DE602004005826T2

DE602004005826T2 - Verfahren zur reinigung von stabilen radioiodium-konjugate

Info

Publication number: DE602004005826T2
Application number: DE602004005826T
Authority: DE
Inventors: Serengulam V. Summit GOVINDAN
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2024-02-05
Also published as: CA2515088A1; JP2006517230A; ATE359511T1; IL170030A; EP1592476B1; US20030220470A1; EP1592476A1; KR101022145B1; MXPA05008352A; WO2004071571A1; US7521531B2; CA2515088C; KR20050103219A; DE602004005826D1; CN1768266A; JP4732331B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Aufreinigung von Reagenzien, die beim Radioimmunnachweis und in der Radioimmuntherapie verwendet werden, und speziell die Aufreinigung von mit radioaktivem Iod markierten Konjugaten, die in vivo eine erhöhte Stabilität und eine erhöhte Retention an Tumorstellen aufweisen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mit radioaktivem Iod versehene monoklonale Antikörper sind für die Diagnose und die Therapie von Krebserkrankungen bedeutend, wie durch Goldenberg in Amer. J. Med. 1993; 94: 297–312 zusammengefasst. Über die letzten dreißig Jahre wurde eine Anzahl von Verfahren entwickelt, um radioaktives Iod für diese Anwendungen in monoklonale und polyklonale Anitkörper chemisch einzuführen. Iod ist als radioaktive Markierung bei diesen Anwendungen bevorzugt, weil die Chemie, die für die Radioiodierung von Protein verwendet wird, vergleichsweise einfach ist, radioaktives Iod nützliche physikalische Abklingeigenschaften aufweist und Isotope von Iod im Handel erhältlich sind. Verschiedene Chemien sind entwickelt worden, um Iod mit Antikörpern zu verknüpfen, die Tumorzellen adressieren. Diese Chemien wurden von Wilbur, Bioconjugate Chemistry 1992; 3: 433–70 besprochen. Das üblichste Verknüpfungsverfahren bestand darin, in situ eine elektrophile radioaktive Iodspezies zur Reaktion mit einer funktionellen Gruppe an einem Antikörper herzustellen. Reagenzien wie beispielsweise Chloramin-T und Iodogen wurden zur Erzeugung von elektrophilem Iod verwendet. Eine Tyrosingruppe am Protein ist in der Regel die Stelle der Iodierung.
Herkömmliche Radioiodierungen von MAKs erfordern das Entfernen von verwendetem Oxidationsmittel, sowie von nicht eingebautem radioaktivem Iod unter Verwendung eines Reinigungsverfahrens. Wenn pufferlösliche Oxidationsmittel wie Chloramin-T verwendet werden, werden das Oxidationsmittel und das radioaktive Iod üblicherweise durch Größenausschlusschromatographie über eine Größenausschlusssäule entfernt, wie beispielsweise die im Handel erhältliche PD10^® Säule.
Ein großer Nachteil bei der Verwendung des direkten Radioiodierungsreaktionsschemas ist das Phänomen der in vivo Deiodierung. Infolge Antikörperinternalisierung und lysosomaler Verarbeitung in vivo wird ein markiertes Protein zu kleinen Peptiden abgebaut und sein radioaktives Iod wird von der Zelle in der Form von Iodtyrosin oder als Iod freigesetzt, das an ein Peptid mit einem geringen Molekulargewicht gebunden ist. Diese Ergebnisse wurden von Geissler et al., Cancer Research 1992; 52: 2907–2915 und Shih et al., J. Nucl. Med. 1994; 35: 899–908 berichtet. Eine derartige in vivo Entfernung von radioaktivem Iod aus Zielzellen verringert die Diskriminierung zwischen Tumor und Nicht-Tumor, die für die Radiodiagnose bedeutend ist, und verringert auch die Verweilzeit von radioaktivem Iod in Zielzellen, was die Wirksamkeit der Radiotherapie erheblich beeinflusst.
Mehrere Ansätze wurden zur Bewältigung des Phänomens der in vivo Deiodierung durch die Ausgestaltung von Iodradiomarkierungen entwickelt, die intrazellulär zurückgehalten werden. Solche Markierungen werden als „verbleibende Markierungen" bezeichnet. In einem Verfahren ist radioaktives Iod an nicht metabolisierbare Kohlenhydrate gebunden und Letztere werden zuerst aktiviert und dann mit Antikörpern konjugiert. Dieser Ansatz ist beispielhaft veranschaulicht durch Lactitoltyramin (LT) und Dilactitolytyramin (Strobel et al., Arch. Biochem. Biophys 1985; 240: 635–45) und Tyrosinzellobiose (All et al., Cancer Research 1990; 50: 783s–88s). Bei einem anderen Ansatz wurde ein Pyridinbasierender Molekülteil, "SIPC", verwendet (Reist et al., Cancer Research 1996; 56: 4970–4977). Pentapeptide, die sämtliche D-Aminosäuren und mehrere basische Aminosäuren enthalten, wurden ebenfalls untersucht (Foulon et al., Cancer Research 2000; 60: 4453–4460). Bei einem noch weiteren Ansatz wurden an DTPA angebrachte mit radioaktivem Iod versehene Peptide, die D-Aminosäuren enthalten, erfolgreich als verbleibende Markierungen verwendet (Govindan et al., Bioconjugate Chemistry 1999; 10: 231–240; Stein et al., Cancer Research 2003; 63: 111–118).
Wenn ein mit radioaktivem Iod versehenes niedermolekulares Material mit MAKs (im Folgenden mit radioaktivem Iod versehene Konjugate) konjugiert wird, wie in den im vorherigen Absatz angegebenen Literaturstellen veranschaulicht, ergibt sich eine zusätzliche Anforderung insoweit, als dass auch das nicht konjugierte Material entfernt werden muss. Dies erfordert unabdingbar ein zusätzliches Säulenreinigungsverfahren. Das Kohlenhydrat-Verfahren führt zu einer geringen Gesamtausbeute und einer geringen spezifischen Aktivität und umfasst am Ende des Verfahrens ein Säulenaufreinigungsverfahren. Die Verfahren von Reist et al. (supra) und Foulon et al. (supra) umfassen zwei Säulenaufreinigungsschritte, einen auf der Stufe der Radioiodierung und den anderen auf der Stufe der Antikörperkonjugation. Das Verfahren von Govindan et al. (supra; weiter beschrieben bei Stein et al. (supra)) umfasst eine Säulenaufreinigung am Ende des Verfahrens mit höheren Gesamtausbeuten und höheren spezifischen Aktivitäten.
Säulenverfahren sind im Allgemeinen aufwändig und weisen als zusätzliche Nachteile die Strahlungsexposition des Personals, insbesondere bei der Handhabung von Hunderten von mCi von I-131 für Präparationen im klinischen Maßstab, und katastrophale Folgen beim Versagen der Säulen auf. Bei Iodogen-basierten Radioiodierungen ist das Oxidationsmittel wasserunlöslich und wird durch einfaches Absaugen mittels einer Spritze oder Abfiltrieren des radioaktiv markierten Materials entfernt. In diesen Fällen ist das einzige weitere Material, das entfernt werden muss, nicht eingebautes radioaktives Iod. Auf Grund der relativ höheren Affinität von Iodid gegenüber Phosphat- oder Hydroxidionen, um an ein starkes Anionenaustauscher-Harz zu binden, hat sich gezeigt, dass nicht eingebautes Iodid unter Verwendung eines Anionenaustauscher-Harzes entfernbar ist [Wegdock et al. J Nuclear Medicine 1990; 31: 508–511; Behr TM et al. Nuklearmedizin 2002; 41: 71–79]. Denkbar ist auch die Verwendung eines immobilisierten Chloramin-T-Oxidationsmittels, wie das im Handel erhältliche "IODO-BEADS"^®, in Kombination mit Anionenaustauscher-Harz. Obgleich durch solche Kombinationen eine gewisse Vereinfachung bei der Aufreinigung von direkt mit radioaktivem Iod versehenen Antikörpern erzielt wird, erfordert die Verwendung von mit radioaktivem Iod versehenen Konjugaten immer noch die Entfernung von nicht konjugierten Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht. Soweit wie diese Aufreinigung in der Regel durch Säulenverfahren erreicht wird, werfen die damit einhergehenden Nachteile der Verfahren praktische Probleme bei der Aufreinigung von radioaktiv markierten Präparaten mit mehreren Hunderten von Millicurie für klinische Anwendungen auf.
Ein Säulenverfahren wurde von Li et al. (Bioconjugate Chemistry 1994; 5: 101–104) beschrieben, um ein mit einem Radiometall chelatisiertes DOTA-Peptid von nicht markiertem DOTA-Peptid durch Hindurchführen durch eine Diethylaminoethylcellulose-Anionentauschersäule und Elution mit mehreren Teilen Wassers aufzureinigen. In diesem Fall besitzt das mit einem Radiometall chelatisierte DOTA-Peptid eine neutrale Ladung und wird daher von der Säule eluiert, während nicht markiertes Material mit negativer Ladung am Chelatorteil durch die Anionenaustauschersäule zurückgehalten wird. Dies wurde durch das Erfordernis der Reinigung von mit Radiometall chelatisiertem bifunktionellem Material notwendig, welches anschließend mit Antikörpern konjugiert wurde, und das Produkt wurde durch ein Größenausschlusssäulenverfahren gereinigt. Somit umfasst die Verfahrensweise von Li et al. (supra) einen mehrstufigen Ansatz und zwei säulenbasierte Aufreinigungsschritte. Wiederum werden solche säulenbasierten Verfahren unpraktisch sein, wenn sie auf die großtechnische Radioiodierung von Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht und anschließender Konjugation mit targetierenden Agenzien angewandt werden. Im letzteren Fall, der Hunderte von Millicurie von radioaktivem Iod umfasst, werden einfachere Aufreinigungsverfahren benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung löst die oben identifizierten Probleme durch Bereitstellen von Aufreinigungsverfahren für mit radioktivem Iod versehene Konjugate, die durch kovalentes Binden von mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptiden an targetierende Agenzien hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung befriedigt den Bedarf für ein Aufreinigungssystem für ein mit radioaktivem Iod versehenes Konjugat, das aus verschiedenen mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Komponenten und targetierenden Agenzien gewonnen ist. Im Unterschied zu den zuvor im Stand der Technik bekannten Verfahren betreffend die direkte Radioiodierung von targetierenden Agenzien wie Antikörpern, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die Radioiodierung einer Komponente mit niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise ein Tryrosin-umfassendes bifunktionelles Peptid, und das Konjugieren der mit radioktivem Iod versehenen Komponente mit Antikörpern umfasst. Die vorliegende Erfindung wendet sich der Notwendigkeit zu, sowohl nicht eingebautes radioaktives Iod als auch nicht konjugierte mit radioaktivem Iod versehene Komponente zu entfernen.
Verfahren der Erfindung stellen einen höheren Ausnutzungsgrad bei der Markierung von Antikörpern mit verbleibenden Iodmarkierungen bereit. Die Verfahren stellen ferner stabile Konjugatpräparate mit radioaktivem Iod höherer Qualität mit einer geringen Aggregatmenge bereit. Andere Vorteile wie beispielsweise die Vereinfachung und die sichere Handhabung, die bei einem Eintopfherstellungs- und Aufreinigungsverfahren einhergehen, werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Größenausschluss (SEC)-HPLC eines rohen (nicht aufgereinigten) Produktes (I-131-IMP-R4-hMN-14). Der Hauptpeak bei ~ 10 Minuten Laufzeit ist bedingt durch das markierte hMN-14, während die Peaks nahe 14 Minuten und 18 Minuten unkonjugiertes I-131-IMPR4 beziehungsweise I-131 darstellen.
2 zeigt die SEC-HPLC von aufgereinigtem I-131-IMPR4-hMN14 und zeigt, dass nicht konjugiertes I-131-IMPR4 und I-131 vollständig durch Anionenaustauscher entfernt werden.
3 zeigt die SEC-HPLC eines Gemisches aus aufgereinigtem Produkt und der Komplexierung des Antigens carcinoembryonales Antigen (CEA) und diese HPLC zeigt, dass die Immunreaktivität des Produktes vollständig beibehalten ist, wie durch die vollständige Verschiebung des durch den markierten Antikörper bedingten Peaks zu dem des Materials mit höherem Molekulargewicht aus Antikörper-Antigen-Komplex veranschaulicht.
DEFINITIONEN
In der folgenden Beschreibung werden eine Anzahl von Begriffen umfänglich benutzt. Definitionen sind angegeben, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Targetierendes Agens. Ein „targetierendes Agens" ist ein Molekülteil, der in der Lage ist, selektiv an eine Zielzelle zu binden. Beispiele für ein targetierendes Agens umfassen ein Proteinmolekül, das ein Antigen oder einen Rezeptor adressieren kann, der durch einen Tumor oder eine Infektionsläsion exprimiert ist, oder eine Komponente mit einer niedrigen molekularen Masse, die einen spezifischen Rezeptor auf einem Tumor oder eine Läsion adressieren kann, oder synthetische Nukleotide, die an Tumorzellen oder Läsionen adressiert sind. Bevorzugte targetierende Agenzien umfassen Antikörper und Polypeptide.
Antikörper. Der Begriff „Antikörper" umfasst monoklonale Antikörper, wie murine, chimäre, humanisierte oder menschliche Antikörper, ebenso wie Antigen bindende Fragmente. Solche Fragmente umfassen Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2, denen ein Fc-Fragment eines intakten Antikörpers fehlt. Solche Fragmente umfassen ferner isolierte Fragmente der variablen Region der leichten Kette, „Fv"-Fragmente der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten, (sFV)2-Fragmente (siehe, zum Beispiel: Tai et al., Cancer Research Supplement, 55: 5983–5989, 1995) und rekombinante Einzelketten-Polypeptidmoleküle, bei denen die leichten und schweren variablen Regionen durch einen Peptidlinker verknüpft sind. Unter „multivalent" wird verstanden, dass der Antikörper gleichzeitig mehr als ein Antigen binden kann, das die gleiche oder eine unterschiedliche Struktur besitzen kann. Unter „multispezifischem" Antikörper wird verstanden, dass der Antikörper gleichzeitig an mindestens zwei Antigene binden kann, die eine unterschiedliche Struktur aufweisen.
Konjugat. Wie hierin verwendet ist ein Konjugat ein Molekül, das ein nicht markiertes oder ein mit radioaktivem Iod versehenes, an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid umfasst (auch bezeichnet als „Komponente mit niedriger molekularer Masse"), das kovalent an ein targetierendes Agens, wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper gebunden ist. Das Konjugat behält die Biospezifität des targetierenden Agens. Beispielsweise ist die Immunreaktivität (Fähigkeit ein Antigen zu binden) des Antikörper-targetierenden Agens annähernd die gleiche oder nach dem Konjugieren nur geringfügig verringert im Vergleich zu derjenigen vor dem Konjugieren mit der Komponente mit niedriger molekularer Masse.
An Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid. Der Begriff „an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid" bezieht sich auf die chemischen Komponenten, die durch die kovalente Bindung einer Aminopolycarbonsäure an ein Peptid ausgebildet werden. Die Bindung erfolgt bevorzugt über die Aminoguppen des Peptids. Jedes geeignete Aminopolycarboxylat wird für die Verwendung im Rahmen dieser Erfindung ins Auge gefasst. Beispielhafte Aminopolycarboxylate umfassen Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), DTPA (Diethylentriamintetraessigsäure), TTHA (Triethylentetraminhexaessigsäure), DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan N,N',N'',N'''-Tetraessigsäure) oder verschiedene Hauptketten-substituierte Varianten davon, wie beispielsweise Isothiocyanatobenzyl-EDTA/DTPA/TTHA/DOTA, unter zahlreichen anderen Aminopolycarboxylaten und deren Derivaten, die man sich leicht vorstellen kann. Der Begriff Peptid wird nachstehend definiert.
Peptid. Die Verwendung des Begriffs "Peptid" in der Formulierung an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid bezeichnet jedes Peptid, das aus L- oder D-Aminosäuren oder einer Kombination aus sowohl L- als auch D-Aminosäuren zusammengesetzt ist. Das Peptid ist bevorzugterweise aus 2–40 Aminosäuren, bevorzugtererweise aus 2–5 Aminosäuren und am bevorzugtesten aus 3–4 Aminosäuren zusammengesetzt. Im optimalen Fall weist das Peptid mindestens ein D-Tyrosin auf, das mit einer basischen Aminosäure wie beispielsweise L- oder D-Lysin verbunden ist, wobei letzteres den Carboxyterminus des Peptids ausbildet. Diese basische Aminosäure kann an die Aminopolycarbonsäure gebunden werden.
Lösung. Wie hierin verwendet, bezeichnet Lösung die Lösung, die das Konjugat aus Antikörper und mit radioaktivem Iod versehenes Aminopolycarboxylat, nicht eingebautes radioaktives Iod und nicht eingebautes mit radiaktivem Iod versehenes Aminopolycarboxylat enthält. Eine bevorzugte Lösung ist eine gepufferte wasserhaltige Lösung.
Nicht gebundenes radioaktives Iod. Wie hierin verwendet, bezeichnet nicht gebundenes radioaktives Iod eine radioaktive Iodspezies, die nicht zu einer reaktiven Iodspezies oxidiert wird und schließt nicht oxidiertes radioaktives Iod ein, das nicht an das Peptid gebunden ist.
Anionenaustauscher-Harz. Wie hierin verwendet, bezeichnet „Anionenaustauscher-Harz" im Handel erhältliche, unlösliche, synthetische oder natürliche Polymermatrices, die entweder protoniertes tertiäres Amin oder funktionelle Tetraalkylammonium-Gruppen enthalten, wobei die Gegenionen (Anionen) mit den Anionen der Testsubstrate austauschbar sind.
Filter. Wie hierin verwendet, bezeichnet „Filter" jede Vorrichtung, die Partikel zurückhalten kann, wie beispielsweise eine Filtergröße zwischen 0,10 μm und 0,30 μm, bevorzugtererweise einen Filter mit einer Porendurchmessergröße von etwa 0,22 μm.
Oxidationsmittel. Wie hierin verwendet, bezeichnet „Oxidationsmittel" jedes oxidierende Agens, das zum Oxidieren von radioaktivem Iod verwendet wird, um mit radioaktivem Iod versehenes Monochloridmolekül zu aktivieren, welches die Radioiodierungsspezies in Radioiodierungsreaktionen ist, wie in Wilbur (supra) diskutiert.
Iodogen-Verfahren. Dieser Begriff bezeichnet ein Radioiodierungsverfahren, das die Verwendung von Iodogen als Oxidationsmittel umfasst. Iodogen (1,3,4,6-Tetrachlor-3-alpha,6-alpha-diphenylglycoluril) ist ein wasserunlösliches Material, das aktive Radioiodierungsspezies nach Kontakt mit einer Lösung aus radioaktivem Iod erzeugt, wie in Wilbur (supra) diskutiert.
Chloramin-T Verfahren. Dieser Begriff bezeichnet die Verwendung von Chloramin-T (Natrium N-Chlortoluensulfonamid), als ein wasserlösliches Oxidationsmittel, das aktive Radioiodierungsspezies nach Mischen mit einer Lösung von radioaktivem Iod erzeugt, wie in Wilbur (supra) diskutiert.
Verbindungsteil. Der Verbindungsteil ist eine funktionelle Gruppe, die in der Lage ist mit dem targetierenden Agens eine kovalente Bindung auszubilden und ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Maleimid, Chloracetamid, Bromacetamid, Iodacetamid, Vinylsulfon, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxysulfosuccinimidester, Amidatester, Isocyanat oder Isothiocyanat. Der Verbindungsteil ist in ein an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid unter Verwendung von homobifunktionellen und heterobifunktionellen quervernetzenden Molekülen eingeführt. Die Verwendung von homobifunktionellen und heterobifunktionellen Reagenzien als Quervernetzer ist im Stand der Technik gut bekannt (Wong, S.S., 1991; Chemistry of protein conjugation and cross-linking; CRC Press, Boca Raton, FL; Seiten 1–48).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass ein kurzer Kontakt mit einem Anionenaustauscher-Harz konjugierte Komponenten mit niedriger molekularer Masse wirksam entfernt. Das gereinigte Produkt wird durch Abfiltration von dem Anionenaustauscher-Harz isoliert. Zum Abfiltrieren des Harzes von dem Konjugat und dem nicht umgesetzten Iodid und dem mit Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptid kann eine jede Filtriervorrichtung verwendet werden, die das partikuläre Material zurückhalten kann. Eine Filtriervorrichtung mit 22 μm ist am bevorzugtesten. Das Verfahren zur Entfernung von nicht konjugiertem Material mit niedriger molekularer Masse durch Rühren mit Anionenaustauscher-Harz funktioniert besonders gut mit den erfindungsgemäßen Aminopolycarboxylat-Komponenten, wie DTPA.
Die wirksame Entfernung von nicht konjugierten Polycarboxylat-Komponenten durch eine einfache Eintopfreinigung, die ein aufwändiges Säulen-Reinigungsverfahren vermeidet, wurde unerwartet entdeckt. Auf der Grundlage der Selektivität von Gegenionen für das Anionenaustauscher-Harz wäre man nicht in der Lage vorherzusagen, dass eine kurze Kontaktzeit mit Anionenaustauscher-Harzen nicht konjugierte Komponenten mit niedriger molekularer Masse, wie beispielsweise Polycarboxylate, wirksam entfernen könnte. Beispielsweise wird davon ausgegangen, dass Hydroxid schwache Bindungsfähigkeiten an ein Anionenaustauscher-Harz besitzt und eine Acetatgruppe nur unwesentlich besser als Hydroxid bindet. Eine Acetatgruppe betrifft insofern die vorliegenden Aminopolycarboxylate, als dass Aminopolycarboxylate Essigsäurereste an Stickstoffatomen enthalten und diese Essigsäurereste vollständig als Acetate in Pufferlösungen mit pH > 6 ionisiert sind. Beispielsweise beträgt nach der Produktinformation des Herstellers (AG^® 1 und AG 2 Strong Anion Exchange Resin Instruction Manual, BioRad Corporation) die Selektivität von Iodid auf einem AG 1^®-Anionenaustauscher-Harz das 175-fache derjenigen von Hydroxid (die willkürlich auf 1 gesetzt ist), während diejenige von Acetat nur um das 3,2-Fache besser ist als diejenige von Hydroxid. Ferner wird das Harz in Phosphatform verwendet, die eine relative Selektivität von 5 (im Vergleich zu 1 für Hydroxid) aufweist, was etwas höher ist als diejenige von Acetat. Die relativ höhere Selektivität von Iod hinsichtlich des Bindens an Anionenaustauscher-Harz sagt nur die erfolgreiche Entfernung des Iodids durch ein Anionenaustauscherverfahren vorher. Trotz der geringeren Selektivität des Acetat- gegenüber dem Phosphation, um an Anionenaustauscher-Harz zu binden, hat der Erfinder jedoch festgestellt, dass das Ionenaustauscher-Verfahren bei der Entfernung der nicht konjugierten Komponente mit niedriger molekularer Masse, die Aminopolycarboxylate enthält, wirksam arbeitet, was auf der Grundlage einer Anionenaustauscher-Harzbindungsselektivität nicht vorhergesagt werden könnte. Obgleich er nicht wünscht, an eine Theorie gebunden zu sein, nimmt der Erfinder an, dass diese verbesserte Selektivität auf der Gegenwart von mehreren Acetatgruppen im gleichen Molekül beruht, wie durch die Aminopolycarboxylat-Substruktur der Komponente mit niedriger molekularer Masse dargestellt. Somit wurde festgestellt, dass durch Einbau von Aminopolycarboxylatteilen in die Komponente mit niedriger molekularer Masse nicht konjugiertes mit radioaktivem Iod versehenes Material durch einfaches Rühren für einige Minuten mit einer Suspension von Anionenaustauscher-Harz und Abfiltrieren des Produkts wirksam entfernt werden kann. Das vereinfachte erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber dem Verfahren von Li et al. (supra) vom Funktionsablauf insofern verschieden und zweckmäßig, als das Säulenreinigungsverfahren vollständig vermieden wird.
Anionenaustauscher-Harz
Für diese Experimente wurde das im Handel erhältliche stark basische Anionenaustauscher-Harz, das quateräre Ammoniumgruppen enthält, die an das Styroldivinylbenzencopolymergitter angebaut sind, verwendet. Dieses Harz weist eine Quervernetzung von 8% auf, was der Porengröße mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 1000 Da und einer mittleren Maschenweite von 100–200 (Partikeldurchmesser 150–75 μm) entspricht.
Allerdings ist die Erfindung nicht auf die oben angeführten spezifischen Anionenaustauscher-Harzmerkmale beschränkt, sondern umfasst sowohl das oben beschriebene starke basische Anionenaustauscher-Harz als auch schwaches basisches Anionenaustauscher-Harz, wie beispielsweise die im Handel erhältliche Diethylaminoethylcellulose. Zusätzlich ist das Ausmaß der Quervernetzung an dem verwendeten Harz nicht limitierend. In dem spezifischen Fall eines stark basischen anionischen Harzes kann die Quervernetzung von 2% (Porengröße mit Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 2700 Da) bis 12% (Porengröße mit Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 400 Da) und die Partikelgröße des Harzes in dem Bereich von einer Maschenweite von 20–400, entsprechend einem Partikeldurchmesserbereich von 850 μm bis 38 μm variieren.
Konjugate
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von nicht metabolisierbaren und mit radioaktivem Iod versehenen Peptiden, die für die Markierung von Antikörpern verwendet werden, so dass die Radioaktivität in vivo residualisiert ist. Diese speziell ausgestalteten Peptide enthalten 2–40 Aminosäuren, bevorzugterweise 2–5 Aminosäuren und enthalten bevorzugterweise D-Aminosäuren. D-Aminosäuren werden bevorzugt an dem Peptid zwischen der Bindungsstelle des Peptids an einen Antikörper und einem radioaktiven Iod verwendet, das an Tyrosin oder Tyramin gebunden ist. Bevorzugterweise befinden sich innerhalb dieser Region keine zwei benachbarten Aminosäuren, die L-Aminosäuren sind. Glycin ist in diesem Zusammenhang eine L-Aminosäure. Indem D-Aminosäuren auf diese Art und Weise verwendet werden, können die Peptidbindungen, die das radioktive Iod mit dem Antikörper verbinden, nicht in dem Lysosom hydrolysiert werden. Zusätzlich sind ein oder mehrere Aminopolycarboxylat-Teile an dem Peptid angebracht und der N-Terminus und/oder eine Seitenkettenaminogruppe sind mit einem Quervernetzungsmittel verbunden, das eine funktionelle Gruppe für die kovalente Bindung an den Antikörper besitzt. Die kovalente Antikörper-bindende Gruppe kann ein Aminorest sein (zur ortsspezifischen Bindung an das oxidierte Kohlenhydrat des Fc-Teils von MAKs), ein Imidat oder Isothiocyanat (befestigbar an Lysin-Gruppen von Proteinen), ein Maleimid, ein Brom- oder Iodacetamidrest (spezifisch für Thiole auf MAKs) und dergleichen. Die Aminosäure(n), die unmittelbar der vorangehenden D-Tyrosineinheit folgt/folgen und die verwendet wird/werden zum Einführen von Antikörper-bindenden Quervernetzungsmitteln, können natürliche L-Aminosäuren sein. Die Aminopolycarboxylateinheit kann Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), DTPA (Diethylentriamintetraessigsäure), TTH (Triethylentetraminhexaessigsäure), DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure), NOTA (1,4,7-Triazacyclononan-N,N',N''-triessigsäure) oder verschiedene Hauptketten-substituierte Varianten davon sein, wie beispielsweise 1-[(p-Isothiocyanat)benzyl]-EDTA (Benzyl-EDTA), 1-[(p-Isothiocyanato)benzyl]-DTPA (Benzyl-DTPA), 1-[(p-Isothiocyanato)benzyl] -TTHA (Benzyl-TTHA), 1-[(p-Isothiocyanato)benzyl]-DOTA (Benzyl-DOTA), 1-[(p-Isothiocyanato)benzyl]-NOTA (Benzyl-NOTA), unter zahlreichen anderen Aminopolycarboxylaten und deren Derivate, die leicht ins Auge gefasst werden können.
In einer weiteren Ausführungsform ist das bifunktionelle Iodierbare Aminopolycarboxylat durch Anfügen einer Tyramingruppe und einer Antikörper-bindenden Gruppe an das Aminopolycarboxylat gewonnen. Eine Protease-empfindliche Bindung ist in diesen Strukturen nicht vorhanden. Alternativ sind Aminopolycarboxylate, deren Hauptkette mit einer Antikörper-bindenden Gruppe substituiert ist, in entsprechende Dianhydride umgewandelt, die dann mit D-Tyrosin umgesetzt werden, um eine Einheit zu erhalten, die zwei D-Tyrosinreste enhält. Da die Amidbindung(en) zwischen dem bifunktionellen Aminopolycarboxylat und dem D-Tyrosin nicht durch Proteasen erkannt werden/wird, bilden diese eine andere Art von verbleibenden Iodmarkierungen.
Die Tatsache, dass ein jodierter D-Tyrosinteil gegen Deiodinasen resistent sein wird, ist eine vorteilhafte Eigenschaft, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Diese Möglichkeit ist durch Dumas et al., Biochem. Biophys. Acta 1973; 293: 36–47 beschrieben.
Beispiele für ein an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid, das für die Radioiodierung eines Antikörpers nützlich ist, sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend: X-Gly-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(DTPA); [X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(½DTPA)]2; X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys((1-(p-NH)benzyl)DTPA)-OH; X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Lys(X)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; und X-Lys(X)Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH: wobei X ein Quervernetzer ist, der eine funktionelle Gruppe zur kovalenten Bindung an targetierende Vektoren enthält, einschließlich Proteine, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, Fragmente und Konstrukte davon.
Beispiele, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, wobei das radioaktive Iod I-123, I-124, I-125 oder I-131 ist.
Antikörper
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antikörper, wie MAKs, multivalente Antikörper und multispezifische Antikörper verwendet, die Marker oder Tumor-assoziierte Antigene erkennen oder binden, die auf hohem Niveau auf Zielzellen exprimiert sind und die überwiegend oder nur auf erkrankten Zellen gegenüber normalen Geweben exprimiert sind, sowie Antigene, die mit bestimmten normalen Zellen und zu abladierenden Geweben verbunden sind, wie beispielsweise Knochenmarkszellen und ektopische Gewebe, wie beispielsweise Nebenschilddrüse, Milz und Endometrium und Antikörper, die schnell internalisiert werden. "Multivalenter" Antikörper soll bedeuten, dass der Antikörper mehr als ein Antigen binden kann, welches die gleiche oder eine unterschiedliche Struktur aufweisen kann. "Multispezifischer" Antikörper soll bedeuten, dass der betreffende Antikörper gleichzeitig an mindestens zwei Antigene binden kann, die von unterschiedlicher Struktur sind. Beispielsweise würde ein Antikörper mit zwei unterschiedlichen Spezifitäten als multivalent und multispezifisch betrachtet werden, da er zwei strukturell unterschiedliche Ziele gleichzeitig binden kann. Andererseits wäre ein Antikörper mit zwei oder mehr spezifischen Armen, die dasselbe Ziel binden, aber keine anderen Spezifitäten, multivalent aber nicht multispezifisch. Eine Vielzahl von multispezifischen und/oder multivalenten Antikörpern kann unter Verwendung der Gentechnik hergestellt werden. Beispielsweise kann ein bispezifisches Fusionsprotein, beispielsweise bestehend aus einem scFv mit einer einzigen Bindungsstelle für ein Antigen und einem Fab-Fragment mit einer einzigen Bindungsstelle für ein zweites Antigen, monovalent sein. Ein bispezifischer Antikörper kann auch divalent sein und besteht, beispielsweise, aus einem IgG mit zwei Bindungsstellen für ein Antigen und zwei scFv mit zwei Bindungsstellen für ein zweites Antigen.
Antikörper, die im Umfang der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen MAKs mit Eigenschaften, wie sie oben beschrieben sind, und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden MAKs: LL1 (anti-CD74), LL2 (anti-CD22), RS7 (antiepitheliales Glykoprotein-1 (EGP-1)), PAM-4 (anti-MUC1), MN-14 (anticarcinoembryonales Antigen), MU-9 (anti-Dickdarm-spezifisches Antigen-p), AFP (antialpha-Fetoprotein), Antiprostata-spezifisches Membran-Antigen (PSMA), wie beispielsweise J591, und G250 (anti-Carboanhydratase IX). Andere nützliche Antigene, die unter Verwendung dieser Konjugate targetiert werden können, umfassen HER-2/neu, CD19, CD20, VEGF, EGF-Rezeptor, alkalische Phosphatase, Prostatasäurephosphatase, Tenascin, Plazentawachstumsfaktor (P1GF), Insulin-artiger Wachstumsfaktor (ILGF) und Ganglioside.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antikörper verwendet, die schnell internalisieren und dann erneut exprimiert, verarbeitet und auf Zelloberflächen präsentiert werden, was eine kontinuierliche Aufnahme und Ablagerung von zirkulierendem Immunkonjugat durch die Zelle ermöglicht. Ein Beispiel für ein am meisten bevorzugtes Antikörper-/Antigen-Paar ist LL1, ein anti-CD74-MAK (invariante Kette, Klasse II-spezifisches Chaperon, Ii). Das CD74-Antigen ist auf B-Zell-Lymphomen, bestimmten T-Zell-Lymphomen, Melanomen und bestimmten anderen Tumoren (Ong et al., Immunology 1999; 98: 296–302) stark exprimiert.
Die Krankheiten, die mit anti-CD74-Antikörpern behandelt werden, umfassen beispielsweise, sind aber nicht beschränkt auf Non-Hodgkin-Lymphom, Melanom und multiples Myelom. Die kontinuierliche Expression von CD74-Antigen auf der Oberfläche von Zielzellen für kurze Zeiträume und die anschließende Internalisierung und erneute Expression des Antigens erlaubt es dem targetierenden LL1-Antikörper zusammen mit jedem beliebigen therapeutischen Teil, den er als "Nutzlast" trägt, internalisiert zu werden. Dieses erlaubt, dass sich eine hohe, und therapeutische, Konzentration an therapeutsichem LL1-Immunkonjugat innerhalb derartiger Zellen akkumuliert. Internalisierte LL1-Immunkonjugate werden durch Lysosomen und Endosomen im Kreislauf durchgeführt und der verbleibende radioaktive Teil wird auf diese Weise innerhalb der Zielzellen zurückgehalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper, die bei der Behandlung von Erkrankungen des Menschen verwendet werden, humane oder humanisierte (cdr-aufgepfropfte) Varianten von Antikörpern; obwohl murine und chimäre Varianten von Antikörpern verwendet werden können. Bei veterinärmedizinischen Anwendungen wäre wahrscheinlich IgG der gleichen Spezies der wirksamste Vektor, obwohl IgGs über die Artgrenze hinweg nützlich bleiben würden. IgG-Moleküle der gleichen Art sind als Abgabevehikel am bevorzugtesten, um Immunreaktionen zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn wiederholte Behandlungen in Betracht kommen. Es ist beim Menschen weniger wahrscheinlich, dass ein humaner oder humanisierter IgG-Antikörper eine anti-IgG-Immunantwort in Patienten erzeugt. Indem sie ein internalisierendes Antigen adressieren, internalisieren Antikörper, wie beispielsweise hLL1 und hLL2 schnell nach dem Binden an Zielzellen, was bedeutet, dass das getragene Konjugat aus mit radiokativem Iod versehenem Antikörper schnell in Zellen internalisiert wird.
Der MAK ist ein muriner, chimärer, humanisierter oder humaner Antikörper und kann intakt oder ein Fragment oder verschiedene konstruierte Varianten davon sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der MAK derivatisiert oder Disulfid-reduziert, um Thiolgruppen aufzuweisen.
Antikörper-Ziele
Antikörper können verwendet werden gegen verschiedene erkrankte Gewebe, Zellen und Organismen, wie beispielsweise kardiovaskuläre Läsionen, (z.B. Gerinsel, Gefäßpropfen, atherosklerotische Plaques) Amyloidablagerungen (z.B. Amyloidose und bei Alzheimerscher Krankheit), infektiösen Organismen, (z.B. Bakterien, Pilze, Rickettsien, Viren, Parasiten), Entzündung (z.B. Klasse III-Autoimmunerkrankungen, wie immunvermittelte Thrombozytopenie, wie akute idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische idiopathische thrombozytopenische Purpura, Dermatomyositis, Sjögren-Syndrom, multipler Sklerose, Sydenham'scher Chorea, Myasthenia gravis, systemischen Lupus erythematodes, Lupus nephritis, rheumatisches Fieber, polyglanduläre Symptome, bullöses Pemphigoid, Diabetis mellitus, Purpura Schoenlein-Henoch, post-streptokokkale Nephritis, Erythema nodosum, Takayasu-Syndrom, Addison'sche Krankheit, rheumatoide Arthritis, Sarkoidose, Colitis ulcerosa, multiformes Erythem, IgA-Nephropathie, Polyarteriitis nodosa, Spondylarthritis, Goodpasture-Syndrom, Thromboangiitis ubiterans, Sjogren's syndrom, primäre biliäre Leberzirrhose, Hashimoto-Syndrom, Thyreotoxikose, Sklerodermie, chronische aktive Hepatitis, Polymyositis acuta/Dermatomyositis, Polychondritis, Pamphigus vulgaris, Wegener'sche Granulomatose, membranöse Nekropathie, amyotrophische Lateralsklerose, Tabes dorsalis, Riesenzellenarteritis/Polymyalgie, perniziöse Anämie, schnell fortschreitende Glomerulonephritis und fibrosierende Alveolitis usw.), disloziertes oder ektopisches normales Gewebe (z.B. Nebenschilddrüse, Endometrium, Milz, Thymus) und Tumore (flüssig (z.B. Leukämien und Lymphome) und solide (z.B. Karzinome, Sarkome, Gliome, Melanome).
Die vorliegende Erfindung wird unten mit Beispielen erläutert, ohne den Schutzumfang zu begrenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Vereinfachtes Eintopfherstellungs- und Aufreinigungverfahren zum Markieren von Disulfid-reduziertem anti-CEA-MAK, hMN-14, mit mit radioaktivem Iod versehenem IMP-R4
Das Verfahren ist unten unter Verwendung von IMP-R4 als das Material mit der niedrigen molekularen Masse veranschaulicht, das mit radioaktivem Iod versehen und an Disufid-reduzierten anti-CEA-MAK, hMN-14, konjugiert wird. IMP-R4 weist die Struktur MCC-Lys(MCC)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH auf, wobei MCC 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carbonyl ist. IMP-R4 ist ein Teil des Gegenstandes der U.S. Patentanmeldung 09/696, 740 , die am 26. Oktober 2000 eingereicht wurde.
I-131-Natriumiodid vom Anbieter wurde mit dem Siebenfachen seines Volumens mit 0,5 M Natriumphosphat pH 7,4 gepuffert und unter zusätzlicher Verwendung von 1,4 ml 40 mM Natriumphosphat pH 7,4 in ein iodogenbeschichtetes Glasfläschchen überführt, das mit einem Rührfisch ausgestattet war und IMP-R4 (0,13 μmol/100 mCi I-131) enthielt. Die Lösung wurde 8–15 Minuten gerührt und nicht eingebautes radioaktives Iod wurde mit überschüssiger 4-Hydroxyphenylessigsäure gelöscht. Das mit radioaktivem Iod versehene IMP-R4 wurde 30 Minuten an Disulfid-reduziertes hMN-14 (IgG-SH zu IMP-R4-Verhältnis: 0,6 in einem Experiment) konjugiert und nicht verwendete Thiolgruppen wurden mit Natriumtetrathionat abgedeckt. Schließlich wurden 2–3 ml einer 20% Gew./Vol. Suspension eines Anionenaustauscher-Harzes AG 1X8^® (Maschenweite 100–200) in Phosphatform zugefügt und für 5 Minuten gerührt. Das radioaktiv markierte Material wurde dann in einen sterilen Behälter, der mit einem Septum versiegelt war, unter Verwendung einer Milli-Fil^®GS Filtereinheit mit 0,22 μm (Millipore Corporation) filtriert. Menschliches Serumalbumin wird optional zu dem Produkt zu einer Endkonzentration von 1%–2,5% zugefügt.
Typische Wiedergewinnungsraten waren wie folgt. Ausgehend von 57,4 mCi I-131, enthielt das Endprodukt 40 mCi (69,9%), während bei einem Durchgang, der 123 mCi I-131 umfasste, ein Endprodukt 63 mCi (51%) enthielt. Bei Radiomarkierungen (n = 9) unter Verwendung von 40 mCi–123 mCi I-131 reichte der Gesamteinbau von 61%–75%, wie durch HPLC-Analysen gemessen, während die Wiedergewinnungsraten sich in einem Bereich von 50%–70% befanden. Immunreaktivitäten, wie durch die Komplexierung mit CEA beurteilt und durch die HPLC analysiert, betrugen > 95%. Die Endprodukte wiesen eine Reinheit von > 95% auf, wie durch HPLC-Analysen ermittelt, mit Aggregaten < 5% und mit spezifischen Aktivitäten in dem Bereich von 5 mCi/mg–6 mCi/mg.
Beispiel 2: In vitro Stabilität in Puffer und bei Serumexposition
Man lies ein gereinigtes Produkt aus Beispiel 1 (62,9 mCi Gesamtradioaktivität) bei einer Konzentration von 0,9 mCi/ml und einer Antikörperkonzentration von 0,2 mg/ml in Phosphatpuffer mit 2,5% HSA bei Raumtemperatur für 20 Stunden stehen und analysierte es mittels Größenausschluss-HPLC. Ein beispielhafter Phosphatpuffer ist eine wässrige Lösung von 0,1 M Natriumphosphat, der auf einen pH zwischen 6,0 und 7,5 eingestellt ist. Dies zeigt, dass das Produkt praktisch unverändert war. Komplexbildung mit 20-fachem molaren Überschuss des CEA-Antigens offenbarte die Beibehaltung der Immunreaktivität.
In einem zweiten Experiment wurde das obige Produkt 33,3-fach in menschlichem Serum verdünnt und bei 37° C für 20 Stunden inkubiert. Die Analyse zu dieser Zeit zeigte einen vernachlässigbaren Verlust der Markierung und das Material komplexierte noch mit CEA, was die Beibehaltung der Immunreaktivität anzeigt.
Beispiel 3: Markierung bei einem niedrigeren pH und Aufreinigung
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit einer Abwandlung dergestalt angewandt, dass I-131 Natriumiodid mit dem Siebenfachen seines Volumens aus 0,3 M Natriumphosphat pH 6 gepuffert wurde, gefolgt von einem Überführen des gepufferten I-131 in ein Iodogen-Glasfläschchen unter Verwendung von 1,4 ml 0,03 M Natriumphosphat pH 6. Nach der Radioiodierung, dem Konjugieren an Disulfid-reduziertem hMN-14 und Aufreinigen durch Rühren mit AG^® 1X8 Anionenaustauscher-Harz, wurden ausgehend von 56,5 mCi I-131 Natriumiodid 39 mCi (69%) von gereinigtem I-131-IMP-R4-hMN-14 wiedergewonnen. In einem weiteren Experiment wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens 69,3 mCi gereinigtes Produkt (63,1%) ausgehend von 109,8 mCi I-131 Natriumiodid erhalten. In diesen zwei Experimenten wurde wiederum die vollständige Beibehaltung der Immunreaktivität unter Verwendung der Komplexbildung mit CEA dokumentiert.
Beispiel 4: Radioiodierung unter Verwendung von immobilisiertem Chloramin-T als Oxidationsmittel, gefolgt von Konjugation und Anionenaustauscherreinigung
In diesem Experiment wird das im Handel erhältliche immobilisierte Chloramin-T (IODO-BEADS^®) an Stelle des Iodogens verwendet. Ein oder mehrere Kügelchen wird/werden in Radioiodierung-Glasfläschchen verwendet. Ansonsten sind die Abläufe identisch zu den in Beispiel 1 beschriebenen. Auf diesem Weg wird gereinigtes I-131-IMP-R4-hMN-14 nach Anionenaustauscherreinigung erhalten und das Produkt durch einfache Filtration isoliert.

Claims

Verfahren zum Herstellen und Aufreinigen eines Konjugates aus einem mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptid und einem targetierenden Agens, umfassend: (A) Bereitstellen einer Lösung umfassend (i) ungebundenes radioaktives Iod, (ii) ein mit radioaktivem Iod versehenes, an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid, das nicht mit einem targetierenden Agens konjugiert ist, und (iii) ein mit radioaktivem Iod versehenes, an Aminopolycarboxylat angebrachtes Peptid, das mit dem targetierenden Agens konjugiert ist; (B) Kontaktieren der Lösung mit einem Anionenaustauscher-Harz; und (C) gemeinsames Hindurchführen des Anionenaustauscher-Harzes und der Lösung durch einen Filter, der in der Lage ist, Anionenaustauscher-Harzpartikel zurückzuhalten; wobei ein gereinigtes Konjugat des mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptides und des targetierenden Agens erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung von (A) durch Radioiodierung eines an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptides hergestellt wird, um ein mit radioaktivem Iod versehenes Peptid auszubilden, und Konjugieren des mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptides mit einem targetierenden Agens, um ein Konjugat aus einem mit radioaktivem Iod versehenen, an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptid auszubilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Radioiodierung des Peptides ausgehend von radioaktivem Natriumiodid mit einem Oxidationsmittel durchgeführt wird, um ein Radioiodid zu erzeugen, das in der Lage ist, an das Peptid zu binden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oxidationsmittel Iodogen oder Chloramin-T ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Oxidationsmittel Chloramin-T ist und die Radioiodierung in Gegenwart einer immobilisierten, unlöslichen Kügelchenform von Chloramin-T durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Filter einen Porendurchmesser zwischen 0.1 μm und 0.3 μm aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anionenaustauscher-Harz aus funktionellen quartären Ammoniumgruppen auf einem Polymergitter besteht und das Ausmaß der Quervernetzung an dem Polymer etwa 2%–12% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anionenaustauscher-Harz aus funktionellen tertiären Amingruppen auf einem Polymergitter besteht.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Partikelgröße des Harzes zwischen einer Maschenzahl von 20 und 400 (Partikeldurchmesser von 850 μm–38 μm) liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gereinigte Lösung des Konjugates zusammen weniger als 10% des unkonjugierten radioaktiven Iods und des unkonjugierten mit radioaktivem Iod versehenen Peptides umfasst, die ursprünglich in der Lösung vor der Exponierung gegenüber dem Anionenaustauscher-Harz vorhanden waren.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Rühren des Harzes mit der Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Hindurchführen der Lösung durch eine Säule, die Anionenaustauscher-Harz enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das an Aminopolycarboxylat angebrachte Peptid nach Anspruch 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: X-Gly-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys (DTPA); [X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys (½DTPA)]₂; X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys((1-(p-NH)benzyl)DTPA)-OH; X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Lys(MCC)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; und X-Lys(X)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH; wobei X ein Quervernetzer ist, der einen Verbindungsteil umfasst, der in der Lage ist, mit dem targetierenden Agens eine kovalente Verbindung auszubilden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, wobei das targetierende Agens über einen Verbindungsteil mit dem an Aminopolycarboxylat angebrachten Peptid konjugiert wird, der Maleimid, Chloracetamid, Bromacetamid, Iodacetamid, Vinylsulfon, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxysulfosuccinimidester, Amidatester, Isocyanat oder Isothiocyanat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Maleimid-Verbindungsteil ein 4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexan-1-carbonyl-Teil ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Maleimid-Verbindungsteil ein 2-(N-Maleimid)acetyl-Teil ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aminopolycarboxylat EDTA, DTPA, Benzyl-EDTA, Benzyl-DTPA, Benzyl-DOTA, TTHA (Triethylentetraminhexaessigsäure), NOTA oder Benzyl-NOTA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid IMP-R4 ist, d.h.: MCC-Lys(MCC)-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)benzyl)DTPA)-OH, und wobei MCC der 4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexan-1-carbonyl-Teil ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das targetierende Agens ein monoklonaler Antikörper (MAk) ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit einer malignen Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit einer kardiovaskulären Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit einer Autoimmunkrankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Autoimmunkrankheit eine Klasse III-Autoimmunkrankheit ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei besagte Klasse III-Autoimmununkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend immunvermittelte Thrombozytopenie, Dermatomyositis, Sjögren-Syndrom, multiple Sklerose, Sydenham'sche Chorea, Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, Lupus nephritis, rheumatisches Fieber, polyglanduläre Symptome, bullöses Pemphigoid, Diabetis mellitus, Purpura Schoenlein-Henoch, post-streptokokkale Nephritis, Erythema nodosum, Takayasu-Syndrom, Addison'sche Krankheit, rheumatoide Arthritis, Sarkoidose, Colitis ulcerosa, multiformes Erythem, IgA-Nephropathie, Polyarteriitis nodosa, Spondylarthritis, Goodpasture-Syndrom, Thromboangiitis ubiterans, Sjogren's syndrom, primäre biliäre Leberzirrhose, Hashimoto-Syndrom, Thyreotoxikose, Sklerodermie, chronische aktive Hepatitis, Polymyositis acuta/Dermatomyositis, Polychondritis, Pamphigus vulgaris, Wegener'sche Granulomatose, membranöse Nekropathie, amyotrophische Lateralsklerose, Tabes dorsalis, Riesenzellenarteritis/Polymyalgie, perniziöse Anämie, schnell fortschreitende Glomerulonephritis und fibrosierende Alveolitis.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit der Alzheimer'schen Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit einem infektiösen Organismus verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper ein internalisierender Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper anti-CEA-MAk, MN-14; anti-EGP-1-MAk; anti-CD22-MAk; anti-CD20-MAk; anti-Dickdarm-spezifisches Antigen-p-MAk; anti-CD74-MAk; anti-MUC1-MAk; anti-AFP-MAk; Antiprostataspezifisches Membran-Antigen; oder anti-Carboanhydratase IX-Mak ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper ein muriner, chimärer, humanisierter oder menschlicher Antikörpern ist und intakt oder ein Fragment oder verschiedene konstruierte Versionen davon sein kann.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper derivatisiert oder Disulfid-reduziert ist, so dass er Thiolgruppen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das radioaktive Iod I-123, I-124, I-125 oder I-131 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Antigene, auf die der targetierende Vektor zielt, HER-2/neu, CD 19, CD20, VEGF, EGF-Rezeptor, alkalische Phosphatase, Prostatasäure-Phosphatase, Tenascin, Plazentawachstumsfaktor (P1GF), Insulin-artiger Wachstumsfaktor (ILGF) und Ganglioside umfassen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper in der Lage ist, kardiovaskuläre Läsionen, Amyloidablagerungen, infektiöse Organismen, Entzündung, Autoimmunkrankheiten, dislozierte oder ektopische normale Gewebe und flüssige oder feste Karzinome zu targetieren.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper in der Lage ist, Gerinnsel, Gefäßpropfen, atherosklerotische Plaques, Amyloidose, Bakterien, Pilze, Rickettsien, Viren, Parasiten, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, multiple Sklerose, disloziertes oder ektopisches Nebenschilddrüsengewebe, disloziertes oder ektopisches Endometriumgewebe, disloziertes oder ektopisches Milzgewebe, disloziertes oder ektopisches Thymusgewebe, Leukämien, Lymphome, Karzinome, Sarkome, Gliome oder Melanome zu targetieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das targetierendes Agens ein multivalenter Antikörper oder ein multivalenter, multispezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper mit einer malignen Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper mit einer kardiovaskulären Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper mit einer Autoimmunkrankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Autoimmunkrankheit eine Klasse III-Autoimmunkrankheit ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Klasse III-Autoimmununkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend immunvermittelte Thrombozytopenie, Dermatomyositis, Sjögren-Syndrom, multiple Sklerose, Sydenham'sche Chorea, Myasthenia gravis, systemischen Lupus erythematodes, Lupus nephritis, rheumatisches Fieber, polyglanduläre Symptome, bullöses Pemphigoid, Diabetis mellitus, Purpura Schoenlein-Henoch, post-streptokokkale Nephritis, Erythema nodosum, Takayasu-Syndrom, Addison'sche Krankheit, rheumatoide Arthritis, Sarkoidose, Colitis ulcerosa, multiformes Erythem, IgA-Nephropathie, Polyarteriitis nodosa, Spondylarthritis, Goodpasture-Syndrom, Thromboangiitis ubiterans, Sjogren's syndrom, primäre biliäre Leberzirrhose, Hashimoto-Syndrom, Thyreotoxikose, Sklerodermie, chronische aktive Hepatitis, Polymyositis acuta/Dermatomyositis, Polychondritis, Pamphigus vulgaris, Wegener'sche Granulomatose, membranöse Nekropathie, amyotrophische Lateralsklerose, Tabes dorsalis, Riesenzellenarteritis/Polymyalgie, perniziöse Anämie, schnell fortschreitende Glomerulonephritis und fibrosierende Alveolitis.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper mit der Alzheimer'schen Krankheit verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper mit einem infektiösen Organismus verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper ein internalisierender Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper derivatisiert oder Disulfid-reduziert ist, um Thiolgruppen aufzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper in der Lage ist, kardiovaskuläre Läsionen, Amyloidablagerungen, infektiöse Organismen, Entzündung, Autoimmunkrankheiten, dislozierte oder ektopische normale Gewebe und flüssige oder feste Karzinome zu targetieren.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper eine Bindestelle für CD74, CD22, epitheliales Glycoprotein-1, MUC1, carcinoembryonales Antigen, Dickdarm-spezifisches Antigen-p, alpha-Fetoprotein, Prostata-spezifisches Membran-Antigen, Carboanhydratase IX, HER-2/neu, CD19, CD20, VEGF, EGF-Rezeptor, alkalische Phosphatase, Prostatasäure-Phosphatase, Tenascin, Plazentawachstumsfaktor (P1GF), Insulin-artigen Wachstumsfaktor (ILGF) und Ganglioside umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der multivalente Antikörper oder multivalente, multispezifische Antikörper in der Lage ist, Gerinnsel, Gefäßpropfen, atherosklerotische Plaques, Amyloidosis, Bakterien, Pilze, Rickettsien, Viren, Parasiten, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, multiple Sklerose, disloziertes oder ektopisches Nebenschilddrüsengewebe, disloziertes oder ektopisches Endometriumgewebe, disloziertes oder ektopisches Milzgewebe, disloziertes oder ektopisches Thymusgewebe, Leukämien, Lymphome, Karzinome, Sarkome, Gliome oder Melanome zu targetieren.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die immunvermittelte Thrombozytopenie akute idiopathische thrombozytopenische Purpura oder chronische idiopathische thrombozytopenische Purpura ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die immunvermittelte Thrombozytopenie akute idiopathische thrombozytopenische Purpura oder chronische idiopathische thrombozytopenische Purpura ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die MN-14, RS7, LL2, 1F5, A20, Mu9, LL1, PAM-4, Immu31, J591 und G250 umfasst.