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DE3886655T2 - Verfahren zur Herstellung eines Oktapeptids. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Oktapeptids.

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DE3886655T2
DE3886655T2 DE88309306T DE3886655T DE3886655T2 DE 3886655 T2 DE3886655 T2 DE 3886655T2 DE 88309306 T DE88309306 T DE 88309306T DE 3886655 T DE3886655 T DE 3886655T DE 3886655 T2 DE3886655 T2 DE 3886655T2
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DE
Germany
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leu
obzl
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formula
compound
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DE88309306T
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DE3886655D1 (de
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Castiglione Roberto De
Romualdo Forino
Mauro Galantino
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Pfizer Italia SRL
Original Assignee
Carlo Erba SpA
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C07K7/065—Thymic humoral factor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Oktapeptids der Formel H-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-OH(A) und seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze. Das Peptid, das thymische humorale Wirksamkeit hat, wurde ursprünglich aus Kälberthymusdrüsen isoliert und dann durch Festphasen-Synthese dargestellt, wie es in der US- A-4 621 135 beschrieben ist.
  • Die vorliegende Synthese, die auf herkömmlichen Lösungsverfahren basiert, bietet den Vorteil einer leichten Vergrößerung des Maßstabs und besserer Endausbeuten an gereinigtem Zielprodukt. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung tritt keine Bildung eines Succinimidyl-Derivats auf, welches das cyclische Hauptnebenprodukt in der Festphasensynthese des Standes der Technik ist. Das Nebenprodukt wird durch eine interne Reaktion zwischen der β-Carboxylgruppe von Asp (selbst wenn sie geschützt ist) und der Aminogruppe von Gly gebildet. Die Reaktion läuft bei streng sauren oder streng basischen Bedingungen ab, wie sie zur Entfernung des Endpeptids vom festen Träger mit Fluorwasserstoff angewendet werden.
  • Das erfindungsgemäße Syntheseschema kann folgendermaßen dargestellt werden:
  • worin
  • X und W unabhängig voneinander Schutzgruppen für die Aminogruppe darstellen, K eine Hydroxy- oder Hydrazidogruppe darstellt, Q eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe oder eine Hydroxygruppe darstellt, unter der Voraussetzung, daß Q eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe sein muß, wenn K eine Hydroxygruppe ist, und Y und Y' jeweils unabhängig eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe darstellen.
  • Die Peptide (B) und (C) werden kondensiert, das resultierende Peptid (D) wird von den Schutzgruppen befreit und, wenn gewünscht, wird das resultierende Peptid (A) in ein pharmazeutisch akzeptables Salz überführt.
  • Die Peptide (B) und (C) und das resultierende Zwischenprodukt (D) können ihre Amino- und Carboxylgruppen, welche nicht in die Bildung der Peptidbindung involviert sind, durch geeignete Schutzgruppen blockiert haben. Diese Schutzgruppen können durch Azidolyse, Verseifung, Hydrogenolyse oder andere Verfahren, die den in der Peptidchemle bekannten Verfahren entsprechen, entfernt werden. Die folgenden Gruppen können zum Schutz der Amino-Funktionen verwendet werden: die Benzyloxycarbonyl-, t- Butyloxycarbonyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenyl- sulphenyl-, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-, 3,5-Dimethoxy-α, α'-Dimethylbenzyloxycarbonyl- und die Methylsulphonylethoxycarbonyl-Gruppe. Die folgenden Gruppen können zum Schutz der Carboxylfunktionen verwendet werden: Die Methyl-, Ethyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, 9-Fluorenylmethyl-, Phenyl-, 2,2,2-Trichlorethyl-Gruppe und substituierte Hydrazide.
  • Die Kondensation zwischen der Aminogruppe von Peptid (C) und der Carboxylgruppe von Peptid (B) unter Bildung des Zwischenproduktes (D) kann über ein aktiviertes Acylderivat wie z. B. ein gemischtes Anhydrid, ein Azid, einen aktivierten Ester, ein Imidazol- oder ein substituiertes Imidazolderivat erfolgen, oder aber durch direkte Kondensation zwischen der freien Aminogruppe und der Carboxylgruppe in Gegenwart eines kondensierenden Agenses wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid allein oder zusammen mit N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxybenzotriazol und 4- Dimethylaminopyridin. Das aktivierte Acylderivat kann "in situ" unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden, wobei von der Verbindung (B) in der K OH oder NHNH&sub2; ist, ausgegangen wird.
  • Die Kondensation kann in einem Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid, Pyridin, Acetonitril, Tetrahydrofuran, N-Methyl-2-pyrrolidon und Dimethylsulfoxid durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von -30ºC bis Umgebungstemperatur liegen. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 1 bis 120 Stunden. Typischerweise sind sowohl Y wie Y' die gleiche Schutzgruppe für die Carboxylgruppe, Q stellt eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe dar und K stellt eine Hydroxylgruppe dar.
  • Das Syntheseschema, die Schutzgruppen und die kondensierenden Agensien sind so gewählt, daß die Gefahr einer Racemisierung vermieden wird. Das so hergestellte Peptid (A) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon wird isoliert. Es kann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff oder einem Verdünnungsmittel formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung herzustellen.
  • Die Herstellung der Ausgangsmaterialien (B) und (C) können nach bekannten klassischen Lösungsverfahren hergestellt werden. Eine nützliche Verbindung der Formel (B) ist die Verbindung:
  • Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OH (VIII)
  • worin Z Benzyloxycarbonyl darstellt und Bzl Benzyl darstellt; sie kann durch Behandlung einer Verbindung der Formel (VII):
  • Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (VII)
  • worin Z und Bzl wie oben definiert sind und Tce 2,2,2-Trichlorethyl darstellt, mit Zinkpulver erhalten werden.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Rf-Werte wurden an vorbeschichteten Platten aus Silikagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck), Schichtdicke 0,25 mm, Länge 20 cm unter Verwendung der folgenden Entwicklungssysteme bestimmt:
  • System A: n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4/1/1 Volumenteile.
  • System B: Benzol/Ethylacetat/Essigsäure/Wasser = 10/10/2/1 in Volumenteilen (obere Phase).
  • System C: Benzol/Benzin (60-80)/Ethylacetat = 25/5/70 Volumenteile.
  • "Merck" ist ein Warenzeichen.
  • Dünnschichtchromatographische Analysen wurden bei einer Temperatur im Bereich von 18ºC bis 25ºC durchgeführt. Daher können die Rf-Werte um ± 5 % variieren.
  • Die Rt-Werte wurden durch HPLC-Analysen unter Anwendung der folgenden Systeme erhalten:
  • System 1 - Mobile Phase: A (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,3, Puffer, der 10 % (V/V) Acetonitril enthält); B (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,3, Puffer, der 60 % (V/V) Acetonitril enthält)
  • Säule: u BONDAPAK TMC&sub1;&sub8; (WATERS) 10 um (3,9 mm x 30 cm)
  • Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min
  • U.V.-Detektion: 210 nm
  • System 2 - Mobile Phase: A (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 10 % (V/V) Acetonitril enthält); B (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 70 % (V/V) Acetonitril enthält)
  • Säule: u BONDAPAK TMC&sub1;&sub8; (WATERS) 10 um (3,9 mm x 30 cm)
  • Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min
  • U.V.-Detektion: 210 nm
  • System 3 - Mobile Phase: A (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 10 % (V/V) Acetonitril enthält); B (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 70 % (V/V) Acetonitril enthält)
  • Säule: RP-18 5 um (4 mm x 25 cm) Lichrosorb (Merck)
  • Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min
  • U.V.-Detektion: 210 nm
  • System 4 - Mobile Phase: A (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 10 % (V/V) Acetonitril enthält); B (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,5, Puffer, der 70 % (V/V) Acetonitril enthält)
  • Säule: u BONDAPAK TMC&sub1;&sub8; (WATERS) 10 um (3,9 mm x 30 cm)
  • Durchflußgeschwindigkeit: 2,0 ml/min
  • U.V.-Detektion: 210 nm
  • System 5 - Mobile Phase: A (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,3, Puffer, der 10 % (V/V) Acetonitril enthält); B (0,02 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,3, Puffer, der 60 % (V/V) Acetonitril enthält)
  • Säule: u BONDAPAK TMC&sub1;&sub8; (WATERS) 10 um (3,9 mm x 30 cm)
  • Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
  • U.V.-Detektion: 210 nm
  • Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren mit einer Tottoli- Apparatur bestimmt und sind unkorrigiert. Die meisten Derivate erweichen und zersetzen sich vor dem Schmelzen. In dieser Beschreibung werden die Symbole und Abkürzungen verwendet, wie sie üblicher Weise in der Peptidchemie verwendet werden (siehe z. B. Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)).
  • Andere in den folgenden Beispielen verwendeten Symbole oder Abkürzungen sind: AcOH, Eisessig; AcOEt, Ethylacetat; Zers., Zersetzung; DCC, Dicyclohexylcarbodiimid; DCEU, Dicyclohexylurea; DMAP, 4-Dimethylaminopyridin; DMF, Dimethylformamid; ECC, Ethylchloroformat; Et&sub2;O, Diethylether; EtOH, Ethylalkohol 95 %ig; HOBt, 1-Hydroxybenzotriazol; i - Pr&sub2;O, Diisopropylether; i-PrOH, Isopropylalkohol; HPLC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie; MeOH, Methylalkohol; NMM, N-Methylmorpholin; Tce, 2,2,2-Trichlorethyl; THF, Tetrahydrofuran; TLC, Dünnschichtchromatographie.
    • BEISPIEL Herstellung von H-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-OH . 2HCl Stufe 1 - Boc-Gly-OTce (I)
  • Eine Lösung aus 3,85 g (22 mmol) Boc-Gly-OH und 3,16 ml (33 mmol) 2,2,2-Trichlorethanol in DMF wurden 18 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 1,3 g (11 mmol) DMAP und 4,95 g (25 mmol) DCC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann von DCEU abfiltriert und in Vakuum eingedampft.
  • Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel (Merck) 0,040 - 0,063 mm gereinigt, wobei mit CH&sub2;Cl&sub2; eluiert wurde. Es wurden 5,5 g (86 % Ausbeute) der Verbindung I als Öl erhalten: Rfc = 0,69.
    • Stufe 2 - HCl . H-Gly-OTce (II)
  • 35,0 g (114,2 mmol) Boc-Gly-OTce (I) wurden in 350 ml einer gesättigten Lösung von HCl in AcOH gelöst. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur war die Boc-Entfernung vollständig und das Lösungsmittel wurde in Vakuum bei 30ºC abgedampft. Aus AcOEt wurden 24,0 g (90 % Ausbeute) Verbindung II erhalten: Schmelzpunkt: 198-201ºC (Zers.); RfA = 0,70.
    • Stufe 3 - Boc-Asp (OBzl)-Gly-GTce (III)
  • Zu einer Lösung von 37,7 g (116,50 mmol) Boc-Asp(OBzl)-OH in 500 ml wasserfreiem THF wurden sukzessive 12,9 ml (116,50 mmol) NMM und 11,5 ml (116,50 mmol) ECC bei einer Temperatur von -12ºC zugesetzt. Nach 2- minütigem Rühren bei dieser Temperatur wurde ein kalte Lösung aus 28,3 g (116,50 mmol) HCl . H-Gly-OTce (II) und 12,9 ml (116,50 mmol) NMM in 100 ml DMF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -12ºC gerührt, dann wurden Salze abfiltriert und es wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in AcOEt gelöst und mehrere Male mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der rohe Rückstand wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; wieder gelöst und durch Säulenchromatographie an Silikagel (Merck) 0,040 - 0,063 mm gereinigt, wobei mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH 99:1 eluiert wurde. Nach Entfernung der Lösungsmittel wurden 51,1 g (86 % Ausbeute) der Verbindung III als ein Öl erhalten: RfB = 0,79; Rt&sub1; = 17,8 min (linearer Gradient von 80 bis 90 % B in 15', dann isokratisch 90 % B für 10').
    • Stufe 4 - HCl . H-Asp(OBzl)-Gly-OTce (IV)
  • Ausgehend von 45,5 g (88,90 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Gly-OTce (III) und bei gleicher Arbeitsweise wie in Stufe 2 wurde 39,2 g (98 % Ausbeute) der Verbindung IV als Schaum erhalten: RfA = 0,69.
    • Stufe 5 - Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (V)
  • Ausgehend von 29,5 g (87,47 mmol) Boc-Glu(OBzl)-OH und 39,2 g (87,47 mmol) HCl . H-Asp(OBzl)-Gly-OTce (IV) und nach der in Stufe 3 beschriebenen Arbeitsweise wurden 52,0 g (81 % Ausbeute) der Verbindung V als Öl erhalten: RfB = 0,71.
    • Stufe 6 - HCl . H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (VI)
  • Ausgehend von 33,3 g (45,5 mmol) Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (V) und nach der in Stufe 2 beschriebenen Arbeitsweise wurden 29,5 g (98 % Ausbeute) der Verbindung VI als Öl erhalten: RfA = 0,79.
    • Stufe 7 - Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (VII)
  • Zu einer Lösung von 12,0 g (45,14 mmol) Z-Leu-OH in 100 ml wasserfreiem THF, wurden der Reihe nach 5,0 ml NMM (45,14 mmol) und 4,5 ml (45,14 mmol) ECC bei einer Temperatur von -12ºC gegeben.
  • Nach 2-minütigem Rühren bei dieser Temperatur wurde eine kalte Lösung von 30,1 g (45,14 mmol) H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce . HCl (VI) und 5,01 ml (45,14 mmol) NMM in 80 ml DMF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -12ºC gerührt, dann durch Filtration von Salzen befreit und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in AcOEt gelöst und mehrere Male der Reihe nach mit NaCl-gesättigten Lösungen von 0,5 M Citronensäure, 0,5 M NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es wurden 36,7 g (92 % Ausbeute) der Verbindung VII aus AcOEt/i-Pr&sub2;O erhalten: Schmelzpunkt = 109 (Erweichung) -112ºC (Zers.); [α]20D = -16,8º (C 1, DMF), RfB = 0,69; Rt&sub3; = 26,5 min (linearer Gradient von 70 bis 90 % B in 20', dann isokratisch 90 % B für 10').
    • Stufe 8 - Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OH (VIII)
  • Eine Lösung von 31,6 g (36,0 mmol) Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (VII) in 500 ml AcOH und 215 ml Wasser wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten mit 31,6 g Zinkpulver zur Reaktion gebracht, das mit 0,1 N HCl, Aceton und Et&sub2;O gewaschen worden war. Nach Filtration des Reaktionsgemisches mit einer Superzelle mit hohem Durchfluß wurde das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in AcOEt gelöst und mehrere Male der Reihe nach mit NaCl-gesättigten Lösungen von 0,5 M Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Es wurden 25,8 g (96 % Ausbeute) der Verbindung VII aus AcOEt/i-Pr&sub2;O erhalten: Schmelzpunkt = 158 - 164ºC (Zers.); [α]20D = -19,8º (C 1, DMF); RfB = 0,46; Rt&sub2; = 10,9 min (linearer Gradient von 70 bis 90 % B in 20').
    • Stufe 9 - p-Tos-OH . H-Leu-OBzl (IX)
  • Zu einer Suspension von 13,12 g (100 mmol) H-Leu-OH in 105 ml Benzylalkohol und 200 ml wasserfreiem Chloroform wurden 38,0 g (200 mmol) p-Tos-OH . H&sub2;O gegeben; das Gemisch wurde 25 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das produzierte Wasser (5,4 ml) wurde unter Verwendung eines Separator nach Dean und Stark, der zur Verwendung bei Lösungsmitteln, die dichter als Wasser sind, bestimmt ist, gesammelt. Zerreiben mit 500 ml Et&sub2;O nach dem Abkühlen und Verdampfen des Chloroforms ergab 37,46 g (95 % Ausbeute) der Verbindung IX: Schmelzpunkt: 124 - 126ºC; [α]20D = -3,0º (C=1, MeOH); RfA = 0,65; Rt&sub2; = 16,7 min (linearer Gradient von 10 bis 60 % B in 20').
    • Stufe 10 - Boc-Phe-Leu-OBzl (x)
  • Zu einer Lösung von 41,25 g (156,5 mmol) Boc-Phe-OH in 240 ml wasserfreiem THF, wurden 17,36 ml (156,5 mmol) NMM und 15,36 ml (156,5 mmol) ECC nacheinander bei einer Temperatur von -12ºC zugegeben. Nach 2-minütigem Rühren bei dieser Temperatur wurde eine kalte Lösung von 61,52 g (156,5 mmol) p-Tos-OH . H-Leu-OBzl (IX) und 17,36 ml (156,5 mmol) NMM in 480 ml DMF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -12ºC gerührt, dann durch Filtration von Salzen befreit und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in AcOEt gelöst und mehrere Male mit NaCl-gesättigten Lösungen von 0,5 M Citronensäure, 0,5 M NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es wurden 69 g (94,1 % Ausbeute) der Verbindung X aus AcOEt/leichtes Petroleum erhalten: Schmelzpunkt: 84 - 87ºC; [α]20D = -22º (C 1, MeOH); RfB = 0,70; Pt&sub5; = 11,0 min (isokratisch 90 % B für 15').
    • Stufe 11 - HCl . H-Phe-Leu-OBzl (XI)
  • 32,0 g (68,3 mmol) Boc-Phe-Leu-OBzl (x) wurden in 320 ml einer gesättigten Lösung von HCl in AcOH gelöst. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur war die Boc-Entfernung vollständig, das Lösungsmittel wurde dann bei 30ºC im Vakuum verdampft. Es wurden 26,0 g (94 % Ausbeute) der Verbindung XI aus AcOEt erhalten: Schmelzpunkt: 158 - 160ºC; [α]20D = -17,5º (C 1, MeOH); RfA = 0,72; Rt&sub3; = 13,8 min (linearer Gradient von 60 bis 90 % B in 20').
    • Stufe 12 - Boc-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XII)
  • Ausgehend von 24,37 g (64,1 mmcl) HCl . H-Phe-Leu-OBzl (XI) und nach der in Stufe 10 beschriebenen Arbeitsweise wurden 42,01 g (89,7 % Ausbeute) der Verbindung XII aus AcOEt/Et&sub2;O erhalten: Schmelzpunkt: 120 - 123ºC; [α]20D = -28,8º (C 1, MeOH); RfB = 0,62; Rt&sub3; = 21,0 min (isokratisch 90 % B für 30')
    • Stufe 13 - HCl . H-Lys(z)-Phe-Leu-OBzl (XIII)
  • Ausgehend von 41,96 g (57,4 mmol) Boc-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XII) und nach der in Stufe 11 beschriebenen Arbeitsweise wurden 36,82 g (96,1 % Ausbeute) der Verbindung XIII aus MeOH/AcOEt erhalten: Schmelzpunkt: 187 - 191ºC; [α]20D = -6,3º (C 1, MeOH); RfA= 0,61; Rt&sub3; = 11,0 min (isokratisch 90 % B für 20').
    • Stufe 14 - Boc-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XIV)
  • Ausgehend von 1,08 g (5 mmol) Boc-Pro-OH und 3,34 g (5 mmol) HCl . H-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XIII) und nach der in Stufe 10 beschriebenen Arbeitsweise wurden 3,75 g (90 % Ausbeute) der Verbindung XIV aus AcOEt/i-Pr&sub2;O erhalten: Schmelzpunkt: 124 - 8ºC; [α]20D = -47,9º (C 1, MeOH); RfB = 0,64; Rt&sub2;= 19,4 min (linearer Gradient von 80 bis 90 % B in 20', isokratisch 90 % für 5').
    • Stufe 15 - HCl . H-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XV)
  • Ausgehend von 3,75 g (4,5 mmol) Boc-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XIV) und nach der Arbeitsweise von Stufe 2 wurden 3,2 g (91 % Ausbeute) der Verbindung XV aus MeOH/AcOEt erhalten: Schmelzpunkt: 100 - 103ºC; [α]20D= -33,8º (C 1, MeOH); RfA = 0,58; Rt&sub2; 7,5 min (linearer Gradient von 80 bis 90 % B in 20').
    • Stufe 16 - Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XVI)
  • Eine Lösung von 26,6 g (35,6 mmol) Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OH (VIII) und 27,2 g (35,6 mmol) HCl . H-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XV) in 150 ml DMF wurden für 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 8,2 g (39,2 mmol) DCC, 5,3 g (39,2 mmol) wasserfreiem HOBt, 4,0 ml (35,6 mmol) NMM und 0,45 g (3,56 mmol) DMAP reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde dann von DCEU abfiltriert und auf ein kleines Volumen konzentriert. Das Produkt wurde durch tropfenweise Zugabe einer kalten Citronensäurelösung ausgefällt. Es wurden 39,5 g (77 % Ausbeute) der Verbindung XVI aus DMF/MeOH erhalten: Schmelzpunkt: 179 - 82ºC (Zers.); [α]20D = -35,5º (C 1, DMF); RfB = 0,50; Rt&sub4; = 16,1 min (isokratisch 100 % B für 20').
    • Stufe 17 - H-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-OH (XVII)
  • Eine Lösung von 31,5 g (21,6 mmol) Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-Pro-Lys(Z)-Phe-Leu-OBzl (XVI) in 330 ml AcOH und 330 ml MeOH wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 25,8 g 10 %-igem Palladium auf Kohle, 13,3 ml Ameisensäure und 38,3 ml NMM umgesetzt. Nach Filtration des Reaktionsgemisches mit einer Superzelle mit hohem Durchsatz, wurde das Lösungsmittel verdampft; es wurden 19,6 g (98 % Ausbeute) der Verbindung XVII) aus EtOH/AcOEt erhalten: Schmelzpunkt: 206 - 210ºC (Zers.); [α]20D = -44,7º (C 1, AcOH); Rt&sub2; = 12,0 min (linearer Gradient von 10 bis 60 % B in 20').
    • Stufe 18 - H-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-OH . 2HCl (XVIII)
  • 19,5 g (21,4 mmol) der Verbindung XVII wurden mit 58,5 ml 1 N HCl gelöst, und die Lösung zum Rückstand eingeengt. 20,6 g (97,2 % Ausbeute) der Verbindung XVIII wurden aus AcOH/Et&sub2;O erhalten: Schmelzpunkt: 108ºC (Erweichung) -160ºC (Zers.); [α]20D = -57,6º (C 0,5, MeOH); Rt&sub2; = 12,0 min (linearer Gradient von 10 bis 60 % B in 20')

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (A)
H-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-OH (A)
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
- Kondensieren einer Verbindung der Formel (B)
in der X eine Schutzgruppe für die Aminogruppe ist, Y und Y' jeweils unabhängig voneinander eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe darstellen, und K eine Hydroxy- oder Hydrazidogruppe ist, mit einer Verbindung der Formel (C)
in der W eine Schutzgruppe für die Aminogruppe ist, und Q eine Schutzgruppe oder eine Hydroxygruppe darstellt, unter der Voraussetzung, daß Q eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe sein muß, wenn K eine Hydroxygruppe ist;
- Entfernen der Schutzgruppen aus der resultierenden Verbindung der Formel (D)
in der X, Y, Y', W und Q wie oben definiert sind; und, wenn gewünscht,
- Überführen des resultierenden Peptids der Formel (A) in ein pharmazeutisch akzeptables Salz des genannten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gruppen Y und Y' beide die gleichen Schutzgruppe für die Carboxylgruppe sind, Q eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe darstellt und K eine Hydroxygruppe darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Verbindung der Formel (B) die Verbindung
Z-Leu-Glu (OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OH (VIII)
ist, worin Z für Benzyloxycarbonyl steht, und Bzl für Benzyl steht, welche durch Behandlung einer Verbindung der Formel (VII) :
Z-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OTce (VII)
worin Z und Bzl wie oben definiert sind, und Tce 2,2,2-Trichlorethyl darstellt, mit Zinkpulver erhalten wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das außerdem die Formulierung des auf diese Weise hergestellten Peptids der Formel (A) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
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