DE2649727A1

DE2649727A1 - Traegergebundene peptide, pth- peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellung

Info

Publication number: DE2649727A1
Application number: DE19762649727
Authority: DE
Inventors: Robert L Colescott
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1975-10-31
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1977-05-05
Also published as: GB1567030A; FR2329645B1; GB1567029A; FR2329645A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere auf trägergebundene Peptide, die zur Herstellung biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt dabei sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch ihre Herstellungsverfahren.

Seit langem werden bestimmte natürliche biologisch aktive Substanzen aus dem Material tierischer Drüsen gewonnen, die zur Behandlung von Krankheiten und Mangelerscheinungen in der Humanmedizin Verwendung finden. Eine derartige Substanz ist das Nebenschilddrüsenhormon, üblicherweise kurz als PTH bezeichnet, das lange Zeit aus

542-(case 5972)-FSBk

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tierischen Nebenschilddrüsen, insbesondere von Schweinen und Rindern, gewonnen wurde.

Die große Mühe, die mit der Gewinnung der relativ kleinen Nebenschilddrüsen von Tieren unmittelbar nach dem Schlachten verbunden ist, die nur begrenzte Menge derart gewonnener Drüsen sowie das aufwendige Reinigungsverfahren, das zur Herstellung in der Humanmedizin verwendbarer Peptide erforderlich ist, stellen außerordentlich große Nachteile bei der Herstellung natürlicher Peptidhormone aus tierischen Drüsen dar. Obgleich infolgedessen auf diesem Gebiet ein außerordentliches Interesse an der Entwicklung praktischer Methoden sowie neuer Verbindungen besteht, die eine kommerzielle Synthese von Peptiden wie etwa, des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons (HPTH) ermöglichen, wurde nach Wissen der Erfinder bisher kein verfahrensmäßiger oder stofflicher Zugang zur Lösung dieses Problems gefunden.

Für das menschliche Nebenschild'drüsenhormon (HPTH) wurde eine Sequenz von 84 Aminosäuren ermittelt, deren aminoterminale Sequenz \-~5K folgende Struktur aufweist:

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Die Abkürzungen Phe,Asn, His etc. stehen dabei für die verschiedenen Aminosäuregruppierungen in der Peptidkette; die Zahlen stellen die Positionen der Aminosäuregruppe in der Kette entsprechend der üblichen Nomenklatur dar (vgl. Niall et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (1974)

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384-83). Das obengenannte Fragment hat offensichtlich im Vergleich mit dem Gesamtmolekül die volle biologische Aktivität.

Zur Synthese gewisser Peptide mit relativ kurzer Aminosäurekettenlänge sind einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen worden; hierzu sind zu nennen: R.B. Merrifield: "Solid Phase Peptide Synthesis. I. "The Synthesis of a Tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc. Vol. 85 (I963), 2149 - 54; J.V/. Stewart und J.D. Young: "Solid Phase Peptide Synthesis", V/.H. Freeman Company, San Francisco, California. In diesen Publikationen finden sich jedoch keinerlei Angaben über trägergebundene Peptide mit Aminosäuren der erfindungsgemäßen Art und Sequenz.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, intermediäre trägergebundene Peptide anzugeben, aus denen biologisch aktive Peptide abgeleitet werden können, insbesondere Peptide mit der Aktivität des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons, sowie ein Verfahren für die kommerzielle Herstellung derartiger Peptide. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Synthese in bzw. an fester Phase gelöst, wobei zunächst ein unlösliches Polystyrolharz, das durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhalten ist, chlormethyliert wird, worauf an das Harz zunächst Phenylalanin, dann Asparagin sowie die anderen Aminosäuren der Kette in vorgegebener Sequenz unter Verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden. Nach dem Ankuppeln der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Harz abgespalten und die verbliebenen Schutzgruppen entfernt.

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26X9727

Alle eingesetzten Aminosäuren sind dabei, wenn nichts anderes angegeben, die natürlich vorkommenden L-Isomeren.

Die Erfindung gibt also trägergebundene Peptide an, die sich insbesondere zur Herstellung von Peptiden mit biologischer Aktivität eignen, insbesondere trägergebundene Peptide mit (jy-CHp-O-Phe-Asn an einem Ende der Aminosäurekette, wobei (S) das Harz und Phe und Asn die Aminosäuren Phenylalanin und Asparagin bedeuten, ferner Verfahren zur Herstellung dieser trägergebundenen Peptide.

Die Aminosäureketten der erfindungsgemäßen Peptidharze sind dabei identisch mit den Aminosäureketten natürlicher Peptide mit biologischer Aktivität. Es werden ferner auch andere Peptide mit Aminosäureketten angegeben, deren Aminosäuren hinsichtlich Art und Sequenz von den Aminosäureketten natürlicher biologisch aktiver Peptide verschieden sind, von denen jedoch Peptide mit biologischer Aktivität abgeleitet werden können, ferner entsprechende Zwischenprodukte.

Die Totalsynthese der erfindungsgemäßen Peptide natürlicher oder modifizierter Sequenz umfaßt zahlreiche Reaktionen, bei denen ebenfalls zahlreiche neue Peptid-Zwischenstufen gebildet werden, die im folgenden hinsichtlich ihrer Strukturformel Schritt für Schritt anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.

Herstellung eines unlöslichen Harzes

Das mit dem Symbol (r) abgekürzte unlösliche Harz ist ein Polymermaterial, das in den bei der Peptidsynthe-

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se verwendeten Lösungsmitteln unlöslich, jedoch von ihnen solvatisierbar und penetrierbar ist und als aktive Rezeptorphase für die erste Aminosäure, im vorliegenden Fall Phenylalanin, dienen kann.

Praktisch bevorzugt ist die Verwendung eines unlöslichen Polystyrolharzes, das durch katalytisch^ Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhältlich ist. Das wie angegeben ausgewählte Harz wird mit Chlormethy]-methy äther und Zinntetrachlorid als Katalysator nach folgender Reaktionsgleichung chlormethyliert:

(T) + Cl-CH₂OCH₃ (T) -CH₂-Cl + CH₃OH,

Die Reaktion-wird im einzelnen durch das folgende Beispiel erläutert.

Beispiel 1

1 kg eines zu 2 % mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,055 - 0,075 mm (200 - 400 mesh) Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde anschließend durch Suspendieren, 10 minütiges Rühren und Filtrieren durch eine Glasfritte unter Verwendung von jeweils 2 1 folgender Lösungsmittel gewaschen: mit 2 Teilen Tetrahydrofuran, mit 2 Teilen Wasser, mit 1 Teil IN NaOH, mit 2 Teilen Wasser, mit 2 Teilen Dimethylformamid (DMF), mit 2 Teilen Dioxan sowie mit 3 Teilen Methanol. Das gewaschene Harz wurde anschließend im Vakuum bei 60 ⁰C getrocknet.

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JH

500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 Chlormethyl-methyläther bei Raumtemperatur gerührt] die Temperatur wurde anschließend in einem Eis-Wasser-Bad auf 0 - 5 ⁰C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g wasserfreies Zinnchlorid in 925 ml eiskaltem Chlormethylm3thyläther zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt. Das Harz wurde durch eine Glasfritte abfiltriert und mit jeweils 2 1 der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2-NHC1 in Dioxan, V/asser sowie zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde bei 45 - 50 ⁰C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 - 1,0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent).

Phenylalanin-Veresterung an das Polystyrolharz

Zunächst wird Phenylalanin an das Polystyrolharz gebunden. Die Reaktion geschieht nach folgender Gleichung:

0-,

+ HOOC-C-CH₂

NH

BA

0 H

f R J-CH₂-O-C-C-CH₂-NH

BA-HCl

Kupplungsreaktion 1

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Jß

in der Formel bedeuten:

(R) das Polystyrolharz,
BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin, Dlisopropyläthylamin oder ein Alkalimetallsalz

sowie

P eine Aminoschutzgruppe wie etwa Amyloxycarbonyl (AMOC), o-Nitrophenylsulfenyl (NPS) oder vorzugsweise t-Butyloxycarbonyl (BOC).

Wie aus der obigen Formel hervorgeht, wird das t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin in Gegenwart eines Säureakzeptors mit dem chlormethylierten Harz verknüpft.

Die Reaktion geht aus dem folgenden Ausführungsbeispiel 2 hervor.

Beispiel 2

50 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von 0,74 mäq/g (yj mäq Chlor) wurden mit 19,6 g BOC-L-Phenylalanin (74 mäq) in 150 ml absolutem Äthanol gerührt, worauf anschließend 9,77 ml Triäthylamin (72 mäq) zugesetzt wurden; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert und auf der Fritte mit 500-ml-Teilen folgender Lösungsmittel ge-

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JN

waschen: zweimal mit denaturiertem Alkohol (mit 5 % Methanol denaturierter Alkohol), zweimal mit Dioxan, zweimal mit denaturiertem Alkohol, zweimal mit Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das Harz wurde anschließend bei KO - 45 ⁰C im Vakuum getrocknet. Die Stickstoffanalyse ergab Werte zwischen etwa 0,50 - 0,70 mäq/g. Nach der (im folgenden beschriebenen) Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa 0,38 mäq/g bestimmt.

Abspaltung der Schutzgruppe

OHH

Θ « I I

-CH₂-O-C-C-N-P

CH„

1. Säure

2. Base

0 H

-CH₂-O-C-C-NH₂

Das resultierende Peptidharz wird als Verbindung 1 bezeichnet.

Die Abspaltung der Schutzgruppe von der Aminofunktion des Phenylalanins geschieht durch Verwendung einer geeigneten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Aminsalz wird anschließend durch Behandeln mit einer starken organischen Base neutralisiert. Ein Ausführungsbeispiel für dieses Verfahren gibt das folgende Bei-

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spiel 5.

Beispiel 3

6 g des BOC-Phenylalaninharzes nach Beispiel 2 wurden in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die Probe wurde zweimal mit je 40 ml Methylen chlorid jeweils 2 min gewaschen. Darauf wurden 40 ml 50 ^i Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugegeben und das Ge. misch 30 min zur Reaktion gebracht. Nach Filtration wurde das Harz dreimal mit je 40 ml Methylenchlorid, zweimal mit je 40 ml Methanol und dreimal mit je 40 ml Chloroform jeweils 2 min gewaschen. Anschließend wurde mit 40 ml einer 10 ^igen Lösung von Diisopropylamin in Chloroform 5 min neutralisiert. Das Harz wurde darauf dreimal mit 40 ml Chloroform und dreimal mit 40 ml Methylenchlorid gewaschen.

Kupplung

0 H

R ]-CHo-O-C-C-NH₉ + AOOC-C-CHo-C-NH I Ii

0 0

OH H Il H H -CH₉-O-C-C-N-C-C-N-P + ι ι

CH-,

NH

I
P

oder

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a-θ-- JKo

26AS727

Θ|Ι η η υ

-CH₀-O-C-C-NH₀ + HOOC-C-CH₀-C-NH 2 ι 2 I I

P'

CHr

NH

O O

( H Il H H

Θ ( η Ii η η

-CH₉-0-C-C-N-C-C-N-P ¹ I I

In der Formel bedeuten:

P eine Aminoschutzgruppe wie oben beschrieben,

A einen aktiven Ester wie p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder Pentachlorphenyl,

P' eine Amid-Schutzgruppe wie Benzhydryl, Xanthydryl ο.dgl. und

CA ein Kupplungsagens, das Peptidbindungen zu bilden vermag, wie etwa Diimide, Azide, gemischte Anhydride und vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).

Die genannten Symbole (r) , P, P', A und CA haben im folgenden einschließlich der Ansprüche die zuvor definierte Bedeutung.

Da Formelangaben wie die obige zuviel Platz beanspruchen, werden die Reaktionsprodukte nachfolgend in der entsprechenden abgekürzten Schreibweise dargestellt:

[R) -CHg-O-Phe-Asn-P

P¹

in der Phe Phenylalanin- und Asn Asparaginreste bedeuten und(R)₅P¹ und P die obige Bedeutung besitzen.

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-HT-

Diese vereinfachte Nomenklatur wird im folgenden bei allen Reaktionen verwendet.

Die Abspaltung der Schutzgruppe führt, wie im Zusammenhang mit dem Phenylalaninharz erläutert, zu einem Produkt folgender Struktur:

(r) -CEL-O-Phe-Asn-NHo (Verbindung 2). V_y 2 ,2

P'

Nach Wissen der Erfinder handelt es sich hierbei um die erstmalige Herstellung dieses Peptidharzes, was einen bedeutenden Schritt bei der Hormonsynthese von HPTH bzw. dem HPTH-Fragment darstellt.

Von den Erfindern wurde ferner die bedeutsame Fest stellung gemacht, daß die Vollständigkeit der Kupplungs reaktion durch Ninhydrin-Test geprüft werden kann (vgl. E. Kaiser, R. Colescott, CD. Bossinger und P. Cook, Anal. Biochem. 54 (1970) 595-98). Wenn die Ninhydrinreaktion negativ ist, kann die Schutzgruppe vom Harz abgespalten und zur folgenden Kupplungsreaktion übergegangen werden. Bei positivem Ausfall der Ninhydrinreaktion wird der Kupplungsschritt wiederholt, bis die Ninhydrinreaktion schließlich negativ ist.

Die folgenden Ausführungsbeispiele beziehen sich auf die Kupplung von Asparagin.

Beispiel

Zu dem von Schutzgruppen befreiten Phenylalaninharz 709818/1082

λ*

nach Beispiel 3 mit 3,5 mäq Aminogruppen wurde eine Lösung von 7 mmol (etwa 100 % Überschuß) BOC-L-ß-Benzhydrylasparagin in 40 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach 2 min wurde eine Lösung von 7 ^mäq Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und das Gemisch 45 min gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert und zweimal mit jeweils 40 ml Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. Die Ninhydrin-Reaktion wurde an einer 3-5 mg-Probe des Peptidharz-Reaktionsprodukts vorgenommen und ergab sich als negativ. Anschließend wurden die Schutzgruppen nach Beispiel 3 abgespalten.

Beispiel 5

2 g Phenylalaninharz wurden von den Schutzgruppen befreit und wie oben beschrieben neutralisiert. Anschließend wurden 3 mmol NPS-L-ß-Benzhydrylasparagin, die in 25 ml Methylenchlorid gelöst waren, sowie 2 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h gerührt, filtriert und mit 2 Teilen Methylenchlorid, 2 Teilen Methanol und 3 Teilen Methylenchlorid gewaschen.

Beispiel 6

Anstelle des NPS-Derivats in Beispiel 5 kann das AMOC-Derivat unter Verwendung der gleichen Äquivalentmengen eingesetzt werden, wobei die gleichen Ergebnisse erzielt werden.

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Peptidsynthese

In der folgenden Tabelle 1 sind die entsprechend aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 2-34 unter Bezeichnung der jeweiligen Verknüpfungsposition in der Kette unter Nennung des in jedem Schritt ansynthetisierten Aminosäurereaktanten sowie der bevorzugten Schutzgruppen aufgeführt.

Tabelle 1

Reaktion Position ansynthetisierte Nr. Nr. Aminosäure Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe

2	33	. Asparagin
3	32	Histidin
4	31	Valin
5	30	Asparagins äure
6	29	Glutamin
7	28	Leucin
8	27	Lysin

10

11

26

25
24

Lysin

Arginin

Leucin BOC-L-ß-Benzhydrylasparagin

BOC-L-im-Carbobenzyloxy-L-histidin

BOC-L-VaIin

BOC-L-ß-Benzylaspartat

BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

BOC-L-Leucin

BOC-E-2-Chlorcarbobenzyloxy-L-lysin in 10 $ DMF zur Löslichkeit

BOC- ε-2-Chlorcarbobenzyloxy-L-lysin in 10 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-Tosylarginin in 20 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-Leucin

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13

34- -

ίο

(Tabelle I₁ Fortsetzung)

12	23	Tryptophan
13	22	Glutaminsäure
14	21	Valin
15	20	Arginin
16	19	Glutamins äure
17	18	Methionin
18	17	Serin
19	16	Asparagin
20	15	Leucin
21	14	Histidin

Lysin

BOC-L-Tryptophan in 10 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-^-Benzylglutaminat BOC-L-Valin

BOC-L-Tosylarginin in 20 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L- 7-Benzylglutamat BOC-L-Methionin BOC-0-Benzyl-L-serin BOC-L-ß-Benzhydrylasparagin BOC-L-Leucin

BOC-im-Carbobenzyloxy-L-histidin

BOC- £ - Chlorcarbobenzyloxy-L-lysin in 10 ^ DMF zur Löslichkeit

23	12	Glycin	BOC-Glycin
24	11	Leucin	BOC-L-Leucin
25	10	Asparagin	BOC-L-ß-Benzhydrylasparagin
26	9	Histidin	BOC-im-Carbobenzyloxy-L- histidin
27	8	Methionin	BOC-L-Methionin
28	7	Leucin	BOC-L-Leucin
29	6	Glutamin	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenyl ester
30	5	Isoleucin	BOC-L-Isoleucin
31	4	Glutaminsäure	BOC-L-7-Benzylglutamat
32	3	Serin	BOC-0-Benzyl-L-serin
33	2	Valin	BOC-L-Valin
34	1	Serin	BOC-0-Benzyl-L-serin

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Jeder folgende Reaktionsschritt der Verknüpfung einer weiteren Aminosäuregruppe verläuft dabei in gleicher Weise wie in Zusammenhang mit der Verknüpfung von Asparagin in Reaktion 2 (vgl. Beispiel 4) beschrieben, indem das jeweils zuvor erhaltene Peptidharz mit der folgenden Aminosäure in geschütztem Zustand gekuppelt, die Schutzgruppe vom neu angekuppelten Peptid abgespalten und neutralisiert wird. Im einzelnen werden dabei jeweils folgende Reaktionsschritte vorgenommen:

Kupplung:

7 mmol der jexveiligen BOC-Aminosäure (0,43 Äquivalent Überschuß in 40 ml Methylenchlorid oder DMF-Gemisch, falls erforderlich)_;

7 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (Kupplungsagens) in 15 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 45 min_; zweimaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min und

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min;

Abspaltung der Schutzgruppe:

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min _?

50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, 5 min, 40 ml (nach Reaktion Nr. 12 wird 1 <fo 2-Mercaptoäthanol oder Ä'thandithiol zu der 50 $igen Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugesetzt)_?

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Wl

(Fortsetzung:)

dreimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methanol, jeweils 2 min _} und

dreimaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min ;

Neutralisation:

zweimal je 40 ml 10 % Diisopropylamin in Chloroform, jeweils 5 min und

viermaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen sowie der Neutralisation bei den Reaktionen 3 - 3^ entsprechen dabei den bei Reaktion 2 beschriebenen mit Ausnahme folgender Abweichungen:

Wie bereits angegeben weist die aus Reaktion Nr. 2 herrührende Verbindung 2 nach Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation folgende Struktur auf:

(r) -CH₀-O-PtIe-ASn-NH₀;

W d , d .

P¹
nach Reaktion 3 liegt Verbindung 3 vor:

-CH₀O-PhC-ASn-HiS-NH₀; 2 , , «d

P' W

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nach. Reaktion 4 liegt Verbindung 4 vor:

-CH₀-O-Phe-Asn-HiS-VaI-NH₀; d Il ²

P' W
nach Reaktion 5 liegt Verbindung 5 vor:

R) -CH₀-O-Phe-Asn-His-Val-Asp-NHo Il I P¹ W Bz

In Reaktion 3_a wo in Position 32 Histidin angekuppelt wird, wird zum Schutz der Itnidazolgruppe vorzugsweise Carbobenzyloxy (CBZ) verwendet, jedoch kann hierfür in gleicher Weise auch Tosyl oder Dinitrophenyl (DNP) als Schutzgruppe eingesetzt werden. Die Abkürzung W bezeichnet dabei CBZ, Tosyl oder DNP.

In Reaktion 5* wo in Position 30 Asparaginsäure angekuppelt wird, wird als Schutzgruppe vorzugsweise Benzyl oder ein Benzylderivat eingesetzt. Unter der Abkürzung Bz wird entsprechend Benzyl oder ein Benzylderivat verstanden.

Unter Benzylderivaten im hier verblendeten Sinne werden Derivate der Benzylgruppe wie etwa halogeniertes Benzyl, alkyliertes Benzyl oder alkoxyliertes Benzyl ο.dgl. verstanden. Derartige Derivate sind in der Peptidchemie üblich, weshalb sich eine nähere Erläuterung erübrigt.

Bei der Synthese wird in der angegebenen Weise bis zur Verknüpfung von GIn in Position 29 verfahren. In dieser

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Position kann DCC als Kupplungsagens nur dann verwendet werden, wenn das Glutamin über eine geeignete Schutzgruppe wie etwa Benzhydryl oder Xanthydryl verfügt; dabei können die genannten Gruppen entweder daran gebunden sein oder Schutzkatalysatoren den entsprechenden Lösungen zugesetzt sein. Ohne einen derartigen Schutz verursacht DCC eine Nebenreaktion, die einen Teil des Glutamins verbraucht. Alternativ dazu kann Glutamin in ungeschützter Form als aktiver Ester angekuppelt werden.

Das von Schutzgruppen befreite trägergebundene Peptid ''im folgenden kurz als Peptidharz bezeichnet) wird mit einem aktiven Ester des Glutamins wie etwa dem p-Nitrophenylester, dem o-Nitrophenylester oder dem Pentachlorphenylester bewegt bzw. gerührt.

Der entsprechende Kupplungsschritt wird im folgenden Beispiel 7 näher erläutert.

Beispiel 7

Das der Verbindung 5 nach Reaktion 5 entsprechende

Peptidharz (nach Abspalten der Schutzgruppe und Neutralise
sation) wurde dreimal mit/40 ml Dimethylformamid jeweils

2 min gewaschen. 12 mmol in 40 ml Dimethylformamid gelöster BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester wurden 20 h mit dem Harz geschüttelt und anschließend mit 3 Teilen Dimethylformamid,

3 Teilen Methanol und 3 Teilen Methylenchlorid gewaschen. Das Glutamin in Position 6, Reaktion 29, wird in gleicher Weise angekuppelt.

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An die Kupplung in Position 16 schließt sich die übliche Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation an; dabei resultiert ein Peptidharz (Verbindung I9) folgender Struktur:

i -O-Phe-Asn-His-Val-Asp-Glti-Leu-Lys-Lys-Arg-Leu-Trp-Glu-Val-Arg-Glu-

²II Il III ' ' ]

j.· i Bz P¹ VVT B₂ T B₂

-Met-Ser-Asn-NH2

B₂ P¹

(Verbindung 19).

Bei der Verknüpfung von Lysin in Reaktion Nr. 8, Position 27, wird als B-Amino-Schutzgruppe vorzugsweise 2-Chlorcarbobenzyloxy (Cl-CBZ) verwendet, jedoch sind in gleicher Weise auch 2-Bromcarbobenzyloxy oder 2.Λ-Dichlorcarbobenzyloxy verwendbar.

Die Bezeichnung V wird zur Kennzeichnung verx^endet, daß die E-Amino-Schutzgruppe aus einer der obengenannten Gruppen besteht.

Zur Kupplung der Aminosäure Arginin in Reaktion Nr. bzw. Position 25 wird als Schutzgruppe zum Schutz der Guanidino-Punktion vorzugsweise die Tosylgruppe (p-Toluolsulfonylgruppe) verwendet, jedoch kann in gleicher Weise auch eine Nitrogruppe eingesetzt werden; als Kurzbezeichnung wird hierfür entsprechend das Symbol T verwendet, das Tosyl oder Nitro bedeutet.

Die Symbole T und V besitzen ebenfalls wie die übrigen Abkürzungen an allen verwendeten Stellen einschließlich der

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Ansprüche die gleiche Bedeutung.

Nach jeder Kupplungsreaktion und vor der Schutzgruppen abspaltung vom Peptidharz wird der Ninhydrin-Test durchgeführt. Wenn der Test positiv verläuft, wird die zuletzt durchgeführte Kupplungsreaktion wiederholt. Wenn der Test negativ ist, vri.rd zur Schutzgruppenabspaltung vom Peptidharz übergegangen.

Nach der Verknüpfung des Serins in Reaktion Nr. J4 in Position 1 nach der oben beschriebenen Verfahrensweise und Sequenz sowie nach der Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation des gekuppelten Peptidharzes wird Verbindung ~$K mit folgender Struktur erhalten:

Ö-CHo-O-Phe-Asn-His-Val-Asp-Gln-Leu-Lys-Lys-Arg-Leu-Trp-Glu-Val-Arg-Glu-Met-Il Il ! I I I ' '

P» W Bz P¹ VVT Bz T Bz

-Ser-Asn-Leu-His-Lys-Gly-Leu-Asn-His-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Ser-Val-Ser-N^

Il Il Il ' !I I

_Bz pt wv P¹ W P¹ Bz Bz Bz

(Verbindung

Dieses Peptidharz wird anschließend zur Abspaltung des Harzes und der verbliebenen Schutzgruppen weiterbehandelt. Das Harz sowie alle noch verbliebenen Schutzgruppen können geeigneterweise durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt v/erden. Die Reaktionsgleichung hierfür ist:

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( R Vc^-O-Phe-Asn-HIs-Val-Asp-Gln-Leu-Lys-Lys-Arg-Leu-Trp-Glu-Val-Arg-Glu-

^-^ Il Ii ill ι Ii

P¹ W BzP¹ VVT Bz T Bz

-Met-Ser-Asn-Leu-His-Lys-Gly-Leu-Asn-His-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Ser-Val-Ser-NH

Il Il Il t Il ι

Bz P¹ WV P¹ W P¹ Bz Bz Bz

(Reaktion 35) HF

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 (Verbindung 35)

Das folgende Beispiel 8 erläutert diese Spaltungsreaktion.

Beispiel 8

2 g der Verbindung 32 wurden zusammen mit 2 ml Anisol in ein Gefäß aus KeI-F eingebracht, worauf 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde anschließend 1 h bei 0 C gerührt. Darauf wurde der Fluorwasserstoff durch Vakuumdestillation entfernt und der Rückstand viermal mit Äthylacetat gewaschen und anschließend mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde dann zu einem flaumig-weißen Pulver lyophilisiert. Durch dieses Verfahren wird das Peptid vom Harz abgespalten, wobei zugleich sämtliche Schutzgruppen an den Aminosäuren entfernt werden.

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Beispiel 9

In derselben Weise wie bei den vorhergehenden Beispielen wurde ein 1-34-Peptidharz hergestellt, bei dem das L-Serin in Position 1 durch Behandlung der Verbindung 33 mit BOC-O-Benzyl-D-serin anstelle von BOC-0-Benzyl-L-serin durch D-Serin ersetzt war. Nach der Abspaltung des Harzes sowie der verbliebenen Schutzgruppen lag folgendes Reaktionsprodukt vor:

D-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

(Verbindung 36).

Dieses Analogon besaß aufgrund des Küken-Hyperkalzämie-Tests (vgl. J.A. Parsons, B. Reit und CJ. Robinson, Endocrinology 92 (1973) W) biologische Aktivität.

Reinigung

Nach Gelfiltration an Biogel P-6 (Hersteller Biorad) wurde das rohe menschliche 1-34-Nebenschilddrüsenhormonpeptid (HPTH (1-34)) an Carboxymethylcellulose (CMC) (Whatman CM52) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert. Nach Entsalzen an Polyacrylamidgel wurde die Homogenität des synthetischen Peptids durch Dünnschichtchromatographie an Cellulose (Brinkmann Celplate-22, Eastman 6θβ5) und Silicagel platten (Merck) geprüft. Die aufgegebene Probenmenge betrug 30 /Ug in 5 ul 0,IM Essigsäure. Dabei wurden folgende Lö-

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sungsmittelsysteme verwendet: R^ n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:5; R„ Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5:5:1:3; R° n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser 15:10:3:12; R_f n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Ä'thylacetat 1:1:1:1. Die Peptidflecken wurden durch Besprühen der Platten mit Ehrlich-Reagens und 0,5 % Ninhydrin in Äthanol sichtbar gemacht. Das gereinigte synthetische HPTH-(1-34)-Peptid ergab einen einzigen Fleck mit R~ (Cellulose, Brinkman) 0,19; R_f (Kieselsäure) 0,11; R° (Kieselsäure) 0,17; R° (Cellulose, Brinkman) 0,40; R° (Cellulose, Eastman 6065) 0,66 und R„ (Cellulose, Brinkman) 0,48.

Die biologische Aktivität des synthetischen HPTH-(1-34) in vitro aufgrund des Rattennieren-Adenylatcyclase-Tests sowie des Küken-Hyperkalzämle-Tests geht aus der nachstehenden Tabelle 2 hervor. Zu Vergleichszwecken sind ferner entsprechende Daten an nativem Rinder-PTH - Cl-84) [βΡΤΗ-(1-84ϊ (nativ)] und synthetisch hergestelltem Rinder-PTH-(1-34) [bPTH-(1-34)J sowie von nativem menschlichen PTH-(1-84) angegeben.

Tabelle 2

Biologische Aktivität synthetischer und natürlicher Nebenschilddrüsenhormone

in vitro in vivo

Rattennieren-Adenylat- Küken-Hyperkalzämie

cyclase [mRC u/mg] [MRC u/mg]

HPTH-(l-84) (nativ) 350 unbekannt

HPTH -(1-34) (gereinigt, ,

Verbindung 35) ^^{υυ ρΗυυ}

BPTH-(l-84) (nativ) 3000 2500

BPTH-(l-34) 5¹^OO 7700

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3o

Aus den angeführten Beispielen ist ersichtlich, daß die Synthese von PTH-Peptiden mit biologischer Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie über die entsprechenden Peptid-Zwisehenprodukte in bemerkenswert günstiger Weise durchführbar ist, was angesichts des Stands der Technik bei der technischen Peptidsynthese völlig unerwartet war.

Das erfindungsgemaße Verfahren ist nicht auf die Synthese von PTH-Peptiden beschränkt, sondern läßt sich z.B. auch auf andere Reaktionen an festen Trägern übertragen, bei denen ähnliche Sequenzen aufgebaut werden.

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Claims

Ansprüche

1. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH_o-Asn-Phe-0-CH_o- (R, P¹

) = unlösliches Polystyrolharz und P' = Xanthydryl oder Benzhydryl.

2. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₂-VaI-HiS-ASn-PhC-O-CH₂- (r) W P'

) = unlösliches Polystyrolharz,

P' = Xanthydryl oder Benzhydryl und

W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl.

3. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NHo-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-CEL 2 , , ,

Bz W P' mit:

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(RJ = unlösliches Polystyrolharz, P¹ = Xanthydryl oder Benzhydryl, W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinltrophenyl und

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitro benzyl oder Benzhydryl.

4. Trägergebundenes Peptid der Struktur

N^-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asft-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn

I Il I I I I I I

Bz Bz Bz P¹ WP' VW P¹

Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn

Il I III I' I '

Bz Bz T Bz TVV P' Bz WP¹

= unlösliches Polystyrolharz, P' = Xanthydryl oder Benzhydryl, T = Tosyl oder Nitro,

V = 2-Chlorearbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy oder 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl und

W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl.

5. Peptid der Struktur

D-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn- - Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe,

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6. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß P-Bz-L-Serin angekuppelt wird an

NHo-Väl-Ser-Glu-lie-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser- |i Ii IiII

Bz P¹ WP¹ VW P¹ Bz

-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-

Il t III I I "I I

Bz T Bz TVV P¹ Bz W P¹

-Θ

) - unlösliches Polystyrolharz,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl,

V/ = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl, P¹ = Xanthydryl oder Benzhydryl,

V = 2-Chlorcarbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy oder 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy,

T = Tosyl oder Nitro und P = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder

o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

7. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß

P-Bz-D-Serin angekuppelt wird an

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-28--

NHo-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-Hie-AHn-Leu-Cly-Lys-Hie-Leu-Asn-Ser-

Il I Il I I I I

Bz Bz P¹ WP¹ VW P¹ Bz

■Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-

Il I I I I I I Il

Bz T Bz TVV P¹ Bz WP¹

(r) = unlösliches Polystyrolharz,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl,

W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl, P¹ = Xanthydryl oder Benzhydryl,

V = 2-Chlorcarbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy oder 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy,

T = Tosyl oder Nitro und

P = t-Butyloxycarbonyl, Amy1oxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder γ_} dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt ferner zur Abspaltung der Gruppen (r) -CHg, Bz, P¹, T, V und W mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt wird.

9. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß

InIH₂-Phe-O-CH₂- (¹R]

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P-Asn

P¹

gekuppelt wird zu einem trägergebundenen Peptid der Struktur

P-Asn-Phe-O-CHg-P¹

(r) = unlösliches Polystyrolharz, P' = Xanthydryl oder Benzhydryl und

P = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ferner die Schutzgruppe P vom Peptid abgespalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt von Anspruch 10 mit P-L-His zu einem trägergebundenen Peptid der Struktur W

P-His-Asn-Phe-O-CHo- (R.

I I <—

W P'

mit W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl gekuppelt wird.

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12. Verfahren nach Anspruch H₃ dadurch gekennzeichnet, daß ferner die Schutzgruppe P vom Peptid abgespalten wird.

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