DE3787371T2

DE3787371T2 - Biologisch aktives mittel.

Info

Publication number: DE3787371T2
Application number: DE88900205T
Authority: DE
Inventors: H Bradlow; Fred Chasalow
Original assignee: Long Island Jewish Medical Center
Current assignee: Long Island Jewish Medical Center
Priority date: 1986-12-09
Filing date: 1987-12-07
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2007-12-08
Also published as: CA1321141C; EP0297117A1; WO1988004175A1; JPH01501938A; DE3787371D1; EP0297117B1; AU1042188A; AU614071B2; EP0297117A4; JP2527995B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues biologisch aktives Mittel, isoliert aus Zystenflüssigkeit aus der menschlichen weiblichen Brust. Das neue Mittel ist für die Behandlung von Hochdruck in Säugetieren nützlich und kann außerdem verwendet werden, um Vorhofflimmern, idiopathisches Ödem und kongestives Herzversagen in Säugetieren zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues biologisch aktives Mittel, das für die Behandlung von Hochdruck, kongestivem Herzversagen, Vorhofflimmern und idiopathischem Ödem in Säugetieren nützlich ist.
Kongestives Herzversagen ist durch ein unvollständiges Entleeren des Bluts aus dem Herzen während der ventrikulären Kontraktion gekennzeichnet, das zu einer Vergrößerung des Herzens führt. Bei Behandlung mit Wirkstoffen (Herzglykosiden) tritt eine Verringerung der Herzfrequenz auf, die Ventrikel werden vollständiger gefüllt und die Größe des Herzens nimmt ab und beginnt, zum Normalzustand zurückzukehren.
Vorhofflimmern ist ein Zustand, in dem der Vorhof sich viel öfter als die Ventrikel kontrahiert, was dazu führt, daß die tieferen Herzkammern von Impulsen bombardiert werden. Die Ventrikel antworten durch schwache und ineffiziente Kontraktionen. Die Wirkstoffe (Herzglykoside), die zur Behandlung von Vorhofflimmern verwendet werden, unterdrücken diese Leitung, verlangsamen die Frequenz der ventrikulären Kontraktion und helfen, erneut einen synchronen und effektiven Herzschlag zu etablieren.
Digitalis, Digoxin, Ouabain und verwandte Steroidglykoside sind eine Klasse von als kardiotoxische Mittel bekannten Verbindungen, die die Kontraktionskraft des Herzens steigern. Eine Klasse kardiotoxischer Mittel, die Herzglykoside (beispielsweise Digitalis, Digoxin und Ouabain), sind durch einen basischen Cyclopentanperhydrophenanthrenkern gekennzeichnet, an den ein ungesättigter Lactonring am C17 angeheftet ist. Diese Struktur, die ein Aglykon genannt wird, wird mit einem bis vier Zuckermolekülen verbunden. Die pharmakologische Wirkung beruht auf dem Aglykon, aber die Zuckergruppen beeinflussen die Solubilisierungseigenschaften und die Stärke des resultierenden Glykosides.
Die bedeutendsten therapeutischen Verwendungen von Herzglykosid-Wirkstoffen ist die Behandlung von kongestivem Herzversagen und Vorhofflimmern. Wenn Digitalis zur Behandlung von kongestivem Herzversagen verwendet wird, werden die erzeugten vorteilhaften Wirkungen den positiv inotropen (die Muskelkontraktivität beeinflussenden) Wirkungen des Wirkstoffs zugeschrieben. Die größere Kontraktionskraft, die das Ergebnis der Verabreichung des Wirkstoffes ist, steigert die Freisetzung von Blut aus dem Herz, wodurch der kardiale Ausstoß gesteigert und die systemische Zirkulation verbessert werden.
Einer der Nachteile von Digoxin und seinen Verwandten ist ihr niedriger therapeutischer Index. Es gibt nur ein enges Fenster von Konzentrationen, innerhalb derer die Wirkstoffe zur Behandlung von kongestivem Herzversagen oder Vorhofflimmern wirksam sind. Zusätzlich gibt es unzählige nachteilhafte Nebenwirkungen, die aus der Therapie mit Digoxin und verwandten Herzglykosiden resultieren. Diese sind ausführlich in einem Übersichtsartikel von T. W. Smith et al., in Proc. Cardiovas. Dis. 26: 21-56, 1984 dargestellt worden. Die Nebenwirkungen der Digoxin-Therapie umfassen Impotenz, Schwäche und Depressionen. Ein weiterer Nachteil ist, daß einige Patienten auf eine Digoxin-Behandlung nicht reagieren. Weiterhin sind Digoxin und Digitalis nur zur Erniedrigung des Blutdruckes im Patienten wirksam, die zuvor an kongestivem Herzversagen gelitten haben, und sind in normalen hypertensiven Patienten unwirksam. Ouabain wirkt sehr schnell; es hat eine Halbwertzeit von 21 Stunden und wird von den Nieren rasch ausgeschieden. Als Folge davon ist seine Verwendung auf Notfallbehandlungen begrenzt.
Hochdruck ist ein verbreiteter Zustand und gekennzeichnet durch eine Erhöhung des Arterialdruckes, der zu sekundären Organschäden und einer verringerten Lebenserwartung führen könnte. Der Zustand wird derzeit unter Verwendung von vier allgemeinen Wirkstoffklassen behandelt: Diuretika, antiadrenerge Mittel, Vasodilatatoren und Angiotensin-Blockern (Harrison's Principles of Internal Medicine, K. J. Issel Bacher et al., Herausgeber, S. 1172-1176, McGraw-Hill, New York, 1980). Jeder der obengenannten Wirkstoffe erzeugt Nebenwirkungen und ihre Verwendung ist beschränkt. Herzglykoside, die zur Behandlung von kongestivem Herzversagen verwendet werden, sind zur Behandlung von Hochdruck im wesentlichen unwirksam.
Das idiopathische Ödem ist durch periodische Episoden von Ödem oder Wasserretention charakterisiert. Die derzeit verfügbaren Behandlungen sind unspezifisch und umfassen die Verabreichung von Diuretika, beta-adrenergen Blockern, z. B. Propanolol, Bettruhe und Reduktion der Salzaufnahme mit der Nahrung.
Ein neues aktives biologisches Mittel ist unerwarteter Weise aus der Zystenflüssigkeit aus menschlicher Brust abgeleitet worden. Insbesondere von der Flüssigkeit aus Typ l-Zysten der menschlichen weiblichen Brust ist festgestellt worden, daß sie ein biologisch aktives Mittel enthält, das Säugetieren verabreicht werden kann, um ihren Blutdruck zu senken. Das neue biologische Mittel kreuzreagiert mit spezifischen Antikörpern gegen Digoxin, einem gut bekannten Herzglykosid. Überraschenderweise wurde weiterhin festgestellt, daß das neue biologisch aktive Mittel die Aktivität des Enzymes Na&spplus;K&spplus;-ATPase stimuliert, anders als Digoxin und verwandte Herzglykoside. Die Wirkung dieses Enzymes führt zu einem diuretischen Effekt, der für den beobachteten hypotensiven Effekt verantwortlich sein kann.
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues biologisch aktives Mittel bereitzustellen.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues biologisch aktives Mittel bereitzustellen, das aus Zystenflüssigkeit aus der menschlichen weiblichen Brust abgeleitet ist und das die Fähigkeit hat, den Blutdruck in Säugetieren zu senken, und das außerdem verwendet werden kann, um kongestives Herzversagen, Vorhofflimmern und idiopathisches Ödem in Säugetieren zu behandeln.
Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Behandeln von Hochdruck in Säugetieren durch Verabreichen eines biologisch aktiven Mittels, das aus der Flüssigkeit von Zysten der menschlichen weiblichen Brust abgeleitet ist, bereitzustellen.
Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue pharmazeutische Formulierung für die Behandlung von Hochdruck in Säugetieren bereitzustellen, umfassend ein biologisch aktives Mittel, das aus der Flüssigkeit von Zysten der menschlichen weiblichen Brust abgeleitet ist, und pharmazeutisch verträgliche Salze und/oder Träger.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann angesichts der vorliegenden Beschreibung, der sie begleitenden Ansprüche und der dazugehörigen Zeichnungen offensichtlich sein.
Fig. 1 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer Sephasorb HP®-Säule.
Fig. 2 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer Sephadex LH-20®-Säule unter Verwendung von Acetonitril: Wasser (7 : 3) als Elutionsmittel.
Fig. 3 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer zweiten Sephadex LH-20®-Säule unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel.
Fig. 4 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles von einer Sephasorb HP®-Säule eines kreuzreaktiven Materials, das in menschlichem Nabelschnurserum (cord serum) vorhanden ist.
Fig. 5 ist ein Elutionsprofil des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer Sephadex LH-20®-Säule unter Verwendung von Isooktan: Methanol:Ethylacetat (4 : 1 : 1) als Elutionsmittel nach Abbau mit Glusalase®.
Fig. 6 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer Sephadex LH-20®-Säule, unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel.
Fig. 7 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittel von einer Amino-Kohlenhydrat-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Säule, eluiert mit einem Acetonitril: Wasser-Gradienten.
Fig. 8 ist eine Darstellung des Elutionsprofiles des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels von einer zweiten Amino-Kohlenhydrat-HPLC-Säule, eluiert mit einem Acetonitril:Wassergradienten, wobei die Absorption des Mittels bei 210 nm gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisch aktives Mittel, das aus der Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen Brust isoliert worden ist und eine anti-hypertensive Aktivität in Säugetieren hat sowie die Eigenschaft, das Enzym Na&spplus;K&spplus;-ATPase zu stimulieren, wobei das Mittel in einem Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen löslich ist und mit Antikörpern gegen Digoxin immunologisch reaktiv ist.
Das neue Mittel kann außerdem für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von kongestivem Herzversagen, Vorhofflimmern und idiopathischem Ödem in Säugetieren verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reinigen eines aktiven biologischen Faktors zur Verfügung, der aus der Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen weiblichen Brust isoliert wird. Das Reinigungsverfahren umfaßt das Mischen der rohen Flüssigkeit aus Zysten der weiblichen Brust mit Methanol, Ethanol, Isopropanol oder t-Butanol, gefolgt von wiederholten Extraktionen mit Lösungsmitteln abnehmender Polarität. Der extrahierte Faktor wird dann einer sequenziellen Säulenchromatographie unterworfen.
Das erfindungsgemäße neue biologisch aktive Mittel wird aus der Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen weiblichen Brust isoliert.
Kürzlich ist gezeigt worden, daß Flüssigkeit aus den Zysten in der Brust weiblicher Menschen mit einer starken zystischen Erkrankung ein weites Spektrum biologischer Moleküle enthält.
Die Zystenflüssigkeit aus der menschlichen weiblichen Brust kann auf der Grundlage der Elektrolytzusammensetzung in zwei Typen eingeteilt werden. Die Typ 1-Flüssigkeit ist durch hohe Kaliumspiegel und niedrige Spiegel sowohl von Natriumals auch Chloridionen gekennzeichnet, während die Typ 2-Flüssigkeit durch niedrige Kaliumspiegel und hohe Spiegel sowohl von Natrium- als auch Chloridionen gekennzeichnet ist.
Um das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel zu erhalten, wird Zystenflüssigkeit durch Absaugen mit der Nadel aus weiblichen Menschen mit einer starken zystischen Erkrankung der Brust isoliert. Die isolierte Flüssigkeit wird bei -20ºC eingefroren, bis ihre Ionenzusammensetzung analysiert wird. Die Flüssigkeit wird dann aufgetaut und die Ionenzusammensetzung (d. h., die Konzentration an Natrium, Chlorid und Kalium) durch ionenselektive Elektroden unter Verwendung von Standardverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmt. Typ 1-Flüssigkeiten, die definitionsgemäß Kalium- und Chloridkonzentrationen von mehr als 100 meq/l und Natriumkonzentrationen von weniger als 50 meq/l enthalten, werden vereinigt und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert.
Nach der Isolierung und Bestimmung der Ionenzusammensetzung wird das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel unter Verwendung organischer Lösungsmittel gereinigt. Die Brustzystenflüssigkeit wird zunächst durch Zusetzen eines niederen Alkohols, bevorzugt Methanol, fraktioniert, obwohl Ethanol, Isopropanol und t-Butanol ebenso verwendet werden können. Der das biologisch aktive Mittel enthaltende Alkoholüberstand wird weiter durch sequenzielles Zufügen von organischen Lösungsmitteln abnehmender Polarität fraktioniert. Eine bevorzugte Sequenz von Lösungsmitteln ist Acetonitril und Acetonitril: Ethylacetat (1 : 1). Eine große Vielzahl von organischen Lösungsmitteln mit Ionenpolarität kann beim Extraktionsverfahren verwendet werden. Daher sind Methylacetat, Propylacetat, Toluol und Benzol nicht-beschränkende Beispiele von Lösungsmitteln, die als Extraktionsmittel verwendet werden können. Das biologisch aktive Mittel kann an diesem Punkt gelagert werden oder bevorzugt weiter durch Chromatographie unter Verwendung eines Druck-stabilisierten Polydextrans, beispielsweise Sephasorb HP® (Pharmacia, Piscataway, NJ) und zusätzlich auf Sephadex LH-20® (Pharmacia Piscataway, NJ) unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel gereinigt werden.
Ein besonders bevorzugte Reinigungsschema wird durch Bewegen von Flüssigkeit aus Typ 1-Zysten aus menschlicher weiblicher Brust mit Methanol durchgeführt, wobei eine Präzipitation unerwünschter Bestandteile in der Flüssigkeit hervorgerufen wird; das Präzipitat wird verworfen. Der Überstand wird mit Acetonitril behandelt. Dies führt zur Präzipitation weiterer unerwünschter Bestandteile. Nach dem Verwerfen des Präzipitates werden Methanol und Acetonitril unter Verwendung eines herkömmlichen Rotationsverdampfers abgezogen und eine erste wäßrige Phase, die das erfindungsgemäße Mittel enthält, gewonnen. Die erste wäßrige Phase wird weiter mit einer Lösung von Acetonitril-Ethylacetat 1 : 1 extrahiert, und es wird eine organische Phase, die das aktive Mittel enthält, erhalten. Das Acetonitril und Ethylacetat werden aus der organischen Phase entfernt und eine zweite wäßrige Phase, die das Mittel enthält, erhalten. Die zweite wäßrige Phase wird dann lyophilisiert und das Lyophilisat mit Methanol-Wasser (1 : 1) extrahiert. Der Extrakt wird dann einer Chromatographie auf einer Druck-stabilisierten Polydextransäule unterworfen und die das biologisch aktive Mittel enthaltenden Fraktionen gewonnen. Die das aktive Mittel enthaltenden Fraktionen werden durch Testen auf die Immunreaktivität mit Antikörpern gegen Dioxin, wie unten beschrieben, identifiziert. Vom erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittel ist festgestellt worden, daß es mit solchen Antikörpern immunreaktiv ist.
Die Methanol-Wasser-Mischung wird dann aus den das Mittel enthaltenden Fraktionen entfernt.
Das erfindungsgemäße aktive Mittel kann an diesem Punkt verabreicht werden oder bevorzugt zunächst weiter durch Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex LH-20®-Säule gereinigt werden. Ein besonders bevorzugtes Schema würde eine alternative sequenzielle Chromatographie umfassen, in der Sephasorb HP®- und Sephadex H-20®-Säulen verwendet werden. Die Sequenz wäre Sephasorb HP®, Sephadex LH-20® unter Verwendung von Acetonitril:Wasser (7 : 3) als Elutionsmittel, Sephasorb HP® und Sephadex LH-20® unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel.
Alternativ kann das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel aus Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen weiblichen Brust unter Verwendung des folgenden, bequemeren Verfahrens extrahiert und gereinigt werden. Nach Bestimmung ihrer Ionenzusammensetzung wird die Flüssigkeit aus Typ 1-Zysten der menschlichen Brust direkt durch zweifaches aufeinanderfolgendes Zusetzen von organischen Lösungsmitteln abnehmender ionischer Polarität, wie oben beschrieben, fraktioniert. Dieses Verfahren umgeht jedoch den oben beschriebene Extraktionsschritt mit niederem Alkohol. Das so fraktionierte Mittel wird dann einer sequenziellen Chromatographie unter Verwendung von hydrophober Affinitätschromatographie (e.g., Sephadex LH-20®) und anschließend einer Amino-Kohlenhydrat- Säule unterworfen. Dieses rationalisierte Extraktions- und Reinigungsverfahren wird in Beispiel 5, unten, veranschaulicht.
Die Vorteile der Verwendung der oben beschriebenen Fraktionierungs- und chromatographischen Reinigungsverfahren sind die folgenden: Bequemlichkeit, Geschwindigkeit (die gesamte Reinigung kann in 1 bis 2 Tagen durchgeführt werden) Einfachheit (nur 2 Säulenschritte anstelle von 3 oder 4) und erhöhte Reinheit des Endproduktes. Letzteres wird durch die Tatsache bewiesen, daß in Fig. 8 nur ein Peak von lichtabsorbierendem Material bei 210 nm nachgewiesen wurde, wenn diese Fraktion einer erneuten chromatographischen Analyse unterworfen wurde. Die Fähigkeit, Licht bei 210 nm zu absorbieren, stellt ein anderes Merkmal des erfindungsgemäßen aktiven Mittels zusätzlich zur Fähigkeit, an Digoxin-Antikörper zu binden, wie unten erklärt wird, bereit.
Das erfindungsgemäße aktive Mittel kann aufgrund seiner Fähigkeit zur Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen Digoxin nachgewiesen werden. Solche Antikörper sind von New England Nuclear, Boston, MA (Katalog Nr. A082) kommerziell erhältlich. Alternativ können von Clinical Assays, Cambridge, MA (Katalog Nr. 527) erhaltene Antikörper gegen Digoxin verwendet werden, um auf die Gegenwart des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels zu testen.
Der Test auf das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel wird durch Zuführen einer abgemessenen Menge des Antikörpers und radioaktiv markierten Digoxins an eine unbekannte Lösung durchgeführt. Nach Verstreichenlassen einer für die Bindung des Antikörpers ausreichenden Zeit werden gebundene und nicht gebundene Materialien durch Zentrifugation getrennt. Die Gegenwart des Mittels in einer unbekannten Lösung wird in der gebundenen Fraktion unter Verwendung eines Scintillationszählers nachgewiesen. Die Menge des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels wird als ng-Digoxin-Äquivalente ausgedrückt. Ein 1 ng-Digoxin-Äquivalent stellt die Menge des biologisch aktiven Mittels dar, die in diesem Test erforderlich ist, um eine mit einem ng-Standard-Digoxin erhältliche Antwort zu erzeugen. Eine genaue Beschreibung dieses Tests wird unten im Beispiel 2 gegeben.
Das erfindungsgemäße biologische Mittel weist Eigenschaften auf (beispielsweise chromatographisches Verhalten und Abbauprodukte), die nahelegen, daß es ein Steroidkonjugat ist.
Das aus Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der Brust erhaltene biologisch aktive Mittel ist an Säugetiere verabreicht worden und hat einen dramatischen Effekt auf die Senkung von deren Blutdruck gehabt. Nach Verabreichen des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels ist eine Senkung des Blutdrucks gesunder Säugetiere von bis zu fünfundvierzig Prozent (45%) im Vergleich mit den Anfangs- (vor der Verabreichung festgestellten) Blutdruckspiegeln festgestellt worden.
Das gereinigte erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel weist einzigartige und unerwartete Eigenschaften auf. Das Mittel stimuliert das Enzym Na&spplus;K&spplus;-ATPase, während die Herzglykoside Digoxin und Digitalis die Aktivität dieses Enzymes inhibieren. Das Enzym Na&spplus;K&spplus;-ATPase hat eine milde diuretische Wirkung, die für den Patienten in bezug auf hypotensive Aktivität signifikant sein kann. Daher kann das aus Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen weiblichen Brust isolierte aktive Mittel an Säugetiere zur Behandlung von Zuständen verabreicht werden, in denen das Natriumgleichgewicht gestört ist, z. B. bei idiopathischem Ödem.
Zusätzlich wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel die Bindung von Ouabain an seinen zellulären Rezeptor stimuliert (unten im Beispiel 6 gezeigt). Dies ist der am meisten unerwartete Effekt des biologisch aktiven Mittels auf das Na&spplus;K&spplus;-ATPase-System. Da da erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel die Aktivität der Na&spplus;K&spplus;-ATPase stimuliert, wurde erwartet, daß es die Bindung von Ouabain an seinen Rezeptor inhibiert. Unerwarteterweise erhöht jedoch das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel die Menge von Ouabain, die an seinen Rezeptor bindet. Den Erfindern ist keine andere Substanz, die diese Eigenschaft aufweist, bekannt.
Das aus Flüssigkeit von Typ 1-Zysten der menschlichen weiblichen Brust isolierte Mittel ist ein endogener hypotensiver Faktor. Infolge dieser Eigenschaften wird angenommen, daß dieser Typ Substanz nicht nur bei der Behandlung von Erkrankungen, bei denen derzeit Digitalis oder Digoxin oder Ouabain verwendet werden, sondern auch als ein allgemeines anti-hypertensives Mittel nützlich sein wird. Zusätzlich wird vorhergesehen, daß das erfindungsgemäße Mittel, in Kombination mit Ouabain verwendet, die Wirksamkeit von Ouabain und daher dessen Nutzen erhöhen wird.
Für die Behandlung von Säugetieren, die von erhöhtem Blutdruck betroffen sind, mit dem biologisch aktiven Mittel hängt die effektive Dosis der erfindungsgemäßen Verbindungen von der Schwere des Zustandes, dem Stadium und den individuellen Merkmalen jedes behandelten Säugetieres ab. Für die Behandlung von Hochdruck, kongestivem Herzversagen oder Vorhofflimmern in einem Säugetier wird angenommen, daß die Zusammensetzungen im allgemeinen in einem Dosisbereich von 10 ng Digoxin-Äqulvalenten bis 1000 ng Digoxin-Äquivalenten pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Ähnliche Dosen und Schemata werden für die Behandlung idiopathischer Ödeme und anderer durch ein Natriumungleichgewicht gekennzeichneter Erkrankungen verwendet werden.
Das erfindungsgemäße neue Mittel kann über den parenteralen Weg verabreichtwerden (was bevorzugt ist), aber kann ebenso oral, intranasal oder durch transdermale Flecken in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die mit gut bekannten Verfahren hergestellt werden, verabreicht werden. Beispiele einer parenteralen Dosierungsform umfassen wäßrige Lösungen des aktiven Mittels in isotonischer Kochsalzlösung, 5% Glukose oder anderen gut bekannten pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeiten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können so formuliert werden, daß sie für die orale Verabreichung geeignet sind. Der aktive Bestandteil ist in einer Kapsel (in flüssiger Form) oder Tablette enthalten. Die durch jede Kapsel oder Tablette zur Verfügung gestellte Menge der effektiven Dosis ist relativ unwichtig, da die Gesamtdosis durch Verabreichen von entweder einer oder einer Vielzahl von Kapseln oder Tabletten oder beidem erreicht werden kann. Die verwendeten Kapseln können jedes gut bekannte pharmazeutisch verträgliche Material umfassen, beispielsweise Gelatine, Cellulosederivate, etc. Jede Kapsel enthält eine entsprechende Menge des biologisch aktiven Mittels, gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel, umfassend z. B. Polylethylenglykol USP, Ethylenglykol USP, Ethylalkohol USP, gereinigtes Wasser USP und Mischungen daraus. Die Tabletten können im Einklang mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von festen Trägern, Gleitmitteln, etc., die gut bekannt sind, formuliert werden. Beispiele von festen Trägern sind Stärke, Zucker, Bentonit und andere weithin verwendete Träger. Das erfindungsgemäße biologische Mittel kann außerdem getrocknet und in Form einer Tablette mit harter Schale oder einer Kapsel, die beispielsweise Lactose oder Mannitol als ein Bindemittel enthält, und herkömmlichen Füllmitteln und Mitteln für Tabletten verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen Beispielen werden Verfahren für die Extraktion, Reinigung, Charakterisierung und Verwendung des endogenen biologisch aktiven Mittels dargestellt.

Beispiel 1:

Isolierung des biologisch aktiven Mittels aus der Flüssigkeit von Zysten der menschlichen weiblichen Brust

Schritt 1: Extraktion

250 ml Methanol wurden 250 ml Typ 1-Flüssigkeit aus menschlicher weiblicher Brust hinzugefügt, die durch Nadelbiopsie aus Frauen mit einer schweren zystischen Erkrankung der Brust erhalten worden waren. Die Mischung wurde bei 16000 · g zentrifugiert, um denaturierte Proteine und anderes unlösliches Material zu entfernen. Das Präzipitat wurde verworfen. Der verbleibende Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (500 ml) Acetonitril gemischt, 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und zentrifugiert, um denaturierte und unlösliche Materialien zu entfernen. Der Niederschlag wurde verworfen. Acetonitril und Methanol wurden unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer (Buchler, Fort Lee, NJ) mit einem Wasserbad bei 40ºC entfernt. Die wäßrige Phase (200 ml) wurde mit einer Mischung von 200 ml Acetonitril und 200 ml Ethylacetat erneut extrahiert. Die untere wäßrige Phase wurde verworfen und die organische Phase wie oben unter Vakuum entfernt. Das verbleibende Wasser (63 ml) wurde aus dem Extrakt durch Lyophilisieren entfernt. Das feste Material wurde mit 10 ml Methanol/Wasser (1 : 1) extrahiert und jedes unlösliche Material wie oben durch Zentrifugieren eliminiert.
Der Endextrakt wurde im Serumröhrchen gestellt und die Lösungsmittel Methanol und Wasser unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur entfernt. Das Endprodukt (K3) enthielt 1800 ng Digoxin-Äquivalente des biologisch aktiven Mittels, was 7,2 ng Digoxin-Äquivalente in der ursprünglich gesammelten Probe gleichwertig war.

Schritt 2: Chromatographie auf Sephasorb HP®

Der Endextrakt aus Schritt 1 wurde auf Sephasorb HP® (Pharmacia, Piscataway, NJ) mit einer SR-25-Säule (2,5 cm weit · 30 cm hoch) chromatographiert. Die auf die Säule aufgetragene Lösungsmittelmischung war Methanol:Wasser (1 : 1). Die Säule wurde in einem aufwärts fließenden Modus (200 ml/h) mit einer WIZ Modell P-Pumpe (ISCO, Lincoln, NB) eluiert. Sechzig Fraktionen von jeweils 4 ml wurden gesammelt. Die Proben wurden über eine 1,8 ml Probenschlaufe, die über zwei Vier-Wegeventile (SRV-4, Pharmacia, Piscatawayk, NJ) erzeugt wurde, aufgetragen. Bei diesen Verfahren waren alle in Kontakt mit dem Lösungsmittelstrom stehenden Materialien entweder rostfreier Stahl, Teflon oder Borsilikatglas, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Der wie in Schritt 1, oben, hergestellte Endextrakt lag in einem Gesamtvolumen von 9 ml vor und wurde in fünf Portionen chromatographiert. Aliquots der Chromatographie-Fraktionen wurden mit von New England Nuclear (Boston, MA) erhaltenden Reagenzien auf Digoxin-Immunreaktivität getestet, wie unten im Beispiel 2 beschrieben, wobei die Anweisungen des Herstellers beachtet wurden, mit der Ausnahme, daß sowohl 0,2 ml des Antikörpers als auch des Indikators anstelle von 0,5 ml verwendet wurden. Dies wurde getan, um die Empfindlichkeit des Testes zu steigern. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Vier Peaks mit Aktivität wurden unter Verwendung dieser Säule aufgelöst. Dies sollte mit Fig. 4 verglichen werden, die das Verhalten von Material, das aus menschlichem (Nabel)Schnurserum (cord serum) isoliert worden ist, zeigt, wobei dieses Material mit Digoxin-Antikörpern kreuzreagiert, jedoch keine hypotensiven Aktivitäten besitzt. In dem Bereich des Chromatogramms, in dem der Peak des biologisch aktiven Mittels der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurde, wurde sehr wenig der aus dem Nabelschnurserum isolierten Aktivität gefunden, wenn eine Sephasorb HP-Säule unter identischen Bedingungen verwendet wurde.
Die den immunreaktiven Peaks (K3A, K3B, K3C und K3D) entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, die Lösungsmittel unter Vakuum und Wasser durch Lyophilisieren entfernt.

Schritt 3: Chromatographie von K3B auf Sephadex LH-20® mit Acetonitril: Wasser (7 : 3)

Der Peak K3B (Fraktionen 23-26), der in Schritt 2 erhalten wurde, wurde auf Sephadex LH-20® mit einer Lösungsmittelmischung, die aus Acetonitril:Wasser (7 : 3) bestand, chromatographiert. Die Säule (1,9 cm weit · 30 cm hoch) wurde mit Schwerkraft eluiert und 40 Fraktionen von je 2,7 ml wurden gesammelt. Die Proben (5 ml) wurden direkt auf das Säulenbett aufgetragen. Es wurde dann weiteres Lösungsmittel aufgetragen, bis die aktiven Fraktionen eluiert waren. Die Menge biologisch aktiven Mittels wurde in jeder Fraktion unter Verwendung des oben beschriebenen Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Das Mittel wurde in den Fraktionen 16-22 gefunden. Die Fraktionen 16-22 wurden vereinigt, bis zur Trockenheit lyophilisiert und auf Sephasorb HP® rechromatographiert. Der Aktivitätspeak wurde in den Fraktionen 22-26 gefunden, was die reproduzierbare Natur des Verhaltens dieses Materials demonstriert (zuvor bildete das Mittel auf dieser Säule einen Peak in den Fraktionen 23-26).

Schritt 4: Chromatographie auf Sephadex LH-20® mit einem Elutionsmittel aus Methanol

Die Fraktionen 22-26, isoliert aus der zweiten Sephasorb HP®-Säule, wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls, das für Schritt 3 verwendet wurde, chromatographiert, mit der Ausnahme, daß für den Elutionsschritt Methanol verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt, wo das Mittel in den Fraktionen 19-22 eluiert wurde. Jeder Peak wurde getrennt gesammelt und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Jeder Peak wurde in 2 ml Wasser erneut aufgelöst und für die Lagerung bis zur Trockenheit lyophilisiert.

Beispiel 2

Test zum Bestimmen der Digoxin-Immunreaktivität

Die Gegenwart des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels wird durch seine Fähigkeit zur Reaktion mit Digoxin-Antikörpern nachgewiesen. Ein typischer Test wird wie folgt durchgeführt. Standardlösungen, die bekannte Mengen von Digoxin enthalten, wurden durch Verdünnen von Standards, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt worden waren (New England Nuclear, Boston, MA, Katalog Nr. A082), hergestellt. Die Standardkurven wurden durch Zufügen von 0,1 ml der Standardlösungen, die 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 und 2,0 ng/ml Digoxin enthielten, zu 12 · 75 mm Borsilikatkulturröhrchen (Fisher Scientific Co.) und Durchführen von Tests, wie unten beschrieben, hergestellt.
Unbekannte Proben wurden in 12 · 75 mm Kulturröhrchen pipettiert und bis zur Trockenheit unter einem Stickstoffstrom verdampft. Jedem Röhrchen wurden 0,2 ml eines ¹²&sup5;J-markierten Digoxin-Indikators und 0,2 ml Digoxin-Antikörper zugesetzt. Die Röhrchen wurden mit einem Vortex-Gerät durchgemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Anschließend wurden die Röhrchen 30 Minuten bei 2600 · g bei 4ºC zentrifugiert, auf Schaumdekantierungsgestelle (foam decanting racks) (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) überführt und dekantiert. Jedes Röhrchen wurde geblottet und die Menge von ¹²&sup5;J unter Verwendung eines γ-Zählers (Modell 1275 Mini-gamma, LKB, Gaithersburg, MD) bestimmt. Individuelle Digoxin-Werte wurden durch Interpolation gegen die zum gleichen Zeitpunkt erhaltene Standardkurve bestimmt, wobei ein "smooth line best fit"-Programm von LKB verwendet wurde, und als ng Digoxin-Äquivalente, wie oben beschrieben, ausgedrückt.

Beispiel 3

Tests für das endogene biologisch aktive Mittel

In allen Experimenten wurden Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 270-305 g verwendet. Vier Ratten wurden mit einer einzelnen intraperitonealen Injektion von Pentobarbital, 30-40 mg/kg Körpergewicht, betäubt. In die rechte Carotisarterie, linke externe Jugularvene und die Blase wurden Polyethylenkatheter eingeführt.
Nach Abschluß des chirurgischen Verfahrens wurde den Tieren eine Anfangsinjektion von 0,15 M NaCl-Lösung, entsprechend 0,5% Körpergewicht, verabreicht. Um die Nierenfunktion zu verfolgen, wurde eine Infusion von 0,15 M NaCl-Lösung mit 0,045/min, die ¹&sup4;C-Inulin und ³H-PAH (para-Aminohippursäure) (New England Nuclear, Boston, MA) enthielt, in Mengen begonnen, die so berechnet waren, daß 5 uCi pro Stunde bzw. 10 uCi pro Stunde der beiden radioaktiven Isotope bereitgestellt wurden. Nach einem Equilibrierungszeitraum von 40-50 Minuten wurde das Experiment gestartet.
Der intra-arterielle Blutdruck wurde unter Verwendung eines Transducers und einer Physiographie mit 8 Kanälen (Beckman, Palo Alto, CA) aufgezeichnet. Die Druckanzeige wurde unter Verwendung eines manuellen Sphygmomanometers kalibriert. Die Hämatokrit-Werte wurden mit Routineverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gemessen. Die Aktivität von ¹&sup4;C-Inulin und ³H-PAH im Plasma und Urin wurden unter Verwendung eines β-Scintillationszählers (Rackbeta, LKB Instruments, Gaithersburg, MD) gemessen. Die Plasmaelektrolyte wurden unter Verwendung eines Flammenphotometers (Klinaflame, Beckman Instruments, Palo Alto, CA) gemessen. Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) und der renale Blutfluß wurden aus der ¹&sup4;C-Inulin- bzw. ³H-PAH-Clearance unter Verwendung von Standardgleichungen berechnet.
In der ersten Untersuchung wurde ein 1% Aliquot eines 25-fachen Konzentrates (17 ng Digoxin-Äquivalentes), das aus einer Flüssigkeit aus Typ 1-Zysten aus menschlicher weiblicher Brust mit hohem Kaliumgehalt erhalten wurde (K3, oben), in 1 ml 0,15 M NaCl gelöst, und dieses Gesamtvolumen wurde intravenös injiziert. In der zweiten und dritten Untersuchung wurde ein zweites 1% Aliquot, das aus einer Flüssigkeit aus Typ 1-Zysten aus menschlicher weiblicher Brust mit hohem Kaliumgehalt erhalten worden war (K3), in 2 ml 0,15 M NaCl gelöst und 1 ml wurde verabreicht (8,5 ng Digoxin- Äquivalente). In der vierten Untersuchung wurde das in Schritt 4, oben, erhaltene Material (Fraktion 19-22, K3B), das ein 100-faches Konzentrat der ursprünglich aus der Brustzyste aspirierten Flüssigkeit darstellte, in 1 ml 0,15 M NaCl gelöst und 0,2 ml wurden injiziert (entsprechend 13,5 ng Digoxin-Äquivalente).
Der Blutdruck wurde kontinuierlich über die Dauer der Untersuchung aufgezeichnet. Alle 30 Minuten wurden Blutproben von 0,3 ml Volumen entnommen und durch ein gleiches Volumen Kochsalzlösung ersetzt. Eine adäquate Urinableitung wurde nur in der ersten Untersuchung erfolgreich beibehalten; technische Probleme verhinderten die Messungen der renalen Funktionen in den letzten drei Experimenten.
Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 Untersuchung Nr. injiziertes Material injiziertes Volumen anfänglicher Blutdruck niedrigster Blutdruck Zeit (min) bis zur maximalen Antwort Hämatokrit am Anfang Ende 25-faches Konzentrat der rohen Zystenflüssigkeit (K3), gelöst in 1,0 ml * Die GFR stieg von 0,18 ml/min während des Aufzeichnungszeitraums auf 0,28 ml/min nach Verabreichung. ** Endplasmawerte; Na&spplus; 141 mmol/1, K&spplus; 5,4 mmol/1
In jeder Untersuchung, in der ein Tier das biologisch aktive Mittel erhielt, gab es eine signifikante Abnahme des Blutdruckes, die im Experiment 1 irreversibel war (was zum Tod (expiration) des Testtieres führte), und partiell reversibel in den Experimenten 2 und 3. Im Experiment 3 war der Abfall des Blutdruckes innerhalb von 15 Minuten maximal; dem folgte eine graduelle Rückkehr zum Grundlinienblutdruckwert über 20-40 Minuten. Beim Hämatokrit gab es eine konsistente Abnahme, so daß die Schlußbestimmung 51, 69, 57 bzw. 58% der Anfangswerte in den vier Versuchssubjekten entsprach. Der Grund für diesen Abfall des Hämatokrites ist unbekannt. Wenn jedoch die Zellen gezählt wurden, gab es keine Abnahme in der tatsächlichen Anzahl der Zellen (der Hämatokrit beruht auf dem Volumen und nicht der Anzahl der Zellen).
Im Tier 1, dem einzigen Tier, für das die glomeruläre Filtration (GFR) bestimmt werden konnte, betrug der einzige Nierenwert 0,18 ml/min vor der Injektion des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels. Er stieg auf 0,32 und 0,24 ml/min in den beiden Urinsammlungen, die nach Verabreichen des biologisch aktiven Mittels vervollständigt wurden. Die Plasma-Natrium- und Kaliumkonzentration ergab nach Vervollständigung des vierten Experimentes, in dem die Tiere das höchstgereinigte Material erhielten, 141 und 5,4 mmol/l, was normale Werte sind.
Zusätzlich wurde einem Tier eine hochgereinigte Fraktion, die als Endextrakt aus Schritt 4, oben, erhalten wurde, verabreicht. Das befolgte Protokoll war identisch den in Tabelle 1 dargestellten Untersuchungen. Die Daten sind in Tabelle 2, unten, gezeigt. TABELLE 2 Untersuchung Nr. injiziertes Material injiziertes Volumen anfänglicher Blutdruck niedrigster Blutdruck Zeit (min) bis zur maximalen Antwort Hämatokrit am Anfang Ende * nicht durchgeführt
In dieser Untersuchung wurde die am höchsten gereinigte Fraktion aus Schritt 4, oben, verwendet. Das Verabreichen dieses Materials führte zu einem schnellen Abfall des Blutdruckes, wie auch mit den weniger gereinigten Proben beobachtet worden war. Dem gleichen Tier wurde darüber hinaus eine zweite Dosis des aktiven biologischen Mittels (5', Tabelle 2) verabreicht, die 160 pg Digoxin-Äquivalenten entspricht. Dies führte zu einer weiteren Erniedrigung des Blutdruckes.
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß die Verabreichung des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Mittels an Säugetiere zu einer prompten Senkung der Blutdruckwerte führt. Aus diesen Experimenten ist es klar, daß das erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel gut als ein anti-hypertensives Mittel (d. h., ein hypotensives Mittel) wirkt.

Beispiel 4

Verhalten eines von Brustzystenflüssigkeit abgeleiteten Mittels nach Behandlung mit Glusalase®

Ein Teil der Probe K3B (aus Beispiel 1) wurde mit Glusalase®, einem Extrakt aus der Schnecke Helix pomatia (Endo Laboratories, Garden City, NY), der eine Mischung aus Sulfatasen und Glucuronidasen enthält, behandelt. Während die Proben vor der Behandlung nicht mit Ethylacetat aus Wasser extrahiert werden konnten, extrahierte Ethylacetat das Mittel nach dem enzymatischen Abbau aus Wasser. Die Proben haben daher die Eigenschaften von Steroidkonjugaten, die Sulfate und/oder Glucuronsäure enthalten.
Die Glusalase®-abgebauten Proben wurden erneut auf Sephasorb HP®, wie oben, chromatographiert, mit der Ausnahme, daß die Proben unter Verwendung von Isooctan: Methanol:Ethylacetat (4 : 1 : 1) als Elutionsmittel eluiert wurden, und Aliquots jeder Fraktion wurden mit einem Digoxin-Radioimmuntest, wie oben beschrieben, getestet. Die Daten sind in Fig. 5 gezeigt. Das Mittel eluierte nach Abbau mit Glusalase® früher als nicht abgebautes Material (vgl. mit Fig. 1). Dies ist konsistent mit den obigen Extraktionsdaten, die zeigen, daß das biologisch aktive erfindungsgemäße Mittel ein Steroidkonjugat ist.
Hydrolyse veränderte die Menge des biologisch aktiven Mittels (nachgewiesen durch Digoxin-Immuntests), das in diesen Fraktionen vorhanden war, nicht. Dies impliziert, daß weder die Natur des Konjugates noch seine Gegenwart oder Abwesenheit den Test beeinflußt.
Die Erfindung ist oben im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden.

Beispiel 5

Rationalisiertes Extraktions- und Reinigungsverfahren

100 ml gesammelte Typ 1-Flüssigkeit wurden mit einem gleichen Volumen Acetonitril gemischt und unlösliches Material durch Zentrifugation entfernt. Der Extrakt (Überstand) wurde mit einem gleichen Volumen Ethylacetat gemischt und in einem Scheidetrichter in zwei Phasen getrennt. Die untere, wäßrige Phase wurde verworfen. Die flüchtigen Lösungsmittel wurden aus der oberen Phase mit einem herkömmlichen Rotationsverdampfer (Buchler, Fort Lee, NJ) unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt und die verbleibende Flüssigkeit durch Lyophilisation eliminiert.
Das Lyophilisat wurde mit Methanol (5-10 ml) extrahiert und auf eine Sephadex LH-20®-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) (1,9 · 30 cm), die im gleichen Lösungsmittel hergestellt worden war, aufgetragen. Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt und Aliquots bis zur Trockenheit eingedampft und wie oben beschrieben, auf Digoxin-Äquivalente getestet. Dies ist in Fig. 6 gezeigt. Die Fraktionen 11-14, die das biologisch aktive Mittel enthielten, wurden gesammelt und unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur bis zur Trockenheit verdampft.
Das biologisch aktive Mittel wurde weiter über eine HPLC-Säule (LKB, Gaithersburg, MD) unter Verwendung einer Amino-Kohlenhydrat-Säule (Alltech, Chicago, IL) gereinigt. Die Säule wurde mit einem 20 Minuten-Gradienten, beginnend mit 95% Acetonitril: 5% Wasser bis zu 55% Acetonitril: 45% Wasser, eluiert. Alternativ hätte ein isokratisches Elutionsschema (d. h., Elution bei konstanter Konzentration oder ohne Gradienten), das das gleiche Acetonitril: Wasserkonzentrationsverhältnis verwendete, oder eine Mischung aus Methanol und Wasser (entweder in einem Gradienten oder isokratisch) verwendet werden können. Die Säulenfraktionen (jeweils 0,5 ml, 1 Fraktion pro Minute) wurden gesammelt, wie in Fig. 7 gezeigt, und es wurde festgestellt, daß die Fraktionen 19 und 20 das biologisch aktive Mittel enthielten. Diese Fraktionen wurden erneut in eine HPLC-Säule injiziert, wobei das gleiche Absorptionsmittel (Amino-Kohlenhydrat) verwendet wurde. Ein repräsentatives Chromatogramm des von der zweiten Amino-Kohlenhydratsäule gewonnenen biologisch aktiven Mittels ist in Fig. 8 gezeigt. Fraktion 22 enthielt das gereinigte biologisch aktive Mittel.

Beispiel 6

Stimulation der Ouabain-Bindung an den Ouabain-Rezeptor durch das biologisch aktive Mittel

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben unerwarteter Weise auch entdeckt, daß das erfindungsgemäße gereinigte biologisch aktive Mittel die Fähigkeit zur Stimulation der Bindung von Ouabain an den auf der Zelloberfläche angeordneten Ouabain-Rezeptor hat. Dies war eine höchst überraschende Feststellung insofern, als daß erfindungsgemäße biologisch aktive Mittel das zelluläre Enzym Na&spplus;, K&spplus;-ATPase-Enzym stimuliert, während von Ouabain bekannt ist, daß es dieses Enzym inhibiert.
Dies wurde wie folgt gezeigt. Rinderniere wurde in 0,25 M Saccharose (3 : 1 Volumen:Gewicht) in einem Waring-Mixgerät homogenisiert und einer differentiellen Zentrifugation unterworfen, wobei ein GSA-Rotor (Dupont Sorval, Wilmington, DE) bei 7000 · g und ein SA-600-Rotor (Dupont Sorval, Wilmington, Delaware) bei 38000 · g jeweils 30 Minuten verwendet wurden. Die resultierende grobe mikrosomale Präparation wurde in Puffer 1 (Puffer 1 = 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 0,25 mM Na&sub2;EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, pH = 7,4) resuspendiert, dem 20% Glycerin (in einem Verhältnis von 1 ml zu 3 g Frischgewicht der Rinderniere) zugefügt worden war, und als Quelle für den Ouabain-Rezeptor verwendet. Die Ouabain-Bindung an seinen Rezeptor wurde durch Inkubieren von ³H-Ouabain (New England Nuclear, Boston, MA) in Puffer 1, dem 0,5 mM ATP zugesetzt worden waren, gemessen. Dann wurden Aliquots des biologisch aktiven Mittels, das bei Raumtemperatur unter einem Strom von Stickstoffgas zur Trockenheit verdampft worden war und in Puffer 1 erneut aufgelöst worden war, zugefügt. Die Menge des verwendeten biologisch aktiven Mittels betrug zwischen ungefähr 1 und 50 Pikogramm Digoxin-Äquivalente pro Röhrchen. 50 Mikroliter der mikrosomalen Rindernierenpräparation wurden zugefügt, und die Mischung wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, bevor markiertes Ouabain (5 nCi ³H-Ouabain) zugefügt wurden, und 20 Minuten bei 37ºC nach Zufügen des markierten Ouabain-Indikators. Nach Beendigung der Inkubation wurde die Mischung 10 Minuten in einem Eisbad abgeschreckt. Gebundenes Ouabain wurde von ungebundenem Ouabain mittels Filtration durch Glasfaserfilter (GFC Filter, Whatman, Springfield, NJ) abgetrennt.
Unter den oben beschriebenen Bedingungen verursachte das biologisch aktive Mittel eine Zunahme der Ouabain-Bindung von anfänglich 9% bis ungefähr 20% des insgesamt zugesetzten, was einer 2,2-fachen Zunahme entspricht. Die Daten sind in Tabelle 3, unten, gezeigt. TABELLE 3 Zusatz gebundene CPM* (gezählte Zerfälle) bindendes Protein *³H-Ouabain Einsatz = 8099 CPM
Die gestiegene Menge gebundenen markierten Ouabains konnte durch unmarkiertes Ouabain ohne Veränderung der kinetischen Konstanten verdrängt werden, was darauf hinweist, daß die Stärke der Bindung von Ouabain an seinen Rezeptor durch das erfindungsgemäße Mittel nicht beeinflußt wurde. Diese Zunahme der Ouabain-Bindung an Ouabain-bindende Proteine wurde bei Extrakten aus Brustzystenflüssigkeit mit hohen Natriumspiegeln (Typ 2-Brustzystenflüssigkeiten) nicht beobachtet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung kennen keine andere Substanz, die diese Eigenschaften aufweist.

Claims

1. Biologisch aktives Mittel, isoliert aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen Brust mit Wirkung gegen Bluthochdruck in Säugern und mit den Eigenschaften, das Enzym Na&spplus;K&spplus;-ATPase zu stimulieren, wobei das Mittel löslich in Methanol, Ethanol, Isopropanol oder t-Butanol ist und mit gegen Digoxin gerichteten Antikörpern immunologisch reagiert.

2. Mittel nach Anspruch 1, worin das Mittel aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust isoliert wird durch

Ausschütteln der Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust mit Methanol, Ethanol, Isopropanol oder t-Butanol, wodurch eine Präzipitation von ungewünschten Bestandteilen in der Flüssigkeit hervorgerufen wird,

Verwerfen des Präzipitats,

Mischen des in Alkohol gelösten Mittels mit einem ersten polaren Lösungsmittel, um ein zweites Präzipitat zu bilden,

Verwerfen des zweiten Präzipitats,

Verdampfen des ersten polaren Lösungsmittels und Gewinnen einer ersten wäßrigen Phase, enthaltend das Mittel,

weiteres Extrahieren der ersten wäßrigen Phase mit einem zweiten polaren Lösungsmittel, wobei das zweite polare Lösungsmittel weniger polar als das erste polare Lösungsmittel ist,

Erhalten einer organischen Phase, enthaltend das Mittel,

Entfernen des zweiten polaren Lösungsmittels von der organischen Phase und Erhalten einer zweiten wäßrigen Phase, enthaltend das Mittel,

Lyophilisieren der zweiten wäßrigen Phase,

Extrahieren des Lyophilisats mit Methanol-Wasser,

Aussetzen des Extrakts einer Chromatographie über Druckstabilisiertem Polydextran, und

Gewinnen des Mittels.

3. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 oder 2 für das Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von kongestivem Herzversagen.

4. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 oder 2 für das Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Vorhofflimmern.

5. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 oder 2 für das Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von idiopathischem Ödem.

6. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 oder 2 für das Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Bluthochdruck.

7. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 oder 2 für das Herstellen eines Medikaments zum Senken des Blutdrucks.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin die wirksame Menge des Faktors im Bereich zwischen 10 ng Digoxin-Äquivalenten und 1000 ng Digoxin-Äquivalenten pro kg Körpergewicht eines Säugetiers liegt.

9. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend das biologisch aktive Mittel nach Anspruch 1 oder 2 und/oder Salze davon in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, umfassend zwischen 10 ng Digoxin-Äquivalenten und 1000 ng Digoxin-Äquivalenten des Mittels.

11. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 10, worin die Dosisform eine orale Dosisform, ausgewählt aus einer Tablette und einer Kapsel, ist.

12. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 9, umfassend eine parenterale Dosisform.

13. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine wäßrige Lösung des biologisch aktiven Mittels nach Anspruch 1 oder 2.

14. Verfahren zum Reinigen eines biologisch aktiven Mittels, umfassend einen aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust isolierten Faktor, wobei der Faktor immunologisch reagiert mit gegen Digoxin gerichteten Antikörpern und in Säugern Wirkung gegen Bluthochdruck ausübt, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Verwerfen des Präzipitats,

Verwerfen des zweiten Präzipitats,

Erhalten einer organischen Phase, enthaltend das Mittel,

Lyophilisieren der zweiten wäßrigen Phase,

Extrahieren des Lyophilisats mit Methanol-Wasser,

Gewinnen des Mittels.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der Faktor durch Chromatographie an Sephadex LH-20® gereinigt ist.

16. Biologisch aktives Mittel, umfassend einen aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust isolierten Faktor umfaßt, wobei der Faktor immunologisch reagiert mit gegen Digoxin gerichteten Antikörpern, und in Säugern Wirkung gegen Bluthochdruck ausübt, gereinigt durch das Verfahren nach Anspruch 14.

17. Verfahren zum Reinigen eines biologisch aktiven Mittels, umfassend einen aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust isolierten Faktor, wobei der Faktor immunologisch reagiert mit gegen Digoxin gerichteten Antikörpern und in Säugern Wirkung gegen Bluthochdruck ausübt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Verwerfen des Präzipitats,

Verwerfen des zweiten Präzipitats,

Erhalten einer organischen Phase, enthaltend das Mittel,

Lyophilisieren der zweiten wäßrigen Phase,

Extrahieren des Lyophilisats mit Methanol-Wasser,

Gewinnen des Mittels.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Faktor durch Chromatographie an einer Aminokohlenhydrat-Säule weiter gereinigt wird.

19. Biologisch aktives Mittel, umfassend ein aus Typ 1-Flüssigkeit von Zysten der menschlichen, weiblichen Brust isolierten Faktor, wobei der Faktor immunologisch reagiert mit gegen Digoxin gerichteten Antikörpern und in Säugern Wirkung gegen Bluthochdruck ausübt, gereinigt durch das Verfahren nach Anspruch 17.

20. Mittel nach Anspruch 1, worin das Mittel auch die Eigenschaft besitzt, die Bindung von Ouabain an den zellulären Ouabain-Rezeptor zu stimulieren.

21. Mittel nach Anspruch 1, worin das Mittel Licht bei 210 nm des Spektrums absorbiert.

22. Verwendung nach Anspruch 3, worin das Mittel zusammen mit Ouabain verwendet wird, wobei die Menge des Mittels und von Ouabain in Kombination wirksam ist, kongestives Herzversagen zu verhindern.

23. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Mittel zusammen mit einem Mitglied, ausgewählt aus Digoxin und Digitalis verwendet wird, wobei die Menge des Mittels und des Mitglieds in Kombination wirksam ist, kongestives Herzversagen zu verhindern.