DE3873641T2

DE3873641T2 - Arzneimittelemulsion.

Info

Publication number: DE3873641T2
Application number: DE8888305718T
Authority: DE
Inventors: Stanley Stewart Davis; Clive Washington
Original assignee: University of Nottingham
Current assignee: University of Nottingham
Priority date: 1987-06-23
Filing date: 1988-06-22
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2008-06-23
Also published as: AU1957388A; DE3873641D1; ZA884513B; WO1988010116A1; GB8714652D0; EP0296845A1; ATE79262T1; EP0296845B1

Description

Das Antibiotikum Amphotericin B ist bei gewissen infektiösen Zuständen außerordentlich wirksam, insbesondere solchen, welche durch den fungalen Organismus Candida hervorgerufen werden. Die bestehende Therapie erfolgt in Form eines Produkts, das Fungizone genannt wird (eingetragenes Warenzeichen, Squibb), welches aus einer solubilisierten Formulierung von Amphotericin in dem natürlichen oberflächenaktiven Material Natriumdesoxycholat besteht. Dieses Produkt wird von der Squibb Company auf den Markt gebracht. Obwohl es hilfreich bei der Bekämpfung von Candida-Infektionen ist, ist dieses Produkt nicht frei von nachteiligen Reaktionen und Nebeneffekten. Es konnte klar gezeigt werden, daß die Fungizone-Formulierung einen toxischen Effekt haben kann, insbesondere gegenüber der Niere (siehe beispielsweise Reynolds et al (1963), Med. Clin. North American 47 1149-1154). Die antibiotischen Eigenschaften von Amphotericin beruhen auf seiner Bindung an Sterine in Zellmembranen und die anschließende Bildung einer Membranpore. Die Bindung von Ergosterin, dem primären fungalen Sterin, ist stärker als die Bindung von mammalem Sterincholesterin. Die Toxizität von Amphotericin ist jedoch nur selektiv für Pilzzellen und nicht spezifisch; dies ist die Ursache für Nebeneffekte bei Patienten. Es sind alternative Strategien zur Verabreichung von Amphotericin untersucht worden, wobei die Arbeiten, die in Texas von Juliano, Lopez-Berenstein und anderen durchgeführt worden sind, besonders beachtenswert sind (siehe beispielsweise Mehta et Aal (1984), Biochem. Biophys. Acta 770 230-234). Bei diesen Arbeiten wurde eine Liposom-Formulierung (Phospholipid- Bläschen) verwendet, um einen therapeutischen Nutzen zu erzielen. Zu anderen, die auf einer ähnlichen Linie arbeiteten, gehört die Squibb Company mit dem Proliposom- Konzept (siehe beispielsweise Payne et al (1987), J. Pharm. Pharmacol. 39 24-28). Obwohl das liposomale System klinisch nützlich sein mag, ist es gut bekannt, daß Liposome normalerweise schwierig zu präparieren sind und instabil sein können.
Obgleich es möglich ist, Amphotericin-Emulsionssystem durch einfaches Mischen eines kommerziellen Fett-Emulsionsprodukts (Intralipid, (eingetragenes Warenzeichen, Kabi)) mit dem kommerziell solubilisierten System von Amphotericin (Fungizone) herzustellen (vgl. beispielsweise EP-A-202 837), ist dieses System instabil, da es ein Präzipitat des Arzneimittels nach diesem Mischen bildet, wobei es ebenfalls eine geringe Stabilität aufweist, wenn es mehr als wenige Stunden aufbewahrt wird. Das Amphotericin B lagert sich offenbar nicht in die Öl/Wasser-Grenzfläche in den Additiv-Formulierungen ein.
Aus EP-A-215 313 (American Cyanamid) gehen bestimmte Emulsionen hervor, welche bei der Verabreichung an einen Patienten leicht brechen. Das Arzneimittel wird mit einer Ölphase vermischt, bevor Wasser zugesetzt wird, um eine Emulsion zu bilden. Als co-oberflächenaktives Mittel wird Benzylalkohol verwendet. Die Emulsionen brechen nicht nur schnell bei der Verabreichung, sondern sind auch bei der Lagerung nicht sehr stabil.
Aus WO 82/01821 (Chinoin) gehen Formulierungen hervor, bei denen das Arzneimittel als feste Suspension, welche in einer Emuslion dispergiert ist, vorliegt. Die Emulsionen sind wiederum nicht sehr stabil und überwinden nicht das Problem der Toxizität des Arzneimittels. Es sei bemerkt, daß alle diese bisherigen Formulierungen zur topischen Anwendung bestimmt sind.
Aus EP-A-211258 (Abbott) gehen bestimmte Mikroemulsionen hervor, welche sich von den Emulsionen der vorliegenden Erfindung erheblich unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung besteht darin, daß sie eine verbesserte Formulierung für Amphotericin B und andere Arzneimittel, bei denen ähnliche Schwierigkeiten in Erfahrung gebracht worden sind, bereitstellt.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine durch ein oberflächenaktives Mittel stabilisierte Öl-in-Wasser- Emulsion für ein Arzneimittel bereitgestellt, wobei das Arzneimittel sowohl in Öl wie in Wasser schlecht löslich ist, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß wenigstens 50% des Arzneimittels in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels vorliegen.
Die Lokalisierung des Arzneimittels in der Formulierung kann nach bekannten Verfahren festgestellt werden, wie durch Fluoreszenzlöschung, wobei eine geeignete Markierungsverbindung verwendet wird, die dafür bekannt ist, sich in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels zu lokalisieren. Im Falle von Amphotericin B, welches eine intensiv strukturierte Ultraviolett-Absorption im Bereich von 300-400 nm aufweist, stellt Pyren einen geeigneten Markierungsstoff dar. Damit nur ein Löschen in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels zu beobachten ist, kann ein Pyren markiertes Phospholipid verwendet werden, beispielsweise B-(Pyren-1-yl)-decanoyl-gamma-palmitoyl-1-alpha-phosphatidylcholin, welches von Sigma erhältlich ist. Vorzugsweise befinden sich wenigstens 60%, 70%, 80%, 90% oder 99% des Arzneimittels in dem oberflächenaktiven Mittel oder in der Zwischenschicht. Besonders bevorzugt ist im wesentlichen das gesamte Arzneimittel in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels.
Als "schlecht lösliches" Arzneimittel wird ein solches bezeichnet, welches unzureichend löslich ist, um therapeutische Niveaus durch Verabreichung eines herkömmlichen Lösungsvolumens zu erzielen. Bezogen auf eine Infusion einer Arzneimittel haltigen Formulierung würde dies im allgemeinen der Fall sein, daß man weniger als 100 ml der Formulierung pro Stunde, vorzugsweise weniger als 50 ml/h, besonders bevorzugt weniger als 30 oder 10 ml/h zu verabreichen wünscht. Ihrem Kern nach sind die Formulierungen der Erfindung insbesondere für Arzneimittel geeignet, welche nach den Pharmakopöen als "praktisch unlöslich" in Wasser oder Öl eingeteilt werden. Darüberhinaus sollte das Arzneimittel einen ausreichend amphipathischen Charakter besitzen, um in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels zurückgehalten zu werden; ein Material wie Siliciumdioxid ist in Wasser oder Öl unlöslich, aber zugleich nicht ausreichend amphipathisch, um sich selektiv in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels zu lokalisieren. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß eine derartige inerte Verbindung irgendeine pharmakologische Wirkung besitzt. Der Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, durch Routine und nichterfinderische Versuche festzustellen, ob ein Arzneimittel geeignet ist.
Das Arzneimittel kann ein allgemeines Anästhetikum, lokales Anästhetikum, Hypnotikum, Sedativum, Autakoid oder ein Autakoidantagonist (beispielsweise ein Prostaglandin), ein Antibiotikum oder ein antimikrobielles Mittel, ein Antineoplastikum (insbesondere zytotoxische Arzneimittel, wie Methorexate) oder ein Immunosuppresivum sein. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Arzneimitteln sind die Polyen-Antibiotika, einschließlich Tetraenen, wie Nystatin, Pentaenen, wie Aliomycin, Methylpentaenen, wie Filipin, Carbonylpentaenen, wie Mycoticin, Hexaenen, wie Cryptocidin, Carbonylhexaenen, wie Dermostatin, und Heptaenen, wie Amphotericin B. Diese Antibiotika sind im Handel erhältlich oder können auf konventionellem Wege durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise ist das Arzneimittel Amphotericin B, Nystatin oder Filipin, besonders bevorzugt Amphotericin B.
Das oberflächenaktive Mittel kann eine Pluronic (eingetragenes Warenzeichen)-Verbindung, wie Pluronic F68 oder 127, oder Tetronic oder irgendein anderes geeignetes, nichtionisches oberflächenaktives Mittel sein, es ist jedoch vorzugsweise ein Phospholipid, besonders bevorzugt ein Lecithin oder gereinigtes Phosphatidylcholin.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Arzneimittel haltigen Emulsion bereitgestellt, mit den Stufen: (a) gegebenenfalls Lösen des Arzneimittels in einem geeigneten Co-Lösungsmittel, (b) Mischen des Arzneimittels oder einer Lösung davon in dem Co- Lösungsmittel mit einer wäßrigen Präparation eines oberflächenaktiven Mittels, (c) Entfernen zumindest des meisten Co-Lösungsmittels, welches vorliegt, so daß wenigstens 50% des Arzneimittels in dem oberflächenaktiven Mittel vorliegen, (d) Mischen des Produkts der Stufe (c) mit Öl, und (e) Bilden einer Öl-in-Wasser-Emulsion aus dem Produkt der Stufe (d).
Ein wichtiges Merkmal des Verfahrens zur Herstellung der Emulsion dieser Erfindung besteht darin, daß das Arzneimittel in dem oberflächenaktiven Mittel solubilisiert wird, bevor die Emulsion gebildet wird. Die Emulsion kann daher hergestellt werden, indem das Arzneimittel in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wird, die gebildete Lösung mit einer wäßrigen Dispersion oder einer Lösung des oberflächenaktiven Mittels vermischt wird, das meiste oder das gesamte Lösungsmittel verdampft wird und eine Emulsion mit Öl gebildet wird. Falls das Arzneimittel geeignet ist (was Amphotericin nicht ist), kann das Arzneimittel mit der Lösung des oberflächenaktiven Mittels lediglich geschüttelt usw. werden, wobei das Co-Lösungsmittel nicht notwendig sein kann. Ein Co-Lösungsmittel wird vorgezogen.
Das Lösungsmittel (falls verwendet) wird in Bezug auf die Eigenschaften des Arzneimittels ausgewählt, jedoch ist es vorzugsweise leichtflüchtig und bequemerweise ein niedriges Alkanol, ein Äther oder ein Keton, besonders bevorzugt Methanol. Der Ausdruck "leichtflüchtig" wird hier benutzt, um irgendein Lösungsmittel zu beschreiben, welches zufriedenstellend bei der Stufe (c) des Verfahrens bei einer Temperatur verdampft wird, bei welcher nicht das Arzneimittel zerstört oder Wasser verdampft wird. Ein Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von 80ºC oder weniger ist häufig geeignet, jedoch können auch andere geeignet sein, je nach der latenten Wärme zur Verdampfung des Lösungsmittels. Geeigneterweise sollte das Lösungsmittel wenigstens leicht hydrophil sein, so daß eine homogene Lösung/Dispersion in der Stufe (b) des Verfahrens gebildet und irgendwelches Lösungsmittel, welches zurückbleibt, nicht in der Ölphase der endgültigen Emulsion dispergiert wird.
Irgendein pharmazeutisch akzeptierbares Öl kann verwendet werden, beispielsweise Sojabohnen- ode Safloröl oder ein mittelkettiges Triglycerid (wie Miglyol ) oder acetylierte Monoglyceride.
In der endgültigen Emulsion beträgt der Anteil des Öls geeigneterweise 5 bis 50%, bequemerweise 5 bis 30%, vorzugsweise 5 bis 20%.
Das oberflächenaktive Mittel wird in irgendeinem geeigneten Niveau eingesetzt, beispielsweise 0,5 bis 10%, vorzugsweise 1 bis 3%, besonders bevorzugt 1 bis 2%.
Das Niveau des Arzneimittels kann von einem Fachmann so gewählt werden, daß der Dosierungsverlauf usw. stimmt, es beträgt jedoch typischerweise bis zu 1 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,5 mg/ml im Falle von Amphotericin B.
Diese Prozentangaben beziehen sich auf die endgültige Emulsion, wobei der Rest aus Wasser besteht.
Die Emulsion wird normalerweise sterilisiert, beispielsweise durch Filtration oder Wärmebehandlung, um sie zur parenteralen Verabreichung geeignet zu machen, wobei ein Antioxidans, vorzugsweise eine lipophile oder amphiphile Verbindung, wie Tocopherol, vor der Sterilisation zugegeben werden kann.
Die erfindungsgemäßen Emulsionen können topisch, oral, rektal oder durch "Aerosolisation" in die Lungen verabreicht werden, jedoch werden sie üblicherweise parenteral verabreicht, beispielsweise durch kontinuierliche venöse Infusion oder durch Injektion, welche intravenös, subkutan oder intramuskulär sein kann. Andauernde Freigabepräparationen, wie subkutane Depots, können verwendet werden. Die tägliche Dosis wird durch den Fachmann bestimmt, bezogen auf den Patienten, die Krankheit und das Arzneimittel, sie kann jedoch typischerweise 0,10 mg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag sein, bezogen auf das gesamte Körpergewicht.
Im Falle von antifungalen Polyen-Arzneimitteln, wie Amphotericin B, sind die Formulierungen der Erfindung zur Behandlung von Menschen und Tieren geeignet, welche an einer Reihe von fungalen oder Pilzinfektionen leiden, beispielsweise verursacht durch irgendeine Art von Candida (insbesondere C. albicans und C. tropicalis), Torulopsis glabrata und Asperqillus spp. Diese Infektionen sind besonders verbreitet und schwerwiegend bei immungeschwächten Patienten, beispielsweise jenen, welche mit immunosuppressiven Arzneimitteln behandelt worden sind oder solchen, welche am Acquired Immunodeficiency Syndrom (AIDS; akute HIV-Infektion) leiden. Es hat sich herausgestellt, daß Formulierungen nach der vorliegenden Erfindung drei Vorteile aufweisen. Durch die neue Methode der Formulierung ist es erstens möglich, Amphotericin und ähnliche Arzneimittel der oberflächenaktiven Mittel-Schicht einer Öl- in-Wasser-Emulsion einzuverleiben, um eine Arzneimittelbeladung zu erhalten, welche es ermöglicht, das System klinisch zu verwenden. Zweitens wird angenommen, daß das Arzneimittel zurückgehalten wird (höchstwahrscheinlich wird es in die oberflächenaktive Mittelschicht der Emulsion eingebaut), wobei sich herausgestellt hat, daß es bei weitem weniger toxisch gegenüber den roten Blutzellen ist als die im Handel befindlichen Systeme. Drittens ist bei Anwendung geeigneter Bedingungen und Additive gefunden worden, daß es möglich ist, eine sterile Formulierung der Amphotericin-Emulsion durch das Verfahren der Filtration und einer Hitzesterilisation am Ende herzustellen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird nun beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen zeigen:
Fig. 1 die Freisetzung von Hämoglobin von Erythrozyten, welche Zusammensetzungen nach der Erfindung und bekannten Zusammensetzungen ausgesetzt worden sind;
Fig. 2 das Ausmaß der Erythrozytenlyse, welche von dem Aussetzen gegenüber einfachen, solubilisierten Zusammensetzungen herrührt (d. h. nicht nach der Erfindung);
Fig. 3 , die vergleichbar ist mit Fig. 2, die herabgesetzte Zellyse, wenn Emulsionen entsprechend der Erfindung verwendet werden;
Fig. 4 die Langzeitstabilität der Partikelgröße in einer Emulsion nach der Erfindung;
Fig. 5 die Langzeitstabilität des Gehalts an Amphotericin B in einer Emulsion nach der Erfindung; und
Fig. 6 die Zeit des Überlebens einer fungal infizierten Maus, welche mit Zusammensetzungen nach der Erfindung behandelt worden ist.

Beispiel 1: Herstellung des Emulsionssystems

Eine intravenöse Emulsion mit einer Amphotericin-Konzentration von 0,5 mg/ml wurde wie folgt hergestellt:
(Mengen für 100 ml Emulsion)
50 mg Amphotericin B (Sigma), gelöst in 100 ml Methanol.
1,2 g Eiphosphatidylcholin (Lipoid; E80), dispergiert in 90 ml Wasser (Silverson-Mischer).
200 mg Cholesterin, gelöst in 10 ml Sojaöl (für 2% zugesetztes Sterin).
Das methanolische Amphotericin wurde mit der Lecithin-Dispersion gemischt und kurz mit Ultraschall behandelt, um die Vermischung zu unterstützen. Das Gemisch wurde dann auf etwa 20 ml am Rotationsverdampfer eingedampft, um von dem Methanol viel zu verdampfen, und es wurde Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 150 ml zu erhalten. Das Gemisch wurde erneut Ultraschall ausgesetzt (Sonde, 80W, 5 min), um Methanol freizusetzen, das in Lipidbläschen zurückgehalten wird, und erneut auf ein Volumen von etwa 50 ml am Rotationsverdampfer eingedampft. Diese Reihenfolge ist notwendig, um eine maximale Menge des Methanols zu entfernen. Das Produkt wurde mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt, es wurden 10 ml Öl zugesetzt, und das Ganze wurde in einem Heißbad Ultraschall ausgesetzt (Sonde, 50W, 30 min), um die Emulsion zu bilden.
Die Amphotericin-Beladung kann auf 1 mg/ml erhöht werden, indem die Lecithin-Konzentration auf 1,8 g/100 ml Emulsion und 20 ml Sojaöl/100 ml Emulsion erhöht wird.
Es sollte beachtet werden, daß die Amphotericin B-Lösung in Methanol vor der Verwendung vorzugsweise zentrifugiert werden sollte, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und daß das Lecithin/Wasser-System während des Verdampfens zum Schäumen neigt; diese Tendenz verschwindet, wenn das Methanol entfernt ist. Andere Emulgatoren, die den Vorschriften (GRAS- Status) entsprechen, können verwendet werden, um die Emulsion herzustellen. Die Poloxamer- und Poloxamin-Serien (Blockkopolymere von Polyoxyethylen/Polyoxypropylen, erhalten von BASF) können verwendet werden, beispielsweise Poloxamer F68, F127, L92.
Dextran (MG 500000, 1 mg/ml) kann zugesetzt werden, um die geringe Präzipitation zu verhindern, die bei der Behandlung im Autoklaven sichtbar wird. Die Tonizität kann mit einem Mittel eingestellt werden, das die Emulsionsstabilität nicht beeinträchtigt (d. h. ein Nicht-Elektrolyt) und die Solubilität des Amphotericins in der wäßrigen Phase nicht erhöht (nicht eine Polyhydroxy-Flüssigkeit). Eine Aminosäure, wie Glycin oder Alanin, ist eine geeignete Wahl.

Beispiel 2: Herabgesetzte Wechselwirkung gegenüber roten Blutzellen

Die Lyse menschlicher Erythrozyten wurde nach der Methode von Mehta et al a.a.O. gemessen. Das Blut wurde von gesunden männlichen Personen mit einem Alter im Bereich von 19 bis 30 Jahren oder von der lokalen Blutbank erhalten. Es wurde zentrifugiert (5 min bei 2500 g), um die Erythrozyten zu sedimentieren, welche zweimal mit einer isotonischen Salzlösung gewaschen wurden. Beim letzten Waschen trat keine feststellbare Hämoglobinabsorption auf. Das Blut und die gewaschenen Erythrozyten wurden bei 4ºC aufbewahrt und innerhalb einer Woche nach der Entnahme verwendet.
Gewaschene Erythrozyten wurden in einer isotonischen Salzlösung bis zu einer Absorption von 2,0 bei 550 nm suspendiert. Die Amphotericin-Formulierungen wurden zugegeben, um endgültige Amphotericin-Konzentrationen im Bereich von 0-32 ug/ml zu erhalten. Diese wurden durch Wirbeln gemischt und bei 37ºC 20 min inkubiert. Die Reagenz- oder Zentrifugengläser wurden dann 10 min bei 3000 g zentrifugiert und der klare Überstand wurde bei einer Absorption von 550 nm auf Hämoglobin untersucht. Die Gemische, die die Emulsionsformulierung enthielten, zeigten eine erhebliche Tröpfchenstreuung, jedoch konnte das Hämoglobin überprüft werden (UV, 550 nm), wenn um den Faktor 10 verdünnt wurde.
Die Lyse der menschlichen Erythrozyten von drei untersuchten Formulierungen, gemessen anhand der Hämoglobin-Freisetzung, ist in Fig. 1 dargestellt. Sowohl Fungizone wie eine methanolische Lösung von Amphotericin führen zu einer Zellyse bei Amphotericin-Konzentrationen oberhalb 2 ug/ml. Die Lyse ist für beide Formulierungen oberhalb von 12 ug/ml vollständig, da keine intakten Zellen von diesen Lösungen durch Zentrifugieren sedimentiert werden. Methanol allein (2%) führte zu keiner feststellbaren Lyse.
Die Zellen, die mit der Emulsionsformulierung inkubiert worden sind, zeigten keine feststellbare Hämoglobin-Freisetzung. Das Fehlen einer Erythrozytenlyse durch die Amphotericin- Emulsion in vitro deutet darauf hin, daß die Formulierung eine niedrigere Toxizität gegenüber mammalen oder Säugetierzellen besitzt als Fungizone.
Die Emulsionen, die unter Verwendung der Poloxamer-Materialien FI27 und L92 hergestellt worden sind, zeigten ebenfalls eine erheblich herabgesetzte Lyse roter Zellen, verglichen mit dem herkömmlichen Fungizone-System oder solubilisierten Formulierungen, bei denen das Kopolymer allein und Öl verwendet worden ist (Fig. 2 und 3).

Beispiel 3: Die Sterilisationsfähigkeit der Emulsion ohne Verlust der Amphotericin-Wirksamkeit oder Emulsionsstabilität

(a) Filtration

Emulsionen von Amphotericin, hergestellt unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Öl (5 bis 20% Phasen-Volumen und natürlich, z. B. Sojabohnenöl, Safloröl, Triolein, mit, falls erforderlich, zugesetzten Monoglyceriden und acetylierten Monoglyceriden (Myvecet )) und einer Emulgatorkonzentration (Eilecithin 1 bis 10 % oder Blockkopolymer 1 bis 10%) können hergestellt werden, indem ein ultrawirksames Homogenisierungsverfahren verwendet wird, welches auf einem mikrofluidisierenden Apparat (Microfluidics Corporation, USA) basiert. Die sich ergebende kleine Teilchengröße - durschnittlicher Durchmesser weniger als 200 nm - erlaubt es, die Emulsion durch ein Endfilter passieren zu lassen (220 nm), welches das System stabil macht.

(b) Wärmesterilisation

Obgleich Amphotericin B gegenüber Wärme nicht stabil ist, ist es möglich, den Verlust des Arzneimittels durch Ausnutzung des Fo-Konzepts, zusammen mit der Verwendung von bakteriziden Materialien zu minimieren. Das Fo-Konzept ist ein alternativer Weg gegenüber dem klassischen pharmakopöischen Bedingungen zur Sterilisation und basiert auf der Kenntnis der Biobelastung in der Formulierung selbst und jener, die bei der pharmazeutischen Verarbeitung entsteht. Es kann angenommen werden, daß es in einem Herstellungsprozeß möglich ist, presterilisiertes Öl und Emulgator (minimale Biobelastung) zu verwenden. Weiterhin wird bei dem Herstellungsverfahren Amphotericin B Methanol ausgesetzt, und dies sollte ebenfalls zu einer Minimierung der Biobelastung in dem Arzneimittel führen. Aufgrund der o. a. Überlegungen sollte ein Sterilisationsverfahren bei 121ºC für 4 min in Gegenwart von einem Bakterizid ausreichend sein, um eine sterile Emulsionsprobe zu erhalten. Unter diesen Bedingungen zeigte das Amphotericin eine Zersetzung von nicht mehr als 10%. Es wurde festgestellt, daß etwas Amphotericin aus der Emulsion während des Sterilisationsverfahrens bei diesen frühen Versuchen präzipitierte. Dieses Präzipitationsphänomen kann durch sorgfältiges Entfernen des verbliebenen Methanols aus der Emulsionsformulierung eliminiert werden, zusammen mit der Zugabe eines Mittels gegen Kristallkeimbildung, wie Dextran. Eine solche Präzipitation kann zu einer zu großen Bestimmung der Menge des Amphotericins führen, das bei dem Sterilisationsverfahren verloren geht.

Beispiel 4: Langzeitstabilität

Obgleich der Verlust von Amphotericin B während des Erwärmungszyklus von Bedeutung ist, ist der Änderung der Teilchengröße der Emulsion während des Sterilisationsverfahrens und dann der nachfolgenden Langzeitstabilität des Arzneimittels und der physikalischen Stabilität der Emulsion ebenfalls nachgegangen worden. Es wurden UV-Techniken eingesetzt, um dem Arzneimittelverlust nachzugehen. Die Techniken der Photonenkorrelationsspektroskopie und der Laserdefraktometrie wurden eingesetzt, um die Emulsionsteilchengröße zu verfolgen. Weniger als 10% Verlust des Wirkstoffs bei der Lagerung und weniger als 10% Änderung des mittleren Durchmessers innerhalb von wenigstens 10 Wochen wurden festgestellt.

Beispiel 5: Stabilität

In weiteren Tests wurden Emulsionen entsprechend der Erfindung bei 4ºC aufbewahrt. Amphotericin B wurde untersucht, indem die Formulierung in Dimethylsulfoxid verdünnt und die Absorption bei 415 nm gemessen wurde. Die Tröpfchengröße der Emulsion wurde unter Verwendung eines Malvern 2600- Laserdiffraktionsgrößenmeßgeräts gemessen. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieses Größenmeßgerät unempfindlich gegenüber Tröpfchen von weniger als 1 Mikron ist. Dies umfaßt die Mehrheit der Tröpfchen. Das Größenmeßgerät quantifiziert den kleinen Anteil gebildeter großer Tröpfchen durch Koaleszenz und stellt daher einen empfindlichen Indikator für die Emulsionsstabilität dar. Die wahre mittlere Teilchengröße der Emulsion (aufgrund der Photonenkorrelation) beträgt 200 bis 350 nm.
Fig. 4 zeigt die Stabilität der Teilchengrößen und Fig. 5 zeigt die Stabilität des Amphotericin B-Gehalts.

Beispiel 6: In vivo-Aktivität

Männlichen CD-1 Mäusen (25 g) vom Webster-Stamm von den Charles River Laboratorien wurden i. v. mit etwa 1,2 x 10&sup6; Kolonnie bildenden Einheiten von Candida albicans 3153A in Kochsalzlösung zur Bildung einer experimentellen Candidosis injiziert. Dies stellt 8mal die LD50 dar und bei diesem Inokulationsniveau starben 100% der unbehandelten Tiere an einer verbreiteten Injektion innerhalb von 15 bis 20 Tagen nach der Inokulation. Die infizierten Tiere wurden entweder mit der erfindungsgemäßen Formulierung, Fungizone oder einer Virulenzkontrollformulierung behandelt, welche aus einer reinen Emulsion besteht. Willkürliche Gruppen von 10 infizierten Mäusen wurden für jedes Arzneimittelniveau und die Kontrolle verwendet. Die AmB-Präparate wurden mit einer einzigen Injektion i. v. 48 h nach der Infektion verabreicht. Zu dieser Zeit lagen fungale oder Pilz-Läsionen in den Nieren, der Leber und im Gehirn der infizierten Tiere vor. Fungizone wurde in einer Dosis bis zu 4,0 mg/kg verabreicht. Emulsionsassoziiertes AmB wurde in Dosen bis zu 9,0 mg/kg verabreicht. Die überlebenden Tiere wurden täglich aufgeschrieben. Die maximal tolerierte Dosis (MTD) von i. v. injizierten Fungizone betrug 1,0 mg/kg in den infizierten Mäusen. Emulsionsassoziiertes AmB wurde mit der höchsten verabreichten Dosis (9,0 mg/kg) toleriert.
Der Effekt der verschiedenen Formulierungen und Konzentrationen von AmB auf das Überleben der Mäuse, welche eine starke Canidosis besitzen, ist in Fig. 6 dargestellt. 18 Tage nach der Infektion mit C. albicans 3153A und 8 Tage nach der Kontrolle waren Tiere gestorben, wobei die ED50 für Fungizone und die Emulsionsformulierung 0,78 mg/kg bzw. weniger als 0,5 mg/kg betrugen, wobei 80% der Mäuse, welche mit dem Emulsionssystem behandelt worden sind, überlebten, verglichen mit einem Verlust aller Kontrolltiere in 10 Tagen nach der Infektion. Gleich wichtig ist, daß die reduzierte Toxizität der Emulsionsformulierung ((MTD) weniger als 8 mg/kg) es ermöglichte, viel höhere Dosen von AmB zu verwenden, so daß bei Dosen von 8 mg/kg alle Tiere 35 Tage überlebten, verglichen mit einer lediglich 60%-igen Überlebenschance während der ähnlichen Therapie mit den viel niedriger tolerierten Dosen an Fungizone.

Claims

1. Mit einem oberflächenaktiven Mittel stabilisierte Öl-in- Wasser-Emulsion eines Arzneimittels, wobei das Arzneimittel sowohl in Öl wie in Wasser schlecht löslich ist, dadurch gekennzeichnet, daß sich wenigstens 50% des Arzneimittels in der Schicht des oberflächenaktiven Mittels befinden.

2. Emulsion nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ein Polyen-Antibiotikum ist.

3. Emulsion nach Anspruch 2, wobei das Arzneimittel Amphotericin B, Nystatin oder Filipin ist.

4. Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das oberflächenaktive Mittel Lecithin oder gereinigtes Phosphatidyl-cholin ist.

5. Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in der endgültigen Emulsion der Anteil des Öls 5 bis 50% ausmacht.

6. Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei 0,5 bis 10% oberflächenaktives Mittel vorliegen.

7. Verfahren zur Herstellung einer Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Arzneimittel in einer wäßrigen Präparation des oberflächenaktiven Mittels so solubilisiert wird, das wenigstens 50% des Arzneimittels in dem oberflächenaktiven Mittel vorliegen, bevor die Emulsion gebildet wird.

8. Verfahren zur Herstellung einer Arzneimittel-haltigen Emulsion, welches die Schritte umfaßt (a) gegebenenfalls Lösen des Arzneimittels in einem geeigneten Co- Lösungsmittel, (b) Mischen des Arzneimittels oder einer Lösung davon in dem Co-Lösungsmittel mit einer wäßrigen Präparation eines oberflächenaktiven Mittels, Entfernen zumindest des meisten Co-Lösungsmittels, welches vorliegt, so daß wenigstens 50% des Arzneimittels in dem oberflächenaktiven Mittel vorliegen, (d) Mischen des Produkts der Stufe (c) mit Öl, und (e) Bilden einer Öl-in-Wasser-Emulsion aus dem Produkt der Stufe (d).

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das besagte Co- Lösungsmittel verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Co-Lösungsmittel Methanol ist.