DE3831714A1

DE3831714A1 - Tpa-aehnliche polypeptide, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE3831714A1
Application number: DE3831714A
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Bach; Martin Dr Schmidt; Karl-Hermann Dr Strube; Verena Dr Baldinger; Margarete Dr Schwarz
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1988-09-17
Filing date: 1988-09-17
Publication date: 1990-03-22
Also published as: EP0403598A1; JPH04500306A; WO1990003436A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue tPA-ähnliche Polypeptide mit Plasminogenaktivatoraktivität, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

Der humane, gereifte Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) ist ein Polypeptid aus 527 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 68 kD (Pennica et al. 1983, Nature 301, 214-221 und Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5355-5359) (vgl. Abb. 1a-1c). Das Molekül enthält mehrere distinkte Regionen, sog. Domänen, denen verschiedene Funktionen zugeordnet werden. Der N-Terminus wird durch eine Finger-Region gebildet, die dem Fibronektin homolog ist. Anschließend folgt eine Region, die Ähnlichkeit mit mehreren Wachstumsfaktoren besitzt. Im Anschluß daran folgen zwei Kringel-Domänen. Nach einer Spaltstelle, an der das einkettige Molekül in zwei Ketten gespalten werden kann, schließt sich die Protease-Domäne an; diese enthält das aktive Zentrum und besitzt Homologie zu anderen Serin-Proteasen.

Mehrere Eigenschaften machen den Gewebe-Plasminogenaktivator zu einem interessanten Molekül: tPA besitzt eine starke Affinität zu Fibrin, die Plasminogen-Aktivierung ist Fibrin-abhängig; als Protease spaltet tPA Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibrin zu Spaltprodukten abbaut. tPA ist durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren hemmbar. Ferner hat tPA eine relativ kurze Halbwertzeit; das Molekül wird in der Leber rasch abgebaut.

Diese Faktoren bewirken, daß tPA in vivo spezifisch an Blutgerinnseln Plasminogen zu Plasmin aktiviert und durch Abbau des Fibrins die Wiederherstellung des Gefäßstromes bewirkt. tPA kann deshalb in der fibrinolytischen Therapie, z. B. nach einem Herzinfarkt, eingesetzt werden.

Es wurde nun gefunden, daß tPA-ähnliche Polypeptide, die die Aminosequenz des tPA aufweisen, worin jedoch 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, sowie deren Allelvarianten verbesserte Eigenschaften besitzen.

Die neuen Polypeptide enthalten also ein oder mehrere RGD (= Arg-Gly-Asp) Tripeptide anstelle von jeweils einem Tripeptid im tPA bei unveränderter Gesamtlänge des Moleküls.

Die Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die für die mutierten Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten.

Die neuen Polypeptide lassen sich gentechnisch nach bekannten Verfahren herstellen. Ausgangspunkt für die hier beschriebenen Konstruktionen ist ein cDNA-Klon, im folgenden pUCtPA genannt, der die codierende Sequenz von tPA und noch 5′- und 3′-nicht translatierte Bereiche enthält. Nach einer "leader"- und Prosequenz beginnt das reife Protein mit Ser(1) und endet nach Pro(527).

pUCtPA wird wie folgt isoliert: Aus menschlichem Uterus-Gewebe wird mRNA isoliert und in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Nach Einsetzen dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor pUC9 wird eine cDNA-Bibliothek angelegt. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press, nachzulesen. Auch das "screening" solcher Genbanken mit radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden ist inzwischen eine vielfach verwendete und beschriebene Methode. Nach diesem Verfahren kann ein cDNA-Klon, der die kodierende Region und angrenzende Bereiche enthält, isoliert werden.

Teile der DNA-Sequenz von PUC9tPA sind mit Hilfe von Restriktionsenzymen leicht zugänglich. Diese Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten können benutzt werden, um die DNA-Sequenzen, die für die neuen Polypeptide codieren, zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide pBR322, pUC8 oder 9, pUC18 oder 19, M13mp18 oder M13mp19 erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine ermöglichen. Die Transformation bzw. Transfektion der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben. Auch können die Hybridplasmide mit entsprechenden Signalsequenzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide ins Medium erlauben. Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die mutierte tPA-cDNA, unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promoters setzt. Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons und der Leader-/Prosequenz des tPA-Gens. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft sind z. B. die Integration und Expression des Fremdgens auf der Basis des Rinderpapillom-Virus. In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz codieren, ist der Aufbau sog. "shuttle"-Vektoren möglich. Konstruktion und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z. B. in die Maus-Fibroblastenzellinie C127. Es ist selbstverständlich, daß auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe, Insektenzellen und andere Säugerzellen, wie z. B. CHO-, L- und 293-Zellen, für die Expression verwendet werden können.

Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu sezernieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren. So erhält der Gewebe-Plasminogenaktivator bei der Expression in Eukaryontenzellen noch Glykosidseitenketten an den Aminosäuren 117, 184 und 448 (Asn). Bakterien sind nicht in der Lage, Glycosidseitenketten zu synthetisieren. Die meisten in Bakterien exprimierten eukaryontischen Proteine, wie auch tPA und die von ihr erfindungsgemäß abgeleiteten Polypeptide, fallen in der Zelle als denaturierte Einschlußkörper an und müssen proteinchemisch renaturiert werden. Ferner sind Bakterien oft nicht in der Lage, die Initiatoraminsäure Methionin vom fertigen Protein abzuspalten. Durch die Verwendung von Sekretionssystemen können diese Schwierigkeiten umgangen werden.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression der neuen Polypeptide zu benutzen.

Die Reinigung der neuen Polypeptide erfolgt durch deren Abtrennung aus dem Kulturmedium durch Affinitäts- und Ionenaustausch-Chromatographie nach bekannten Verfahren.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Polypeptide besitzen eine erhöhte Gerinnselspezifität, längere Halbwertzeit, verringerte Inhibitorbindung und/oder größere proteolytische Aktivität und können daher zur Thrombolyse eingesetzt werden. Sie zeigen dabei verbesserte Eigenschaften gegenüber humanem Gewebe-Plasminogenaktivator.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, die mindestens eines der neuen Polypeptide enthalten, ggf. in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel. Die Arzneimittel können auch Kombinationen der neuen Proteine mit anderen Fibrinolytika, wie Prourokinase, Urokinase oder Streptokinase oder deren Derivate, sowie mit anderen Pharmaproteinen, z. B. Superoxiddismutase enthalten. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen näher beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, verwiesen.

Beispiel 1 Isolierung eines cDNA-Klones für humanen Gewebe-Plasminogenaktivator

30 g tPA-produzierendes menschliches Uterus-Gewebe wurde in 6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% Sarcosyl im Ultra-Turax® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen über Nacht bei 45 000 rpm abgetrennt. Anschließend wurde die polyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Cellulose abgetrennt. Mit Hilfe des Enzyms AMV-Reverse Transcriptase und oligo(dT)12-18 als Starter wurde die polyA⁺-RNA in einsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli-DNA-Polymerase I. An die doppelsträngige cDNA wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase SalI-Linker angesetzt. Das kommerziell erhältliche Plasmid pUC9 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI linearisiert. Beide DNAs wurden miteinander ligiert und mit dem so erhaltenen Hybrid CaCl₂-behandelte, kompetente Zellen des E. coli-Stammes HB101 transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit 100 µg/ml Ampicillin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die Kolonien wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, Replika-plattiert, mit 0,5 N NaOH/1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2stündiges Backen bei 80°C fest an den Filter gebunden. Die Filter wurden in 6 × SET-Puffer (1 × SET = 0,15 M NaCl, 15 mM Tris/HCl pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1% SDS und 5 × Denhardts Lösung (100 × Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h, bei 68°C vorhybridisiert. Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden drei Oligonukleotid-Sonden, die jeweils 17 Basen der tPA-DNA umfassen, hergestellt. Sie bestehen aus folgenden Sequenzen:

Diese Sonden wurden am 5′-Ende mit γ-³²P-ATP markiert. Sie wurden dann mit den vorhybridisierten Filtern in einer Lösung, die 6 × SET, 0,1% SDS, 5 × Denhardts und 10% Dextransulfat enthält, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Filter werden danach mehrfach in 6 × SET/0,1% SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einem Röntgenfilm exponiert. Klone, die beim "Screening" eine radioaktive Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet. Ein Klon, im folgenden pUCtPA genannt, enthält ein etwa 2,1 kb großes Insert, das die codierende Region, sowie 5′- und 3′-nicht-codierende Bereiche enthält (Abb. 2). Plasmid-DNA von pUCtPA wurde durch Lysozym-Aufschluß und SDS-Alkali-Behandlung der Bakterienkultur sowie anschließende CsCl-Gradientenzentrifugation präpariert.

Beispiel 2 Herstellung von einzelsträngiger tPA-kodierender DNA

Ausgangspunkt war das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pUCtPA. Es wurde präparativ mit dem Restriktionsenzym SalI geschnitten. Die erhaltenen Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das SalI-Fragment, das die tPA-kodierende DNA-Sequenz enthielt, wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. 30 ng dieses Fragmentes wurden bei 4°C mit 100 ng des SalI geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors mp19 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 µl. Die Ligation wurde durch 5minütiges Erhitzen auf 80°C beendet.

1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 µl kompetenten SR 101-Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 µl 0,2 M PTG-Lösung und 120 µl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agarplatten ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich. Klone, die die tPA-cDNA enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-67) wurde die Orientierung der tPA-cDNA innerhalb des Plasmids festgestellt.

Das mP19 Plasmid, welches die cDNA von tPA in der Orientierung enthielt, daß bei der Bildung einzelsträngiger M13 Phagen der t-Strang der tPA cDNA-Bestandteil des Phagengenoms ist, wurde als mptPA bezeichnet.

Werden nun Bakterien des Stammes SR 101 oder davon abgeleitete Zellen mit dem Plasmid mptPA transformiert, so werden bei der Vermehrung dieser Zellen einzelsträngige Bakteriophagen in das Medium entlassen, die den t-Strang der tPA-cDNA enthalten. Die einzelsträngige DNA kann dann mit herkömmlichen und vielfach beschriebenen Methoden isoliert werden.

Im übrigen wurden, falls nicht besonders beschrieben, die Empfehlungen der Hersteller der Enzyme und Plasmide für die Enzymspaltung und Isolierung der Plasmide befolgt.

Beispiel 3 Einführung von Substitutionen in die cDNA von tPA

Im folgenden werden Substitutionen beschrieben, die alle bewirken, daß nach Expression der substituierten cDNA das Aminosäuremotiv RGD einmal oder mehrmals an unterschiedlichen Stellen des Polypeptids tPA enthalten ist. All diese Polypeptide haben eine Länge von 527 Aminosäuren. Ausgangspunkt für die Substitutionen war das in Beispiel 2 beschriebene mptPA.

0,04 µmol der einzelsträngigen mptPA wurden mit 0,5 µmol eines Oligonukleotids (21-27mer), dessen Sequenz bis auf 1-3 Basenaustausche dem zu verändernden Bereich der mptPA DNA komplementär war, umgesetzt. Das Oligonukleotid wurde vorher mit Hilfe der T₄ Polynukleotidkinase phosphoryliert. Ein typischer Mutagenisierungsansatz sah wie folgt aus:

einzelsträngige mptPA DNA
1 µl (0,04 µmol)
kinasiertes Oligonukleotid (inklusive ATP aus Kinasierungsreaktion)	1 µl (0,5 µmol)
10 × Ligase-Puffer	5 µl
1 mM dNTPs	2,5 µl (50 µM Endkonzentration)
1 mM ATP	4 µl (100 µM Endkonzentration)
H₂O	36,5 µl

Der Mutagenisierungsansatz wurde 15 min bei 37°C inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und schließlich mit 1 Einheit Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 Einheiten T₄-Ligase (Biolabs) zugegeben. Der Ansatz wurde danach 16 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 5 µl dieses Ansatzes zur Transformation von Komponenten SR 101-Zellen verwendet. Die daraus resultierenden Phagen-Plaques wurden auf Nitrozellulose übertragen. Danach wurden die Filter 5 min in 5XSSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 h bei 80°C "gebacken". Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Waschen der Filter erfolgte bei 6 × SET/0,1% SDS bei einer Temperatur von 55-65°C in Abhängigkeit von der Basenzusammensetzung und Länge der verwendeten Oligonukleotid-Hybridisierungsprobe. Hybridisiert wurde jeweils mit dem Oligonukleotid, das in dem entsprechenden Mutagenisierungsansatz eingesetzt wurde. Positive Klone wurden autoradiographisch sichtbar gemacht. Positive Klone wichen in 1-3 Positionen von der mptPA-Sequenz ab. Diese Substitutionen bewirkten, daß die in mp18 enthaltene tPA-cDNA nun für ein Polypeptid kodiert, das an einer oder mehreren Stellen das Aminosäuremotiv RGD enthält, wobei die Gesamtzahl der Aminosäuren dieser Polypeptide jeweils 527 ist.

Beispiel 3.1

Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet:

5′ TCTGCGTTTTATCACCTCTGCAGAT 3′

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD1 bezeichnet.

Beispiel 3.2

5′ CCACCCGGCTCGCCTCTGAGCACA 3′

Die Waschtemperatur betrug 62°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD2 bezeichnet.

Beispiel 3.3

5′ ACCAGCAATAATCCCCCCGGTTGCT 3′

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD3 bezeichnet.

Beispiel 3.4

5′ CTGTGCTCCAATCGCCCCTGTAGC 3′

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD4 bezeichnet.

Beispiel 3.5

5′ GGTGCACTCGTCGCCTCTCTCCGCTG 3′

Die Waschtemperatur betrug 64°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD5 bezeichnet.

Beispiel 3.6

5′ GATGCCGTCTCCCCTCCGCCCGC 3′

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD6 bezeichnet.

Beispiel 3.7

5′ CAGGAACCGATCTCCGCGCGACCTCC 3′

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD7 bezeichnet.

Beispiel 3.8

5′ GATGAGTATGTCCCCGCGCAGGAACCG 3′

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD8 bezeichnet.

Beispiel 3.9

5′ TCGCCAGGGTCCCCCCGGTATGTTCT 3′

Die Waschtemperatur betrug 63°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD9 bezeichnet.

Beispiel 3.10

5′ GCTCTCCTGGTCACCGCGGGACGAA 3′

Die Waschtemperatur betrug 61°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD10 bezeichnet.

Beispiel 3.11

5′ GCTGCAGGTCCCCCCGGGGAAGGCA 3′

Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD11 bezeichnet.

Beispiel 3.12

5′ AGTGTCTCCATTACACAGCATG 3′

Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD12 bezeichnet.

Beispiel 3.13

5′ TGGGGCCCGTCGCCCCGAGTGTC 3′

Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD13 bezeichnet.

Beispiel 3.14

5′ CGAATCGCCCCGGCAGGCGTC 3′

Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD14 bezeichnet.

Beispiel 3.15

5′ GGTCGCATGTCGCCACGAATCCAG 3′

Die Waschtemperatur betrug 58°C in 6 × SET/0,1% SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD15 bezeichnet.

Beispiel 4 Konstruktion von Vektoren für die Expression der modifizierten tPA-DNA

DNA des Affenvirus SV40 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und BclI geschnitten und das 0,24 kb-Fragment gelelektrophoretisch präpariert (Abb. 5). Die Enden wurden in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP mit dem Klenow-Fragment der DNA-PolymeraseI aufgefüllt. Anschließend wurden XhoI-Linker anligiert.

Parallel wurde der kommerziell erhältliche Vektor pUC18 mit dem Enzym SmaI linearisiert. Dann wurden ebenfalls XhoI-Linker angesetzt. DNA dieses Vektors ("pUC18Xho") wurde mit XhoI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem 0,24 kb XhoI-SV40-Fragment (s. o.) ligiert. Es entstand pSVpA. pSVpA-DNA wurde präparativ mit XhoI gespalten und wie oben mit Klenow-Polymerase in Gegenwart der vier dNTPs inkubiert. Das 0,24 kb-Fragment wurde Gel-isoliert. Gleichzeitig wurde der Eukaryonten-Expressionsvektor CL28XhoBPV, entstanden durch Ligation von CL28X und pB2-2 (nach Reddy et al., 1987, DNA 6, 461-72), partiell mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten, d. h. es wurde zeitlich derart limitiert inkubiert, daß Moleküle entstanden, die nur an einer der beiden XbaI-Erkennungssequenzen gespalten, also linearisiert sind (Abb. 6). Der Ansatz wurde dann wie beschrieben mit Klenow-Polymerase und dNTPs umgesetzt. Die linearen Moleküle wurden anschließend durch Gelelektrophorese isoliert.

Es erfolgte dann die Ligation der linearen pCL28XhoBPV-Fragmente mit dem vorbehandelten 0,24 kb-Fragment aus SV40. Nach Transformation und Screening von Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der das SV40-Fragment in der etwa 0,15 kb 3′-wärts der XhoI-Stelle gelegenen vormaligen XbaI-Stelle trug; diese DNA ("pCL28XhoBPV-SVpolyA") trug die SV40-Transkriptionsstopsignale der "frühen" Gene.

Plasmid-DNA von pCL28XhoBPV-SVpolyA wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Gleichzeitig wurde mptPARGD1-15 mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und das 2,1 kb große Fragment isoliert. Beide Fragmente wurden mittels T4-Ligase miteinander verbunden. Nach Transformation und Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der die mutierte tPA-DNA einfach und in der korrekten Orientierung enthielt: pCL28BPV-tPA-RGD1-15.

Beispiel 5 Transfektion und Etablierung von Zellinien

C127I-Zellen (J. Virol. 26 (1978), 292; ATCC catalogue of cell lines and hybridomas 5th edition, 1985, p 142) wurden mit BPV-Expressionsplasmiden transfiziert mit der Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode (Virology 52 (1973)/456, DNA cloning; volume II; ed. D. M. Glover IRL Press, Seiten 143 ff. und 213 (1985)). 5×10⁵ C127I-Zellen wurden in DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) + 10% FCS (Foetales Kalbsserum) in 60 mm Petrischalen eingesät. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt auf MEM (Modified Eagles Medium) mit 25 mM Hepes + 10% FCS. Mit 10 µg CsCl-gereinigter Plasmid DNA wurde ein Ca-Phosphat-Copräzipitat gebildet, welches vorsichtig auf die C127I-Zellen aufgebracht wurde. Die Zellen wurden 4 h bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Durch eine anschließende Glycerin-Schock-Behandlung wurde die Effizienz der Transfektion erheblich gesteigert. Hierzu wurde 4 h nach Aufbringen des Präzipitates das Medium von den Zellen abgezogen. Die Zellen wurden 3 min mit je 2 ml 15% Glycerin/HBS (DNA cloning Vol. II, Seite 152) pro 60 mm Petrischale bei Raumtemperatur inkubiert. Die Glycerin/HBS-Lösung wurde abgezogen, der Zellrasen mit 3 ml DMEM + 10% FCS gewaschen. Die Zellen wurden mit DMEM + 10% FCS bei 37°C; 7% CO₂ inkubiert. Dreimal in der Woche wurde das DMEM + 10% FCS abgezogen und durch frisches ersetzt. Nach 2-3 Wochen waren transfizierte Zellen, die das BPV-Genom enthalten, als Ansammlungen transformierte Zellen, sogenannte Foci, zu erkennen. Foci, die die oben beschriebenen tPA-Muteine exprimieren, wurden durch einen Casein-Agar-Overlay (siehe unten) identifiziert. Nach 2-3 h Inkubation bei 37°C; 7% CO₂ waren im trüben Casein-Agar Lysehöfe an den Stellen zu erkennen, an denen sich tPA-exprimierende Zellen befinden. Nach Entfernen des Casein-Agar wurden die sich an diesen Stellen befindenden Zellen nach der "cloning-cylinder"-Methode isoliert (DNA cloning Vol. II, S. 220). Die erhaltenen Zellinien wurden anschließend mit Standardmethoden in DMEM + 10% FCS hochgezüchtet.

Zur Produktion wurden die Zellinien nach Erreichen der Konfluenz in serumfreiem DMEM gehalten. Das tPA-Mutein aus dem so erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand kann nun charakterisiert und aufgereinigt werden.

Für den oben erwähnten Agar-Overlay-Test werden folgende Lösungen benötigt:

Overlay-Agarose

1) 8% Magermilchlösung in H₂O werden 30 min bei 100°C gekocht und anschließend im 37°C Wasserbad abgekühlt.
2) eine 2%ige Lösung von Low-melting Agarose in PBS wird nach Autoklavieren im 37°C Wasserbad abgekühlt. Anschließend wird im Verhältnis 1 : 1 doppelt konzentriertes DMEM zugegeben.
3) 0,64 mg Plasminogen wird in 1 ml H₂O gelöst. Durch Zusammenpipettieren von 16 ml Lösung 2, 4 ml Lösung 1 und 0,4 ml Plasminogen wird die Overlay-Agarose hergestellt. Diese wird nach Mischen im 37°C Wasserbad gehalten.

Zur Durchführung des Tests werden die Zellen in 60 mm Petrischalen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen. Anschließend werden je 2 ml "Overlay-Agarose" vorsichtig in die Petrischalen pipettiert. Die Petrischalen werden zum Abkühlen und Erstarren der Agarose bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird 2-3 h im Brutschrank bei 37°C unter Zugabe von 7% CO₂ inkubiert und die Größe und Anzahl der Lysehöfe bestimmt.

Beispiel 6 Isolierung eines neuen Polypeptids

Aus dem gemäß Beispiel 5 erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand wurde das tPA-Mutein nach Sterilfiltration und Zugabe von 0,01% ®Tween 80 durch eine Affinitätschromatographie an Erythrina-Trypsin-Inhibitor-Sepharose (ETI-Sepharose, 1 cm×3 cm) isoliert. Zur Herstellung der Affinitätsmatrix wurden 5 mg ETI an 1 ml CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt. Das Gelmaterial wurde vor dem Auftragen des Zellüberstands mit 20 mM Na-Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,01% ®Tween 80, pH 7,0 äquilibriert. Nach dem Auftragen wurde das Gelmaterial mit demselben Puffer behandelt, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Desorption des spezifisch gebundenen Muteins erfolgte anschließend durch Elution mit 0,1 M Glycin, 0,1 M Arginin/HCl, 0,01% ®Tween 80, pH 3,0. Das Eluat wurde vereinigt und mit 0,1 M Natronlauge auf pH 5,0 eingestellt.

Beispiel 7 Charakterisierung des Oligosaccharid-Anteils

5-10 µg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Muteins wurden durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Nach dem Absättigen mit PBS-Puffer (2 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4), der 0,1% ®Tween 20, pH 7,4 enthielt, wurde die Membran 2 h mit an Peroxidase gekoppeltem Lektin von Griffonia Simplicifolia inkubiert. Nach dem Entfernen ungebundenen Materials mit Hilfe von TBS-Puffer (10 mM Tris, 150 mM CaCl, pH 7,4) wurde die Nitrozellulose 5-10 min in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02% H₂O₂ und 0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol inkubiert. Positive Reaktionen wurden durch Blaufärbung der Proteinbande innerhalb von 5 min sichtbar. Die Reaktion wurde dann durch Transferieren der Nitrozellulose-Membran in Wasser gestoppt.

Die Oligosaccharid-Reste enthalten α-gebundene Galaktose-Reste, die gemäß Abb. 8 mit β-gebundenen subterminalen Galaktose-Resten verknüpft sind. Dabei sind die α-Galaktose-Reste bevorzugt an der Galaktose 6′ (Numerierung der Zuckerreste siehe Abb. 8) lokalisiert. Die anderen subterminalen Galaktose-Reste sind entweder durch Sialinsäure oder weitere α-gebundene Galaktose substituiert.

Claims

1. tPA-ähnliche Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Aminosäuresequenz des tPA aufweisen, worin 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, sowie deren Allelvarianten.

2. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.

3. Vektoren, die Gensequenzen enthalten, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.

4. Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Peptidsequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wirtsorganismus ein Gen zur Expression bringt, das für die Peptidsequenzen nach Anspruch 1 kodiert.

5. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, enthaltend die Kombination aus mindestens einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 und einem anderen Fibrinolytikum.