DE3882620T2 - Biologische sensoren. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Sensoren zur Verwendung bei biologischen, biochemischen und chemischen Testverfahren und im besonderen Immunosensoren, die verwendet werden, um die Wechselwirkung von Antikörpern mit ihren entsprechenden Antigenen zu beobachten.
• Wenn Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert werden, ändern sich die Eigenschaften der Oberfläche, wenn eine Lösung, die ein entsprechendes Antigen enthält, in Kontakt mit der Oberfläche gebracht wird, um so zu erlauben, daß das Antigen an den Antikörper bindet. Im besonderen kann die Veränderung in den optischen Eigenschaften der Oberfläche mit einem geeigneten Gerät aufgezeichnet werden.
• Das Phänomen der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) kann verwendet werden, um winzig kleine Veränderungen im Brechungsindex der Oberfläche zu bestimmen, während die Reaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper vor sich geht Die Oberflächen-Plasmon- Resonanz ist die Oszillation des Plasmas von freien Elektronen, das an einer Metallgrenzfläche vorhanden ist. Diese Oszillationen werden beeinflußt durch den Brechungsindex des der Metalloberfläche benachbarten Materials und das ist es, was die Basis des Sensormechanismus bildet. Die Oberflächen-Plasmon-Resonanz kann erzielt werden durch Verwendung der evaneszenten Welle, die gebildet wird, wenn ein p-polarisierter Lichtstrahl an der Grenzfläche eines Mediums, zum Beispiel Glas, das eine hohe di-elektrische Konstante besitzt total intern reflektiert wird. Eine Druckschrift, die diese Technik beschreibt, wurde unter dem Titel "Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosensing" von Lieberg, Nylander und Lundstrom in Sensors and Actuators, Vol. 4, page 299 veröffentlicht. Ein Diagram der in dieser Druckschrift beschriebenen Anlage ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen veranschaulicht. Ein Lichtstrahl 1 wird aus einer Laserquelle (nicht gezeigt) auf eine interne Oberfläche 2 eines Glaskörpers 3 gerichtet. Ein Detector (nicht gezeigt) zeichnet den intern reflektierten Strahl 4 auf. Auf die externe Oberfläche 2 des Glaskörpers 3 ist ein dünner Metallfilm 5, zum Beispiel Gold oder Silber aufgebracht, und auf den Film 5 ist ein weiterer dünner Film 6 eines weiteren organischen Materials, das Antikörper enthält, aufgebracht. Eine Probe 7, die ein Antigen enthält, wird mit dem Antikörperfilm 6 in Kontakt gebracht, um so eine Reaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper zu hervorzurufen. Wenn eine Bindung auftritt, wird sich der Brechungsindex der Schicht 6 durch die Größe der Antikörpermoleküle verändern, und diese Veränderung kann festgestellt und gemessen werden unter Verwendung der Oberflächen-Plasmon-Resonanztechnik, wie es im folgenden erklärt wird.
• Die Oberflächen-Plasmon-Resonanz kann experimentell in der Anordnung von Figur 1 beobachtet werden durch Variation des Winkels des einfallenden Strahls 1 und Aufzeichnung der Intensität des intern reflektierten Strahls 4. Bei einem bestimmten Einfallswinkel wird die parallele Komponente des Lichtmomentes mit der Dispersion für die Oberflächenplasmone an der gegenüberliegenden Oberfläche 8 des Metallfilms zusammenpassen. Vorausgesetzt, daß die Dicke des Metallfilms 5 richtig ausgewählt ist, wird eine elektromagnetische Kopplung zwischen der Glas/Metall-Grenzfläche an Oberfläche 2 und der Metall/Antikörper-Grenzfläche bei Oberfläche 8 als ein Ergebnis der Oberflächen-Plasmon-Resonanz und so eine Abschwächung beim reflektierten Strahl 4 bei diesem besonderen Einfallswinkel auftreten. Entsprechend wird, wenn der Einfallswinkel des Strahls 1 geändert wird, die Oberflächen-Plasmon-Resonanz beobachtet als ein scharfes Loch in der Intensität des intern reflektierten Strahls 4 bei einem bestimmten Einfallswinkel. Der Einfallswinkel, bei dem Resonanz auftritt, wird vom Brechungsindex des Materials gegenüber dem Metallfilm 5 - i.e. die Antikörperschicht 6 - beeinflußt und der Einfallswinkel, der der Resonanz entspricht, ist entsprechend ein direktes Maß des Zustandes der Reaktion zwischen dem Antikörper und deren Antigen. Eine gesteigerte Empfindlichkeit kann durch Wahl eines Einfallswinkels auf halbem Weg entlang der Remissionssteigungskurve erhalten werden, wo die Antwort bei Beginn der Antikörper/ Antigenreaktion im wesentlichen linear ist, und dann beibehalten dieses festgelegten Einfallswinkels und Beobachten der Veränderung in der Intensität des reflektierten Strahls 4 gegen die Zeit.
• Bekannte Systeme der beschriebenen Art unter Bezugnahme auf Figur 1, verwenden ein Prisma als Glaskörper 3. Ein Diagramm, das diese Anordnung zeigt, ist in Figur 2 angegeben, was einfach eine experimentelle Anordnung ist, die die Oberflächen-Plasmon-Resonanz veranschaulichen soll. Das Prisma ist als Bezugszeichen 8 gezeigt und auf dessen unterer Oberfläche ist ein dünner Film 5 aus Metall aufgebracht. Licht 1 aus einer Laserquelle (nicht gezeigt) fällt auf das Prisma, wo es an Punkt 9 gebrochen wird, bevor es in das Prisma eintritt. Der intern reflektierte Strahl 4 wird ähnlich gebrochen (bei Punkt 10) beim Verlassen des Prismas.
• Ein Problem bei den bekannten SPR-Systemen ist die Langsamkeit des Verfahrens relativ zu Veränderungen im Brechungsindex der Antikörperschicht. Ein weiteres Problem, im besonderen bei der Verwendung von dem Prisma, das in Figur 2 gezeigt ist, liegt darin, daß, da sich der Einfallswinkel entweder durch Bewegen der Quelle oder durch Drehen des Prismas oder durch beides ändert, der Punkt auf der Oberfläche 2, bei dem der eintretende Lichtstrahl einfällt, sich bewegt. Aufgrund der unvermeidbaren Abweichungen im Metallfilm 5 und der Beschichtung 6 des Antikörpers verändert sich der Einfallswinkel, der zur Resonanz führt, da diese Bewegung auftritt, was wiederum einen weiteren veränderlichen Faktor in die Messung einbringt und so Vergleiche zwischen dem anfänglichen, nicht gebundenen Zustand und dem gebunden Zustand der Antikörperschicht 6 weniger genau macht.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Sensor zur Verwendung in biologischen, biochemischen oder chemischen Testverfahren bereitgestellt, wobei dieser Sensor umfaßt einen Block aus einem Material, das gegenüber elektromagnetischer Strahlung durchlässig ist, eine Schicht eines metallischen Materials, das auf wenigstens einen Teil einer ersten Oberfläche dieses Blocks aufgebracht ist, eine Schicht eines empfindlichen Materials, aufgebracht auf die metallische Schicht, Mittel zur Einbringung einer zu analysierenden Probe auf die empfindliche Schicht, um damit zu reagieren, eine Quelle einer elektromagnetischen Strahlung, wobei diese Strahlung in den transparenten Block auf solche Weise gerichtet ist, um intern von diesem Teil der Oberfläche reflektiert zu werden, und Detektormittel, die positioniert sind, um den intern reflektierten Strahl zu empfangen, wobei der Sensor charakterisiert ist durch Mittel zur Fokussierung der Strahlung auf den Teil der Oberfläche auf solche Weise, daß der eintretende Strahl ein konvergierender Fächerstrahl ist, der einen Einfallswinkelbereich überspannt, der den einschließt, der Oberflächen-Plasmon-Resonanz auftreten läßt und dieser eintretende Strahl einen Einfallspunkt oder -linie auf der ersten Oberfläche ergibt, wobei die Charakteristika der Resonanz von der Reaktion zwischen der Probe und der empfindlichen Schicht abhängen, und wobei die Detektormittel dazu in der Lage sind, einen Bereich von Winkeln innerhalb der Spanne des divergierenden Fächerstrahls, der sich aus der internen Reflektion des eintretenden Fächerstrahls ergibt, zu empfangen, wobei der empfangene Bereich von Winkeln ausreichend ist, die Charakteristika der Oberflächen- Plasmon-Resonanz empf ngen zu lassen.
• Entsprechend wird in der vorliegenden Erfindung die Antwortgeschwindigkeit dadurch verbessert, daß man dafür sorgt, daß der eintretende Lichtstrahl, der intern an der Glas/Metall- Grenzfläche reflektiert wird, die Form einer fächerförmigen Verteilung elektromagnetischer Strahlung annimmt, gewöhnlich im sichtbaren oder nahe dem sichtbaren Bereich. Auf diese Art kann der Fortschritt des resonanten Zustandes aufgezeichnet werden, während die Reaktion zwischen der Probe und der Antikörperschicht fortschreitet. In einem Beispiel kann das dadurch erreicht werden, daß man einen "festen" Eingangsstrahl aus einer Quelle elektromagnetischer Strahlung behält und man ihn (den Strahl) auf einen Brennpunkt am Einfallspunkt des Strahls in der Glas/Metall- Grenzfläche bringt. Der Eingangsstrahl wird folglich mehreren einzelnen Strahlen äquivalent, die über einen Winkelbereich auf die Glas/Metall-Grenzfläche fallen. Die Ausrüstung ist so gewählt, daß der Winkelbereich den Steigungswinkel überspannt, der der Oberflächen-Plasmon-Resonanz entspricht, zusammen mit einem Winkelbereich drumherum. Der entsprechende, intern reflektierte Strahl ist sozusagen wirksam mehrere Strahlen und kann über einen Breitbanddetektor oder durch eine Anordnung von in Winkelabständen angeordneten Detektoren, die so positioniert sind, daß sie den gesamten austretenden Strahl sammeln, aufgezeichnet werden. Entsprechend können die Detektoren die Information aus der gesamten Steigung innerhalb von Millisekunden aufzeichnen. Auf diese Weise kann das Fortschreiten des resonanten Zustandes aufgezeichnet werden, während die Reaktion zwischen der Probe und der Antikörperschicht abläuft.
• Die Verwendung eines fächertörmigen Strahls betont die Probleme des Prismas (siehe oben) und, um diese zu vermeiden, ist es vorgesehen, daß die Oberfläche des transparenten Körpers, üblicherweise Glas, auf den das eintretende Licht fällt, eine ebogene, vorzugsweise kreisförniige Oberfläche ist, und in bezug auf den eintretenden Strahl elektromagnetischer Strahlung so angeordnet ist, daß der Strahl rechtwinklig zur Oberflächentangente am Eintrittspunkt eintritt. Entsprechend ist die Oberfläche, aus der der intern reflektierte Strahl austritt, eine gebogene, vorzugsweise kreisförmige Oberfläche.
• In einer ersten Ausführungsform der Erfindung nimmt der transparente Körper die Form einer Glashalbkugel ein, deren flache Oberfläche mit einem dünnen Metallfilm und einer empfindlichen Überzugsschicht auf die oben beschriebene Weise beschichtet ist. Die Quelle der einfallenden elektromagnetischen Strahlung, zum Beispiel eine Lichtquelle, ist so angeordnet, daß der Eintrittsstrahl in den halbkugeligen Körper rechtwinkelig zu der Tangente am Einfallspunkt eindringt und so der Strahl ungebrochen durchgeht und auf das Zentrum der runden flachen Oberfläche tritt. Der Auftreffpunkt auf der flachen Oberfläche ist so für alle Teile des fächerförmigen Strahls gleich.
• Andere Formen als halbkugelig können verwendet werden; zum Beispiel halbzylindrisch, was eher eine Einfallslinie als einen Punkt ergibt, oder stumpfartig halbkugelig oder halbzylindrisch, wobei die Spitze abgeschnitten ist - i.e., wobei sich ein Körper mit zwei flachen, wahrscheinlich parallelen Oberflächen mit kreisrunden Seiten an den Oberflächen zu ergibt.
• Der fächerförmige Strahl kann dadurch gezwungen werden, im wesentlichen planar zu sein, daß er durch einen Schlitz projiziert wird, der in einer Ebene liegt, die durch den Einfallspunkt geht und senkrecht zu der Glas/Metall-Grenzfläche orientiert ist. Alternativ kann sich der Ausdruck "fächerförmig" auf eine Form eines Ausschnitts des eintretenden Strahls beziehen, und der Strahl selbst kann sich in andere Ebenen erstrecken - zum Beispiel keilförmig (was zu einer Einfallslinie führt) oder konisch geformt.
• Obgleich die auf den Metallfilm aufgebrachte Schicht hier als eine Antikörperschicht zur Verwendung bei Immunoessays beschrieben wird, wird erkennbar sein, daß jede empfindliche Schicht, deren Brechungsindex sich infolge eines auftretenden Ereignisses ändert, verwendet werden kann, um so einen sensitiven Detektor mit einer breiten Vielzahl von Anwendungen auf den Gebieten der Biologie, Biochemie und Chemie zu ergeben. Als ein Beispiel könnte die empfindliche Schicht einer DNS oder RNS Probe sein, die im Verlauf des Tests mit deren Komplement in Lösung bindet, die die zu untersuchende Probe darstellt.
• Das Metallfilmmaterial ist üblicherweise Silber oder Gold, gewöhnlich aufgebracht durch Verdampfen. Der Film muß so gleichförmig wie möglich sein, um für eine genaue Bewegung im Einfallspunkt des eintretenden Strahls zu sorgen. Es wird angenommen, daß ein strukturierter Metallfilm die beste Resonanz gibt, und es gibt verschiedene Arten, auf die der Glaskörper vorbehandelt werden kann, um die Beschaffenheit des Metallfilms zu verbessern und besonders die natürliche Tendenz solcher Filme zu steuern, diskontinuierliche Inseln zu bilden;
• 1. Eintauchen in geschmolzene Metallnitrate und andere geschmolzene Salze. Dieses hat den Effekt der Einführung von Metallionen auf die Oberfläche auf eine Art, die strukturiert sein kann und die als Keime für die Inselbildung wirken.
• 2. Ionenbombadierung von kaltem oder heißem Glas, um Keimplätze einzuführen. Es wurde gezeigt, daß die Entfernung der beweglicheren Ionen die Dicke reduziert, bei der der verdampfte Film kontinuierlich wird.
• 3. Autokatalytisches Metallisieren oder galvanisches Metallisieren auf dünn gedampfte Filme (0 bis 100 Angstroms dick) Autokatalytisch metallisierte Filme überleben zu einer größeren Dicke als gedampfte Filme und konnten stabilere Kerne für das nachfolgende Beschichten bilden.
• 4. Bedampfen auf autokatalytisch beschichtete Filme. Die autokatalytisch beschichteten Filme besitzen eine stärkere Neigung zu einer Inselbildung und zu größeren Inseln mit größeren Zwischenräumen als gedampfte Filme. Das könnte von Vorteil sein, wenn man auf Licht einer vorgeschriebenen Wellenlänge regelt.
• Die Beschichtungsbeschaffenheit kann auch verbessert werden durch:
• 1. Kontrollieren der Oberflächentemperatur des Glases während des Beschichtens. Die Verwendung eines Substrates mit höherer Temperatur steigert die Inselgröße und den Abstand dazwischen und umgekehrt.
• 2. Bedampfen in Gegenwart eines magnetischen oder elektrostatischen Feldes oder einer Elektronenemissionsanlage, um den ionengehalt des Dampfstrahls zu regeln. Der Ladungszustand des Substrats beeinflußt bekanntermaßen die Inselstruktur.
• 3. Kontrolle des Einfallswinkels des verdampften Dampfstromes im Bezug aut die Glasoberfläche. Die Mobilität der verdampften Atome und folglich deren Fähigkeit zur Bildung größerer Inseln ist größer, wenn die Bewegungsenergie der Atome relativ zur Glasoberfläche gesteigert ist.
• Um die Erfindung besser verständlich zu machen, werden im folgenden einige Ausführungsformen davon unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen nur beispielhaft beschrieben, worin:
• Figuren 1 und 2 Diagramme bekannter experimenteller Anordnungen zur Demonstration des Oberflächen-Plasmon-Resonanzeffektes sind;
• Figur 3 in einer schematischen Ausführung eine Querschnittsansicht eines Sensors gemäß eines Beispiels der Erfindung zeigt;
• Figur 4 eine schematische Seitenansicht eines weiteren Beispiels eines Sensors gemäß der vorliegenden Erfindung ist; und
• Figuren 5(a) und 5(b) die Leistungsfähigkeit veranschaulicht, zu der eine Anordnung gemäß der Erfindung in der Lage ist.
• Bezugnehmend auf Figur 3 fällt ein parallel ausgerichteter Strahl 13 einer elektromagnetischen Strahlung der Breite 2r aus einer Quelle, die nicht gezeigt ist, aber passend einen Laserdiodenkollimatorstift, wie den, der unter der Modellnummer TXCK 1200 von Telefunken Elektronik hergestellt, umfaßt, auf eine halbzylindrische fokussierende Linse 14 der fokalen Länge f&sub1;, die das Licht auf einen Punkt 15 auf einer Grenzfläche 27 zwischen einer optisch durchlässigen Komponente, allgemein gezeigt bei 28, und einer reflektierenden Schicht 19 in Form einer metallischen Beschichtung konvergieren läßt. Die optische Komponente besteht bei diesem Beispiel aus einer Glasträgerplatte oder einer Glasscheibe 16 (auf die die reflektierende Schicht beschichtet ist) und einer halbzylindrischen Linse 11 mit deren Krümmungszentrum am Punkt 15 gelegen. Eine geeignete, den Brechungsindex treffende Flüssigkeit wird, wie bei 29 gezeigt, zwischen die gegenüberliegenden Oberflächen der Platte 16 und Linse 11 gegeben, und die Anordnung ist derart, daß alle Lichtstrahlen im konvergenten Strahl, der aus der Linse 14 austritt, radial zu der optisch durchlässigen Komponente 28 durchgehen und so keiner Brechung unterliegen und im Zentrum an Punkt 15 gebündelt werden. Ein Schlitz 30 zwingt den konvergenten Strahl zu einer im wesentlichen planaren fächerförmigen Gestalt, so daß nur ein kleines Gebiet der reflektierenden Schicht 19 belichtet wird, um Effekte infolge einer Ungleichmäßigkeit der Metallbeschichtung zu reduzieren.
• Das intern von Punkt 15 reflektierte Licht wandert als eine divergente, planare, fächerförmige Streuung zurück aus der Komponente 28 und fällt auf die fokussierende Linse 31, die einen Lichtstrahl 32 erzeugt, der im wesentlichen parallel ausgerichtet ist oder wenigstens ein im Verhältnis zu der fächerförmigen Streuung des aus der Komponente 28 austretenden Lichts reduzierte Divergenz besitzt. Strahl 32 ist so ausgerichtet, auf einen Detektor 18 zu fallen (zum Beispiel eine Anordnung von photoempfindlichen Detektoren), und es soll angemerkt werden, daß der Hauptzweck der Linse 31 darin besteht, Streureflektionen in der Anordnung 18 zu reduzieren, was sicherstellt, daß Strahl 32 rechtwinklig auf deren Oberfläche trifft. Wenn jedoch die Streureflektionen weniger bedeutend sind, oder wenn die Anordnung 18 ausreichend nah an die Austrittsoberfläche der Komponente 28 plaziert werden kann (möglicherweise sogar daran angebracht oder auf der Oberfäche plaziert), wird die Linse 31 nicht benötigt.
• Die Anordnung der Detektoren ist getroffen, um elektrische Signale zu erzeugen, die die Veränderung der Intensität des Lichts mit Position gegenüber dem Strahl 32 anzuzeigen; dabei gibt der SPR- Effekt vor, daß eine starke Absorbtion in einem bestimmten Winkel auftritt, der durch das Material in der Flüssigkeit bestimmt wird, der die reflektierende Schicht 19 ausgesetzt ist. Diese elektrischen Signale werden aufgezeichnet und digitalisiert und in eine geeignete Analysenanordnung gefüttert, die einen Mikroprozessor oder einen größeren Computer beinhalten kann.
• Es kann im Interesse der Minimalisierung der Störeffekte von äußerem Licht wünschenswert sein, ohne jedoch auf die Kosten und Unbequemlichkeit der Abschirmung der gesamten Anlage oder wenigstens der Komponenten 5 und 28 zurückgreifen zu müssen, vorzusehen, daß eine charakteristische Modulierung auf das Licht gegeben wird, und daß die Detektoren und/oder die Verarbeitungskreise so "getuned" sind, daß sie vorzugsweise auf eine solche Modulierung ansprechen.
• Eine zweite Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden in Bezugnahme auf Figur 4 beschrieben. In Figur 4 umfaßt das Gerät einen halbkugeligen Körper 11 aus einem transparenten Material wie Glas oder Quarz, umgeben von einem Gehäuse 12. Eine Quelle (nicht gezeigt) elektromagnetischer Strahlung erzeugt einen parallel ausgerichteten Eingangsstrahl 13 elektromagnetischer Strahlung. Die Frequenz der Strahlung muß zu der Bildung von Oberflächen-Plasmonwellen führen und liegt in der Praxis innerhalb oder nahe an dem sichtbaren Bereich. Geeignete Quellen beinhalten einen Helium-Neon- Laser oder einen infraroten Diodenlaser, jedoch kann eine gewöhnliche Lichtquelle geeigneten Filtern und Kollimatoren verwendet werden.
• Eine Linse 14 wird verwendet, um den parallelen Einfallsstrahl 13 auf einen Brennpunkt an einem Punkt 15 genau über dem Zentrum der kreisrunden flachen Oberfläche der Halbkugel 11 beabstandet zu bringen. Der Punkt 15 liegt in der Oberfläche einers Glasscheibe 16 aus einem transparenten Material wie Glas, dessen Brechungsindex gleich oder nahezu gleich dem der Halbkugel 11 ist. Die Anordnung ist derart, daß der Punkt 15 an dem annäherndem Zentrum der Krümmung der gebogenen Oberfläche der Halbkugel liegt.
• Strahlung, die intern an Punkt 15 reflektiert wird, tritt aus der Halbkugel in Form eines divergenten Strahls 17 aus und trifft in einen strahlungsempfindlichen Detektor 18, der ein elektrisches Ausgangssignal zur Analyse durch einen externen Schaltkreis (nicht gezeigt) auf oben beschriebene Weise erzeugt. Der Detektor kann zum Beispiel eine Diodenanordnung sein, oder ein ladungsgekoppeltes Flächenelement oder ähnliches Abbildesystem.
• In einer praktischen Ausführungsform des Gerätes wird eine Metallfilmschicht, als Bezugsnummer 19 gezeigt, auf die Oberfläche der zuvor genannten Glasscheibe 16 aufgebracht. Der Punkt 15, auf den der Einfallsstrahl gebündelt wird, liegt entsprechend auf der Grenzfläche zwischen dem Metallfilm und der Glasscheibe 16. Auf die Oberfläche des Metallfilms wird eine empfindliche Schicht 20 aufgebracht, deren Brechungsindex sich ändert, wenn der Test vor sich geht. Die empfindliche Schicht kann zum Beispiel eine Antikörperschicht sein. Die empfindliche Schicht 20 ist auf eine relativ kleine aktive Zone oberhalb des Punktes 15 und innerhalb eines zentralen Loches, vorgesehen in einer kreisrunden Scheibe 21 aus einem absorbierenden Material, beschränkt. Über Scheibe 21 liegend sind zwei weitere Scheiben 22, 23 aus nichtabsorbierendem Material. Eine zentrale Öffnung in der oberen Scheibe 23 ergibt eine Vertiefung 25, in die eine zu untersuchende Probe gegeben wird. Eine zentrale Öffnung 24 in Scheibe 22 besitzt eine solche Größe die infolge der Kapillarwirkung Flüssigkeit in Vertiefung 25 in die aktive Zone oberhalb der Schicht 20 fließen läßt. Die Dicke der Scheibe 21 ist so bemessen, eine Tiefe für die aktive Zone derart vorzugeben, eine radiale Bewegung der Probenflüssigkeit, die aus der Öffnung 24 durch Kapillarwirkung austritt, nach außen voranzutreiben. Die absorbierende Schicht 21 absorbiert die Probe, die durch die aktive Zone 21 geflossen ist.
• Die gesamte Einheit umfaßt Glasscheibe 16, Scheibe 21 und Scheiben 22 und 23 und ist wegwerfbar, so daß für jeden Test eine neue Einheit einschließlich einer empfindlichen Schicht 22 verwendet werden kann. Die Scheibe 16 wird auf die flache Oberfläche der Halbkugel 11 aufgesetzt, vorzugsweise nach Aufbringen einer dünnen Schicht eines optischen Öls oder Fettes auf die flache Oberfläche, um eine gute optische Kupplung zwischen der Halbkugel und der Glasscheibe sicherzustellen. Gegebenenfalls kann die Halbkugel selbst wegwerfbar sein, vorausgesetzt, daß sie billig genug hergestellt werden kann, wobei dann keine Notwendigkeit besteht, eine separate Scheibe 16 einzubauen, und der Metallfilm direkt auf die Halbkugel aufgebracht werden kann.
• Um das Gerät zu verwenden, wird eine zu untersuchende Probe, die ein Antigen enthält, das in der Lage ist, mit den Antikörpermolekülen in Schicht 20 zu binden, in die Vertiefung 25 gegeben und wandert durch Kapillarwirkung durch die Öffnung 24. Austretend aus der Öffnung 24 beginnt die flüssige Probe schnell radial nach außen in alle Richtungen auf die absorbierende Scheibe 21 zu fließen, wobei sie, wenn sie dieses tut, die Antikörperschicht 20 passiert. Die der Schicht 20 benachbarte Probe wird entsprechend im Verlauf des Tests ständig wieder aufgefrischt, was eine maximale Empfindlichkeit sicherstellt.
• Während die Probe über die Schicht 20 fließt, wird jedes Antigen in der Probe, das in der Lage ist, an den Antikörper in Schicht 20 zu binden, dieses tun, wodurch sich der Brechungsindex der Schicht 20 verändert, während die Reaktion fortschreitet Diese Veränderung im Brechungsindex wird dadurch kontinuierlich im Verlauf des Tests aufgezeichnet, daß man an Punkt 15 den gebündelten Lichtstrahl 13 anlegt. Vorausgesetzt, daß die Bedingungen richtig sind - besonders der Einfallswinkel an Punkt 15 ist richtig -, führt die Anwendung von Strahl 13 zur Bildung einer Plasmonwelle, die dadurch Energie aus dem Eingangsstrahl abzieht und eine Abschwächung der Intensität des Auslaßstrahls 17 bei einem bestimmten Einfallswinkel hervorruft. Der Einfallswinkel ist so angeordnet, daß der mittlere Winkel des Winkelbereichs des Einlaßstrahls annähernd auf halbem Wege entlang der Remissionsteigungskurve liegt, wie oben beschrieben, und der Test wird bei einem konstanten Einfallswinkel durchgeführt, wobei die Intensität des reflektierten Strahls oberhalb und unterhalb dieses Mittelpunktniveaus aufgezeichnet wird. Das führt zu einem linearen und hochgradig empfindlichen Output.
• Die anfängliche Remissionssteigung, die zur Einstellung des Einfallswinkels gewählt wird, sollte die Kurve sein, die sich ergibt, wenn etwas neutrale oder Pufferlösung durch die Zelle fließt, oder wenn im Test die Probe durch die Zelle fließt, bevor jede Reaktion davon stattgefunden hat. Im Zusammenhang mit dem letzteren Verfahren, das gegenwärtig bevorzugt ist, sollte angemerkt werden, daß, während die Probe in die aktive Zone, die Schicht 20 benachbart ist, zu fließen beginnt, der Brechungsindex sich nicht sofort infolge der Antikörper-Antigen-Reaktion zu ändern beginnt. Es ist entsprechend ausreichend Zeit, eine anfängliche Aufzeichnung mit der nicht umgesetzten, durchfließenden Probe vorzunehmen, wobei die Aufzeichnung bei Verwendung eines Feed-Back-Schaltkreises verwendet werden kann, den Einfallswinkel auf einen geeigneten Wert auf halbem Weg entlang der Remissionssteigung schnell so einzustellen, daß der Rest des Versuchs bei diesem bestimmten Winkel durchgeführt werden kann.
• In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Halbkugel 11 durch einen Halbzylinder ersetzt. In diesem Fall können Figuren 3 und 4 als Schnitte durch ein geeignetes Gerät mit dem Halbzylinder 11, der sich oberhalb und unterhalb der Papierebene erstreckt, angesehen werden. Die Verwendung eines Halbzylinders ergibt die Möglichkeit einer Resonanzlinienfläche anstelle des einzelnen Punktes 15 und entsprechend einer linearen aktiven Zone. Die Öffnung 24 wird zu einem Schlitz und die Vertiefung 25 wird verlängert. Die Lichtquelle wird so betrieben, einen "blatt"-förmigen Ausgangsstrahl zu erzeugen, der durch eine zylindrische Linse 3 auf Linie 15 fokussiert wird. Der Detektor 18 ist entsprechend in seinem Ausmaß linear und wird vorzugsweise von einzelnen Detektoren oder Detektorenanordnungen gebildet, wobei jeder so angeordnet ist, einen spezifischen Abschnitt entlang der Länge der Linie 15 aufzuzeichnen.
• Die halbzylindrische Linse 11 besitzt den Vorteil, daß sie verwendet werden kann, einige Tests gleichzeitig bei einer einzigen Probe durchzuführen. Dabei nimmt die Schicht 20 die Form einer Serie von getrennten empfindlichen Flächen ein, wobei jede einen anderen Antikörper enthält, und wobei jede getrennte Fläche durch ihren eigenen Detektor 18 aufgezeichnet wird. Eine einzige in Vertiefung 25 gegebene Probe wird durch den Schlitz 24 auf die aktive Fläche fließen und gleichzeitig mit verschiedenen empfindlichen Flächen reagieren, wobei sich individuelle Output-Aufzeichnungen ergeben, die durch Detektoren 18 aufgezeichnet werden können.
• Obgleich die Halbkugel/Halbzylinder 11 so dargestellt ist, daß sie eine vollständige 180º Krümmung besitzt, sollte tatsächlich angemerkt werden, daß nur der Teil in der Nähe der flachen Oberfläche verwendet wird, und daß aus diesem Grund ein beträchtlicher Teil des Körpers 11 abgeschnitten werden kann, wobei eine abgestumpfte Halbkugel oder Halbzylinder gebildet wird, wie das beispielhaft durch die gepunktete Linie 26 in Figur 4 angezeigt ist.
• Wie anhand des Vorstehenden festzustellen ist, erlaubt die Erfindung, einen ganzen Streuwinkelbereich von Interesse oder wenigstens einen beträchtlichen Teil davon auf einmal zu untersuchen. Dabei ist die Untersuchungsgeschwindigkeit nur durch die Ansprechcharakteristika der Detektoren in der Anordnung 18 und der damit verbundenen Proben und Rechenschaltkreise begrenzt. Das erlaubt, daß anfängliche Ausgleichsvorgänge und andere Abweichungen, die während die Analyse auftreten können, aufgezeichnet und in Betracht gezogen werden, und erlaubt auch schnell durchzuführende Kalibrierungstests.
• Darüberhinaus hat sich herausgestellt, daß, wenn jede Analyse oder Assay bei einem festgesetzten Reflektivitätswert (wie durch einen geeigneten Output aus den Rechenkreisen bestimmt) begonnen wird, der absolute Brechungsindex der flüssigen Probe dann, der sehr wohl zwischen Proben variieren kann, unwichtig ist. Wichtig ermöglicht die Erfindung, die gewünschten Reflektivitätscharakteristika auf der Zeitskala so kurz zu bestimmen, daß es weniger ist als die für die chemische Bindung, notwendig für SPR, benötigte Zeit, die zwischen dem betreffenden Inhaltsstoff der flüssigen Probe und der Reflektionsschicht erreicht wird.
• Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sie erlaubt, Kalibrierungsläufe mit Flüssigkeiten bekannter SPR- Charakteristika durchzuführen, um kompensierende Daten zu erzeugen, die in den Rechnern gespeichert werden können, und die automatisch als Korrekturen während der klinischen Analyse, falls notwendig, verwendet werden. Diese kompensierenden Daten können zum Beispiel verwendet werden, Abweichungen der Reflektivität oberhalb des Punktes 15 in Betracht zu ziehen, ein Phänomen, das besonders auftreten kann, wenn die reflektierende Schicht durch Aufdampfen hergestellt wurde.
• Figur 5 zeigt eine Darstellung eines Videosignals, abgeleitet aus Detektor 18 in der Anordnung der Figuren 3 und 4, wie auf einem Oszilloskopschirm dargestellt wird. Die SPR-Resonanz kann klar erkannt werden.
• Der Detektor wird elektronisch abgetastet, üblicherweise etwa 200 Mal pro Sekunde, um die Bewegung der Resonance in "Echtzeit" aufzeichnen zu lassen, während die biochemischen Substanzen an die Oberfläche der metallbeschichteten Platte 16 gebunden werden. Die Reflektivitätskurve in Figur 5a wurde durch die annährend Gaussprofil des Strahls aus der Laserdiodenquelle moduliert. Dieses Profil kann durch eine geeignete Signalverarbeitung wie in Figur 5b gezeigt, entfernt werden, was durch Subtraktion des festen Hintergrunds infolge des Umgebungslichtes und durch Division durch das Signal ohne jede Resonanz erzielt wurde.

Claims (13)

1. Ein Sensor zur Verwendung in biologischen, biochemischen oder chemischen Testverfahren, wobei dieser Sensor umfaßt einen Block(11, 16) aus einem Material, das gegenüber elektromagnetischer Strahlung durchlässig ist, eine Schicht (19) eines metallischen Materials, das auf wenigstens einen Teil einer ersten Oberfläche (27) dieses Blocks aufgebracht ist, eine Schicht (20) eines empfindlichen Materials, aufgebracht auf die metallische Schicht, Mittel zur Einbringung einer zu analysierenden Probe auf die empfindliche Schicht (20), um damit zu reagieren, eine Quelle einer elektromagnetischen Strahlung (13), wobei diese Strahlung (13) auf solche Weise in den transparenten Block (11, 16) gerichtet ist, um intern von diesem Teil der Oberfläche reflektiert zu werden, und Detektormittel, die positioniert sind, um den intern reflektierten Strahl zu empfangen, wobei der Sensor charakterisiert ist durch Mittel (14) zur Fokussierung der Strahlung auf den Teil (15) der Oberfläche (27) auf solche Weise, daß der eintretende Strahl ein konvergierender Fächerstrahl ist, der einen Einfallswinkelbereich überspannt, der den einschließt, der Oberflächen-Plasmon-Resonanz auftreten läßt, und dieser eintretende Strahl einen Einfallspunkt oder -linie auf der ersten Oberfläche ergibt, wobei die Charakteristika der Resonanz von der Reaktion zwischen der Probe und der empfindlichen Schicht (20) abhängen, und wobei die Detektormittel (18) dazu in der Lage sind, einen Bereich von Winkeln innerhalb der Spanne des divergierenden Fächerstrahls (17), der sich aus der internen Reflektion des eintretenden Fächerstrahls ergibt, zu empfangen, wobei der empfangene Bereich von Winkeln ausreichend ist, die Charakteristika der Oberflächen-Plasmon-Resonanz empfängen zu lassen.

2. Ein Sensor wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Strahlung aus der Quelle in den Block (11, 16) durch eine zweite gebogene Oberfläche eintritt.

3. Ein Sensor wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei das Zentrum der Krümmung der zweiten Oberfläche auf der ersten Oberfläche (27) liegt.

4. Ein Sensor wie in einem der Ansprüche 2 oder 3 beansprucht, wobei die zweite Oberfläche kreisförmig ist.

5. Ein Sensor wie in einem der Ansprüche 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Eintrittsstrahl elektromagnetischer Strahlung in den Block (11, 16) in einer Richtung senkrecht zu der Tangente an der Oberfläche des Eintrittspunktes eintritt.

6. Ein Sensor wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Detektormittel (18) außerhalb des Blockes (11, 16) positioniert sind und wobei der intern reflektierte Strahl (17) aus dem Block durch eine dritte Oberfläche des Blockes austritt, wobei die dritte Oberfläche gebogen ist.

7. Ein Sensor wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Zentrum der Krümmung der dritten Oberfläche auf der ersten Oberfläche (27) liegt.

8. Ein Sensor wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 beansprucht, wobei der durchlässige Körper (11, 16) die Form einer Halbkugel annimmt, deren flache Oberfläche die erste Oberfläche (27) darstellt und dessen kreisrunde Oberfläche die zweite Oberfläche einschließt, und wobei der Teil der ersten Oberfläche im Zentrum der ersten Oberfläche gelegen ist.

9. Ein Sensor wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 beansprucht, wobei der durchlässige Körper (11, 16) die Form eines Halbzylinders annimmt, dessen flache Oberfläche die erste Oberfläche (27) ist, und dessen gebogene Oberfläche die zweite Oberfläche beinhaltet, und wobei der Teil der ersten Oberfläche auf der zentralen Längsachse der ersten Oberfläche gelegen ist.

10. Ein Sensor wie in einem der Ansprüche 8 oder 9 beansprucht, wobei der obere Teil der gebogenen Oberfläche des Körpers (11, 16) weggelassen ist, wobei sich eine abgestumpfte Halbkugel oder Halbzylinder ergibt.

11. Ein Sensor wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Detektormittel (18) die Form eines groß- Flächen-Detektors einnehmen, der so positioniert ist, den gesamten austretenden Strahl zu sammeln.

12. Ein Sensor wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Detektormittel (18) die Form einer Anordnung von in Winkeln beabstandeten Detektoren einnehmen, die angeordnet sind, den gesamten austretenden Strahl zu sammeln.

13. Ein Sensor wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die empfindliche Schicht (20) die Form einer Antikörperschicht einnimmt, die mit einer Probe, die einen entsprechenden Antikörper enthält, umgesetzt werden soll.