende Verfahren zum Nachweis der IIS-geschnittenen Fragmente und insbesondere zur Erzeugung der ssDNA-Fragmente aus den IIS-geschnittenen, amplifizierten ds-Fragmenten werden nachstehend beschrieben.
Im allgemeinen können nachweisbare ssDNA-Fragmente erzeugt werden, indem man die IIS-geschnittenen dsDNAs in ssDNA-Fragmente auftrennt und anschließend sämtliche auf diese Weise erhaltenen ssDNAs oder nur eine Untergruppe davon (die beispielsweise unter Anwendung einer geeigneten Trennstufe erzeugt worden ist) nachweist. Ein derartiges Verfahren ist zwar nicht vom Schutzumfang der Erfindung ausgeschlossen, ist aber aufwändig und zeitraubend und führt möglicherweise nicht zu der angestrebten Auflösung.
Daher wird das nachzuweisende ssDNA-Fragment vorzugsweise durch Verwendung einer Exonuclease erzeugt, die dazu herangezogen wird, sämtliche im Gemisch (das nach IIS-Restriktion erhalten worden ist) vorhandenen Aminosäuren abzubauen, mit Ausnahme des ssDNA-Strangs, der schließlich nachzuweisen ist.
Zu diesem Zweck muss das nachzuweisende ssDNA-Fragment gegenüber einem Abbau durch die verwendete Exonuclease beständig sein. Dies kann erreicht werden, indem man bei der Amplifikationsstufe c) einen Exonuclease-resistenten Primer verwendet, der während der Amplifikationsreaktion nicht in die amplifizierten Stränge (oder in einen davon) eingebaut wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Exonuclease-resistente Primer ferner eine Biotin-Markierung, die eine leichte Reinigung und Manipulation der amplifizierten Fragmente aufgrund ihrer Affinität gegenüber Streptavidin ermöglicht, wobei das letztgenannte Produkt an einen festen Träger, z. B. magnetische Kügelchen, gekuppelt werden kann.
Als Exonuclease können beliebige, an sich bekannte Exonucleasen verwendet werden. Vorzugsweise wird eine 5' → 3'-Exonuclease verwendet, wie T7-Gen-6-Exonuclease und λ-Exonuclease. Diese Exonucleasen und ihre Verwendung sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. aus WO-94/16090 und EP-0 744 470.
Der verwendete Primer ist gegenüber der verwendeten Exonuclease beständig. Beispielsweise im Fall einer T7-Gen-6-Exonuclease oder einer λ-Exonuclease enthält der Primer innerhalb seiner Sequenz üblicherweise ein und vorzugsweise mehrere Nucleotidderivate, die den Primer gegenüber der Exonuclease beständig machen. Diese können (ohne Beschränkung hierauf) Nucleotidderivate enthalten, bei denen ein oder zwei der nicht-brückenbildenden Sauerstoffatome des Phosphatrestes durch eine schwefelhaltige Gruppe, z. B. eine Phosphorthioatgruppe, durch eine Alkylgruppe, durch eine stickstoffhaltige Gruppe, z. B. eine Amingruppe, oder durch eine selenhaltige Gruppe ersetzt sind. Die Verwendung von Phosphorthioat-nucleotiden wird besonders bevorzugt. Bezüglich einer weiteren Beschreibung derartiger Exonuclease-resistenter Primer und ihrer Herstellung wird erneut auf WO-94/16090 und EP-0 744 470 verwiesen.
Bei der Amplifikationsstufe c) werden diese Exonuclease-resistenten Primer weiter gemäß den vorstehenden Angaben verwendet (d. h. in einer an sich für AFLP^R bekannten Art und Weise), wonach sie in die erhaltene, amplifizierte, ligierte dsDNA eingebaut werden, wodurch ein Strang davon gegenüber Exonuclease beständig gemacht wird. Wenn mehrere Amplifikationsstufen herangezogen werden, z. B. eine nicht-selektive Präamplifikation unter anschließender selektiver Amplifikation, soll der Exonuclease-resistente Primer in der letzten Amplifikationsstufe verwendet werden.
Die auf diese Weise erhaltene amplifizierte dsDNA wird sodann in Stufe d) mit der IIS-Restriktionsendonuclease im wesentlichen auf die vorstehend angegebene Weise geschnitten, um die erste und zweite IIS-geschnittene dsDNA zu erhalten. Aus diesem IIS-geschnittenen Gemisch kann dann in Stufe e1) eine zum Nachweis durch MALDI-TOF geeignete ssDNA durch Behandlung mit der geeigneten Exonuclease erzeugt werden, gegebenenfalls nach einer an sich bekannten Vorbehandlung der dsDNA, z. B. durch Wärmedenaturierung (eine derartige Vorbehandlung ist im allgemeinen nicht erforderlich, wenn T7-Gen-6-Exonuclease verwendet wird).
Dieser erfindungsgemäße Aspekt ist schematisch in 2 dargestellt, wobei (9) den Exonuclease-resistenten Primer bedeutet und die übrigen Ziffern im wesentlichen gemäß den Angaben zu 1 entsprechen. Aus der Erörterung der vorstehenden bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ersichtlich, dass es sich bei der ersten dsDNA (1) üblicherweise um ein Restriktionsfragment handelt, das durch Schneiden einer Ausgangs-DNA, z. B. einer genomischen DNA oder cDNA, mit (vorzugsweise) einem häufig schneidenden und einem selten schneidenden Enzym erhalten worden ist, während es sich bei der zweiten dsDNA (2) um einen AFLP^R-Adapter, der eine IIS-Erkennungsstelle enthält, handelt.
Bei der Ligationsstufe wird das Restriktionsfragment (1) mit einem Adapter (2) verknüpft, um eine ligierte dsDNA (4') bereitzustellen. (Üblicherweise wird ein zweiter AFLP^R-Adapter, der in 2 mit (10) bezeichnet ist, mit dem anderen Ende des Fragments (1) verknüpft. Dieser zweite Adapter (10) kann, wie nachstehend erörtert, (ebenfalls) eine IIS-Restriktionsstelle enthalten oder nicht.)
In Stufe c) wird anschließend die ligierte dsDNA (4) amplifiziert, wobei man einen Exonuclease-resistenten Primer (9) verwendet, der dem Adapter (2) entspricht. (Neben dem Exonuclease-resistenten Primer (9) wird üblicherweise ein zweiter Primer (in 2 nicht dargestellt) verwendet, der dem Adapter (10) entspricht.)
Nach der Amplifikation wird in Stufe d) das amplifizierte Gemisch mit dem geeigneten IIS-Restriktionsenzym behandelt. Wie in Stufe d) von 1 ergibt dies eine erste IIS-geschnittene dsDNA (6') und eine zweite IIS-geschnittene dsDNA (7').
Die erste IIS-geschnittene dsDNA (6') umfasst den Adapter (2) mit der IIS-Erkennungsstelle (3) und einen Teil (der Sequenz) des ursprünglichen Restriktionsfragments (1). Auch hier ist aufgrund der Anwesenheit des Exonuclease-resistenten Primers (9) ein Strang der ersten IIS-geschnittenen dsDNA (6') Exonuclease-resistent. Die zweite IIS-geschnittene dsDNA (7') umfasst den restlichen Teil der Sequenz des Restriktionsfragments (1) sowie den zweiten AFLP^R-Adapter (10) und ist gegenüber einem Abbau durch eine Exonuclease nicht resistent (es sei denn, der verwendete zweite Primer ist ebenfalls Exonuclease-resistent, wie beispielsweise nachstehend erörtert wird).
In Stufe e1) wird das Gemisch aus der IIS-Restriktion mit der Exonuclease behandelt. Dadurch werden sämtliche Nucleinsäuren im Gemisch, die nicht Exonuclease-resistent sind, entfernt, einschließlich die aus dsDNA (7') erhaltenen ssDNAs, der nicht-geschützte Strang von dsDNA (6') sowie (beispielsweise) die restlichen Restriktionsfragmente aus dem Ausgangsgemisch, die nicht amplifiziert worden sind. Dadurch verbleibt die Exonuclease-resistente ssDNA (8'), die sodann nachgewiesen werden kann.
Daher wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Stufe c) ein Exonuclease-resistenter Primer verwendet, vorzugsweise ein Exonuclease-resistenter Primer, der der zweiten dsDNA von Stufe b) entspricht, d. h. der dsDNA, die die IIS-Erkennungssequenz enthält. Ferner wird gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform in Stufe e1) eine ssDNA erzeugt, indem man mindestens das IIS-geschnittene Fragment (die Stränge davon), das die zweite dsDNA von Stufe b) (eine dieser entsprechende Sequenz) umfasst, mit einer Exonuclease behandelt. Vorzugsweise wird in Stufe e1) das gesamte IIS-geschnittene Gemisch, das nach Stufe d) erhalten worden ist, mit der Exonuclease behandelt.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung betrifft die Verwendung eines Primers, der gegenüber einer Exonuclease und insbesondere gegenüber einer 5' → 3'-Exonuclease, wie einer T7-Gen-6-Exonuclease und/oder einer λ-Exonuclease resistent ist, bei AFLP^R. Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, enthält der Primer üblicherweise auch eine Sequenz, die einer Erkennungsstelle einer IIS-Restriktionsendonuclease entspricht.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit zur Verwendung bei dem oder den vorerwähnten Verfahren, wobei das Kit (mindestens) folgendes umfasst:

– eine Restriktionsendonuclease vom IIS-Typ;
– mindestens einen dsDNA-Adapter, der mindestens eine Erkennungsstelle (eine entsprechende Sequenz) für die Restriktionsendonuclease von IIS-Typ umfasst, wobei sich die Erkennungsstelle in einer Position im dsDNA-Adapter befindet, die bewirken würde, dass die IIS-Restriktionsendonuclease eine dsDNA schneidet, wenn diese mit dem dsDNA-Adapter ligiert ist;
– mindestens einen Primer, der zur Hybridisierung mit mindestens einem Teil des dsDNA-Adapters befähigt ist;
– und gegebenenfalls weitere Komponenten für AFLP^RAFLP^R-Kits, die an sich bekannt sind.

Dieses Kit umfasst ferner vorzugsweise eine Exonuclease, insbesondere eine 5' → 3'-Exonuclease, wie eine T7-Gen-6-Exonuclease und eine λ-Exonuclease, wobei in diesem Fall mindestens einer der Primer, die im Kit vorhanden sind, vorzugsweise gegenüber dieser Exonuclease resistent ist. Beim Exonuclease-resistenten Primer im Kit kann es sich vorzugsweise um einen biotinylierten Primer handeln, wobei in diesem Fall das Kit ferner Streptavidin umfasst, das an einen festen Träger, z. B. an magnetische Kügelchen, gekuppelt ist.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass verschiedene Variationen und Verbesserungen der vorstehenden Methodik möglich sind, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Diese Variationen und Verbesserungen umfassen beispielsweise die folgenden Punkte:

– Das Restriktionsfragment (1) kann nicht nur mit einem, sondern mit zwei Adaptern, die eine IIS-Erkennungsstelle enthalten, verknüpft sein, d. h. so dass in 2 der "zweite" Adapter (10) ebenfalls eine IIS-Erkennungssequenz enthält (in 2 nicht dargestellt. Diese IIS-Erkennungssequenz im zweiten Adapter (10) kann auf die gleiche IIS-Endonuclease (verglichen mit der Erkennungssequenz im "ersten" Adapter (2)), abgestellt sein. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann ferner im wesentlichen auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, durchgeführt, abgesehen von der Tatsache, dass dann, wenn die Adapter (2) und (10) Erkennungssequenzen für verschiedene IIS-Endonucleasen enthalten, die ligierte dsDNA (4) in Stufe d) mit zwei IIS Endonucleasen geschnitten wird, d. h. gleichzeitig, nacheinander und/oder unabhängig. Dies führt zur Bildung von nachweisbaren Fragmenten, die sich von beiden Enden des ursprünglichen Restriktionsfragments (1) ableiten, d. h. vergleichbar zu Fragmenten (6)/(6'), (7) oder (8)/(8'), die voneinander unabhängig sind und die getrennt oder gleichzeitig nachgewiesen werden können, was die erfindungsgemäße Zuverlässigkeit und/oder Auflösung verbessert. Ferner kann der Nachweis von beiden Enden des Fragments für eine interne Referenz (Standard für den entsprechenden Marker) während des MS-Nachweises sorgen, was beim Nachweis von bestimmten wichtigen AFLP^R-Markern von Bedeutung sein kann. Ferner ist es klar, dass in der erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei der beide Enden eines Restriktionsfragments (1) nachgewiesen werden, üblicherweise zwei Exonuclease-resistente Primer für die Amplifikation verwendet werden, die jeweils einem der verwendeten Adapter (2) und (10) entsprechen.
– Beim Verfahren von 2 kann der Primer, der dem zweiten Adapter (10) entspricht, eine selektive Entfernung der zweiten IIS-geschnittenen dsDNA (7) ermöglichen. Diese Ausführungsform ist schematisch in 3 dargestellt, wobei (11) den Primer bedeutet, der dem zweiten Adapter (10) entspricht. Dieser Primer (11) trägt eine funktionelle Gruppe (12), die eine (selektive) Entfernung des Fragments (7) ermöglicht, z. B. eine Biotingruppe, die es erlaubt, das oder die Fragmente (7) selektiv an mit Streptavidin beschichtete Kügelchen (13) zu binden. Nach Entfernung der Fragmente (7) kann die erste IIS-geschnittene dsDNA (6), die im Überstand verbleibt, nachgewiesen werden, und zwar als dsDNA oder als entsprechende ssDNA. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass bei dieser Ausführungsform auch von Biotin/Streptavidin abweichende Gruppen, Liganden oder Bindungspaare verwendet werden können.
– In noch allgemeinerer Weise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren beliebige Verfahren, bei denen entweder das oder die ersten, IIS-geschnittenen dsDNA-Fragmente (6) oder das oder die zweiten, IIS-geschnittenen dsDNA-Fragmente (7) selektiv aus dem nach Stufe d) erhaltenen IIS-Restriktionsgemisch entfernt oder isoliert werden, wonach das oder die verbleibenden und/oder das oder die entfernten Fragmente nachgewiesen werden können.
– Ferner ist es möglich, aus der in Stufe d) erhaltenen ersten oder zweiten, IIS-geschnittenen dsDNA nicht eine, sondern zwei ssDNAs zu erzeugen, d. h. für/aus jedem einzelnen Strang. Bei dieser Ausführungsform können die beiden ssDNAs, die aus der gleichen IIS-geschnittenen dsDNA erzeugt worden sind, von unterschiedlicher Länge sein. Beispielsweise kann die ssDNA, die dem komplementären (d. h. "antisense") Strang entspricht, um zwei Basenpaare kürzer als die ssDNA sein, die dem kodierenden (d. h. "sense") Strang entspricht, und sie kann als interne Referenz oder Standard insbesondere zum Nachweis von spezifischen AFLP^R-Markern dienen.
– Wenn ferner Exonuclease-resistente Primer auf der Basis von Phosphorthioat-Bindungen verwendet werden, können die Position(en) dieser Bindungen so moduliert und/oder gewählt werden, dass die Primer nachweisbare ssDNA-Fragmente liefern, die in Bezug auf das Nachweisfenster der angewandten massenspektroskopischen Technik optimiert sind.
– Während der Amplifikationsstufe(n) kann eine Mismatch-Amplifikation angewandt/induziert werden, die bewirken kann, dass sich die IIS-Erkennungsstelle mit der Restriktionsstelle für das selten oder häufig schneidende Enzym überlappt. Auf diese Weise kann die Anzahl von Basen/Nucleotiden, die sich vom Restriktionsfragment ableiten (die die Unterschiede in der Masse oder der Sequenz, die nachgewiesen werden oder nachzuweisen sind, festlegen) erhöht werden, was zu einer weiteren Verbesserung der erzielbaren Auflösung führen kann.
– Gegebenenfalls können nach der IIS-Restriktionsstufe d) die dsDNA-Fragmente (z. B. die dsDNA-Fragmente (6) und/oder (7)) weiter mit einer oder mehreren zusätzlichen Restriktionsendonucleasen geschnitten werden, z. B. mit einer Kombination von verschiedenen "4-Schneidern", um spezifische, nachweisbare Fragmente (in Form eines Satzes) von unterschiedlicher Länge (und somit von unterschiedlicher Masse) bereitzustellen. Dies kann die Auflösung erhöhen und/oder die Anzahl der erhaltenen "einzigartigen" nachweisbaren Fragmente steigern.

Ferner kann gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die IIS-Restriktionsstufe d) durch eine Restriktion mit einer oder mehreren weiteren Restriktionsendonucleasen ersetzt werden z. B. durch eine Kombination von einem oder mehreren "4-Schneidern". Dies kann zu einem Satz von Restriktionsfragmenten führen, von denen eines, mehrere oder im wesentlichen sämtliche Fragmente anschließend in geeigneter Weise nachgewiesen werden, z. B. auf der Grundlage von Unterschieden in Bezug auf Masse, Größe, Gewicht oder Sequenz des oder der Fragmente. Dies kann erneut zu einer Erhöhung der Auflösung und/oder zu einer Erhöhung der Anzahl der erhaltenen "einzigartigen" nachweisbaren Fragmente führen.
Wie vorstehend erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse eines Gemisches von amplifizierten Restriktionsfragmenten, die unter Anwendung von AFLP^R erzeugt worden sind, verwendet werden. Als solches kann das erfindungsgemäße Verfahren für sämtliche Zwecke eingesetzt werden, für die herkömmliches AFLP^R (d. h. unter Beteiligung von Elektrophorese/Autoradiographie) und/oder Varianten oder Verbesserungen davon herangezogen werden.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse beliebiger Arten von Nucleinsäuresequenzen oder Gemischen von Nucleinsäuresequenzen eingesetzt werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) von Pflanzen abgeleitete Sequenzen, von Tieren abgeleitete Sequenzen, von Menschen abgeleitete Sequenzen, mikrobielle Sequenzen, Hefesequenzen, Sequenzen von Pilzen und Algen, virale Sequenzen sowie synthetische Sequenzen.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von DNA-Sequenzen verwendet werden, einschließlich genomischer DNA-, cDNA-, struktureller Gen-, regulatorischer Sequenzen und/oder Teilen davon; sowie von RNA, einschließlich mRNA, gegebenenfalls durch analoge Modifikation des vorstehend angegebenen Verfahrens. Eine spezielle Anwendungsmöglichkeit von Interesse kann im Nachweis von cDNA-AFLP^R-Fragmenten bestehen.
Bei diesen und anderen Anwendungsmöglichkeiten kann das erfindungsgemäße Verfahren für beliebige Zwecke eingesetzt werden, bei denen ein polymorpher Marker oder eine transkribierte Gensequenz verwendet und/oder identifiziert werden können. Dies umfasst (ohne Beschränkung hierauf) sämtliche Anwendungsmöglichkeiten, die im Stand der Technik für polymorphe Marker bei bekannten DNA-Fingerabdruck-, Genotypisierungs-, Transkript-Profilerstellungs- und DNA-Identifizierungstechniken beschrieben werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich selbstverständlich in besonderer Weise bei diesen Anwendungsmöglichkeiten, bei denen ein AFLP^R-Marker verwendet und/oder identifiziert werden kann, einschließlich der vorerwähnten und in EP-A-0 534 858 und in den gleichzeitig anhängigen europäischen Patentanmeldungen 98 202 549.6 und 98 202 451.5 erwähnten Anwendungsmöglichkeiten. Ferner kommt es in Betracht, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren neue genetische Marker identifizierbar sind. Dies stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu herangezogen werden, ein Individuum als ein Mitglied einer bestimmten Spezies, Unterspezies, Varietät, Züchtung, Rasse, Stamm oder Linie einzuordnen oder um die Vererbung von genetischen Merkmalen oder Eigenschaften zu untersuchen. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Markern verwendet werden, die für die Anwesenheit, die Abwesenheit oder den Zustand einer genetisch festgelegten oder genetisch beeinflussten Krankheit oder Störung sprechen, einschließlich Krebs, Onkogene und onkogene Mutationen, wobei in diesem Fall das erfindungsgemäße Verfahren für diagnostische Zwecke eingesetzt werden kann.
Mögliche Gebiete zur Anwendung umfassen daher (ohne Beschränkung hierauf) die Pflanzen- und Tierzucht, die Identifizierung von Varietäten oder Züchtungen, die diagnostische Medizin, die Diagnose von Krankheiten bei Pflanzen und Tieren, die Identifizierung von genetisch vererbten Krankheiten beim Menschen, die Analyse von familiären Beziehungen, die forensische Wissenschaft, Organtransplantationen, die Typisierung von Mikroorganismen und Viren, z. B. das Multiplex-Testen auf Stämme von infektiösen Krankheiten; sowie die Untersuchung von genetischen Vererbungen, Genexpressionen, Mutationen, Onkogenen und/oder Arzneistoffresistenz; oder für den mRNA-Nachweis.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren für den mit hohem Durchsatz ausgeführten Nachweis von einzelnen Nucleotid-Polymorphismen oder SNPs durchgeführt werden. Es ist zu erwarten, dass auf der Grundlage derartiger SNPs unter Verwendung von Assoziationsstudien wichtige Gene, die an Krankheiten des Menschen und/oder anderer Organismen beteiligt sind, identifiziert und/oder untersucht werden können. Die hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht eine Unterscheidung zwischen SNP-Allelen.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge einer spezifischen DNA, eines DNA-Fragments oder eines Markers, die in einer Ausgangsprobe vorhanden sind, verwendet werden. Beispielsweise kann bei der Transkript-Profilierung unter Verwendung von cDNA-AFLP^R das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge an cDNA in einer biologischen Probe herangezogen werden. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bereitstellung von quantitativen Daten bei Homozygot/Heterozygot-AFLP^R-Techniken herangezogen werden.
Neben den bereits vorstehend erwähnten Vorteilen ergeben sich einige weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens:

– Da das erfindungsgemäße Verfahren auf dem Nachweis der Masse oder der Sequenz der erzeugten Fragmente beruht, ergeben sich keine Störungen aus Kreuzhybridisierungseffekten, die bei Verfahren auf der Basis von Hybridisierung auftreten können, einschließlich bei Techniken auf Array-Basis.
– Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bestimmung oder quantitative Bewertung von spezifischen Markern, z. B. auf der Grundlage der Peakfläche und/oder der Peakhöhe.
– Die Verwendung von radioaktiven oder fluoreszierenden Markern ist nicht erforderlich (obgleich die geeignete Verwendung vom Schutzumfang der Erfindung nicht ausgeschlossen ist).
– Die Verwendung von Massemarkierungen ist nicht erforderlich (obgleich die geeignete Verwendung vom Schutzumfang der Erfindung nicht ausgeschlossen ist).
– Bei den meisten Ausführungsformen umfasst die Erfindung nur enzymatische Stufen. Diese können in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden und/oder lassen sich leicht automatisieren.
– Im Gegensatz zu Nachweistechniken auf Gelbasis können AFLP^R-Marker sämtlicher Größen nachgewiesen werden. Hierzu gehören Fragmente/Marker von Größen, die unter Verwendung derzeitiger gelelektrophoretischer Techniken nicht leicht nachgewiesen werden können, z. B. Fragmente/Marker mit 600 Basenpaaren oder mehr.
– Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht einen hohen Durchsatz. Ferner können Ergebnisse für eine spezifische Probe rasch gewonnen werden.
– Im Prinzip kann die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines einzelnen Peaks im erzeugten Massenspektrum oder Chromatogramm bereits einen Hinweis auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Markers oder cDNA-AFLP^R-Fragments von Interesse darstellen.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, die schematisch in 6 dargestellt ist, werden Oligonucleotide, die sich für einen Nachweis unter Verwendung von MALDI-TOF und/oder unter Verwendung einer anderen der vorerwähnten Techniken eignet, unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease erzeugt, die dazu befähigt ist, eine Ausgangsnucleinsäure (in 6 mit (14) bezeichnet) an zwei Stellen zu schneiden, insbesondere an zwei Stellen, die sich von der Erkennungsstelle unterscheiden, und insbesondere an einer Stelle, die sich strangaufwärts von der oder den erkannten Sequenzen befindet, und einer Stelle, die sich strangabwärts von der oder den erkannten Sequenzen befindet. (In 6 ist die Erkennungsstelle mit (15) bezeichnet und die beiden geschnittenen Stellen sind mit (16) bzw. (17) bezeichnet.
Nachstehend sind einige nicht-beschränkende Beispiele für derartige "doppelt schneidende" Restriktionsendonucleasen aufgeführt:

– BaeI, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– BcgI, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– BplI, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– Bsp24I, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– CjeI, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– CjePI, das die folgende Erkennungssequenz aufweist:
– und AloI und Hin4I, worunter BcgI bevorzugt wird, und zwar aufgrund der Tatsache, dass nur zwei Basenüberhänge erzeugt werden, was die Spezifität der Ligation der zweiten dsDNA an die erste dsDNA verbessert.

Somit wird es durch Schneiden einer Ausgangsnucleinsäure, z. B. einer dsDNA, insbesondere einer genomischen DNA oder cDNA, mit einer derartigen "doppelt schneidenden" Restriktionsendonuclease möglich, ein oder mehr Fragmente mit einer Länge/Größe zwischen 20–50, üblicherweise zwischen 30–40 Basenpaaren und häufig mit 34 oder 36 Basenpaaren zu erzeugen. Diese Fragmente, die in 6 mit (18) bezeichnet sind, enthalten üblicherweise die Erkennungsstelle(n)/Sequenz(en) (10) der verwendeten Restriktionsendonuclease sowie etwa 30 (je nach der verwendeten Restriktionsendonuclease) "unbekannte" Basen, die vollständig von der verwendeten Ausgangsnucleinsäure abhängig sind. Somit sind diese Fragmente neben der Tatsache, dass sie eine für den Nachweis durch MALDI-TOF und/oder eine der übrigen vorstehend erwähnten Techniken geeignete Größe aufweisen, auch spezifisch/repräsentativ für die Ausgangsnucleinsäure (14).
Üblicherweise schneiden bei Verwendung einer von Pflanzen abgeleiteten DNA als Ausgangsnucleinsäure (14) derartige "doppelt schneidende" Restriktionsendonucleasen die DNA mit einer Häufigkeit von etwa 1-mal pro 3 000 Basenpaaren. Somit liefert dies im allgemeinen ein Gemisch der vorerwähnten "kleinen" Restriktionsfragmente (18) und "großen" Restriktionsfragmente. Diese großen Fragmente, die in 6 mit (19) bezeichnet sind, weisen üblicherweise eine Größe von mehreren Hundert bis sogar 1 000 Basenpaaren und durchschnittlich von etwa 2 000 bis 3 000 Basenpaaren auf und enthalten üblicherweise keine Sequenz, die der oder den Erkennungsstellen/Sequenzen der verwendeten Restriktionsendonuclease entspricht.
Im Prinzip ist es möglich, eines oder mehrere – oder im wesentlichen alle – der Fragmente (18) und/oder (19), die in dem auf diese Weise geschnittenen Gemisch vorhanden sind, nachzuweisen und insbesondere eines oder mehrere – oder im wesentlichen alle – der kleinen Fragmente (18), gegebenenfalls nach Isolation des oder der Fragmente (18) aus dem geschnittenen Gemisch und/oder nach selektiver Entfernung der großen Fragmente (19) nachzuweisen.
Erfindungsgemäß wird jedoch das geschnittene Gemisch insbesondere zunächst amplifiziert, wobei es besonders bevorzugt ist, mindestens eine selektive Amplifikationsstufe vorzunehmen, um die Komplexität des Fragmentgemisches zu verringern. Anschließend werden gemäß diesem bevorzugten Verfahren eines oder mehrere – oder im wesentlichen alle – der amplifizierten Fragmente (18) und/oder (19) und insbesondere eines oder mehrere der amplifizierten kleinen Fragmente (18) nachgewiesen, z. B. bei der Anwendung von MALDI-TOF und/oder einer der übrigen vorerwähnten Nachweistechniken.
Eine derartige Amplifikation wird vorzugsweise unter Anwendung der bekannten AFLP^R-Methodik durchgeführt, d. h. durch Ligation der im geschnittenen Gemisch vorhandenen Fragmente, d. h. sowohl der kleinen Fragmente (18) als auch der großen Fragmente (19), an mindestens einen Adapter und durch anschließende Amplifikation der Gemische unter Verwendung von Primern, die zum Einsatz mit diesen Adaptern geeignet sind. (In 6 sind die Adapter mit (20) und die Primer mit (21) bezeichnet. Dieser Vorgang kann im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben und unter anderem gemäß EP-A-0 534 858 durchgeführt werden.) Ferner kann diese Amplifikation eine einzige Amplifikationsstufe oder mehrere Amplifikationsstufen umfassen. Wie bereits erwähnt, wird mit dem Ziel, die Komplexizität des Gemisches zu verringern, bei mindestens einer der Amplifikationsstufen ein Primer verwendet, der mindestens ein selektives Nucleotid enthält, wie aus der AFLP^R-Methodik bekannt ist. Beispielsweise kann eine Kombination aus einer nicht-selektiven Präamplifikation und einer oder mehreren selektiven Amplifikationen herangezogen werden, oder eine Kombination von mehreren selektiven Amplifikationsstufen, wobei jeweils Primer mit einer zunehmenden Anzahl von selektiven Nucleotiden verwendet werden, wie es im nachstehenden Beispiel III beschrieben ist. Um bei einer Amplifikation, die mehrere Amplifikationsstufen umfasst, Fehlpaarungen zu vermeiden, wird vorzugsweise die Anzahl an selektiven Nucleotiden für jede Amplifikationsrunde nicht um mehr als 1 oder 2 erhöht.
Ferner wird bei der Amplifikation vorzugsweise ein Gemisch von mindestens zwei Adaptern verwendet, insbesondere von Adaptern mit unterschiedlichen Adapter-Kern-Sequenzen (in 6 nicht dargestellt). Mit diesen Adaptern wird insbesondere auch ein Gemisch von mindestens zwei Primern, die zur Anwendung mit diesen Adaptern geeignet sind, verwendet (ebenfalls in 6 nicht dargestellt).
Ferner werden vorzugsweise die Amplifikationsbedingungen so gewählt, dass die Adapter-ligierten "kleinen" Fragmente (18) in wirksamerer Weise als die Adapter-ligierten "großen" Fragmente (19) amplifiziert werden, z. B. unter Anwendung eines Amplifikationsprofils (z. B. Zeit, Temperatur), das ausreicht, eine vollständige Elongation des oder der Primer (21) entlang der Adapter-ligierten kurzen Fragmente (18) zu ermöglichen, jedoch nicht ausreicht, um eine vollständige Elongation des oder der Primer (21) entlang der Adapter-ligierten großen Fragmente (19) zu ermöglichen.
Nach der Amplifikation wird ein amplifiziertes Gemisch erhalten, das zum überwiegenden Teil aus den amplifizierten, Adapter-ligierten "kleinen" Fragmenten (in 6 mit (22) bezeichnet) und den amplifizierten Adapter-ligierten "großen" Fragmenten (in 6 mit (23) bezeichnet), besteht. Dieses amplifizierte Gemisch kann sodann auf an sich bekannte Weise analysiert werden, d. h. durch (spezifischen) Nachweis von einem oder mehreren – oder im wesentlichen allen – der amplifizierten, Adapter-ligierten "kleinen" Fragmente (22), von einem oder mehreren – oder im wesentlichen allen – der amplifizierten, Adapter-ligierten "großen" Fragmente (23) oder einer Kombination davon, nachdem gegebenenfalls die Adaptersequenzen durch Verdau mit dem "doppelt schneidenden" Restriktionsenzym entfernt worden sind, um die Auflösung des Nachweises zu verbessern.
Vorzugsweise werden eines oder mehrere – oder im wesentlichen alle – der amplifizierten, Adapter-ligierten "kleinen" Fragmente (22) nachgewiesen, z. B. unter Anwendung von Massenspektroskopie, wie MALDI-TOF, und/oder einer der übrigen vorerwähnten Techniken, z. B. einer chromatographischen Technik; oder einer geeigneten Kombination davon. Zu diesem Zweck wird die Länge der bei der oder den Amplifikationsstufen verwendeten Adapter (20)/Primer (21) vorzugsweise so gewählt, dass die erhaltenen amplifizierten, Adapter-ligierten "kleinen" Fragmente (22) immer noch eine für einen derartigen Nachweis geeignete Größe aufweisen, beispielsweise gemäß den vorstehenden Angaben. Wenn herkömmliche AFLP-Adapter und -Primer verwendet werden, z. B. mit einer Länge von etwa 10–30 Basenpaaren, ist dies im allgemeinen der Fall, d. h. es ergeben sich beispielsweise amplifizierte, Adapter-ligierte "kleine" Fragmente (22) mit 50 bis 100 bp, vorzugsweise mit 60 bis 80 bp und üblicherweise mit etwa 70 bp.
Auch hier können wie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren ein oder mehr Adapter-ligierte kleine Fragmente (22) als doppelsträngige Fragmente (wie sie beispielsweise direkt nach der Amplifikation erhalten werden oder als einzelsträngige Sequenzen, die aus den amplifizierten, doppelsträngigen Fragmenten (22) erzeugt worden sind, nachgewiesen werden (in 6 nicht dargestellt).
Vor dem Nachweis können das eine oder die mehreren Adapter-ligierten kleinen Fragmente (22), die nachzuweisen sind, (spezifisch) aus dem amplifizierten Gemisch isoliert werden. Beispielsweise können das eine oder die mehreren Adapter-ligierten kleinen Fragmente (22) von dem oder den Adapter-ligierten "großen" Fragmenten (23) und/oder beliebigen anderen Fragmenten/Komponenten, die im amplifizierten Gemisch enthalten sind, abgetrennt werden oder das oder die Adapter-ligierten "großen" Fragmente (23) können (selektiv) aus dem amplifizierten Gemisch entfernt werden.
Dies kann in einer beliebigen geeigneten Art und Weise durchgeführt werden, beispielsweise unter Anwendung einer geeigneten Trenntechnik, z. B. einer Technik, die auf dem oder den Unterschieden in Bezug auf die Größe zwischen den kleinen Fragmenten (22) und den großen Fragmenten (23) beruht. Alternativ können Primer (22) bei der Amplifikation verwendet werden, die eine (selektive) Isolierung der amplifizierten Fragmente ermöglichen. Beispielsweise kann bei der letzten Amplifikationsstufe ein Primer (21) verwendet werden, der eine Biotingruppe trägt, was es ermöglicht, die amplifizierten Fragmente selektiv unter Verwendung eines mit Streptavidin beschichteten Trägers zu isolieren, z. B. unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen (in 6 nicht dargestellt).
Ferner kann gegebenenfalls bei der (letzten) Amplifikation (Amplifikationsstufe) ein Satz von Primern verwendet werden, die jeweils unterschiedliche Massen aufweisen. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Analyse von verschiedenen Primerkombinationen ohne Überlappung zwischen den Massen der verschiedenen Fragmente/Oligonucleotide.
Dieser Aspekt der Erfindung führt im allgemeinen zu den gleichen Vorteilen, wie sie vorstehend erwähnt wurden. Insbesondere ist eine kurze Zeit für den Nachweis erforderlich, was einen hohen Durchsatz ermöglicht. Ferner besteht keine Notwendigkeit sich einer Autoradiographie und/oder radioaktiver/fluoreszierender Markierungen zu bedienen, und es werden Oligonucleotide erhalten, die spezifisch für die Ausgangsnucleinsäure sind und die unter Anwendung einer Nachweistechnik, die auf (Unterschieden) der Masse beruhen, analysiert werden können.
Ferner bietet dieser Aspekt der Erfindung im Vergleich zum vorstehend beschriebenen Verfahren die folgenden weiteren Vorteile:

– Aus der Ausgangsnucleinsäure (14) leitet sich ein höherer Anteil ab – d. h. im wesentlichen der Gesamtheit im Fall eines Verdaus der amplifizierten, ligierten Restriktionsfragmente mit der "doppelt schneidenden RE" – der Nucleotide in den amplifizierten "kleinen" Fragmenten (18), die schließlich nachgewiesen werden, z. B. als amplifizierte Fragmente (22). Diese umfassen im allgemeinen die Nucleotide, die der Erkennungssequenz (17) der verwendeten "doppelt schneidenden" Restriktionsendonuclease entsprechen, sowie die etwa 30 "unbekannten" Nucleotide, die in den kleinen Fragmenten (18) vorhanden sind. Dies bedeutet nicht nur, dass die Unterschiede in der Masse zwischen den einzelnen, nachzuweisenden Oligonucleotiden (22) zunehmen, sondern dass auch die Chancen, dass unterschiedliche Fragmente (18)/(22) die gleiche Masse (aber beispielsweise nur eine unterschiedliche Nucleotidsequenz) aufweisen, verringert werden, z. B. auf 3% oder weniger. Dadurch werden die Empfindlichkeit und/oder Auflösung verbessert.
– Die bei der Amplifikation verwendeten Primer sind vom verwendeten Restriktionsenzym unabhängig.

Somit betrifft dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen und gegebenenfalls zum Nachweisen eines Oligonucleotids, wobei das Verfahren mindestens die folgenden Stufen umfasst:

a) Bereitstellung einer dsDNA;
b) Restriktion der dsDNA mit mindestens einer Restriktionsendonuclease, die die dsDNA an zwei Stellen, die sich von der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuclease unterscheiden, schneidet, um ein Gemisch von geschnittenen Fragmenten bereitzustellen, wobei das Gemisch ein oder mehr Fragmente, die die Erkennungsstellen/Sequenz(en) der Restriktionsendonuclease enthalten, und ein oder mehr Fragmente, die keine Sequenz, die den Erkennungsstelle(n)/Sequenz(en) der verwendeten Restriktionsendonuclease entspricht, enthalten, umfasst; und
d) Nachweis mindestens eines der in Stufe b) erhaltenen geschnittenen Fragmente.

In der Stufe (d) werden vorzugsweise ein oder mehr (oder im wesentlichen alle) der Fragmente, die die Erkennungsstelle(n)/Sequenz(en) der Restriktionsendonuclease enthalten, nachgewiesen, gegebenenfalls nach (spezifischer) Isolierung dieser (eines oder mehrerer) Fragmente aus dem in Stufe b) erhaltenen Gemisch.
Vorzugsweise umfasst dieses Verfahren die folgenden Stufen:

a) Bereitstellung einer dsDNA;
b) Restriktion der dsDNA mit mindestens einer Restriktionsendonuclease, die die dsDNA an zwei Stellen, die sich von der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuclease unterscheiden, schneidet, um ein Gemisch von geschnittenen Fragmenten bereitzustellen, wobei das Gemisch ein oder mehr Fragmente, die die Erkennungsstelle(n)/Sequenz(en) der Restriktionsendonuclease enthält, und ein oder mehr Fragmente, die keine Sequenz, die den Erkennungsstelle(n)/Sequenz(en) der verwendeten Restriktionsendonuclease entspricht, enthalten, umfasst; und
c) Amplifikation des Gemisches der in Stufe b) erhaltenen Fragmente;
d) Nachweis von mindestens einem der in Stufe c) erhaltenen amplifizierten Fragmente oder gegebenenfalls nach Verdau der amplifizierten Fragmente mit der "doppelt schneidenden RE", um die Adaptersequenzen zu entfernen.

In der Stufe (d) werden vorzugsweise ein oder mehr (oder im wesentlichen alle) der amplifizierten Fragmente nachgewiesen, die die Erkennungsstelle/Sequenz(en) der Restriktionsendonuclease enthalten, gegebenenfalls nach spezifischer Isolierung dieser (eines oder mehrerer) Fragmente aus dem in Stufe c) erhaltenen amplifizierten Gemisch. Vorzugsweise sind der oder die in der Amplifikationsstufe (c) verwendeten Primer biotinyliert, so dass die Fragmente aus dem amplifizierten Gemisch unter Verwendung von Streptavidin an einem festen Träger, z. B. an magnetischen Kügelchen, isoliert werden können.
Die Amplifikation von Stufe c) wird vorzugsweise unter Anwendung der AFLP^R-Methodik, wie sie beispielsweise vorstehend beschrieben wurde, durchgeführt. Der Nachweis von Stufe d) wird vorzugsweise unter Anwendung von Massenspektroskopie, wie MALDI-TOF, oder einer chromatographischen Technik, wie Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC); oder unter Anwendung einer geeigneten Kombination einer chromatographischen Technik und einer massenspektroskopischen Technik, z. B. Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS), durchgeführt.
Bezüglich weiterer bevorzugter Umstände und Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung wird auf die vorstehende allgemeine Beschreibung verwiesen.
Nachstehend wird die Erfindung anhand des folgenden, nicht-beschränkenden experimentellen Teils erläutert.
Experimenteller Teil
Beispiel I
AFLP-Fingerprints, hergestellt mit AFLP-Adaptern und selektiven Amplifikationsprimern, die eine Erkennungsstelle für die Restriktionsenzyme vom Typ IIS GsuI oder BsgI enthalten.
AFLP-Fingerprints, erzeugt mit den standardmäßigen AFLP-Adaptern und selektiven Amplifikationsprimern, die keine Typ-IIS-Stelle enthalten, werden als Kontrollen mitgeführt.
1. Biologisches Material
Bei den verwendeten biologischen Materialien handelt es sich um die parentalen Linien einer Population von rekombinanten Inzuchtlinien von Arabidopsis. Bei diesen parentalen Linien handelt es sich um die Ökotypen Colombia (Probe Nr. NW20) und Landsberg erecta (Probe Nr. N933). Sie wurden vom Arabidopsis-Aufbewahrungszentrum in Nottingham (UK) bezogen.
2. EcoRI/MseI-AFLP-Matrizen-Präparation, Präamplifikation und selektive Amplifikation
Sämtliche Maßnahmen wurden gemäß standardmäßigen Verfahren (Vos et al., Nucleic Acids Research, Bd. 23, Nr. 21, S. 4407–4414 und EP-A-0 534 858) durchgeführt. AFLP-Reaktionen wurden mit ³³P radioaktiv markiert und an einem standardmäßigen AFLP-Sequenz-Gel aufgetrennt. Die Sequenzen der Adapter, der Präamplifikationsprimer und der selektiven Amplifikationsprimer sind nachstehend angegeben.
2.1 Standardmäßiges AFLP-Verfahren (4, Bahnen 1 und 2):
EcoRI-Adapter:

91M35: 5'-ctcgtagactgcgtacc-3' (SEQ ID NO. 1) und
91M36: 3'-catctgacgcatggttaa-5' (SEQ ID NO. 2)

EcoRI +1 Präamplifikationsprimer:

E01K: 5'-gactgcgtaccaattca-3' (SEQ ID NO. 3)

EcoRI + 2 selektiver Amplifikationsprimer:

E12: 5'-gacctgcgtaccaattcac-3' (SEQ ID NO. 4)

MseI-Adapter:

92A18: 5'-gacgatgagtcctgag-3' (SEQ ID NO. 5)
92A19: 3'-tactcaggactcat-5' (SEQ ID NO. 6)

MseI + 1 Präamplifikationsprimer:

M02: 5'-gatgagtcctgagtaac-3' (SEQ ID NO. 7)

MseI + 3 selektiver Amplifikationsprimer:

M47: 5'-gatgagtcctgagtaacaa-3' (SEQ ID NO. 8)

2.2 AFLP-Fingerprints, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer GsuI-Stelle (5'-3' CTGGAG N₁₆/N₁₄). (4, Bahnen 3 und 4).
EcoRI-Adapter, Präamplifikations-AFLP-Primer und selektiver AFLP-Primer: bezüglich der Sequenz wird auf 2.1 verwiesen.
MseI-Adapter:

99I21: 5'-gacgatgagtctggag-3' (SEQ ID NO. 9)
99I22: 5'-tactccagactcat-3' (SEQ ID NO. 10)

MseI +1-Präamplifikationsprimer:

99I23: 5'-gacgatgagtctggagtaac-3' (SEQ ID NO. 11)

MseI + 3 selektiver Amplifikationsprimer:

99I25: 5'-gacGATGAgtctggagtaacaa-3' (SEQ ID NO. 12)

(Die in Großbuchstaben dargestellten Nucleotide sind durch Phosphorthioat-Bindungen verbunden, um Resistenz gegen T7-Gen-6-Exonuclease zu verleihen).
2.3 AFLP-Fingerprints, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer BsgI-Stelle (5'-3' GTGCAG N₁₆/N₁₄). (4, Bahnen 5 und 6)
EcoRI-Adapter, Präamplifikations-AFLP-Primer und selektiver AFLP-Primer: bezüglich der Sequenzen wird auf 2.1 verwiesen.
MseI-Adapter:

99I37: 5'-gacgatgagtgtgcag-3' (SEQ ID NO. 13)
99I38: 5'-tactgcacactcat-3' (SEQ ID NO. 14)

MseI +1-Präamplifikationsprimer

99I40: 5'-tactgcacactcat-3' (SEQ ID NO. 14))

MseI + 3 selektiver Amplifikationsprimer:

99I41: 5'-gacGATGAgtgtgcagtaacaa-3' (SEQ ID NO. 16)

(Die in Großbuchstaben dargestellten Nucleotide sind durch Phosphorthioat-Bindungen verbunden, um Resistenz gegen T7-Gen-6-Exonuclease zu verleihen).
3. Ergebnisse
4 zeigt, dass sehr ähnliche Fingerabdrücke erhalten werden, wenn standardmäßige AFLP-Adapter und -Primer verwendet werden (Bahnen 1 und 2) oder wenn AFLP-Adapter und -Primer verwendet werden, die eine GsuI-Stelle (Bahnen 3 und 4) oder eine BsgI-Typ IIS-Stelle (Bahnen 5 und 6) enthalten.
Die Bahnen 1, 3 und 5 enthalten die EcoRI/MseI +2/+3-Fingerabdrücke, die sich von der Probe N933 ableiten.
Die Bahnen 2, 4 und 6 enthalten die EcoRI/MseI +2/+3-Fingerabdrücke, die sich von der Probe NW20 ableiten.
(Die +2/+3-selektiven Nucleotide sind in sämtlichen Fällen die gleichen (Bahnen 1–6) und entsprechen dem EcoRI-Primer E12 (+AC) und dem MseI-Primer M47 (+CAA).
Die Bahn 7 enthält eine Leiter mit 10 Basenpaaren als Größenstandard.
Beispiel II:
Restriktionsenzymverdau von AFLP-Reaktionen, erzeugt mit einem MseI-AFLP-Adapter und -Amplifikationsprimer mit einem Gehalt an einer Typ IIS-Restriktionsenzymstelle
1. Biologisches Material
Beim verwendeten biologischen Material handelt es sich um zwei rekombinante Inzuchtlinien (RIL) von Arabidopsis (Proben Nr. 1923 und 1904). Bei den parentalen Linien der RIL-Population handelt es sich um die Ökotypen Colombia und Landsberg erecta. Die RIL wurden vom Arabidopsis-Aufbewahrungszentrum in Nottingham (UK) bezogen.
2. EcoRI/MseI-AFLP-Matrizenherstellung, Präamplifikation und selektive Amplifikation
Sämtliche Maßnahmen wurden gemäß standardmäßigen Verfahren (Vos et al., Nucleic Acids Research, Bd. 23, Nr. 21, S. 4407–4414 und EP-A-0 534 858) durchgeführt. Die Sequenzen der Adapter, Präamplifikationsprimer und selektiven Amplifikationsprimer entsprechen den Angaben von Beispiel I mit folgenden Ausnahmen:
2.1 Standardmäßige AFLP-Amplifikation:
Der selektive Amplifikationsprimer M47 wurde ersetzt durch den Primer
M50: 5'-gatgagtcctgagtaacat-3 (SEQ ID NO. 17)
2.2 AFLP-Fingerabdrücke, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer GsuI-Stelle
Der +3 MseI-selektive Amplifikationsprimer I25 wurde ersetzt durch den Primer
I32: 5'-gacgATGAGtctggagtaacag-3' (SEQ ID NO. 18)
(Die in Großbuchstaben dargestellten Nucleotide sind durch Phosphorthioat-Bindungen verbunden, um Resistenz gegen T7-Gen-6-Exonuclease zu verleihen).
2.3 AFLP-Fingerabdrücke, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP- Primern mit einem Gehalt an einer BsgI-Stelle
Der +3 MseI-selektive Amplifikationsprimer I41 wurde ersetzt durch den Primer
I48: 5'-gacgATGAGtgtgcagtaacat-3' (SEQ ID NO. 19)
(Die in Kleinbuchstaben dargestellten Nucleotide sind durch Phosphorthioat-Bindungen verbunden, um Resistenz gegen T7-Gen-6-Exonuclease zu verleihen).
3. Durchführung von AFLP-Reaktionen mit doppelsträngigen Fragmenten
Nach der selektiven Amplifikationsreaktion gemäß dem standardmäßigen Verfahren in einem Volumen von 20 μl mit Primersequenzen, die in den Abschnitten 2.1, 2.2 und 2.3 beschrieben sind, wurde eine identische Menge von 20 μl selektiven Amplifikationsreagenzien zugesetzt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 40 μl ergab. Ein zusätzlicher Zyklus einer PCR-Amplifikation wurde mit dem Thermozyklusprofil 30 sec 94°C, 30 sec 56°C und 4 min 72°C durchgeführt, um sämtliche AFLP-Fragmente in doppelsträngige DNA umzuwandeln.
4. Restriktionsenzymverdau
Im Anschluss an die Herstellung von doppelsträngigen AFLP-Reaktionsgemischen gemäß den Angaben in den vorstehenden Abschnitten 2 und 3 wurde eine 5 μl-Probe aus jedem Röhrchen vor dem Restriktionsenzymverdau als Kontrolle entnommen. Der restliche Inhalt der einzelnen Röhrchen (Volumen 35 μl) wurde mit 15 μl Restriktionsligationspuffer versetzt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 50 μl ergab. 5 μl GsuI- oder BsgI-Restriktionsenzym wurde zu den AFLP-Reaktionsgemischen, die mit den entsprechenden AFLP-Adapter- und Primersequenzen hergestellt worden waren, gegeben. Die Proben wurden 110 Minuten bei 37°C (BsgI) oder 30°C (GsuI) inkubiert. Nach dem Restriktionsenzymverdau wurde eine weitere Aliquotmenge von 5 μl entnommen, mit Aufsetzfarbstoff vermischt und zusammen mit den unverdauten Kontrollproben auf ein 18%-Polyacrylamidgel aufgesetzt.
5. Ergebnisse
5 enthält folgende Angaben:
AFLP-Reaktionsgemische, hergestellt mit eine GsuI-Stelle enthaltenden MseI-Adaptern und AFLP-Primern:
Bahn 1: Probe 1923, AFLP-Reaktion E12/I32 (GsuI-Stelle) vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 2: Probe 1904, AFLP-Reaktion E12/I32 (GsuI-Stelle) vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 3: Probe 1923, AFLP-Reaktion E12/I32 (GsuI-Stelle) nach Restriktionsenzymverdau.
Bahn 4: Probe 1904, AFLP-Reaktion E12/I32 (GsuI-Stelle) nach Restriktionsenzymverdau.
AFLP-Reaktionsgemische, hergestellt mit eine BsgI-Stelle enthaltenden MseI-Adaptern und AFLP-Primern:
Bahn 5: Probe 1923, AFLP-Reaktion E12/I48 (BsgI-Stelle) vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 6: Probe 1904, AFLP-Reaktion E12/I48 (BsgI-Stelle) vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 7: Probe 1923, AFLP-Reaktion E12/I48 (BsgI-Stelle) nach Restriktionsenzymverdau.
Bahn 8: Probe 1904, AFLP-Reaktion E12/I48 (BsgI-Stelle) nach Restriktionsenzymverdau.
Standardmäßige AFLP-Reaktionen
Bahn 9: Probe 1923, standardmäßige AFLP-Reaktion E12/M50 vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 10: Probe 1904, standardmäßige AFLP-Reaktion E12/M50 vor Restriktionsenzymverdau.
Bahn 11: Probe 1923, standardmäßige AFLP-Reaktion E12/M50 nach Restriktionsenzymverdau.
Bahn 12: Probe 1904, standardmäßige AFLP-Reaktion E12/M50 nach Restriktionsenzymverdau.
Größenleiter:
Bahn 13: enthält eine Größenleiter mit 10 Basenpaaren als Standard für die Fragmentgröße.
5 zeigt folgendes:

1) Ein starkes Fragment von 32 Basen in den Bahnen 3 und 4, wie erwartet nach Verdau mit GsuI.
2) Ein starkes Fragment mit 32 Basen in den Bahnen 7 und 8 wie erwartet nach Verdau mit BsgI.
3) Kein Restriktionsfragment mit 32 Basen in den übrigen Bahnen (Proben vor Verdau mit GsuI oder BsgI oder in einer der Bahnen 9–12, die die standardmäßigen AFLP-Reaktionsgemische enthalten).

Somit zeigt 5, dass doppelsträngige AFLP-Oligotags durch Herstellung von AFLP-Matrizen mit Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer BsgI- oder GsuI-Stelle und Verdau von AFLP-Reaktionsgemischen mit einem Gehalt an doppelsträngigen DNA-Fragmenten mit diesen Restriktionsenzymen erzeugt werden können.
Beispiel III:
Erzeugung von spezifischen nachweisbaren Oligonucleotiden unter Verwendung einer "doppelt schneidenden" Restriktionsendonuclease
Genomische DNA wird unter Verwendung von BcgI verdaut, um ein Gemisch bereitzustellen, das kleine Fragmente mit der oder den BcgI-Erkennungssequenzen sowie große Fragmente ohne einen Gehalt an einer derartigen BcgI-Erkennungsstelle enthält. Die Fragmente mit einem Gehalt an der BcgI-Erkennungsstelle können schematisch folgendermaßen wiedergegeben werden:
Das Gemisch von Fragmenten wird mit zwei verschiedenen Adaptern (Adapter X: xxxxxNN, Adapter Y: yyyyyNN), die jeweils eine verschiedene Kernsequenz aufweisen, ligiert und amplifiziert. Der untere Strang unterliegt keiner Ligation, wird aber während der ersten Amplifikationsstufe "aufgefüllt". Dies liefert Fragmente, die an ihren jeweiligen Termini die Adapter X-X, X-Y, Y-X oder Y-Y aufweisen.
Die Komplexizität des Gemisches wird durch Amplifikation mit Primern mit einem Gehalt an selektiven Nucleotiden verringert. Um eine Fehlpaarung zu verringern, werden Amplifikationen durchgeführt, bei denen die Anzahl an selektiven Nucleotiden, die bei jeder Amplifikationsstufe verwendet werden, nicht um mehr als 1 oder 2 pro Amplifikationsstufe erhöht wird. Nur die Fragmente mit verschiedenen Adaptern an beiden Termini unterliegen einer exponentiellen Amplifikation. Gegebenenfalls werden für eine letzte +ATG/+CGA-Erweiterung 2 oder 3 aufeinanderfolgende Amplifikationen durchgeführt. Bei der letzten Amplifikationsstufe wird ein Primer mit einem Biotin-Molekül ("bio") markiert.
Die Fragmente werden unter Verwendung von Streptavidin-Kügelchen gereinigt. Die Oligonucleotid-Markierungen werden durch Behandlung der Kügelchen mit Alkali oder durch Wärmedenaturierung isoliert. Die Markierungen werden im Überstand der Alkali- oder Wärmebehandlung erhalten.
Die Oligonucleotid-Markierungen werden unter Anwendung von Massenspektroskopie analysiert, z. B. durch Bestimmung der Masse der Markierungen mit einer Länge von 70 Nucleotiden, gegebenenfalls nach Verdau mit BcgI, um nicht-informative Adaptersequenzen zu entfernen, was zu einer höheren Auflösung beim Nachweis der erhaltenen Markierungen mit einer Länge von 32 Nucleotiden führt.
Dieses Verfahren kann folgendermaßen durchgeführt werden:
Die DNA-Matrize wird durch Verdau von 200–500 ng genomischer DNA mit 5 Einheiten BcgI hergestellt. Die auf diese Weise erhaltenen Restriktionsfragmente werden mit einem Gemisch der folgenden Adapter ligiert:
Adapter 1: (SEQ ID NO. 20 und 21)

5' CTCGTAGACTGCGTACCNN 3'
3' GAGCATCTGACGCATGG 5'

Adapter 2: (SEQ ID NO. 22 und 23)

5' GACGATGAGTCCTGAGANN 3'
3' CTGCTACTCAGGACTCT 5'

Das Gemisch von Adapter-ligierten Fragmenten wird sodann unter Anwendung einer Präamplifikation mit einem Satz von +1- und +2-Primern zur Verwendung mit Adapter 1 bzw. Adapter 2 amplifiziert, d. h.
+1-Primer für Adapter 1: CTCGTAGACTGCGTACCN (SEQ ID NO. 24)
+2-Primer für Adapter 2: GACGATGAGTCCTGAGACN (SEQ ID NO. 25)
Das Präamplifikationsprofil umfasst eine kurze Denaturierung (1 sec, 94°C), gefolgt von einer kurzen Verlängerung (5 sec, 56°C), beide 40-mal wiederholt. Ein derartiges Profil begünstigt die Amplifikation der kleinen Adapter-ligierten Fragmente im Vergleich zur Amplifikation der großen Adapter-ligierten Fragmente.
Der +1/+2-Präamplifikation schließt sich eine selektive +2-Amplifikation, eine selektive +3-Amplifikation oder eine selektive +4-Amplifikation (oder eine Kombination von +2-, +3- oder +4-selektiven Amplifikationen) unter Verwendung der folgenden Primer an:
+2-Primer für Adapter 1: CTCGTAGACTGCGTACCNN (SEQ ID NO. 26)
+3-Primer für Adapter 2: GACGATGAGTCCTGAGACNN (SEQ ID NO. 27)
+3-Primer für Adapter 1: CTCGTAGACTGCGTACCNNN (SEQ ID NO. 28)
+4-Primer für Adapter 2: GACGATGAGTCCTGAGACNNN (SEQ ID NO. 29)
Einer der bei der letzten Amplifikationsstufe verwendeten Primer enthält eine 5'-Biotingruppe. Das Gemisch von amplifizierten Fragmenten wird sodann isoliert und gereinigt, indem man das Gemisch mit magnetischen Kügelchen, die mit Streptavidin beschichtet sind, in Kontakt bringt. Die Oligonucleotidfragmente werden durch Inkubation der Kügelchen, die die Restriktionsfragmente tragen, mit Alkali oder durch Wärmebehandlung (5 min, 95°C) isoliert. Der auf diese Weise erhaltene Überstand, der die amplifizierten Restriktionsfragmente enthält, kann sodann analysiert werden, z. B. durch eine massenspektroskopische Technik, wie MALDI-TOF. Das selektive Amplifikationsprofil umfasst eine kurze Denaturierung (1 sec, 94°C), gefolgt von einer kurzen Verlängerung (5 sec, 65°C), beide 13-mal wiederholt, wobei die Verlängerungstemperatur allmählich auf 56°C mit einer Temperaturverringerung von 0,7°C pro Zyklus abgesenkt wird, wonach sich weitere 23 Zyklen anschließen, die aus einer Denaturierungsstufe von 1 sec bei 94°C und einer Verlängerungsstufe von 5 sec bei 56°C bestehen.
Beispiel IV
Erzeugung von Oligotags aus AFLP-Reaktionsgemischen, die mit einem MseI-AFLP-Adapter und einem Amplifikationsprimer mit einer Typ IIS-Restriktionsenzymstelle erzeugt worden sind,
1. Biologisches Material
Beim verwendeten biologischen Material handelt es sich um zwei parentale Linien (Proben IR20 und 6383) aus einer F2-Population von Reis. Die parentalen Linien wurden von IRRI (Philippinen) bezogen.
2. EcoRI/MseI-AFLP-Matrizenherstellung, Präamplifikation und selektive Amplifikation
Sämtliche Maßnahmen wurden gemäß standardmäßigen Verfahren (Vos et al., Nucleic Acids Research, Bd. 23, Nr. 21, S. 4407–4414 und EP-A-0 534 858) durchgeführt. AFLP-Reaktionsgemische wurden mit 33P radioaktiv markiert und an einem standardmäßigen AFLP-Gel (Sequenziergel) aufgetrennt. Die Sequenzen der Adapter, Präamplifikationsprimer und selektiven Amplifikationsprimer entsprechen den Angaben in Beispiel I mit folgenden Ausnahmen:
2.1 AFLP-Fingerabdrücke, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer GsuI-Stelle (5'-3' CTGGAG N16/N14). (7).
Der +3-MseI-selektive Amplifikationsprimer I25 wurde durch den Primer 00s45thio: 5'-gatgaGTCTGGAGTAACAC-3' (SEQ ID NO. 30), (Die in Kleinbuchstaben dargestellten Nucleotide sind durch Phosphorthioat-Bindungen verbunden, um Resistenz gegen T7-Gen-6-Exonuclease zu verleihen).
2.2 AFLP-Fingerabdrücke, erzeugt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer BsgI-Stelle (5'-3' GTGCAG N16/N14). (8).
Der +3-MseI-selektive Amplifikationsprimer I41 wurde durch den Primer 00s24bio: 5'-GA(bioT)GAGTGTGCAGTAACAC-3' (SEQ ID NO. 31) ersetzt (bioT bezieht sich auf ein mit dem Desoxythymidinnucleosid gekuppeltes Biotin-Molekül).
3. Herstellung von AFLP-Reaktionsgemischen mit doppelsträngigen Fragmenten
Nach der selektiven Amplifikationsreaktion gemäß dem standardmäßigen Verfahren in einem Volumen von 20 μl mit den in den Abschnitten 2.1 und 2.2 beschriebenen Primersequenzen wurde eine identische Menge von 20 μl selektiven Amplifikationsreagenzien zugegeben, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 40 μl ergab. Ein zusätzlicher Zyklus der PCR-Amplifikation wurde gemäß dem Thermozyklusprofil 30 sec bei 94°C, 1 min 56°C und 2 min 72°C durchgeführt, um sämtliche AFLP-Fragmente in doppelsträngige DNA umzuwandeln.
4. Herstellung von AFLP-Oligonucleotid-Markierungen
Im Anschluss an die Herstellung von doppelsträngigen AFLP-Reaktionsgemischen gemäß den Angaben in den vorstehenden Abschnitten 2 und 3 wurde eine Probe von 10 μl aus jedem Röhrchen entnommen und vor der Herstellung der AFLP-Oligonucleotid-Markierung mit 10 μl Aufsetzfarbstoff als Kontrolle vermischt. 10 μl eines jeden Röhrchens wurden mit 5 μl Gemisch mit einem Gehalt an 0,5 μl 10 × PCR-Puffer, 0,66 Einheiten Exonuclease I, 0,594 μl 10 × Shrimp-alkalische Phosphatase-Puffer und ddH₂O versetzt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 15 μl ergab. Die Proben wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach sich eine 10-minütige Inkubation bei 70°C zur Inaktivierung der Exonuclease I anschloss. Diese 15 μl-Probe wurde mit 10 μl Restriktionsenzymgemisch mit einem Gehalt an 2,5 μl Restriktionsenzympuffer, 3 Einheiten GsuI- oder BsgI-Restriktionsenzym und S-Adenosylmethionin gemäß den Angaben des Herstellers ersetzt. Die Proben wurden 180 min bei 30°C (GsuI) oder 37°C (BsgI) inkubiert. Nach dem Restriktionsenzymverdau wurde eine 5 μl Aliquotmenge entnommen, mit Aufsetzfarbstoff vermischt und auf ein Sequenzierungsgel zusammen mit der unbehandelten Kontrollprobe als Kontrolle für den Verdau durch die Restriktionsenzyme aufgesetzt.
Der Rest des Restriktionsenzym-Verdauungsgemisches wurde zur Isolierung der Oligonucleotid-Markierungen verwendet.
Das GsuI-Verdauungsgemisch wurde mit 5 μl 5 × T7-Gen-6-Exonuclease-Puffer und 5 Einheiten T7-Gen-6-Exonuclease versetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, wonach sich eine 10-minütige Inkubation bei 70°C anschloss. Eine 5 μl-Probe wurde entnommen und mit 5 μl Aufsetzfarbstoff vermischt und auf ein Sequenzierungsgel zusammen mit den vorstehend erwähnten Proben aufgesetzt. Der Rest der Probe wurde unter Verwendung eines Nucleotid-Entfernungskits der Fa. Qiagen gereinigt.
Die Probe wurde von der Qiagen-Säule mit 100 μl ddH₂O eluiert und durch Abdampfen des Wassers auf ein Endvolumen von 15 μl eingeengt. Diese 15 μl-Probe wurde mit 15 μl Aufsetzfarbstoff vermischt und auf ein Sequenzierungsgel zusammen mit den vorstehend erwähnten Proben aufgesetzt.
Das BsgI-Verdauungsgemisch wurde mit einem Gemisch mit einem Gehalt an 5 μl mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen, das in 80 μl STEX-Lösung (1 000 mM NaCl/10 mM Tris HCl/1 mM EDTA/0,1% Triton X-100, pH-Wert 8,0) rekonstituiert worden war, versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter mäßigem Bewegen inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Kügelchen mit einer Magnetteilchen-Konzentriervorrichtung eingeengt und nacheinander 2-mal mit 100 μl STEX und 1-mal mit 100 μl ddH₂O gewaschen und in 15 μl rekonstituiert. Die Oligonucleotid-Markierungen wurden 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Nach Einengen mit einer Magnetteilchen-Konzentriervorrichtung wurde der Überstand rasch entfernt und in ein weiteres Probenröhrchen übertragen. 15 ml Aufsetzfarbstoff wurden zugegeben. Diese Probe wurde auf Sequenzierungsgel zusammen mit den vorstehend erwähnten Proben aufgesetzt.
Sämtliche vorerwähnten Proben wurden an einem denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel analysiert.
5. Ergebnisse
In 7 ist folgendes enthalten:
AFLP-Reaktionsgemische, hergestellt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer GsuI-Stelle:
Bahn 1: enthält eine Größenleiter mit 10 Basenpaaren als Standard für die Fragmentgröße; die Fragmentgrößen in Basenpaaren sind auf der linken Seite angegeben.
Bahn 2: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war.
Bahn 3: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war.
Bahn 4: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war.
Bahn 5: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war.
Bahn 6: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I und GsuI.
Bahn 7: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I und GsuI.
Bahn 8: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I und GsuI.
Bahn 9: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I und GsuI.
Bahn 10: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease.
Bahn 11: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease.
Bahn 12: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (Gsul-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease.
Bahn 13: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der 00s45-Thioprimer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease.
Bahn 14: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease und anschließende Reinigung unter Verwendung einer Nucleotid-Entfernungssäule.
Bahn 15: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease und anschließende Reinigung unter Verwendung einer Nucleotid-Entfernungssäule.
Bahn 16: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease und anschließende Reinigung unter Verwendung einer Nucleotid-Entfernungssäule.
Bahn 17: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s45thio (GsuI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, gefolgt von einem Verdau mit Exonuclease I, GsuI und T7-Gen-6-Exonuclease und anschließende Reinigung unter Verwendung einer Nucleotid-Entfernungssäule.
8 enthält folgendes:
AFLP-Reaktionsgemische, hergestellt mit MseI-Adaptern und AFLP-Primern mit einem Gehalt an einer BsgI-Stelle:
Bahn 1: enthält eine Größenleiter mit 10 Basenpaaren als Standard für die Fragmentgröße; die Fragmentgrößen in Basenpaaren sind auf der linken Seite angegeben.
Bahn 2: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war.
Bahn 3: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war.
Bahn 4: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der 00s24-Bioprimer mit 33P markiert war.
Bahn 5: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der 00s24-Bioprimer mit 33P markiert war.
Bahn 6: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, anschließend einem Verdau mit Exonuclease I und BsgI.
Bahn 7: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI.
Bahn 8: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der 00s24-Bioprimer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI.
Bahn 9: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der 00s24-Bioprimer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI.
Bahn 10: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI, gefolgt von einer Isolation der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Strepavidin-Kügelchen.
Bahn 11: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI, gefolgt von einer Isolation der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Strepavidin-Kügelchen.
Bahn 12: Probe IR20, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der E35-Primer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI, gefolgt von einer Isolation der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Strepavidin-Kügelchen.
Bahn 13: Probe 6383, AFLP-Reaktion E35/00s24bio (BsgI-Stelle), bei der der 00s24-Bioprimer mit 33P markiert war, anschließend Verdau mit Exonuclease I und BsgI, gefolgt von einer Isolation der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Strepavidin-Kügelchen.
7 zeigt folgendes:

1) Eine Markierung von E35 oder 00s45thio führt erwartungsgemäß zu einem vergleichbaren Fingerabdruck in den Bahnen 2 und 4 und in den Bahnen 3 und 5 mit gewissen Beweglichkeitsänderungen aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen den 33P-markierten Strängen der Fragmente.
2) Die Fragmentgrößen in den Bahnen 6 und 7 sind nach Verdau mit GsuI um 29 Nucleotide verringert, verglichen mit den Fragmentgrößen in den Bahnen 2 und 3.
3) Erwartungsgemäß werden fast alle Fragmente durch GsuI verdaut, was in den Bahnen 8 und 9 zu einem starken Fragment mit 29 Nucleotiden führt.
4) Die Bahnen 10 und 11 zeigen, dass die GsuI-verdauten Fragmente, die in den Bahnen 6 und 7 ersichtlich sind, erwartungsgemäß durch T7-Gen-6-Exonuclease verdaut werden.
5) Die 33P-markierten 00s45thio enthaltenden Fragmente werden erwartungsgemäß durch den Verdau mit T7-Gen-6-Exonuclease nicht beeinflusst, wie aus den Bahnen 12 und 13 ersichtlich ist.
6) Nach Reinigung mit dem Nucleotid-Entfernungskit sind die Fragmente mit 29 Nucleotiden immer noch vorhanden, wie aus den Bahnen 16 und 17 ersichtlich ist.

8 zeigt folgendes:

1) Die Markierung von E35 oder 00s24bio führt erwartungsgemäß zu einem vergleichbaren Fingerabdruck in den Bahnen 2 und 4 und in den Bahnen 3 und 5 mit gewissen Beweglichkeitsänderungen aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen den 33P-markierten Strängen der Fragmente und der Anwesenheit eines Biotinmoleküls (was zu einer geringeren Beweglichkeit der Fragmente führt).
2) Die Fragmentgrößen in den Bahnen 6 und 7 sind nach Verdau mit BsgI um 29 Nucleotide verringert, verglichen mit den Fragmentgrößen in den Bahnen 2 und 3.
3) Erwartungsgemäß werden fast sämtliche Fragmente durch BsgI verdaut, was zu einem starken Fragment von 29 Nucleotiden (das aufgrund der Anwesenheit eines Biotin-Moleküls als ein Fragment mit einer Beweglichkeit von 34 Nucleotiden wandert) in den Bahnen 8 und 9 führt.
4) Nach Reinigung mit Streptavidin-beschichteten, magnetischen Kügelchen sind in den Bahnen 12 und 13 die Fragmente mit 29 Nucleotiden immer noch vorhanden.

Beispiel V
Erzeugung von Oligotags durch AFLP-Reaktionen unter Verwendung eines Typ IIS-Restriktionsenzyms, Adapters und Amplifikationsprimers
1. Biologisches Material
Beim verwendeten biologischen Material handelt es sich um zwei parentale Linien (Proben IR20 und 6383) aus einer F2-Population von Reis. Die parentalen Linien wurden von IRRI (Philippinen) bezogen.
2. BcgI-AFLP-Matrizenpräparation, Präamplifikation und selektive Amplifikation
2.1 Matrizenpräparation unter Verwendung von BcgI
Matrizenpräparationen wurden gemäß standardmäßigen Verfahren (Vos et al., Nucleic Acids Research, Bd. 23, Nr. 21, S. 4407–4414 und EP-A-0 534 858) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das BcgI-Restriktionsenzym vor der Ligation der Adapter durch 10-minütige Inkubation des Restriktionsverdauungsgemisches bei 70°C inaktiviert wurde. Die Sequenzen der Adapter, Präamplifikationsprimer und selektiven Amplifikationsprimer sind nachstehend angegeben:
BcgI-Adaptersequenz 1:

00s25: 5'-ctcgtagactgcgtaccNN-3' (SEQ ID NO. 32)
00s26: 5'-ggtacgcagtctacgag-3' (SEQ ID NO. 33) wobei N eine der vier Desoxynucleoside A, C, G oder T bedeutet.

BcgI-Adaptersequenz 2:

00s27: 5'-gacgatgagtcctgagaNN-3' (SEQ ID NO. 34)
00s28: 5'-tctcaggactcatcgtc-3' (SEQ ID NO. 35) wobei N eine der vier Desoxynucleoside A, C, G oder T bedeutet.

BcgI +1-Präamplifikationsprimer an Adaptersequenz 1:

00s29: 5'-ctcgtagactgcgtacca-3' (SEQ ID NO. 36)

BcgI +2-Präamplifikationsprimer an Adaptersequenz 2:

00s35: 5'-gacgatgagtcctgagacc-3' (SEQ ID NO. 37)

BcgI +3-Amplifikationsprimer an Adaptersequenz 1 :

00s31bio: 5'-bio-ctcgtagactgcgtaccaca-3' (SEQ ID NO. 38) (bio bezeichnet ein Biotin-Molekül, das an das 5'-Ende des Primers gekuppelt ist).

BcgI +4-Amplifikationsprimer an Adaptersequenz 2:

00s41: 5'-gacgatgagtcctgagaccac-3' (SEQ ID NO. 39)
00s42: 5'-gacgatgagtcctgagaccag-3' (SEQ ID NO. 40)

2.2 Präamplifikationen
Präamplifikationsreaktionen wurden gemäß den standardmäßigen Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die vorerwähnten Primer (00s29 und 00s35) verwendet wurden und dass das Thermozyklusprotokoll auf die Amplifikation kleiner Fragmente angepasst wurde.
Das Thermozyklusprotokoll bestand aus 40 Zyklen mit 1 sec bei 94°C und 5 sec bei 56°C.
2.3 AFLP-selektive Amplifikation
AFLP-Reaktionsgemische wurden mit 33P radioaktiv markiert und an einem standardmäßigen AFLP-(Sequenz)-Gel aufgetrennt.
Die Durchführung der selektiven Amplifikationsreaktionen entsprach dem standardmäßigen Verfahren, mit der Ausnahme, dass die vorerwähnten Primer in folgenden Kombinationen verwendet wurden:
Kombination 1: 00s31bio/00s41
Kombination 2: 00s31bio/00s42
Das selektive Amplifikations-Thermozyklusverfahren wurde an die Amplifikation kleiner Fragmente angepasst.
Das angewandte selektive Thermozyklusverfahren bestand aus 13 Zyklen (1 sec, 94°C und 5 sec, 65°C), wobei die Temperatur von 65°C auf 56°C verringert wurde, wonach sich 23 Zyklen anschlossen (1 sec, 94°C und 5 sec, 56°C).
3. Herstellung von AFLP-Reaktionsgemischen mit doppelsträngigen Fragmenten
Nach der selektiven Amplifikationsreaktion in einem Volumen von 20 μl mit den im Abschnitt 2.3 beschriebenen Primersequenzen wurde eine identische Menge an 20 μl selektiven Amplifikationsreagenzien zugesetzt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 40 μl ergab. Ein zusätzlicher Zyklus der PCR-Amplifikation wurde gemäß dem Thermozyklusprofil mit 1 sec bei 94°C und 5 sec bei 56°C durchgeführt, um sämtliche AFLP-Fragmente in doppelsträngige DNA-Fragmente umzuwandeln.
4. Präparation von AFLP-Oligonucleotid-Markierungen
Im Anschluss an die Präparation von doppelsträngigen AFLP-Reaktionsgemischen, die in den vorstehenden Abschnitten 2 und 3 beschrieben wurden, wurde eine 5 μl-Probe aus jedem Röhrchen entnommen und mit 5 μl Aufsetzfarbstoff als Kontrolle vor Präparation einer AFLP-Oligonucleotid-Markierung vermischt.
In einem Röhrchen wurden 5 μl doppelsträngiges AFLP-Reaktionsprodukt mit 15 μl STEX mit einem Gehalt an 5 μl mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter mäßigem Bewegen inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Kügelchen mit einer Magnetteilchen-Konzentriervorrichtung eingeengt und nacheinander 2-mal mit 100 μl STEX und 1-mal mit 100 μl ddH₂O gewaschen und in 10 μl ddH₂O rekonstituiert. Die Oligonucleotid-Markierungen wurden 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Nach Einengen an einer Magnetteilchen-Konzentriervorrichtung wurde der Überstand rasch entfernt und in ein weiteres Probenröhrchen übertragen und mit 10 μl Aufsetzfarbstoff versetzt. Diese Probe wurde auf ein Sequenziergel zusammen mit den vorerwähnten Proben aufgesetzt.
Sämtliche vorerwähnten Proben wurden an einem denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Sequenziergel analysiert.
5. Ergebnisse
9 enthält folgendes:
AFLP-Reaktionsgemische, hergestellt aus Matrizen, die mit dem BcgI-Restriktionsenzym hergestellt worden sind:
Bahnen 1, 6, 7 und 12: sie enthalten eine Leiter mit einer Größe von 10 Basenpaaren als Standard für die Fragmentgröße; die Fragmentgrößen sind auf der rechten Seite in Basenpaaren angegeben.
Bahn 2: Probe IR20, AFLP-Reaktion 00s40/00s31bio, wobei der 00s40-Primer mit 33P markiert ist.
Bahn 3: Probe 6383, AFLP-Reaktion 00s40/00s31bio, wobei der 00s40-Primer mit 33P markiert ist.
Bahn 4: Probe IR20, AFLP-Reaktion 00s40/00s31bio, wobei der 00s40-Primer mit 33P markiert ist, gefolgt von einer Isolierung der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen.
Bahn 5: Probe 6383, AFLP-Reaktion 00s40/00s31bio, wobei der 00s40-Primer mit 33P markiert ist, gefolgt von einer Isolierung der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen.
Bahn 8: Probe IR20, AFLP-Reaktion 00s41/00s31bio, wobei der 00s41-Primer mit 33P markiert ist.
Bahn 9: Probe 6383, AFLP-Reaktion 00s41/00s31bio, wobei der 00s41-Primer mit 33P markiert ist.
Bahn 10: Probe IR20, AFLP-Reaktion 00s41/00s31bio, wobei der 00s41-Primer mit 33P markiert ist, gefolgt von einer Isolierung der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen.
Bahn 11: Probe 6383, AFLP-Reaktion 00s4 I/00s31bio, wobei der 00s41-Primer mit 33P markiert ist, gefolgt von einer Isolierung der Oligonucleotid-Markierungen unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen.
9 zeigt folgendes:

1) Das angepasste Amplifikationsprofil zeigt klar die Amplifikation des Fragments mit 70 Nucleotiden, wie aus den Bahnen 2, 3, 8 und 9 ersichtlich ist.
2) Nach Reinigung unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen sind die Fragmente mit 70 Nucleotiden in den Bahnen 4, 5, 10 und 11 immer noch vorhanden.

Beispiel VI
Darstellung eines alternativen Verfahrens zur Erzeugung von Oligonucleotid-Markierungen mit fixierter Länge, beispielsweise für die massenspektroskopische Analyse
Beginn mit BcgI-verdauten DNA-Fragmenten:
Adapter X (xxxxxNN) und Y (yyyyNN) jeweils mit einer anderen Kernsequenz werden mit BcgI-verdauten DNA-Fragmenten verknüpft.
Die Komplexizität des DNA-Gemisches wird durch Amplifikation mit selektiven Nucleotiden verringert. Bei der letzten Amplifikation wird ein Primer mit einem 5'-Biotin-Molekül verwendet.
Biotinylierte Fragmente werden aus dem Amplifikationsreaktionsgemisch unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen gereinigt.
Die mit den magnetischen Kügelchen gekuppelten Fragmente werden sodann verdaut. Nur die kurzen Fragmente, die an die Kügelchen gekuppelt sind, werden verdaut, da es sich bei diesen um die einzigen Fragmente handelt, die eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym tragen. Auf diese Weise werden Fragmente von fixierter Länge von den Kügelchen freigesetzt, wobei die Länge im Bereich für eine Analyse beispielsweise durch MALDI-TOF-Massenspektroskopie-Analyse liegt.
Die freigesetzten kurzen Fragmente werden mit einem Nucleotid-Entfernungskit gereinigt.
Die gereinigten kurzen Fragmente werden analysiert. Aufgrund der Anwesenheit beider Stränge der BcgI-Fragmente ergibt jedes Fragment jeweils zwei Peaks bei der massenspektroskopischen Analyse. Wenn die Anwesenheit beider Stränge ein Problem darstellt, kann während der letzten Amplifikationsstufe ein Primer verwendet werden, der ein Biotin-Molekül an seinem 5'-Primerende trägt und Nuclease-resistente Internucleotid-Bindungen, wie Phosphorthioat-Bindungen aufweist. Ein derartiger Primer weist folgende Struktur auf:
Die Nucleotide A, T und G sind durch Nuclease-resistente Bindungen getrennt. Wenn dieser Primer verwendet wird, können die unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen gereinigten Fragmente mit BcgI geschnitten werden. Eine Seite des Fragments (die an die magnetischen Kügelchen gekuppelt ist) wird nur in einem der Stränge des Fragments geschnitten, während die andere Seite des Fragments in beiden Strängen geschnitten wird. Dies führt zu den nächsten Fragmenten.
Die unterstrichenen Nucleotide werden getrennt, bleiben aber zu diesem Zeitpunkt am anderen Strang gekuppelt. Die Kügelchen werden gewaschen, wodurch die auf der rechten Seite angegebenen kleinen Fragmente entfernt werden. Wenn die erhaltenen Fragmente an den Kügelchen denaturiert werden, z. B. durch Alkali- oder Wärmebehandlung werden nur zwei Typen von Fragmenten freigesetzt. Bei Darstellung auf die vorstehend angegebene Weise sehen diese Fragmente folgendermaßen aus:
Die auf diese Weise erzeugten Fragmente befinden sich in einem Bereich, der für den Nachweis durch eine massenspektroskopische Analyse optimal ist.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass das Verfahren von Beispiel VI gleichermaßen unter Verwendung beliebiger anderer "doppelt schneidender" Restriktionsendonucleasen durchgeführt werden kann, d. h. mit Restriktionsendonucleasen, die an zwei Stellen schneiden, die sich von der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuclease unterscheiden. Gleichermaßen können andere Affinitätsmarkierungen, die von der Biotin-Markierung abweichen, verwendet werden.
Beispiel VII
MALDI-TOF-massenspektrophotometrische Analyse von Oligonucleotid-Markierungen aus AFLP-Reaktionsgemischen, die mit einem MseI-AFLP-Adapter und einem Amplifikationsprimer, der eine Typ IIS-Restriktionsenzymstelle enthält, erzeugt worden sind.
1. Präparation von AFLP-Oligonucleotid-Markierungen
Die analysierten Oligonucleotid-Markierungen wurden aus der in Beispiel IV verwendeten parentalen Linie 6383 gemäß dem in Beispiel IV angegebenen Verfahren erzeugt, mit der Ausnahme, dass ein biotinylierter Primer mit einem Gehalt an einer GsuI-Restriktionsstelle verwendet wurde.
Die erzeugten Oligonucleotid-Markierungen wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrophotometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
2. Ergebnisse
10 enthält ein Massenspektrum einer an den vorstehend erzeugten Oligonucleotid-Markierungen durchgeführten MALDI-TOF-massenspektrophotometrischen Analyse.
10 zeigt folgendes:

1) Deutlich ausgeprägte Peaks um die Masse 8615, bei der es sich um die durchschnittliche Masse der erzeugten Oligonucleotid-Markierungen handelt.
2) Insgesamt 20–25 Peaks sind sichtbar, die 20–25 Oligonucleotid-Markierungen mit unterschiedlichen Massen repräsentieren.

Claims

Verfahren zum Erzeugen und Nachweisen eines Oligonucleotids, das spezifisch für eine Sequenz in einer ersten dsDNA ist, wobei die erste dsDNA mit einer Restriktionsendonuclease in einer Position in der ersten dsDNA geschnitten wird, die sich von der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease unterscheidet, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellung der ersten dsDNA; und (b) Ligation der ersten dsDNA mit einer zweiten dsDNA unter Bereitstellung einer ligierten dsDNA, wobei die zweite dsDNA-Sequenz mindestens eine Erkennungsstelle für eine IIS-Restriktionsendonuclease umfasst und wobei sich die Erkennungsstelle in einer Position in der zweiten dsDNA befindet, die bewirkt, dass die IIS-Restriktionsendonuclease die erste dsDNA, die mit der zweiten dsDNA ligiert ist, schneidet; (c) Amplifikation der verknüpften dsDNA; (d) Restriktion der amplifizierten, ligierten dsDNA mit der mindestens einen Restriktionsendonuclease des IIS-Typs; und (e) Nachweis von mindestens einer amplifizierten, IIS-geschnittenen dsDNA; wobei die Nachweisstufe (e) die folgenden Stufen umfasst: (e1) Erzeugen mindestens einer ssDNA aus einem amplifizierten, ligierten dsDNA-Fragment, das in Stufe (d) erhalten worden ist; und (e2) Nachweis der ssDNA durch Massenspektroskopie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite dsDNA eine vorgegebene Länge und Sequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die ssDNA eine Länge im Bereich von 10–100 Nucleotiden aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die ligierte dsDNA unter Verwendung mindestens eines Primers amplifiziert wird, der zur Hybridisierung mit einem Teil der zweiten dsDNA befähigt ist, die sich in der ligierten dsDNA in Nachbarstellung zur ersten dsDNA befindet.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Primer ferner zur Hybridisierung mit 1–10 Basen in der ersten dsDNA befähigt ist, die sich in der ligierten dsDNA in Nachbarstellung zur zweiten dsDNA befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei ein biotinylierter Primer in der Amplifikationsstufe verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei ein Exonuclease-resistenter Primer in der Amplifikationsstufe verwendet wird und wobei eine ssDNA durch Behandlung eines amplifizierten, ligierten dsDNA-Fragments, das den Exonuclease-resistenten Primer enthält, mit einer Exonuclease erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die dsDNA vor Behandlung mit der Exonuclease in ssDNA-Fragmente aufgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, wobei es sich bei der ersten dsDNA um ein Restriktionsfragment handelt, das durch Verdau einer Ausgangs-DNA mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen zu einer entsprechenden Reihe von Restriktionsfragmenten erhalten worden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Restriktionsendonucleasen mindestens eine häufig schneidende Restriktionsendonuclease und mindestens eine selten schneidende Restriktionsendonuclease umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der ersten dsDNA um genomische DNA oder cDNA handelt oder die erste dsDNA von genomischer DNA oder cDNA abgeleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die zweite dsDNA, die eine IIS-Erkennungsstelle umfasst, eine Länge von bis zu 20–50 Basenpaaren aufweist und wobei sich die IIS-Erkennungsstelle in einem Abstand von 0–6 Basenpaaren vom Ende der zweiten dsDNA, die mit der ersten dsDNA zu ligieren ist, befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei die IIS-Restriktionsendonuclease aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: AceIII, AlwI, AlwXI, Alw26I, BbvI, BbvII, BbsI, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BinI, BsaI, BsgI, BsmAI, BsmFI, BspMI, EarI, EciI, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HinGUII, HphI, Ksp632I, MboII, MmeI, MnlI, NgoVIII, PleI, RleAI, SapI, SfaNI, TaqII und Tth111II.
Kit zur Verwendung beim Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Kit folgendes umfasst: (a) eine Restriktionsendonuclease vom IIS-Typ und mindestens einen dsDNA-Adapter, der mindestens eine Erkennungsstelle für eine IIS-Restriktionsendonuclease umfasst, wobei sich die Erkennungsstelle in einer Position im dsDNA-Adapter befindet, die bewirken würde, dass die IIS-Restriktionsendonuclease eine dsDNA schneidet, wenn diese mit dem dsDNA-Adapter ligiert ist, und (b) mindestens einen Primer, der zur Hybridisierung mit mindestens einem Teil des dsDNA-Adapters befähigt ist.
Kit nach Anspruch 14, das ferner eine Exonuclease enthält und in dem mindestens einer der im Kit vorhandenen Primer gegen die Exonuclease beständig ist.