DE3752372T2

DE3752372T2 - Verfahren zur regulierung der metabolischen stabilität von proteinen

Info

Publication number: DE3752372T2
Application number: DE3752372T
Authority: DE
Inventors: Andreas Bachmair; Daniel Finley; Alexander Varshavsky
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1986-10-02
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2007-10-02
Also published as: ATE247708T1; JPH08252096A; WO1988002406A3; DE3752372D1; EP0324789B1; JP2883594B2; JP3038193B2; JPH02501618A; JPH11187875A; JP2776414B2; EP0324789A1; JPH1057061A; CA1313831C; JP2612874B2; WO1988002406A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Sowohl bei bakteriellen als auch eukaryotischen Zellen existieren Proteine mit verhältnismäßig langer Halbwertszeit, deren Halbwertszeiten nahe bei der Zellbildungszeit liegen oder diese übertreffen, gemeinsam mit Proteinen, deren Halbwertszeiten weniger als ein Prozent der Zellbildungszeit betragen können. Die Raten des intrazellulären Proteinabbaus sind eine Funktion des physiologischen Zellzustands und scheinen unterschiedlich für einzelne Proteine gesteuert zu sein. Insbesondere sind beschädigte oder auf andere Weise abnormale Proteine in vivo metabolisch instabil. Obwohl die spezifischen Funktionen des selektiven Proteinabbaus in den meisten Fällen noch unbekannt sind, ist offensichtlich, daß zahlreiche Regulationsproteine eine extrem kurze Halbwertszeit in vivo aufweisen. Die metabolische Instabilität derartiger Proteine ermöglicht eine schnelle Einstellung ihrer intrazellulären Konzentrationen durch regulierte Veränderungen in den Raten ihrer Synthese bzw. ihres Abbaus. Die wenigen Augenblicke, in denen die metabolische Instabilität eines intrazellulären Proteins als wesentlich für seine Funktion gezeigt worden ist, umfassen das cII-Protein des Bakteriophagen Lambda und die HO-Endonuclease der Hefe Saccharomyces cerevisiae.
Der größte Teil des selektiven Turnovers von intrazellulären Proteinen unter normalen metabolischen Bedingungen ist ATP-abhängig und (bei Eukaryoten) nicht lysosomal. Jüngste biochemische und genetische Unterlagen zeigen, daß bei Eukaryoten eine kovalente Konjugation von Ubiquitin mit intrazellulären Proteinen von kurzer Halbwertzeit wesentlich für ihren selektiven Abbau ist. Die Regeln, die bestimmen, ob ein gegebenes Protein metabolisch stabil oder instabil in vivo ist, waren bisher unbekannt.
Nagai und Thogersen, Nature, Band 309, Seiten 810–812 (1984) beschreiben die Einfügung der Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg zwischen die 31 Aminoendständigen Reste von λ-cII-Protein und Val 1 von menschlichen β-Globin und die Produktion des Hybriden mit hohem Ertrag in E.coli. Sie spalteten dann das Hybrid spezifisch bei dem einzigen Arginin unter Verwendung des Blutkoagulationsfaktors X_a und setzten damit die authentische β-Globinkette frei. Da der Faktor X_a spezifisch für das Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg⁷ ist, was in Proteinsequenzen selten ist, ist ihr Expressions/Spaltungssystem anwendbar für die effiziente Produktion von eukaryotischen Proteinen.
Hershko u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 81, Seiten 7021–7025 (1984) beschreiben, daß die selektive Modifikation von NH₂-endständigen α-NH₂-Gruppen von Globin und Lysozym ihren Abbau durch das Ubiquitin-Proteolysensystem von Retikulozyten verhindert. Die Konjugation durch Ubiquitin von ε-NH₂-Gruppen von Lysinresten, üblicherweise in Mehrfachen gesehen, wurde auch bei α-NH₂-blockierten Proteinen verhindert. Natürlicherweise vorkommende N^α-acetylierte Proteine werden durch das Ubiquitinsystem nicht mit einer signifikanten Rate abgebaut, während ihre nicht-acetylierten Gegenstücke von anderen Spezies gute Substrate sind. Die Verfasser vermuten, daß eine Funktion der N^α-Acetylierung von zellulären Proteinen darin besteht, ihren Abbau durch das Ubiquitinsystem zu verhindern. α-NH₂-blockierte Proteine können ihre Aktivität als Substrate für einen Abbau erhöht bekommen durch den Einbau von α-NH₂-Gruppen durch die Einfügung von Polyalaninseitenketten. Proteine, bei denen die meisten ε-NH₂-Gruppen blockiert sind, die α-NH₂-Gruppe jedoch frei ist, werden durch das Ubiquitinsystem abgebaut, jedoch mit einer reduzierten Rate. Die Verfasser vermuten, daß das Freisetzen eines freien NH₂-Endpunktes von Proteinen für den Abbau erforderlich ist und die Bildung von für den Abbau bestimmten Ubiquitinkonjugaten initiieren kann.
Die Erfindung liegt in dem, was in den Ansprüchen beansprucht ist. Genkonstrukte und/oder Fusionsproteine, die sich von denjenigen, die in den Ansprüchen definiert sind, unterscheiden, werden in der vorliegenden Beschreibung nur zu Vergleichszwecken erwähnt. Sie liegen nicht im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung bezieht sich auf Methoden zur technischen Behandlung des Aminoendpunktes von Proteinen, um dadurch die metabolische Stabilität und andere Eigenschaften eines Proteins zu steuern. Des weiteren sieht die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von Proteinen entweder in vivo oder in vitro mit einem der Aminosäurereste, wie im Anspruch 1 angegeben, am Aminoendpunkt des Proteins vor. Die Erfindung basiert zum Teil auf der überraschenden Feststellung, daß die in vivo-Halbwertszeit eines intrazellulären Proteins eine Funktion ihres Amino-endständigen Aminosäurerestes ist, und auf einer neuartigen (und mehr allgemein anwendbaren) Technik, die es ermöglicht, Proteine mit spezifizierten Aminoendpunkten in vivo oder in vitro zu erzeugen. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine neu identifizierte Protease, eine Ubiquitinspezifische Prozeßprotease, die Eigenschaften hat, die es ermöglichen, entweder in vitro oder in vivo jeden gewünschten Aminosäurerest am Aminoendpunkt eines Proteins in Betracht kommenden freizusetzen.
Die Beschaffenheit der am Aminoendpunkt eines intrazellulären Proteins freigesetzten Aminosäure zeigte sich als eine kritische Determinante, die spezifiziert, ob ein Protein einen langen oder kurzen Lebenszyklus in vivo aufweist. Die einzelnen Aminosäuren können als entweder stabilisierende oder destabilisierende Aminosäuren in Bezug auf die Halbwertszeit spezifiziert werden, die sie einem Protein bei Freisetzung am Aminoendpunkt des Proteins vermitteln. Destabilisierende Aminosäurereste vermitteln kurze Halbwertszeiten bis hinunter zu wenigen Minuten für einige der destabilisierenden Aminosäuren. Stabilisierende Aminosäurereste vermitteln lange Halbwertszeiten von vielen Stunden. Diese überraschende und neu erkannte Abhängigkeit der Halbwertszeit eines Proteins von seinem Amino-endständigen Rest wird hier als die N-Ende-Regel bezeichnet.
Basierend auf der N-Ende-Regel kann der Aminoendpunkt eines Proteins somit so konstruiert oder verändert werden, daß die intrazelluläre Halbwertszeit des Proteins verändert und auf diese Weise die Lebenszeit und/oder die Aktivität des Proteins in vivo reguliert werden kann. Diese Fähigkeit kann für eine rationelle Proteinausbildung in vielen verschiedenen Zusammenhängen ausgenutzt werden. Natürliche oder Wildtypproteine können so modifiziert werden, daß sie gegenüber einem Abbau in vivo mehr oder weniger resistent werden. Die Ausbildung bzw. Veränderung des Proteins kann auf der Proteinebene oder auf der genetischen (DNA)-Ebene vorgenommen werden. Zum Beispiel können Proteine dadurch modifiziert werden, daß man den Aminoendpunkt chemisch ändert bzw. bearbeitet, um eine Freisetzung am Aminoendpunkt eines Aminosäurerestes der stabilisierenden oder destabilisierenden Klasse herbeizuführen. Auf der genetischen Ebene können Proteine kodierende Gene dazu gebracht werden, eine Aminosäure der gewünschten Klasse am Aminoendpunkt zu kodieren, so daß das exprimierte Protein eine vorherbestimmte Amino-endständige Struktur freilegt, die es entweder metabolisch stabil oder instabil in Bezug auf den N-Ende-Regel-Weg des proteolytischen Abbaus macht. Des weiteren können Proteine mit einer "Abdeck"-Protueinsequenz verschmolzen ausgeprägt werden, die den bearbeiteten Aminoendpunkt abdeckt, so daß, bei Aufhebung der Abdeckung, das Protein die gewünschte Eigenstabilität oder andere Eigenschaften darbietet, die von der Beschaffenheit des Amino-endständigen Restes des Proteins abhängen. Bei derartigen Konstrukten kann zum Beispiel die Junktion zwischen den beiden Proteinsequenzen für eine spezifische Aufspaltung zum Beispiel durch eine Endoprotease ausgebildet sein. Die endoproteolytische Spaltung der Fusionssequenz befreit den spezifisch behandelten Aminoendpunkt des in Betracht kommenden Proteins und unterwirft das Protein dem durch die N-Ende-Regel geregelten Abbau. Ein spezifischer und neuer Weg zur Behandlung des Aminoendpunktes des Proteins wird nach der vorliegenden Erfindung durch die Identifizierung von Ubiquitin-spezifischer Prozeßprotease und Bestimmung ihrer Substratspezifizität geschaffen. Unter Verwendung dieser Protease können Fusionen von Ubiquitin mit anderen Proteinen spezifisch entweder in vitro oder in vivo bearbeitet werden, um Proteine mit gewünschten Amino-endständigen Resten zu erzeugen.
Ein anderer und ebenfalls neuer Weg zur spezifischen Behandlung von Proteinen mit kurzer Lebensdauer ist nach der vorliegenden Erfindung durch die Erkenntnis geschaffen, daß Ubiquitin-Protein-Fusionen, wie etwa Ubiquitin-Pro-β-Galactosidase, die nicht wirksam entubiquitiniert werden können, metabolisch instabil sind. Somit kann man durch die Verbindung der Amino-endständigen Ubiquitinkomponente mit einem Protein auf eine Weise, die seine Entfernung entweder unmöglich oder ineffizient macht, Proteine durch eine verschiedene Technik destabilisieren, die nicht direkt auf der N-Ende-Regel basiert.
Außerdem können verschiedene Zellen entwickelt werden, die putative Mutationen in der/den "N-Ende"-Abbauprotease (s) enthalten, die entweder konditionell oder nichtkonditionell den Abbau von Proteinen mit kurzer Lebensdauer stoppen. Diese Zellen können zur Überproduktion von Proteinen verwendet werden, die für gewöhnlich eine kurze Lebensdauer innerhalb der Zelle hätten.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt die Konstruktion von Ubiquitin-lacZ-Genfusionen.
2 zeigt Experimente, bei denen die Halbwertszeiten von behandelten β-Gal-Proteinen direkt gemessen werden.
3 zeigt die Veränderung von Aminosäureresten an der Ubiquitin-β-Gal-Junktion (A) unter Verwendung der neu gefundenen Eigenschaften von Ubiquitin-spezifischer Prozeßprotease und die Aminosäuresequenz in der Nachbarschaft der Junktion (B).
4 zeigt das Vorhandensein multipler Ubiquitinkomponenten in metabolisch instabilen β-Gal-Proteinen.
5 zeigt eine Serie von β-Gal-Spezies, die Ubiquitin in metabolisch instabilen β-Gal-Proteinen enthalten.
6 zeigt, daß sowohl prokaryotische als auch eukaryotische intrazelluläre Proteine langer Lebensdauer stabilisierende Aminosäurereste an ihren Aminoendpunkten aufweisen, während abgesonderte Proteine einen komplementären Bias darbieten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Ermittlung der N-Ende-Regel wird nachstehend im Einzelnen beschrieben. Kurz gesagt, wurde diese den Proteinabbau bestimmende Regel aufgefunden durch Untersuchung der in vivo-Halbwertszeiten der Enzym-β-Galactosidase mit verschiedenen Aminosäureresten an ihrem Aminoendpunkt und hergestellt als ein Fusionsprotein mit Ubiquitin. Wenn ein ein Ubiquitin-β-Galactosidase-Fusionsprotein kodierendes Chimärengen in der Hefe S. cerevisiae ausgeprägt wird, wird Ubiquitin von dem entstehenden Fusionsprotein abgespalten, was eine entubiquitinierte β-Galactosidase (β-Gal) ergibt. Mit einer Ausnahme findet diese Spaltung statt ungeachtet der Beschaffenheit des Aminosäurerestes von β-Gal an der Ubiquitin-β-Gal-Junktion, wodurch es möglich wird, selektiv verschiedene Reste an den Aminoendpunkten von sonst identischen β-Gal-Proteinen freizulegen. Die so ausgebildeten β-Gal-Proteine zeigen auffallend unterschiedliche Halbwertszeiten in vivo, die von mehr als zwanzig Stunden bis zu weniger als drei Minuten reichen, in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Aminosäure am Aminoendpunkt der β-Gal. Aminosäuren können somit nach den Halbwertszeiten geordert werde, die sie der β-Gal bei Vorhandensein in ihrem Aminoendpunkt vermitteln. Zum Beispiel vermitteln die Aminosäuren Methionin, Serin, Alanin, Threonin, Valin, Glycin und Cystein eine Halbwertszeit von mehr als zwanzig Stunden. Phenylalanin, Leucin, Asparagin und Lysin erbringen Halbwertszeiten von etwa drei Minuten. Arginin, die am meisten destabilisierende Aminosäure, vermittelt eine Halbwertszeit von etwa zwei Minu ten. (vgl. Tabelle 1 unten bezüglich einer vollständigen Liste von Aminosäuren und den entsprechenden Halbwertszeiten.)
Die gegenwärtig bekannten Amino-endständigen Reste in langlebigen, nicht kompartimentierten intrazellulären Proteinen sowohl von Prokaryoten als auch Eukaryoten gehören praktisch ausschließlich zu der stabilisierenden Klasse von Aminosäuren, genau wie es durch die N-Ende-Regel vorausgesagt wird. Dieses Ergebnis impliziert in starkem Maße die N-Ende-Regel allgemein im selektiven Abbau von intrazellulären Proteinen.
Die geeignete Amino-endständige Aminosäure scheint ein wesentliches (obwohl nicht notwendigerweise ein ausreichendes) Erfordernis für die metabolische Stabilität eines nicht-kompartimentierten, intrazellulären Proteins zu sein. Daher muß, damit ein Protein intrazellulär relativ stabil ist, eine stabilisierende Aminosäure im Aminoendpunkt vorhanden sein. Das Vorhandensein eines destabilisierenden Restes im Aminoendpunkt eines Proteins ist häufig, obwohl nicht immer, ausreichend für seine metabolische Destabilisation in vivo. Wenn eine solche Destabilisierung in einem verhältnismäßig kleinen Ausmaß auftritt, zeigt die weitere Analyse entweder eine nicht ausreichende Zugänglichkeit des Aminoendpunktes oder einen Mangel an "zulässiger" Sequenzumgebung in der Nachbarschaft des Aminoendpunktes, wie etwa einen Mangel an Segmentmobilität im Amino-endständigen Bereich des Proteins. Das Vorhandensein einer stabilisierenden Aminosäure am Aminoendpunkt vermittelt zumindest in einigen Fällen (wie zum Beispiel für β-Gal beobachtet) dem Protein Stabilität. Jedoch kann eine stabilisierende Aminosäure am Aminoendpunkt nicht immer eine lange Halbwertszeit erbringen, weil andere Abbauwege bei der Bestimmung des endgültigen Schicksals des Proteins beteiligt sein können. Zum Beispiel können endoproteolytische Spaltungen (Spaltungen außerhalb der Endpunktregionen des Proteins) zur Freisetzung einer destabilisierenden Aminosäure am Aminoendpunkt eines resultierenden Produkts der Spaltung führen, das dann schnell über den N-Ende-Regel-Weg abgebaut wird. Die geeigneten Umstände für die Verwendung einer stabilisierenden Aminosäure können empirisch ermittelt werden.
Obgleich die N-Ende-Regel nur eine Komponente (wenn auch eine zentrale) einer komplexeren "Halbwertszeitregel" sein kann, die andere Aspekte des selektiven Proteinabbaus in vivo umfaßt, liefert die N-Ende-Regel einen rationellen, praktikablen Zugang für den Aufbau bzw. die Veränderung der Proteinstruktur, um Proteine zu produzieren, die mehr oder weniger widerstandsfähig gegenüber einem Abbau durch den N-Ende-Regel-Weg sind als natürliches, nicht modifiziertes Protein. Proteine können auf der Protein- oder Genebene aufgebaut oder verändert werden, um eine gewünschte Aminosäure entweder der stabilisierenden oder der destabilisierenden Klasse an ihrem Aminoendpunkt vorzunehmen. Die Fähigkeit, die Halbwertszeit eines Proteins, zu regulieren, gibt die Möglichkeit, die intrazelluläre Aktivität des Proteins zu modulieren.
Ein direkter Zugang zum Modifizieren eines Proteins zur Erhöhung oder Verringerung seiner metabolischen Stabilität besteht darin, den Aminoendpunkt des Proteins direkt auf der Proteinebene zu bearbeiten. Um eine gewünschte Proteins direkt auf der Proteinebene zu bearbeiten. Um eine gewünschte Amino-endständige Aminosäure zu schaffen, kann der Aminoendpunkt des in Betracht kommenden Proteins chemisch verändert werden, zum Beispiel durch Zugabe einer Aminosäure der stabilisierenden oder destabilisierenden Klasse zum Aminoendpunkt eines Proteins oder Polypeptids unter Verwendung eines geeigneten chemischen Verfahrens. So kann zum Beispiel ein instabiles Protein dadurch stabiler gemacht werden, daß ein stabilisierender Aminosäurerest (z. B. Methionin, Serin, Alanin, Threonin, Valin, Glycin oder Cystein) dem Aminoendpunkt des Proteins hinzugefügt wird. Umgekehrt kann ein stabiles Protein dadurch destabilisiert werden, daß eine destabilisierende Aminosäure dem Aminoendpunkt hinzugefügt wird. Ein eindeutiger Weg zur Modifizierung des Aminoendpunktes eines Proteins wäre es, spezifische Enzyme, Aminosäure-Protein-Ligasen, zu verwenden, die eine posttranslatorische Hinzufügung einer einzelnen Aminosäure zum Aminoendpunkt des Proteins katalytisch beeinflussen. Andere Methoden für nicht-genetische Veränderungen der gleichen Art können ohne weiteres vom Fachmann ermittelt werden.
Bei einigen Proteinen ist das Amino-endständige Ende als Ergebnis der Gestaltung des Proteins (d. h. seine tertiäre oder quaternäre Struktur) verdeckt. In diesen Fällen kann eine intensivere Veränderung des Aminoendpunktes erforderlich sein, um das Protein für den N-Ende-Regel-Weg zugänglich zu machen. Zum Beispiel können dann, wenn ein einfacher Zusatz oder Ersatz des einzelnen Amino-endständigen Restes wegen eines unzugänglichen Aminoendpunktes nicht ausreichend ist, mehrere Aminosäuren (einschließlich Lysin, die Stelle der Ubiquitinverbindung mit Substratproteinen) dem anfänglichen Aminoendpunkt zugesetzt werden, um die Zugänglichkeit und/oder Segmentmobilität des bearbeiteten Aminoendpunktes zu erhöhen.
Die Modifizierung bzw. Ausbildung des Aminoendpunktes eines Proteins kann auch auf der genetischen Ebene durchgeführt werden. Es können herkömmliche Techniken der Mutationsort-gerichteten Mutagenese für den Zusatz oder Ersatz geeigneter Codons am 5'-Ende eines isolierten oder synthetisierten Gens zur Erschaffung einer gewünschten Amino-endständigen Struktur für das kodierte Protein verwendet werden. So kann zum Beispiel, damit das ausgeprägte Protein die gewünschte Aminosäure an seinem Aminoendpunkt aufweist, das geeignete Codon für eine stabilisierende Aminosäure in den Aminoendpunkt der Protein-kodierenden Sequenz eingesetzt bzw. eingebaut werden.
Gleichzeitig werden ausgeprägte Proteine häufig in natürlicher Weise innerhalb einer Zelle nach der Translation modifiziert. Dies kann eine Modifizierung des Aminoendpunktes einschließen. Zum Beispiel kann auf den Aminoendpunkt durch eine Aminopeptidase eingewirkt werden, die eine oder mehrere Aminosäuren vom Aminoendpunkt abspaltet. Aminosäuren können dem Aminoendpunkt auch durch posttranslatorische Verfahren zugesetzt werden. Die Erfindung bietet einen Weg zur "Umgehung" noch undefinierter Regeln der Aminoendständigen Proteinbehandlung, um exakt und spezifisch die gewünschten Aminosäurereste am Aminoendpunkt einer ausgereiften bearbeiteten Protein spezies freizusetzen. Um die Wirkung derartiger posttranslatorischer Ereignisse auf die endgültige Struktur des Aminoendpunktes eines in Betracht kommenden Proteins zu minimieren, kann ein spezifisches Fusionsprotein gebildet werden, wobei dem Aminoendpunkt eines in Betracht kommenden Proteins (behandelt für die gewünschte stabilisierende oder destabilisierende Struktur) eine "Abdeck"-Proteinsequenz, verschmolzen mit dem Aminoendpunkt, vorausgeht. Die Fusionsproteine sind so ausgebildet, daß die mit dem Aminoendpunkt des in Betracht kommenden Abdeckproteins verschmolzene Proteinsequenz für eine spezifische Spaltung an der Verbindung zwischen den beiden zugänglich ist. Die Entfernung der Proteinsequenz hebt somit die Abdeckung des Aminoendpunktes des in Betracht kommenden Proteins auf und die Halbwertszeit des freigesetzten Proteins wird so durch den vorbehandelten Aminoendpunkt geregelt. Das Fusionsprotein kann für eine spezifische Spaltung in vivo, zum Beispiel durch eine Wirtszellenendoprotease, oder für eine spezifische Spaltung in eine in vitro-System ausgestattet sein, wobei es nach der Trennung von einer Produktionszelle (der die Fähigkeit zur Spaltung des Fusionsproteins fehlt) aufgespalten werden kann.
Ubiquitin ist ein weithin nützlicher Fusionspartner für die Konstruktion eines Fusionsproteins mit einem in Betracht kommenden Protein, die Erkenntnis, daß künstliche Ubiquitin-Protein-Fusionen präzise durch eine cytoplasmische eukariotische Protease mit geringer oder keiner Abhängigkeit von dem Protein, mit dem Ubiquitin verschmolzen ist, aufgespalten werden kann, kann sowohl in vivo als auch in vitro bei Strategien zur Proteingestaltung angewandt werden und ist ein hervorstehender Aspekt der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel kann die Ubiquitin-Protein-Fusionsmethode zur künstlichen Erzeugung authentischer Aminoendpunkte in durch künstliche Maßnahmen produzierten Proteinen verwendet werden. Somit kann eine Aminoendpunktcharakteristik von natürlichen eukaryotischen oder prokaryotischen Proteinen durch Aufspaltung in vitro von in einem prokaryotischen Wirt produzierten Ubiquitin-Protein-Fusionen erzeugt werden.
Eine spezifische Methodik zur Produktion von Ubiquitin-β-Galactosidase-Fusionsproteinen wird nachstehend im einzelnen beschrieben. LacZ (das β-Gal-Gen) kann bei dieser Methodik durch irgendwelche andere Proteine kodierende Gene ersetzt werden.
Im allgemeinen werden Ubiquitin-Fusionsproteine durch ein Chimärengenkonstrukt ausgeprägt, das, in der Orientierung 5' bis 3', ein Ubiquitingen umfaßt, das mit einem das in Betracht kommende Protein kodierenden Gen verbunden ist. Das Codon für die Amino-endständige Aminosäure des in Betracht kommenden Proteins ist unmittelbar angrenzend an das Ende 3' des Ubiquitingens angeordnet. Das Fusionsgenprodukt wird endoproteolytisch entweder in vivo oder in vitro (unter Verwendung entweder reiner oder teilweise gereinigter Ubiquitin-spezifischer Protease, identifiziert nach der vorliegenden Erfindung) am Knotenpunkt zwischen Ubiquitin und dem in Betracht kommenden Protein aufgespalten, um das in Betracht kommende Protein mit der gewünschten Aminosäure an seinem Aminoendpunkt zu erzeugen. Es gibt eine Anzahl spezifischer Verwendungen für die beschriebene Fähigkeit zur spezifischen Gestaltung des Aminoendpunktes des Proteins. Eine derartige Verwendung ergibt sich durch die Tatsache, daß die intrazelluläre Halbwertszeit des freigesetzten Proteins durch die Prinzipien der N-Ende-Regel bestimmt wird. Andere Anwendungen der hier beschriebenen spezifischen Methode zur Gestaltung des Aminoendpunktes des Proteins reichen von der Einstellung der gewünschten Funktionseigenschaften eines in Betracht kommenden Proteins bis zur Modulierung seiner Antigenität und wiederum bis zu anderen Verwendungen, die ohne weiteres vom Fachmann ermittelt werden können.
Diese Methode des Erzeugens des gewünschten Aminosäurerestes am Aminoendpunkt eines in Betracht kommenden Proteins beinhaltet zwei neuartige Komponenten: zum einen die Verwendung von Ubiquitin-Protein-Fusionen und zum anderen die Verwendung von Ubiquitin-spezifischer Prozeßprotease, die identifiziert worden ist und deren auffallende Substratanforderungen in dieser Arbeit erkannt wurden. Obgleich die anfängliche Identifizierung der Ubiquitinspezifischen Protease in vivo vorgenommen wurde, ist das Enzym auch verhältnismäßig stabil und aktiv in vitro (in Extrakten) und kann ohne weiteres durch dem Fachmann bekannte Techniken auf Homogenität gereinigt werden. Des weiteren wird die Substratspezifizität der Ubiquitin-spezifischen Prozeßprotease in hohem Maße in der Entwicklung beibehalten und ist die gleiche in Hefe und bei Säugetieren. Das Enzym kann chromatographisch von einem Rohextrakt durch sequentielle Chromatographie auf Phosphorzellulose, DEAE-Zellulose und SH-Sepharose unter anderen dem Fachmann bekannten Metho den gereinigt werden. Alternativ kann das Gen für diese Protease vom Fachmann geklont werden. Das geklonte Proteasegen kann entweder in vivo verwendet werden, oder das Gen kann alternativ in einem geeigneten Wirt im Übermaß ausgeprägt werden, wobei die im Übermaß ausgeprägte Ubiquitinspezifische Protease gereinigt und für den gleichen oder ähnliche Zwecke in vitro verwendet wird. Die Auffindung dieses Enzyms und die detaillierte Charakterisierung seiner Substratspezifizität sorgt für die Nutzung dieses Enzyms in vitro und in vivo.
Die Verwendung von Ubiquitin-Protein-Fusionen zur Ermöglichung der Erzeugung eines gewünschten Aminosäurerestes am Aminoendpunkt eines in Betracht kommenden Proteins kann auf eine Förderung der Reinigung derartiger Proteine aus Produktionszellen ausgedehnt werden. Es kann ohne weiteres ein Gen konstruiert werden, das ein geeignetes Markenprotein, wie etwa Streptavidin, kodiert, verbunden mit einem oben beschriebenen Ubiquitin-Protein-Fusionskonstrukt. Die resultierende (Markenprotein)-Ubiquitin-Protein-Fusion kann auf einfache Weise von Produktionszellen unter Verwendung der vorgewählten Eigenschaft des Markenproteins, zum Beispiel der bekannten Fähigkeit von Streptavidin der Trennbarkeit durch Affinitätschromatography auf einer Biotinsäule, getrennt werden. Somit kann die gereinigte (Markenprotein)-Ubiquitin-Protein-Fusion sodann spezifisch durch die mit der vorliegenden Erfindung beschriebene Ubiquitin-spezifische-Protease aufgespalten werden, um ein Endprodukt, ein interessierendes Protein mit dem gewünschten Aminosäurerest an seinem Aminoendpunkt, zu erzeugen.
Das Codon für die Amino-endständige Aminosäure der gewünschten Aminosäure durch zum Beispiel Mutationsort-gerichtete Mutagenesetechniken ist geläufiger Standard auf dem Fachgebiet. Wenn das das interessierende Protein kodierende Gen ein synthetisches Gen ist, kann das geeignete 5'-Codon während des Syntheseprozesses eingebaut werden. Alternativ können Nukleotiden für einen spezifisches Codon dem 5'-Ende eines isolierten oder synthetisierten Gens durch Ligation einer geeigneten DNA-Sequenz mit dem (den Aminoendpunkt kodierenden) 5'-Ende des Gens zugefügt werden.
Ubiquitin-ähnliche Fusionspartner, die die Fähigkeit haben, durch die Ubiquitinspezifische Protease aufgespalten zu werden, können ebenfalls benutzt werden. Außerdem können andere Fusionspartner als Ubiquitin zum Abdecken des Aminoendpunktes eines in Betracht kommenden Proteins verwendet werden. In geeigneten Fällen können die Fusionsproteine so ausgebildet werden, daß sie eine proteolytische Spaltungsstelle für eine Restriktions-Endoprotease enthalten, die eine ausreichend enge Spezifizität aufweist, so daß nur ein Zielort in einem Fusionsprotein aufgespalten wird. Eine kritische Eigenschaft für eine derartige Protease muß eine ausreichend gelockerte Anforderung an die Beschaffenheit des/der Aminosäurereste (s) sein, die an die Carboxy-endständige Seite des Aufspaltungsortes anstoßen. Der Zielort für die Aufspaltung ist der Knotenpunkt zwischen dem Fusionspartner und dem Aminoendpunkt des in Betracht kommenden Proteins und somit ist die Erkennungsstelle für die Endoprotease so lokalisiert, daß die Spaltung an dieser Stelle erfolgt. Die im Handel erhältliche Protease, Komplementfaktor X_a, bietet diese Eigenschaften und kann somit verwendet werden, um direkt Proteine mit vorbestimmten Aminosäureresten in der Endposition ihrer Aminoendpunkte zu erzeugen (vgl. K. Nogai und H.C. Thogersen Nature 309: 810 (1984)). Die Erkennungsstelle für die Endoprotease kann in den Knotenpunkt zwischen der abdeckenden Proteinsequenz und der Region 3' eingebaut werden, die den Aminoendpunkt des in Betracht kommenden Proteins kodiert.
Eine andere und unterschiedliche Methode zur Konstruktion kurzlebiger Proteine wird nach der Erfindung durch die Erkenntnis geliefert, daß Ubiquitin-Protein-Fusionen, wie etwa die Ubiquitin-Pro-β-Galactosidase-Fusion (Tabelle 1), die nicht wirksam entubiquitiniert werden können, metabolisch instabil sind. Somit kann man durch die Verbindung der Amino-endständigen Ubiquitinkomponente mit einem Protein in einer Weise, die ihre Entfernung entweder unmöglich oder ineffizient macht, ein Protein durch eine bestimmte Technik destabilisieren, die qualitativ verschieden ist von der Methode der Erzeugung des gewünschten Aminoendpunktes eines Proteins gemäß den Erfordernissen der N-Ende-Regel. Eine Verhinderung der wirksamen Entubiquitinierung einer Ubiquitin-Protein-Fusion kann auf mehreren Wegen erreicht werden, zum Beispiel durch Verwendung eines Prolinrestes am Ubiquitin-Protein-Knotenpunkt, wie in Tabelle 1 gezeigt, oder durch Veränderung der Aminosäurensequenz des Ubiquitins nahe seinem Carboxylendpunkt in der Weise, daß die Ubiquitinkomponente nicht länger von der Ubiquitin-spezifischen Prozeßprotease erkannt wird, jedoch noch von dem Rest des Abbauweges erkannt werden kann. Diese und andere Wege zur Reduzierung der Rate einer Entubiquitinierung einer Ubiquitin-Protein-Fusion können ohne weiteres vom Fachmann ermittelt werden.
Die Methoden nach der Erfindung können u. a. zur Regulierung der Halbwertszeit eines Proteins auf intrazelluläre Weise verwendet werden. Es gibt viele Fälle, in denen diese Fähigkeit vorteilhaft ist. Zum Beispiel kann, wenn ein Gen in eine Zelle für eine Ausprägung in dieser eingeführt wird, das ausgeprägte Produkt auf eine lange oder kurze Halbwertszeit hin je nach der besonderen Notwendigkeit konstruiert werden.
Im allgemeinen sind destabilisierte Proteine, die kurze Halbwertszeiten haben, eher zugänglich für eine Regulierung intrazellulärer Werte des Proteins. Die Fähigkeit zur Feinregulierung der intrazellulären Werte und Aktivität eines Proteins kann in der Therapie oder bei der Arbeit mit Zellkulturen in vitro nützlich sein. Bei der Gentherapie kann zum Beispiel ein Gen in eine Zelle eingesetzt werden, um einen genetischen Defekt oder anomalen Zustand zu kompensieren. Das Gen kann unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters eingesetzt werden. Die Einführung resultiert in einer verstärkten Ausprägung des Genprodukts und folglich höheren Werten des Produkts innerhalb der Zelle. Falls das Gen so konstruiert ist, daß ein instabiles Protein kodiert wird, ist die intrazelluläre Konzentration des ausgeprägten Proteins schneller ansprechend auf eine spätere Reduktion in der Rate ihrer Synthese, weil es in der Zelle nicht überdauert. Auf diese Weise kann der intrazelluläre Wert und/oder Aktivitätszustand des durch das eingesetzte Gen kodierten Proteins feiner reguliert werden.
Das Verfahren nach der Erfindung kann auch zur Erweiterung der Verwendung auswählbarer Marker durch Verkürzung der Zeit verwendet werden, die für einen auf den Marker bezogenen Phenotyp notwendig ist, um manifest zu werden. Zu diesem Zweck kann ein von einem Markergen kodiertes Produkt dadurch destabilisiert werden, daß sein Aminoendpunkt gemäß der N-Ende-Regel verändert wird. Auf diese Weise kann die Selektion für den negativen Phenotyp gefördert werden, weil das Produkt des Markergens schneller vernichtet wird, nachdem die Funktion des den Marker kodierenden Gens aufgehoben ist. Ein Beispiel ist das Thymidin-Kinase-Gen-(tk-Gen). Das tk-Gen kann so konstruiert werden, daß ein weniger stabiles Enzym kodiert wird, indem eine geeignete destabilisierende Aminosäure am Aminoendpunkt eingeführt wird. Die zum tk^–-Phenotyp führende Genmutation wird von den Zellen schneller manifestiert, weil Rest-tk schneller abgebaut wird. Dieses kann besonders nützlich bei langsam wachsenden Zellen sein, bei denen mehr Zeit erforderlich ist, um tk "auszudünnen", das vor der Umwandlung zum tk^–Typ synthetisiert worden ist.
Die Prinzipien einer auf der N-Ende-Regel basierenden Proteinmodifizierung können auch bei der Konstruktion von Cytotoxinen verwendet werden. Proteinhaltige Cytotoxine können als instabile Proteine konstruiert werden, die durch den N-Ende-Regel-Weg abbaubar sind, so daß sie nicht fortbestehen, nachdem ihre toxische Wirkung auf eine Empfängerzelle ausgeübt worden ist. Die Reduzierung der Lebensdauer des Toxins reduziert die Wahrscheinlichkeit, das Nichtempfängerzellen abgetötet werden.
Die Auffindung des N-Ende-Regel-Wegs des Abbaus ermöglicht die Entwicklung von Mutantenzellen mit Mutationen in Genen, die wesentliche Komponenten des N-Ende-Regel-Wegs kodieren. Zum Beispiel können Zellen erzeugt werden, die entweder dauernd oder bedingt unfähig sind, ansonsten kurzlebige Proteine wirksam abzubauen. Diese Zellen können dazu verwendet werden, gewünschte Proteine herzustellen, die normalerweise in einer Zelle instabil wären.
Die Erfindung wird durch die folgende detaillierte Beschreibung der Ermittlung der N-Ende-Regel weiter erläutert.
Verfahren Proteinsequenzierung
S. cerevisiae-Zellen, die pUB23 (1) tragen, welches ub-Met-β-Gal (3A) kodiert, wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert, gefolgt von einer Extraktherstel-Jung, Immunausscheidung von β-Gal und Elektrophorese, wie nachfolgend beschrieben. Das feuchte Polyacrylamidgel wurde der Autoradiographie ausgesetzt, das Band von β-Gal wurde erregt und die elektroeluierte β-Gal wurde sechs Zyklen einer radiochemischen Sequenzierung durch Edman-Abbau unterzogen. Die Sequenzierung wurde ausgeführt von W. Lane von der Mikrochemischen Fakultät der Harvard-Universität.
Ortsgerichtete Mutagenese
pUB23 (1) wurde sequentiell mit Acc I, dem Klenow-Fragment von pol I und Bam HI behandelt. Ein den Ort Xho I enthaltendes Fragment wurde gereinigt und eingesetzt zwischen einem eingefüllten Hind-III-Ort und einem BAM-HI-Ort der M13mp9-Phagen-DNA. (J. Messing und J. Vieira, Gene 19, 263 (1982). Die ortsgerichtete Mutagenese (M. Smith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985)) wurde ausgeführt wie beschrieben von Kramer, W. u. a. Nucl. Acids Res.12, 9441 (1984) unter Verwendung eines synthetischen 25-Rest-Oligodeoxyribonucleotids, enthaltend zehn Basen am 5'-Ort und zwölf Basen am 3'-Ort des Met-Codons von β-Gal. Alle vier Basen konnten an den ursprünglichen Met-Codon-Positionen während der Synthese auftreten. Primäre Phagenplaques wurden durch Hybridisierung gescreent (Wood, N.I. u. a. PNAS 82, 1585 (1985)), unter Verwendung einer 12-Rest-Oligonukleotidsonde, die die Region von Codonveränderungen und Hybridisierung zur Ursprungssequenz überspannte. Nicht-hybridisierende Plaques, die Einschlüsse von der gewünschten Größe enthielten, wurden durch die Kettenterminationsmethode sequenziert. (Sanger, F. u. a., PNAS 71 5463 (1977)). Zur Übertragung der gewünschten Konstrukte in den pUB23-Hintergrund, wurde Replikationsform-DNA von Mutantphagen mit Xho I und Bam HI digeriert und dem gleichen Digest des Plasmids pLGSD5-ATG zugesetzt (vgl. 1 und L. Guarente, Methods Enzymol., 101 181 (1983)). Das verbundene Gemisch wurde zur Umwandlung des E. coli-Stammes MC1061 verwandt. (M.J. Casadaban und S.N. Cohen, J. Mol. Biol., 138179 (1980)). Kolonien, die in Betracht kommende Plasmide enthielten (bei denen der offene Leserahmen von β-Gal wiederhergestellt war) wurden an ihrer hellblauen Farbe auf X-Gal-Platten erkannt.
Impuls-Behandlungsversuche
S. cerevisiae-Zellen des Stammes BWG-9a-1 (MAT his4 ura3 ade6), umgewandelt (F. Sherman u. a. "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1981)) mit in Betracht kommenden Plasmiden wurden bei 30°C auf A₆₀₀ von etwa 5 in einem Medium von 2 Prozent Galactose, 0,67 Prozent Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren (DIFCO), Adenin (10 μg/ml) und Aminosäuren einschließlich Methionin (Sherman, F. u. a. a. a. O.) zum Wachsen gebracht. In typischer Weise wurden Zellen aus einer Kultur von 5 ml durch Filtration durch die Mulde einer Millipore-Microtiterfiltrationsplatte abgeerntet, mehrere Male auf dem Filter mit dem gleichen, Methionin-fehlenden Medium gewaschen und in 0,3 ml einer 1-prozentigen Galactose, 50 mM Caliumphosphatpuffer (ph-Wert 7,4) resuspendiert. Sodann wurde [³⁵S] Methionin (50 bis 100 μCi) über 5 Minuten bei 30°C zugesetzt; die Zellen wurden durch Filtrierung gesammelt und auf 0,4 ml des Cycloheximid mit 0,5 mg/ml enthaltenden Wachstumsmediums resuspendiert. Proben (0,1 ml) wurden zu angegebenen Zeiten abgezogen und 0,75 ml eines Kaltpuffers A zugegeben (vgl. unten wegen der Pufferzusammensetzung), der Leupeptin, Pepstatin A, Antipain, Aprotinin und Chymostatin (Sigma), (jeweils mit 20 μg/ml) zusätzlich zu 0,4 ml Glaskügelchen enthielt. Unmittelbar danach wurden die Zellen durch Verwirbelung über etwa 3 Minuten bei 4°C zerstört; die Extrakte wurden bei 12.000 g über 3 Minuten zentrifugiert und Radioaktivität säureunlöslichen ³⁵S in den Überständen wurde be stimmt. Aliquoten der Überstände, die gleiche Mengen des gesamten säureunlöslichen ³⁵S enthielten, wurden zur Immunausscheidung mit einem monoklonalen Antikörper auf Gal behandelt. Aszitische Flüssigkeit, die einen molaren Überschuß des Antikörpers (zumindest das Zehnfache) enthielt, wurde jeder Aliquote zugesetzt, mit anschließender Inkubation bei 4°C über 2 Stunden; dann wurde Protein-A-Sepharose (Pharmacia) zugesetzt, die Suspension wurde unter Schütteln bei 4°C 30 Minuten lang inkubiert und bei 12.000 g für 1 Minute zentrifugiert. Die Protein-A-Sepharose-Pellets wurden dreimal im Puffer A (siehe unten), der 0,1 Prozent Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, gewaschen, resuspendiert in einem SDS, Dithiotreitol (DTT) enthaltenden elektrophonetischen Probenpuffer (U.K. Laemmli, Nature 227680 (1970)), 3 Minuten lang bei 100°C erwärmt und dann 1 Minute bei 12.000 g zentrifugiert. Gleiche Aliquoten der Überstände wurden der Elektrophorese in einem 7-prozentigen diskontinuierlichen Polyacrylamid-SDS-Gel (15 mal 15 mal 0,15 cm) mit anschließender Fluoreszenzaufnahme unterzogen. Bei einigen Versuchen wurde das obige Protokoll nicht verwendet, sondern die Extrakte wurden dadurch hergestellt, daß die Zellen direkt in Gegenwart von SDS, im wesentlichen mit den gleichen Ergebnissen, aufgekocht wurden.
Analyse von in E. Coli produzierten ub-β-Gal-Proteinen
Plasmid pUB23 (1 und 3) wurden in DS410, einen Kleinzellen produzierenden E. coli-Stamm, eingeführt. (N. Stoker, u. a., in "Transcription and Translation: A practical Approach", B. D. Harnes und S. J. Higgins, Herausgeber, IRL Press, Oxford, 1984, Seite 153). Es wurden Kleinzellen hergestellt und 60 Minuten lang bei 36°C mit [³⁵S] Methionin (600 Ci/mmol, Amersham) markiert, wie von N. Stoker u. a., a. a. O., beschrieben.
Die markierten Kleinzellen wurden zentrifugiert, resuspendiert in 2 Prozent SDS, 10 mM DTT, 10 mM Na-HEPES (ph-Wert 7,5) und 3 Minuten lang bei 100°C erwärmt. Nach dem Zentrifugieren bei 12.000 g für 1 Minute wurde der Überstand mit Puffer A (1 Prozent Triton X-100, 0,15 M NaCl, 5 mM Na-EDTA, 50 mM Na-HEPES, ph-Wert 7,5) zwanzigfach verdünnt, gefolgt von dem Zusatz von Phenylmethyl-Sulfonylfluorid (PMSF) und N-Ethylmaleimid zu 0,5 mM bzw. 10 mM. Nach 4 Stunden bei 4°C wurde die Probe gegen Puffer A, 0,5 mM PMSF enthaltend, über Nacht bei 4°C dialysiert und für eine Immunausscheidung behandelt (wie oben beschrieben).
Analyse von in Hefe produzierten ub-β-Gal-Proteinen
S. cerevisiae-Zellen, die in Betracht kommende Plasmide trugen, wurden in 800 ml eines Uracil-fehlenden Mediums zum Wachsen gebracht, dann abgeerntet und mit Glaskügelchen in einem Puffer A zerstört, der Leupeptin, Pepstatin A, Antipain, Aprotinin und Chymostatin (jeweils mit 3 μg/ml) enthielt. Der Extrakt wurde bei 12.000 g für 3 Minuten zentrifugiert. Gesättigtes Ammoniumsulfat wurde dem Überstand bis zu einer Endkonzentration von 57 Prozent zugesetzt. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 4°C wurde das ausgeschiedene Protein durch Zentrifugieren bei 23.000 g für 30 Minuten gesammelt. Das Pellet wurde im Proteasehemmer enthaltenden Puffer A erneut gelöst. Nach Klärung bei 12.000 g über 3 Minuten wurde die Probe durch eine Affinitätssäule geleitet, die durch Vernetzung einer IgG-Fraktion aus einer aszitischen Flüssigkeit (einen monoklonalen Antikörper zu Gal zu Affi-Gel 10 (Bio-Rad) enthaltend) hergestellt war. Die IgG-Fraktion, die für die Vernetzung verwendet wurde, war von der aszitischen Flüssigkeit durch Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose gereinigt worden. Nach dem Waschen mit Puffer A, dem Triton X-100 fehlte, wurden die Antikörper-gebundenen Proteine mit 0,25 M Glycin-HCl (ph-Wert 2,6) eluiert. Das Eluat wurde unmittelbar auf einen ph-Wert von 7,5 mit 1 M Na-HEPES (pH-Wert 8,5) eingestellt und danach auf 0,1 Prozent SDS gebracht. Die Probe wurde durch Ultrafiltration in Centricon 30 (Amicon) konzentriert und der Elektrophorese in einem 7-prozentigen diskontinuierlichen Polyacrylamid-SDS-Gel unterzogen (U. K. Laemmli, Nature (London) 227, 680 (1970)). Elektroblotting von Proteinen zu Nitrozellulose und Immunoblot-Analyse mit einem Peptid-vermittelten Antikörper zu Ubiquitin wurden durchgeführt wie beschrieben P. S. Swerdlow, D. Finley und A. Varshavsky, Analyt. Biochem. 156, 147 (1986). Die gleichen Ergebnisse wurden mit einem anderen Antikörper zu Ubiquitin, erhalten von A. Haas (Univ. of Milwaukee Med. School) erzielt.
Detaillierte Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Konstruktion einer Ubiquitin-lacZ-Genfusion. pUB2, ein genomischen DNA-Klon auf pBR322-Basis (E. Ozkaynak, u. a., Nature 312, 663 (1984)) enthält sechs Wiederholungen der Ubiquitin kodierenden Hefesequenz (offene Kästen) zusammen mit den Flankenbereichen (gezackte Linien). pUB2 wurde, wie im Diagramm gezeigt, dadurch modifiziert, daß eine Bam-HI-Stelle sechs Basen abwärts von der ersten Ubiquitin-Wiederholung plaziert wurde. Dieses ermöglichte die Konstruktion einer Rahmeninnenfusion (bestätigt durch Nukleotidsequenzierung) zwischen einer einzigen Ubiquitin Wiederholung und dem lacZ-Gen des Expressionsvektors pLGSD5-ATG (genannt G2 bei L. Guarente, Methods Enzymol. 101 181 (1983)). Der Ausdruck "2 μm" bezeichnet einen Bereich von pLGSD-ATG, der den Replikationsursprung und Flankensequenzen des Hefeplasmid genannten 2-μm-Kreises enthält (vgl. L. Guarante, a. a. O.). 3B zeigt die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins in der Nachbarschaft des Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunktes.
2 zeigt, daß die Halbwertszeit in vivo von Gal eine Funktion ihres Aminoendständigen Restes ist. Kleinzellen (Bahn a), die von dem pUB23 tragenden E. coli-Stamm, der anfänglichen ub-lacZ-Fusion (1 und 3B) isoliert waren, wurden mit [³⁵S]Methionin über 60 Minuten bei 36°C markiert, mit nachfolgender Analyse von β-Gal wie beschrieben. Das gleiche Ergebnis wurde erzielt, wenn der markierte Kleinzellen-SDS-Extrakt mit einem nicht markierten Hefe-SDS-Extrakt vor der Immunausscheidung von Gal kombiniert wurde (Bahn b). S. cerevisiae-Zellen, die pUB23 (1) trugen, was ub-Met-β-Gal (3B) kodiert, wurden mit [³⁵S]Methionin über 5 Minuten bei 30°C markiert, mit nachfolgender Analyse von β-Gal. Das gleiche Ergebnis wurde erzielt bei Längen der Markierperioden mit [³⁵S]Methionin von 1 bis 30 Minuten und mit Hefeextrakten, die entweder durch mechanische Zerstörung von Zellen in Gegenwart von Proteasehemmern oder durch Aufkochen der Zellen direkt in einem SDS-haltigen Puffer produziert wurden (Bahn c). Gleich wie in Bahn a, jedoch E. coli-Zellen, die das Kontrollplasmid pLGSD5 (genannt G1 in L. Guarente, a. a. O.) trugen, welches Gal kodiert. (Bahnen d bis g) S. cerevisiae-Zellen, die pUB23 trugen (1), was ub-Met-β-Gal (3A) kodiert, wurden mit [³⁵S]Methionin über 5 Minuten bei 30°C markiert (Bahn d) gefolgt von einer Nachbehandlung in Gegenwart von Cycloheximid über 10, 30 und 60 Minuten (Bahnen e bis g), Extraktion, Immunausscheidung und Analyse von β-Gal (Bahnen h bis j) Gleich wie die Bahnen d bis f, jedoch mit ub-IIe-β-Gal (vgl. 3A). (Bahnen k bis m) Gleich wie die Bahnen h bis j, jedoch mit ub-Gln-β-Gal. (Bahnen n bis q) Gleich wie die Bahnen d bis g, jedoch ub-Leu-β-Gal. (Bahnen r bis u) Gleich wie die Bahnen d bis g, jedoch mit ub-Arg-β-Gal. Bezeichnungen: ori; Ursprung des Trenngels; ub, Ubiquitin; β-Gal, ein elektrophoretisches Band des einen spezifizierten Amino-endständigen Rest enthaltenden β-Gal-Proteins; bei dieser Terminologie wird der Met-β-Gal-Teil der ub-Met-β-Gal als β-Gal bezeichnet. Pfeilspitzen bezeichnen ein metabolisch stabiles Abbauprodukt von 90kD von β-Gal, das offensichtlich als Ergebnis einer endoproteolytischen Spaltung in vivo eines Anteils des kurzlebigen β-Gal-Proteins wie etwa Leu-β-Gal und Arg-β-Gal gebildet wird (Bahnen n bis u).
3 zeigt die wechselnden Aminosäurereste von Gal am Ubiquitin-Gal-Knotenpunkt. (A) Das Anfangsplasmid, pUB23 (1), das ub-Met-β-Gal kodiert, wurde, wie oben beschrieben, mutagenisiert, um das ursprüngliche Met- Codon ATG am ub-β-Gal-Knotenpunkt in Codons umzuwandeln, die 19 Aminosäuren als Met spezifizieren. (Die ursprüngliche Runde der Mutagenese, gezeigt in 3, produzierte 15 von 19 möglichen Substitutionen. Die verbleibenden vier Substitutionen wurden später produziert (siehe Tabelle 1)). Die Pfeilspitze zeigt die Stelle der Entubiquitinierungsspaltung in vivo im entstehenden Fusionsprotein, die bei sämtlichen Fusionsproteinen außer ub-Pro-Gal auftritt (siehe Text). Sämtliche der gezeigten Konstruktionen kodieren His als zweiten Gal-Rest. Zusätzlich folgten bei einigen der Konstruktionen (ub-Met-His-Glyβ-Gal, ub-Met-Gln-Gly-β-Gal und ub-Met-Gln-His-Gly-β-Gal, letztere hergestellt durch eine Einsatzmutation, siehe Tabelle 2) entweder His oder Gln auf Met am Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunkt, mit nicht unterscheidungsfähigen Konsequenzen für die metabolischen Stabilitäten der entsprechenden Gal-Proteine. (B) Die Aminosäuresequenz (in Einzelbuchstaben-Abkürzungen) von ub-Met-β-Gal, das Anfangsfusionsprotein (1) in der Nachbarschaft des ub-β-Gal-Knotenpunkts. Einzelbuchstaben-Abkürzungen von Aminosäuren: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, IIe; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; Y, Tyr.
4 zeigt, daß Ubiquitin-Gal, falls nicht entubiquitiniert, kurzlebig ist. (Bahnen a bis g) S. cerevisiae-Zellen, die Plasmide tragen, welche ub-X-β-Gal-Fusionsproteine kodieren, bei denen X der am oberen Ende jeder Bahn angegebene Rest ist, wurden 5 Minuten bei 30°C [³⁵S]Methionin markiert, gefolgt von Extraktion, Immunausscheidung und Analyse von β-Gal. Fluorographische Expositionen für diese Bahnen waren mehrfach länger als diejenigen für ähnli che Muster in 2 zur Enthüllung der multiplen Ubiquitinierung kurzlebiger β-Gal-Proteine. (Bahnen h, i) Fluorographische Überexposition der Bahnen n, o in 2 zur Enthüllung der "Leiter" von mehrfach ubiquitinierten Leu-β-Gal-Proteinen in einem Impulsbehandlungsexperiment (Behandlung von 0 bzw. 10 Minuten). (Bahn j) Gleich wie Bahnen a bis g, jedoch mit ub-Pro-β-Gal. (Bahn k) Gleich wie Bahn j, jedoch mit ub-Gln-ß-Gal. (Bahn j) Gleich wie Bahn j. (Bahnen m bis p) S. cerevisiae-Zellen, die ein Plasmid trugen, das ub-Pro-ß-Gal kodiert, wurden 5 Minuten bei 30°C mit [³⁵S]Methionin markiert (Bahn m), gefolgt von einer Nachbehandlung in Gegenwart von Cycloheximid über 10, 30 und 60 Minuten (Bahnen n bis p). Der obere kleine Pfeil rechts bei der Bahn p bezeichnet ub-Pro-β-Gal, wovon ein kleiner Teil noch nach einer Nachbehandlung von einer Stunde vorhanden ist. Der untere kleine Pfeil zeigt eine augenscheinlich entubiquitinierte Pro-β-Gal an, die sich langsam während der Nachbehandlung ansammelt und metabolisch stabil ist. Der Punkt links an der Bahn m bezeichnet ein endogenes Hefeprotein, das bei einigen Versuchen durch den verwendeten Antikörper ausgefällt wird. Eckige Klammern bezeichnen die mehrfach ubiquitinierten β-Gal-Spezies (siehe 5). Weitere Bezeichnungen sind die gleichen wie in 2.
5 zeigt die "Leiter"-Gal-Spezies, die Ubiquitin enthält. (Bahn a) S. cerevisiae-Zellen, die ein Plasmid trugen, welches ub-Gln-β-Gal kodiert, wurden aufgezogen und zerstört, und die Extrakte wurden zur Isolierung von β-Gal-Proteinen durch Affinitätschromatographie bei einer Säule mit immobilisiertem Antikörper gegen β-Gal behandelt. Die so gewonnenen β-Gal-Proteine wurden in einem Polyacrylamid-SDS-Gel elektrophoretisch behandelt, zu Nitrozellulose übertragen und mit einem Antikörper zu Ubiquitin untersucht. (Bahn b) Gleich wie Bahn a, jedoch mit ub-Pro-β-Gal. (Bahn c) Gleich wie b, jedoch eine längere autoradiographische Exposition. (Bahn d) S. cerevisiae-Zellen, die ein Plasmid trugen, welches ub-Leu-β-Gal kodiert, wurden mit (³⁵S]Methionin 5 Minuten markiert, mit nachfolgender Extraktion, Immunausscheidung und Elektrophorese von β-Gal (die gleiche Probe wie in 4, Bahn f). Eckige Klammern bezeichnen die mehrfach ubiquitinierte Gln-β-Gal-Spezies, ermittelt mit Antikörper zu Ubiquitin. Die Pfeilspitzen zeigen die Position des Bandes entubiquitinierter β-Gal (feststellbar durch entweder Anfärben mit Coomassie oder metabolische Markierung, jedoch nicht mit einem Antikörper zu Ubiquitin), abgeleitet vom ub-Gln-β-Gal-Fusionsprotein.
6 zeigt, daß sowohl prokaryotische als auch eukaryotische langlebige intrazelluläre Proteine stabilisierende Aminosäurereste an ihren Aminoendpunkten aufweisen, während abgesonderte Proteine eine komplementäre Vorlage zeigen.
(A) 208 langlebige, direkt sequenzierte, intrazelluläre (nicht-kompartimentierte) Proteine mit nicht-blockierten Aminoendpunkten von sowohl Prokaryoten (77 Proteine) als auch Eukaryoten (131 Proteine) wurden in drei Gruppen nach der Beschaffenheit ihrer Amino-endständigen Reste gemäß Definition durch die N-Ende-Regel aufgeteilt (Tabelle 1). Sämtliche der untersuchten langlebigen intrazellulären Proteine tragen ausschließlich stabilisierende Reste an ihren Ami noendpunkten. In den Feldern B bis D finden sich Darstellungen von analogen Diagrammen für 243 abgeschiedene eukaryotische Proteine (B), für 37 leichte und schwere Immunoglobulinketten (C) und für 94 abgeschiedene eukaryotische Toxine (D). Die Einträge in C und D sind Teilmengen der Einträge B. Für Proteine in B bis D entsprechen die zusammengetragenen Aminoendpunkte, wenn immer die Zuordnung möglich ist, der meistbearbeiteten Form eines Proteins, das noch innerhalb einer Abscheidungszelle lokalisiert ist. Die Daten A bis D wurden aus dem gesamten Satz vollständiger Proteinsequenzen, die vor 1981 verfügbar waren, manuell zusammengestellt. Die gleichen Schlußfolgerungen wurden kürzlich nach einer detaillierteren und umfangreicheren, computergestützten Tabulierung von Protein-Aminoendpunkten unter Nutzung der aktuellen Datenbank der National Biomedical Research Foundation gewonnen. Die Amino-endständigen Reste von Asn, Cys, His und Trp wurden aus der Zusammenstellung ausgeschlossen, weil Halbwertszeiten in vivo der entsprechenden Gal-Proteine noch unbekannt sind (siehe jedoch die Legende zu Tabelle 1). Die Einbeziehung der Reste (Tabelle 1) in eine kürzliche Zusammenstellung der gleichen Art veränderte die ursprüngliche Schlußfolgerung nicht. Obgleich das Amino-endständige Pro ebenfalls von der Zusammenstellung ausgeschlossen war, scheint Pro ein stabilisierender Rest für β-Gal zu sein (Tabelle 1), in Konsistenz mit dem häufigen Vorkommen von Pro an den Aminoendpunkten langlebiger nichtkompartimentierter Proteine.
Ergebnisse und Diskussion
Schnelle Entubiquitinierung in vivo eines naszierenden Ubiquitin-β-Gal-Fusionsproteins
Verzweigte Ubiquitinkonjugate, bei denen das Carboxyl-endständige Glycin von Ubiquitinkomponenten über eine Isopeptid-Bindung mit den ε-Aminogruppen von internen Lysinresten in Proteinen vereinigt ist, umfassen offenbar die Hauptmenge von Ubiquitinkonjugaten in eukaryotischen Zellen. Die Verbindung von Ubiquitin mit den Amino-endständigen α-Aminogruppen von Targetproteinen zur Erbringung von linearen Ubiquitinkonjugaten kann auch auf chemischem Wege durchführbar sein. Siehe A. Hershko, u. a., PNAS USA 81: 7021 (1984). Ob lineare Ubiquitin-Protein-Fusionen gegenwärtig in vivo durch posttranslatorische enzymatische Konjugation von Ubiquitin mit Protein-Aminoendpunkten synthetisiert werden oder nicht, können derartige Proteine auch dadurch produziert werden, daß geeignete Chimärengene konstruiert und diese in vivo ausgeprägt werden. Die Konstruktion eines solchen Gens, das Hefeubiquitin gebunden an Gal von Escherichia coli kodiert, ist in 1 gezeigt.
Wenn dieses Gen in E. coli ausgeprägt wird, hat das resultierende β-Gal-haltige Protein eine augenscheinliche molekulare Masse, die etwa 6 kD größer ist als diejenige der Kontroll-β-Gal, ein Wert, der sich mit dem Vorhandensein von Ubiquitin in dem durch das Chimärengen kodierten Protein versteht. Im Gegensatz dazu ist, wenn das gleiche Gen in Hefe ausgeprägt wird, das entsprechende β-Gal-Protein elektrophoretisch von der Kontroll-β-Gal nicht zu unterschei den. Dieses Ergebnis ist unabhängig von der Länge des Zeitraums der Markierung mit [³⁵S]Methionin (zwischen 1 und 30 Minuten). Ferner bestätigte die Bestimmung des Amino-endständigen Restes in der putativen Met-β-Gal (Halbwertszeit t_1/2 20 Stunden) durch Edman-Abbau der in vivo markierten, Gelgereinigten β-Gal (2, Bahn d) direkt das Vorhandensein des erwarteten Met-Restes (3A und Tabelle 1) am Aminoendpunkt. Ein unabhängiger Beweis dafür, daß die Ubiquitinabspaltung vom Fusionsprotein unmittelbar nach dem letzten Gly-Rest von Ubiquitin auftritt, wird nachstehend erbracht. Wir schlußfolgern, daß in Hefe Ubiquitin wirksam von dem naszierenden Ubiquitin-Fusionsprotein abgespalten wird, was eine entubiquitinierte β-Gal erbringt. [Das Fehlen der Entubiquitinierungsreaktion in E. coli steht in Übereinstimmung mit anderen Beweisführungen, die aussagen, daß den Prokaryoten sowohl Ubiquitin als auch Ubiquitin-spezifische Enzyme fehlen].
Die durch das Chimärengen, Gly-Met (1 und 3B) kodierte Ubiquitin-β-Gal-Verbindung ist identisch mit den Verbindungen zwischen benachbarten Wiederholungen im Polyubiquitin-Vorläuferprotein, das wirksam zu ausgereiftem Ubiquitin verarbeitet wird. Somit ist es wahrscheinlich, daß die gleiche Protease, bis jetzt biochemisch nicht charakterisiert, sowohl für die Umwandlung von Polyubiquitin in ausgereiftes Ubiquitin als auch für die Entubiquitinierung des naszierenden Ubiquitin-β-Gal-Proteins verantwortlich ist. Falls dem so ist, wäre es ein potentieller Weg, die Entubiquitinierung in vivo der Ubiquitin-β-Gal zu unterbinden (und dadurch eine Analyse der metabolischen Konsequenzen einer stabilen Ubiquitin-Anheftung an β-Gal zu ermöglichen), den Met-Rest von β-Gal am Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunkt (3B) in andere Aminosäurereste umzuwandeln (3A). Die unerwarteten Ergebnisse eines derartigen Vorgehens sind nachstehend beschrieben.
Die Halbwertszeit in vivo von β-Gal ist eine Funktion ihres Amino-endständigen Restes.
Das ATG-Codon, welches den ursprünglichen Met-Rest von Gal am Ubiquitin-Knotenpunkt (3B) spezifiziert, wurde durch stellengerichtete Mutagenese in 19 andere Aminosäuren (siehe 3A und Tabelle 1) spezifizierende Codons umgewandelt. Diese Konstruktionen unterscheiden sich ausschließlich im ersten Codon von β-Gal am Ubiquitin-Knotenpunkt (3A). Nachdem jedes der so ausgebildeten 16 Plasmide in Hefe eingesetzt wurde, führte die Analyse der entsprechenden in vivo impulsmarkierten Gal-Proteine zu den folgenden Ergebnissen (2, 4 und Tabelle 1):

1) Mit einer Ausnahme (siehe unten) erfolgt die wirksame Entubiquitinierung der naszierenden Ubiquitin-β-Gal ungeachtet der Beschaffenheit des Aminosäurerestes von β-Gal am Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunkt. Somit ist die offenbar Ubiquitin-spezifische Protease, die das ursprüngliche Ubiquitin-β-Gal-Protein am Gly-Met-Knotenpunkt aufspaltet, im allgemeinen unempfindlich gegenüber der Beschaffenheit des ersten Restes von β-Gal am Knotenpunkt (3A und Tabelle 1). Dieses Ergebnis macht es in der Tat möglich, unterschiedliche Aminosäurenreste an den Aminoendpunkten von ansonsten identischen, in vivo produzierten β-Gal-Proteinen freizulegen.
2) Die Halbwertszeiten in vivo der so ausgebildeten β-Gal-Proteine variieren von mehr als 20 Stunden bis zu weniger als 3 Minuten in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des am Aminoendpunkt der β-Gal freigelegten Aminosäurerestes (2, 4 und Tabelle 1). Speziell haben mit entweder Met, Ser, Ala, Thr, Val, Cys oder Gly am Aminoendpunkt entubiquitinierte β-Gal-Proteine verhältnismäßig lange Halbwertszeiten in vivo von 20 Stunden oder mehr (2, Bahnen d bis g, und Tabelle 1), ähnlich der Halbwertszeit einer Kontroll-β-Gal, deren Gen nicht mit dem von Ubiquitin verschmolzen worden war. In starkem Gegensatz dazu haben die β-Gal-Proteine mit entweder Arg, Lys, Phe, Leu, Asp oder Trp am Aminoendpunkt sehr kurze Halbwertszeiten zwischen etwa 2 Minuten für Arg-β-Gal und etwa 3 Minuten für Lys-β-Gal, Phe-β-Gal, Leu-β-Gal, Asp-β-Gal, Asn-β-Gal und Trp-β-Gal (2, Bahnen n bis u, Tabelle 1). Die Halbwertszeit von β-Gal-Proteinen mit Amino-endständigen Resten von entweder Gln, His oder Tyr beträgt etwa 10 Minuten (2, Bahnen k bis m, und Tabelle 1), während eine Amino-endständige Ile oder Glu der β-Gal eine Halbwertszeit von etwa 30 Minuten vermittelt (2, Bahnen h bis j, und Tabelle 1). Sowohl Impulsbehandlung als auch kontinuierliche Markiertechniken wurden bei diesen Ergebnissen verwendet und erbrachten ähnliche Ergebnisse.

Der Satz einzelner Aminosäuren kann mit Blick auf die Halbwertszeiten geordert werden, die sie Gal bei Freilegung an ihrem Aminoendpunkt vermitteln. Die resultierende Regel (Tabelle 1) wird als die "N-Ende-Regel" bezeichnet. Tabelle 1 Die N-Ende-Regel
*Die Rate der Entubiquitinierung in vivo von ub-Pro-β-Gal ist extrem niedrig. Der gezeigte Wert t1/2 ist derjenige des anfänglichen ub-Pro-β-Gal-Fusionsproteins (siehe 4, Bahnen j bis p).
Legende zu Tabelle 1
Die N-Ende-Regel. Die Halbwertszeiten in vivo von β-Gal-Proteinen in der Hefe S. cerevisiae wurden entweder durch die Impulsbehandlungstechnik (für kurzlebige Gals; siehe unten) oder durch Messung der enzymatischen Aktivität von Gal in Rohextrakten bestimmt. Für die Messung der β-Gal-Aktivität wurden in einem galactosehaltigen Medium wachsende Zellen an ein im übrigen identisches Medium übertragen, dem Galactose fehlte und das 10 Prozent Glucose enthielt. Nach einem weiteren Wachstum über zumindest 5 Stunden bei 30°C wurde das Verhältnis von β-Gal-Aktivitäten pro Zelle vor und nach der Verschiebung auf Glucose für jedes der β-Gal-Proteine bestimmt. [Gal-Promoter gesteuerte Ausprägung der Fusionsgene (1 und 3) wird im Glucosemedium zurückgedrängt]. Für kürzerlebige β-Gal-Proteine (t1/2 < 1 Stunde) wurde die Impulsbehandlungstechnik ebenfalls verwendet (2 und 4). Elektrophoretische Bänder von β-Gal-Proteinen, markiert mit [²⁵S]Methionin in Puls-Behandlungsexperimenten, wurden von mit einer Scintillationssubstanz imprägnierten getrockneten Gels ähnlich denen der 2 und 4 ausgeschnitten, und ³⁵S in den Bändern wurde bestimmt. Der Zerfall in vivo kurzlebiger Gal-Proteine wich von der Kinematik erster Ordnung in sofern ab, als die Abbaurate bei Messung zu späteren Zeitpunkten (1 Stunde) der Behandlung niedriger war, wobei die niedrigere Rate entweder einen zeitabhängigen toxischen Effekt von Cycloheximid oder intrinsische Eigenschaften des Abbauprozesses in vivo wiedergab. [Ein Anhalten der Translation ist für eine wirksame Kurzzeitbehandlung in S. cerevisiae erforderlich wegen der Aminosäuren-Poolausgleichungsprobleme, die mit dem Vorhandensein von Vakuolen in diesem Organismus in Verbindung stehen]. Die unten aufgeführten Halbwertszeitwerte wurden für die ersten 10 Minuten der Behandlung bestimmt. Mehrere Beweislinien (siehe Beschreibung der 4 und 6) lassen darauf schließen, daß Pro ein Stabilisierungsrest ist. Die aufgelisteten Trägheitsradien der Aminosäuren sind M. Levitt, J. Mol. Biol. 104: 59 (1976) entnommen.
Der Amino-endständige Platz einer Aminosäure ist wesentlich für ihre Wirkung auf die Halbwertszeit von Gal
Es wurde eine ortsgerichtete Mutagenese angewandt, um ein eine "stabilisierende" Aminosäure spezifizierendes Codon (bei diesem Experiment der Met-Rest) vor dem ersten Codon von β-Gal am Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunkt einzusetzen (Tabelle 2). Die Einsetzung eines stabilisierenden Restes (Met) vor entweder einem anderen stabilisierenden Rest (Thr) oder einer Vielfalt von destabilisierenden Resten (Gln, Lys und Arg) am Ubiquitin-β-Gal-Knotenpunkt führt unveränderlich zu einer langlebigen entubiquitinierten β-Gal (Tabelle 2). Des weiteren wird im Gegensatz zu Ubiquitin-Pro-β-Gal, die nicht nur kurzlebig, sondern auch widerstandsfähig gegenüber einer Entubiquitinierung ist (4, Bahnen j bis p und Tabelle 1) Ubiquitin-Met-Pro-β-Gal wirksam in vivo entubiquitiniert, um eine langlebige Met-Pro-β-Gal zu erbringen (Tabelle 2). Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die Identität des Aminosäurerestes und sein Amino-endständiger Platz (wahrscheinlich das Vorhandensein einer freien α-Aminogruppe) wesentlich für seine Wirkung auf die Halbwertszeit von β-Gal sind. Zusätzlich stützen diese Ergebnisse (Tabelle 2) weiterhin die Erwartung, daß die Ubiquitinabspaltung vom Fusionsprotein unmittelbar nach dem letzten Gly-Rest des Ubiquitins auftritt (3A).
Tabelle 2 Der N-endständige Platz einer Aminosäure ist wesentlich für ihre Wirkung auf die Halbwertszeit von β-Gal
Der Amino-endständige Platz einer Aminosäure ist wesentlich für ihre Wirkung auf die Halbwertszeit von β-Gal. Die Einsetzmutanten erhielt man im wesent lichen wie für den Anfangssatz der Mutanten beschrieben, mit der Ausnahme, daß ein 32-Rest-Oligonucleotid, 5'-CCCGGGATCCGTGC (G/C/T/) (G/T) CATACCACCTCTTAG benutzt wurde, 14 Basen auf der 5'-Seite und 15 Basen auf der 3'-Seite des hinter dem Met-Codon eingesetzten mehrdeutigen Codons enthaltend. Die Basen in Klammern bezeichnen Mehrdeutigkeiten an den Positionen 16 und 17 in der Sequenz. Die Halbwertszeiten der entsprechenden β-Gal-Proteine wurden nach der Beschreibung in der Legende zu Tabelle 1 bestimmt.
Ein langlebiges Spaltungsprodukt von Gal wird während des Abbaus kurzlebiger β-Gal-Proteine gebildet.
Die elektrophoretischen Muster von kurzlebigen (jedoch nicht von langlebigen) β-Gal-Proteinen enthalten unveränderlich ein spezifisches Spaltungsprodukt von 90 kD von β-Gal (2, Bahnen n bis u), das sich, anders als die Mutterβ-Gal-Spezies, während der Nachmarkierungsbehandlung (chase) ansammelt (4, Bahnen m bis p). Das β-Gal-Fragment von 90 kD bildet einen verhältnismäßig kleinen Teil der Anfangsmenge der impulsmarkierten β-Gal. Nichtsdestoweniger besagt seine Existenz, daß eine endoproteolytische Spaltung in vivo ein Proteinfragment vor dem metabolischen Schicksal seines kurzlebigen Mutterproteins retten kann. Es bleibt abzuwarten, ob die sich ergebende Möglichkeit mehrfacher Halbwertszeiten innerhalb einer einzelnen Proteinspezies bei der Konstruktion von natürlicherweise kurzlebigen Proteinen ausgenutzt wird.
Ubiquitin-β-Gal ist ohne Entubiquitinierung kurzlebig
Ubiquitin-Pro-β-Gal, die einzige Ubiquitin-β-Gal-Fusion, die nicht in vivo entubiquitiniert wird (4, Bahnen j bis p), hat eine Halbwertszeit von etwa 7 Minuten (Tabelle 1), was weniger ist als 1 Prozent der Halbwertszeit von metabolisch stabilen β-Gal-Proteinen (Tabelle 1). Eine Interpretation dieses Ergebnisses besteht darin, daß eine metabolisch stabile Ubiquitin-Anheftung an Protein-Aminoendpunkte ausreichend ist, um einen Abbau von Akzeptorproteinen zu signalisieren. Diese Interpretation steht im Einklang mit früheren biochemischen und genetischen Beweisführungen, daß eine Ubiquitinierung kurzlebiger Proteine in einer Säugetierzelle wesentlich für ihren Abbau ist. Gleichzeitig werden sämtliche Ubiquitin-β-Gal-Fusionsproteine außer Ubiquitin-Pro-β-Gal schnell in vivo entubiquitiniert (Tabelle 1). Somit darf die posttranslatorische aminoterminale Ubiquitinierung von Proteinen an einem anfänglichen Erkennungs- oder Erwartungsschritt, der Proteine für einen Abbau in vivo bezeichnet, nicht beteiligt sein. Ob eine posttranslatorische aminoterminale Ubiquitinierung (falls sie tatsächlich in vivo auftritt) wesentlich ist für spätere Stufen des Abbauweges, bleibt noch zu bestimmen. Frühere Experimente in vitro zeigten, daß die chemische Vorzugsmodifizierung von Aminoendpunkten von proteolytischen Substraten ihren Abbau in einem Ubiquitin-abhängigen proteolytischen System in vitro verhindert. Auf der Grundlage dieser Daten war davon auszugehen, daß eine aminoterminale Ubiquitinierung von Proteinen wesentlich für ihren Abbau ist. Eine alternative Interpretation der gleichen Ergebnisse besteht darin, daß eine chemische Blockierung der Aminoendpunkte der Proteine die Erkennung ihrer Amino-endständigen Reste durch den "N-Ende-Regel"-Weg verhindert, dessen anfängliche Stufen nicht notwendigerweise Ubiquitin-abhängig sind.
Kurzlebige β-Gal-Proteine werden in vivo mehrschichtig ubiquitiniert.
Überexpositionen von Impulsbehandlungsfluorogrammen (2) legen dar, daß das Hauptband eines entubiquitinierten, kurzlebigen β-Gal-Proteins mit einer "Leiter" einer größeren Molekularmasse coexistiert, wobei β-Gal-haltige Bänder unregelmäßig mit Intervallen von 4 bis 7 kD beabstandet sind (4, Bahnen c bis g). Keine derartigen größeren Spezies erscheinen, wenn die Fluorogramme langlebiger β-Gal-Proteine in gleicher Weise einer Überexposition ausgesetzt werden (4, Bahnen a und b). Eine immunologische Analyse sowohl mit Antikörpern zu β-Gal als auch Antikörpern zu Ubiquitin beweist, daß die "Leiter"-β-Gal-Spezies Ubiquitin enthalten (5).
Ein Modell für den selektiven Abbauweg
Mit Ausnahme von natürlichen oder konstruierten Ubiquitin-Fusionsproteinen (1 und Tabelle 1) fehlen den naszierenden Proteinen offensichtlich Ubiquitinkomponenten. Die Amino-endständige Behandlung in vivo von naszierenden nicht-kompartimentierten Proteinen erzeugt ihre ausgereiften Aminoendpunkte über die Wirkung von Amino-endständigen Peptidasen, deren Substratspezifitäten zum Teil charakterisiert worden sind. (siehe Tsunasawa, S. u. a. J. Biol. Chem. 260 5382 (1985); Boissel, J.P. u. a. PNAS USA 82, 8448 (1985)). Wir unterstellen, daß die so erzeugten Aminoendpunkte von einem "N-Ende-Lese"-Enzym erkannt werden. Ein spezifisches Modell ist, daß eine Erwartung für den Abbau eines Proteinmoleküls als Ergebnis der Erkennung seines Aminoendständigen Restes durch ein stochastisch arbeitendes Enzym erfolgt, dessen Wahrscheinlichkeit des "Klemmens" am Aminoendpunkt des Targets durch die N-Ende-Regel bestimmt wird (Tabelle 1). Sobald die Erwartung besteht, folgt ihr eine hochgradig prozessive Ubiquitinierung des Targetproteins, das im Falle von β-Gal zu mehr als 15 Ubiquitinanteilen pro Molekül Gal konjugiert wird ( 4, Bahnen c bis g, und 5). Das mehrschichtige ubiquitinierte Targetprotein wird dann von einem "Abwärts"-Enzym (1) abgebaut, für das die Ubiquitinanteile des Targets entweder als Erkennungssignale oder Denaturations(Entfaltungs)-Mittel oder beides dienen.
Die Ubiquitin-haltigen "Leiter"-β-Gal-Spezies (4, Bahnen c bis l, und 5) bestehen aus offensichtlich verzweigten Ubiquitinanteilen, die mit den e-Aminogruppen von internen Lysinresten in β-Gal vereinigt sind. Überraschenderweise sind die von Ubiquitin-Pro-β-Gal abgeleiteten "Leiter"-β-Gal-Spezies elektrophoretisch nicht unterscheidbar von den analogen Spezies von β-Gal, deren Amino-endständiges Ubiquitin vom naszierenden Fusionsprotein abgespaltet ist (4, Bahnen j bis l, und 5). Falls die elektrophoretisch nicht unterscheidbaren ubiquitinierten β-Gal-Spezies tatsächlich strukturmäßig homolog sind, stünden diese Ergebnisse im Einklang mit zwei alternativen Modellen, bei denen, unmittelbar nachdem die ersten Ubiquitine mit β-Gal zweigkonjugiert sind, entweder eine zweig-ubiquitinierte Ubiquitin-Pro-β-Gal eine Amino endständige Entubiquitinierung erfährt oder, alternativ, eine analoge β-Gal-Spezies, der die Amino-endständige Ubiquitinkomponente fehlt, sie wiedererlangt. Eine experimentelle Auflösung dieser Unklarheit mag ergeben, ob die posttranslatorische Amino-endständige Ubiquitinierung von Proteinen, (falls sie in vivo auftritt) eine Rolle beim selektiven Protein-Turnover spielt.
Obgleich sowohl prokariotische als auch eukaryotische Proteine der N-Ende-Regel zu folgen scheinen (siehe unten), fehlt den Bakterien offensichtlich das Ubiquitinsystem. Somit ist es möglich, daß das hypothetische N-Ende-Erkennungsprotein stärker zwischen Prokaryoten und Eukaryoten als der Rest des selektiven Abbauweges gehalten wird. Interessanterweise stehen die Eigenschaften eines Säugetier-Proteins E3, dessen Vorhandensein erforderlich ist für die Ubiquitinierung von proteolytischen Substraten durch Ubiquitin-Konjugationsenzyme in vitro, im Einklang damit, daß es eine Komponente des N-Ende-Erkennungsproteins ist.
Die N-Ende-Regel und die bekannten Aminoendpunkte von intrazellulären Proteinen.
Die nicht-blockierten Amino-endständigen Reste in metabolisch stabilen, nichtkompartimentierten Proteinen sowohl von Prokaryoten als auch Eukaryoten gehören ausschließlich (6A) zur stabilisierenden Klasse (Met, Ser, Ala, Gly, Thr, Val), das heißt der Klasse, die Gal lange Halbwertszeiten in vivo vermittelt (Tabelle 1). Das eine kurzlebige intrazelluläre Protein, für das der ausge reifte Aminoendpunkt bekannt ist, ist das cII-Protein des Phagen Lambda, die zentrale Komponente eines Startreagens, das bestimmt, ob λ lytisch wächst oder eine infizierte Zelle lysogenisiert. (Y.S. Ho, D. Wulff, M. Rosenberg, in Regulation of Gene Expression, l. Booth und C. Higgins, Herausgeber (Cambridge Univ. Press, London, 1986), Seite 79; F. Banuett, M.A. Hoyt, L. McFarlane, H. Echols, I. Herskowitz, J. Mol. Biol. 187, 213 (1986); M.A. Hoyt, D.M. Knight, A. Das, H.I. Miller, H. Echols, Cell 31, 565 (1982); K. Nasmyth, Nature (london) 320, 670 (1983)). Die Halbwertszeit von cII bei Lambda-infiziertem E. coli beträgt weniger als 3 Minuten. Auffällig ist, daß der ausgereifte Aminoendpunkt von cll mit Arg (Ho, Y.W. u. a., J. Biol. Chem. 257, 9128 (1982)) startet, dem am meisten destabilisierenden Rest der N-Ende-Regel (Tabelle 1).
Während die destabilisierenden Aminosäuren entweder hydrophob, ungeladen hydrophil oder geladen sein können, teilen sie die Eigenschaft, daß sie größere Trägheitsradien aufweisen als irgendeine der stabilisierenden Aminosäuren außer Met (Tabelle 1).
Amino-endständige Reste in kompartimentierten Proteinen gehören zum großen Teil zur stabilisierenden Klasse.
Die 6 veranschaulicht einen deutlichen Unterschied zwischen der Wahl von Amino-endständigen Resten bei langlebigen, nicht-kompartimentierten intrazellulären Proteinen (A) und bei kompartimentierten Proteinen, wie etwa abgeschiedenen Proteinen (B), von denen viele auch langlebig in ihren jeweiligen extrazellulären Kompartiments sind. Eine Implikation dieser Erkenntnis ist, daß ein einziger intrazellulärer Abbauweg, der nach der N-Ende-Regel arbeitet, sowohl für die Verschiedenheit von Halbwertszeiten in vivo von intrazellulären Proteinen als auch für die selektive Zerstörung von kompartimentierten Proteinen verantwortlich sein könnte, die abweichend in den intrazellulären Raum eingeführt werden. Solche mißkompartimentierten Proteine können für die Zelle schädlicher sein als andere. Es ist daher von Interesse, daß abgeschiedene eukaryotische Toxine stark destabilisierende Reste (Arg, Lys, Leu, Phe, Asp) an ihren Aminoendpunkten öfter enthalten als die allgemeine Population abgeschiedener Proteine (6, Felder B bis D).
Die obige Betrachtung läßt auch die Vermutung zu, daß, wenn die topologische Außenseite einer Zelle, wie etwa die Lumina des endoplastischen Retikulums und Golgi-Komplexes, und der extrazelluläre Raum Abbauwege analog dem N-Ende-Regel-Weg haben sollten, sie auf "invertierten" Versionen der N-Ende-Regel basieren könnten, bei denen Amino-endständigen Reste, die in der Zelle destabilisieren, nun die Stabilisierenden sind und umgekehrt. Somit müssen die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung auch vorteilhaft für die Beeinflussung der metabolischen Stabilität und anderer Eigenschaften kompartimentierter Proteine, einschließlich der sekretierten, sein.
Mögliche Rolle des N-Ende-Regel-Wegs beim Turnover langlebiger Proteine
Langlebige intrazelluläre Proteine mit destabilisierenden (Tabelle 1) vorletzten Resten behalten im allgemeinen ihren anfänglichen Amino-endständigen Methioninrest bei. Die Amino-endständigen Reste in langlebigen intrazellulären Proteinen, die eine Amino-endständige Behandlung erfahren, gehören unveränderlich zur stabilisierenden Klasse (Tabelle 1). Eine interessante Möglichkeit, die den N-Ende-Regel-Weg im Turnover langlebiger Proteine beinhalten würde, besteht darin, daß der Ratenbegrenzungsschritt beim Abbau langlebiger Proteine in vivo eine langsame Aminopeptidasespaltung sein kann, die einen destabilisierenden Rest freilegt, gefolgt von einem schnellen Abbau über den N-Ende-Regel-Weg. Zu beachten ist, daß eine Feinabstimmung der Abbaurate in diesem Fall eine Funktion der Rate der einen destabilisierenden Rest freilegenden Aminopeptidasespaltung sein kann und nicht eine Funktion der Destabilisierungsfähigkeit des Restes gemäß der N-Ende-Regel.
Die N-Ende-Regel und der selektive Abbau kurzlebiger und beschädigter Proteine
Es ist unwahrscheinlich, daß die Erkennung von Polypeptidketten-Faltungsmustern oder von lokalen chemischen Merkmalen, die auf ein ansonsten langlebiges, jedoch beschädigtes Protein für einen selektiven Abbau in vivo zielen, direkt durch den N-Ende-Regel-Weg vermittelt wird. Statt dessen gehen wir davon aus, daß spezifische Proteasen (in der Funktion analog zu Nucleasen, die spezifische Lesionen in der DNA erkennen) ein angezieltes Protein spalten, um so einen destabilisierenden Rest am Aminoendpunkt eines oder der beiden Produkte einer Spaltung freizulegen. Eine testfähige Voraussage dieses Modells ist, daß die anfänglichen Spaltungsprodukte des Abbauweges destabilisierende Reste an ihren N-Endpunkten tragen müssen. Die Vorzugsexposition destabilisierender Reste an den Aminoendpunkten von Produkten der anfänglichen Proteinspaltungen kann entweder auf intrinsische Spezifitäten der beteiligten Proteasen oder einfach auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß eine Mehrheit der Aminosäuren zur destabilisierenden Klasse (Tabelle 1) gehört. Des weiteren stünde zu erwarten, daß anfängliche Spaltungen eines Proteins Aspekte seiner ursprünglichen Struktur destabilisieren, womit die Wahrscheinlichkeit weiterer interner Schnitte erhöht wird. Ob die anfänglichen Spaltungsprodukte eines Proteins ausschließlich über den N-Ende-Regel-Weg abgebaut würden oder durch zusätzliche interne Spaltungen weiter bearbeitet werden müßten, würde von mehreren Faktoren abhängen, wie etwa der Freilegung destabilisierender Reste an den Aminoendpunkten anfänglicher Spaltungsprodukte, und den relativen Raten der Einbringung interner Schnitte. Bei diesem Modell würde der N-Ende-Regel-Weg wesentlich sein für den Abbau der meisten der metabolisch instabilen Proteine, von chemisch beschädigten, vorzeitig abgeschlossenen, nicht richtig gefalteten und mißkompartimentierten bis zu jenen, die sich nicht zu nativen Multiuntereinheitsaggregaten zusammenfügen, und schließlich zu ansonsten normalen Proteinen, die in vivo kurzlebig sind. Somit kann die metabolische Instabilität eines Proteins nicht nur durch die Freilegung eines destabilisierenden Restes an ihrem Aminoendpunkt vermittelt werden, sondern auch durch lokale strukturelle chemische Merkmale seiner Polypeptidkette, die zu proteolytischen Spaltungen führen, welche destabilisierende Reste an den Aminoendpunkten der Spaltungsprodukte freilegen.
Für ein gegebenes Protein kann eine Vielfalt von Faktoren zusätzlich zur N-Ende-Regel bei der Modellierung seiner Halbwertszeit in vivo zusammenwirken. Unter solchen Faktoren können genannt werden die Flexibilität und Zugänglichkeit des Aminoendpunktes des Proteins (Thornton, J.M. und Sibanda, B.L., J. Mol. Bio. 167443 (1983)), das Vorhandensein chemisch blockierender Aminoendständiger Gruppen wie etwa der Acetylgruppe, die Verteilung von ubiquitinfähigen Lysinresten nahe dem Aminoendpunkt und andere Variablen, wie etwa die Struktur des Carboxyendpunktes. Da Amino-endständige Bereiche von Multiuntereinheitsproteinen gewöhnlich bei den Schnittflächen zwischen Untereinheiten beteiligt sind (Thornton, J.M. und Sibanda, B.L., J. Mol. Bio. 167443 (1983)), ist die quarternäre Struktur des Proteins noch ein weiterer Parameter, von dem angenommen wird, daß er die Wirkung des N-Ende-Regel-Wegs auf die Proteinhalbwertszeiten in vivo moduliert. Schließlich kann, wie oben in Ansatz gebracht wurde, der N-Ende-Regel-Weg auch wesentlich sein für den Abbau von Proteinen, deren anfängliche Erkennung als Targets zum Abbau unabhängig von der Struktur an ihren Aminoendpunkten ist.
Funktionelle Bedeutung eines posttranslatorischen Zusatzes von Aminosäuren zu Aminoendpunkten von Proteinen.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß sowohl in Bakterien als auch in Eukaryoten eine ungewöhnliche Klasse von Enzymen, Aminoacyl-Transfer-RNA-Protein-Transferasen, existiert, die eine posttranslatorische Konjugation von spezifischen Aminosäuren mit ausgereiften Aminoendpunkten von Akzeptorproteinen in vitro katalysieren (R.L. Sofer, in Transfer RNA : Biological Aspects, D. Soll, J.N. Abelson, P.R. Schimmel, Herausgeber (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1980), Seite 493; C. Deutch, Methods Enzymol. 106, 198 (1984): A. Kaji, H. Kaji, G.D. Novelli, J. Biol. Chem. 240, 1185 (1965)). Die posttranslatorische Zugabe von Aminosäuren zu Proteinen in vivo beschleunigt dramatisch in einem belasteten oder regenerierenden Gewebe, zum Beispiel nach einer körperlichen Verletzung von Axonen von Nervenzellen (S. Shyne-Athwal, R.V. Riccio, G. Chakraborty, N.A. Ingolia, Science 231, 603 (1986); N.A. Ingolia u. a., J. Neurosci 3, 2463 (1983)). Die N-Ende-Regel liefert eine Erklärung für dieses Phänomen. Wir gehen davon aus, daß selektive Veränderungen in der metabolischen Stabilität von ansonsten unbeschädigten, langlebigen Proteinen, die durch einen veränderten physiologischen Zustand der Zelle erforderlich sein können, durch einen posttranslatorischen Zusatz von destabilisierenden Aminosäuren zu den Aminoendpunkten von Targetproteinen in vivo herbeigeführt werden. In auffälliger Weise beteiligen die bekannten Reaktionen eines posttranslatorischen Zusatzes von Aminosäuren zu Proteinen (R.L. Sofer, in Transfer RNA: Biological Aspects, D. Soll, J.N. Abelson, P.R.
Schimmel, Herausgeber (Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY 1980), Seite 493; C. Deutch, Methods Enzymol. 106, 198 (1984) : A. Kaji, H. Kaji, G.D. Novelli, J. Biol. Chem. 240, 1185 (1965); S. Shyne-Athwal, R.V. Riccio, G. Chakraborty, N.A. Ingolia, Science 231, 603 (1986); N.A. Ingolia u. a., J. Neurosci 3, 2463 (1983)) zum großen Teil diejenigen Aminosäuren (Arg, Lys, Leu, Phe und Tyr), die gemäß der N-Ende-Regel (Tabelle 1) destabilisierend sind. Physiologische Zustände, bei denen ein Zusatz von destabilisierenden Aminosäuren zu Proteinen erwartungsgemäß auftreten könnte, umfassen den Eintritt und Austritt aus dem Zellenzyklus, Reaktionen auf chemische oder physische Beanspruchung und spezifische Differenzierungsereignisse, wie etwa eine erythroide Differenzierung und Spermatogenese, bei denen ein Anteil vorexistierender, ansonsten langlebiger intrazellulärer Proteine selektiv abgebaut wird.
Der Abbau in vitro von einigen proteolytischen Substraten in einem Ubiquitinabhängigen System von Säugetier-Retikulozyten wurde kürzlich als Abhängigkeit vom Vorhandensein bestimmter Aminoacyl-tRNAs gezeigt (Ferber, S. und Crechanover, A., J. Biol. Chem. 2613128 (1986)). Wir gehen davon aus, daß dieses Phänomen ebenfalls ein Erfordernis für einen posttranslatorischen Zusatz von spezifischen destabilisierende Aminosäuren zu den Aminoendpunkten von proteolytischen Substraten widerspiegelt. Die anfänglichen in Rede stehenden proteolytischen Substrate haben Amino-endständige Reste von Asp oder Glu, die beide gemäß der N-Ende-Regel (Tabelle 1) destabilisierend sind. Dieses führt zu einer interessanten und testfähigen Möglichkeit, daß bestimmte Amino-endständige Reste in Proteinen nicht direkt destabilisierend als solche sein können, sondern nur durch Ihre Fähigkeit, mit anderen destabilisierenden Resten konjugiert zu werden.

Claims

Genkonstrukt, das ein Ubiquitin-Fusionsprotein kodiert, wobei das Genkonstrukt eine Ubiquitin kodierende DNA-Sequenz, verbunden mit einer ein in Betracht kommendes Protein oder Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz, umfaßt, das in Betracht kommende Protein oder Polypeptid eine Amino-endständige Aminosäure aufweist, ausgewählt aus Ser, Ala, Thr, Val, Gly, Cys, Met, Ile, Glu, Tyr, Gln, His, Phe, Leu, Trp, Asp, Asn, Lys, Arg, und wobei das in Betracht kommende Protein oder Polypeptid nicht Ubiquitin ist, wenn die Amino-endständige Aminosäure des in Betracht kommenden Proteins oder Polypeptids Met ist, und das Ubiquitin-Fusionsprotein spezifisch durch eine ubiquitinspezifische Endoprotease zwischen dem Carboxy-endständigen Ubiquitinrest und dem benachbarten Amino-endständigen Rest des in Betracht kommenden Proteins oder Polypeptids proteolytisch spaltbar ist.
Durch das Genkonstrukt nach Anspruch 1 kodiertes Fusionsprotein, wobei das Genkonstrukt ein in Betracht kommendes Protein oder Polypeptid mit einem vorbestimmten Aminosäurerest an seinem Aminoendpunkt umfaßt und das Ubiquitin derart proteolytisch spaltbar ist, daß die Spaltung zur Freisetzung des vorbestimmten Amino-endständigen Restes des in Betracht kommenden Proteins oder Polypeptids führt.
Wirtszelle, die das Genkonstrukt nach Anspruch 1 oder das Fusionsprotein nach Anspruch 2 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 3, die eukaryotisch ist.
Wirtszelle nach Anspruch 3, die prokaryotisch ist.
Wirtszelle nach Anspruch 5, die bakteriell ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die E. coli ist.