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DE3881698T2 - Lectine, die beta-d-galactosid binden. - Google Patents

Lectine, die beta-d-galactosid binden.

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DE3881698T2
DE3881698T2 DE88907006T DE3881698T DE3881698T2 DE 3881698 T2 DE3881698 T2 DE 3881698T2 DE 88907006 T DE88907006 T DE 88907006T DE 3881698 T DE3881698 T DE 3881698T DE 3881698 T2 DE3881698 T2 DE 3881698T2
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amino acid
lectins
peptide
lectin
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Vivian Teichberg
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Incyte Pharmaceuticals Inc
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Description

  • Die Erfindung betrifft die Isolierung eines Lectins menschlichen Ursprungs, die Bestimmung der Aminosäuresequenzen von Lectinen verschiedener Herkunft, einschließlich der Lectine menschlichen Ursprungs, ihre Synthese, die therapeutische Verwendung dieser Sequenzen als Immunstimulanzien und Immunsuppressoren und als interferonartige Mittel zur Behandlung bestimmter Virosen und bestimmter Krebsformen, die Herstellung von polyclonalen und monoclonalen Anti-Lectin-Antikörpern und ihre Anwendung zur Immundiagnostik, die Identifizierung und Isolierung der Lectingene, die die genannten Aminosäuresequenzen erkennen, die Verwendung der Expression dieser Gene zur Produktion von Lectinen, Aminosäuresequenzen und dafür geeigneten Oligonucleotiden.
  • Lectine sind Proteine, die in einer großen Vielzahl von Vertebraten vom Zitteraal (daher ihr Name) bis zum Vogel und bis zu Säugetieren gefunden wurden.
  • Lectine sind Proteine, die Zucker binden und sich mit Mono- und Oligosacchariden durch nicht-kovalente Bindungen verbinden. Alle Lectine sind oligomere Proteine, die mehrere Bindungsstellen für Saccharide pro Molekül tragen, d.h. sie sind multivalent. Diese polyvalente Struktur verleiht den Lectinen die Eignung, Zellen, die auf ihrer äußeren Membran geeignete Saccharidfraktionen tragen, zu agglutinieren.
  • Im Verlauf der letzten zwanzig Jahre wurden mehrere hundert Lectine, die hauptsächlich aus Pflanzen extrahiert wurden, gereinigt und charakterisiert. Diese Lectine wurden entweder als Reagentien zur Reinigung und Charakterisierung von Glycokonjugaten oder als Mitogene für spezifische Lymphozytenklassen verwendet.
  • Gegenwärtig werden bestimmte Lectine in Blutbanken zur Bluttypisierung hauptsächlich wegen der mangelnden Verfügbarkeit von natürlichen Anti-O(H)-Antikörpern und wegen der Tatsache, daß bestimmte unter ihnen zwischen den Blutuntergruppen A&sub1; und A&sub2; unterscheiden, verwendet. Gelegentlich werden die Lectine zur Trennung von Erythrozytenmischpopulationen, beispielsweise in den seltenen Fällen von mosaikartigen Blutgruppen, als Folge der Bildung von Chimären, von somatischen Mutationen oder Knochenmarkstransplantationen verwendet. Da bestimmte Lectine (beispielsweise das Phytohämagglutinin (PHA) und das Concanavalin A) die B-Lymphozyten stimulieren (beispielsweise das Phytolaquemitogen), werden ebenfalls Lectine zur Identifikation der Hauptunterpopulationen der Lymphozyten verwendet. Im Gegensatz zu den Antigenen, die nur einen schwachen Teil der Lymphozyten stimulieren (üblicherweise 0,02 bis 0,2%), stimulieren die Lectine einen erhöhten Anteil (bis zu 70 bis 80%) der B-Zellen, unabhängig von der antigenen Spezifität der Lymphozytenrezeptoren. Die Lectine sind somit polyclonale Aktivatoren oder polyclonale Liganden. Sie werden zur Untersuchung des Mechanismus, gemäß dem ein Antigen, das an der Oberfläche der lymphoiden Zelle wirkt, spezifisch die clonale Expansion und die Synthese der Immunglobuline begünstigt oder hemmt. Als andere Produkte, die durch von Lectinen stimulierten Lymphozyten synthetisiert wurden, sind verschiedene Lymphokine, wie Interleukin 2 (Il-2) und Interferon zu nennen. Die mitogene Stimulierung, insbesondere durch PHA, wird ebenso, sowohl als diagnostisches Mittel zum Nachweis von angeborenen und erworbenen immunologischen Mängeln, zum Nachweis von Sensibilisierungen infolge infektiöser Mittel oder im Zusammenhang mit bestimmten Autoimmunerkrankungen, als auch zur Kontrolle der Wirkung verschiedener Behandlungen mit Immunsuppressoren und Immuntherapeutika verwendet. Eine andere besonders nützliche Anwendung der Stimulierung der Lymphozyten durch diese Lectine ist durch cytogenetische Untersuchungen menschlicher und tierischer Chromosomen gegeben.
  • Die Lectine werden ebenso in großem Umfang von Immunologen zur Untersuchung der Eigenschaften und der Konstitution der Lymphozytenmembranen verwendet. Unter Verwendung geeigneter Lectinderivate ist es möglich, nicht nur die Verteilung der Lectinrezeptoren auf der Lymphozytenoberfläche, sondern auch die Beweglichkeit der Rezeptoren in der Membran zu untersuchen und beispielsweise zu zeigen, daß die Neuverteilung und die Kappenbildung der Rezeptoren auf den Lymphozytenoberflächen eine Folge der Fixierung der Lectine sind.
  • Die Lectinrezeptoren, d.h. die Membranbestandteile, die mit den Lectinen reagieren, können auf den Elektrophoretogrammen detektiert werden oder in gereinigter Form durch die gleichen Methoden, die man zur Isolierung von Oberflächenantigenen mit Hilfe der entsprechenden Antikörper verwendet, isoliert werden. Die Detektion wird bevorzugt durch Färbung des Lectins auf den Elektrophoretogrammen von Membranpräparaten durchgeführt. Die Rezeptoren können aus solubilisierten Membranen durch Präzipitation entweder durch das Lectin allein oder unter Verwendung des letzteren in Assoziation mit einem Anti-Lectin-Antikörper isoliert werden. Die besseren Ergebnisse werden durch affinitätschromatographische Isolierung der Rezeptoren auf immobilisierten Lectinen erhalten.
  • Das Vorhandensein zahlreicher Vertebratengewebe mit einer endogenen Lectinaktivität, die spezifisch β-D-Galactosid fixieren, wurde 1974 nachgewiesen und der Familie der Proteine mit der Bezeichnung "Elektrolectine" zugeschrieben (wegen der Tatsache, daß das erste beschriebene tierische Lectin aus dem elektrischen Organ des Zitteraals (Electrophorus electricus) isoliert wurde). Seither wurden Lectine aus dem Muskel, der Niere, dem Herzen und dem Darm von Hühnerembryonen, aus dem Herzen, der Lunge und der Milz von Kälbern, aus der Lunge der Ratte, aus dem Muskel von Affen, aus der Lunge und dem Muskel von Menschen isoliert. Beachtlicherweise zeigen die bis zum heutigen Tag identifizierten verschiedenen Lectine Eigenschaften, die denen, die für das Elektrolectin des Zitteraals beschrieben wurden, sehr ähnlich sind. Alle agglutinieren Kaninchenerythrozyten, die durch Trypsin behandelt wurden, von allen wird angegeben, daß sie hauptsächlich intrazellulär cytoplasmatisch vorkommen, alle besitzen ein Molekulargewicht zwischen 15000 und 30000 Dalton und setzen sich aus zwei bis vier Untereinheiten zusammen, alle besitzen die gleiche Affinität für die folgenden Saccharide in abnehmender Reihenfolge:
  • β-D-Galactosyl-thiogalactopyranosid (TDG) > Lactose > D- Galactose
  • Von allen bis zu diesem Tag identifizierten Lectinen wurde angegeben, daß sie das Vorhandensein von Reduktionsmitteln zur Aufrechterhaltung ihrer Agglutinationsaktivität benötigen.
  • Außerdem wurde gezeigt, daß die Lectine aus verschiedenen Geweben des gleichen Tieres und die Lectine aus homologen Geweben von verschiedenen Säugetieren eine antigene Kreuzreaktivität zeigen.
  • Die biologischen Funktionen der vertebraten Lectine sind noch nicht mit Sicherheit festgestellt. Es ist jedoch beachtlich, daß ihre Konzentration in den Geweben als Funktion der Entwicklung reguliert wird und daß sie an neoplastischen Prozessen beteiligt sind. Beim erwachsenen Tier sind die vertebraten Lectine prinzipiell in Organen vorhanden, die an der Immunabwehr (d.h. im Thymus, der Plazenta, der Haut) beteiligt sind. Die Lectine mit einer Spezifität gegen Lactose zeigen immunomodulatorische Eigenschaften bei experimentell hervorgerufenen Autoimmunerkrankungen (wie Myasthenia gravis und Typ I Diabetes).
  • Aus den gegenwärtig verfügbaren Daten geht hervor, daß die Lectine eine strukturelle Ähnlichkeit mit den Interferonen zeigen, welche Lymphokine sind, die bereits bei der menschlichen Therapie für bestimmte Virosen und bestimmte Krebsformen experimentell eingesetzt wurden. Außerdem, und wie vorstehend angegeben, hat die funktionelle Untersuchung des Zitteraal-Elektrolectins immunsuppressive Eigenschaften in einer experimentellen Form von Myasthenia gravis, die durch Injektion des Acetylcholinrezeptors hervorgerufen wurde, gezeigt. Diese beiden Arten von Beobachtungen legen nahe, daß Lectine klinisch entweder als Lymphokine und/oder als immunsuppressive Proteine und in der Immundiagnostik unter Verwendung der Reaktion der antigenen Tumorproteine mit Anti-Lectin-Antikörpern verwendet werden können.
  • Mit dem Ziel der Untersuchung der Regulation der Expression und der biologischen Funktionen der vertebraten Lectine haben GITT und BARONDES (PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, Bd. 83, S. 7603-7607, Oktober 1986) die Bestimmung der Sequenzen der Lectine und insbesondere der eines dimären menschlichen Lectins, das β-D-Galactosid bindet, dessen Untereinheit ein Molekulargewicht von 14000 Dalton besitzt, wobei das Lectin aus der menschlichen Lunge stammt, in Angriff genommen. Diese Autoren haben zwei cDNA-Clone durch immunologisches Absuchen einer cDNA-Bank eines menschlichen Hepatoms mit Hilfe eines Antiserums, das spezifisch an ein Lectin bindet, das β-D-Galactosid bindet und ein Molekulargewicht von 14000 Dalton besitzt, isoliert. Sie fanden, daß die Aminosäuresequenzen der Insertionen dieser beiden Clone, die sie so abgeleitet haben, eine starke Homologie untereinander mit der Sequenz des Lectins der Hühnerhaut, das das β-D-Galactosid bindet, und mit acht Peptiden, die sich von dem gereinigten Lectin der menschlichen Lunge ableiten, und ein Molekulargewicht von 14000 Dalton besitzt, zeigen. Jedoch haben die Differenzen zwischen den Sequenzen der zwei Hepatomclone und zwischen jedem dieser Clone und den Peptiden der menschlichen Lunge ihnen nahegelegt, daß es mindestens drei Varianten des Gens, das dieses Lectin codiert, gibt, die in dem menschlichen Gewebe exprimiert werden, wobei jedoch darauf hingewiesen wird, daß sie die Natur der durch die Clone 1 und 2 des menschlichen Hepatoms codierten Proteine nicht festgestellt haben.
  • Bei der Bedeutung der physiologischen Rolle der Lectine bei ontogenetischen Ereignissen und den Differenzierungsschritten erscheint es notwendig, die Homologie zwischen den verschiedenen vertebraten Lectinen zu ermitteln, indem man in jedem möglichen Ausmaß ihre Sequenzen bestimmt und die verfügbaren Quellen von homologen Lectinen, insbesondere im Hinblick auf ihre therapeutische und diagnostische Verwendung, erweitert.
  • Unter diesen Bedingungen haben die Erfinder die strukturelle Homologie verschiedener Lectine, die β-D-Galactosid binden, ermittelt, indem sie die Aminosäuresequenzen der Lectine, die aus dem Zitteraal und der menschlichen Plazenta isoliert wurden, aufgestellt haben. Sie haben die Sequenzen, die sie aufgestellt haben, mit den vorstehend publizierten Sequenzen, die sich von cDNA, die Lectine codiert, die β-D-Galactosid binden, die aus der Haut von Hühnerembryonen bzw. menschlichem Hepatom isoliert wurden, abgeleitet sind und mit der Teilaminosäuresequenz des Lectins der menschlichen Lunge verglichen. Sie haben so starke Homologien zwischen diesen Lectinen verschiedener Ursprünge beleuchtet.
  • Gegenstand der Erfindung ist eine Aminosäuresequenz, die ein Peptid bildet, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid binden, entspricht, wobei das Peptid ein Fragment umfaßt, das einen Tryptophanrest sowie zwei Glutaminsäurereste enthält, wobei das Fragment mindestens teilweise die Bindungsstelle des β- D-Galactosids bildet und die Aminosäuresequenz
  • Trp-Gly-Thr-Glu-Gln-Arg-Glu (a)
  • oder eine Aminosäuresequenz, worin nicht mehr als eine der Aminosäuren Thr oder Gln durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, umfaßt, mit der Maßgabe, daß das Peptid die Sequenzen Gly-Ser-Asn, Met-Glu-Glu, Ala-Gly-Ala oder die Aminosäure Thr unmittelbar stromaufwärts des Fragments nicht enthält.
  • Erfindungsgemäß umfaßt das Peptid, das einem Teil der Sequenz der Lectine entspricht, weiterhin die Sequenz
  • X&sub1;-X&sub1;-Asn-X&sub1;-Gly (b)
  • worin X&sub1; eine hydrophobe Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Val, Ala, Met, Ile und Leu, stromaufwärts der Sequenz (a) ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Sequenz (b) stromaufwärts der Sequenz (a) in einer Entfernung von etwa 35 Aminosäureresten angeordnet.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Peptid, das einem Teil der Sequenz der Lectine entspricht, unter anderem stromabwärts der Sequenz (a), die folgende Aminosäuresequenz
  • Ile-Ile-Leu-Pro-Asp-Gly-X&sub2;-X&sub2;-X&sub2;-X&sub2;-Phe-Pro-Asn-Arg-Leu (c)
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Sequenz (c) stromabwärts der Sequenz (a) in einer Entfernung von etwa 30 Aminosäureresten angeordnet.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Peptid, das einem Teil der Sequenz der Lectine entspricht, weiterhin unmittelbar stromaufwärts der Sequenz (a) die folgende Aminosäuresequenz (d)
  • Asp-Gly-Gly-Ala (d)
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das erfindungsgemäße Peptid weiterhin unmittelbar stromabwärts der Sequenz (a) die folgende Aminosäuresequenz (e):
  • Ala-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-Pro-Gly-Ser-Val-Ala-Glu-Val (e)
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das erfindungsgemäße Peptid ein Aminosäureskelett, das aus mindestens den folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen besteht. Serin Lysin Glycin Leucin Phenylalanin Asparagin Histidin Prolin Arginin Asparaginsäure Valin Tryptophan Glutamin Threonin Leucin Prolin Asparaginsäure Glycin Phenylalanin Asparagin
  • Gemäß einer Variante dieser Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Asparagin Valin Asparaginsäure Alanin Histidin Glycin Threonin Glutamin Prolin Isoleucin Glutaminsäure Lysin
  • Gemäß einer anderen Variante dieser Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Threonin Asparagin Alanin Prolin Lysin Serin Valin Leucin Asparaginsäure Phenylalanin Histidin Glycin Isoleucin Cystein Glutamin Arginin
  • Gemäß einer noch weiteren Variante dieser Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Glycin Valin Glutamin Threonin Lysin Asparaginsäure Alanin Histidin Prolin Isoleucin Asparagin
  • Gemäß einer anderen Variante dieser Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Asparaginsäure Glycin Glutamin Phenylalanin
  • Gemäß einer anderen Variante dieser Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Alanin Prolin Lysin Serin Valin Leucin Asparaginsäure Glutamin Phenylalanin Arginin Tyrosin
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Aminosäuresequenz, die ein Peptid bildet, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die 129 folgenden Aminosäuren, die in der gleichen Sequenz des Lectins des Zitteraals vorhanden sind, umfaßt:
  • Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Aminosäuresequenz dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die folgenden Aminosäuren, die in der gleichen Sequenz in dem Lectin der menschlichen Plazenta vorhanden sind, umfaßt:
  • Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen entsprechen einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid binden, zeigen eine größere Affinität für das β-D-Galactosyl-thioglactopyranosid als für Lactose und eine größere für letzteres als für Galactose und benötigen Reduktionsmittel zum Beibehalten ihrer agglutinierenden Aktivität. Diese Sequenzen umfassen essentielle Determinanten der Lectine und zeigen eine Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen die Lectine verschiedenen Ursprungs sowohl des Menschen als auch von Tieren.
  • Erfindungsgemäß sind die Aminosäuren der Sequenz, die der des Lectins des Zitteraals entspricht, in dem Präparat aus mehreren Peptiden, die durch Abbau in einem Mikrosequenator in Gasphase analysiert wurden und deren Aminosäurezusammensetzungen mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) identifiziert wurden, vorhanden, wobei so die folgenden Peptide identifiziert wurden:
  • Erfindungsgemäß besitzen die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, die einem Teil der Sequenz der vorstehend definierten Lectine entsprechen, eine β-Faltblattstruktur, wobei die Faltblätter mindestens in einer Anzahl von 10 an Positionen entsprechend den Positionen, die den Lectinen verschiedener Ursprünge gemeinsam sind, vorhanden sind.
  • Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen unterscheiden sich weiterhin durch ihren hydrophoben Charakter, der anhand der Hydropathieskala nach KYTE und DOOLITTLE ermittelt wurde.
  • Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen unterscheiden sich ebenso durch die Tatsache, daß das Tryptophan, das sie enthalten, sich in einer Position zwischen Position 69 und Position 76 der Sequenz befindet, ebenso wie zwei Glutaminsäurereste und daß die Region 69 bis 76 mindestens teilweise die Bindungsstelle des β-D-Galactosids bildet.
  • Die Aminosäuresequenzen unterscheiden sich andererseits durch die Tatsache, daß sie mindestens zwei Cystein- oder Semi-Cystinreste enthalten, die sich an den Positionen 44 und 62 befinden, und deren chemischer Zustand eine wichtige Rolle bei der funktionellen Integrität des Proteins spielen dürfte.
  • Die erfindungsgemäßen Aminosäuren unterscheiden sich weiterhin durch die Tatsache, daß sie ein terminales am Stickstoff blockiertes Peptid tragen, das aus einer N-acetylierten Ser- Met-Sequenz besteht.
  • Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur Reinigung der Lectine, die β-D-Galactosid binden, ausgehend von Geweben von Vertebraten und insbesondere des Zitteraals und aus menschlichen Organen, wie insbesondere der Plazenta, durch Homogenisierung und Fraktionierung der tierischen Gewebe und anschließende affinitätschromatographische Isolierung mit Hilfe einer Lactosyl-Sepharose-Matrix, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Elutionspuffer, der zur Isolierung der Lectine verwendet wird, aus einer Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,2, gepuffert durch Phosphat unter Zusatz von Lactose und 2-Mercaptoethanol besteht.
  • Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenzen oder der Sequenzabfolge an Aminosäuren, entsprechend einem Teil der Sequenz der vorstehend definierten Lectine, die das β-D-Galactosid binden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein automatisches Abbauverfahren durch Phenylisothiocyanatkupplung mit dem endständigen Stickstoff des zu sequenzierenden Peptids, Spaltung des aminoterminalen Rests durch Cyclisierung in saurem Milieu und Umwandlung des gebildeten Thiazolinomderivats in ein Phenylthiohydantoinderivat, verwendet wird, wobei das Abbauverfahren in Gegenwart von Polybren durchgeführt wird.
  • Ebenso ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mittels Synthese von Aminosäuresequenzen, entsprechend einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid binden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Synthese durch Durchführen eines Verfahrens, das sich von dem BERGMAN-ZERVAS-Verfahren ableitet, unter Verwendung von Schutzgruppen zum Schutz der reaktiven Funktionen der zu kuppelnden Aminosäuren und von geeigneten Verfahren zur Kupplung, um die geschützten Aminosäuren untereinander zu verbinden, durchgeführt wird, um die gewünschten Sequenzen zu bilden.
  • Weiterhin sind Gegenstand der Erfidung polyclonale Antimenschliche Plazentalectin-Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie im wesentlichen aus Seren bestehen, die aus dem Blut von Tieren, die durch Injektion mit einem vorstehend definierten Lectin, das nach dem vorstehend definierten Reinigungsverfahren für Lectine gereinigt wurde, immunisiert wurden, erhalten worden sind.
  • Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung monoclonale Antimenschliche Plazentalectin-Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus Clonen bestehen, die von Hybridomen isoliert worden sind, die durch Fusion von geeigneten Tumorzellen, insbesondere SP 2-0 oder NS-1 mit Milzzellen von Mäusen, die gegen das Lectin der menschlichen Plazenta, wie vorstehend definiert, das geeigneterweise mit Hilfe des vorstehend definierten Reinigungsverfahrens gereinigt worden ist, immunisiert worden sind, erhalten worden ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Mittel zur Diagnose von Tumorbefall, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die vorstehend definierten polyclonalen und/oder monoclonalen Antikörper umfaßt.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein therapeutisches Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Lectin, das eine Aminosäuresequenz (a) und unmittelbar stromabwärts der Sequenz (a) die Aminosäuresequenz (e) gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
  • Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein therapeutisches Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die vorstehend definierten polyclonalen und/oder monoclonalen Antikörper, gegebenenfalls zusammen mit Toxinen und/oder Enzymen enthält.
  • Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen, die Beispiele zum Erhalt der vorstehend definierten Aminosäuresequenzen und Verfahren zur Kontrolle der Aktivität von Lectinen, die das β-D-Galactosid binden, dieser Sequenzen umfaßt, mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, worin
  • - die Figur 1 die Aminosäuresequenz des Zitteraal-Lectins zeigt, wobei die Anordnung der Peptide und der Fragmente, aus denen es besteht, zu sehen ist;
  • - die Figur 2 ein typisches HPLC-Profil eines tryptischen Abbaus des Elektrolectins zeigt, worin jede der durch Abbau erhaltenen Fraktionen in einem Gasphasensequenator analysiert wurde und worin die entsprechende Sequenz über dem Pic angegeben ist;
  • - die Figur 3 einen Vergleich der Sequenzen, die für die jeweiligen Lectine, die β-D-Galactosid binden, erhalten worden sind, die aus dem Zitteraal, menschlicher Plazenta (Hum.p.) und menschlicher Lunge (Hum.1) erhalten worden sind, mit denen die von cDNA von Hühnerembryonenhaut und von menschlichem Hepatom Li-7 ("Hum.hep.1", "Hum.hep.2") erhalten worden sind, zeigt;
  • - die Figur 4 die β-Faltblattstrukturen und die Hydropathieprofile der Lectine, die β-D-Galactosid binden, die aus Hühnern und Zitteraal isoliert wurden, zeigt. Die zwei oberen Kurven wurden mit Hilfe des CHOU-FASMAN-Verfahrens (BIOCHEMISTRY, 13, (1974), 211-222) berechnet, die zwei unteren Kurven wurden unter Verwendung der Hydropathieskala von KYTE & DOOLITTLE (J. MOL. BIOL. 157, (1982), 105-132) berechnet;
  • - die Figur 5 die Wanderung des menschlichen Lectins in einem Polyacrylamidgel, das durch Elektrofokussierung erhalten worden ist, zeigt;
  • - die Figur 7 die Molekülarten, die durch Hybridisierung nach dem SOUTHERN-Verfahren erhalten worden sind, zeigt; und
  • - die Figur 8 einen Immunblot von der Wanderung von gereinigtem Lectin zeigt.
  • Es ist jedoch zu verstehen, daß die nachstehend angegebenen Beispiele nur den näheren Erläuterungen des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen sollen.
    • Beispiel I Reinigung des Lectins das β-D-Galactosid bindet, ausgehend vom Zitteraal
  • Zitteraale, Electrophorus electricus (lebend erhalten von WORLDWIDE PARAMOUNT AQUARIUM/ARDSLEY, N.Y.), wurden enthauptet und ihr hauptsächliches elektrisches Organ wurde in kleine Würfel zerschnitten und auf -20ºC gefroren. Die Homogenisierung der Gewebe und die Fraktionierung wurden, wie von LEVI & TEICHBERG, J. BIOL. CHEM., 256, (1981), 5735-5740 beschrieben, durchgeführt. Die Lectine wurden affinitätschromatographisch auf einer Lactosyl-Sepharose-Matrix, wie in der zuletzt genannten Druckschrift beschrieben, isoliert. Der Elutionspuffer bestand aus einer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2, die durch 0,01 M Phosphat gepuffert war und mit 100 mM Lactose und 14 mM 2-Mercaptoethanol versetzt war.
  • Die Reinheit des eluierten Lectins wurde elektrophoretisch auf Polyacrylamid-Natriumdodecylsulfat verifiziert und seine Aktivität nach Dialyse gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurde an den mit Trypsin behandelten Erythrozyten von Kaninchen in einem quantitativen Hämagglutinintest, der auf Mikrotiterplatten, ebenfalls wie in der vorstehenden Publikation beschrieben, durchgeführt wurde, kontrolliert.
    • Beispiel II Reinigung des Lectins, das β-D-Galactosid bindet, ausgehend von menschlicher Plazenta
  • Frische menschliche Plazenten, die aus nächtlichen Entbindungen stammten, wurden bis zur ihrer Gewinnung und Behandlung am folgenden Morgen auf Eis gehalten. Die Lectine wurden durch Vorgehen, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen.
  • Die Reinheit und die Homogenität des menschlichen Plazentalectins wurden elektrophoretisch auf Polyacrylamid in Gegenwart eines pH-Gradienten (Technik mit der Bezeichnung "isoelektrische Fokussierung") nach dem folgenden Verfahren bestätigt.
  • Der pHi-Wert des menschlichen Lectins (ELH) wurde durch isoelektrische Fokussierung (IEF) bestimmt, dabei wurde wie folgt vorgegangen:
    • Technik Polyacrylamidvorratslösung
  • 24,25 g Acrylamid
  • 0,75 g Bisacrylamid
  • 2,50 g Amberlit MB-6 (Pharmacia)
  • 250,00 ml destilliertes Wasser
    • Herstellung des Gels (Platten 115 x 230 nm)
  • 15 ml der Vorratslösung wurden filtriert
  • 1,90 ml Pharmalyt (pH-Gradient 3,10)
  • 4,00 ml Glycerin
  • Einstellung auf 30 ml mit Wasser
  • Entgasen
  • Zugabe von 300 ul N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
  • Ausgießen des Gels
  • Polymerisation während einer Stunde
    • Wanderung:
  • Das Gel wurde auf eine gekühlte Platte des Apparats gegeben.
  • Die Elektroden wurden auf jeder Seite angebracht und ein mit einer 1 M H&sub3;PO&sub4;-Lösung für die Anode und ein 1 M NaOH-Lösung für die Kathode getränkter LKB-Papierstreifen wurde angebracht.
    • Vorfokussierung
  • 20 Minuten bei einer konstanten Leistung von 40 mW.
  • Aufbringen der Proben (1 cm von der Anode entfernt)
  • Auf LKB-Papier mit den Maßen 1 x 0,5 cm.
  • ELH: 20 ul aus einer Lösung mit 600 ug/ml entsprechend 12 ug
  • Kontrollproteine: 20 ul Pharmacia Eichlösung
  • Wanderung: 1 Stunde 30 Minuten, Leistung 40 mW konstant
    • Detektion:
  • 45 minütige Fixierung mit 10%iger Trichloressigsäure, dann 30 Minuten in einer 30%igen Ethanol- und 5%igen Essigsäurelösung,
  • Färbung eine Stunde mit Coomassieblau
  • Entfärbung in 40%igem Ethanol + 5%iger Essigsäure
  • Trocknen
  • Anschließend wird die Kurve pHi = f (Wanderungsabstand) (cm) für die Eichproteine aufgestellt.
  • Der so bestimmte pHi-Wert des menschlichen Lectins beträgt 5,25, wie die beigefügte Figur 5 zeigt.
    • Beispiel III Trennung und Reinigung der Peptide 1. Enzymatischer Abbau
  • a) Der tryptische Abbau wurde in 1%igem NH&sub4;HCO&sub3; unter Zusatz von 10 ug durch Tosylphenylalanylchlormethylaceton behandeltes Trypsin, das in 0,01 mM HCl aufgelöst war, mit 1 mg Lectin, das aus dem Zitteraal oder der menschlichen Plazenta, wie in den vorstehenden Beispielen I und II beschrieben, isoliert wurde, durchgeführt. Nach 6stündigem enzymatischem Abbau bei 37ºC wurden weitere 10 ug Trypsin zugesetzt, und der Abbau wurde 6 Stunden später durch Absenken des pH-Werts auf 4 gestoppt. Das Abbauprodukt wurde mittels HPLC auf einer RP300 Säule unter Verwendung des folgenden Gradienten getrennt.
  • Lösungsmittel A: H&sub2;O/0,1% TFA
  • Lösungsmittel B: CH&sub3;CN 80%/H&sub2;O 20%/0,1% TFA
  • (TFA = Trifluoressigsäure)
  • Die beiden Lösungsmittel wurden durch Passage eines Heliumstroms entgast. Die Trennung wurde unter Verwendung eines Gradienten von 0% Lösungsmittel B auf 40% Lösungsmittel B im Verlauf von 8 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute zu Ende geführt. Der Detektor mit variabler Wellenlänge wurde auf 206 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,2 nm eingestellt. Die Arbeitstemperatur betrug 25ºC.
  • b) Der Abbau durch die Protease von Staphylococcus aureus (beschrieben in HOUMARD & DRAPEAU, PROC. NATL. ACAD. SCI., 69, 3506-3509) wurde unter für die Spaltung der Peptidbindungen Glu-X geeigneten Bedingungen durchgeführt: 10 ug Enzym (bezogen von MILES LABORATORIES) wurden zu 1 mg Lectin in 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; bei einem pH-Wert von 7,8 gegeben, und der Abbau wurde 18 Stunden lang bei 37ºC fortgesetzt. Die so erhaltenen Peptide wurden mittels HPLC, wie vorstehend beschrieben, getrennt.
    • 2. Bromcyanspaltung
  • Diese Spaltung wurde in 70%iger Ameisensäure bei 25ºC über 24 Stunden im Dunkeln durchgeführt, wobei 10 mg Bromcyan auf 1 mg Lectin verwendet wurden.
  • Die so erhaltenen Fragmente wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 Superfein in Gegenwart von 5 M Guanidin-HCl getrennt. Die Fragmente wurden auf Sephadex G-25 in 1%igem NH&sub4;HCO&sub3; entsalzt und lyophylisiert.
  • Die durch den Abbau von Trypsin und durch die Protease von Staphylococcus aureus erhaltenen Peptide wurden durch Umkehrphasenchromatographie auf einem WATERS-Gerät getrennt und bei 206 nm mit Hilfe eines Spektrophotometers 440 kontrolliert. Die meisten Trennungen wurden auf einer RP 300 Säule (bezogen von BROWNLEE) in einem Puffer aus 1% Trifluoressigsäure (TFA) unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Gradienten durchgeführt.
    • Beispiel IV Sequenzierung der in den Peptiden der Lectine enthaltenen Aminosäuren 1. Sequenzanalyse
  • Die verschiedenen Peptide wurden durch automatisierten EDMAN-Abbau in einem Gasphasenmikrosequenator (bezogen von APPLIED BIOSYSTEMS) analysiert. Chemisch behandeltes polybren (im Handel unter dem Warenzeichen "CHEMUBRENE" von CHEMUNEX, PARIS) wurde zugesetzt, um die Extraktion der Peptide zu verhindern und um die Ausbeuten zu verbessern. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden mittels HPLC auf einem WATERS-Gerät, das mit einer RP 18 Säule mit einem Durchmesser von 5 um (bezogen von BROWNLEE) ausgestattet war, unter Verwendung eines Natriumacetat/Acetonitrilgradienten identifiziert.
    • a) Analyse der durch Bromcyan gespaltenen Lectinfragmente
  • Die Zusammensetzung der Aminosäuren des Zitteraal-Lectins zeigt das Vorhandensein von drei Methioninresten. Um aus der Anwesenheit dieser Reste einen Vorteil zu ziehen, wurde das Protein unter Verwendung von Bromcyan in 70%iger Ameisensäure hydrolysiert. Nur ein einziges langes Fragment und ein kleines Fragment wurden isoliert, die gereinigt und teilweise sequenziert wurden. Das dritte Peptid mit terminalem Stickstoff (blockiert) wurde nicht isoliert.
  • Die Ergebnisse dieser Spaltungen sind in der beigefügten Figur 1 zusammengefaßt, die eine Anordnung der Peptide und der Fragmente des aus Zitteraal isolierten Lectins zeigt. In dieser Figur bezeichnen C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; die durch Bromcyanspaltung erhaltenen Fragmente. Bei Ersatz der 70%igen Ameisensäure durch eine 50:50 HFBA/Ameisensäure (HFBA = Heptafluorbuttersäurelösung) wurde eine Spaltung an einer zusätzlichen Stelle beobachtet, die aller Wahrscheinlichkeit nach einer Peptidbindung Tryptophan-X (X : nicht identifizierte Aminosäure) entspricht. Dieses neue Peptid wurde teilweise sequenziert, wodurch die Sequenz Gly-(Thr)-Glu-Gln erhalten wurde.
    • b) Analyse der Peptide aus dem tryptischen Abbau
  • Der größere Teil der Sequenz des Lectins des Zitteraals und die Gesamtheit der Ergebnisse bezüglich des menschlichen Proteins wurden durch Analyse der durch tryptischen Abbau erhaltenen Peptide, die auf einer RP 300 Säule, wie in Absatz 1.a) des vorliegenden Beispiels beschrieben, getrennt wurden, erhalten.
  • Die beigefügte Figur 2 zeigt eine tryptische Trennung auf einer RP 300 Säule. Die entsprechenden Peptidsequenzen sind entlang der Pics mit den folgenden Bezeichnungen angegeben:
  • A Ala Alanin
  • B Asx Asp oder Asn
  • C Cys Cystein oder Semi-Cystin
  • D Asp Asparaginsäure
  • E Glu Glutaminsäure
  • F Phe Phenylalanin
  • G Gly Glycin
  • H His Histidin
  • I Ile Isoleucin
  • K Lys Lysin
  • L Leu Leucin
  • M Met Methionin
  • N Asn Asparagin
  • O PCA zyklisiertes Gln
  • P Pro Prolin
  • Q Gln Glutamin
  • R Arg Arginin
  • S Ser Serin
  • T Thr Threonin
  • V Val Valin
  • W Trp Tryptophan
  • X ( ) unbekannt
  • Y Tyr Tyrosin
  • Z Glx Glu oder Gln
  • Die Pics wurden als Funktion der Position der Peptide in der Gesamtheit der in Figur 1 dargestellten Sequenz nummeriert, worin die Peptide durch T&sub1;, T&sub2;, T&sub3;, T&sub4;, T&sub5;, T&sub6;, T&sub7;, T&sub8;, T&sub9;, T&sub1;&sub0;, T&sub1;&sub1; (T = Abbau durch Trypsin) bezeichnet sind. Zwei zusätzliche Peptide (CT 8) wurden erhalten, wahrscheinlich durch Wirkung des in dem Trypsin enthaltenen Chymotrypsins.
  • Die bei jedem der Pics der Figur 2 angegebenen Sequenzen sind die folgenden:
    • c) Analyse der Peptide aus dem Abbau durch die Protease von Staphylococcus aureus.
  • Zusätzliche Sequenzen des Lectins und überlappende Sequenzen wurden durch Analyse der Peptide aus dem Abbau des Zitteraal-Lectins durch die aus Staphylococcus aureus extrahierte Protease erhalten, die unter den verwendeten Versuchsbedingungen die Proteine an den Glu-X Peptidbindungen spaltet. Die Peptide wurden mittels HPLC vor ihrer Sequenzanalyse in einem automatischen Sequenator getrennt. Die durch die Staphylococcus aureus-Protease gespaltenen Peptide sind in der Figur 1 durch SP&sub1;, SP&sub2;, SP&sub3; und SP&sub4; bezeichnet.
  • Die Analysen der Peptidsequenzen, die sowohl durch chemische Spaltung als auch durch proteolytische Spaltungen erhalten wurden, gestatteten die Aufstellung der Gesamtheit der Aminosäuresequenz des Lectins, das das β-D-Galactosid bindet, isoliert aus Zitteraal, und zu mehr als 60% der des Lectins der menschlichen Plazenta. Die in der beigefügten Figur 3 gezeigte Anordnung der Peptide für das Lectin aus Huhn, Zitteraal, der menschlichen Plazenta (Hum.p.), der menschlichen Lunge (Hum.1) und aus menschlichem Hepatom (Hum.Hep.1 und 2) beruht auf den starken Homologien, die die anderen Lectine mit dem 14 KD Protein, das das β-D-Galactosid bindet, das aus Hühnerembryonen isoliert wurde, zeigen.
    • 2. Sekundärstrukturen der Lectine
  • Die charakteristischen Parameter der Sekundärstrukturen der Lectine wurden anhand der Hühnerlectine und der Lectine des Zitteraals mit Hilfe eines logistischen Programms, das von einer Informatikergruppe mit Anwendungsgebiet Gentechnik der Universität Wisconsin bereitgestellt wurde, und mit Hilfe eines "Micro-Vax II"-Computers berechnet. Die Ergebnisse dieser Berechnungen sind in der beigefügten Figur 4 dargestellt, die die Neigung der Lectine zur Bildung von β-Faltblättern darstellt und die ebenso ihre Hydropathieprofile zeigt. Die zwei oberen Kurven - die die β-Faltblattstrukturen als Funktion der Zahl der Aminosäurereste zeigen - wurden mit Hilfe des CHOU-FASMAN-Verfahrens (BIOCHEMISTRY, 13, 211-222) berechnet, und die zwei unteren Kurven - die die Hydropathie als Funktion der Anzahl der Aminosäurereste zeigen - wurden mit Hilfe der Hydropathieskala von KYTE & DOOLITTLE (J. MOL.BIOL. 157, 105-132) erhalten.
  • In der Figur 4 zeigen die Teile jeder der Kurven, die sich über der Schwellenlinie, deren Wert 100 ist, befinden, die Aminosäurereste an, die wahrscheinlich an den β-Faltblattstrukturen beteiligt sind. Daraus folgt, daß die Hühnerlectine und die Lectine des Zitteraals alle beide aus mindestens 10 β-Faltblättern bestehen, die alle aus Aminosäureresten in äquivalenten Positionen der beiden Proteine bestehen.
  • Das gleiche gilt für die Hydropathieprofile, deren Ähnlichkeit in den beiden Proteinen sehr groß ist.
  • Die Aminosäuresequenzen, die aufgestellt werden konnten sowie die Neigung der Lectine zur Bildung von β-Faltblättern und ihre Hydropathieprofile, wie sie in Figur 4 dargestellt sind, beweisen die Homologie der Lectine tierischer Vertebraten. Die Lectine des Huhns und des Zitteraals tragen 51 identische Reste an 130 Positionen, die verglichen wurden, was einer Homologie von 39% entspricht. Die identischen Reste sind auf die ganze Länge der Proteine, außer auf das letzte Drittel der Ketten, das viel weniger Ähnlichkeit als der Rest der Polypeptide zeigt, verteilt.
  • Außer den 51 identischen Resten werden 27 Positionen von homologen Resten eingenommen, die von Codons, die sich nur durch ein einziges Nucleotid unterscheiden, codiert werden. Das terminale am Stickstoff blockierte Peptid besteht aus einer N-Acetyl-Ser-Met-Sequenz. Die Analyse der Peptide aus der Bromcyanspaltung in einem HFBA/Ameisensäuregemisch erlaubte die Zuordnung von Tryptophan in Position 70. Diese Position 70, die dem Tryptophanrest zugeschrieben wurde, wurde durch die Tatsache, daß alle Sequenzen von Lectinen, die in Figur 3 dargestellt sind, die gleiche Zone 70 bis 76 besitzen, erhärtet.
  • Außerdem wird die Anordnung der Peptide, wie in den Figuren 1 und 3 dargestellt, durch Ähnlichkeiten der Zonen, die β- Faltblätter bilden, und der Hydropathieprofile, insbesondere der Sequenzen des Huhns und des Zitteraals, erhärtet.
  • Der Vergleich zwischen den Lectinen des Huhns und der menschlichen Plazenta erbringt 59 identische Reste auf 111 verglichene Positionen. In der Tat sind mehrere Peptidsequenzen in den beiden Proteinen identisch: die Sequenzen 29- 33, 35-40, 45-51, 53-56, 70-76, 78-82, 89-91, 109-111 und 125-127.
  • Der Vergleich zwischen dem Lectin des Zitteraals und dem Lectin der menschlichen Plazenta erbringt 47 identische Reste auf 111 verglichene Positionen.
  • Der Vergleich zwischen den Teilsequenzen der vier Lectine menschlichen Ursprungs, die in Figur 3 dargestellt sind, erbringt signifikante Homologien. 50 Reste von 54 vergleichbaren Positionen (93% Homologie) sind in den Lectinen der Lunge und der menschlichen Plazenta identisch, während man nur 41% Homologie zwischen dem Lectin der menschlichen Plazenta und dem Produkt des cDNA-Clons des menschlichen Hepatoms 1 findet (42 Reste auf 103 verglichene Reste). Diese Ergebnisse zeigen, daß mindestens vier verschiedene Gene, die die Lectine, die das β-D-Galactosid binden, codieren, in dem menschlichen Genom vorhanden sein können, und daß sie einen gemeinsamen Ursprung haben, dessen Folge die Tatsache ist, daß man in den Peptidsequenzen der Lectine verschiedener tierischer Ursprünge die gleichen essentiellen strukturellen Determinanten findet, wie insbesondere die Bindungsstelle für β-D-Galactosid, die sich zumindest teilweise auf der Ebene der Positionen 70 bis 76 befindet. Diese Peptidsequenz enthält einen Tryptophanrest und zwei Glutaminsäurereste an den Positionen 70, 73 bzw. 76.
    • Beispiel V Synthetische Herstellung einer Aminosäuresequenz entsprechend mindestens einem Teil eines Lectins, das das β-D-Galactosid bindet
  • Die in dem vorstehenden Beispiel IV beschriebenen Peptidsequenzen wurden unter Anwendung des Festphasenverfahrens nach MERRIFIELD (sh. J. AM. CHEM. SOC. (1963), 85, 2194) synthetisiert.
  • Die vollständige Synthese des Lectins des Zitteraals und des Lectins der menschlichen Plazenta gestattet eine bessere Annäherung an die Eigenschaften und die Konstitution der Lymphozytenmembranen und die Synthese des zweiteren könnte die Bereitstellung einer vollständig synthetischen Quelle zur Herstellung eines therapeutischen immunstimulierenden und immunsuppressiven Mittels von großem Wert erlauben.
    • Beispiel VI Herstellung polycolonaler Antikörper gegen das menschliche Plazentalectin Herstellung polyclonaler Antikörper gegen das menschliche Plazentalectin:
  • - Kaninchen wurden zum Zeitpunkt 0 mit 50 ug affinitätschromatographisch gereinigtem Plazentalectin in vollständigem Freund'schem Adjuvant durch intradermische Injektion an vielen Punkten injiziert.
  • - Die zweite Immunisierung folgte 15 Tage später mit 50 ug Lectin in unvollständigem Freund'schem Adjuvant durch subkutane Injektion.
  • - Die dritte Immunisierung fand 15 Tage später mit 50 ug Lectin in unvollständigem Freund'schem Adjuvant durch subkutane Injektion statt.
  • - Es wurde regelmäßig alle 3 Wochen Blut abgenommen.
  • - Ausgehend von diesen Seren wurden die Immunglobulinfraktionen mittels DEAE gereinigt und anschließend getestet, um ihre Antikörperaktivität durch das ELISA-Verfahren und durch einen Immunblot zu bestimmen.
    • Assay auf das polyclonale Ansprechen nach dem ELISA-Verfahren:
  • - Das in einem NaCl-Puffer mit β-Mercaptoethanol in einer Konzentration von 5 ug/ml verdünnte Lectin wurde auf eine Nunc-Immunplatte mit 96 Kavitäten in einem Verhältnis von 50 ul pro Kavität eine Stunde bei 30ºC fixiert.
  • - Es wurde dreimal in PBS mit 1% Magermilch und 0,1% Tween (PLT) gewaschen.
  • - Es wurde eine Stunde bei 30ºC gesättigt.
  • - 50 ul pro Kavität der verschiedenen Antiseren und bei unterschiedlichen Verdünnungen (in PLT) wurden auf die Platte verteilt und eine Stunde bei 30ºC inkubiert.
  • - Es wurde dreimal in PLT gewaschen.
  • - 50 ul pro Kavität Anti-Kaninchenziegenserum, das an Peroxidase gekoppelt war und 1:1000 verdünnt war (GAR-pox), wurde zugesetzt.
  • - Es wurde dreimal in PBS gewaschen.
  • - Die Detektion wurde durch 100 ul 1%iges ABTS-Substrat in einem Essigsäurepuffer mit pH-Wert 4,7, der 0,2% H&sub2;O&sub2; enthält, auf 30 Volumina durchgeführt.
  • - Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm in einem Titertek Multiskan Analysator durchgeführt.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der beigefügten Figur 6 gezeigt.
    • Immunblotassay auf das polyclonale Ansprechen:
  • - Es wird eine SDS-PAGE Elektrophorese durchgeführt, bei der das gereinigte Lectin in Gegenwart von β-Mercaptoethanol in einer Menge von 8 ug pro Kavität auf einem 15%igen Acrylamidgel, das 0,1% SDS enthält, bei 250 Volt 4 Stunden lang wandert.
  • - Anschließend wird bei 30 Volt 16 Stunden lang auf Nitrocellulose überführt.
  • - Anschließend wird 5 Stunden bei 4ºC mit PLT gesättigt.
  • - Banden mit einer Größe von 1 cm werden aus der Nitrocellulose ausgeschnitten.
  • - Es wird mit Antiseren inkubiert.
  • - Es wird in PLT gewaschen.
  • - GAR-pox 1/1000 (2 ml/Bande)
  • - Es wird mehrfach in 0,1% PBS-Triton gewaschen.
  • - Es wird mittels Chlornaphtol detektiert.
  • Der Immunblot ist in der beigefügten Figur 7 gezeigt, die zeigt, daß die Kaninchenantiseren (gereinigte IgG-Fraktionen) mit dem Lectin reagieren: die Detektion zeigt eine Bande mit einem Molekulargewicht von 14 KD.
  • In Figur 7 wurden die folgenden Inkubationsschemata verwendet:
  • - Bande Nr. 1: physiologische Lösung aus 0,15 M NaCl, 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4 (PBS).
  • - Bande Nr. 2: normales Mausserum in einer Verdünnung von 1/50.
  • - Bande Nr. 3: Anti-ELH Mauspräfusionsserum in einer Verdünnung von 1/50.
  • - Bande Nr. 4: Anti-ELH Mausserum in einer Verdünnung von 1/50.
    • Beispiel VII Herstellung von monoclonalen Anti-menschlichen Plazentalectin-Antikörpern 1. Immunisierung
  • Weibliche Balb/c-Mäuse wurden immunisiert, indem man ihnen einmal wöchentlich über drei aufeinanderfolgende Wochen intravenös 100 mg gereinigtes Lectin injizierte. Nach einer dreimonatlichen Ruheperiode erhielten die Mäuse intravenös mit der gleichen Menge des Lectins drei Tage vor Entnahme der Splenocyten zur Fusion eine Auffrischungs-Injektion.
    • 2. Fusion
  • Mausmyelomazellen NS 1 wurden zur Fusion verwendet. Sie wurden auf ihre Aminopterinempfindlichkeit selektioniert und in RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 IE/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthielt, gezüchtet.
  • Die Splenocyten wurden durch Injektion von RPMI-Medium ohne Serum in die Milz der hyperimmunisierten Mäuse dispergiert und dreimal vor der Fusion in RPMI-Medium gewaschen.
  • Die Myelomazellen und die Splenocyten wurden anschließend in einem Verhältnis von 1 Myelomazelle auf 10 Splenocyten in Gegenwart von 41% Polyethylenglykol mit einem Gewicht von 1500 (Merck) nach dem KÖHLER und MILSTEIN-Verfahren (Nature, 256, 495-497, 1975) fusioniert. Anschließend wurden sie in RPMI-Medium gewaschen und in 100 ml vollständigem RPMI-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend auf Nunclon Mikrotiterplatten (24 Kavitäten pro Platte) in einem Verhältnis von 1 ml/Kavität, enthaltend 2,2 10&sup5; Zellen, verteilt. Nach 24 Stunden wurde ein 1 ml/Kavitätmedium, bestehend aus vollständigem RPMI-Medium, das 0,1 mM Hypoxanthin, 0,4 M Aminopterin und 16 um Thymidin enthielt, zugesetzt. Aliquote Teile des Selektivmediums wurden am dritten, sechsten und zehnten Tag nach der Fusion ersetzt. Nach 15 Tagen wurden die überlebenden Hybridome in vollständigem RPMI-Medium, das mit Hypoxanthin und Thymidin komplettiert war, gezüchtet und 15 Tage nach der Fusion wurde auf das Vorhandensein von Anti-menschliches Plazentalectin-Antikörpern in den Kulturüberständen abgesucht. Die Clone wurden anschließend schrittweise in vollständigem normalem RPMI-Medium gezüchtet.
  • Die positiven Kulturen wurden nach dem Verfahren der Grenzverdünnung nach OI, V.T. und HERZENBERG, L.A. 1980 "Immunoglobulin-producing hybrid cell lines", in "Selected Methods in Cellular Immunology" (Hrsg. Mishell, R.B. und Shrigi, S.M., S. 351, Fillman, San Francisco) gezüchtet.
  • Die Zellen wurden in den Kavitäten einer Nunclontiterplatte in einer Menge von 0,5 Zellen durchschnittlich pro Kavität mit 3 10&sup5; Thymocyten als Nährzellen verteilt. Nach 10 Tagen wurden die Kavitäten, die Einzelclone enthielten, selektioniert und 5 Tage später wurden die Überstände getestet, um das Vorhandensein von Anti-Hefe-Antikörpern zu bestimmen.
  • Drei Clone, die aus einer positiven Primärkultur hervorgegangen waren, wurden selektioniert und Balb/c-Mäusen injiziert, um große Antikörpermengen zu erhalten. Hierzu wurden die alten weiblichen Balb/c-Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 0,3 ml Tetramethylpentadecan stimuliert.
  • Nach 4 Tagen wurden 20 Millionen Hybridzellen den Mäusen injiziert. Nach 15 Tagen wurden die Ascitesflüssigkeiten entnommen, und ihre Anti-Hefeaktivität wurde getestet.
    • Beispiel VIII Clonierung der Oligonucleotidsonden
  • Die Clonierung wurde durchgeführt, indem zwei Oligonucleotidsonden auf der Basis der Peptidsequenzen des menschlichen Plazentalectins jeweils zwischen den Resten 48 und 56 und 70 und 82 synthetisiert wurden. Vier Hauptmolekülarten wurden in einer Genombank nach dem SOUTHERN-Hybridisierungsverfahren identifiziert und sie wurden cloniert.
  • Genauer wurde die Hybridisierung der durch EcoRI gespaltenen DNA von A&sub4;³¹-Zellen und von durch HINDIII gespaltene DNA des λ-Phagen mit der mit ³²P markierten Sonde P38 durchgeführt.
  • Die spezifische Aktivität der Sonde P38 beträgt 3 10&sup5; cpm/pmol.
  • Die Figur 7 zeigt die SOUTHERN-Hybridisierung, die nach den vorstehenden Bedingungen durchgeführt wurde.
  • 1: DNA des Phagen λ : 10 ug pro Kavität
  • 2: A&sub4;³¹ DNA : 10 ug pro Kavität
    • Beispiel IX Anwendungen der polyclonalen und monoclonalen Anti-menschliches Plazentalectin-Antikörper
  • 1. Die polyclonalen Antikörper, die, wie in dem vorstehenden Beispiel VI beschrieben, gegen das Lectin der menschlichen Plazenta hergestellt wurden, wurden zum Nachweis auf das Vorhandensein und auf die Größe des Plazentalectins in einem Proteingemisch, das einer Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließendem elektrophoretischen Transfer auf Cellulosenitratmembranen und Absorption von Antikörpern (Immunblottechnik) durch die Immunblottechnik, die, wie vorstehend in Beispiel VI beschrieben, durchgeführt wurde, unterworfen wurden, verwendet.
  • 2. Die wie in vorstehendem Beispiel VI gegen das Lectin der menschlichen Plazenta hergestellten polyclonalen Antikörper wurden zum Nachweis des Vorhandenseins von Lectin auf der Oberfläche bestimmter sowohl normaler als auch tumoraler Lymphoidzellen verwendet. Die gegenwärtig erhaltenen Ergebnisse legen nahe, daß der Gehalt an Lectin der auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert wird, als Funktion der Fähigkeit dieser Zellen, Metastasen zu streuen und zu bilden, variiert.
  • Diese polyclonalen Antikörper stellen folglich wirksame Detektionsmittel auf das Vorhandensein von Metastasen dar.
  • 3. Die polyclonalen oder monoclonalen Anti-Lectin-Antikörper stellen weiterhin nützliche diagnostische Mittel zur Bestimmung der metastatischen Fähigkeit von Tumoren dar, wobei eine der bekannten Techniken, wie insbesondere Immunfluoreszenz und ELISA, verwendet wird.
  • 4. Die polyclonalen und monoclonalen Anti-Lectin-Antikörper stellen weiterhin therapeutische Produkte von Wert dar, da sie als Vektoren zum Nachweis von Toxinen oder Enzymen auf Tumorzellen, die das Lectin an ihrer Oberfläche exprimieren, verwendet werden können.
  • Folglich beschränkt sich so die Erfindung in keiner Weise auf die dargestellten Ausführungsformen und Anwendungsformen, die ausführlicher beschrieben wurden. Sie umfaßt im Gegenteil dazu alle Varianten, die sich ein Fachmann auf dem Fachgebiet ausdenken kann, ohne vom Umfang oder Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims (27)

1. Ein Peptid bildende Aminosäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid binden, entspricht, wobei das Peptid ein Fragment umfaßt, das einen Tryptophanrest sowie zwei Glutaminsäurereste enthält, wobei das Fragment mindestens teilweise die Bindungsstelle des β- D-Galactosids bildet und die Aminosäuresequenz (a)
Trp-Gly-Thr-Glu-Gln-Arg-Glu (a)
oder eine Aminosäuresequenz, worin nicht mehr als eine der Aminosäuren Thr oder Gln durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, umfaßt mit der Maßgabe, daß das Peptid die Sequenzen Gly-Ser-Asn, Met-Glu-Glu, Ala-Gly-Ala oder die Aminosäure Thr unmittelbar stromaufwärts des Fragments nicht enthält.
2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Sequenz
X&sub1;-X&sub1;-Asn-X&sub1;-Gly (b)
umfaßt, worin X&sub1; für eine hydrophobe Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Val, Ala, Met, Ile und Leu, stromaufwärts der Sequenz (a) ist.
3. Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz (b) stromaufwärts der Sequenz (a) in einer Entfernung von etwa 35 Aminosäureresten sich befindet.
4. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin stromabwärts der Sequenz (a) folgende Aminosäuresequenz
Ile-Ile-Leu-Pro-Asp-Gly-X&sub2;-X&sub2;-X&sub2;-X&sub2;-Phe-Pro-Asn-Arg-Leu (c)
umfaßt.
5. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz (c) stromabwärts der Sequenz (a) in einer Entfernung von etwa 30 Aminosäureresten sich befindet.
6. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin unmittelbar stromaufwärts der Sequenz (a) die folgende Aminosäuresequenz (d)
Asp-Gly-Gly-Ala
umfaßt.
7. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin unmittelbar stromabwärts der Sequenz (a) die folgende Aminosäuresequenz (e)
Ala-Val-Phe-Pro-Phe-Gln-Pro-Gly-Ser-Val-Ala-Glu-Val (e)
umfaßt.
8. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Aminosäureskelett umfaßt, das aus mindestens den folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen besteht: Serin Lysin Glycin Leucin Phenylalanin Asparagin Histidin Prolin Arginin Asparaginsäure Valin Tryptophan Glutamin Threonin
9. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Asparagin Valin Asparaginsäure Alanin Histidin Glycin Threonin Glutamin Prolin Isoleucin Glutaminsäure Lysin
10. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Threonin Asparagin Alanin Prolin Lysin Serin Valin Leucin Asparaginsäure Phenylalanin Histidin Glycin Isoleucin Cystein Glutamin Arginin
11. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Glycin Valin Glutamin Threonin Lysin Asparaginsäure Alanin Histidin Prolin Isoleucin Asparagin
12. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Asparaginsäure Glycin Glutamin Phenylalanin
13. Peptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sein Skelett weiterhin die folgenden Aminosäuren in den folgenden Positionen umfaßt: Alanin Prolin Lysin Serin Valin Leucin Asparaginsäure Glutamin Phenylalanin Arginin Tyrosin
14. Aminosäuresequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die folgenden 129 Aminosäuren umfaßt, die in der gleichen Sequenz des Lectins des Zitteraals vorhanden sind:
15. Aminosäuresequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die folgenden Aminosäuren umfaßt, die in der gleichen Sequenz des Lectins der menschlichen Plazenta vorhanden sind:
16. Aminosäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Aminosäuresequenz nach Anspruch 14 isoliert worden sind und daß sie den folgenden Peptidformeln entsprechen:
17. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine β- Faltblattstruktur besitzt und daß die Faltblätter mindestens in einer Anzahl von 10 an Positionen, die Aminosäurepositionen entsprechen, die den Lectinen verschiedener Ursprünge gemeinsam sind, vorhanden sind.
18. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens zwei Cystein- oder Semicystinreste enthält, die sich an den Positionen 44 und 62 befinden.
19. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein endständiges, am Stickstoff blockiertes Peptid enthält, das aus einer N-Acetyl-Ser-Met-Sequenz besteht.
20. Verfahren zur Reinigung von Lectinen, die β-D-Galactosid binden, nach einem der Ansprüche 1 bis 19 aus Geweben von Vertebraten und insbesondere des Zitteraals und aus menschlichen Organen, wie insbesondere der Plazenta, durch Homogenisierung und Fraktionierung der tierischen Gewebe und anschließende affinitätschromatographische Isolierung mit Hilfe einer Lactosyl-Sepharose-Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionspuffer, der zur Isolierung der Lectine verwendet wird, aus einer Salzlösung mit einem pH von 7,2, gepuffert durch Phosphat, unter Zusatz von Lactose und 2-Mercaptoethanol, besteht.
21. Verfahren zur Bestimmung der Sequenzen - oder der Sequenzabfolge - an Aminosäuren, entsprechend einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid fixieren, nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein automatisches Abbauverfahren durch Phenylisothiocyanat-Kupplung mit dem endständigen Stickstoff des zu sequenzierenden Peptids, Spaltung des aminoterminalen Rests durch Cyclisierung in saurem Milieu und Umwandlung des gebildeten Thiazolinonderivats in ein Phenylthiohydantoinderivat verwendet wird, wobei das Abbauverfahren in Gegenwart von Polybren durchgeführt wird.
22. Verfahren zur Herstellung mittels Synthese von Aminosäuresequenzen, entsprechend einem Teil der Sequenz der Lectine, die das β-D-Galactosid binden, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese durch Durchführen eines Verfahrens, das sich von dem BERGMAN-ZERVAS-Verfahren ableitet, unter Verwendung von Schutzgruppen zum Schutz der reaktiven Funktionen der zu kuppelnden Aminosäuren und von geeigneten Verfahren zur Kupplung, um die geschützten Aminosäuren untereinander zu verbinden, durchgeführt wird, um die nach einem der Ansprüche 1 bis 19 gewünschten Sequenzen zu bilden.
23. Polyclonale Anti-menschliche-Plazenta-Lectin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus Seren bestehen, die aus dem Blut von Tieren, die durch Injektion mit einem Lectin nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und 17 bis 19, das nach Anspruch 20 gereinigt wurde, immunisiert worden sind, erhalten worden sind.
24. Monoclonale Anti-menschliche-Plazenta-Lectin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Clonen bestehen, die von Hybridomen isoliert worden sind, die durch Fusion von geeigneten Tumorzellen, insbesondere SP 2-0 oder NS-1, mit Milzzellen von Mäusen, die gegen das Lectin der menschlichen Plazenta nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und 17 bis 19, das geeigneterweise nach Anspruch 20 gereinigt worden ist, immunisiert worden sind, erhalten worden sind.
25. Mittel zur Diagnose von Tumorbefall, dadurch gekennzeichnet, daß es polyclonale Antikörper nach Anspruch 23 und/oder monoclonale Antikörper nach Anspruch 24 umfaßt.
26. Therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Lectin nach Anspruch 1 oder 7 gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
27. Therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es polyclonale Antikörper nach Anspruch 23 und/oder monoclonale Antikörper nach Anspruch 24 gegebenenfalls zusammen mit Toxinen und/oder Enzymen enthält.
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