DE3751543T2

DE3751543T2 - Lektinkomplex, sowie verfahren und sonde zu dessen herstellung.

Info

Publication number: DE3751543T2
Application number: DE3751543T
Authority: DE
Inventors: Walter Blaettler; Alarcao Linda D; John Lambert; Simon Moroney
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1986-03-20
Filing date: 1987-03-18
Publication date: 1996-04-11
Anticipated expiration: 2007-03-19
Also published as: JP2594803B2; EP0261225A1; EP0261225B1; JPH08269093A; EP0628315A1; ATE128361T1; JPS63503224A; DE3751543D1; EP0261225A4; WO1987005515A1; CA1338619C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines cytotoxischen Lectinkomplexes mit verminderter nicht-spezifischer Toxizität, wie auch einen neuen Ligand-Träger-Komplex oder Sonde, die bei der Herstellung eines solchen cytotoxischen Lectinkomplexes nützlich ist.
Es gibt mehrere bekannte cytotoxische Lectine, wie Ricin, Abrin, Modeccin, Volkensin und Viscumin, die sehr effizient eucaryontische Zellen abtöten. Diese Lectine sind heterodimere Proteine, die zwei durch eine Disulfidbindung verbrückte Untereinheiten umfassen. Eine Untereinheit, als die A-Kette bezeichnet, zeigt cytotoxische Aktivität durch katalytische Inaktivierung von Ribosomen; wogegen die andere, die B-Kette, für Galactose terminierte Oligosaccharide spezifische Bindungsstellen enthält. Da Moleküle mit Oligosaccharidkomponenten auf Zelloberflächen ubiquitär sind, sind Lectine nicht unterscheidend und daher in ihrer Cytotoxizität unspezifisch. Diese Eigenschaft beschränkt in hohem Maße ihre Einsetzbarkeit zur Abtötung ausgewählter erkrankter oder abnormaler Zellen, wie Tumorzellen.
Früher wurde das Lectin in seine beiden Untereinheiten gespalten, und die A-Kette allein an einen monoklonalen Antikörper unter Bereitstellung eines Toxins mit einer spezifischen Aktivität geknüpft, jedoch zeigen solche konjugierte Produkte deutlich verminderte Toxizität im Vergleich zum Gesamtlectin.
In EP-A-129434 wurde vorgeschlagen, daß Lectin-Ricin in getrennte A- und B-Ketten zu spalten und jede Kette mit einem Antikörper zu konjugieren und danach die getrennten konjugierten Ketten zu verabreichen, so daß die konjugierten A- und B-Ketten an der Zielzelle miteinander in Wechselwirkung treten. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung von Komplexen von nativem Lectin oder die Freisetzung solcher Komplexe aus den Zielzellen derart, daß das vorgeschlagene Verfahren nicht therapeutisch eingesetzt wurde.
Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, die Oligosaccharid-Bindungsstellen eines Lectins, Concanavalin A, durch Behandlung mit einem photoaktivierbaren Arylazidoderivat von Mannose, das spezifisch an die Concanavalin A-Bindungsstellen bindet, zu blockieren und dann mit ultraviolettem Licht unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Concanavalin A und dem Polysaccharidderivat zu bestrahlen, wie bei Beppu et al., J. Biochem., 78, 1013-1019 (1975) beschrieben. Das Produkt behielt seine Aktivität an zwei seiner vier Bindungsstellen und zeigte eine verminderte hämagglutinierende Aktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden berichtet von Fraser et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 73, 790-794 (1976) unter Verwendung von succinyliertem Concanavalin A, und von Thomas, Methods Enzymol., 46, 362-414 (1977) in einem analogen Verfahren. In ähnlicher Weise beschrieben Baenziger et al., J. Biol. Chem., 257, 4421-4425 (1982) die Behandlung der Lectine Concanavalin A, Ricin und Lectin aus Leber mit geeigneten photoaktivierbaren Derivaten von Glycopeptiden und dann die Bestrahlung mit Licht unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Lectin und dem Glycopeptidderivat. Es wurde aber nur ein 1 bis 2%iger Einbau des Glycopeptidderivats in allen Fällen erreicht. Es wurde offensichtlich kein Versuch unternommen, die Wirksamkeit der Markierung der Lectine durch Messungen von entweder der Cytotoxizität (bei Ricin) oder der Hämagglutinierung (bei Concanavalin A) zu bestimmen. Ein analoges Verfahren wurde eingesetzt unter Verwendung von Ricin und einem photoaktivierbaren Derivat von Galactose, beschrieben von Houston, J. Biol. Chern., 258, 7208-7212 (1983). Es wurde gefunden, daß das Produkt 280mal weniger toxisch gegenüber Zellen als unbehandeltes Ricin ist, obwohl die A-Kette allein volle Aktivität bei der Inhibierung der Proteinsynthese in Zellysaten zeigte.
Thorpe et al., Eur. J. Biochem., 140, 63-71 (1984) beschrieben die Konjugation eines monoklonalen Antikörpers an intaktes Ricin, anschließende Fraktionierung des Produktes durch Affinitätschromatographie unter Isolierung in einer 20%igen Ausbeute einer Fraktion, in der der monoklonale Antikörper zufällig die Oligosaccharid-Bindungsstellen des Ricins blockierte, wodurch die Fähigkeit des Konjugats zur nicht-spezifischen Zellbindung vermindert wurde.
Die Schwankungen in den Endergebnissen bei Verwendung photoaktivierbarer Polysaccharide oder monoklonaler Antikörper als Blockierungsmittel für die Oligosaccharid-Bindungsstellen des Lectins wird durch die vorliegende Erfindung beseitigt, welche eine wirksame und reproduzierbare Verminderung der nicht-spezifischen Toxizität von Lectinen ohne exzessive Verminderung ihrer cytotoxischen Eigenschaften bereitstellt.
Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines cytotoxischen Lectins mit verminderter nicht-spezifischer Toxizität, welches die Bereitstellung eines spezifischen Liganden für die Oligosaccharid-Bindungsstellen auf dem Lectin, kovalentes Verknüpfen des Liganden an einen festen Träger unter Bildung einer Sonde, in Kontakt bringen des Lectins mit der Sonde durch eine spezifische Wechselwirkung zwischen den Bindungsstellen und dem Ligand und Bilden einer kovalenten Bindung zwischen dem Lectin und dem Ligand umfaßt, wodurch ein Komplex des Lectins und des Liganden zur Verfügung gestellt wird, der kovalent an den Träger gebunden ist. Die Erfindung umfaßt auch den zusätzlichen Schritt der Trennung der kovalenten Verknüpfung zwischen dem Ligand und dem Träger unter Freisetzung eines Komplexes, der das an den Liganden kovalent gebundene Lectin umfaßt. Sie umfaßt auch den weiteren Schritt der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Komplex und einem monoklonalen Antikörper. Andere und weitere Merkmale gehen aus folgenden Beschreibung hervor.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit irgendeinem Lectin mit cytotoxischer Aktivität, wie Ricin, Abrin, Modeccin, Volkensin oder Viscumin eingesetzt werden.

Zu den Abbildungen:

Abb. 1 ist eine schematische Darstellung der Reaktionen, die zur Herstellung der aktivierten Ligand-Träger-Sonde von Beispiel 1 führen;
Abb. 2 ist eine schematische Darstellung der Reaktionen, die zur Herstellung der aktivierten Ligand-Träger-Sonde von Beispiel 2 führen; und Abb. 3A und 3B sind schematische Darstellungen von Reaktionen, die zur Herstellung der aktivierten Ligand-Träger-Sonde von Beispiel 3 führen.
Der in dieser Erfindung eingesetzte feste Träger kann irgendein fester Träger, der üblicherweise für die Affinitätschromatographie verwendet wird, sein, wie z. B. vernetztes Polyacrylamid und Derivate davon, z. B. Aminoethylpolyacrylamid, derivatisierte poröse Glasperlen, Latexperlen, Polyvinylalkoholperlen und ähnliche.
Der im Verfahren verwendete Ligand kann irgendeine Verbindung sein, die spezifisch an die Oligosaccharid-Bindungsstellen des Lectins bindet. Vorzugsweise enthält der Ligand eine Polysaccharidgruppe, wie ein Disaccharid oder ein höheres Polysaccharid, und enthält vorzugsweise eine Galactoseeinheit zur optimalen Bindungskapazität.
Die kovalente Brücke zwischen dem Liganden und dem Träger unter Bereitstellung der Sonde kann nach irgendeinem üblichen Verfahren gebildet werden. Jedes geeignete heterobifunktionale Vernetzungsmittel, von denen viele bekannt sind und handelsüblich erhältlich sind, kann verwendet werden. Das Vernetzungsmittel muß abspaltbar sein, wenn es ausgewählten Bedingungen oder Reagenzien ausgesetzt wird, um die Abtrennung des Ligand-Lectin-Komplexes nach seiner Bildung vom Träger zu erlauben, obwohl in einigen Fällen der Komplex an den Träger während der anschließenden Verwendung gebunden verbleiben kann. Wahlweise können entweder der Träger und der Ligand oder beide unter Einschluß einer funktionellen Gruppe modifiziert sein, die mit der anderen reaktiv ist, unter Bildung einer kovalenten Verknüpfung zwischen dem Ligand und dem Träger, wodurch die Notwendigkeit zur Verwendung eines gesonderten Venetzers vermieden wird. Die Einheit, die die Abspaltbarkeit des Liganden vom Träger, an dem er kovalent gebunden ist, kann die Form einer Disulfidgruppe einnehmen, die vorzugsweise durch Reduktion unter ausgewählten Bedingungen, unter denen die internen Disulfidüberbrückungen des Lectin selbst nicht so bereitwillig gespalten werden, eine durch Aminolyse spaltbare Thioestergruppe, eine durch Reduktion, vorzugsweise mit Dithionit spaltbare Azogruppe, eine ortho-Nitrobenzylester- oder ortho-Nitrobenzylcarbamatgruppe, die durch Licht mit einer Wellenlänge mit ca. 360 nm spaltbar ist, eine vicinale Glycolgruppe, die durch Oxidation mit Perjodat spaltbar ist, oder ähnliche, einnehmen.
In ähnlicher Weise kann die kovalente Bindung zwischen dem Liganden und dem Lectin nach üblichen chemischen Verfahren zur Bindung von Proteinen oder Polypeptiden an andere Verbindungen oder Gruppen, z. B. unter Verwendung geeigneter Vernetzungsmittel gebildet werden.
Die kovalente Bindung zwischen dem Ligand und dem Träger, wie auch die kovalent Bindung zwischen dem Ligand und dem Lectin kann jeweils in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Stufen, falls erwünscht, gebildet werden. Z. B. kann 2-Pyridyldithiopropionsäure mit einem Träger, wie Aminoethylpolyacrylamid, unter Bereitstellung eines Trägers mit hieran gebundenen 2-Pyridyldithiogruppen umgesetzt werden. Ein eine Disaccharideinheit enthaltender Ligand kann durch Modifikation von Lactose unter Bildung von N-(2'-Mercaptoethyl)lactamin, der dann die 2-Pyridylgruppen auf den Träger durch Disulfidaustausch ersetzen kann, hergestellt werden, und die restliche Amingruppe des Lactamins kann dann als funktionale Gruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Lectin umgesetzt werden. Dies kann durch Verwendung eines bifunktionalen Vernetzungsmittels, wie einem 2,4-Dichlor-6-methoxytriazin, einem Chloratom, das sehr reaktiv mit Aminogruppen bei pH 8 ist, wobei die Reaktion bis zum Abschluß innerhalb von Minuten fortschreitet, andererseits die übrigen Chloratome mit Aminogruppen viel weniger reaktiv sind, und 24 Stunden oder mehr bei einem pH von 8,5 oder mehr benötigen, erfolgen. Dieses Vernetzungsmittel kann zunächst mit der restlichen Aminogruppe des Lactamins bei pH 8 umgesetzt und anschließend bei einem höheren pH mit einer Aminogruppe des Lectins, nach dem es durch die spezifische Bindung des Lectins an die Galactoseeinheit des Lactamins in richtiger Weise ausgerichtet wurde, umgesetzt werden.
Dieses zweite Vernetzungsmittel muß nicht abspaltbar sein, da es erwünscht ist, daß der Ligand permanent an das Lectin unter Blockade der Oligosaccharid-Bindungsstellen des letzteren gebunden verbleibt. In einer anderen Ausführungsform kann der Ligand selbst chemisch unter Aufnahme einer mit Lectinen reaktiven funktionalen Gruppe, unter Bildung einer kovalenten Bindung hiermit modifiziert sein.
Wenn der Ligand selbst unter Aufnahme zwei funktionaler Gruppen modifiziert ist, eine, die zur Bildung einer kovalenten Brücke mit dem Träger in der Lage ist, und die andere, die zur Bildung einer kovalenten Verknüpfung an das Lectin in der Lage ist, sind die beiden funktionalen Gruppen in ihrer Reaktivität oder in ihren Reaktionsbedingungen vorzugsweise unterschiedlich, so daß der Ligand an den Träger unter einer Auswahl an Bedingungen, und an das Lectin unter der anderen Auswahl an Bedingungen gebunden werden kann. In diesem Fall kann der Ligand selbst als ein heterobifunktionales Vernetzungsmittel angesehen werden, das eine Di- oder Polysaccharideinheit enthält, die zur spezifischen Bindung an die Oligosaccharid-Bindungsstellen der Lectine in der Lage ist. Die in den Liganden aufgenommenen beiden funktionalen Gruppen können die gleichen sein, wie solche, die in jedem üblichen heterobifunktionalen Vernetzungsmittel vorliegen.
Nachdem der Ligand an den festen Träger unter Bildung einer Sonde gebunden wurde, das Lectin hierauf durch spezifische Bindung ausgerichtet wurde, und dann kovalent daran unter Bildung eines Ligand-Lectin-Komplexes gebunden wurde, kann der Komplex, falls erwünscht, vom Träger durch Spaltung der Ligand-Träger-Verknüpfung nach üblichen Verfahren abgetrennt werden.
Der Komplex, entweder frei oder an den festen Träger gebunden, hat Oligosaccharid-Bindungsstellen, die durch den Liganden blockiert sind, folglich zeigt er nicht länger eine nicht-spezifische oder nicht-selektive Bindung an Zellen, und hat viel von seiner nicht-spezifischen Toxizität verloren. Der Komplex kann dann behandelt werden, um ihn spezifisch für bestimmte Zellen zu machen, die angegriffen werden sollen, durch kovalente Bindung davon an einen ausgewählten monoklonalen Antikörper, der eine spezifische Immunbindungskapazität für die bestimmten Zellen zeigt. Die kovalente Bindung des Komplexes an den monoklonalen Antikörper kann entweder vor oder nachdem der Komplex abgetrennt oder vom Träger abgespalten wird, durchgeführt werden, wobei übliche Verfahren oder Vernetzungsmittel, einschließlich solcher beschrieben von Thorpe et al., loc. cit. verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie im Beispiel 1 angegeben, wird der Komplex durch den Liganden an den Träger über eine Disulfidgruppe verbunden, die durch Reduktion abspaltbar ist. Die erhaltene, auf dem Ligand verbliebene restliche Thiolgruppe wird dann als funktionale Gruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung mit dem monoklonalen Antikörper verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes geeignete bifunktionale Vernetzungsmittel, das zur Reaktion mit der Thiolgruppe und auch mit der Amino- oder einer anderen Gruppe des monoklonalen Antikörpers in der Lage ist, eingesetzt werden. Vorzugsweise wird eine funktionale Gruppe, die mit der Thiolgruppe unter Bildung der kovalenten Bindung reaktiv ist, in den monoklonalen Antikörper eingeführt, um ihm eine direkte Reaktion mit der funktionalen Gruppe des Komplexes zu ermöglichen. Ist z. B. die funktionale Gruppe auf dem Komplex ein Thiol, kann der monoklonale Antikörper mit einem Reagens, wie z. B. Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) unter Bereitstellung einer Maleimidogruppe auf dem Antikörper umgesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wie im Beispiel 2 angegeben, wird der Ligand (wie auch der erhaltene Lectin-Ligand-Komplex) an den Träger über eine photospaltbare Gruppe verbunden, eine durch Bestrahlung spaltbare ortho-Nitrobenzylcarbamatgruppe, und es wurde ein bifunktionales Vernetzungsmittel unter Bildung kovalenter Bindungen, die gegen Bestrahlung stabil sind, zwischen dem Lectin und dem Liganden der Ligand-Träger-Sonde eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wie im Beispiel 3 angegeben, wird der Ligand an den Träger über eine Azogruppe, die durch vorzugsweise Reduktion mit Natriumdithionit spaltbar ist, verknüpft, wogegen die kovalente Lectin-Ligand-Bindung durch ein difunktionales Vernetzungsmittel unter Bildung von Bindungen, die gegen eine solche Reduktion inert sind, gebildet wird.
Die folgenden spezifischen Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung.

BEISPIEL 1 HERSTELLUNG EINES MODIFIZIERTEN TRÄGERS

Aminoethylpolyacrylamid P-150 (Bio-Rad.) in Form fester Perlen, wurde unter Absättigung aller Restcarboxylgruppen durch Reaktion mit einem wasserlöslichen Carbodiimid in wäßrigem Ammoniumchlorid, wie bei Inman, Methods Enzymology, 35, 30-58 (1974) beschrieben, behandelt. Die Perlen wurden dann mit Pyridyldithiogruppen, die einen Anheftungspunkt für den Liganden über eine Disulfidverknüpfung, wie in der in der oberen rechten Hälfte der Abb. 1 angegebenen Reaktionszusammenfassung gezeigt, funktionalisiert. Zu diesem Zweck wurde zu einer Suspension des Carboxy-verkappten Aminoethylpolyacrylamid 3 (30 ml gepackter Perlen) und 10 ml einer Lösung von 0,1 M Natriumchlorid 0,01 g (5 mmol) 2-Pyridyldithiopropionsäure (Py-S- S CO&sub2;H) in 10 ml Dimethylformamid und 1 ml Wasser zugegeben. Es wurde verdünnte Salzsäure zur Einstellung des pHs der Mischung auf 4,7 zugegeben, und dann wurde mit einer Suspension von 5 ml Wasser, die 1,15 g (6 mmol) 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC HCl) vermischt. Nach 7-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden weitere 0,766 g (4 mmol) des Carbodiimids zugegeben, und der pH der Mischung wurde wiederum mit Salzsäure auf 4,7 eingestellt. Nach 4-tägigem Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Suspension ausgetrocknet und die modifizierten Gelperlen 4 wurden intensiv mit 0,2 M Natriumchloridlösung gewaschen. Zur Sicherstellung eines kompletten Entfernens des Überschusses an 2-Pyridyldithiopropionsäure wurde die Suspension mit 0,1 M Salzsäure angesäuert und mit 5 ml Ethylacetat extrahiert. Die Perlen 4 wurden mit 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 gewaschen. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis ein Anteil der Waschlösung bei Behandlung mit einem Überschuß von Dithioerythritol eine sehr niedrige Konzentration von 2-Pyridinethion zeigt, was eine Absorption von weniger als 0,1 Absorptionseinheiten bei 343 nm anzeigte.
Die Oberflächenkonzentration der Dithiopyridylgruppen auf der Säule der modifizierten Perlen 4 wurde durch Umsetzen einer Probe der Perlen mit einem Überschuß an Dithioerythritol (DTE) in einer Lösung von 100 mM Natriumbicarbonat bei Raumtemperatur für 30 Minuten bestimmt. Die Perlen wurden dann wiederholt mit einer Lösung mit 0,2 M Natriumchlorid gewaschen, und es wurde gefunden, daß die Menge an 2-Pyridinethion in den Waschlösungen, gemessen durch Absorption bei 343 nm (T. Stuchbury et al., Biochem. J., Bd. 141, S. 417-432 (1975)) einer Konzentration von 38 umol/ml der gepackten Perlen entsprach.
Um alle überschüssigen Aminogruppen auf den 2-Pyridyldithio-haltigen Polymerperlen 4 zu verkappen, wurden die Perlen (27 ml) in 50 ml 100 mM Natriumbicarbonatlösung, zu der 4,8 g (5,2 mmol) Methylchlorformiat bei Raumtemperatur gegeben wurden, suspendiert. Nach 5 Minuten wurde ein Überschuß an Chlorformiat durch Extraktion mit 20 ml Ethylacetat entfernt, und die modifizierten Gelperlen wurden mit 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 gewaschen.

HERSTELLUNG DES LIGANDEN

Es wurde ein Ligand hergestellt wie in der oberen linken Hälfte von Abb. 1 angegeben. Es wurden 9,72 g (13,5 mmol) alpha-Lactosemonohydrat 1 in 36 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3,68 g (13,5 mmol) Cystamindiessigsäuresalz zusammen mit einer Lösung von 1,70 g (27,0 mmol) Natriumcyanoborhydrid in 72 ml Methanol zugegeben. Nach Einstellung des pHs der Mischung auf 6,2 mit Essigsäure, wurde die Lösung bei Raumtemperatur 36 Stunden gerührt, worauf das Methanol durch Verdampfung entfernt wurde, der pH der restlichen wäßrigen Lösung wurde auf 5,0 mit Essigsäure eingestellt und die Lösung wurde auf eine 360-ml-Säule von Carboxymethylzellulose, äquilibriert in 2 mM Pyridiniumacetatpuffer bei pH 5,0 aufgegeben. Nach Waschen der Säulen mit 2 Volumeneinheiten des Äquilibrierungspuffers wurde das gebundene Material mit 0,1 M wäßriger ammoniakalischer Lösung eluiert. Die eluiertes Material haltigen Lösungen wurden zur Trockne eingedampft und der Festkörper in 200 ml Wasser wieder aufgelöst, wozu 2,0 g (13,5 mmol) Dithioerythritol (DTE) bei Raumtemperatur gegeben wurden. Nach einstündigem Stehenlassen wurde die restliche Lösung, die eine Mischung von N-(2'-Mercaptoethyl)lactamin 2 und Cysteamin enthielt, auf eine 370-ml-Säule von Carboxymethylzellulose in 10 ml Triethylammoniumbicarbonatpuffer pH 7, enthaltend 1 mM DTE aufgegeben. Die Säule wurde mit 500 ml desselben Puffers gewaschen, anschließend mit einem linearen Gradienten (1 l plus 1 l) einer Lösung von 10 bis 100 mM Triethylammoniumbicarbonat bei pH 7, enthaltend 1 mM DTE entwickelt. Wiederholte Verdampfung aus Wasser und Lyophilisation lieferten 3,85 g (35 % des theoretischen Wertes) von N-(2'-Mercaptoethyl)lactamin-Ligand 2 als weißes Pulver.
Unmittelbar vor der Verwendung wurde der, wie oben beschrieben hergestellte und gereinigte Ligand 2 unter Verminderung der zwischen zwei Lactaminmolekülen gebildeten Dimeren durch Lösen von 1,5 h (3,7 mmol) des Ligands in 10 ml Wasser bei pH 8, Zugabe von 154 mg (1 mmol) DTE und Stehenlassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Der pH wurde dann auf 5,2 mit Essigsäure gesenkt, die Lösung wurde auf eine 100-ml-Säule von Carboxymethylzellulose in 2 mM Pyridiniumacetatpuffer, pH 5,2, aufgegeben. Die Säule wurde mit 200 ml desselben Puffers gewaschen, bis das gesamte DTE entfernt war. Das reine N-(2'-Mercaptoethyl)lactamin 2 wurde in der freien Thiolform mit 0,1 M Salzsäure eluiert. Nach einem Test mit Ellman's Reagens wurde gefunden, daß die Lösung 3,2 mmol des Thiols (85 % des theoretischen Werts) enthielt.

HERSTELLUNG DER LIGAND-TRÄGER-SONDE

Der Ligand 2 wurde kovalent an die zuvor hergestellten verkappten und aktivierten Polyacrylamidgelperlen 4 durch Zugabe von 50 ml (3,2 mmol) der wäßrigen Lösung des Lactamins bei pH 5 zu 27 ml der Gelperlen bei Raumtemperatur verknüpft, was zu einer Suspension bei pH 6,5 führte, die bei Raumtemperatur 15 Stunden geschüttelt wurden, dann wiederholt mit 0,2 M Natriumchloridlösung mit aufeinanderfolgenden Zentrifugations- und Dekantationsschritten gewaschen wurde, bis die Waschlösungen zeigten, daß im wesentlichen das gesamte 2-Pyridinethion-Nebenprodukt entfernt worden war&sub1; wie durch Messungen der Absorption bei 343 nm angezeigt. Die erhaltenen Perlen, in Form einer Sonde 5, mit dem kovalent an die polymeren Perlen verknüpften Liganden hatten eine Oberflächenlactosekonzentration von 38 mM.
Kovalenten Bindung von Ricin an die Ligand-Träger-Sonde 5 wurde die Sonde mit dem bifunktionalen Vernetzungsmittel 2,4-Dichlor-6-methoxytriazin durch Zugabe einer 10 ml der Sonde haltigen Suspension zu 10 ml einer Lösung von 100 mM Natriumbicarbonat, einer Lösung enthaltend 360 mg (2 mmol) des Triazinreagenses in 10 ml Dioxan aktiviert. Nach Vortexieren der Suspension für 1 Minute wurde der Triazinüberschuß durch Extraktion mit 4 ml Diethylether entfernt; die aktivierten Sondenperlen 6 wurden dann mit 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 äquilibriert und in eine Säule gepackt.
HERSTELLUNG DES LECTIN-LIGAND-TRAGERKOMPLEXES
Ricin wurde auf die aktivierte Sondensäule 6 in Form von 2,5 ml einer Lösung, enthaltend 2,1 mg/ml Ricin in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,15 M NaCl, aufgegeben. Zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Ricin und der zweiten funktionalen Chlorgruppe des Triazinvernetzungsmittels wurde dann die Säule mit drei Säulenvolumen von 50 mM Triethanolaminhydrochloridpuffer bei pH 8,6 gewaschen. Nach 24-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur bei pH 8,6 wurde die Säule mit 2 Volumeneinheiten von 0,5 M Galactoselösung bei pH 7 gewaschen, um alles Ricin zu entfernen, das keinen kovalent gebundenen Ricin-Lagand-Komplex gebildet hatte.

ABTRENNUNG DES LECTIN-LIGAND-KOMPLEXES VOM TRÄGER

Der, wie oben beschrieben, kovalent gebundene Ricin-Ligand-Komplex wurde vom Träger durch Spaltung der Disulfidgruppe zwischen dem Ligand und dem Polymer abgetrennt. Es wurde gefunden, daß diese Disulfidgruppe leichter durch Reduktion mit 10 mM DTE bei pH 7 gespalten oder abgetrennt werden konnte, als die Disulfidgruppe, die die A-Kette und B-Kette des Ricins selbst miteinander verbindet. Obwohl eine Vielzahl von Konzentrationen an DTE bei pH-Werten von 7 bis 8 untersucht wurden, wurden optimale Ergebnisse, mit einer minimalen Spaltung der Ricin-Ketten, bei einer Konzentration von 10 mM DTE bei pH 7,0 bei Raumtemperatur für 45 Minuten erhalten, was eine Ausbeute von 36 % des theoretischen Wertes lieferte. Der so erhaltene freie Komplex band nicht an Asialofetuin, was zeigte, daß die Oligosaccharid-Bindungsstellen des Ricin blockiert waren.
Der wie oben beschrieben hergestellte Ricin-Ligand-Komplex wurde auf einer Säule von Concanavalin A-Sepharose in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6, affinitätsgereinigt. Der Komplex bindet an Concanavalin A über die Kohlenhydratketten der Ricin-Komponente, und kann so von Verunreinigungen befreit werden, insbesondere von Thiolen mit niedrigem Molekulargewicht, die die Konjugationsreaktion stören würden. Der Ricin-Ligand-Komplex wurde mit 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6, enthaltend 1 M Methyl-α-D-mannopyranosid eluiert, was zu 12 ml einer Lösung führte, in der 150 bis 200 ug des Ricin-Ligand-Komplexes vorlag. Mit einer Probe des Produkts wurde gezeigt, daß die A-Kette die Proteinsynthese in Reticulocytenlysaten im selben Ausmaß inhibierte, wie die A-Kette aus dem nativen Ricin. Daß dieses Material auf die erwünschte Weise modifiziert worden war, wurde durch seine Passage durch eine Säule von immobilisierten Asialofetuin bestätigt, wovon gezeigt wurde, daß es eine Assoziationskonstante für Ricin von ca. 0,1 uM hat. Mit diesem Kriterium wurde die Ricin-Bindungsstelle als blockiert eingestuft.

KOVALENTE BINDUNG VON LECTIN-LIGAND-KOMPLEX AN MONOKLONALEM ANTIKÖRPER

Zur Bereitstellung des Ricin-Ligand-Komplexes mit der erwünschten Spezifität gegen ausgewählte Zellen wurde er an Mäuse monoklonale Anti-CALLA- Antikörper J5 verknüpft, der handelsüblich erhältlich von Coulter Inc., Hialeah, Florida ist. Für die Konjugation wurde J5 gereinigt und mit SMCC, wie bei Lambert et al., J. Biol. Chem., Bd. 260, 12035-12041 (1985) beschrieben, modifiziert.
Die, wie oben beschriebene, Lösung des Ricin-Ligand-Komplexes wurde dann mit dem gereinigten und modifizierten J5-Antikörper in Puffer bei pH 7 vermischt, und man ließ 1 Stunde bei 4ºC stehen. Nach 1 Stunde wurde durch SDS-PAGE gezeigt, daß die Reaktionsmischung ein kovalent verknüpftes Konjugat zwischen dem monoklonalen Antikörper und dem Ricin-Ligand-Komplex, wie auch überschüssigen monoklonalen Antikörper und etwas nicht reagierten Ricin-Ligand-Komplex enthielt. Die Reaktionsmischung wurde dann einer Affinitätsreinigung auf einer Protein A-Sepharose in 100 mM Natriumphosphatpuf fer, pH 7,0, aufgegeben, wodurch nicht-umgesetzter Ricin-Ligand-Komplex entfernt wurde. Dieser Schritt entfernte auch das früher eingeführte Methyl-α-D-mannopyranosid, wodurch die Verwendung einer Säule von Concanavalin A-Sepharose als weitere Reinigungsstufe ermöglicht wurde. Das von der Protein A-Sepharose -Säule eluierte Material, das das Konjugat und überschüssigen monoklonalen Antikörper enthielt, wurde dann auf eine Säule von Concanavalin A-Sepharose aufgegeben, wo es wie zuvor das Konjugat durch die Kohlenhydratketten des Ricin-Ligand-Komplexes gebunden wurde. Dann wurde überschüssiger monoklonaler Antikörper durch extensive Waschung entfernt, und das gebundene Konjugat wurde mit 1 M Methyl-α-D-mannopyranosid in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, eluiert.
Sowohl der Ricin-Ligand-Komplex, als auch der an den monoklonalen Antikörper gebundene Komplex, wurden auf Cytotoxizität unter Verwendung von Namalwa-Zellen, einer Burkitt-Lymphomalinie, getestet, die im Mittel 60000 CALLA pro Zelle exprimiert, und mehr als 600000 Bindungsstellen für Ricin. Es wurde gefunden, daß der Ricin-Ligand-Komplex ca. 10mal weniger toxisch als natives Ricin war. Diese Verminderung der nicht-spezifischen Toxizität beruht auf der Blockierung der Bindungsstellen auf der B-Kette, da gezeigt wurde, daß die A-Kette, wenn sie aus dem Komplex freigesetzt wurde, voll aktiv war (siehe oben). Wurde der Ricin-Ligand-Komplex an J5 geknüpft, erhöhte sich seine Toxizität 3-fach für CALLA-exprimierende Zielzellen, und seine Toxizität verminderte sich 5-fach für Zielzellen, dem CALLA fehlt. Besonders deutlich war die Toxizität des Konjugats 3-fach durch Zugabe einer sättigenden Menge von J5 vermindert, was deutlich zeigte, daß der Antikörper dem modifizierten Toxin einige Spezifität verleiht.

BEISPIEL 2

Das Reaktionsschema zur Herstellung der Sonde dieses Beispiels, ist in Abb. 2 angegeben.

HERSTELLUNG EINES MODIFIZIERTEN TRÄGERS

Zu einer Suspension von Carboxy-verkapptem Aminoethylpolyacrylamid P- 150 3, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, (26 ml gepackter Perlen) in 0,1 M Bicarbonat (13 ml) wurden 1(5-Maleimidomethyl-2-nitrophenyl)ethylchloroformiat 7 (1,02 g, 3,48 mmol) in Dioxan (6 ml) zugegeben. Nach 5-minütigem heftigem Schütteln wurden Methylchlorformiat (5 ml) zur Verkappung von überschüssigen Aminogruppen zugegeben, und das Schütteln wurde für weitere 5 Minuten fortgesetzt. Dann wurden modifizierte Polyacrylamid-Gelperlen 8 durch Filtration gewonnen und der Reihe nach mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, einer Mischung von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Dimethylformamid (1:1, Volumen/Volumen), Dimethylformamid und dann mit den gleichen Lösungen in umgekehrter Reihenfolge gewaschen.

HERSTELLUNG DER LIGAND-TRÄGER-SONDE

Die modifizierten Polyacrylamidperlen 8 (24 ml der gepackten Perlen) wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (13 ml) suspendiert und mit einer Lösung des Liganden N-(2'-Mercaptoethyl)lactaimin 2, hergestellt wie in Beispiel 1, (700 mg, 1,74 mmol) in Wasser, pH 7,0, behandelt. Die Mischung wurde über Nacht geschüttelt, und die den kovalent an die polymeren Perlen gebundenen Liganden enthaltende Sonde 9 wurde dann durch Filtration auf einen Büchner-Trichter gewonnen erschöpfend mit Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Eine Probe der Ligand-Träger-Sonde 9 (0,3 ml) wurde zur Herstellung einer kleinen Säule und zur Messung der spezifischen Bindungskapazität der Sondenperlen für Ricin verwendet. Es wurde gefunden, daß 1 ml der Sondenperlen bei pH 7,0 einen Überschuß von 1,0 mg Ricin auf eine spezifische Art und Weise binden. Das gesamte spezifisch gebundene Ricin konnte mit 0,2 M Lactose-haltigen Puffer eluiert werden.
Eine Säule mit Sondenperlen 9 wurde mit dem bifunktionalen Vernetzungsmittel 2,4-Dichlor-6-methoxytriazin auf die folgende Weise aktiviert. Zu einer Suspension der Polyacrylamidperlen, enthaltend den Lactose-Ligand (10 ml) in einer 0,1 M Natriumbicarbonat (10 ml) wurde eine Lösung von 2,4- Dichlor-6-methoxytriazin (0,24 g, 1,34 mmol) in Dioxan (6,6 ml) gegeben. Die Suspension wurde 1 Minute heftig geschüttelt, dann wurde der Überschuß an Triazin durch Extraktion mit Diethylether (3 x 5 ml) entfernt. Die aktivierten Sondenperlen 10 wurden dann mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, äquilibriert und in eine Säule gepackt.

HERSTELLUNG DES LECTIN-LIGAND-TRÄGERKOMPLEXES

Eine Lösung von Ricin (10 mg in 5 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,15 M Natriumchlorid) wurde zweimal durch die aktivierte Sondensäule geleitet, die dann mit drei Säulenvolumen von 0,05 M Triethanolaminhydrochlorid, pH 8,6, gewaschen wurde, und bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen wurde. Gebundenes Ricin, das aber nicht kovalent verknüpft war, wurde von den Perlen durch Waschen mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,2 M Lactose, entfernt. ABTRENNEN DES LECTIN-LIGAND-KOMPLEXES VOM TRÄGER Durch kovalente Verknüpfung mit dem Ligand zurückbleibendes Ricin wurde von den Trägerperlen durch Photolyse auf die folgende Weise freigesetzt. Die Perlen wurden aus der Säule mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (10 ml) zu einer Glaspetrischale überführt, wo die Suspension eine Schicht von nicht mehr als 0,5 cm bildete. Die Suspension wurde dann 10 Min in einer Entfernung von 15 cm mit einer Balck Ray Longwave Ultraviolet Lampe (Modell B-100 A, Ultraviolet Produkts, Inc., San Gabriel, CA, Emissionspeak bei 365 nm, Intensität bei 15 cm ist ca. 1,1 mW/cm²) unter Spaltung der Verknüpfung zwischen dem Ligand und dem Träger bestrahlt. Die bestrahlte Suspension wurde in die Säule zurückgegossen und dann wurden die Perlen erschöpfend mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Die kombinierten Waschlösungen (50 ml), die den freigesetzten Ricin-Ligand-Komplex enthielten, der frei vom Träger war, wurden durch eine Säule von Asialofetuin-TSK (2 ml, Bindungskapazität für Ricin: 4 mg/ml) geleitet unter Entfernung von Spuren von Ricin-Verunreinigungen, die vorliegen könnten. Die Endlösung auf 2 ml durch Ultrafiltration (YM-10 Membran, Amicon, Danvers, MA) konzentriert und dann durch eine kleine Säule Biogel P-g äquilibriert in 0,05 M Triethanolaminhydrochloridpuffer, pH 8,0, enthaltend Natriumchlorid (150 mM) und EDTA (1 mM) geleitet, was 1,2 mg reinem Ricin-Ligand-Komplex in 2,8 ml Puffer lieferte.

KOVALENTE BINDUNG VON LECTIN-LIGAND-KOMPLEX AN MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Zur kovalenten Verknüpfung des Komplexes an den Antikörper J5 wurde eine Sulfhydrylgruppe in den Komplex mit dem heterobifunktionalen Vernetzungsmittel 2-Iminothiolanhydrochlorid (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) eingeführt, und eine Maleimidogruppe wurde in den monoklonalen Antikörper mit dem heterobiofunktionalen Vernet zungsmittel Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-2-carobxylat (SMCC), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), wie im folgenden in Einzelheiten beschrieben, eingeführt.
Die Lösung von Ricin-Ligand-Komplex (2,8 ml) wurde auf Eis gekühlt und mit einer 0,5 M Lösung von 2-Iminothiolanhydrochlorid, pH 8,0 (0,044 ml), behandelt, was eine Endkonzentration von 2-Iminothiolan von 8 mM ergab. Die Reaktion wurde nach 90 Minuten auf Eis durch Gelfiltration durch eine Säule von Biogel P-6, äquilibiert mit 5 mM Bistrisacetatpuffer, pH 5,8, enthaltend Natriumchlorid (50 mM) und EDTA (1 mM) abgebrochen. Auf diese Weise wurden im Mittel 0,8 Thiolgruppen pro Ricin-Ligand-Komplexmolekül eingeführt.
Zu einer Lösung von J5 in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (3 mg J5 in 1,5 ml), wurden 12 äquivalente SMCC (0,075 mg) in trockenem Dioxan (0,02 ml) zugegeben. Nach Inkubation bei 30ºC für 30 Minuten wurde die Reaktionslösung durch eine Säule von Sephadex G-25 bei 4ºC geleitet, was modifizierten J5 mit im Mittel von 1,5 Maleimidogruppen pro Antikörpermoleküle lieferte.
Die Lösungen von modifizierten Ricin-Ligand-Komplex und modifiziertes J5 wurden vermischt, und der pH auf 7,0 durch Zugabe von 0,5 M Triethanolaminhydrochloridpuffer, pH 8,0 (0,028 ml), eingestellt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde Jodacetamid auf eine Endkonzentration von 5 mM zugegeben und die Lösung durch Ultrafiltration (YM-10 Filter, Amicon) ca. 2 ml konzentriert. Die Reinigung erfolgte durch Gelfiltration durch eine Säule (1,5 x 96 cm) Biogel P-300 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
Sowohl der Ricin-Ligand-Komplex als auch der an den monoklonalen Antikörper gebundene Komplex zeigte die Eigenschaften einer nicht-spezifischen Toxizität ähnlich zu solche wie die Produkte des Beispiels 1.

BEISPIEL 3

Der Ligand wird über eine Azofunktion verknüpft und kann durch Behandlung mit 0,5 M Natriumdithionit, pH 8,5, (siehe z. B. Cohen, Methods Enzymol., Bd. 34 (1974, 102-108) freigesetzt werden. Die Reaktionsfolge zur Herstellung der Sonde ist in den Abb. 3A und 3B zusammengefaßt.

HERSTELLUNG DES LIGANDEN

Zu einer gerührten Lösung von Lactose (4,0 g, 11,1 mmol als Monohydrat) in Wasser (40 ml) wurde eine Lösung von Anilin (2,07 g, 22,2 mmol) in Methanol (8 ml) und eine Lösung von Natriumcyanoborhydrid (0,7 g, 11,1 mmol) in Methanol (6 ml) zugegeben. Der pH der Mischung wurde auf 6,5 mit Essigsäure eingestellt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt.
Nach 15 Stunden wurde das Methanol durch Verdampfung entfernt, und Aceton (12 ml) wurde zur Zerstörung des überschüssigen Natriumcyanoborhydrids zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Dann wurde diese Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser (75 ml) wieder aufgelöst, die Lösung auf pH 5,5 mit Essigsäure eingestellt, und auf eine Säule (60 ml) Amberlite IA-118H-Ionenaustauscherharz, äquilibriert in Wasser, aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser (600 ml) gewaschen, und der Zucker wurde mit einer Lösung von 1 M Ammoniumbicarbonat, was 5,4 g eines weißen Festkörpers ergab, der N-Phenyllactamin-Ligand 13, kontaminiert mit etwas Salz enthielt, eluiert.

HERSTELLUNG DES MODIFIZIERTEN TRAGERS

Zur einer Suspenslon von Carboxy-verkapptem Aminoethylpolyacrylamid P- 150 3 (12 ml gepackten Perlen) in einer Lösung von 0,2 M NaCl (Gesamtvolumen 20 ml) wurde p-Nitrobenzoylazid (576 mg, 3 mmol) in THF (5 ml) und Triethylamin (304 mg, 3 mmol) zugegeben. Das Gel wurde sanft 20 Minuten geschüttelt, und dann wurden weitere 304 mg (3 mmol) Triethylamin zugegeben. Nach Schütteln der Suspension für weitere 25 Minuten, wurden die p-Nitrobenzoyl-substituierten Trägerperlen 11 der Reihe nach mit einer Mischung von THF und 0,2 M Nacl-Lösung (1:1, Volumen/Volumen), Formamid und 0,2 M NaCl-Lösung gewaschen.
Die Perlen wurden dann in einer Lösung von 100 mM NaHCO&sub3; (10 ml) suspendiert und heftig mit Methylchlorformiat (2 ml) 5 Minuten unter Verkappung überschüssiger Aminogruppen geschüttelt. Die Suspension wurde mit Diethylether (2 x 15 ml) unter Entfernung überschüssigen Chlorformiats extrahiert, und die Perlen wurden mit 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Zu einer Suspension des Gels in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, (20 ml, Endvolumen) wurde Natriumdithionit (2,61 g, 15 mmol) zugegeben. Dann wurde die Suspension bei 55ºC in einem Wasserbad gehalten, wobei sie periodisch entfernt und geschüttelt wurde. Nach 45 Minuten wurden die p-Aminobenzoyl-substituierten Trägergelperlen mit einer Lösung von 0,2 M NaCl gewaschen. Zu einer Suspension dieser modifizierten Polyacrylamid-Gelperlen (5 ml gepackter Perlen) in 1 M Hcl (10 ml, Endvolumen) bei 0ºC wurde eine kalte Lösung von Natriumnitrit (69 mg, 1 mmol) in Wasser (1 ml) zugegeben. Die Suspension wurde sanft bei 4ºC 20 Minuten geschüttelt, und dann wurden die Perlen rasch mit einer kalten Lösung von 0,2 M NaCl unter Bereitstellung der p-Diazobenzoyl-substituierten Trägerperlen 12 gewaschen.

HERSTELLUNG DER LIGAND-TRÄGER-SONDE

Eine Lösung des N-Phenyllactamin-Ligand 13 (810 mg, 1,9 mmol) in einer gesättigten Lösung von Natriumborat (10 ml) wurde zu der dem kalten Diazomodifizierten Träger 12 zugegeben, der sofort eine tiefrote Farbe bekam. Die Suspension wurde sanft bei 4ºC über Nacht geschüttelt, dann erschöpfend mit 0,2 M NaCl-Lösung gewaschen, was eine tiefrot gefärbte Ligand-Träger- Sonde 14 zurückließ, in der der Ligand kovalent an den Träger über eine Azogruppe gebunden wurde. Ein Teil der Ligand-Träger-Sonde 14 (0,50 ml) bei, der eine spezifische Bindungskapazität von 0,5 mg Ricin pro ml gepackter Perlen gezeigt wurde. Es wurde bestätigt, daß das Ricin spezifisch gebunden wurde, durch Aufzeigen, daß das gebundene Ricin auf zwei Arten eluiert werden konnte. Entweder konnte die Ricin-Ligand-spezifische Wechselwirkung durch Verdrängung mit einer hohen Konzentration von Galactose getrennt werden, oder die Ligand-Trägerbindung konnte durch Behandlung mit einer Lösung von 0,2 bis 0,5 M Natriumdithionit, pH 8, gespalten werden. In beiden Fällen wurde Ricin oder Ricin-Ligand-Komplex quantitativ von der Säule eluiert. Als weiteren Beleg dafür, daß die Behandlung mit Dithionit Ricin durch Spaltung des Liganden vom Träger freisetzte, verlor das Gel sofort seine tiefe rote Farbe, die auf dem Chromophor der Azogruppe beruht.
Die Ligand-Träger-Sonde 14 wurde mit dem bifunktionalen Vernetzungsmittel 2,4-Dichlor-6-methoxytriazin auf die folgende Weise aktiviert. zu einer Suspension der Ligand-Träger-Sondenperlen 14 (5 ml Volumen, gepackte Perlen in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0) in trockenem DMF (20 ml) wurde zu einer Lösung von 2,4-Dichlor-6-methoxytriazin (1,8 g, 10,0 mmol) in trockenem DMF (10 ml) zugegeben. Die Suspension wurde sanft bei Raumtemperatur 22 Stunden gerührt. Die aktivierten Sondenperlen 15 wurden dann der Reihe nach mit DMF, DMF-100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, und schließlich mit 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen und in eine Säule gepackt.

HERSTELLUNG DES LECTIN-LIGAND-TRAGERKOMPLEXES

Eine Lösung von Ricin (5,7 mg in 3 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,15 N Natriumchlorid) wurde auf die aktivierte Sondensäule 15 gegeben, und der Durchlauf einmal aufgegeben. Die Säule wurde mit drei Säulenvolumen 0,05 M Triethanolaminhydrochloridpuffer, pH 8,6, gewaschen und bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen. Gebundenes Ricin, das nicht kovalent verknüpft war, wurde durch Waschen der Säule mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M Galactose, entfernt. Der Ricin-Ligand-Komplex wurde dann vom Träger durch Spaltung der kovalenten Bindung auf die folgende Weise freigesetzt. Die Säule wurde mit 0,05 M Triethanolaminhydrochloridpuffer, pH 8,6, unter Entfernung restlicher Galactose, und dann mit einer Lösung von 0,2 M Natriumdithionit, enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, pH 8,0, gewaschen. Die Perlen wurden dann in einen getrennten Behälter überführt und mit der Lösung von 0,2 M Natriumdithionit, 0,3 M Natriumchlorid, pH 8,0, 20 Minuten gerührt. Die Suspension wurde filtriert und die Perlen wurden zweimal mehr mit Dithionit auf die gleiche Weise behandelt. Die Thionitlösungen wurde gesammelt, was eine Lösung von 12 ml ergab, die ca. 0,8 mg Ricin-Ligand-Komplex frei vom Träger enthielt.
Der Komplex kann kovalent an einen monoklonalen Antikörper, wie J5, unter Verwendung üblicher bifunktionaler Vernetzungsmittel gebunden werden.
Andere Lectine können für das Ricin mit ähnlichen Ergebnissen ausgetauscht werden. Die Lectin-Ligand-monoklonalen Antikörperkomplexe können zur Abtötung ausgewählter Zellen in vitro wie auch in vivo eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Sonde, die zur spezifischen Bindung an Lectin unter Bildung eines Komplexes mit im Vergleich zu freiem Lectin verminderter nicht-spezifischer Cytotoxizität in der Lage ist, umfassend:

Bereitstellung eines spezifischen Liganden, der zur spezifischen Bindung an und zur Bildung einer kovalenten Bindung mit einer Oligosaccharid- Bindungsstelle auf einem cytotoxischen Lectin in der Lage ist, und

kovalentes Verknüpfen des spezifischen Liganden an einen festen Träger unter Bildung der Sonde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der spezifische Ligand ein Disaccharid oder ein höheres Polysaccharidderivat, spezifisch für ein cytotoxisches Lectin, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der spezifische Ligand eine Galactoseeinheit umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der spezifische Ligand N-(2-Mercaptoethyl)-lactamin oder N-Phenyllactamin ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das cytotoxische Lectin Ricin oder Abrin ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines cytotoxischen Lectinkomplexes mit im Vergleich zu freiem Lectin verminderter nicht-spezifischer Toxizität, wobei der Komplex ein cytotoxisches Lectin umfaßt, das kovalent an einen spezifischen Liganden gebunden ist, der zur spezifischen Bindung an die Oligosaccharidstelle des cytotoxischen Lectins in der Lage ist, umfassend:

Bereitstellung eines spezifischen Liganden, der zur spezifischen Bindung an die Oligosaccharid-Bindungsstelle auf einem Lectin in der Lage ist,

kovalentes Verknüpfen des Liganden an einen festen Träger unter Bildung der Sonde gemäß Anspruch 1, in Kontakt bringen des Lectins mit der Sonde unter Bildung einer spezifischen Bindung zwischen der Eindungsstelle und dem Liganden, und

daran anschließend Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Lectin und dem Ligand, wodurch ein Komplex aus dem Lectin und dem Ligand bereitgestellt wird, der kovalent an den Träger gebunden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, umfassend einen zusätzlichen Schritt, worin die kovalente Bindung zwischen dem Ligand und dem Träger unter Freisetzung hieraus eines Komplexes umfassend das kovalent an den Liganden gebundene Lectin gespalten wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, ferner umfassend einen Schritt, worin der cytotoxische Lectinkomplex aus einem unkomplexierten cytotoxischen Lectin durch Affinitätsreinigung gewonnen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin der spezifische Ligand ein Disaccharid oder ein höheres Polysaccaridderivat für ein cytotoxisches Lectin umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der spezifische Ligand eine Galactoseeinheit umfaßt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin der spezifische Ligand N-(2-Mercaptoethyl)-lactamin oder N-Phenyllactamin ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, worin das cytotoxische Lectin Ricin oder Abrin ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin der cytotoxische Lectinkomplex zur kovalenten Bindung an einen monoklonalen Antikörper in der Lage ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin der Ligand des cytotoxischen Lectinkomplexes eine restliche Thiolgruppe umfaßt, die zur Bildung einer kovalenten Bindung an einen monoklonalen Antikörper in der Lage ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines cytotoxischen Lectinkomplexes, der kovalent an einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, umfassend die kovalente Bindung eines monoklonalen Antikörpers an einen cytotoxischen Lectinkomplex, der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15 hergestellt ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend einen zusätzlichen Schritt der Trennung der kovalenten Bindung zwischen dem spezifischen Ligand und dem Träger entweder vor oder nach dem Schritt der kovalenten Verknüpfung des monoklonalen Antikörpers an den cytotoxischen Lectin-Ligand- Komplex.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die kovalente Bindung an den festen Träger durch ein gegenüber das Lectin inerte Reagens abspaltbar ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die kovalente Bindung an den Träger eine Disulfidgruppe oder eine Azogruppe oder eine lichtspaltbare Gruppe umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 13, worin die lichtspaltbare Gruppe eine ortho-Nitrobenzylester- oder eine ortho-Nitrobenzylcarbamatgruppe umfaßt.

20. Sonde, die zur spezifischen Bindung an ein Lectin unter Bildung eine Komplexes mit im Vergleich zu freiem Lectin verminderter nicht-spezifischer cytotoxizität in der Lage ist, umfassend:

einen festen Träger, der kovalent an einen spezifischen Liganden, umfassend ein Disaccharid oder ein höheres Polysaccharid, das zur spezifischen Bindung an die Oligosaccharidstelle auf einem cytotoxischen Lectin in der Lage ist und eine funktionelle Gruppe hat, die zur Bildung einer kovalenten Bindung mit der Oligosaccharidstelle in der Lage ist, gebunden ist.

21. Sonde nach Anspruch 20, worin der spezifische Ligand eine Galactoseeinheit umfaßt.

22. Sonde nach Anspruch 20 oder Anspruch 22, worin das cytotoxische Lectin Ricin oder Abrin ist.

23. Sonde nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin der spezifische Ligand in N-(2'-Mercaptoethylen)-lactamin oder N-Phenyllactamin ist.

24. Sonde nach den Ansprüchen 20 bis 23, worin die kovalente Bindung an den Trägern durch ein gegenüber das Lectin inertes Reagens spaltbar ist.

25. Sonde nach einem der Ansprüche 20 bis 24, worin die kovalent Bindung an den Träger eine Disulfidgruppe, eine Azogruppe oder eine lichtspaltbare Gruppe umfaßt.

26. Sonde nach Anspruch 25, worin die lichtabspaltbare Gruppe eine ortho-Nitrobenzylester- oder eine ortho-Nitrobenzylcarbamatgruppe umfaßt.