DE3886710T2

DE3886710T2 - Verfahren zur selektiven inhibierung von hiv.

Info

Publication number: DE3886710T2
Application number: DE88905514T
Authority: DE
Inventors: Kou Hwang; Jeffrey Lifson; Michael Mcgrath; Hin-Wing Yeung
Original assignee: University of California; Genelabs Inc
Current assignee: Genelabs Technologies Inc
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2008-05-28
Also published as: KR890701022A; US4869903A; EP0318562A4; EP0318562B1; JPH02500437A; DK38289A; OA09030A; DE3886710D1; AU613382B2; KR960007695B1; WO1988009123A1; DK38289D0; EP0318562A1; AU1952288A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Proteinen zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung von HIV-Infektionen und auf ein Verfahren zur selektiven Inhibierung (Hemmung) der zellulären Proliferation von HIV-infizierten Zellen in vitro.

Literaturverzeichnis

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Das menschliche Immunschwächevirus (HIV) ist ein Retrovirus, welches der ursächliche Wirkstoff für das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (aquired immunodeficiency syndrome; AIDS) und einer Reihe anderer Erkrankungen ist (Coffin). Das Virus wird durch parenterale Einimpfung und oder sexuellen Intimkontakt übertragen. Es wird geschätzt, daß in den USA gegenwärtig ungefähr zwei Millionen Menschen durvch HIV infiziert sind und nach aktuellen Einschätzungen wird die Mehrheit der jetzt infizierten Personen innerhalb einer Folgezeit von 7 - 10 Jahren AIDS oder eine andere schwerwiegende, mit HIV Zusammenhang stehende klinische Erkrankung entwickeln (Barnes).
HIV ist für Zellen, welche das Antigen CD4 (T4, leu3) für die Differenzierung der Zelloberfläche exprimieren, tropisch und zellschädigend. Man nimmt an, daß der virale Tropismus aus Wechselwirkungen zwischen CD4 und dem Umhüllungsprotein resultiert. Diese Wechselwirkungen scheinen an dem Prozeß beteiligt zu sein, durch welchen das HIV-Virus anfällige Zellen infiziert und auch dem Mechanismus zugrundezuliegen, durch den das HIV-Virus in T-Zellen eine Zellfusion induziert (Lifson, 1986a, 1986b; Dalgleish; Klatzman, 1984, 1984b; Maddon; McDougal, 1985a, 1985b; Sodroski). Der Prozeß der Zellfuxion, der zum Selltod führen kann, kann seinerseits zur fortschreitenden Erschöpfung des Bestandes an CD4-Zellen beitragen, welche für AIDS charakteristisch ist und welche ein Faktor sein kann, der zum HIV-induzierten Immunkompromiß und seinen sekundären Folgeerscheinngen, opportunistische Infektionen und Neoplasmen, beiträgt (Fahey).
Die Skala der Wirtszellen für das menschliche Immunschwächevirus (HIV) schließt außer CD4- und T-Zellen die Zellen der einkernigen phagogozytierenden Familie ein, welche periphere Blutmonocyten, Gewebemakrophagen (Steicher), Langerhans-Zellen der Haut und dentritische Zellen von retikulären Membranen (Armstrong) innerhalb der Lymphknoten umfaßt.
Einkernige Phagocyten kuonnen innerhalb des zentralen Nervensystems eine Hauptzielzelle (target cell) für die HIV-Infektion darstellen (Koenig; Gartner, 1986b). Zellen der Makrophagenfamilie stellen in vivo wahrscheinlich ein Hauptreservoir dar und können entweder allein oder durch ihre Wechselwirkungen mit T- Zellen zur Entwicklung und Pathogenese von AIDS und verwandten klinischen Krankheiten beitragen (Crowe). Zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Versuche legen nahe, daß ein großer Prozentsatz von Monocyten/Makrophagen, die aus HIV-infizierten Personen entnommen wurden, zur Expression von HIV-Antigenen befähigt ist, was auf eine weit fortgeschrittene Infektion der Vorläufer der makrophagen hindeutet. Es gibt auch Beweise dafür, daß uakrophagen, welche das HIV-Oberflächenantigen ausdrücken, mit CD4+ T-Zellen in Wechselwirkung treten und mit diesen verschmelzen können, was zur Zerstörung der wichtigen T-Zellen führt (Crowe).
Gegenwärtig werden intensive Anstrengungen zur Entwicklung von Therapien unternommen, welche die Entwicklung von ersten klinischen Symptomen bei HIV-infizierten Personen verhindern oder blockieren können. Diese Anstrengungen haben sich zum größten Teil auf die Verwendung von nukleosidanalogen Arzneimitteln konzentriert, welche das virale Reverse Transkriptase-Enzym hemmen (Yarochan, 1986, 1987; Broder, 1985, 1987). Es wäre zu erwarten, daß diese Arzneimittel die virale Erstinfektion von Zellen, wie T-Zellen und Monocyten/Makrophagen, hemmen, da Reverse Transkriptase für die frühe virale Infektion erforderlich ist. Wenn jedoch die virale Infektion in einer Zelle einmal stattgefunden hat und die virale Reproduktion dann unter Verwendung von Enzymen der Wirtszelle durchgeführt wird, wäre zu erwarten, daß die Inhibitoren der Reversen Transkriptase eine begrenzte hemmende Wirkung auf die virale Reproduktion und die Expression von viralen Antigenen auf der Oberfläche der Wirtszelle haben. In vitro durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß auch bei fortwährender Anwesenheit von Nukleosid-Analogen bei längerer Züchtung HIV-Reproduktion stattfindet. Obwohl Anzeichen einiger nützlicher Wirkungen beobachtet wurden, haben die frühen klinischen Untersuchungsergebnisse wenig Beweise dafür geliefert, daß diese Arzneimittel gegen ein späteres Fortschreiten der HIV-Infektion zu schweren klinischen Krankheiten wirksam sein könnten.
Es wurde gefunden, daß die virale Expression und die Zellproliferation bei HIV-infizierten T-Zellen und Monocyten/Makrophagen durch zwei Pflanzenproteine - Trichosanthin (TCS) und Momocharin (MMC) - selektiv gehemmt werden kann. Ein wesentlicher Gesichtspunkt dieser Feststellung ist die Erkenntnis, daß die virale Hemmung in HIV-infizierten Zellen bei Konzentrationen von TCS oder MMC erreicht werden kann, welche für nicht infizierte Zellen im wesentlichen nicht toxisch sind. Diese selektive Wirkung wird einige Tage nach dem Einwirkenlassen von TCS oder MMC durch eine deutliche Abnahme von viralem, mit HIV-infizierten Zellen berbundenem Antigen und meßbarer Aktivität der Reversen Transkriptase deutlich sichtbar, ohne daß dabei eine wesentliche Abnahme der Expression von nichtviralem Protein in nicht infizierten Zellen auftritt. Ein weiterer Gesichtspunkt der selektiven hemmwirkung von TCS und MMC, der beobachtet wurde, ist ein wesentlicher Verlust an Lebensfähigkeit der Zelle bei HIV-infizierten Zellen bei einer Konzentration von TCS und MMC, welche die Lebensfähigkeit von nicht infizierten Zellen nicht wesentlich vermindert. Normalerweise wurden diese selektiven Hemmwirkungen bei Konzentrationen von TCS oder MMC beobachtet, die zwischen etwa 0,01 und 3,0 ug/ml liegen.
Die selektive Hemmwirkung von TCS und MMC kann der vorgeschlagenen hemmwirkung dieser Proteine gegenüber Ribosomen zugeschreiben werden. MMC ist in einem zellfreien System ein starker Hemmer der Proteinsynthese (Barbierei, 1982) und es wurde im Hinblick auf die beobachtete homologie der Aminosäuren zwischen TCS und der A-Kette von Ricin aufgrund theoretischer Überlegungen angenommen, daß TCS ähnlich wie Ricin und verschiedene einkettige Pflanzenproteine oder Glykoproteine, welche N-Glykosidase- Aktivität besitzen und von welchen berichtet wurde, daß sie Ribosomen durch Glykosidspaltung an einer oder mehreren ausgewählten Stellen in der ribosomalen RNA (rRNA) inaktivieren, eine Ribosomen inaktivierende Wirkung hat.
Es wurde nun gefunden, daß eine große Zahl von einkettigen Proteinen mit Ribosomen inaktivierender Wirkkung, einschließlich Gelonin, verschiedene Arten von antiviralen Proteinen der Kermesbeere (pokeweed), α- Sarcin, Restriktocin, Mitolgillin und Ricin-A-Kette, auch eine selektive Hemmung der viralen Expression in HIV-infizierten T-Zellen bewirken. Es wurde auch gefunden, daß die selektiven Hemmwirkungen virusspezifisch sind, wie durch das Fehlen von selektiver Hemmung in T-Zellen nachgewiesen wurde, die mit dem HTLV-I-Virus, einem verwandten, aber verschiedenen menschlichen Retrovirus, infiziert waren.
Die selektive Hemmwirkung in HIV-infizierten Zellen kann (a) durch die selektive Hemmwirkung der viralen Antigenexpression durch TCS und MMC in HIV-infizierten Zellen der einkernigen phagozytierenden Linie; (b) durch selektive Hemmung der Zellproliferation, gemessen gegenüber dem Grad der Protein- und DNA-Synthese in behandelten, nicht infizierten T-Zellen; und (c) durch selektiven Verlust der Lebensfähigkeit von T-Zellen gezeigt werden. Diese Hemmwirkungen sind in T-Zellen für einige repräsentative einkettige oder eine A-Kette enthatende Pflanzen- und Pilzproteine mit Ribosomen inaktivierender Wirkung (scRIPs) beobachtet worden.
Es wurde weiterhin gefunden, daß die selektiven hemmwirkungen in HIV-infizierten T-Zellen durch kontiuierliche Einwirkung von scRIPs auf die Zellen bei einer ausgewählten Konzentration an scRIP oder durch kurzzeitige oder stoßweise (pulsed) Einwirkung, z. B. 30 - 120 Minuten, von scRIP auf HIV-infizierte Zellen erreicht werden können. Bei der stoßweisen (pulsierenden) Einwirkung (pulse-exposure) können die Konzentration von scRIP und die Einwirkungszeit so gewählt werden, daß eine fast vollständige Hemmung von HIV-infizierten T-Zellen ohne nennenswerte Hemmung von nicht infizierten Zellen bewirkt wird.
Dementsprechend sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer HIV-Infektion vor.
In weiterer hinsicht betrifft die Erfindung:
- ein Verfahren zur selektiven Hemmung der zellulären Proliferation von HIV-infizierten T-Zellen in vitro, umfassend das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins, welche wirksam ist, die Lebensfähigkeit von HIV-infizierten T-Zellen gegenüber nicht infizierten T-Zellen selektiv herabzusetzen; und
- ein in vitro-Verfahren zur selektiven hemmung einer HIV-Antigen-Expression in HIV-infizierten Zellen der einkernigen phagozytierenden Zellfamilie, umfassend das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins und während einer Dauer, welche wirksam sind, das Mengenverhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in den infizierten Zellen zu verringern.
HIV-infizierte T-Zellen können der Einwirkung eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins (scRIP) bei einer Konzentration und während einer Dauer ausgesetzt werden, welche wirksam sind, um eine wesentliche Herabsetzung der Expression des viralen Antigens in den Zellen zu bewirken. In dem Fall, daß die inhibierende Wirkung von MMC oder TCS für die Expression des viralen Antigens selektiv ist, kann die scRIP-Dosis und die Einwirkungszeit so gewählt werden, daß in den HIV-infizierten Zellen selektiv hemmen, kann die scRIP-Dosis und die Einwirkungszeit so gewählt werden, daß eine Hemmung der Zellproliferation in HIV-infizierten T-Zellen, wie sie beispielsweise durch selektiven Verlust der Zellebensfähigkeit in HIV-infizierten Zellen oder durch Hemmung der Thymidinaufnahme in den Zellen gemessen wird, ohne wesentliche Hemmung dieser Parameter in nicht infizierten T-Zellen bewirkt wird. Normalerweise liegt die Konzentration an Anti-HIV-Protein, welchem die Zellen ausgesetzt werden, zwischen etwa 0,01 und 1 ug/ml.
Die Fähigkeit der scRIPs zur hemmung der Expression des HIV-Antigens in infizierten T-Zellen kann zur Behandlung von HIV-Infektionen beim Menschen verwendet werden. Ein solches Verfahren umfaßt das Verabreichen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins an den Patienten in einer Dosis, welche wirksam ist, einen meßbaren Abfall bei mindestens einer der folgenden Indikationen einer HIV-Infektion zu bewirken:
(a) HIV-Antigenspiegel, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden sind;
(b) HIV-Antigenspiegel im Blutstrom;
(c) die Reverse-Transkriptase-Aktivität, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden ist;
(d) das Verhältnis der Lebensfähigkeit von HIV-infizierten zu nicht infizierten T-Zellen; und
(e) im Falle der Verwendung von MMC oder TCS, das Verhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in HIV-infizierten Zellen der einkernigen phagozytierenden Familie.
Die Abnahme der Indikation(en) ist vorzugsweise innerhalb 1 - 5 Tagen nach der Verabreichung des Proteins meßbar. Das Verfahren kann zusätzlich das alternative Messen der Abnahme in mindestens einer der Indikationen und das Widerholen der Verabreichung des Proteins umfassen, bis die gemessene Indikation der HIV-Infektion keine weitere Abnahme zeigt.
Bevorzugte scRIPs schließen aus Pflanzen abgeleitete und aus Pilzen abgeleitete scRIPs ein, wie Trichosanthin, Momorcharin, ein antivirales Protein der Kermesbeere, α-Sarcin, Mitogillin und Restrictocin.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden deutlicher, wenn die nachfolgende detailierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in welchen:
Figuren 1A - 1C chromatographische Elutionsdiagramme zeigen, die bei der Isolierung von Trichosanthin erhalten wurden;
Figuren 2A - 2C chromatographische Elutionsdiagramme zeigen, die bei der Isolierung von α- und β-Momorcharin erhalten wurden;
Figuren 3A - 3H sind zytofluorographische Diagramme (linearer Maßstab) von T-Zellen, welche zuerst mit einem (nicht spezifischen) Kontroll-Antikörper (Abbildungen auf der linken Seite) oder menschlichem anti- HIV-Antikörper (Abbildungen auf der rechten Seite) und dann mit Fluorescein-markiertem anti-menschlichem Antikörper für nicht infizierte T-Zellen (3A, B); HIV-infizierte T-Zellen (3C,D); und nicht infizierte oder HIV-infizierte T-Zellen 16 Tage nachdem sie 10 ug/ml TCS (3E, F) oder MMC (3G, H) ausgesetzt worden waren, zur Reaktion gebracht wurden.
Figur 4 zeigt die hemmung der Expression von p24-HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen in Prozent als Funktion der Konzentration von TCS (offene und gefüllte Quadrate) und MMC (Dreiecke);
Figur 5 zeigt die hemmung der Expression von p24-HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen in Prozent als Funktion der Konzentration von PAP-I (offene Quadrate), PAP-II (Dreiecke) und PAP-S (gefüllte Quadrate);
Figur 6 zeigt die Hemmung der Expression von p24-HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen in Prozent als Funktion der Konzentration von Mitogillin (offene Quadrate), Restrictocin (Dreiecke) und α-Sarcin (gefüllte Quadrate);
Figur 7 zeigt die Abnahme der HIV-Reproduktion in infizierten Zellen, die mit TCS und MMC behandelt wurden, wie durch die erniedrigten Spiegel von an Partikel gebundener Reverser Transkriptase (RT) gezeigt wird, die in der überstehenden Flüssigkeit der Kultur nachweisbar waren, die 5 Tage nach der Zugabe von TCS (gefüllte Diamanten) oder MMC (offene Quadrate) geerntet wurde, wobei gefüllte Quadrate das Fehlen von RT-Aktivität in nicht infizierten Zellen anzeigen;
Figuren 8A und 8B sind zytofluorographische Diagramme von permeabilisierten, nicht infizierten (8A) und HIV-infizierten Monocyten/Makrophagen nach Markerung mit Maus-anti-p24 Antikörper und mit Fluorescein-markiertem anti-Maus Antikörper;
Figur 9 zeigt die prozentuale Zunahme von Makrophagen, welche exprimiertes virales p24-Antigen enthalten (wie es durch permeabilisierte Fluoreszensanalyse (permeabilized fluorescence analysis) nachweisbar ist), als Funktion der Zeit nach der in vitro-Infektion mit HIV in normalen Makrophagen, die von zwei Spendern abgeleitet sind (offene Kreise und Dreiecke) und die Änderung der Lebensfähigkeit der Zellen, welche bei den Zellen während der gleichen Zeitspanne auftritt;
Figuren 10A - 10D sind zytofluorographische Diagramme von nicht infizierten (10A) und HIV-infizierten (10B) Monocyten/Makrophagen, sowie infizierten Makrophagen, die 4 Tage vor der Prüfung auf Anwesenheit von viralem p24-Antigen nach der Methode von Figur 8 mit 5 ug/ml TCS (10C) oder 5 ug/ml MMC (10D) behandelt wurden:
Figur 11 ist ein Diagramm, welches die Zunahme der Expression von HIV-p24-Antigen während einer Zeitspanne von 10 Tagen, nachdem aus einem HIV-infizierten Patienten isolierte Monocyten/Makrophagen in die Kultur eingebracht worden waren (offene quadrate) und die Hemmung der Expression von p24, wenn den Zellen beim ersten Einbringen in die Kultur 0,3 ug/ml TCS zugesetzt wurde (gefüllte Kreise) oder wenn das TCS (0,3 ug/ml) der Kultur nach 4 Tagen (gefüllte Quadrate) zugesetzt wurde, als bereits ein großer Teil der gezüchteten Zellen p24-Antigen ausdrückte;
Figur 12 ist ein Diagramm, welches die prozentuale Änderung von HIV-infizierten Monocyten/Makrophagenzelle mit nachweisbaren Gehalten an HIV-p24-Antigen (wie es durch permeabilisierte Fluoreszenzanalyse (permeabilized fluorescence analysis) nachweisbar ist), wie sie 0,24 und 96 Stunden nach der Zugabe von 5ug/ml TCS (gefüllte Dreiecke), MMC (offene Kreise) oder ohne Behandlung mit Medikament (gefüllte Kreise) gemessen wurde:
Figur 13 ist ein Diagramm, welches die prozentuale Änderung von HIV-infizierten Monocyten/Makrophagenzelle mit nachweisbaren Gehalten an HIV-p24-Antgen, gemessen 4 Tage nach Zugabe von 0, 0,5 oder 5ug/ml TCS (offene Dreiecke) oder MMC (offene Kreise) nach der bei Figur 8 angegebenen Methode;
Figur 14 zeigt die Expression von p24-Antigen in Prozent in Bezug auf unbehandelte Zellen (100%) 4 Tage nach der Zugabe von 0, 0,005, 0,05, 0,5 und 5u/ml MMC (Dreiecke);
Figur 15 zeigt den Grad der Hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, dargestellt als Funktion der TCS-Konzentration;
Figur 16A und 16B zeigt den Grad der hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, als Funktion der Einwirkungszeit von TCS (16A) oder MMC (16B) bei 2ug/ml;
Figuren 17A und 17B sind Diagramme, welche die absoluten Auszählungen von lebensfähigen Zellen für in gleicher Weise angelegte Kulturen von HIV-infizierten (H9.HIV) und nicht infizierten (H9) T-Zellen zeigen, die in Gegenwart von wechselnden Konzentrationen von TCS 2 Tage (Figur 17A) oder 5 Tage (Figur 17B) gezüchtet wurden, und Figur 17C zeigt den Prozentsatz von lebensfähigen Zellen, die nach 2 Tagen in gleichartig angelegten Kulturen, die mit wechselnden Konzentrationen von TCS behandelt wurden, vorhanden sind:
Figur 18A und 18B zeigen die prozentuale Hemmung der zellulären Proliferation von HIV-infizierten (H9.HIV) und nicht infizierten T-Zellen bei Zugabe von zunehmenden Konzentrationen von PAP-I, nachgewiesen durch hemmung des Einbaus von ³H-Thymidin in zelluläre DNA (18A) und Hemmung des Einbaues von ³H-Leucin in zeluläres Protein (18B);
Figur 19 zeigt den Grad der hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, als Funktion der Konzentration von PAP-II;
Figur 20 zeigt den Grad der Hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, als Funktion der Konzentration von mitogillin;
Figur 21 zeigt den Grad der hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, als Funktion der Konzentration von Restrictocin;
Figur 22 zeigt den Grad der Hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HIV-infizierten T-Zellen (H9.HIV) und nicht infizierten Zellen (H9) gemessen wurde, als Funktion der Konzentration von α-Sarcin; und
Figuren 23 - 23C zeigen den Grad der Hemmung der zellulären Proliferation, wie er durch prozentualen Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA in HTLV-infizierten T-Zellen (offene Quadrate) und nicht infizierten T-Zellen (gefüllte Quadrate) gemessen wurde, gemessen bei zunehmenden Konzentrationen von TCS (23A), MMC (23B) und Mitogillin (23C).

Definitionen

Wenn nicht anders angegeben, haben die nachstehenden Ausdrücke in vorliegender Beschreibung die folgenden Bedeutungen:
1. "HIV" bedeutet ein CD4+-abhängiges (T4, leu3-abhängig) menschliches Immunschwäche-Retrovirus, wie es durch HIV-1 beispielhaft dargestellt wird, und bekannte Varianten davon.
2. "Einkernige Zellen der phagozytierenden Familie" bedeutet einkernige CD4+-Phagozyten, welche periphere CD4+-Blutmonocyten, periotnale Makrophagen, Langerhans-Zellen der Haut, dentritische Reticulumzellen der Lymphknoten, Lungenmakrophagen, Kupfer-Zellen der Leber und Monocyten/Makrophagenzellen umfassen.
3. "Monocyten/Makrophagenzellen" sind einkernige Zellen der Familie der Phagozyten, die in peripherem Blut vorhanden sind und die Vorläufer von Blutmakrophagen darstellen. Die Zellen werden aus peripherem Blut oder aus Gewebe, das der menschlichen Milz durch Biopsie entnommen wurde, gewonnen und in Zellkulturen gezüchtet.
4. "T-Zellen" beduetet entweder transormierte T-Lumphoidzellen, die gegen HIV-Infektion empfindlich sind oder gegen HIV empfindliche Zellen, die aus Zubereitungen von primären, peripheren blutmononukleatzellen gewonnen werden.
5. "HIV-infizierte Zellen" bedeutet HIV-infizierte T-Zellen und/oder einkernige Zellen der phagocytierenden Familie.
6. "Nicht infizierte Zellen" bedeutet T-Zellen und/oder einkernige Zellen der phagocytierenden Familie, die nicht durch HIV-infiziert sind.
7. "Einkettige, Ribosomen inaktivierende Proteine (scRIP)" bezieht sich auf einkettige Proteine oder Peptide, die befuahigt sind, die Proteinsynthese in einem zellfreien System zur Synthese von Proteinen durch ortsspezifische enzymatische Inaktivierung von eukariotischer ribosomaler RNA zu hemmen, wie nachstehend in Abschnitt IV beschrieben wird.

II. Selktive hemmung der Expression von HIV-Antigen

In diesem Abschnitt werden die Parameter der selektiven hemmung der Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten menschlichen Zellen durch scRIPs geprüft. Die menschlichen Zellen, welche speziell beschrieben werden, sind T-Zellen, deren Zerstörung in vivo bei einer fortgeschrittenen klinischen HIV-Infektion mit einem Verlust der immunologischen Funktion verbunden ist, und Monocyten/Makrophagen, ein Typ von einkernigen Zellen der phagozytierenden Familie, wie er oben erläutert wurde, welche wahrscheinlich ein Reservoir des Virus in der infizierten Person darstellen und, wenn sie HIV-Proteine exprimieren, befähigt sein können, mit T-Zellen zu verschmelzen und sie zu zerstören. Die Monozyten/Makrophagen können auch bei der Verbreitung der Infektion eine Rolle spielen, insbesondere innerhalb des Nervensystems (Koenig).

A. T-Lymphozytenzellen

Normale menschliche T-Lymphozyten können durch Standard-Verfahren (Foung) aus peripherem Blut oder aus festem lymphoiden Gewebe hergestellt werden. Die Zellen schließen eine Fraktion von CD4+-Zellen ein, die gewünschtenfalls mit auf Affinität beruhenden Verfahren, welche für das CD4+-Oberflächenantigen spezifisch sind, weiter isoliert werden können. Im Normalfall wird die Mischung von CD4+-Oberflächenantigen spezifisch sind, weiter isoliert werden können. Im Normalfall wird die Mischung von CD4+- und Nicht- CD4+-Zellen verwendet. Die Zellen werden während einer Zeitspanne von einigen Tagen bis einigen Wochen durch Aktivierung mit einem bekannten Lymphzytenmitogen, wie PHA, in einer Kultur und in Standard-Zellmedien, wie RPMI-1640-Medium, das mit fötalem Kalbsserum und Interleukin-2 ergänzt ist, gehalten. Die gezüchteten T-Lumphozyten können in vitro mit HIV infiziert werden, beispielsweise unter Verwendung eines HIV-Isolates, das von einem AIDS-Patienten gewonnen wurde.
Außerdem können zusammenhängende Stämme von T-Zellen, die normalerweise von Patienten mit malignen Lumpherkrankungen gewonnen werden, ebenfalls verwendet werden. Solche Zellen können in Standard-Kulturmedien, wie RPMI-1640, welches durch in der hitze inaktiviertes fötales Kalbsserum ergänzt ist, gehalten werden.
Ein charakterisches Merkmal von HIV-infizierten T-Zellen ist das Auftreten von HIV-Umhüllungsproteinen, insbesondere der hauptsächlichen Umhüllungsproteine gp120 und gp41, auf der oberfluache der infizierten Zellen. Wie oben angedeutet, scheint gp120 eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von CD4+-T-Lymphozyten und der nachfolgenden Zerstörung dieser Lumphozyten zu spielen, gp41 kann ebenfalls bei der durch HIV-Umhüllung vermittelten Zellfusion beteiligt sein (Kennedy). Daher kann die in vorliegender Beschreibung erwähnte Fähigkeit der sc RIPs, die Expression dieser viralen Antigene zu hemmen, ein wichtiger hinweis auf di Fähigkeit des Proteins sein, durch Viren vermittelte, zur Zerstörung von T- Zellen führende Prozesse zu hemmen und den Verlust der immunologischen Funktion aufzuhalten, der bei mit HIV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, wie AIDS, beobachtet wird. Die gezeigten antiviralen Eigenschaften sind jedoch nicht auf die Wirkung nach diesem Mechanismus beschränkt.
Wie in beispiel 3 im einzelnen beschrieben ist, wurden die Wirkungen von TCS und α-MMC auf die Expression des HIV-Antigens (einschließlich gp120 und gp41) auf der Oberfläche von infizierten T-Zellen geprüft. Die Wirkung des fortgesetzten Einwirkenlassens von TCS und MMC auf die Expression von HIV- Antigen wird in Figur 3 gezeigt. HIV-infizierte T-Zellen (Zellstamm H9) wurden 16 Tage mit 10 ug/ml TCS oder α-MMC behandelt und dann durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse auf Expression von HIV-Antigen geprüft. Zusammenfassend dargestellt wurde menschliches Serum von einer HIV-positiven Person mit Testzellen inkubiert und anschließend wurde gewaschen und gebundenes spezifisches IgG mit Ziegen-antimenschlichem IgG-Reagens nachgewiesen. Die Ergebnisse der quantitativen Fließzytometrie-Analyse sind in Figur 3 dargestellt und werden in Beispiel 3 diskutiert. Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl TCS als auch MMC den Grad der Expression von HIV-Antigen in behandelten, HIV-infizierten T-Zellen auf Hintergrundniveau herabsetzen.
Ein weiteres HIV-Antigen, welches als ein Indikator für die Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen verwendet werden kann, ist das HIV-Kernproteinantigen p24. Dieses Antigen, das hauptsächlich in den infizierten Zellen lokalisiert ist, kann leicht durch Behandeln der Zellen mit einem die Membranen durchdringenden Mittel, wie Triton X-100 , um das Eindringen von anti-p24-Maus monoklonalem Antikörper in die Zellen zu erleichtern, und dann durch Behandeln der Zellen mit einem mit einem fluoreszierenden Mittel markierten anti-Maus-IgG-Antikörper bestimmt werden. Diese Verfahren sind im einzelnen in Beispiel 4 beschrieben. Andererseits kann die virale Reproduktion durch Bestimmen der menge von HIV- p24-Antigen, das entweder in den überstehenden zellfreien Flüssigkeiten von infizierten Kulturen oder in Lysaten von infizierten Zellen vorhanden ist, durch Verwendung einer auf Antigenfang basierenden immunologischen Bestimmung vom Schichttyp quantitativ erfaßt werden. Beide Arbeitsweisen liefern ein Maß für die Expression oder die Produktion von viralem Antigen, d.h. für die Menge von HIV-Antigen, das durch die infizierten Zellen produziert wird und das durch die enzelnen verwendeten Analysenmethoden nachweisbar ist.
Die Wirkung von niedrigen Konzentrationen einiger scRIPs auf die Expression von p24 in HIV-infizierten T-Zellen wurde nach Verfahren bestimmt, die im einzelnen in Beispiel 4 beschrieben sind. Es wurden HIV- infizierte und nicht infizierte T-Zellen mit dem ausgewählten scRIP bei kontinuierlicher Einwirkung von Konentrationen zwischen 0,01 und 5ug/ml während 10 Tagen gezüchtet und dann wurde das p24-Antigen wie oben beschrieben bestimmt. Figur 4 zeigt die prozentuale Hemmung von p24, die durch die angegebenen TCS- und MMC-Konzentrationen bewirkt wurde. Die Daten zeigen eine im wesentlichen vollständige Hemmung von viralem Antigen bei kontinuierlichem Einwirkenlassen von scRIP-Konzentrationen von 1g/ml.
Figur 5 zeigt die Wirkung von drei Zubereitungen von antiviralem Protein der kermesbeere auf die Expression von p24 in HIV-infizierten T-Zellen. Die Ergebnisse sind den mit TCS und MMC erzielten Ergebnissen qualitativ ähnlich, obwohl geringfügig höhere scRIP-Konzentrationen erforderlich waren, um eine vollständige hemmwirkung der Expression von p24 zu bewirken.
In Figur 6 wird die Hemmwirkung von drei Pilz-sc-RIPs auf die Expression von p24 in HIV-infizierten Zellen dargestellt. Wie ersichtlich ist, bewirkten die niedrigsten geprüften Konzentrationen vollständige oder fast vollständige Hemmung der Expression von p24 in infizierten T-Zellen. Die offensichtlich größere spezifische Aktivität der Pilz-scRIPs kann teilweise auf ihre niedrigeren Molekulargewichte (Abschnitt I) und damit höhere molare Konzentration bei der in ug/ml angegebenen Konzentration zurückzuführen sein.
Es wurde bestätigt, daß die oben diskutierte Hemmung der Expression von HIV-Antigen eine Hemmung der viralen Reproduktion darstellt, wie durch den Verlust des Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT-Aktivität) in infizierten Zellen angezeigt wird. Dieses Merkmal ist aus Figur 7 ersichtlich, welche die Aktivität der Reversen Transkriptase in HIV-infizierten T-Zellen als Funktion der TCS- oder MMC-Konzentration dar stellt. Die Abnahme der RT-Aktivität steht im Einklang mit der Hemmung der Expression des HIV-Oberflächenantigens in infizierten Zellen (Figur 3).
Wie aus dem nachfolgenden Abschnitt III ersichtlich ist, bewirkt die Konzentration von 0,1 - 1ug/ml scRIP, die erforderlich ist, um im wesentlichen eine vollständige Hemmung der Expression des HIV-Antigens in infizierten T-Zellen zu bewirken, wenn überhaupt, nur eine geringe Hemmung der zellulären Proliferation in nicht infizierten T-Zellen. Diese Selektivwirkung bei T-Zellen kann daher ausgenutzt werden, um eine HIV- Infektion in infizierten T-Zellen bei geringer toxischer Wirkung auf nicht infizierte Zellen zu hemmen.

B. Einkernige Zellen der phagozytierenden Familie

Da die einkernigen Zellen der phagozytierenden Familie (MPLC) eine andere Gruppe von durch HIV infizierbaren Zellen darstellen und wahrscheinlich ein wichtiges Reservoir des Virus im Menschen bereitstellen, ist die hemmende Wirkung von MMC und TCS gegen HIV-Infektion in dieser Gruppe von Zellen ebenfalls von Interesse. Der Zelltyp, der geprüft wurde ist der Monozyten/Makrophagen-Typ, eine einkernige Zelle der Makrophagenlinie, die im peripheren Blut vorkommt und ein Vorläufer von Gewebemakrophagen ist. Diese Zellen, welche in vorliegender Beschreibung der Einfachheit halber als "Monozyten" bezeichnet werden, können aus peripherem Blut oder aus lebendem, der menschlichen Milz entnommenen Gewebe nach bekannten Verfahren isoliert werden (Crose). Die Zellen werden vorzugsweise in einem neuen in vitro Kultursystem gezüchtet, welches mit Teflon beschichtete Gefäße verwendet, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist. Bei der in vitro-Züchtung machen die aus peripherem Blut gewonnenen Monozyten eine Differenzierung durch und erwerben einige charakteristische Eigenschaften von Gewebemakrophagen. Zur Isolierung der Monozyten läßt man die einkernigen Zellen von peripherem Blut an einer Glasschale ankleben, was die Trennung der Monozyten von den nicht haftenden Lumphozyten erlaubt. Die abgetrennten Monozyten werden dann als Suspension in Schalen gezüchtet, die mit Teflon beschichtet sind. Obwohl sich die Zellen nicht vermehren, können sie während bis zu 4 Monaten oder mehr ohne wesentlichen Verlust an Lebensfähigkeit der Zellen in lebensfähigem Zustand in der Kultur gehalten werden.
Die Zellen können, wie in Beispiel 6 beschrieben, in vitro mit einem HIV-Isolat infiziert werden, oder sie können in infizierter Form von einer HIV-infizierten Person durch ähnliche Verfahren erhalten werden. Die Expression von HIV-Antigen in Monozyten/Makrophagen kann, wie oben ausgeführt wurde, leicht durch die Änderungen des Gehaltes an p24-Antigen verfolgt werden. Figuren 8A und 8B zeigen 10 Tage nach der in vitro vorgenommenen HIV-Infektion gemessene, zytofluorograghische Diagramme von HIV-infizierten Monozyten, die mit (nicht spezifischen) Kontroll-Antikörpern bez. mit Maus-anti-p24-Antikörpern reagieren gelassen wurden. Etwa 60% der Zellen zeigen nachweisbare (über Hintergrund) Fluoreszenzintensitäten was eine HIV-Infektion anzeigt.
Ein wichtiges Merkmal des Systems von Monozyten-Zellkulturen zum Studium der HIV-Infektion und von inhibitoren besteht darin, daß die Zellen in aktiv infizierten Zustand während längerer Zeitspannen von einigen Wochen oder mehr in der Kultur gehalten werden können. Dieses Merkmal ist aus Figur 9 ersichtlich, welche die Lebensfähigkeit der Monozyten (gefüllte Symbole) und Gehalte an p24-Antigen (offene Symbole) als Funktion von Tagen nach der in vitro erfolgten Infektion mit HIV darstellt, wobei die Kreise und Dreiecke zwei verschiedene Monozyten-Donoren darstellen. Experimentelle Einzelheiten werden in Beispiel 6 gegeben. Wie ersichtlich ist, nimmt das virale Antigen bis zu einem Maximum von etwa 50 - 60% infizierter Zellen stetig zu und bleibt dann nach etwa 2 Wochen auf der gleichen Höhe, während die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Testperiode im wesentlichen unverändert bleibt.
Die Hemmung der Expression von viralem Antigen in HIV-infizierten Monozyten bei Einwirkung von TCS oder MMC ist in Figur 9 dargestellt. Hier werden 5 ug/ml TCS oder MMC 10 Tage nach der HIV-Infektion auf die Monozyten einwirken gelassen und die Zellen werden 4 Tage später durch Fließzytometrie analysiert. Figuren 10A und 10B zeigen die zytofluorographischen Diagramme von unbehandelten Zellen, die nach Reaktion mit (nicht spezifischem) Kontroll-Antikörper und anti-p24-Antikörper ähnlich wie in Figuren 8A bez. 8B analysiert wurden. Die zytofluorograghischen Diagramme von mit TCS und MMC behandelten Zellen werden in Figuren 10C bez. 10D dargestellt. Der Gehalt an p24, der bei den mit scRIP behandelten Zellen (Figuren 10C, 10D) erkennbar ist, liegt nahe bei Hintergrundniveau (Figur 10A), was 4 Tage nach dem Einwirkenlassen von antiviralen Proteinen eine im wesentlichen vollständige Hemmung der Expression von viralem Antigen anzeigt. Beispiel 7A beschreibt Einzelheiten des Verfahrens.
Der zeitliche Verlauf des Verlustes an p24-Antigen in infizierten Monozyten nach dem Einwirkenlassen TCS oder MMC ist aus Figur 12 ersichtlich. Jeder Zeitpunkt stellt den Prozentgehalt Zellen mit einer über dem Hintergrund liegenden antigen-spezifischen Fluoreszenz dar, der wie oben beschrieben durch Fließzytometrie (flow cytometry) bestimmt wurde. Unbehandelte Zellen (gefüllte Kreise) zeigen wenig Änderung des Antigenspiegels, wogegen Zellen, die sowohl mit TCS (Dreiecke) als auch mit MMC (offene Kreise) behandelt wurden, einen Tag danach eine mehrfache Änderung des viralen Antigens und 4 Tage nach dem Einwirkenlassen von TCS oder MMC einen im wesentlichen vollständigen Verlust von p24-Antigen zeigen. Einzelheiten der Untersuchungen werden in Beispiel 7B gegeben.
Die Daten in Figur 13, welche die Hemmung der Expression von p24 als Funktion von TCS oder MMC qufzeichnen, zeigen, daß sowohl TCS als auch MMC bei einer Konzentration von 0,5 ug/ml eine fast vollständige Hemmung der Expression von p24 bewirken. Aus Figur 14 ist die prozentuale Hemmung von p24 bei 3 Stunden stoßweisem Einwirkenlassen (pulse exposure) von MMC bei so niedrigen Konzentration wie 0,5 ug/ml ersichtlich. Die Daten zeigen eine fast vollständige Hemmung bei einer Konzentration von 5 ug/ml.
Es wurde gefunden, daß die hemmende Wirkung von TCS oder MMC auf HIV-infizierte Monozyten für virale Proteine selektiv ist, zumindest wenn man eine niedrige Dosis des scRIP kurzzeitig stoßweise (pulse exposure) auf die infizierten Zellen einwirken läßt. Speziell wurde gefunden, daß HIV-infizierte Monozyten, wenn sie einer stoßweisen Gabe von TCS von niedriger Ionzentration ausgesetzt werden, eine deutliche Abnahme von meßbarem p24 (Figur 14), jedoch keine wesentliche Abnahme von meßbaren zellulären Oberflächenantigenen zeigen, wie durch das Oberflächenantigen HLA-DR veranschaulicht wird. Einzelheiten der untersuchung werden in Beispiel 7D geliefert.
Es wurde auch die Anwesenheit von HIV in Makrophagen, die aus AIDS-Patienten isoliert wurden und die Hemmung der Expression von HIV-Antigen in in vivo infizierten und von einem infizierten Spender isolierten Monozyten untersucht. Es wurden einige Monozytenpräparate sowohl aus peripherem Blut als auch aus Milzzellen von Aids-Patienten auf Expression von p24-Antigen untersucht. Die Makrophagenkulturen wurden im wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Spender HIV- seropositiv waren und daß kein von außen kommendes virus zugesetzt wurde, ume eine in vitro-Infektion zu bewirken. Die Quelle für HIV in der kultur war diejenige, die aufgrund einer natürlichen in vivo-Infektion des Zellspenders vorhanden war. Monozyten, die unmittelbar nach der Isolierung untersucht wurden, enthielten nur einen geringen Prozentsatz an HIV-positiven Zellen, wie durch die Anwesenheit von p24-Antigen deutlich erkennbar war. Der Prozentsatz von Zellen mit p24-Expression nahm in der Kultur während einer Zeitspanne von 3 bis 4 Tagen allmählich zu, wie für eine Kultur von Milzzellen (offene Quadrate) in Figur 11 gezeigt wird. In fünf untersuchten Monozytenpräparaten, die von HIV-seropositiven Personen gewonnen wurden, exprimierten die gezüchteten Zellen nach 3 bis 4 Tagen in der Kultur etwa 10% bis 40% p24. Die Ergebnisse zeigen, daß ein großer Anteil der in HIV-seropositiven Personen vorhandenen Monocyten mit HIV infiziert waren. Offensichtlich exprimiert nur ein kleiner Prozentsatz dieser infizierten Zellen HIV-Antigene, wenn sie nicht während kurzen Zeitspannen in vitro gezüchtet werden. Die Möglichkeit, daß die Zunahme der Zahl von Zellen, welche p24 exprimieren, durch die Verbreitung des Virus unter den gezüchteten Zellen verursacht wird, ist in Anbetracht der relativ neiedrigen Geschwindigkeit der Expression von p24 in frisch infizierten gezüchteten Monozyten (Figur 7) unwahrscheinlich.
Die hemmende Wirkung von TCS auf die Expression von p24 in den in vivo infizierten Zellen wurde sowohl am Anfang der Kultur, als der Prozentsatz von p24 exprimierenden Zellen ziemlich niedrig war, als auch in einer separaten Kultur 5 Tage nach Beginn der kultur untersucht, zu welcher Zeit Expression von p24 in etwa 45% der Zellen beobachtet wurde. Figur 11 zeigt die Ergebnisse der Behandlung mit TCS (0,3 g/ml) von 5 10&sup5; Monozyten die während einer Zeitspanne von 10 Tagen gezüchtet wurden. Am Beginn der Kultur zugesetztes TCS verhinderte die Expression von HIV-Antigen während der Versuchszeit von 10 Tagen vollständig. Wenn TCS der 5 Tage alten Kultur der Monozyten zugesetzt wurde, verminderte es den Prozentsatz von Zellen, welche p24 exprimierenden, innerhalb von 3 Tagen von etwa 45% auf 2%, und innerhalb von 5 Tagen verminderte es den prozentsatz von p24 exprimierenden Zellen auf Hintergrundniveau. Aus diesen Daten ist klar ersichtlich, daß TCS die Expression von HIV-Antigen in Monozyten, die einer infizierten Person entnommen wurden, entweder vor oder nach dem Auftreten der Expression des antigens in der kultur blockieren kann.
Die in diesem Abschnitt diskutierten Verfahren und Erkenntnisse können wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Anfängliche Erkenntnisse, die in der kopendenten Patentanmeldung für ein "Verfahren zur Hemmung von HIV" dargelegt wurden, zeigten, daß niedrige Konzentrationen von TCS und α- und β-MMC die Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen und einkernigen Zellen der Familie der Makrophagen in wirksamer Weise hemmen. Niedrige Konzentrationen (z.B. weniger als etwa 1 ug/ml) der gleichen Verbindungen ergab lediglich eine geringfügige Hemmung der Proteinsynthese in nicht infizierten Zellen.
2. Die oben erwähnten selektiven Hemmwirkungen auf die virale Expression in infizierten T-Zellen wurde nun für einige zusätzliche einkettige, Ribosomen inaktivierende Proteine gezeigt, die sowohl aus Pflanzen als auch aus Pilzen gewommene scRIPs einschließen.
3. Zusätzliche zu den selektiven, in HIV infizierten T-Zellen beobachteten Hemmwirkungen (wie sie durch eas Fehlen der hemmung von rotein, das in nicht infizierten Zellen bei niedrigem scRIP-Konzentrtionen bewirkt wird, nachgewiesen wird) sind MMC und TCS befähigt, bei niedrigen Konzentrationen und/oder kurzen Einwirkungszeiten, die virale Proteinsynthese in HIV-infizierten Monozyten/Makrophagen selektiv zu hemmen.

III. Selektive Hemmung der Vermehrung von T-Zellen

Untersuchungen, die in einer bereits früher hinterlegten kopendenten Patentanmeldung beschreiben sind, zeigten, daß TCS in HIV-infizierten Zellen eine deutliche selektive Verminderung der Zellproliferation und der Lebensfähigkeit der Zellen bewirkte. In diesem Abschnitt werden die Parameter der selektiven hemmung der Zellproliferation in HIV-infizierten Zellen untersucht. Die selektive Hemmwirkung von einigen repräsentativen scRIPs auf die Zellproliferation bei niedriger Dosierung wurde nun nachgewiesen. Außerdem wurde gefunden, daß im wesentlichen vollständige Selektivität durch pulsierende Dosierung (pulse dosing) errecht werden kann. Es wird auch gezeigt, daß die selektiven Wirkungen relativ spezifisch für die HIV-Infektion sind, da keine nennenswerten selektiven Hemmwirkungen in T-Zellen beobachtet werden, die mit dem verwandten, jedoch verschiedenen menschlichen Retrovirus HTLV-I infiziert sind.
Die Hemmung der Zellproliferation wurde durch Verfolgen der Hemmung der Aufnahme von Thymidin in behandelten Zellen bestimmt, und in einigen Fällen wurde dieses Verfahren durch Daten der hemmung der aufnahme von Aminosäure und/oder der herabsetzung der Lebensfähigkeit der Zellen ergänzt. Die Einzelheiten dieser Untersuchungen der zellulären Hemmung werden in Beispielen 8 und 9 gegeben.
Um die wirksame Hemmdosis von scRIP zu bestimmen, wurden die nicht infizierten und die HIV-infizierten Zellen wachsenden Mengen der ausgewählten scRIP, normalerweise bei Konzentrationen zwischen 0,01 und 5 ug/ml und einer Einwirkungszeit von 3 Tagen, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann 12 Stunden mit radioaktiv markiertem Thymidin pulsierend behandelt und die in die zelluläre DNA eingebaute radioaktive Markierung als Gradmesser für die Zellproliferation gemessen. Figur 15 zeigt die Grade der Aufnahme von Tymidin, die bei 0,01, 0,1 1, 5 und 10 ug/ml TCS gemessen wurden, wobei H9 und H9.HIV nicht infizierte bez. HIV-infizierte T-Zellen bezeichnen. Wie ersichtlich ist, wird bei etwa 0,2 ug/ml eine 50%ige Hemmung von infizierten Zellen erreicht, wogegen der gleiche Grad von Hemmung in nicht infizierten Zellen fast 10ug/ml TCS erfordert. Der als Verhältnis der beiden Konzentrationen definierte Selektivitätsindex beträgt für TCS somit etwa 50. Ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden für MMC erhalten.
Wie aus Figur 15 ersichtlich ist, wurde die maximale selektive Wirkung (größte Differenz zwischen den beiden Kurven) bei 1 ug/ml TCS beobachtet. Gemäß einer Form der Erfindung wurde festgestellt, daß die Selektivität der Hemmung zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen wesentlich verstuarkt werden kann, wenn man die Zellen im Unterschied zu einer kontinuierlichen Einwirkung einer pulsierenden Dosierung von ausgewählter scRIP aussetzt. Dieser Effekt ist aus Figuren 16A und 16B ersichtlich, welche die Hemmung der Aufnahme von Thymidin als Funktion der Einwirkungszeit von 2ug/ml TCS (16A) oder MMC (16B) darstellen. Wie gezeigt wird, ergab kein geprüftes scRIP eine nennenswerte hemmung der aufnahme von Thymidin durch nicht infizierte Zellen nach Einwirkung der Verbindungen während bis zu 2 Stunden. Im Gegensatz dazu rechte 2-stündiges Einwirkenlassen ohne nachfolgende Einwirkung aus, um eine fast follständige hemmung der Zellproliferation bei infizierten Zellen zu bewirken, wenn diese 3 Tage später gemessen wurde.
Figuren 17A - 17C zeigen die Wirkung von zunehmenden Konzentrationen von TCS auf die Lebensfähigkeit der Zellen, wie es in der früher eingereichten Patenanmeldung beschrieben ist. Die Zahl von lebenden Zellen 2 und 5 Tage nach der Zugabe von TCS in der angegebenen Konzentration ist in Figuren 17A bez. 17B dargestellt und der Prozentsatz an lebenden Zellen in Figur 17C, wobei die Lebensfähigkeit durch vitalen Farbausschluß (vital dye exclusion) (Trypan Blue) bestimmt wurde.
Die Daten für die Lebensfähigkeit der Zellen in den Figuren zeigen, daß infizierte Zellen leichter abgetötet werden, insbesondere bei höheren Konzentrationen von TCS, wobei bei 2 Tagen ein ausgeprägterer Effekt beobachtet wurde als bei 5 Tagen. Dies spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wieder, daß weniger als 100% der Zellen innerhalb der "infizierten" Population wirklich ergiebig (productively) infiziert waren. Zellen, welche nicht ergiebig infiziert sind, scheinen gegenüber TCS und MMC weniger empfindlich zu sein. Der ersichtliche relativ geringere Effekt der Einwirkung des Wirkstoffes auf die Anzahl der Zellen bei Tag 5 kann das bevorzugte schnellere Wachstun von einzelnen Zellen innerhalb der "infizierten" Population, die selbst nicht ergiebig infiziert sind, widerspiegeln. Der Vergleich der Gesamtzahl von lebenden Zellen mit dem Prozentsatz der Lebensfähigkeit legt nahe, daß TCS in einer von der Dosis abhängigen Weise sowohl eine zytozide (zelltötende) als auch eine zytostatische (das Zellwachstum hemmende) Wirkung ausüben kann, wobei die Wirkungen auf HIV-infizierte Zellen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen bei einer vorgegebenen Peptikonzentration bevorzugt sind. Ähnliche Ergebnisse wurden mit α- und β-MMC erhalten.
Figuren 18A und 18B zeigen den Grad von zellulärer Hemmung von H9- und H9.HIV-Zellen bei der Einwirkung von zunehmenden Konzentrationen von PAP-I. Wie aus Figur 18A ersichtlich ist, sind die 50%- Hemmkonzentrationen und der Selektivitätsindex für die Aufnahme von Thymidin den für TCS beobachteten Werten sehr ähnlich. Figur 18B zeigt, daß die Hemmung des Einbaus von Aminosäure (Leucin) in behandelte H9- und H9.HIV-Zellen sich eng an die Hemmung der Thymidinaufnahme anschließt.
Figuren 19 - 22 zeigen selektive Hemmkurven für H9- und H9.HIV-Zellen, die mit PAP-II (figur 19), Mitolgillin (figur 20), Restrictocin (Figur 21) und α-Sarcin (Figur 22) behandelt wurden. In allen Fällen lag der Selektivitätsindex zwischen 50 und 70. In Übereinstimmung mit den Daten für die Hemmung des viralen Antigens, die im obigen Abschnitt III diskutiert wurde, zeigen die Daten, daß die drei geprüften Pilzproteine bei etwas niedrigeren Konzentrationen wirksam sind als sie bei scRIPs pflanzlichen Ursprunges beobachtet wurden.
Die hemmende Wirkung von gereinigtem Ricin mit A-Kette auf HIV-infizierte T-Zellen wurde ebenfalls untersucht. Sowohl infizierte als auch nicht infizierte Zellen wurden bei steigenden konzentrationen zwischen 0,001 und 10 ug/ml einem eine A-Kette entaltendem Ricin ausgesetzt. Die Zellhemmung wurde durch Hemmung der Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen. Die infizierten und nicht infizierten Zellen wurden sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von 100 mMol Laktose getestet, welche zugesetzt wurde, um die nicht spezifische Toxizität von verunreigender B-Kette in der Zubereitung des ein gereinigtes, eine A- Kette enthaltenden Ricins zu kontrollieren.
Der Grad der Hemmung der Aufnahme von ³H-Thymidin betrug in nicht infizierten Zellen bei 10 ug/ml Ricin mit A-Kette etwa zwischen 20 und 30% und die Laktose hatte eine geringe Wirkung. Im Gegensatz dazu stieg die Hemmung von HIV-infizierten Zellen zwischen 0,1 und 1 ug/ml deutlich und war bei 10ug/ml Ricin mit A-Kette praktisch vollständig (98% Hemmung).
Die hemmende Wirkung von scRIPs auf T-Zellen, welche mit HTLV-I infiziert waren, wurde ebenfalls untersucht, HTLV-I (menschlicher T-Zellen-Leukämie/Lumphom-Virus) hat einige Merkmale mit HIV gemeinsam, welche einen Tropismus für OKT4/leu3+-Lumphozyten, eine MG&spplus;²-abhängige hochmolekulare Reverse Transkriptase, ähnliche Größe und Natur einiger Strukturproteine und beschränkte nukleinsäure- Homolgie (Sarngadharan) einschließen.
Mit HTLV-I-infizierte T-Zellen wurden nach den in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren steigenden Konzentrationen von TCS,MMC oder Mitogillin ausgesetzt. Die Hemmung der Aufnahme von Thymidin wird für die drei geprüften Proteine in Figuren 23A - 23C sowohl für nicht infizierte (H9) als auch für infizierte (C9/PL) T-Zellen als Funktion der scRIP-Konzentration dargestellt. Es wurde bei keiner der geprüften Verbindungen eine selektive Hemmwirkung beobachtet. Insbesondere waren mit HTLV-I infizierte Zellen nicht empfindlicher gegen die hemmung durch diese Verbindungen als die nicht infizierten H9-Zellen. Die in diesem Abschnitt diskutierten Verfahren und Erkenntnisse können wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Anfängliche Befunde, die in der kopendenten Patentanmeldung für "Verfahren zur Hemmung von HIV" dargelegt sind, zeigen, daß TCS und MMC die zelluläre Proliferation in HIV-infizierten T-Zellen selektiv hemmen könne, wie sowohl durch Hemmung der Aufnahme von Thymidin als auch durch die verminderte Lebensfähigkeit der Zellen nachgewiesen wurde.
2. Die selektiven Hemmwirkungen auf die zelluläre Proliferation in infizierten T-Zellen wurde nun für einige zusätzliche, den Proteinen mit A-Kette ähnliche Pflanzen- und Pilzproteine gezeigt. Alle getesteten Verbindungen zeigten einen Selektivitätsindex zwischen etwa 50 - 70, wenn sie unter Analysenbedingungen geprüft wurden, welche ein kontinuierliches Einwirkenlassen der Verbindungen auf HIV-infizierte und nicht infizierte Zellen einschließen.
3. Durch Behandeln von infizierten T-Zellen mit pulsierender Dosierung (pulse dosing) von scRIPs kann im wesentlichen vollständige Selektivität (d. h. keine meßbaren Hemmwirkungen auf nicht infizierte Zellen) erreicht werden.
4. Die Hemmwirkungen sind für HIV spezifisch, wie durch das Fehlen jeglicher Selektivität in T-zellen nachgewiesen wurde, die mit dem verwandten, jedoch verschiedenen menschlichen Retrovirus HTLV-I infiziert waren.

IV. Einkettige Ribosomen inaktivierende Proteine

Die scRIP-Proteine, welche gemäß vorliegender Erfindung verwendbar sind, können in Abhängigkeit von der herkunft des Proteins (Pflanze, Pilz oder Bakterium) in eine von vier Gruppen und eine Strukturuntereinheit der natürlich vorkommenden Proteine (einkettige oder zweikettige Untereinheit) eingeteilt werden.
Die erste Gruppe schließt einkettige Inhibitoren der Proteinsythese ein, welche von einer großen Zahl von Pflanzen produziert werden. Beispiele von Proteinen dieser Gruppe sind TCS (Law, Kuo-Fen, Gu, Xuejun, Wang, Kezhen), MMC (Falasca, Spreafico, Lin, 1970, 1978, Barbieri, 1979, 1980), die antiviralen Proteine der Kermesbeere (Barbieri, 1982, Irvin , 1975, 1980,1983), Gelonin (Stirpe, 1980), Dianthin 30 und Dianthin 32 (Stirpe, 1981), Crotin II (Conde) Curcin II (Conde), Weizenkeimhemmer (Roberts) und einige andere Proteinhemmer, die aus Getreidekörnern erhalten wurden (Coleman, Gasperi-Campani).
Eine zweite Gruppe von scRIPs wird aus Pilzen gewonnen und kommen in der Natur in einkettiger Peptidform vor. Beispiele dieser Gruppe sind α-Sarcin (Rodriguez, Olson, 1985a, 1965b), Restrictocin (Rodriguez), Mitogillin (Rodriguez), Enomycin (Conde) und Phenomyzin(Conde).
Einige Pflanzen produzieren Zytoxine, welche aus zwei unähnlichen Untereinheiten oder Peptidketten bestehen, nämlich einer enzymatisch aktiven A-Kette, welche eine Ribosomen inaktivierende, für die ribosomale RNA der großen Untereinheit der Ribosomen spezifische Wirkung hat, und eine B-Kette, welche dazu dient, das Toxin an die Rezeptoren der Zelloberfläche zu binden (Olsnes, 1982). Die am besten bekannten Zytotoxine dieses Typs sind Ricin, Abrin und Modeccin, die alle eine ähnliche Struktur und einen ähnlichen Wirkungsmechanismus haben. Die Untereinheiten in diesen Proteinen sind durch eine Disulfidbindung verbunden, die unter reduzierenden Bedingungen gespalten werden kann (Olsnes, 1982), was die Reinigung der einzelnen Untereinheiten ermöglicht. Die A-Untereinheiten der Zytotoxine, d. h. die Ribosomen inaktivierenden untereinheiten, bilden gemäß vorliegender Erfindung die dritte Klasse von scRIPs.
Die vierte Gruppe von scRIPs sind einkettige bakterielle Proteine oder Peptid-Zytotoxine, wie das Zytotoxin aus Shigella dysenteriae und verwandte Shiga-ähnliche Toxine (Calderwood). Diese Toxine bestehen aus einer A-kettenähnlichen Untereinheit, die den A-Ketten der oben beschriebenen Pflanzenzytotoxine ähnlich ist und den gleichen Wirkungsmechanismus hat (Endo, 1987), und mehreren B-Untereinheiten, die zellbindende Funktionen haben. Diese A-Untereinheiten bilden die vierte Gruppen von scRIPs.
Einige Beweisanzeichen deuten darauf hin, daß die scRIPs in allen vier Gruppen strukturelle Merkmale gemeinsam haben und einen gemeinsamen Wirkungsmechanismus besitzen. Die A-Ketten von Ricin, Modeccin und Abrin zeigen alle Bereiche mit Sequenzhomologie der Aminosäuren (Olsnes, 1987) und eine Reihe von einkettigen pflanzlichen RIPs, welche antivirale Proteine der Kermesbeere (Irvin, 1975), Weizenkeim inaktivierende Proteine (roberts), MMC (Barbieri), Gelonin (Stirpe), Dianthine (Stirpe) und TCS (Maraganore) einschließen, sind der A-Kette von Ricin in Bezug auf die primäre Peptidstruktur ähnlich. Die Shiga-ähnlichen bakteriellen Toxine zeigen ebenfalls Sequenzhomologie mit Ricin A (Calderwood). Die primären Strukturen von Restrictocin, Mitogillin und α-Sarcin, Restrictocin, Enomycin, homologie (Rodriguez).
Den in diesem Abschnitt definierten scRIPs ist auch der Mechanismus der Ribosomen inaktivierenden Wirkung gemeinsam, welche die ortsspezifische enzymatische Wirkung auf die große ribosomale RNA (rRNA) der 60S ribosomalen Untereinheit einschließt (Olsnes). Von einigen der untersuchten scRIPs, welche die A- Ketten von Ricin, Abrin und Modeccin, die einkettigen pflanzlichen Hemmer der antiviralen Proteine der Kermesbeere, Crotin II. Curcin II, die Pilzproteine Mitogillin, α-Sarcin, Restrictocin, Enomycin, Phenomycin und Shiga-ähnliche bakterielle Toxine einschließen, wurde eine katalytische Inaktivierung der 60S Untereinheit von eukariotischen Ribosomen berichtet (Conde). Im Falle vieler pflanzlicher Inhibitoren, welche Ricin, Abrin, Modeccin und antivirales Protein aus der Kermesbeere einschließen, umfaßt der Mechanismus der ribosomalen Inaktivierung eine N-Glykosidasewirkung, welche das Adenin von einer spezifischen Adenosin-Nukleotid-Untereinheit entfernt. Im Falle der bisher untersuchten, aus Pilzen gewonnene Inhibitoren, welche α-Sarcin, Mitogillin und Restrictocin einschließen, ist eine Spaltung von Phosphodiester an einer spezifischen Stelle, die nahe am Ort der Spaltung durch das hemmende Protein mit N- Glykosidase-Wirkung liegt, beteiligt (Endo, 1982, 1987).
Ein anderes gemeinsames Merkmal von einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteinen, über das bereits berichtet wurde, ist die verstärkte hemmung der Proteinsynthese in gewissen, durch Viren infizierten Zellsystemen. Beispielsweise wurde beobachtet, daß Gelonin, Dianthin 32, MCI (M.charantia Hemmer) und PAP- S alle in HEp-2-Zellen, die entweder mit Herpes-Simplex-Virus-I (HSV-I) oder mit Poliovirus I infiziert waren, eine stärkere hemmung der Proteinsynthese bewirken, als in nicht infizierten Zellen (Foa-Tomasi).
Die Mengen an hemmenden Protein, die erforderlich sind, um selektive Hemmwirkungen zu erreichen, lagen normalerweise zwischen 10 und 100 ug/ml, und der beobachtete Grad der Hemmung betrug normalerweise weniger als 50%(Figur 3 von Foa-Tomasi).
In jüngerer Zeit ist gezeigt worden, daß einige einkettige Hemmer, welche α-Sarcin, Mitogillin, Restrictocin, PAP und eine A-Kette enthaltendes Abrin einschließen, in HeLa-Zellen, die durch das Picornavirus Encephalomocarditis Virus (EMC) infiziert sind, die Proteinsynthese selektiv hemmen. Die selektive Hemmung wurde bei relativ niedrigen aktivierenden Konzentrationen von α-Sarcin und Abrin mit A- Kette beobachtet. Die selektive Hemmung von mit Adenovirus infizierten HeLa-Zellen und mit Semliki Forest Virus infizierten BHK-Zellen wurde ebenfalls beobachtet. Weitere Untersuchungen weisen darauf hin, daß die Bindung von EMC-Virus oder Poliovirus an Oberflächenrezeptoren einer durch Viren infizierbaren Witszelle die Durchlässigkeit der Zelle für inaktivierendes Protein steigern kann (Fernandez-Puentes, 1980,1903).
Obwohl virale Infektion die proteinhemmenden Wirkungen von einkettigen, Ribosomen inaktivierenden proteinen auf infizierte Zellen verstärken kann, scheint dieser Effekt star vom beteilitgten Virus und dem infizierten Zelltyp abzuhängen. Beispielsweise zeigte in der oben erwähnten Untersuchung von durch Viren infizierten HeLa-Zellen die Infektion mit EMC eine wesentlich stärkere selektive hemmung der Proteinsynthese als in den gleichen, mit Adnovirus infizierten Zellen. In der gleichen Literaturstelle zeigten mit Simliki Forest Virus infizierte BHK-Zellen bei der Proteinhemmung eine Differenz von höchstens 40% zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen. und, wie oben angedeutet wurde, in entweder mit Poliovirus oder mit HSV-I infizierten HEp-2-Zellen wurden selektive proteinhemmende Wirkungen nur bei hohen inaktivierenden Konzentrationen beobachtet und die maximale Differenz im Grad der Hemmung zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen betrug etwa 50%.
Aus den im obigen Abschnitt III dargelegten Befunden ist ersichtlich, daß T-Zellen, die mit verschiedenen Retroviren infiziert sind, drastische Unterschiede in ihrem Ansprechen auf scRIPs zeigen. Insbesondere ergibt sich bei der Infektion von menschlichen T-Zellen mit HYLV-I keine nach weisbare selektive hemmwirkung durch scRIPs. Im Gegensatz dazu werden in T-Zellen, die mit HIV, einem verschiedenen, jedoch nahe verwandten Retrovirus, infiziert sind, bei niedrigen inaktivierenden Konzentrationen zwischen etwa 0,1 und 1 ug/ml Differenzen in der Hemmwirkung von bis zu 80 - 90% beobachtet. Ferner werden bei den sektiven Hemmwirkungen Differenzen von bis zu 100% beobachtet, wenn die Zellen einer pulsierenden Dosierung (pulsed dose) ausgesetzt werden.
Es wurde gezeigt, daß niedrige Dosierungen von TCS und MMC eine deutliche selektive Hemmung der Bildung von viralem Antigen in HIV-infizierten T-Zellen und Monozyten/Makrophagen und eine selektive Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen in infizierten T-Zellen bewirken. Diese Feststellung wurde nun für T-Zellen auf insgesamt 9 scRIPs ausgedehnt, welche für einkettige pflanzliche und aus Pilzen gewonne Hemmer und die A-Kette von pflanzlichen Toxinen der zweiten Untereinheit repräsentativ sind.
Außerdem wurde nunmehr gezeigt, daß die Behandlung von HIV-infizierten T-Zellen und/oder Monzyten/Makrophagen mit scRIP einige wesentliche Wirkungen hervorruft, die bisher nicht beobachtet wurden. Dieses sind:
(a) Im wesentlichen vollständige Hemmung der Expression von HIV-Antigen und der viralen Reproduktion in HIV-infizierten T-Zellen bei scRIP-Konzentrationen, die für nicht infizierte Zellen im wesentlichen nicht toxisch sind;
(b) Selektive Abnahme von viralem Antigen gegenüber zellulärem Antigen in durch Viren infizierten Monozyten/Makrophagen, die mit TCS behandelt wurden; und
(c) Im wesentlichen der gleiche Grad von selektiver Hemmung, der durch eine Reihe von verschiedenen geprüften scRIPs verursacht wird. Wie in Abschnitt III im einzelnen ausgeführt wird, ergaben alle geprüften Pflanzen-und Pilzerverbindungen einen Selektivitätsindex für die Hemmung der zellulären proliferation von etwa 50 - 70. Dies steht im Gegensatz zu Berichten des Standes der Technik, wo die selektiven Wirkungen unter den geprüften, Ribosomen inaktivierenden Proteinen in weiten Grenzen variierten. Dieses Ergebnis zeigt zusammen mit dem repräsentativen Charakter der 9 geprüften scRIP- Verbindungen, daß die in diesem Abschnitt vorgelegten, deutlichen selektiven Wirkungen in berechtigter Weise dahingehend verallgemeinert werden können, daß die vier oben definierten Gruppen von scRIPs umfassen.

V. Behandlung der HIV-Infektion von Menschen

Ein Bindeglied in der Ätiologie von AIDS scheint die Zerstörung von CD4+-T-Lymphozyten zu sein, und es gibt in vitro- und in vivo-Beweismaterial, welches nahelegt, daß bei mindestens einem Mechanismus der Zerstörung von Zellen eine Fusion von infizierten Zellen unter Bildung großer vielkerniger Zellen beteiligt ist. Die Erfinder und ihre Mitarbeiter haben früher die Beziehung zwischen der Expression des CD4-Antigens und der Infizierbarkeit durch HIV untersucht (Lifson, 1986a - c). Diese Untersuchungen bestätigten frühere Berichte, wonach die HIV-Infektion von T-Lymphozyten das CD4-Antigen erfordert, was nahelegt, daß der Infektionsvorgang Wechselwirkungen zwischen dem CD4-Antigen und einem oder mehreren Umhüllungsproteinen von HIV erfordert (Dalgleish; Klatzman, 1984a, 1984b, 1986; McDougal 1985a, 1985b, 1986, Maddon; Sodroski). Die früher von den Erfindern durchgeführten Untersuchungen zeigen auch, daß infizierte T-Zellen sowohl mit infizierten als auch mit nicht infizierten CD+-T-Zellen in vitro unter Bildung großer vielkerniger Plasmamassen (Syncitia) verschmelzen können und daß die Zellfusion durch Zugabe von anti-CD4-Antikörpern blockiert werden kann. Dies weist daruf hin, daß die Zellfusion, wie die HIV-Infektion, Wechselwirkungen zwischen viralen Antigenen auf der Oberfläche der infizierten Zellen und den T-Lymphozyten-CD4-Antigen (entweder in infizierten oder in nicht infizierten Zellen) erfordert. Dieses Ergebnis kann auch erklären, ein wie großer Teil der CD+-T-Zellen in vivo zerstört werden kann, obwohl nur eine relativ kleine Zahl von CD+-T-Zellen, die aus einer HIV-infizierten Person isoliert wurden, einen Hinweis auf eine HIV-Infektion geben. In Übereinstimmung mit diesem Mechanismus würden infizierte T-Lumphozyten gesunde T-Zellen zur Zellfusion und zur Zerstörung "rekrutieren".
Unter Verwendung von T-Lymphozyten, die weder der starken Expression von CD4+-Antigen ausgewählt wurden, haben die Erfinder in früheren Untersuchungen weiterhin gezeigt, daß (a) die Infizierbarkeit von T- Lymphozyten durch HIV mit steigender Konzentration des Antigens an der Oberfläche wesentlich zunimmt und (b) die Bildung von Plasmamassen (Syncitia) infolge Zellfusion in den CD4+-Zellen mit starker Expression des Antigens viel schneller erfolgt. Diese Ergebnisse stützen frühere Befunde in Bezug auf die Bedeutung von CD4+-Antigen bei der HIV-Infektion und dem anschließenden Auftreten von Zellfusion.
Es gibt auch Hinweise darauf, daß Monozyten/Makrophagen in der Ätiologie der HIV-Infektion beteiligt sein können. Es wurde berichtet, daß Zellen der Familie der Monozyten/Makrophagen in vitro mit HIV infiziert werden können (Crowe; Gartner, 1986a, 1986b; Koenig; Ho; Chayt; Armstrong; Steicher) und daß Monozyten bei der Verbreitung von HIV in das Zentrale Nervensystem (ZNS) verwickelt sind (Koenig). Die Untersuchungen an Monozyten die von einem HIV-infizierten Patienten gewonnenen wurden, über die in Abschnitt III berichtet wurde, weisen darauf hin, daß ein großer Prozentsatz von Blut- und Milzmakrophagen die HIV-Infektion verbergen kann, obwohl in vivo in einem relativ kleinen Prozentsatz der Zellen virale Antigene aktiv exprimiert werden können. Zusätzlich dazu, daß sie ein mögliches Reservoir von HIV im Körper bilden, können Makrophagen auch direkt an der Zerstörung von T-Lymphozyten durch Zellfusion beteiligt sein. Vor kurzer Zeit durchgeführte Untersuchungen der Erfinder und ihrer Mitarbeiter zeigen, daß HIV-infizierte Monozyten befähigt sind, leicht mit nicht infizierten CD4+-Lymphozyten unter Bildung riesiger vielkerniger Plasmamassen (Syncitia) zu fusionieren (Crowe). Es gibt auch hinweise auf die Beteiligung von Makrophagen bei der HIV-Infektion des ZNS (Koenig).
Aus den vorstehenden Ausführungen kann klar erkannt werden, wie die durch scRIPs hervorgerufenen selektiven viralen Hemmwirkungen gemäß vorliegender Erfindung zur Behandlung von HIV-Infektionen von Menschen verwendet werden können. Die Fähigkeit der scRIPs, die Reproduktion von HIV selektiv zu hemmen, wie sie durch im wesentlichen vollständige Hemmung der Expression von viralem Antigen und der Reversen Transkriptase-Aktivität nachgewiesen wurde, würde den Grad der Infektion durch Verminderung der Produktion von zur Infektion weiterer Zellen befähigten neuen Viren vermindern. Außerdem kann die Hemmung der viralen Reproduktion dazu beitragen, das Virus-"Reservoir", welches durch die Monozyten/Makrophagen und andere Zellen gebildet werden kann, zu eliminieren. In dieser hinsicht wird darauf hingewiesen, daß mindestens ein scRIP, nämlich TCS, fähig zu sein scheint, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten und daß es daher gegen die Verbreitung der HIV-Infektion in das ZNS wirksam sein sollte.
Außerdem legt der oben diskutierte Hinweis nahe, daß die Fusion von CD4+-Zellen mit infizierten T-Zellen oder Monzyten/Makrophagen die Anwesenheit von HIV-Antigenen auf der Oberfläche der infizierten Zellen erfordert. Eine auffällige Wirkung der anti-HIV-Proteine ist die Fähigkeit, die Expression von viralen Antigenen in infizierten Zellen zu hemmen und im wesentlichen zu eliminieren. Es wäre zu erwarten, daß eine wesentliche Verminderung der Expression von viralen Proteinen mit einer deutlichen Herabsetzung der zytopathogenen Folgen der Infektion verbunden ist.
Ein weiterer therapeutischer Vorteil der erfindungsgemäßen HIV-Behandlung mit scRIPs ist die selekive Hemmung von HIV-infizierten T-Zellen. Da infizierte T-Zellen die Fähigkeit haben, mit nicht infizierten T- Zellen zu fusionieren, um eine beschleunigte Erschöpfung der gesamten Population von T-Zellen zu bewirken, sollte die selektive Zerstörung der infizierten Zellen das Ausmaß der "sekundären" Zerstörung von T- Zellen beschränken.
Es ist auch zu erwarten, daß die scRIP-Proteine andere Ereignisse, die mit dem Verlust der immunologischen Fähigkeit bei HIV-infizierten personen in Beziehung stehen, durch allgemeine Erniedrigung des Virus-Spiegels und Hemmung der viralen Proteinsynthese in infizierten Zellen, hemmen oder verhindern.
Die Höhe der Dosierung eines scRIP, welche therapeutische wirksam ist, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, die in einem behandelten menschlichen Patienten leicht überwacht werden können. Eine selektive Hemmung der HIV-Reproduktion und der zellulären Proliferation in T-Zellen wurde bei so niedrigen Dosierungen von scRIP wie 0,01 ug/ml beobachtete, insbesondere für die geprüften, aus Pilzen gewonnenen scRIPs. Für einige scRIPs oder für akutere Grade der Infektion können Dosierungshöhen von bis zu 1 ug/ml oder mehr erforderlich sein. Auch bei Einwirkenlassen von scRIP über lange Zeit sind jedoch Konzentrationen im Bereich von 1 - 2 ug/ml für nicht infizierte Zellen nicht in ernster Weise hemmend (Abschnitt IV). Unter Annahme eines Plasmavolumens von ungefähr 3,50 Liter können Konzentrationen von scRIP im Blutstrom zwischen 0,01 und 1ug/ml durch Verabreichung einer Gesamtdosis von scRIP von zwischen etwa 0,03 und 3 mg des scRIP errecht werden. Im Falle von TCS ist diese Dosierung mit der Dosis von 5 - 12 mg TCS zu vergleichen, welche zur Einleitung von Fehlgeburten beim Menschen verwendet wird, und diese Höhe der Dosis ist im allgemeinen nicht mit ernsten Nebenwirkungen am Menschen verbunden (Kuo-Fen; Wang).
Bei der Behandlung der HIV-Infektion wird einem HIV-infizierten "no line break" Patienten ein scRIP in einer Dosierung verabreicht, welche wirksam ist, eine meßbare Abnahme bei mindestens einer der folgenden indikationen einer HIV-Infektion zu hervorzurufen:
(a) Spiegel des HIV-Antigens, der mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden ist;
(b) Spiegel des HIV-Antigens im Blutstrom;
(c) Reverse-Transkriptase-Aktivität, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden ist;
(d) das Verhältnis der Lebensfähigkeit von HIV-infizierten zu nicht infizierten T-Zellen; und
(e) das Verhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären antigen in HIV- infizierten einkernigen Zellen der phagozytierenden Familie bei der Behandlung mit TCS oder MMC.
Vorzugsweise ist das Anzeichen für die HIV-Hemmung, welches überwacht wird, der Antigenspiegel im Plasma, z.B. Serum- oder Plasm-p24-Spiegel, welche leicht durch Verwendung eines ELISA-Verfahrens verfolgt werden können. Vorzugsweise wird die Abnahme der Indikation(en) innerhalb von 1 - 5 Tagen nach der Verabreichung von der Verbindung meßbar. Das Verfahren kann außerdem eine alternative Messung des Abfalls bei mindestens einer der Indikationen und die Wiederholung der Verabreichung des scRIP umfassen, bis die gemessene Indikation der HIV-Infektion keine weitere Abnahme zeigt.
Wenn eine Reihe von Dosierungen verabreicht wird, z.B. über eine Zeitspanne von einigen Wochen, sollte der Patient in Bezug auf allergische Reaktionen auf das anti-HIV-Protein überwacht werden. Wenn sich eine ernste Reaktion auf das zuerst verabreichte scRIP, z.B. TCS, entwickelt, kann ein zweites scRIP, z.B. MMC, verabreicht werden, um die immunologische Reaktion und die neutralisation des Proteins so gering wie möglich zu halten. Vorläufige, durch einen der Erfinder im Tierversuch ermittelte Daten legen nahe, daß die zwei Proteine im wesentlichen nicht zur immunologischen Kreuzreaktion befähigt sind. Da jedoch viele Patienten, denen die Behandlung zuteil werden würde, in ernsthafter Weise "immune compromised" sind, kann die Immunreaktion auf die Proteine eine relative kleine Nebenwirkung darstellen.
Das Protein kann parenteral in einer von mehreren Verabreichungsformen verabreicht werden, welche die Form der Lösung und die durch Lipsomen enkapsulierte Form einschließen, und an einen Träger gebunden sein, wie an einen anti-T-Zelle, einen anti-Makrophagen oder an einen HIV-Antikörper, um das protein auf die durch HIV-infizierbaren oder infizierten Zellen zu steuern. Verfahren zur Herstellung und Lagerung von verschiedenartigen Arzneimittelformulierungen von Peptiden und zur intravenös, intramuskulär, subkutan, über die Schleimhaut oder durch Inhalation erfolgenden Verabreichung sind in der pharmazeutischen Indstrie bekannt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen verschiedene Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung und typische HIV-Wirkungen, die bei den Prüfverfahren der Erfindung beobachtet wurden. Die Beispiele sollen den umfang der Erfindung erläutern, diesen jedoch in keiner Weise beschränken.

Materialien

A. Reagenzien

³H-Thymidin und ³H-Leucin wurden von New England Nuclear und an Ziegen-anti-menschliches IgG-Reagens gebundenes Fluoresceinisocyanat von Zymed (Burlingame, CA) erhalten. Anti-p24 monoklonaler Antikörper wurde von Dr. J. Carlson, UC Medical Center, Davis, CA, zur Verfügung gestellt.

B. HIV-Isolate

Für alle Versuche, bei denen eine in vitro-Infektion von Monozyten/Makrophagen involviert war, die von nicht infizierten Spendern herrührten, wurde der DV-Stamm von HIV verwendet. Dies ist ein "low-passage" Isolat, das aus peripherem Blut eines heterosexuellen Mannes mit Kaposi's Sarkom erhalten wurde (Crowe). Einige Liter eines Vorrates mit hohem Virusgehalt wurde im VB-Stamm von T-Lymphomzellen gezüchtet (Lifson et al. 1986a - c), und aliquote Teile davon wurden bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert. Die Vorratskulturen von HIV-DV enthielten etwa 5 10&sup5; infektiöse Einheiten/ml, wobei eine infektiöse Einheit als die Menge von infektiösem Virus definiert ist, die erforderlich ist, um durch 5-tägiges Züchten bei einer Inokulierung von 5 10&sup5; VB-Indikatorzellen eine charakteristische zytopathische Wirkung hervorzurufen. Die Vorratskulturen enthielten etwa 89 10³ cpm Reverse-Transkriptase-Aktivität, wie durch publizierte Verfahren gemessen wurde (Hoffman). Bei anderen Versuchen wurden, wie im einzelnen darglegt, Monozyten/Makrophagen verwendet, welche aus HIV-infizierten Spendern erhalten wurden. In diesen Versuchen war das verwendete HIV-Isolat das autologe Isolat aus dem jeweiligen Patienten. Für die Untersuchungen mit T-Zellen wurde das HXB-2-Isolat von HIV verwendet.

C. T-Zellen

Die Zellen von H9-T-Lumphozyten wurden vom H9-Zellstamm abgeleitet (Popovic). VB-Zellen, ein T-lymphoplastoider Zellstamm, wurde von Dr. S. Smith (Stanford University) erhalten. Zur Gewinnung eines stark CD4-exprimirenden Nebenstammes von VB wurde fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren unter Verwendung eines durch Fluoreszenz markierten anti-CD4-Antikörpers verwendet. Die Zellen wurden in RPMI- 1640 gehalten, das mit 10%(v/v) von in der hitze inaktiviertem fötalem Kalbsserum ergänzt war.

D. Monozyten/Makrophagen

Kulturen von menschlichen Makrophagen wurden aus einkernigen Zellen von peripherem Blut hergestellt, die aus Leukophorese-Präparaten von menschlichem Blut und "buffy coats" von normalen blutspendern nach bekannten Verfahren gewonnen wurden (Crowe). Kurz gesagt wurden einkernige Zellen aus peripherem Blut durch Dichtezentrifugation über Ficoll-Hyaque isoliert und in RPMI-1640 als Medium, das durch 20% fötales Kalbsserum ergänzt war, bei 37ºC während 1 Stunde an Petrischalen aus Glas ankleben gelassen. Nach dem Waschen (zur Entfernung von verunreinigenden, nicht anhaftenden Lymphozyten) wurden die Lymphozyten von den Petrischalen zurückgewonnen, indem man diese in 5 umol EDTA-PBS und 5% FCS als Medium 10 Minuten auf stellte und mit einem "rubber policeman" abkratzte. Das gewonnene Präparat von Monozyten wurde dann zentrifugiert, in RPMI-1640 als Medium mit 10% gepooltem männlichen HIV-negativem menschlichem Serum (vollständiges Medium) resuspendiert und zu 2 10&sup6; Zellen pro ml in Kulturgefäße aus Teflon gegeben. Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm in der Kultur während der ersten 5 Tage auf eine stabile Dichte von ungefähr 5 10&sup5; Zellen pro ml ab. Langzeitkulturen wurden bis zu 4 Monaten bei dieser Dichte gehalten. Das Medium wurde routinemäßig alle 7 Tage ausgewechselt.

E. Ribosomen inaktivierende Proteine

1. Trichosanthin

Trichosanthin (TCS) ist ein pflanzliches Protein, welches aus Wurzelknollen von Trichosanthes kirilowii gewonnen wird. Das Protein, welches auch als α-Trichosanthin (Law) und Radix trichosanthis (Kuo-Fen) bekannt ist, ist ein basisches einkettiges Protein, das aus einer zwischen 224 (Gu) und 234 (Xuejun) liegenden Zahl von Aminosäureresten besteht und das ein Molekulargewicht von etwa 24.000 Dalton hat. Eine bevorzugtes Reinigungsverfahren zur herstellung von TCS in gereinigter Form wird nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Verfahren schließt drei chromatographische Trennungen ein, welche in Figur 1 gezeigt werden. Die Proteinsequenz von TCS wurde vollendet (Gu; Wang) und aus der zytofluorographischen Analyse mit Röntgenstrahlen wurde ein molekulares Modell abgeleitet (Kezhan).

2. Momorcharin

Momocharin ist ein basisches Glykoprotein, das aus den Samen der bitteren Melonenplflanze Momordica charantia gewonnen wird. Das Protein scheint in zwei verwandten Formen vorzukommen, welche als α- und β-Momocharin bezeichnet werden. Für α-Momorcharin wird ein Molekulargewicht von zwischen etwa 31.000 und 32.000 Dalton angegeben und es hat einen Gehalt an neutralem Zucker von 1,6%. Für β- Momocharin wird ein Molekulargewich von etwa 29.000 Dalton angegeben und es hat einen Gehalt an neutralem Zucker von 1,3%(Chan). Beide Formen von Momocharin sind in Bezug auf die Hemmung der Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen gemäß der Erfindung wirksam. Momorcharin wird in vorliegender Beschreibung dahingehend definiert, daß es sowohl α- als auch β-Momocharin, sowie alktive Teile dieser Proteine umfaßt, welche in Bezug uf die Hemmung der Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten Blutzellen wirksam sind. Das planzliche Glykoprotein kann bis zur Homogenität durch Fraktionieren eines Aceton-Extraktes aus Samen von M. charantia an CM- Sepharose CL-6B und Sephadex G100 nach publizierten Verfahren (Yeung, 1985) und wie nachstehend in Beispiel 2 beschreieben, isoliert werden. Figur 2 zeigt drei chromatographische Trennungen, welche die Herstellung von MMC beinhaltet. Die Proteine sind nach Fraktionierung durch HPLC auf einer mit TSK250 beschickten Gelpermeationskolonne, SDS-Gelektrophorese und Immunoelektrophorese homogen.
Momorcharin scheint mit einem oder mehreren M. charantia-Inhibitorren ("MCI"), die Molekulargewichte im Bereich von 30.000 bis 32.000 Dalton haben und die in zellfreien Systemen eine Ribosomen inaktivierende Wirkung haben, verwandt und vielleicht sogar identisch zu sein. Solche Inhibitoren, welche in der Literatur beschreiben wurden, sind ein Momordica charantica-Inhibitor, der ein Molekulargewicht von 31.000 Dalton (Falasca) oder 30.000 Dalton (Spreafico) hat; "Agglutinin", das ein Molekulargewicht von etwa 32.000 Dalton hat (Lin. 1970, 1978); und möglicherweise eine oder mehrere der vier Untereinheiten (Molekulargewichte 30.500, 29.00, 28,500 und 27.000 Dalton) in einem hemaglutinierenden Lectin, das aus Samen von M. charantia gewonnen wurde (Barbieri, 1980).
Es wird darauf hingewiesen, daß das MCI, welches äußerst intensiv als ein Ribosomen inaktivierendes Protein untersucht wurde, ursprünglich als ein Protein mit 23.000 Dalton charakterisiert wurde, obwohl eine nachfolgende Molekulargewichtsbestimmung ein Molekulargewicht von 31.000 Dalton ergab (Falasca).

3. Antivirales Protein I der Kermesbeere (pokeweed antiviral protein-I; PAP-I)

PAP-I ist ein pflanzliches einkettiges Protein mit einem Molekulargewich von ungefähr 27.000 Dalton. Das protein wurde von Dr. James D. Irvin zur Verfügung gestellt und wurde aus der Kermesbeere Phytolacca americana nach publizierten Verfahren hergestellt (Irvin, 1975). Kurz gesagt, wurden von jungen Pflanzen gewonnene Blätter von P. americana in destilliertem Wasser homogenisiert, filtriert, das Filtrat auf einen Gehalt von 40% Ammoniumsulfat gebracht und zentrifugiert, um das abeschiedene Material zu entfernen. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie chromatographiert. Eine Proteinfraktion, welche die gesamte Hemmwirkung des PAP-Proteins enthielt, wurde weiter durch Phosphozellulose-Ionenaustauschchromatographie fraktioniert. Die Fraktion, welche bei 0,12 M KCl eluiert wurde und welche die Hauptmenge der proteinhemmenden Wirkung enthielt, wurde verwendet.

4. Antivirales Protein II der Kermesbeere (pokeweed antiviral II; PAP-II)

PAP-II ist ein weiteres einkettiges Ribosomen hemmendes Protein, das aus P. americana erhalten wird. Das Protein stellt eine einzelne Polypeptidkette mit einem molekulargewicht von ungefähr 29.000 Dalton dar. Das Protein wurde durch Dr. James D. Irvin zur Verfügung gestellt und wurde nach publizierten Verfahren hergestellt (Irvin, 1980) welche eine Abwandlung des Reinigungsverfahrens zur Herstellung von PAP-I beinhalten. Kurz gesagt ergaben die eluierten Fraktionen aus der abschließend bei der Reinigung von PAP-I verwendeten Phosphzellulosekolonne zwei Hauptfraktionen mit proteinhemmender Wirkung. Die erste Fraktion entspricht PAP-I. Die zweite Fraktion wurde als PAP-II genommen. Wie PAP-I hemmt das PAP-II- Protein in einem zellfreien System die eukariotische Proteinsynthese stark und hemmt auch die Transmission des Tabakmosaik-Virus. Die beiden Proteine sind jedoch hinsichtlich ihres Molekulargewichtes, ihrer tryptischen Peptidkarten "tryptic peptide maps" und ihrer immunologischen Eigenschaften verschieden.

5. Antivirales Protein S der kermesbeere (pokeweed antiviral protein-S; PAP-S)

PAP-S ist ein drittes unterschiedbares einkettiges Ribosomen hemmendes Protein, das aus P. americana erhalten wird. Das Protein besteht aus einer einzigen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton. Das Protein wurde von Dr. James D. Irvin zur Verfügung gestellt und wurde nach publizierten Verfahren (Barbieri) hergestellt. PAP-I, PAP-II und/oder PAP-S werden in vorliegender Beschreibung in allgemeinerer Weise als "Pokeweekd Antivirales Protein" bezeichnet. 6. α-Sarcin α-Sarcin ist ein aus Pilzen gewonnenes einkettiges Peptid mit einem Molekulargewich von ungefähr 17.000 Dalton (Sacro). Das Protein wurde von Dr. R. Amils. Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, Spanien, zur Verfügung gestellt und kann aus Aspergillus giganteus nach publizierten Verfahren hergestellt werden (Olson, 1963a, 1965b). Kurz gesagt wurde eine Fermentation von A. giganteus durch eine Platten- und Rahmenpresse filtriert, und der gewaschene Extrakt wurde an einer Kolonne von auf pH 7 equilibrierten Carbonsäureharz adsorbiert. Die Eluierung mit 1,5 M KCl ergab zwei Fraktionen mit α-Sarcin-Wirkung. Diese wurden konzentriert, vereinigt und mit Aktivkohle behandelt, um einige verunreinigende Proteine zu entfernen. Das Rohprodukt wurde weiter an einem Ionenaustauscherharz auf Carbonsäurebasis fraktioniert, wobei ein 0,4 M bis 0,9 M Phosphatpuffergradient verwendet wurde. α-Sarcin wurde als ein im wesentlichen reines Protein eluiert.

7. Restrictocin

Restrictocin ist wie α-Sarcin ein aus Pilzen gewonnenes einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 17.000 Dalton. Das Protein wurde von Dr. R. Amils zur Verfügung gestellt und kann aus Aspergillus restrictus nach publizierten Verfahren gewonnen werden (Olson, 1963).

8. Mitogillin

Mitogillin ist ein verwandtes, aus Pilzen gewonnenes Protein, welches ebenfalls ein Molekulargewicht von etwa 17.000 Dalton hat. Das Protein wurde von Dr. R. Amils zur Verfügung gestellt und kann aus Apergillus restrictus nach publizierten Verfahren gewonnen werden (Olson, 1966).

Beispiel 1

Herstellung von Trichosanthin

Alle Schritte des nachstehend beschriebenen Verfahren wurden bei 4ºC durchgeführt. Frische Wurzelknollen von T. kirilowii wurden geschält, in kleine Stücke geschnitten und in einem Waring-Mischer in normaler physiologischer Kochsalzlösung bei pH 7 (0,7 1/kg) homogenisiert. Das homogenisierte Produkt wurde durch Gaze filtriert, um Stücke zu entfernen. Der Extrakt wurde mit 1 N NaOH auf pH 8 eingestellt, 2 Stunden gerührt und dann über Nacht stehen gelassen. Die Suspension wurde bei 5.000 UPM 15 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde mit 1 N NaOH auf pH 8 eingestellt. Nach 1-stündigem Stehen wurde kaltes Aceton (0,8 ug/ml Lösung) zugesetzt. Es entstand ein schwerer Niederschlag und die Mischung wurde 30 Minuten gerührt. Der Niederschlag (AP1) wurde durch Zentrifugieren bei 5.000 UPM währen 15 Minuten gesammelt. Zur überstehenden Lösung wurde kaltes Aceton (1,2 ug/ml überstehende Lösung) zugesetzt und nach 2-stündigem Stehen wurde das abgesetzte Material (AP2) durch Zentrifugieren gewonnen. Die beiden Fraktionen AP1 und AP2 wurden in einem minimalen Volumen von mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und nach ausgedehnter Dialyse gegenüber dem gleichen Puffer wurde die überstehende Lösung und der Niederschlag jeder Fraktion durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde dann nochmals mit PBS extrahiert, zentrifugiert und die überstehende Lösung mit der vorigen überstehenden Lösung vereinigt, um die Unterfraktion S zu bilden, während der nach der nochmaligen Extraktion erhaltene Niederschlag die Unterfraktion P bildete. Somit ergab Fraktion AP1 zwei unterfraktionen AP1S und AP1P. Die Ausbeuten in den einzelnen Fraktionen sind: 3,2 g AP1S; 3,8 g AP2S aus 1 kg in kleine Stücke geschnittener frischer Knolle.
Fraktion AP2S (1 g) wurde in etwa 10 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4 gelöst und auf eine mit CE Sepharose CL-6B (Pharmacia) befüllte Kolonne aufgegeben. Die Kolonne war vorher mit 0,05 M Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt wurden und die Elution erfolgte am Anfang mit dem gleichen Puffer. Nachdem die dritte Fraktion (Peak C3; Figur 1A) eluiert worden war, wurde ein linearer Gradient von 0 - 0,3 M NaCl im gleichen Puffer angewendet, wie in Figur 1A gezeigt wird. Die mit C6 bezeichnete Fraktion (Peak C6) wurde gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um hochgereinigtes Trichosanthin zu erhalten. Die durchschnittliche Ausbeute und Prozentsatz der Gewinnung von Trichosanthin aus AP2S beträgt etwa 180 mg (18%).
Hochgereingtes Trichosanthin wurde auch aus Fraktion AP1S durch eine weitere chromatographische Stufe mit der mit DEAE-Sepharose CL-6B befüllten Kolonne erhalten. AP1S (1 g) wurde in 14 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Dialyse gegen 0,02 M NH&sub4;HCO&sub3;, das 0,1 M NaCl enthielt (pH 8,0) wurde es auf eine Kolonne (1,5 x 32 cm) aufgebracht, die mit DEAE-Sepharose CL-6B befüllt war und die vorher mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die Kolonnenchromatographie wurde bei Raumtemperatur und mit einer Fließgeschwindigkeit von 70 ml/h durchgeführt und das Eluat wurde in Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die Kolonne wurde mit 100 ml des Startpuffers gewaschen (0.02 M NH&sub4;HCO&sub3;) der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen und dann wurde die stufenweise Eluierung mit 0,2 M NaCl und 0,5 M NaCl im gleichen Bicarbonatpuffer durchgeführt. Die Eluierung wurde durch dekadische Extinktion (Absorbanz) bei 280 nm überwacht. Das Eluat wurde in 4 Fraktionen D1 - D4 gesammelt (identifiziert in Figur 1B), dalysiert und lyophilisiert. Die durchschnittliche Ausbeute und die prozenzuale Gewinnung der mit Trichosanthin angereicherten Fraktion D1 aus AP1S beträgt etwa 185 mg (18,5%).
Die mit Trichosanthin angereicherte Fraktion D1 wurde an einer CM-Sepharose CL-6B-Kolonne durch ein ähnliches Verfahren, wie es oben für AP2S beschrieben wird, weiter gereinigt. Die mit P6 bezeichnete Fraktion (Peak P6) wurde gesammelt und bei -70ºC aufbewahrt oder gegen destilliertes Wasser dialysiert und' lyophilisiert, um hochgereinigtes Trichosanthin zu erhalten. Die durchschnittliche Ausbeute und der Prozentsatz der Gewinnung von Trichosanthin aus D1 (1 g) beträgt etwa 445 mg (44, 5%).

Beispiel 2

Herstellung von α- und β-Momorcharin

Geschälte und getrocknete reife Samen von Momodrica charantia (100g) wurden in 0,9%iger Salzlösung (etwa 4 ml pro 1 g) mit einem Waring-Mischer homogenisiert und durch Gase filtriert. Der pH-Wert des Filtrates wurde vor dem Zentrifugieren bei 12.000 UPM währen 20 Minuten mit 2 N HCl auf 4,0 eingestellt. Die überstehende Lösung (roher Extrakt) wurde dann bei 4ºC einer Fraktionierung mit Aceton unterworfen. Dem Rohextrakt wurden 0,8 v/v kaltes Aceton (-20ºC) unter ständigem Rühren langsam zugesetzt und die Mischung wurde 1 Stunde bei 4ºC gehalten, bevor sie bei 5,000 UPM währen 15 Minuten zentrifugiert wurde, um den Niederschlag (API) zu entfernen. Der überstehenden Lösung wurde dann kaltes Aceton (-20ºC) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2,0 v/v zu erreichen. Nach 1-stündigem Stehen bei 4ºC wurde die Mischung bei 5,000 UPM währen 15 Minuten zentrifugiert, um den Niederschlag (APII) zu gewinnen, welcher dann in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) resuspendiert und dialysiert wurde und anschließend auf eine mit CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia) beschickte Kolonne, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben wurde. Die anfängliche Eluierung erfolgte mit dem gleichen Puffer. Nachdem die dritte Fraktion eluiert worden war, wurde ein linearer Gradient von 0 - 0,2 M NaCl im gleichen Puffer angewendet, wie aus figur 2A ersichtlich ist, welche das Eluierungsprofil der Kolonne zeigt. Die als C5b und C6a bezeichneten Proteinfraktionen (Peaks C5b und C6a) wurden gesammelt und bei -70ºC aufbewahrt oder gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die durchschnittlichen Ausbeuten und der Prozentsatz der aus APII gewonnene Substanzen sind: C5b (136 mg, 17%) und C6a (76 mg und 9,5%).
Die Proteinfraktionen C5b (50 mg) und C6a (50 mg) wurden separat in je 2,5 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,2) gelöst und durch Zentrifugieren von ungelösten Anteilen befreit, bevor sie auf eine mit Sephadex G-100 (fein) (Pharmacia) beschickte Kolonne aufgegeben wurden, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt und eluiert wurde. Die mit C&sub5; - G&sub1; (Peak G&sub1; in figur 2B) und C&sub6; - G&sub1; (Peak G&sub1; in Figur 2C) bezeichneten Hauptfraktionen von Proteinen wurden gesammelt und bei -70ºC aufbewahrt oder gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um α-Momorcharin (C&sub5; - G&sub1;) bezw. β-Momorcharin (C&sub6; - G&sub1;) zu erhalten. Die durchschnittlichen ausbeuten und die prozentualen Gewinnungen aus C5b und C6a sind: α-Momorcharin (35 mg, 72%) und β-Momorcharin (32 mg, 64%).
Die Ausbeuten und die prozentuale Gewinnungen an α-Momorcharin und β-Momorcharin aus 1 kg von geschälten und getrockneten Samen von Momordica charantia betragen etwa 800 mg (0,08%) bez. 400 mg (0,04%).

Beispiel 3

Wirkung von TCS und MMC auf die Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen.

Um die Wirkung von TCS und α-MMC auf die Expression von viralem Antigen (einschließlich der Expression der für die Pathogenese wichtigen Umhüllungs-Antigene gp 120 und gp 41) zu bestimmen, wurden HIV-infizierte H9-Zellen bei 0,5 10&sup6;/ml in eine Kultur eingeimpft und in RPMI-1640, das durch 10% in der hitze inaktiviertes fötales Kalbsserum ergänzt war, in Gegenwart von TCS oder α-MMC bei Konzentrationen im Bereich von 0,3 bis 10 ug/ml gezüchtet. Das Kulturmedium wurde alle 3 -5 Tage durch frisches Medium ersetzt, welches zusätzliches TCS oder α-MMC enthielt, um die angegebene Konzentration aufrechtzuerhalten. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Zellen durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse auf Expression von HIV-Antigenen geprüft. kurz gesagt wurden für jede Bestimmung 1 10&sup6; Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, die 1% HI-FCS (färbender Puffer) enthielt. Die Zellen wurden dann bei 4ºC während 45 Minuten in einer Verdünnung von 1 : 50 mit vorher charakterisierten HIV-antikörperpositivem oder -negativem Serum in färbendem Puffer inkubiert. Nach dem Waschen wurde gebundener spezifischer Antikörper mit einem mit Fluorescein konjugierten Ziegen-anti-menschlichem IgG-Reagens nachgewiesen. Eine quantitative fließzytometrische Analyse wurde auf einem Ortho Zytofluorographen 50 H durchgeführt. Figuren 3A bis 3H zeigen die Ergebnisse der fließzytometrischen Analyse, die am 16. Tag der Kultur durchgeführt wurde. Figuren 3A und 3B zeigen das Fehlen von Reaktivität des HIV-antikörpernegativen (3A) und antikörperpositiven (3B) Patientenserums mit nicht infizierten H9-Zellen. Figuren 3C und 3D zeigen die spezifische Reaktivität des antikörperpositivens Serums mit HIV-infizierten Zellen (3D), während HIV-antikörpernegatives Serum nicht reagiert (3C). Das antikörpernegative Serum reagiert nicht mit HIV-infizierten Zellen, die mit 10ug/ml TCS (3E) oder α-MMC (3G) behandelt wurden. Das antikörperpositive Serum zeigt nur hintergrundspiegel von Reaktivität (ungefähr 2% oder weniger Zellen, welche die obige Schwellenfluoreszenz zeigen) mit den mit TCS behandelten (3F) und den mit α-MMC behandelten (3H) HIV-infizierten Zellen, was die tatsächliche Abwesenheit der Expression von viralem Antigen durch die behandelten Zellen anzeigt. Diese aufsehenerregende Erscheinung ist beim Vergleich von Figur 3F mit Figur 3H in höchst auffälliger Weise zu bemerken.

Beispiel 4

Wirkung von scRIP auf die Expression von HIV-p24-Antigen in HIV-infizierten T-Zellen

VB-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von scRIP bei gleichzeitigem Einimpfen von infektiösem zellfreiem HIV-Virus behandelt. Die Zellen wurden zu 0,5 10&sup6;/ml eingeimpft und in RPMI- 1640, das mit 10% in der Hitze inaktiviertem fötalem Kalbsserum ergänzt war, in ständiger Gegenwart einer ausgewählten Konzentration von TCS, α-MMC oder PAP-I gezüchtet. Die scRIP-Konzentrationen sind in Figuren 4 - 6 auf der Ordinate angegeben.
Die Zellen wurden 3 - 5 Tage gezüchtet und in Bezug auf die Entwicklung von charakteristischen, durch HIV induzierten Krankheiterscheinungen beobachtet (Lifson, 1986a). Die zellfreien überstehenden Lösungen wurden gesammelt und unter Verwendung einer handelsüblichen Apparatur zur Bestimmung von HIV- Antigen vom ELISA-Typ untersucht, um durch Messen der Spiegel des HIV-p24-Kernproteins die virale Reproduktion zu bestimmen.
Figur 4 zeigt den durch infizierte Zellen hervorgerufenen Spiegel von p24, ausgedrückt in Bezug auf diejenigen Spiegel, die durch unbehandelte infizierte Zellen hervorgerufen wurden, als Funktion von steigenden Konzentrationen von TCS (offene und gefüllte Quadrate) und α-MMC (Dreiecke). Bei einer scRIP-Konzentration zwischen 0,5 und 1 ug/ml wurde sowohl für MMC als auch für TCS eine im wesentlichen vollständige Hemmung der Expression von viralem Antigen erreicht.
Figur 5 zeigt die durch infizierte T-Zellen hervorgerufenen Spiegel von p24, die wie in Figur 4 als Funktion von steigenden Konzentrationen von PAP-I (offene Quadrate), PAP-II (Dreiecke) und PAP-S (gefüllte Quadrate) dargestellt sind. Die Ergebnisse sind denjenigen ähnlich, die aus Figur 4 ersichtlich sind, obwohl etwas höhere Konzentrationen von PAP-scRIP-Verbindungen erforderlich waren, um den gleichen Grad von Hemmung des Antigens zu bewirken.
Figur 6 zeigt die durch infizierte T-Zellen hervorgerufenen Spiegel von p24, die wie in Figuren 4 und 5 als Funktion von steigenden Konzentration von Mitogillin (offene Quadrate), restrictocin (Dreiecke) und α- Sarcin (gefüllte Quadrate) dargestellt sind. Für alle drei scRIP-Verbindungen wurde bei einer Konzentration von 0,5 ug/ml eine im wesentlichen vollständige Hemmung von p24 errecht.

Beispiel 5

Wirkung der Behandlung mit TCS und MMC auf die Reproduktion von HIV in infizierten T-Zellen

Die Reproduktion von HIV wurde ebenfalls durch Messen der an Partikel gebundenen Aktivität von Reverser Transkriptase in den zellfreien überstehenden Flüssigkeiten der Kulturen bestimmt. Infizierte und nicht infizierte Zellen wurden eingeimpft und, wie oben beschrieben, verschiedenen ausgewählten Konzentrationen von TCS oder von α-MMC ausgesetzt. 2 und 5 Tage nach der Einwirkung des Wirkstoffes wurden die Zellsuspensionen gesammelt und durch Zentrifugieren bei 500 g während 10 Minuten pelletisiert. Die überstehende Lösung wurde dann bei 45.00 g während 1 Stunde zentrifugiert und die Reverse-Transkriptase- Aktivität (RT-Aktivität) wurde, wie beschrieben, gemessen (Hoffman).
Die für die am 5. Tag entnommenen überstehenden Flüssigkeiten erhaltenen Ergebnisse sind in figur 7 als Funktion der Konzentration von zugesetztem scRIP graphisch dargestellt. Nicht infizierte Zellen (gefüllte Kreise) zeigten keine nachweisbare RT-Aktivität. Sowohl die Behandlung mit TCS (gefüllte Diamanten) und MMC (offene Quadrate) ergab in den Kulturen eine signifikante, von der Konzentration abhängige Abnahme der viralen Reproduktion, wie durch Messen der an Partikel gebundenen RT-Aktivität in zellfreien überstehenden Kulturflüssigkeiten gemessen wurde. Bei hohen Konzentration von TCS wurde praktisch kein RT-Aktivität nachgewiesen, insbesondere wenn man die geringe Menge von Virus berücksichtigt, die während der ersten Stunden der Behandlung produziert wurden, bevor die anti-HIV-Mittel, eine Möglichkeit hatten, ihre Wirkung zu entfalten.

Beispiel 6

Infektion von Monozyten/Makrophagen durch HIV

A. Prozentsatz von infizierten Zellen

Monozyten/Makrophagen wurden wie oben beschrieben isoliert und kultiviert. Um die Makrophagenzellen mit HIV zu infizieren, wurden die Makrophagen nach 5 - 15 Tagen in der Kultur durch Zentrifugieren pelletisiert, dann mit 2 ug/ml Polybren in PBS resuspendiert und dann 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen und dem Zentrifugieren wurden die pelletisierten Zellen bei einer Konzentration von 5 10&sup5; Makrophagen/ml und 5 10&sup5; infektiösen Einheiten/ml in HIV-DV resuspendiert. Die Zellen wurden mit dem Virus bei 37ºC über Nacht in Kontakt gelassen, dann wurde nicht gebundenes Virus durch Waschen entfernt und die Zellen wurden zu 5 10&sup5; Zellen/ml in einem vollständigen Medium resuspendiert.
Die Häufigkeit der HIV-infizierten Makrophagen wurde, wie beschrieben und wie oben in Beispiel 4 erläutert, durch zytofluorographische indirekte Immunofluoreszenz mit Einzelzellen bestimmt. Figur 8 zeigt graphische Darstellungen der Zellauszählungen als Funktion des Fluoreszenzgrades für HIV-infizierte Zellen, die mit Kontrollantikörper (MOPC-21) (A) oder anti-p24-Antikörper (B) markiert waren. Die Daten zeigen, daß etwa 60% der Zellen in den infizierten Makrophagen 10 Tage nach der in vitro-Infektion mit anti-p24 Antikörper reaktiv sind. Mit Zellen von anderen Spendern wurde routinemäßig ein Spiegel von etwa 40 - 60% von infizierten Zellen erreicht.

B. Langzeit-Lebensfähigkeit der Zellen

Um zu bestimmen, ob HIV-infizierte Makrophagen während einer langen Zeit in der Kultur überleben, wurden die Zellen während einer Zeitspanne von einigen Wochen auf die Expression von p24-Antigen geprüft. Der zeitliche Verlauf der Expression von p24 in Zellen von infizierten Makrophagen von zwei verschiedenen Spendern (offene kreise und Dreiecke) ist in Figur 9 graphisch dargestellt. Wie ersichtlich ist, nimmt die Expression von HIV-Antigen während der ersten zwei Wochen nach der Infektion (zeit Null) schnell zu und bleibt dann während mindestens 4 Wochen auf einem hohen Niveau. Die Lebensfähigkeit der infizierten Zellen von beiden Spendern (gefüllte kreise und Dreiecke in Figur 7) wurde unter Verwendung von "trypan blue exclusion" ebenfalls geprüft. Die infizierten Zellen zeigen während einer Zeitspanne von 4 Wochen in der Kultur fast keinen Verlust an Lebensfähigkeit. Währen der Testperiode wurden bei den infizierten Zellen keine zytopathischen Wirkungen beobachtet.

Beispiel 7

Wirkung von TCS und MMC auf die Expression von HIV-p24-Antigen in HIV-infizierten Monozyten/Makrophagen

A. Hemmung der Expression von HIV-p24-Antigen

Wie oben präparierte, in Kultur gezüchtete Makrophagen wurden während 7 Tagen in einer Kultur gehalten. Dann wurden die makrophagen einer Endkonzentration von 5 ug/ml TCS oder MMC ausgesetzt. Vier Tage nach der Zugabe des Wirkstoffes wurden die Zellen, wie oben beschrieben, durch indirekte Immunofluoreszenz mit anti-p24-Antikörper auf Expression von p24 geprüft. Figur 10 zeigt das zytofluorographische Profil von (A) Kontrollzellen (nicht infiziert), (B) infizierten Zellen, welche dem Wirkstoff nicht ausgesetzt waren, (C) infizierten, mit TCS behandelten Zellen und (D) infizierten, mit MMC behandelten Zellen. Wie ersichtlich ist, verringert eine 4-tägige Behandlung mit jedem der beiden Wirkstoffe die Expression von p24 in infizierten Zellen nahezu auf Hintergrundniveau.
Figur 11 zeigt eine ähnliche Hemmung der Expression von p24-Antigen durch TCS in HIV-infizierten Monozyten/Makrophagen. hier wurden die Zellen entweder am Tage 0 (gefüllte Kreise) oder nach 4 Tagen (gefüllte Quadrate) in der Kultur 0,3 ug/ml TCS ausgesetzt. Wie ersichtlich ist, verhinderte die Anwesenheit von TCS zur Zeit 0 die Expression von HIV-p24-Antigen in den Zellen und TCS bewirkte auch 4 Tage nachdem die Zellen dem inhibitor ausgesetzt wurden, eine Herabsetzung der bestehenden p24-Spiegel auf nahezu 0.

B. Zeitlicher Verlauf der Wirkung von TCS und MMC

In Kultur gezüchtete Makrophagen, die mit HIV infiziert waren, wurden, wie oben in Abschnitt A beschrieben, mit 5 ug/ml TCS oder MMC behandelt. Die Zellen wurden 1 und 4 Tage nach Zugabe des Wirkstoffes nach der oben erwähnten, indirekten Immunofluoreszenz-Methode auf Expression von p24- Antigen geprüft. Die in figur 12 graphisch dargestellten Daten zeigen, daß etwa 2/3 der Hemmung der Expression von p24- Antigen sowohl bei TCS (offene Dreiecke) als auch bei MMC (offene Kreise) innerhalb 24 Stunden eintritt. Die wie oben gemessene RT-Aktivität wurde in den mit jedem Wirkstoff behandelten Zellen ebenfalls deutlich herabgesetzt. Am 4. Tag war sowohl die Expression von p24 als auch die RT-Aktivität auf Hintergrundniveau gesunken, wogegen unbehandelte, HIV-infizierte Zellen keine Abnahme der Expression von p24 (gefüllte Kreise in Figur 11) und keine Abnahme der RT-Aktivität zeigten. Die Lebensfähigkeit der Zellen, wie sie mit dem "trypan blue exclusion"-test gemessen wurde, wurde während der 4-tägigen Behandlung mit jedem Wirkstoff auf etwa 60 - 70% herabgesetzt.

C. Dosis-Wirkung für TCS und MMC

Kulturen der infizierten Zellen wurde TCS oder MMC in Dosierungen von entweder 0,5 ug/ml oder 5 ug/ml zugesetzt. Die Zellen wurden 4 Tage nach der Zugabe des ausgewählten Wirkstoffes, wie oben beschrieben, auf Expression von p24 geprüft. Die Ergebnisse sind in Figur 13 graphisch dargestellt. Wie ersichtlich ist, ergaben beide Konzentrationen der Wirkstoffe 4 Tage nach Zugabe von entweder TCS (Dreiecke) oder MMC (offene Kreise) eine fast vollständige hemmung der Expression von p24. Um das Ansprechen von infizierten Zellen auf niedrigere Konzentrationen des scRIP zu bestimmen, wurden die infizierten Zellen während 3 Stunden Konzentrationen von MMC im Bereich von 0,05 bis 5ug/ml ausgesetzt. Das MMC wurde dann ausgewaschen und die Zellen wurden 4 Tage nach Beginn der Einwirkung des scRIP auf Hemmung der Expression p24 geprüft. Die Ergebnisse sind in Figur 14 dargestellt. Die Hemmung der Expression von HIV-Antigen war auch bei 0,05 ug/ml größer als 80%.

D. Selektive Hemmung der Expression von HIV-Antigen

Um zu prüfen, ob die durch TCS in vitro vermittelte Hemmung von HIV-p24-Antigen für HIV-Proteine spezifisch ist, wurde eine Standard-Bestimmung der Hemmung von HIV mit chronisch infizierten Makrophagen durchgeführt. In diesem Versuch wurden pro Vertiefung (Reaktionsgefäß) 1,5 10&sup5; Makrophagen mit verschiedenen Konzentrationen von TCS im Bereich von 5 ng/ml bis 5ug/ml während 3 Stunden behandelt, wonach freies TCS aus der Kultur ausgewaschen wurde. Behandelte und unbehandelte Kontrollzellen wurden 4 Tage später ausgewertet. Wie in früheren Versuchen gezeigt wurde, setzt eine pulsierende Behandlung (pulse treatment) von HIV-infizierten Makrophagen mit TCS den Grad der Expression von p24-Protein auch bei einer Konzentration von TCS von 50 ng/ml wesentlich herab. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Effekt der Einwirkung von TCS auf die Expression von zellulären Proteinen und auf ein spezielles zelluläres Antigen, nämlich HLA-DR, ebenfalls untersucht.
HLA-DR wird normalerweise auf der Oberfläche von HIV-infizierten Makrophagen zu ungefähr 450 Fluorescein-Einheiten pro Zelle (unter Verwendung von direkt fluoreceiniertem anti-DR monoklonalem Antikörper als färbendes Reagens) nachgewiesen. Bei der Behandlung mit TCS wurde keine wesentliche Abnahme der Menge von DR auf der Oberfläche von HIV-infizierten makrophagen festgestellt. Auch bei einer Konzentration von 5 ug/ml TCS wurde nach der Behandlung keine nachweisbare Abnahme der Menge von DR- Antigen auf der Zelloberfläche nachgewiesen, wogegen HIV-p24 in einer parallelen Bestimmung bei meßbaren anti-HIV-p24 Wirkungen einer 40%igen, bei 50 mg/ml nachgewiesenen Hemmung um mehr als 70% abnahm. In ähnlicher Weise wurden parallele, mit TCS behandelte Kulturen 4 Tage nachdem sie der Einwirkung von TCS ausgesetzt wurden, während 3 Stunden mit ³H-Leucin (20 uCi/ml) pulsierend behandelt (pulsed) und die in das Protein eingeführt Radioaktivität wurde durch Fällung mit TCA bestimmt. Bei kei ner Dosierung von TCS wurde eine Hemmung der Aufnahme von ³H-Leucin beobachtet.

Beispiel 8

Hemmung der zellulären Proliferation von HIV-infizierten T-Zellen durch TCS und MMC

A. Zellulärer Einbau von ³H-Thymidin

Nicht infizierte H9-T-Zellen oder chronisch mit HIV infizierte Zellen wurden, wie oben beschrieben, in Platten mit 96 Vertiefungen (2,5 10&sup4; Zellen pro Vertiefung) in einem Endvolumen von insgesamt 200 ul RPMI- 1640, das durch 10% (v/v) von in der hitze inaktiviertem Kalbsserum ergänzt war, eingeimpft. Es wurde TCS oder MMC bis zum Erreichen von Endkonzentrationen im Bereich von 0,01 bis 1 ug/ml zugesetzt. Nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator, der mit 5 - 7% CO&sub2; beschickt wurde, wurden die Kulturen 12 Stunden mit 1 uCi/Vertiefung ³H-Thymidin pulsierend behandelt (pulsed). Nach der 12-stündigen pulsierenden Behandlung wurden die Kulturen durch Waschen der Vertiefungen der Platte mit destilliertem Wasser auf Glasfaserfiltern gesammelt, und die Filter wurden durch Flüssig-Scintillationszählung ausgezählt. Die Daten werden als prozentuale Hemmung des Einbaues radioaktiver Markierung in Bezug auf positive Kontrollen ausgedrückt, die keine Testsubstanz enthielten.
Die für die Einwirkung von TCS erhaltenen Daten sind in Figur 15 für nicht infizierte (H9) und HIV-infizierte (H9,HIV) Zellen graphisch dargestellt. Die Konzentration von TCS, die dem Schnittpunkt jeder Kurve mit der 50%-Hemmlinie entspricht, gibt die Konzentration an TCS an welche eine 50%ige Hemmung der zellulären Proliferation bewirkt, wie sie durch eine 50%ige Hemmung der Aufnahme von Thymidin in DNA angezeigt wird. Das Verhältnis der Konzentrationen von TCS, die benötigt werden, um eine 50%ige Hemmung in nicht infizierten und in HIV-infizierten Zellen hervorzurufen, wird als der Selektivitätsindex definiert und beträgt für TCS bei ununterbrochenen Gegenwart des Inhibitors etwa 50 - 60. Das heißt, es wir ungefähr 50- bis 60mal mehr TCS benötigt, um einen vergleichbaren Grad von Hemmung in nicht infizierten Zellen zu vewirken als in HIV-infizierten T-Zellen. Ein ähnlicher Selektivitätsindex wurde für MMC beobachtet. Diese Selektivitätindices wurden bei kontinuierlicher Anwesenheit von scRIP erhalten. Wie nachstehend beschrieben wird, wird bei pusierendem Einwirkenlassen (pulsed exposure) ein höhere Selektivität beobachtet. Für den Einbau von ³H-Leucin in nicht infizierte und infizierte T-Zellen wurden sowohl bei der Behandlung mit TCS als auch bei der Behandlung mit MMC ähnliche Selektivitätsindices beobachtet.

B. Zeit der Einwirkung von TCS und MMC

Nicht infizierte H9-T-Zellen oder chronisch mit HIV infizierte Zellen wurden mit 2ug/ml TCS oder MMC behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (5, 15, 30, 60 und 120 Minuten) der Einwirkung wurden aliquote Anteile der behandelten Zellen gewaschen, um freies TCS und MMC zu entfernen, und die Zellen wurden, wie oben beschrieben, zu 2,5 10&sup4; Zellen/Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingeimpft. Die Zellen wurden 3 Tage kultiviert und dann 12 Stunden mit 1 uCi/Vertiefung ³H-Thymidin pulsierend behandelt. Nach einer Zeitspanne der pulsierenden Behandlung von 12 Stunden wurden die Kulturen geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in zelluläre DNA wurde, wie oben erwähnt, durch Scintllationszählung gemessen. Die Daten werden in Prozent Hemmung des Einbaues von radioaktiver Markierung in Bezug auf positive Kontrollen ausgedrückt, die keine Testverbindung enthalten.
Die für die Einwirkung von TCS und MMC erhaltenen Daten sind in Figuren 16A bez. 16B graphisch dargestellt. Wie ersichtlich ist, ruft die Einwirkung von TCS oder MMC während 1 Stunde oder länger in infizierten Zellen eine Hemmung der zellulären Proliferation hervor, die größer als 50% ist, wogegen in nicht invizierten Zellen auch 2 Stunden nach der Einwirkung des zugesetzten scRIP keine signifikante Hemmung beobachtet wurde. Somit wird bei zeitlich beschränkter (im Gegensatz zu kontinuierlicher) Einwirkung des Inhibitors die selektive hemmund der zellulären Proliferation von HIV-infizierten Zellen (Beispiel 8A) weiter verstärkt.

C. Auswirkung auf Zellwachstum und Lebensfähigkeit

Das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit wurden 2 und 5 Tage nach Zugabe der anti-HIV-Wirkstoffe bestimmt. Die Auszählung der Zellen wurde unter Verwendung eines Hemozytometers durchgeführt und die Lebensfähigkeit wurde durch "trypan blue exclusion" bestimmt. Wie in Figuren 17A und 17B gezeigt wird, ergab die Behandlung mit TCS und MMC sowohl nach 2 als auch nach 5 Tagen eine von der Konzentration abhängige Hemmung der zellulären Proliferation (absolute Auszählung von lebensfähigen Zellen.ml), wobei eine bevorzugte Hemmung der Proliferation von HIV-infizierten Zellen auftrat. Figur 17C zeigt, daß der Prozentsatz von lebensfähigen Zellen in den behandelten Kulturen in einer von der Konzentration abhängigen Weise vermindert wurde, wobei bevorzugte Wirkungen bei den HIV-infizierten Zellen auftraten. Daher scheint das Wachstum und die Lebensfähigkeit der Zellen sowohl durch zytozide (verminderter Prozentsatz von lebensfähigen Zellen) und zytostatische (verminderte absolute Zahl von Zellen und verminderter Prozentsatz von lebenden Zellen ) Mechanismen beeinträchtigt zu werden.

Biespiel 9

Wirkung von scRIP auf die zelluläre Proliferation in HIV-infizierten und nicht infizierten T-Zellen

Es wurde die Wirkung von einigen ausgewählten scRIP-Verbindungen auf die zelluläre Proliferation in nicht infizierten und HIV-infizierten T-Zellen im wesentlichen nach den auf der Aufnahme radioaktiver Markierung basierenden Verfahren geprüft, die in Beispiel 8A beschrieben wurden. Im einzelnen wurden die Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen eingeimpft, dann einer ausgewählten Konzentration des scRIP ausgesetzt, wobei nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen geprüft wurde. Die Zellen wurden dann bei einem Grad der radioaktiven Markierung von 1uCi/Vertiefung 12 Stunden ³H-Thymidin oder ³H-Leucin ausgesetzt, bevor die Zellen geerntet und die eingeführte radioative Markierung ausgezählt wurde. Wie oben sind die Daten in Prozent Hemmung der Einführung von radioaktiver Markierung in Bezug auf Kontrollen ausgedrückt, die keine Prüfsubstanz enthalten.
Figur 18A zeigt die durch Behandeln mit PAP-I bewirkte selektive Hemmung der zellulären Proliferation, wie sie durch Einbau von Thymidin in nicht infizierte und HIV-infizierte T-Zellen nachgewiesen wird. Figur 18B zeigt eine ähnliche selektive Hammung des Einbaues von Leucin in infizierte und nicht infizierte T-Zellen durch PAP-I. Figur 19 zeigt ein ähnliches Ergebnis für den Einbau von Thymidin in infizierte und nicht infizierte T-Zellen, die der Einwirkung von PAP-II ausgesetzt wurden.
Figuren 20 - 22 sind ähnliche graphische Darstellungen der Hemmung des Einbaues von Thymidin in infizierte und nicht infizierte Zellen, die der Einwirkung von Mitogillin (Figur 20), Restrictocin (figur 21) und α-Sarcin (figur 22) ausgesetzt wurden. In jedem Fall trat eine 50%ige Hemmung der Aufhahme von Thymidin in HIV-infizierten Zellen bei einer scRIP-Konzentration von etwa 0,05 ug/ml auf, und der Selektivitätsindex betrug etwa 100.

Beispiel 10

Hemmung der zellulären Proliferation von durch HTLV-I infizierten T-Zellen durch TCS und MMC

A. Zellulärer Einbau von ³H-Thymidin

Ein durch HTLV-I infizierter "producer" Zellstamm C91/PC wurde von Dr. Gregory Reyes, Genelabs Incorporated, (Redwood City. CA) erhalten. Alsnegativer Kontrollzellstamm dienten H9-Zellen, ein kontinuierlicher Zellstamm, der nicht mit irgendeinem bekannten Retrovirus infiziert war.
Nicht infizierte H9-T-Zellen oder C91/PC-Zellen, die chronisch mit HTLV-I infiziert waren, wurden wie in Beispiel 7A auf Platten mit 96 Vertiefungen geimpft. Es wurde TCS, MMC oder Mitogillin bis zum Erreichen einer Endkonzentration im Bereich von 0,05 bis 5 ug/ml zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen bei 37ºC in einem mit einem Befeuchter ausgestatteten Inkubator, der mit 5 - 7 % CO&sub2; beschickt wurde, wurden die Kulturen 12 Stunden pulsierend mit 1 uCi/Vertiefung 3H-Thymiding behandelt. Nach 12 Stunden pulsierender Behandlung wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern geerntet und das in die zelluläre DNA eingebaute Thymidin wurde, wie oben beschrieben, gemessen. Die Daten werden in Prozent Hemmung des Einführung radioaktiver markierung in Bezug auf positive Kontrollen ausgedrückt, die keine Testverbindung enthalten.
Die bei die Einwirkung von TCS erhaltenen Daten sind in Figur 23A für nicht infizierte (H9) und durch HTLV-I infizierte ((C91/PC)Zellen graphisch dargestellt. Wie ersichtlich ist, besteht zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen bei keiner Konzentration von TCS ein signifikanter Unterschied in der durch Einbau von Thymidin gemessenen zellulären Proliferation. Bei steigenden Konzentrationen von TCS wurde eine nicht selektive Hemmung der zelluluare Proliferation beobachtet.
Ähnliche Ergebnisse wurden für MMC (Figur 23B) und Mitolgillin (Figur 23C) erhalten, welche keine selektiven Hemmwirkungen auf die durch HTLV-I infizierten Zellen und bei steigenden Konzentrationen jedes scRIP eine nicht selektive Hemmung der zellulären Proliferation zeigt.
Obwohl die Erfindung in Bezug auf spezielle Ausführungsformen, Verwendungen und Verfahren beschrieben wurde, wird erkannt werden, daß verschiedene Änderungen und Abwandlungen gemacht werden können, ohne den Geltungsbereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Verwendung eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer HIV-Infektion.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das genannte inaktivierende Protein aus der aus Trichosanthin, Momorcharin, einem antiviralen Protein aus Kermesbeere, Alpha-Sarcin, Mitogillin und Restrictocin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das genannte inaktivierende Protein aus der aus Trichosanthin und Momorcharin beste henden Gruppe ausgewählt ist.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das genannte inaktivierende Protein Trichosanthin ist.

5. Verwendung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das genannte inaktivierende Protein N-Glykosidase-Aktivität besitzt.

6. Verwendung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Behandlung einer HIV-Infektion durch ein Verfahren zur selektiven Hemmung der zellulären Proliferation von HIV-infizierten T-Zellen, welches das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins umfaßt, welche wirksam ist, die Lebensfähigkeit von HIV-infizierten T-Zellen gegenüber nicht infizierten T-Zellen selektiv herabzusetzen.

7. Verwendung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Behandlung einer HIV-Infektion durch ein Verfahren zur selektiven Hemmung der Expression von HIV-Antigen in HTV-infizierten Zellen der einkernigen, phagozytierenden Zellfamilie, welches das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins mit N-Glykosidase-Aktivität auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins und während einer Dauer umfaßt, welche wirksam sind, das Mengenverhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in den infizierten Zellen zu verringern.

8. Verwendung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Behandlung einer HIV-Infektion durch ein Verfahren zur selektiven Hemmung der Expression von HIV-Antlgen in HIV-infizierten Zellen der einkernigen, phagozytierenden Zellfamilie, welches das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden, aus der aus Trichosanthin und Momorcharin bestehenden Gruppe ausgewählten Proteins auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins und während einer Dauer umfaßt, welche wirksam sind, das Mengenverhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in den infizierten Zellen zu verringern.

9. Verwendung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Behandlung eines menschlichen, durch HIV infizierten Patienten durch ein Verfahren, welches das Verabreichen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins an den Patienten in einer Konzentration umfaßt, welche wirksam ist, ejne meßbare Abnahme mindestens einer der folgenden Indikationen einer HIV-Infektion hervorzurufen:

(a) HIV-Antigen-Spiegel, der mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden ist;

(b) HIV-Antigen-Spiegel im Blutstrom;

(c) Reverse-Transkriptase-Aktivität, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden ist;

(d) das Verhältnis der Lebensfähigkeit von HIV-infizierten zu nicht infizierten T-Zellen.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die genannte Abnahme der Indikation(en) innerhalb 1-5 Tagen nach der Verabreichung meßbar ist.

11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, welche zusätzlich das alternative Messen der Abnahme mindestens einer der genannten Indikationen und das Wiederholen der genannten Verabreichung umfaßt, bis die gemessene Indikation einer HIV- Infektion keine weitere Abnahme zeigt.

12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9, 10 oder 11, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein parenteral in einer Dosierung verabreicht wird, die wirksam ist, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbundene Expression von HIV-Antigen zu hemmen.

13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Indikationen zusätzlich eine meßbare Abnahme des Verhältnisses eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in HIV-infizierten Zellen der einkernigen, phagozytierenden Zellfamilie einschließen.

14. Verfahren zur selektlven Hemmung der zellulären Proliferatjon von HIV-infizierten T-Zellen in vitro, umfassend das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosoinen inaktivierenden Proteins auf die infizjerten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins, die wirksam ist, um die Lebensfähigkeit der HIV-infizierten T-Zellen im Vergleich zu nicht infizierten T-Zellen selektiv herabzusetzen.

15. In vitro-Verfahren zur selektiven Hemmung der Expression von HIV-Antigen in HIV-infizierten Zellen der einkernigen, phagozytierenden Zellfamilie, umfassend das Einwirkenlassen eines einkettigen, Ribosomen inaktivierenden Proteins auf die infizierten Zellen bei einer Konzentration des inaktivierenden Proteins und für eine Zeitdauer, welche wirksam sind, das Verhältnis eines ausgewählten HIV-Antigens zu einem ausgewählten zellulären Antigen in den infizierten Zellen zu vermindern.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das genannte inaktivierende Protein aus der aus Trichosanthin, Momorcharin, einem antiviralen Protein aus Kermesbeere, Alpha-Sarcin, Mitogillin und Restrictocin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das genannte inaktivlerende Protein aus der aus Trichosanthin und Momorcharin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das genannte inaktivierende Protein Trichosanthin ist.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das genannte inaktivierende Protein N-Glykosidase-Aktivität besitzt.