DE3884811T2

DE3884811T2 - Hyperimmun globulin gegen hiv.

Info

Publication number: DE3884811T2
Application number: DE88908090T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Allain; Henry Balfour; Richard Condie; Laurence Cummins; Lawrence Falk; Frank Rhame
Original assignee: University of Minnesota; Biomune Corp
Current assignee: University of Minnesota; Biomune Corp
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1988-08-10
Publication date: 1994-02-24
Anticipated expiration: 2008-08-11
Also published as: KR890701133A; AU618555B2; JPH0796560B2; EP0379516A1; KR970003056B1; FI900670A0; AU2322588A; DK35290D0; NO900674L; DE379516T1; IE882455L; NO180271B; EP0379516B1; DE3884811D1; JPH02504514A; IE62584B1; NO180271C; NO900674D0; DK35290A; NZ225796A

Description

Hintergrund der Erfindung

Das erworbene Immundefizienz-Syndrom, auch AIDS genannt, ist als eine dringende Notlage der öffentlichen Gesundheit anerkannt worden. Im Dezember 1986 waren über 27'700 Amerikaner davon betroffen, etwa die Hälfte davon sind inzwischen gestorben, und niemand ist von der Krankheit geheilt worden. Zwischen 1 Million und 1,5 Millionen Amerikaner sind wahrscheinlich durch den humanen Immundefizienz-Virus (HIV), die Ursache von AIDS, infiziert worden. Mindestens 20 bis 50% dieser infizierten Menschen werden an AIDS erkranken. Die amtliche Gesundheitsbehörde der Vereinigten Staaten sagt voraus, dass bis Ende 1991 mehr als 179 000 Menschen dieser Krankeit zum Opfer gefallen sein werden. Es gibt zur Zeit keine wirksame Behandlung und zur Entwicklung eines Impfstoffs werden mindestens fünf Jahre nötig sein. Siehe Chem. Eng. News (8. Dezember 1986) auf Seiten 7-14.
Die Wirkung der Infektion mit dem HIV scheint zu variieren. AIDS selbst ist eine schwere Defizienz des Immunsystems, welche durch ein breites Spektrum von sogenannten Gelegenheitsinfektionen - jene, die durch Mikroorganismen erzeugt werden, welche bei Personen mit einem normalen Immunsystem selten Erkrankungen verursachen - und durch aus der Immundefizienz resultierende Krebsgeschwüre charakterisiert wird. Die meisten durch den Virus infizierten Personen bleiben während verschiedener Zeitdauer symptomfrei. Es gibt jedoch eine wachsende Anzahl infizierter Patienten, welche einen als AIDS-bezogenen Komplex (ARC) bekannten Zustand aufweisen, welcher durch Fieber, Diarrhoea und geschwollene Lymphknoten charakterisiert ist. Der ARC wird heute weitgehend als unausweichbar zu AIDS führende Entwicklung betrachtet.
Im Gegensatz zu manchen anderen viralen Infektionen beim Menschen verspricht die Synthese von Antikörpern gegen HIV keine Klärung der Infektion. Der HIV kann von vielen seropositiven Personen noch lange Zeit nach deren ursprünglichen Infektion isoliert werden. Die Lentiviren, welche andere Tiere infizieren, erzeugen bekanntlich Infektionen, welche während der ganzen Lebensdauer des infizierten Tieres bestehen bleiben. Unglücklicherweise scheint es, dass der HIV beim Menschen in ähnlicher Weise eine ein Leben lang anhaltende Infektion erzeugt. Die Anwesenheit von Antikörpern gegen den HIV im Serum ist deshalb kein Zeichen der Immunität, sondern in den meisten Fällen vielmehr ein Zeichen, dass die Infektion fortschreitet. Es sind jedoch in gewissen Personen, während des Ablaufes ihrer Infektion mit HIV, Antikörper gefunden worden, welche den HIV in vitro neutralisieren können. Diese neutralisierenden Antikörper sind unter Verwendung von Versuchen identifiziert worden, welche das Vermischen des zellfreien Virus mit dem aus infizierten Spendern erhaltenen Serum und hierauf das Ermitteln der Infektiosität dieses Gemisches bei empfindlichen Zielzellen umfassen.
Beispielsweise haben M. Robert-Guroff und R.C. Gallo (europäische Patentanmeldung Nr. 193'384) die HIV-Infektion des H9-Klons der HT-Zelllinie untersucht, indem sie unter Verwendung einer indirekten Immunfluoreszenz-Methode die Expression des HIV-Kernproteins p24 studiert haben. Drei Tage nach der Infektion waren, gemäss Angabe durch die p24-Expression, etwa 80% der mit dem Serum eines gesunden, normalen Spenders vorbehandelten und mit dem HIV inkubierten H9-Zellen infiziert. Im Gegensatz dazu haben am dritten Tag nur 10% der H9-Zellen p24 exprimiert, wenn sie dem Virus ausgesetzt worden waren, welcher mit dem von einem ARC-Patienten erhaltenen Serum vorbehandelt wurde. Neutralisierende Antikörper wurden in 60% der erwachsenen AIDS- Patienten und in 80% der Erwachsenen mit ARC gefunden, jedoch nicht in gesunden heterosexuellen Vergleichspersonen. Die genannten Autoren haben jedoch die verschiedenen Sera bezüglich der Bindungseigenschaften der Antikörper nicht weiter charakterisiert, sie haben lediglich darüber spekuliert, dass die neutralisierenden Antikörper auf die Proteine der Haupthülle des HIV, beispielsweise gp41 und gp120, zielen können.
Allerdings weiss man bis heute nicht, ob die Immunreaktion dieser infizierten Personen sie vor der Entwicklung weiterer immunologischer Schädigung schützen kann. Während einige Veränderungen in dem Muster der serologischen Reaktivität mit spezifischen Komponenten des HIV-Proteins während des Fortschreitens der Infektion bis zur Erkrankung erfolgen, sind bisher keine spezifischen Muster gefunden worden, welche einen Zusammenhang mit dem Schutz der Gesundheit oder der Entwicklung der Krankheit zeigen würden.
In einer Studie haben J. Goudsmit et al., J. Infect. Diseases, 155, 558 (1987) recombinanten HIV- Kern und Hüllenantigene verwendet, um in dem Serum von Spendern, die verschiedene Stadien der HIV-Infektion aufwiesen, Antikörper gegen diese Proteine zu finden. In allen geprüften Sera haben sie Antikörper gegen das Antigen der HIV-Hülle gefunden, während sich bei fünf von sechs AIDS-Patienten keine Antikörper gegen das Kernantigen finden liessen. In 11 von 13 anderen Personen jedoch konnten Antikörper gegen dieses Protein nachgewiesen werden. Das HIV-Antigen ist auch unter Verwendung eines Immuntestes in fester Phase untersucht worden, und es wurde in allen sieben Serumproben nachgewiesen, in welchen der Antikörper zum Kern abwesend war. Das Antigen wurde in keiner der 12 Serumproben gefunden, welche den Antikörper zum Kern enthielten. Obschon Goudsmit et al. angenommen haben, dass die Abwesenheit des Antikörpers gegen das HIV-Kernprotein und das Vorhandensein von HIV-Antigenen in symptomfreien Personen eine künftige klinische Erkrankung ankünden dürften, haben sie keine der Serumproben auf eine HIV- neutralisierende Wirkung geprüft.
Ein bei den Anstrengungen zur Entwicklung eines Impfstoffs kritischer Aspekt der Immunreaktion ist die Möglichkeit einer spezifischen Antikörperreaktion zum HIV, welche die Infektion durch den Virus verhindern, beschränken oder eliminieren könnte. Solche Antikörper würden als in vivo neutralisierende Antikörper fungieren, und es ist ein bedeutendes Ziel für die Immunogene eines allfälligen Impfstoffes, diese Typen von Antikörpern zu Tage zu fördern.
Es besteht deshalb ein Bedarf nach Methoden zur Identifizierung und Gewinnung von Antikörpern, welche sich insofern HIV-spezifisch erweisen, als sie für die Behandlung und/oder die Prophylaxe von AIDS wirksam sind.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Es wird alllgemein angenommen, dass das Scheitern bei der Isolierung von HIV aus allen infizierten Personen auf technische Beschränkungen in den heutigen Kulturmethoden der T-Lymphocytenkultur und auf die Entleerung der Zielzellen in den fortgeschrittenen Stufen der Krankheit zurückgeht. Wir haben aber das Bestehen einer symptomfreien Untergruppe von infizierten Personen entdeckt, welche als Reaktion auf HIV Antikörper entwikkelt haben, die zur Neutralisation des HIV in vivo insofern wirksam sind, als HIV von dem Serum dieser Personen nicht gezüchtet werden kann und HIV-Markierungsantigene in dem Serum durch keine der zur Verfügung stehenden Gewebekulturen und Immunotests gefunden werden kann. Diese Personen können als von dem nachweisbaren replizierenden Virus insofern frei betrachtet werden, als dieser Zustand durch die dem Fachmann zur Verfügung stehenden Methoden festgestellt werden kann. Deshalb beruht die vorliegende Erfindung auf der Identifizierung dieser Personen und der Isolierung einer diese Antikörper enthaltende Blutfraktion (im folgenden als HIV-Hyper-Immunoglobulin oder "HIVIG") und der Verwendung von HIVIG zur Neutralisation der HIV-Infektiosität in vitro und in vivo.
Die vorliegende Erfindung stellt also ein HIV- spezifisches Immunoglobulin zur Verfügung, welches nach einem Verfahren hergestellt ist, welches umfasst:
(a) die Identifizierung eines menschlichen Spenders, der klinisch gesund ist und dessen Plasma:
(i) einen anti-HIV p24-Antikörpertiter von wenigstens etwa 128 zeigt;
(ii) HIV p24 negativ beim Enzymimmuntest ist;
(iii) HIV-Kultur-negativ ist; und
(b) die Isolierung einer Probe von Immunoglobulin aus dem Blut dieses Spenders, das einen HIV-Neutralisationstiter von mindestens etwa 8000 bei einer Konzentration von etwa 5 Gew.-% an Immunoglobulin aufweist.
Es sind symptomfreie, dem HIV ausgesetzte Personen gefunden worden, welche nachweisbare Antikörper gegen das HIV-Kernprotein p24 enthalten, obschon sie kein nachweisbares HIV-Antigen aufweisen. Siehe J. Goudsmit et al., oben erwähnt. Man hat bisher jedoch noch nicht realisiert, dass einige dieser Personen eine Quelle von Immunoglobulin sein können, welches einen äusserst hohen HIV-Neutralisationstiter haben. Der HIV- Neutralisationstiter beträgt mindestens etwa 8000 und liegt vorzugsweise so hoch wie 15'000-20'000, noch bevorzugter liegt er über 50'000, gemäss der Messung in einer Lösung von 5 Gew.-% in physiologischer Kochsalzlösung gemäss der im folgenden beschriebenen Technik.
Sowohl das Blutplasma des einzelnen Spenders als auch das von dem Spender abgeleitete anti-HIV-Immunoglobulin (IgG) weisen einen hohen Titer an gegen das HIV-Kernprotein p24 gerichteten Antikörpern auf. Vorzugsweise beträgt der anti-p24-Titer im Plasma des Spenders mindestens etwa 128, vorzugsweise liegt er bei etwa 256, noch bevorzugter bei etwa 512. Der anti-p24- Titer einer Lösung von 5 Gew.-% des aus dem Blut des Spenders abgeleiteten IgG beträgt mindestens etwa 10'000, vorzugsweise etwa 15'000 und noch bevorzugter etwa 30'000. Der Antikörpertiter der IgG-Zusammensetzung im bezug auf die Proteine der viralen Hülle (gp41 und gp120) ist für die Wirksamkeit des vorliegenden IgG nicht kritisch, da die AIDS-Patienten bis zu ihrem Tod die Anwesenheit und den Titer von Antikörpern gegen diese HIV-Proteine aufweisen.
Die Antikörpertiter von p24 und gp41 werden nach dem durch G.J. Dawson et al.[J.P. Allain et al., Lancet, 1233-36, (1986)] ausgearbeiteten kompetitiven Immuntest ermittelt; vertrieben werden sie durch Abbott Laboratories Inc., North Chicago, IL, als "Abbott HTLV III Confirmatory EIA". [Siehe technisches Bulletin: "Human T-Lymphotropic Virus III Antigen (Env/Core) (Recombinant E. Coli)-EIA", (93-3704/R1, Februar 1986)] deren Offenbarungsgehalt hierin durch Referenz miteingeschlossen wird.
Der Test auf das HIV-p24-Antigen wird nach der durch D.A. Paul et al., J. Cell. Biochem., 10, (Suppl. A), 224 (Abstract D130) (1986) veröffentlichten Technik durchgeführt; vertrieben wird er durch Abbott Laboratories, Inc. als "Abbott HTLV III Antigen EIA", wie beschrieben in dem technischen Bulletin "Antibody to Human T-Lymphotropic Virus Type III (Human)" (83-2100/R2, November 1986), dessen Offenbarung hierin durch Referenz miteingeschlossen wird. Der Ausdruck "Blutkultur", wie er in bezug auf den Nachweis von HIV im Spenderblut verwendet wird, wird, wie durch R.C. Gallo et al., Science, 224, 500-502 (1984) beschrieben, durchgeführt, deren Offenbarungsgehalt hierin durch Referenz miteingeschlossen wird. Der hier verwendete Ausdruck "klinisch gesund" bezieht sich auf die Abwesenheit der ARC- oder AIDS-Symptome, in Uebereinstimmung mit den von CDC (Centers for Disease Control, Atlanta, GA) (AIDS) festgelegten Kriterien oder mit der Begriffsdefinition, welche durch die National Institutes of Health AIDS Working Group in Zusammenarbeit mit dem CDC entwickelt worden sind. [Siehe Ebbesen et al., AIDS: a basic guide for clinicians. Kopenhagen: Munksgaard, (1984) Seite 234] (ARC). Vorzugsweise sollte die T4-Lymphozytenzahl des Spenders mindestens etwa 400, noch bevorzugter etwa 600 Zellen/ml Blut betragen.
Die Fähigkeit zur Neutralisation der HIV-Infektiosität in vitro mittels HIVIG, welches einen hohen Titer an Antikörpern gegen das virale HIV-Kernprotein p24 enthält, kann die Basis von Versuchen über die Wirksamkeit einiger Prototypen von HIV-Impfstoffen bilden und kann auch bei der Grundlagenforschung über die Mechanismen der HIV-Infektion nützlich sein, beispielsweise bezüglich der Auswirkung von Mutationen auf die Produkte der viralen Genexpression.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Steigerung des Antikörpertiters gegen HIV-p24 im Plasma, indem einem Patienten, der dem HIV ausgesetzt wurde, eine pharmazeutische Einheitsdosisform des vorliegenden HIVIG verabreicht wird. Es wird deshalb angenommen, dass das HIVIG der vorliegenden Erfindung ein therapeutisches Potential haben dürfte, sei es als prophylaktisches Mittel zur Verlängerung der Lebenserwartung von infizierten und/oder erkrankten Patienten durch Verzögerung des klinischen Fortschreitens der Erkrankung, oder möglicherweise als Heilmittel, welches zur Vernichtung der Virulenz des Virus wirken kann. Das HIVIG kann auch einen wertvollen Zusatz zu den antiviralen Mitteln, AZT (Azidothymidin), DDC (Didesoxycytidin), oder zu anderen möglicherweise wirksamen Medikamenten darstellen. Wie oben besprochen gab es bisher keinen Grund zur Annahme, dass Antikörper, welche HIV in vitro zu neutralisieren vermögen, das Fortschreiten von AIDS wirksam unterdrücken würden. Die Abwesenheit der klinischen ARC- oder AIDS-Symptome bei den HIVIG-Spendern zusammen mit der Abwesenheit sowohl der viralen Infektionsität als auch des p24-Antigens in deren Serum ergeben jedoch einen starken zusätzlichen empirischen Anhaltspunkt dafür, dass das HIVIG in vitro wirksam sein wird.
Es muss verstanden werden, dass die vorliegende HIVIG-Quelle notwendigerweise aus Spendern besteht, welche vorher dem HIV ausgesetzt worden sind. Allerdings erwartet man eine besser steuerbare HIVIG-Quelle von der Entwicklung eines im wesentlichen ähnlichen Antikörperspektrums in gesunden Personen nach deren Behandlung mit Impfstoffen, welche von immunogenen viralen Proteinen oder von Fragmenten derselben, vorzugsweise über die rekombinante virale DNS, abgeleitet werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemässe IgG wird aus dem durch Plasmapherese von ausgewählten, dem HIV ausgesetzten Spendern erhaltenen Plasmapool isoliert, welche Spender keine signifikante aktive Virusreplikation aufweisen. Die Spender wurden aus einem Pool von symptomfreien Sero-konvertierten Personen ausgewählt, welche in der Folgezeit das im folgenden beschriebene Spektrum der anti-HIV-Antikörper aufwiesen, während sie bei der Prüfung auf das HIV-Antigen negativ reagierten. Das Plasma der Spender war auch zur Infektion von HIV-empfindlichen Zellen nicht fähig.
Alle kontaminierenden Viren im Plasmapool können durch Alkoholfraktionierung inaktiviert werden. Morbidity and Mortality Weekly Report, 35, 231 (11. April 1986). Das IgG wurde aus dem Plasma durch Fraktionierung auf der Zentrifuge in Gegenwart von kaltem Ethanol (-10ºC bis 0ºC) bei neutralem pH (6,6 bis 7,3) gewonnen. [Siehe E.J. Cohn, US-Patente Nrn. 2 390 074 und 2 770 616]. Das gewünschte IgG kann auch nach der von G.U. Bethel und R.M. Condie in der US-Patentanmeldung Nr. 36 031 (am 4. Mai 1979 eingereicht) beschriebenen Methode durch gesteuerte Proteinfraktionierung gewonnen werden. Die erhaltene IgG-enthaltende Paste wird in einem Ueberschuss an destilliertem Wasser suspendiert und zur Entfernung von Ethanolresten bei einer Temperatur unterhalb von 0ºC lyophilisiert.
Vorzugsweise wird das IgG-Produkt mit einem flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie eine wässrige IV-Flüssigkeit, verdünnt, bevor es auf seine Bioaktivität geprüft oder als eine Einheitsdosisform in vivo verabreicht wird. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, PA (16. Ausgabe, 1980), Seiten 1488-1496, dessen Offenbarungsgehalt hierin durch Referenz miteingeschlossen wird. Die erhaltene Lösung wird beispielsweise durch Filtration sterilisiert. Die mit den IgG-Präparaten üblicherweise verwendeten Konservierungsmittel, wie Maltose, Glycin oder Thimerosal, können in pharmazeutisch annehmbaren Mengen zugegeben werden.
Vorzugsweise werden die erhaltenen Lösungen parenteral verabreicht, beispielsweise durch intravenöse Infusion oder Injektion. Die Menge des verabreichten IgG kann stark variieren und wird von dem körperlichen und psychischen Zustand des HIV-infizierten Patienten abhängig sein. Solche Faktoren sind notwendigerweise empirisch und können durch den Kliniker, unter Verwendung der oben beschriebenen, für ARC oder AIDS geltenden Kriterien bestimmt werden. Bei gewissen klinischen Lagen kann es nötig sein, mehrere Dosen der IgG-Zusammensetzung zu verabreichen, um die Infektiosität der von den infizierten Zielzellen freigesetzten viralen Partikeln zu neutralisieren.
Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden ausführlichen Beispiele beschrieben.

Beispiel - Isolierung des anti-p24-Immunoglobulins von hohem Titer (HIVIG)

A. Technik des Immuntests

1. Nachweis des HIV-Antigens.

Wie von J. Goudsmit et al., Lancet, 177 (1986) allgemein beschrieben wurde, wurden Serumproben auf das HIV-Antigen in einem Immuntest auf fester Phase geprüft (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Von der Probe wurden 200 Mikroliter über Nacht bei Raumtemperatur (etwa 22ºC) mit mit menschlichem Antikörper gegen HIV überzogenen Kügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen; der IgG-Antikörper von Kaninchen gegen HIV wurde zugegeben und während 4 Stunden bei 45ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden wie zuvor gewaschen und hierauf während zwei Stunden bei 45ºC mit dem Konjugat der Meerrettich-Peroxidase und des Ziegenantikörpers gegen das Kaninchen-IgG inkubiert. Nach einem letzten Waschen wurden die Kügelchen in Röhrchen transferiert und mit o-Phenylendiamin versetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit wurde jedem Röhrchen 1 ml H&sub2;SO&sub4; zugegeben. Das A&sub4;&sub9;&sub2; wurde unter Verwendung eines Wellenlängen-Spektrophotometers Quantum Dual (Abbott Laboratories) abgelesen. Eine Probe wurde als positiv bezeichnet, wenn ihre OD (Oberflächendosis) ≥0,050 zusätzlich des Mittelwertes von fünf Wiederholungen ab normalem menschlichem Plasma betrug. Der Test ist äusserst empfindlich für das HIV-Kernantigen p24 und kann das Antigen in der überstehenden Flüssigkeit von Kulturen der HIV-infizierten HT-9-Zellen bei 10³ Zellen/ml nachweisen (die überstehende Flüssigkeit von nicht infizierten HT-9-Zellen ist negativ). Die Spezifität des Tests wird teilweise durch den Kaninchenantikörper bestimmt, welcher bei Verwendung auf Immunoblots von gereinigtem HIV-Lysat oder in den RIPA-Techniken das p55/24 (Kern) stark und das gp120/41 (Hülle) nur schwach nachweist. Das gereinigte rekombinante Kernantigen ist bei 50 pg/ml nachweisbar, wenn es in Serum oder Plasma versetzt wird, während gereinigtes, rekombinantes Hüllenantigen bei etwa 500 ng/ml nachweisbar ist. Die Quantifizierung des HIV-Antigens wurde durch Vergleich der OD der Proben mit der OD von bekannten Mengen des gereinigten HIV-Lysates durchgeführt. Bei Verwendung dieses Antigens als Standard liegt die Nachweisgrenze dieses Tests bei etwa 0,05 ng/ml.

2. Nachweis der Antikörper gegen die Proteine des HIV-Kerns und der Hülle.

Die Antikörper wurden durch Verwendung des im Handel erhältlichen kompetitiven Enzym-Immuntests (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) ermittelt, wie durch J.F. Allain et al., Lancet, 1233-36 (1986) allgemein beschrieben wurde. Kurz, in dem ersten System wurden Kügelchen, welche mit dem das gesamte p24gag-Genprodukt sowie auch Fragmente der p15- und p18-gag-Genprodukte enthaltenden rekombinanten HIV-Kernantigen überzogen waren, während 16 bis 22 Stunden bei Raumtemperatur mit 50 ul von serienweise zweifach verdünnten Serumproben (in normalem menschlichem Plasma verdünnt) und mit 200 ul Konjugat der Meerrettich-Peroxidase und des menschlichen Antikörpers gegen das HIV-Kernantigen inkubiert. Die Kügelchen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und die Farbe wurde, wie für den Antigentest oben beschrieben, entwickelt. Da es sich um einen kompetitiven Enzym-Immuntest handelt, war die Intensität der entwickelten Färbung der Menge Antikörper gegen das HIV-Kernantigen in der Probe umgekehrt proportional. Der Endpunkt wurde als die durch zwei dividierte Summe der negativen Kontrollmittelwerte (n = 3) und der positiven Vergleichsmittelwerte (n = 2) festgelegt. Der Antikörpertiter wurde als die höchste Verdünnung angenommen, bei welcher das A&sub4;&sub9;&sub2; der Probe unter dem Endpunkt lag. Dieselbe Technik wurde bei der Prüfung auf die Antikörper gegen das Hüllenantigen verwendet; die Kügelchen wurden aber mit dem rekombinanten HIV-Antigen der Hülle (welches das gesamte p41env-Genprodukt sowie auch 45 Aminosäuren aus dem gp120env-Genprodukt enthält), und es wurde anstelle der Kernantikörper der menschliche Antikörper gegen die HIV-Hülle verwendet. Hergestellt wurden die markierten Antikörper für die Prüfung auf Antikörper gegen den Kern und Antikörper gegen die Hülle aus den Sera von Patienten mit hohem Titer gegenüber dem Kern bzw. der Hülle auf Immunoblots.

B. Auswahl der Spender

Die Serumproben wurden von 25 Personen erhalten, welche zuvor bei der Prüfung auf HIV-Antikörper eine positive Reaktion hatten. Der Gehalt an anti-p24- und anti-gp41-Antikörpern wurde nach dem in Teil A(2) hieroben beschriebenen kompetitiven Enzym-Immuntest der Abbot Laboratories gemessen. Die gp120-Antikörper wurden durch das Immunoblot nachgewiesen, jedoch nicht quantifiziert. Siehe J.P. Allain et al., supra. Die Prüfung auf das HIV-Antigen wurde sowohl durch Kultur als auch durch den in Teil A(1) hieroben beschriebenen Immuntest durchgeführt. Von den 25 Personen waren 11 symptomfrei und negativ in bezug auf das Plasmaantigen, während sie einen relativ hohen Titer an HIV-Antikörpern aufwiesen. Von diesen Spendern wurden drei als Plasmaspender ausgewählt, welche alle negativ in bezug auf die HIV-Kultur des Blutes und negativ in bezug auf das HIV-Antigen waren. Sie waren klinisch gesund mit einer T&sub4;-Lymphozytenzahl von ≥400/ml. Die Spender erfüllten die Erfordernisse des Code of Federal Regulations [21 C.F.R. §§640.60-640.63 (1. April 1986)] als Plasmaquelle, mit der Ausnahme, dass sie in bezug auf HIV-Antikörper positiv waren. Die Spender wurden einer Plasmapherese gemäss den CFR-Erfordernissen unterworfen und das erstgewonnene Plasma wurde gefroren und bis zur Fraktionierung auf einer Temperatur von unter 0ºC gehalten [21 C.F.R. §640.65 (1. April 1986)]. Die Kriterien zur Auswahl dieser drei Spender waren: der Spender JD zeigte einen niedrigen Titer an anti-gp120, keine nachweisbaren Antikörper gegen p24 und einen mässigen Titer an gp41; der Spender MG zeigte einen hohen Titer an gp41 und gp120 und keinen nachweisbaren Titer an 10 anti-p24; und der Spender DE zeigte einen hohen Titer an p24 und gp120 und einen niedrigen Titer an gp41. Diese Spektra an HIV-Antikörpern werden in Tabelle 1 unten zusammengefasst. TABELLE 1 SPEKTRUM DER HIV-ANTIKÖRPER IM SPENDERPLASMA Immunoblot¹ Spender ¹Vom Auge quantifiziert S = stark, M = mässig, N = nicht nachweisbar
Von jedem Spender werden zwei Plasmaeinheiten vereinigt, um einen Ausgangsvorrat von etwa 1200 ml zu bilden. Die drei einzelnen Vorräte werden nach dem durch Cohn et al., J. Clin. Invest., 23, 417 (1944) beschriebenen Verfahren fraktioniert, deren Offenbarung hierin durch Referenz miteingeschlossen wird. Von der erhaltenen IgG-Paste "Fraktion II" wird der Rest des Ethanols durch Lyophilisieren entfernt, und es wird eine 5%-ige (Gewicht/Gewicht) IgG-Lösung aus dem Pulver durch Auflösen desselben in 0,9%-iger Kochsalzlösung hergestellt. Die Lösungen werden durch sterile Filter von 0,2 Mikron filtriert und vor ihrer Prüfung auf neutralisierende Wirkung unter sterilen Bedingungen gelagert. Es werden keine Konservierungsmittel oder Stabilisierungsmittel zugegeben. Die Vergleichsprobe (5% IgG) wurde aus dem von Spendern isolierten IgG hergestellt, welche sich für HIV als nicht reaktiv erwiesen hatten.

C. Bestimmung der neutralisierenden Wirkung

Die 5%-ige IgG-Lösungen wurden durch Hitze während 30 Minuten bei 56ºC inaktiviert, durch Filter von 0,45 Mikron filtriert, und es wurden davon Serienverdünnungen in Gewebekulturmedien hergestellt. [RPMI - 1640 mit 10%-igem fetalem Kalbsserum (FCS), mit Penicillin und Streptomycin ergänzt]. Von der verdünnten Probe wird 0,5 ml mit 0,5 ml HIV (100 infektiöse Einheiten/ml) vermischt und während zwei Stunden bei 37ºC mit 5%-igem CO&sub2; inkubiert. 0,5 ml werden verworfen und 4,0 ml H9-Zellen (5 x 10&sup5; Zellen/ml) werden zugegeben und die Kulturen bei 37ºC mit 5%-igem CO&sub2; inkubiert. Nach 5 bis 7 Tagen wird von der Kultur 0,45 ml entnommen, die Zellen werden durch Zugabe von 0,05 ml 5%-igem Triton X-100 aufgeschlossen. Die Zelllysate werden auf das HIV-Antigen während einer Zeitspanne von drei Wochen bei einem Zeitintervall von 5 bis 7 Tagen geprüft. Die Konzentrationen an HIV-Antigen wurden durch einen Immuntest auf fester Phase (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) bestimmt. Die Hemmung der HIV-Replikation (Neutralisation) wird durch Werte der optischen Dichte angegeben, welche unter jenen der Vergleichsproben liegen (normales menschliches Serum, das in bezug auf HIV- Antikörper negativ ist).
Als HIV-Neutralisationstiter wird die höchste Verdünnung genommen, welche einen Wert der optischen Dichte unterhalb jenes der Vergleichsprobe ergibt. Die Neutralisationstiter der 5%-igen IgG- Lösungen werden in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben. TABELLE 2 Neutralisationstiter IgG-Lösung Titer Vergleichs-IgG Negativ

D. Besprechung

Die in Tabelle 2 zusammengestellten Daten zeigen, dass nur die von dem Spender DE-2 abgeleitete IgG-Lösung eine messbare Menge von anti-p24-Antikörpern enthielt und dass nur diese Lösung den HIV in vitro zu neutralisieren vermochte. Es ist auch offensichtlich, dass Lösungen, welche einen hohen Gehalt an anti-gp41- und anti-gp120-Antikörpern, jedoch kein anti-p24 enthielten, keine oder nur eine schwache neutralisierende Wirkung hatten. Zusammen mit Daten des serologischen Spektrums, welche in Gegenwart von anti-p24-Antikörpern eine fehlende Antigenität des Blutes zeigen, führen diese Daten zur Annahme, dass die anti-Kern-Antikörper und nicht die anti-Hülle-Antikörper ausgezeichnete serologische Markierungsmittel zur Identifizierung von Spendern darstellen, welche neutralisierende Antikörper liefern können. Es wird angenommen, dass von symptomfreien Spendern abgeleitetes HIVIB, welches einen hohen Titer an anti-p24-Antikörpern aufweist, in vivo zur Unterdrückung des Fortschreitens der HIV-Infektion oder zur Behandlung von ARC- oder AIDS-Patienten wertvoll sein kann.
Die Erfindung ist mit Bezugnahme auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungs formen und Techniken beschrieben worden. Es soll jedoch verstanden werden, dass innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung viele Variationen und Modifikationen gemacht werden können.

Claims

1. Immunoglobulin (IgG), welches nach einem Verfahren hergestellt ist, welches umfaßt:

(a) Identifizierung eines menschlichen Spenders, der mit HIV infiziert ist, klinisch gesund ist und dessen Plasma:

(i) einen Anti-HIV p24-Antikörpertiter von wenigstens etwa 128 zeigt;

(ii) HIV p24 negativ beim Enzymimmunoassay ist;

(iii) HIV-Kultur-negativ ist; und

(iv) eine T&sub4;-Lymphocytenzahl von wenigstens etwa 400/ml Blut aufweist; und

(b) Isolierung einer Probe von Immunoglobulin aus dem Blut dieses Spenders, das einen HIV-Neutralisationstiter aufweist, der zur Neutralisation der Infektiosität von HIV effektiv ist.

2. Verfahren zur in vitro Neutralisation von HIV, umfassend:

Behandlung einer Menge von HIV mit einer Menge des IgG von Anspruch 1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, die zur Neutralisation der Infektiosität des HIV effektiv ist.

3. Zusammensetzung zur Neutralisation der Infektiosität von HIV, umfassend:

eine Menge von Immunoglobulin (IgG), die zur Neutralisation der Infektiosität von HIV effektiv ist, wobei dieses IgG aus Blutplasma erhalten wurde, das einen Anti-HIV p24-Antikörpertiter von wenigstens 128 und eine T&sub4;-Lymphocytenzahl von wenigstens 400/ml Blut aufweist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, welche für parenterale Applikation angepaßt ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, welche für intravenöse Applikation angepaßt ist.

6. Zur Neutralisation der Infektiosität von HIV effektives Immunoglobulin (IgG), wobei dieses IgG aus Blutplasma erhalten wurde, das einen Anti-HIV p24-Antikörpertiter von wenigstens 128 und eine T&sub4;-Lymphocytenzahl von wenigstens 400/ml Blut aufweist, zur Verwendung als therapeutisches Mittel.

7. Verwendung eines zur Neutralisation der Infektiosität von HIV effektiven Immunoglobulins (IgG), wobei dieses IgG aus Blutplasma erhalten wurde, das einen Anti-HIv p24-Antikörpertiter von wenigstens 128 und eine T&sub4;-Lymphocytenzahl von wenigstens 400/ml Blut aufweist, zur Herstellung einer Pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung von HIV-Infektion.