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DE3744825C2 - - Google Patents

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DE3744825C2
DE3744825C2 DE3744825A DE3744825A DE3744825C2 DE 3744825 C2 DE3744825 C2 DE 3744825C2 DE 3744825 A DE3744825 A DE 3744825A DE 3744825 A DE3744825 A DE 3744825A DE 3744825 C2 DE3744825 C2 DE 3744825C2
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DE
Germany
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env
gag
protein
plasmid
htlv
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DE3744825A
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English (en)
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Robert Mitchell Cedar Grove N.J. Us Crowl
Daru Oakland Calif. Us Young
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebenen rekombinanten Vektor und einzellige Organismen gemäß den Ansprüchen 4 bis 8 zur Herstellung eines Proteins mit der Bezeichnung gag/env, welches Teile des Strukturproteins (gag) und des Hüllproteins (env) des HTLV-III Virus einschließt, welches das verursachende Agenz von AIDS (acquired immune deficiency syndrome) ist. Dieses Protein kann durch organisch-synthetische Methoden oder durch die Anwendung rekombinanter DNA Techniken, bei denen die erforderlichen Gensequenzen mittels eines Vektors in einen verträglichen einzelligen Wirtsorganismus eingeschleust werden, hergestellt werden.
1985 wurden nahezu 8000 Menschen mit AIDS diagnostiziert und die Zahl ist seither ständig gestiegen. Man rechnet mit weiteren fünfzehntausend Fällen im Jahre 1986 und es ist nicht ausgeschlossen, daß sich die Zahl der Fälle im Jahre 1987 erneut verdoppelt [New York Times Magazine, 2. März 1986, S. 42]. AIDS wird charakterisiert durch das Auftreten schwerer opportunistischer Infektionen einhergehend mit einem Angriff auf das Immunsystem des Körpers [Gottlieb et al., New Eng. J. Med. 305, 1425 (1981)]. Die Krankheit wurde bei homosexuellen Männern, Patienten, die Bluttransfusionen erhielten, Drogensüchtigen, die die Drogen intravenös appli­ zieren, und aus Haiti und Zentralafrika stammenden Personen festgestellt [Piot et al., Lancet 11, 65 (1984)].
Man nahm an, daß das auslösende Agenz viralen Ursprungs sei, weil die epidemiologische Verbreitung von AIDS mit der einer übertragbaren Krankheit übereinstimmte. Mindestens drei Retroviren wurden von kultivierten T-Zellen verschie­ dener AIDS-Patienten oder von weißen Blutzellen krankheits­ gefähdeter Personen isoliert. Ferner wurde ein neues menschliches Retrovirus mit der Bezeichnung LAV (lymphadeno­ pathy-associated virus) als AIDS verursachendes Agenz ent­ deckt. Dieses Virus wurde von einem Lymhadenopathie-Patien­ ten isoliert, daher der Name (Mantagnier et al., in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C. Gallo et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 363-370 (1984)].
Weitere menschliche Retroviren, insbesondere zwei Unter­ gruppen des menschlichen T-Zell Leukämie/Lymphoma/Lympho­ tropischen Virus, Typ I [Poiesz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7415 (1980)] und III [Popovic et al., Science 224, 497 (1984)] wurden ebenfalls isoliert. Noch ein weiteres Virus, das ARV-Virus (AIDS-associated retrovirus) wurde als auslösendes Agenz erkannt [Levy el al., Science 225, 840 (1984)]. Sowohl das HTLV-III- als auch das ARV- Retrovirus besitzen biologische und seroepidemiologische Eigenschaften, die mit dem LAV übereinstimmen [Levy et al., supra, Popovic et al., supra]. Folglich wurden mindestens drei Retroviren als verursachende Agenzien von AIDS postu­ liert: LAV, ARV und HTLV-III. In dieser Anmeldung werden sie kollektiv als AIDS-Viren bezeichnet. Da das HTLV-III Virus als Prototyp dieser Virusgruppe gilt, bezieht sich die Bezeichnung "Determinante Gruppe, die mit den Sequenzen eines HTLV-III-Virusproteins übereinstimmt" auf die Protein­ sequenzen aller drei AIDS-Viren.
Ein Grund für die Schwierigkeiten bei der Bestimmung des tatsächlichen AIDS verursachenden Agenz war die Kreuzreak­ tion verschiedener retroviraler Antigene mit Serenproben von AIDS-Patienten. Zum Beispiel zeigten Serenproben von AIDS- Patienten Reaktionen mit Antigenen des HTLV-I [Essex et al., Science 220, 859 (1983)] und HTLV-III [Sarngadharan et al., Science 224, 506 (1984)] Virus. Hüllproteingenprodukte von HTLV-III Viren zeigten Kreuzreaktivität mit Antikörpern in Seren von erwachsenen T-Zell Leukämie-Patienten [Kiyokawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6202 (1984)]. Erwachsene T-Zell Leukämien (ATL) unterscheiden sich von AIDS darin, daß HTLV-I T-Zell Malignitäten verursacht, die durch ein unkontrolliertes Wachstum von T-Zellen charakteri­ siert sind. Bei AIDS gibt es statt eines Zellwachstums den Zelltod. Diese cytopathischen Eigenschaften von HTLV-III Viren waren entscheidend bei der endgültigen Bestimmung des spezifischen retroviralen Ursprungs dieser Krankheit.
Das verursachende Agenz von AIDS wurde unter Verwendung von immortalisierten menschlichen Neoplasmen-T-Zell-Linien (HT) isoliert, welche mit für AIDS charakteristischen cyto­ pathischen und von AIDS-Patienten isolierten Retroviren infiziert wurden. Seroepidemiologische Tests, bei denen diese Viren verwendet wurden, zeigten eine vollständige Korrelation zwischen AIDS und dem Vorhandensein von Anti­ körpern gegen virale HTLV-III Antigene [Montagnier et al., supra; Sarngadharan et al., supra; Schüpbach et al., Science 224, 503 (1984)]. Außerdem fand man heraus, daß nahezu 85% der Patienten mit Lymphadenopathie Syndrom und ein hervorstechender Anteil asymptomatischer homosexueller Männer in AIDS endemischer Umgebung zirkulierende Antikörper gegen HTLV-III in sich trugen. Zusammengefaßt sprechen diese Daten dafür, daß die HTLV-III Viren als hauptsäch­ liche AIDS verursachende Agenzien anzusehen sind.
Bis zur erfolgreichen Züchtung des AIDS-Virus unter Verwendung der H-9 Zell-Linie konnte das env-Protein des AIDS-Virus weder isoliert, noch charakterisiert oder synthetisiert werden. Dies lag haupsächlich daran, daß das Virus cytopathisch ist und seine Isolierung deshalb nicht möglich war [Popovic et al., supra]. Sobald jedoch eine menschliche T-Zell-Linie entdeckt wurde, die gegen die cyto­ pathischen Wirkungen des Virus resistent war, konnte die molekulare Klonierung der AIDS proviralen DNA durchgeführt werden.
Das Bedürfnis nach genauen und schnellen Methoden für die Diagnose von AIDS in menschlichem Blut und in anderen biologischen Körperflüssigkeiten und das Bedürfnis nach einer Methode zur Verhinderung der Krankheit durch Impfung ist sehr groß. Alle zur Zeit verfügbaren Testmethoden sind jedoch fehlerhaft. Das CDC (Center for Disease Control) hat sogar darauf hingewiesen, daß die momentan verfügbaren Testmethoden ausschließlich zur Untersuchung von Blutproben auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV-III ver­ wendet werden sollten. Das CDC ging sogar noch weiter indem es erklärte, daß die zur Zeit verfügbaren ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay) Testmethoden nicht für die generelle Untersuchung von Risikogruppen oder als Diagnose- Test für AIDS verwendet werden sollten [Federal Register 50(48), 9909, 12. März 1985].
Bei früher angewendeten AIDS-Testmethoden hat man ver­ säumt, ein spezifisches antigenes Protein des verursachenden Agenz für AIDS zu verwenden. Die zuerst verwendeten Proteine stammten von einem viralen Lysat. Da dieses Lysat aus menschlichen, mit dem Virus infizierten Zellen hergestellt wurde, enthielt es sowohl menschliche, als auch virale Proteine. Die Herstellung eines reinen Antigens aus viralem Protein ist sehr schwierig. Die bisher verwendeten Antigene brachten daher sowohl falsch positive als auch falsch negative Ergebnisse [Budiansky, Natur 312, 583 (1984)]. Die durch die Verwendung solcher Protein/Peptid-Lysate ent­ standenen Fehler könnten durch die Verwendung einer zur Bindung von AIDS-Antikörpern geeigneten Verbindung, die im wesentlichen frei von Nicht-AIDS spezifischen Proteinen ist, verhindert werden. Verbindungen aus im wesentlichen reinen AIDS Hüll- und Strukturproteinen können als Antigene ver­ wendet werden.
Sowohl das Hüll- als auch das Strukturprotein des HTLV-III Virus besitzen determinante Gruppen, die die Unter­ suchung und Diagnose auf AIDS-Viren und/oder den Schutz durch Impfung gegen AIDS-Viren ermöglichen würden. Und Personen, die mit HTLV-III Viren in Berührung gekommen sind, und die demzufolge AIDS-gefährdet sind oder die die Krank­ heit haben, können durch die Existenz von Antikörpern gegen das virale Strukturprotein (gag) und/oder das Hüllprotein (env) identifiziert werden [Sarngadharan et al., Science 224, 506 (1984)].
Die Verfügbarkeit einer wirksamen Testmethode zur Bestimmung des AIDS-Virus oder von Partikeln davon im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ist ebenfalls wichtig. Groopman et al., [Blood 66, 742 (1985)] haben berichtet, daß Antikörper gegen AIDS-Viren nicht immer im Blut von AIDS- Kranken vorhanden sind. Groopman et al. haben einen Patien­ ten mit AIDS und einem weiteren mit AIDS-ähnlicher Krankheit (ARC) untersucht, deren Blutproben Antikörper-negativ waren, von denen aber HTLV-III Viren gezüchtet werden konnten.
Vor kurzem wurde die rekombinante DNA-Technologie auf das AIDS-Problem angewendet. Die Klonierung und Expression des HTLV-III env-Gens wurde von Crowl et al. [Cell 41, 979 (1985)] und von Chang et al. [Biotechnology 3, 905 (1985)] beschrieben. Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] haben das HTLV-III Strukturprotein in E. coli. exprimiert.
Durch Anwendung solcher Verfahrenstechniken der Gentech­ nologie erhielt man gereinigte, virale Antigene, die sicher und zuverlässig sind und deren Herstellung weniger kost­ spielig ist. Noch besser wäre jedoch die Verfügbarkeit eines viralen Proteins mit determinanten Gruppen des HTLV-III env-Proteins und des HTLV-III gag-Proteins. Ein solches Protein wäre ein außergewöhnlich wirksames Mittel für den Nachweis von AIDS-Antikörpern und könnte als Grundlage für eine Reihe von genauen diagnostischen Tests und für mögliche Impfungen gegen den AIDS-Virus dienen.
Deshalb wurde ein neues Protein mit der Bezeichnung gag/env, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des HTLV-III gag- Proteins und des HTLV-III env-Proteins übereinstimmt, durch die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt. Dieses Protein gestattet den Nachweis von AIDS-Antikörpern oder AIDS-Viren in menschlichen Seren oder anderen biologischen Körperflüssigkeiten und kann als Impfstoff Menschen vor AIDS schützen. Das neue gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung ist durch die in Fig. 2 gezeigte Aminosäurese­ quenz oder funktionelle Teile davon charakterisiert.
Die Erfindung liefert rekombinante Vektoren, die DNA- Sequenzen, die das gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung kodieren, enthalten und einzellige Organismen zur Herstellung des gag/env-Proteins der vorliegenden Erfindung. Es werden auch Methoden zur Expression, Isolierung und Reinigung des gag/env-Pro­ teins der vorliegen­ den Erfindung beschrieben. Das so hergestellte gag/env- Protein kann für eine Anzahl wichtiger immunologischer Prozesse verwendet werden.
Das gag/env-Protein kann als diagnostisches Reagens zum Nachweis von Antikörpern gegen AIDS-Viren in menschlichen Seren verwendet werden.
Als Immunogen verwendet kann das gag/env-Protein zur Produktion von Antikörpern, die gegen die in diesem Protein enthaltenen antigenen Determinanten gerichtet sind, in Tieren verwendet werden.
Es gibt wichtige Vorteile bei der Verwendung des gag/env-Proteins im Vergleich zur Verwendung von separaten gag- und env-Proteinen. Das env- Protein selbst ist ausgesprochen unlöslich, was die Reinigung erschwert. Die Kombination der beiden Proteine ergibt jedoch ein Produkt, das besser löslich ist und dessen Reinigung einfacher ist. Massenproduktion und Reinigung sind ebenfalls einfacher, wenn nur ein einziges Molekül isoliert werden muß. Schließlich ermöglicht das gag/env-Protein die Entwicklung eines diagnostischen Tests der spezifischer ist als solche mit separaten gag- und env-Proteinen.
Die folgende detaillierte Beschreibung und die folgenden Figuren tragen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung bei:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung von Expres­ sions-Plasmiden, die die Synthese von gag (obere Abbildung) und gag/env (untere Abbildung) Proteinen bewirken. Die Restriktionsschnittstellen, welche das gag- und env-Gen begrenzen sind gezeigt und die schraffierte Region kenn­ zeichnet das env-Segment des gag/env-Fusionsgens. Bei beiden Plasmiden ist die Transkription unter der Kontrolle des λPL Promoters. Die Translationssignale kommen vom Plasmid pEV-vrf2.
Fig. 2 offenbart die Nukleotidsequenz des gag/env Fusionsgens (mit ausgewählten Positionsnummern und Restrik­ tionsschnittstellen) und die davon abgeleitete Aminosäure­ sequenz des gag/env-Proteins.
Fig. 3 zeigt die Analyse des in E. coli exprimierten gag/env-Proteins mittels Elektrophorese. Die Spur 1 zeigt die Coomassie-blau gefärbten Gesamtproteine von Zellen enthaltend das rekombinante Plasmid, welches das gag/env- Fusionsgen codiert und von Kontrollzellen. Die Spuren 2 und 3 zeigen die Western-Blot-Analyse der gleichen Gesamtpro­ teine, die entweder mit Kaninchen-Antikörpern gegen das env-Peptid 500-511 (Spur 2) oder mit Schafs-Antikörpern gegen das gag-Peptid p24 (Spur 3) abgetastet wurden. Die Immunkomplexe in den Spuren 2 und 3 wurden durch einen zweiten Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt war, sichtbar gemacht. Bei allen drei Spuren bezieht sich "g/e" auf das gag/env-Protein und "c" auf eine negative Kontrollprobe, die zum Aufzeigen der Spezifität verwendet wurde. Die Beweglichkeiten der Molekulargewichtsstandards (in kD) sind gezeigt, und die Positionen des gag/env- Proteins sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung enthalten eine Anzahl von Verfahrensschritten, die in logischer Folge die folgenden Maßnahmen umfassen: (1) Identifizierung und­ Isolierung der Gene, die das gag- und env-Protein oder Frag­ mente davon kodieren, (2) Einschleusen dieser Gene oder Genfragmente in einen passenden Vektor zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, der ein gag/env-Fusionsgen enthält, (3) Transfer des rekombinanten Vektors in einen verträg­ lichen einzelligen Wirtsorganismus, (4) Selektion und Kulti­ vierung von transformierten Wirtszellen, die die einge­ schleusten Gensequenzen replizieren und exprimieren können, (5) Identifizierung und Reinigung des Genprodukts.
Isolierte HTLV-III-Viren können sowohl als Quelle für das gag-Gen, als auch für das env-Gen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel haben Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] ein 2.2 Kilobasenpaare-enthaltendes Fragment der 5′-Region des viralen Genoms als Quelle für das gag-Gen verwendet. Andererseits kann auch genomische DNA von Zellen, in welche das provirale HTLV-III Genom integriert wurde, als Genquelle dienen [Shaw et al., Science 226, 1165 (1984)]. Crowl et al. [Cell 41, 979 (1985)] haben solche genomischen DNA von mit HTLV-III infizierten H9-Zellen verwendet um das env-Gen zu erhalten.
Alternativen zur Isolierung der gag- und env-Gene beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf die chemische Synthese der entsprechenden Gensequenzen und die Herstellung von DNA, die zu den von den entsprechenden Genen hergestell­ ten Boten-RNAs komplementär ist.
Ungeachtet ihrer Herkunft, können gag- und env-Proteine kodierende DNA-Sequenzen in Bakterien kloniert werden, und Klone, die gag- und env-Gensequenzen enthalten, können mittels bekannter Methoden identifiziert werden. Zum Bei­ spiel können zu diesen Gensequenzen komplementäre DNA(cDNA)- Proben vorbereitet werden und diese dann mittels Hybridi­ sierungstechniken zur Erkennung von Klonen, die die gag- und env-Gene enthalten, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde mittels eines λ Vektors und XbaI vedauter DNA einer HTLV-III infizierten H9-Zelllinie (siehe oben) eine Genbank hergestellt. Klone enthaltend das provirale HTLV-III Genom wurden dann durch Hybridisierung mit HTLV-III cDNA aus dieser Genbank isoliert. Aus einem dieser Klone, λHXB-3 genannt, wurde dann ein 1700 Basenpaare-enthal­ tendes ClaI/HindII Fragment isoliert, welches die Nukleotide für die meisten der Aminosäuren des gag-Vorläuferproteins kodiert.
Die direkte Quelle für die in der bevorzugten Aus­ führungsform der vorliegenden Erfindung verwendeten env- Gensequenzen, war ein Derivat des Plasmids pEV3/env 44-640 mit deletierten env-Aminosäureresten 514-524. Diese Deletion führt überraschenderweise zu einem deutlichen Anstieg der Expression des env-Gens. Die env-Gensequenzen, die die Codons 467 bis 640 enthalten, wurden durch BglII/HindIII- Spaltung des Plasmids pEV3/env 44-640 erhalten.
Nach der Identifizierung und Isolierung der HTLV-III gag- und env-Gene werden diese in einen geeigneten Vektor eingebaut, der die für die Transkription und Translation dieser eingeschleusten Gensequenzen notwendigen Elemente enthält. Geeignete Vektoren können aus Segmenten von chromo­ somalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen zusammengesetzt sein, wie z. B. verschiedene bekannte Plasmide und Phagen DNAs. Auch Kombinationen von Plasmiden mit Phagen DNAs sind geeignet, wie z. B. Plasmide, die mit Expressionskontrollsequenzen von Phagen ausgestattet wurden. Besonders geeignete Vektoren sind pEV-vrf Plasmide (pEV-vrfl, -2 und -3), SV40, Adenovirus, Hefe-Plasmide, gt-WES-Lambda B, Charon 4A und 28, Lambda-gt-l-lambda B, von M13-abstammende Vektoren, wie z. B. pUC8, 9, 18 und 19, pBR313, pBR322, pBR325, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, ColE1, pSC101, pm121, RSF2124, pCR1 oder RP4.
Der Einbau der gag- und env-Gene in einen Vektor ist einfach durchzuführen sofern beide Gene und der gewünschte Vektor mit dem(n) gleichen Restriktionsenzym(en) geschnitten werden können, da komplementäre DNA-Enden geschaffen werden. Ist dies nicht möglich, müssen die geschnittenen Enden entweder durch Abbau der überlappenden Einzelstränge oder durch Auffüllen der überlappenden Einzelstränge in stumpfe Enden überführt werden und danach mit einem Enzym, wie z. B. T4 DNA Ligase, verbunden werden. Andererseits kann jede gewünschte Schnittstelle durch Verknüpfen der DNA-Enden mit Verbindungssequenzen (Linkern) hergestellt werden. Solche Linker können spezielle Oligonukleotid-Sequenzen enthalten, die für Restriktionsschnittestellen kodieren. Der geschnit­ tene Vektor und die gag- und env-Gene oder Genfragmente davon können aber auch mittels homopolymerer Enden, wie von Morrow in Methods in Enzymology 68, 3 (1979) beschrieben, modifiziert werden.
Nach erfolgtem Einbau eines der beiden Gene (env oder gag) oder Genfragmenten davon in einen geeigneten Vektor, kann das andere Gen oder Genfragment mittels wohlüberlegter Spaltung mit einem Restriktionsenzym in die unmittelbare Nachbarschaft des ersten Gens oder Genfragments gebracht werden, wodurch ein Fusionsgen entsteht. Bei chemischer Synthese der env- und gag-Gene kann das Fusionsgen selbst­ verständlich auch direkt hergestellt und als Ganzes in den Vektor eingebaut werden.
In der bevozugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde das ClaI/HincII Fragment, welches das gag-Gen des rekombinanten Phagen λHXB-3 (oben beschrieben) enthält, mit ClaI und PvuII gespaltener DNA des E. coli Expressionsplasmids pEV-vrf2, verbunden, um das Expressions­ plasmid pEV2/gag 15-512 (Fig. 1, oberer Teil), welches ein 56 kD Protein enthaltend die Aminosäurereste 15-512 des gag-Proteins kodiert, zu isolieren. Die gag-Sequenzen distal (stromabwärts in 3′ Richtung) zur in der Nähe von Amino­ säurerest 437 liegenden BglII Restriktionsschnittstelle wurden dann durch eine env-Sequenz in einem BglII/HindIII Fragment eines Derivates des Plasmids pEV3/env 44-640 (mit deletierten Aminosäureresten 514-254) ersetzt um das Plasmid pEV2/gag15-436/env 467-640 Δ 514-524, welches das gag/env- Fusionsgen der vorliegenden Erfindung enthält, zu isolieren (Fig. 1, unterer Teil).
Die Konstruktion des Plasmids pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 wird im Detail in den Abschnitten B bis E des nachstehenden Beispiels beschrieben. Die Nukleotid­ sequenz des erfindungsgemäßen gag/env-Gens wurde nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert [Methode in Enzymol. 65, 499 (1980)] bestimmt. Die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 2 gezeigt.
Viele der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendbaren Vektoren enthalten einen oder mehrere Selek­ tionsmarker, die zur Selektion der gwünschten Transforman­ ten verwendet werden können. Als Selektionsmarker kommen beispielsweise die vom Plasmid pBR322 kodierte Tetrazyklin- und Ampicillinresistenz, die von Plasmid pUC8 kodierte Ampicillinresistenz und β-Galaktosidase-Aktivität oder die von Plasmid pEV-vrf2 kodierte Ampicillinresistenz in Frage. Durch solche Selektionsmarker wird die Selektion von trans­ formierten Wirtszellen vor allem dann sehr erleichtert, wenn diesen die von den Vektoren beigesteuerten Aktivitäten fehlen.
Die in Vektoren einegebauten Nukleotidsequenzen der gag- und env-Genfragmente können Nukleotide enthalten, die nicht Teil der tatsächlichen gag- und env-Gene sind. Andererseits können die Genfragmente nur einen Teil der vollständigen Gene enthalten. Es ist nur erforderlich, daß die in einen Vektor eingebauten Genfragmente die Synthese eines Poly­ peptids oder Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des gag-Proteins und des env-Proteins übereinstimmt, bewirken.
Die Auswahl eines geeigneten Wirtsorganismus wird von verschiedenen dem Fachmann bekannten Faktoren bestimmt. So spielen beispielsweise Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, Toxizität der Expressionsprodukte, Expressions­ charakteristika, notwendige biologische Sicherheitsvor­ kehrungen und Kosten eine Rolle und es muß ein Mittelweg zwischen allen diesen Faktoren gefunden werden. Schließlich muß man auch wissen, daß nicht alle Wirtszellen bei der Expression individueller rekombinanter DNA-Moleküle gleich effizient sind.
Als geeignete einzellige Wirtsorganismen kommen Pflanzenzellen, Säugerzellen, Hefezellen, Bakterienzellen, z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilis, und Actinomyceten in Frage. Ein beson­ ders bevorzugter Wirtsorganismus der vorliegenden Erfindung ist Escherichia coli Stamm MC 1061 [Casadaban es al., J. Mol. Biol. 138, 179 (1980)]. Außer diesem Stamm können aber auch andere E. coli K-12 Stämme, die das Plasmid pRK248cIts enthalten, verwendet werden. Zur Verwendung in anderen E. coli K-12 Stämmen kann dieses Plasmid von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen werden. Es wurde dort unter der ATCC Nr. 33766 hinterlegt und ist allgemein zugänglich. Der E. coli Stamm wurde ebenfalls bei ATCC (ATCC Nr. 53338) hinterlegt und ist ebenfalls allgemein zugänglich.
Der Transfer von rekombinanten Vektoren in einzellige Wirtszellen kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. In Abhängigkeit des gewählten Vektor/Wirtszell- Systems kann der Transfer mittels Transformation, Transduk­ tion oder Transfektion durchgeführt werden. Nach erfolgtem Transfer können die resultierenden modifizierten Wirtszellen kultiviert und die Expressionsprodukte aus der Kulturbrühe isoliert werden.
Nach der Expression in E. coli ist das gag/env-Protein hauptsächlich in cytoplasmati­ schen Einschlußkörpern (unlösliche Proteinaggregate) zu finden, was die Reinigung dieses Proteins erheblich erleich­ tert. Zur Isolierung des gag/env-Proteins werden die Bakterienzellen vorzugsweise mechanisch zerstört oder lysiert und die unlöslichen Proteine werden danach mittels Zentrifugation präzipitiert. Eine weitere wesentliche Reinigung kann dann mittels sequentieller Waschungen des Präzipitats mit steigenden Harnstoffkonzentrationen gefolgt von Standardproteinreinigungsmethoden erreicht werden.
Zur Gewinnung von gag/env-Probenmaterial für analytische Zwecke, z. B. für Polyacrylamidgelelektrophoresen, können die Zellen mittels einer Detergenz, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgeschlossen werden. Zur Gewinnung von großen Mengen an gag/env-Protein werden die Zellen vorzugsweise mittels Ultraschall, oder mit mechanischen Mitteln, z. B. der French-Druckzelle, aufgeschlossen.
Der Zellaufschluß kann aber auch mit chemischen oder enzymatischen Mitteln erfolgen. Da zweiwertige Kationen oft die Zellmembranintegrität stabilisieren, führt die Behand­ lung der Zellen mit geeigneten Chelatbildnern, z. B. EDTA oder EGTA, zu einer Zerstörung der Membran und als Folge davon zu einem Herauslaufen der Proteine aus dem Zellinnern. Zu dem gleichen Ergebnis führt auch die Behandlung der Zellen mit dem Enzym Lysozym, welches die Peptidoglykan­ struktur der Zellwand hydrolysiert. Eine weitere Aufschluß­ methode, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist die Gefriertaumethode bei der die Zellen mittels abwechselndem Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen werden. Diese letzt­ genannte Methode kann auch mit der Lysozymmethode kombiniert werden.
Nachdem das gag/env-Protein aus den Zellen herausgelöst ist, kann es in der Mischung mittels bekannten Methoden identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Radioimmuno­ assay oder Enzymimmunoassay unter Verwendung von Antikörpern gegen dieses Protein durchgeführt werden. Vorzugsweise jedoch wird das agg/env-Protein mittels SDS-Polyacrylamid­ gelelektrophorese und Western-Blot-Analyse identifiziert.
Das gag/env-Protein kann mittels Fällung, z. B. Natrium- oder Ammoniumsulfatfällung, mittels Ultrazentrifugation oder mittels jeder dem Fachmann bekannten Methode konzentriert werden. Für die weitere Reinigung kommen konventionelle Proteinreinigungsverfahren, z. B. Gelfiltration, Ionenaus­ tauscher-Chromatographie, präparative Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln bei niedrigen Temperaturen oder Gegenstrom­ verteilung in Frage.
Da das gag/env-Protein determinante Gruppen zweier Hauptkomponenten des HTLV-III Virus aufweist und da dieses Virus das AIDS auslösende Agenz ist und auch immunologisch mit weiteren viralen Agenzien, die mit AIDS oder ARC in Verbindung gebracht wurden, verwand ist, stellt dieses Protein ein wirksames diagnostisches Werkzeug zum Nachweis von Antikörpern gegen AIDS-Viren in menschlichen Seren dar. Das gag/env-Protein kann zu diesem Zweck in zahlreichen, bekannten Nachweisverfahren verwendet werden.
Beispiel
Das folgende Beispiel illustriert die Erfindung ohne sie zu beschränken. Es illustriert die Methode zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, der ein gag/env-Fusionsprotein exprimiert, welches Teile des Strukturproteins (gag) und des Hüllproteins (env) des HTLV-III Virus einschließt. Dieser Vektor wurde erfindungsgemäß durch die folgenden Maßnahmen erhalten:
  • (1) Die DNA-Sequenz, welche die Nukleotide für die Amino­ säuren 15-512 des gag-Proteins enthält (alle bis auf die ersten 14 Aminosäurereste), wurde aus dem rekombinanten g Phagen HXB-3 isoliert und danach mit der DNA des E.coli Expressionisplasmids pEV-vrf 2 verbunden. Das Plasmid das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV2/gag 15-512 bezeichnet.
  • (2) Die DNA-Sequenz, welche die Nukleotide für die Amino­ säuren 319-331 des env-Proteins enthält, wurde mittels gezielter Mutagenese innerhalb der env-Protein kodieren­ den DNA-Sequenz des Expressionsplasmids pEV3/env 44-640 deletiert. Das Plasmid, das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV/env 44-640 Δ 319-331 bezeichnet.
  • (3) Mittels gezielter Mutagenese wurden die Nukleotide für die Aminosäuren 514-524 des env-Proteins innerhalb der env-Protein kodierenden DNA-Sequenz des Plasmids pEV/env 44-640 Δ 319-331 deletiert. Das Plasmid, das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 bezeichnet.
  • (4) Ein DNA-Fragment aus Plasmid pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524, das die Aminosäurereste 467-640 Δ 514-524 des env-Gens kodiert, wurde mit gespaltenem Plasmid pEV2/gag 15-512 verbunden wodurch das Plasmid pEV2/gag 15-436/env 467-460 Δ 514-524 entstand, welches die Synthese eines gag/env-Fusionsproteins mit den Aminosäureresten 15-436 des gag-Proteins und den Amino­ säureresten 467-640 Δ 514-524 des env-Proteins bewirkt.
Alle die zuvor beschriebenen Plasmide wurden durch Transformation in den E.coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts vermehrt.
Allgemeine Methoden zur Herstellung von rekombinanten Vektoren Isolierung von DNA
Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979), wurde zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus 1 ml Übernachtkulturen verwendet. Diese Methode erlaubt die Gewinnung von geringen Mengen Plasmid-DNA aus Bakterien­ kolonien für analytische Zwecke. Größere Mengen Plasmid-DNA wurde aus 1-Liter Kulturen durch Cäsiumchloridzentrifuga­ tion nach einer Standardmethode gewonnen.
Enzymatische Reaktionsbedingungen
Die verwendeten Restriktionsenzyme sowie die verwendete T4 DNA-Ligase wurden von New England Biolabs, Beverly, MA, bezogen. Diese Enzyme wurden unter den vom Hersteller be­ schriebenen Reaktionsbedingungen eingesetzt.
Eine Restriktionsenzymeinheit ist definiert als Enzym­ menge, die zur vollständigen Spaltung von 1,0 µg DNA in 60 Minuten bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 0,05 ml benötigt wird. Die Verdauungsgemische enthielten, neben der zu spaltenden DNA, 100 µg/ml Rinderserumalbumin und die folgenden Pufferlösungen:
BglII: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl₂ und 10 mM 2-Mercaptoäthanol (2-ME),
ClaI: 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.9) und 6 mM MgCl₂,
HincII: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol (DTT),
HindIII: 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) und 10 mM MgCl₂,
HpaI: 6 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT,
PstI: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) und 10 mM MgCl₂,
PvuII: 60 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl₂ und 6 mM 2-ME,
StuI: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂ und 6 mM 2-ME.
Die T4 DNA-Ligase Behandlungen wurden bei 16°C in Ligase-Puffer enthaltend die zu ligierende DNA und 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1.0 mM ATP und 50 µg/ml Rinderserumalbumin, durchgeführt. Eine Ligase­ einheit ist definiert als Ligasemenge, die für die 50%ige Verknüpfung von Lambda HindIII DNA Fragmenten in 30 Minuten bei 16°C, in 10 µl Inkubationsmischung und einer 5′DNA- Enden Konzentration von 0,12 µM (300 µg/ml) benötigt wird.
Reinigung von DNA-Fragmenten mittels Agarosegelelektro­ phorese
Nach der Verdauung mit den jeweiligen Restriktions­ enzymen, wurden die DNA-Fragmente, welche für die Klonierung verwendet wurden, mittels 1%iger Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) angefärbt, die DNA-Fragmente unter UV-Licht ausgemacht und die gewünschten Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Die Gelfragmente wurden mit Hilfe einer Injektionsnadel zerkleinert und das resultierende Homogenisat in 4 ml 10 mM Tris-HCl (ph 7.4), 1 mM EDTA und 300 mM NaCl resuspendiert. Diese Lösung wurde dann 3 Stunden bei -80°C aufbewahrt, anschließend während 30 Minuten bei 37°C aufgetaut und während 30 Minuten bei 37°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen 0,45 µ Membran­ filter filtriert, auf ein Volumen von 0,25 ml mit sec-Butanol konzentriert und 3× mit Aethanol enthaltend 10 µg/ml E.coli tRNA (Transfer RNA) als Carrier, präzipi­ tiert.
Kulturmedien
Das M9CA-Medium enthält pro Liter: 100 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 0,5 g NaCl, 1 g NH₄Cl, 1 mM MgSO₄, 0,5% Glukose und 0,5% Casaminosäuren. Der pH-Wert wird auf pH 7.4 eingestellt.
Luria-Brühe (LB) enthält pro Liter: 5 g Bacto-Yeast Extract, 10 g Bacto-Trypton und 10 g NaCl. Der pH-Wert wird auf pH 7.5 eingestellt.
Falls erforderlich, werden 15 µg/ml Tetracyclin und 50 µg/ml Ampicillin zugegeben.
Transformation und Isolierung von transformierten Bakterienzellen
Die Transformation des E.coli Stammes MC 1061 (pRK248cIts) wurde unter modifizierten Bedingungen, wie von Kushner [in Genetic Engineering, eds. Boyer et al., Elsevier/North-Holland, Amsterdam, S. 17 (1978)] beschrie­ ben, wie folgt durchgeführt:
200 ml Bakterienkulturen wurden in LB bei 30°C bis zu einem A₆₀₀-Wert zwischen 0,5 und 1,0 aufgezogen, dann wurden die Zellen sedimentiert (6000 U/min) und in 50 ml 10 mM Morpholinopropan-Sulfonsäure (MOPS), pH 7.0, und 10 mM RbCL resuspendiert. Die Zellen wurden erneut sedimentiert und anschließend in 30 ml 10 mM MOPS (pH 6.5), 50 mM CaCl₂ und 10 mM RbCL resuspendiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 0°C wurden die Zellen sedimentiert, in 6 ml 10 mM MOPS (pH 6.5) und 50 mM CaCl₂, 10 mM RbCL, 15% Glycerin resuspendiert, auf 40 Eppendorf-Gefäße verteilt (300 µl/Gefäß) und bei -80°C eingefroren.
Die Transformation wurde, wie im folgenden beschrieben, durchgeführt:
100 µl der eingefrorenen Zellen wurden aufgetaut und dann in Gegenwart von 10 µl Ligationsmischung enthaltend 100 µg DNA während 30 Minuten bei 0°C, 2 Minuten bei 37°C und 2 Minuten bei 0°C inkubiert. Durch Zugabe von 0,1 bis 0,5 ml LB wurden die Zellen anschließend während 60 Minuten bei 22°C inkubiert. Je 20 µl Zellsuspension wurden dann auf LB-Platten gebracht, die 50 µl/ml Ampicillin ent­ hielten, und während 20 Stunden bei 30°C inkubiert.
Zellwachstum und Induktion der Genexpression
E.coli MC 1061 Kulturen enthaltend das Plasmid pRK248cIts und ein gewünschtes Expressionsplasmid wurden in M9CA-Medium bei 30°C bis zur Mitte der exponentiellen Phase wachsen gelassen und dann zur Inaktivierung des λ PL Repressors während 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Jeweils 1 ml-Proben wurden zentrifugiert und die Zellkuchen zur Vorbereitung der nachfolgenden Analysen in Tris-Glycin-Puffer (pH 7.4) und 10% Glycerin resuspendiert.
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Ana­ lyse
Die in Tris-Glycin-Puffer resuspendierten Zellen wurden mit dem gleichen Volumen 2×Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] vermischt, während 5 Minuten bei 95°C inku­ biert und mittels 12.5% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, wie von Laemmli (siehe oben) beschrieben, aufgetrennt. Danach wurden die Proteine während 6 Stunden in Gegenwart von 12.5 mM Tris-HCL (pH 7.4), 96 mM Glycin, 20% Methanol und 0,01% SDS mittels Elektrophorese bei 95 V aus dem Gel auf 0,1 µ Nitrocellulosefilter transferiert. Die Western-Blot-Analyse wurde dann wie von Towbin et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350 (1979)] beschrieben, durchgeführt.
Gezielte Mutagenese
Die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagenesis") wurde nach der von Morinaga et al., [Biotechnology 2, 636 (1984)] beschriebenen Methode durchgeführt. Die bei der Mutagenese verwendeten synthetischen Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines automatischen Syntheseapparates nach der Phosphit-Methode [Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981); Matteuci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] hergestellt und wie von Maxam et al. [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] beschrieben, mittels Polyacryl­ amidelektrophorese gereinigt.
Koloniehybridisierungsmethode
Die Koloniehybridisierungen wurden wir von Grundstein et al., [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 72, 3961 (1975)] be­ schrieben durchgeführt, unter Verwendung von nach der Methode von Maniatis et al. [Cell 15, 687 (1978)] herge­ stellten 5′-³²P-markierten synthetischen Oligonukleotiden als Sonde.
B. Konstruktion des Plasmids pEV2/GAG 15-512
Wie vorstehend kurz beschrieben, wurde für die Konstruk­ tion des endgültigen Plasmids, welches das gag/env-Fusions­ protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, zuerst das Plasmid pEV2/gag 15-512 konstruiert, welches die Nukleotide für die Aminosäuren 15-512 des gag-Gens enthält. Zur Herstellung des Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden zuerst 50 µg DNA des rekombinanten λ Phagen HXB-3 isoliert, welcher das provirale HTLV-III Genom enthält. Die isolierte λ HXB-3 DNA wurde dann mit je 50 Einheiten der Restrik tionsenzyme ClaI und HincII während 120 Minuten bei 37°C behandelt und ein gewünschtes 1700 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in 0,1× TE Puffer [1 mM Tris-HCl (pH 7.4) und 0.1 mM EDTA] zu einer Endkonzentration von 0,03 pMol/µl resuspendiert.
2µg des E.coli Expressionsplasmids pEV-vrf2 wurden mit je 5 Einheiten der Restriktionsenzyme ClaI und PvuII während 1 Stunde bei 37°C behandelt und das 1700 Basenpaare- enthaltende Fragment das den λ PL Promoter enthält, wurde mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese isoliert und nach Äthanolpräzipatation zu einer Endkonzentration von 0,03 pMol/µl resuspendiert.
Das verwendete Plasmid pEV-vrf2 ist ein Derivat des frei zugänglichen Plasmids pBR322 [ATCC Nr. 31344]. Die Her­ stellung des Plasmids pEV-vrf2 wurde von Crowl et al. [Gene 38, 31 (1985)] detailliert beschrieben. Der verwendete re­ kombinante λ Phage HXB-3 wurde von Shaw et al. [Science 226, 1165 (1984)] beschrieben. Dieser Phage wurde mit Hilfe rekombinierter DNA-Techniken unter Verwendung einer HTLV-III infizierten H-9 Zelllinie, wie bereits oben beschrieben, erhalten. Eine für die vorliegende Arbeit geeignete HTLV-III infizierte Zelllinie, ist die Zelllinie H9/HTLV-III B. Diese Zelllinie ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. CRL 8543 deponiert worden. Außer der genannten H9/HTLV-III B Zelllinie kann jedoch jede beliebige HTLV-III infizierte Zelllinie als Quelle für das HTLV-III Genom ver­ wendet werden, da die Kenntnis der DNA Sequenz des HTLV-III Genoms [Shaw et al., wie oben] die Synthese von Hybridisie­ rungssonden erlaubt, die zur schnellen Identifizierung von HTLV-III Genomen geeignet sind.
300 pMole des aus λ HXB-3 erhaltenen gag/ClaI-HincII Fragments wurden mit 0,03 pMolen des aus pEV-vrf2 erhaltenem ClaI-PvuII Fragments vereint und unter Verwendung von 200 Einheiten T4 DNA Ligase während 18 Stunden bei 15°C in einem Gesamtvolumen von 10 µl miteinander verbunden. Die DNA des Reaktionsgemisches wurde dann zur Transformation von E.coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten gebracht, die Ampicillin enthielten, und während 18 Stunden bei 30°C inkubiert. Es wurden verschiedene Plasmid-DNAs isoliert und mit BglII, PstI oder HindIII wurde das Vorhandensein der erwarteten Fragmentgröße bestätigt. Ein Plasmid, pEV/gag 15-512 bezeichnet, wurde auf seine Fähigkeit gag-Vorläuferprotein zu exprimieren, wie im folgenden beschrieben, getestet. Mit dem Plasmid pEV/gag 15-512 transformierte Zellen wurden aufgezogen und zur Expression des gag-Vorläuferproteins bei 42°C induziert. Die Expressionsprodukte wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse, wie oben beschrieben, analysiert.
Es wurde festgestellt, daß die mit dem Plasmid pEV/gag 15-512 transformierten und induzierten Zellen Proteine liefern, welche auf dem Gel als zwei Hauptbanden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 56 und 53 Kd wandern. Die Größe des vollständigen gag 15-512 Proteins ist ungefähr 56 Kd. Jede der Hauptbanden reagierte mit anti-gag-Protein Antikörpern. Ferner wurden auch geringe Mengen an Proteinen mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die ebenfalls mit den oben genannten Antikörpern reagierten.
C. Konstruktion des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ 319-331
Die in das endgültige Plasmid der vorliegenden Erfindung integrierte env-Gensequenz wurde in zwei Schritten, wie in diesem Abschnitt und im folgenden Abschnitt D beschrieben, mittels gezielter Multagenese hergestellt:
Das Expressionsplasmid pEV3/env 44-640 [Crowl et al., Cell 41, 979 (1985]) bewirkt die Synthese eines 68 Kd HTLV-III env-Proteins. Die DNA-Seqeunz dieses Plasmids, die für die Amonosäuren 319-331 des env-Proteins kodiert, wurde unter Verwendung eines 18-mer synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz 5′-GCA TTT GTT AAC AGT-3′ mittels der oben beschriebenen gezielten Mutagenese deletiert. Dieses Oligonukleotid wurde so ausgewählt, daß es die Nukleotide, welche die Aminosäurereste 318 und 332 des env-Proteins kodieren, unmittelbar benachbarte. Auf diese Weise wurden 39-Basenpaare der env-Sequenz deletiert und eine neue, nur einmal vorkommende HpaI Restriktionsschnittstelle geschaf­ fen. Die StuI und HindIII Schnittstellen des Plasmids pEV3/env 44-640 wurden zur Öffnung der Schlaufe des Hetero­ duplex verwendet.
Plasmid DNAs, die mit dem ³²P-markierten synthetischen Oligonukleotid im Koloniehybridisierungstest (siehe oben) hybridisierten, wurden zur Transformation von E.coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Es wurden verschiedene Plasmid DNAs isoliert und das Vorhandensein der neuen, nur einmal vorkommenden HpaI Restriktionsschnitt­ stelle getestet. Ein Plasmid mit den gewünschten Eigen­ schaften wurde pEV3/env 44-640 Δ 319-331 genannt.
D. Konstruktion des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524
Eine zweite Deletion innerhalb der env-Protein kodieren­ den DNA-Sequenz des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ 319-331 wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz 5′-AGA GCA GTG GCA GCA GGA-3′ mittels gezielter Mutagenese, wie oben beschrieben, geschaffen. Dieses Oligonukleotid brachte die Nukleotide, welche die Aminosäurereste 513 und 525 des env-Proteins kodieren, in unmittelbare Nachbarschaft, wodurch die Deletion der Nukleotide, welche die Aminosäurereste 514-524 des env-Proteins kodieren, unter Verwendung der Restriktions­ schnittstellen HpaI und HindIII ermöglicht wurde.
Plasmid DNAs, die mit dem ³²P-markierten synthetischen Oligonukleotid hybridisierten, wurden zur Transformation von E.coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts ver­ wendet. Es wurden verschiedene Plasmid DNAs isoliert und das Vorhandensein der 33-Basenpaare-Deletion mittels Restrik­ tionsenzymanalyse mit HpaI und HindIII getestet. Zusätzlich wurde die 33-Basenpaare-Deletion durch Sequenzierung nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert [Methods Enzymol. 65, 499 (1980)] bestätigt. Ein Plasmid mit der gewünschten Deletion wurde pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 genannt.
Wie vorstehend bereits bemerkt, führte die Δ 514-524 Deletion zu einer signifikanten Erhöhung der env-Protein Expression.
E. Konstruktion des Plasmids pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524
2 µg DNA des E.coli Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden gleichzeitig mit 5 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI und 4 Einheiten des Restriktionsenzyms BglII behandelt und ein gewünschtes ungefähr 1300 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Amisosäurereste 15-436 des gag-Proteins kodiert, wurde mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese, wie oben beschrieben isoliert. Weitere 2 µg DNA des E.coli Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden gleichzeitig mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI und 5 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI behandelt und ein gewünschtes 1 Kb-enthaltendes Fragment, das den λ PL Promoter enthielt, wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert, 0,3 µg DNA des E.coli Plasmids pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 wurden gleichzeitig mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI und 4 Einheiten des Restriktions­ enzyms BglII behandelt und ein gewünschtes ungefähr 4 Kb-enthaltendes Fragment, das die Aminosäurereste 467-640 Δ 514-524 des env-Proteins kodiert, wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert.
Je 300 pMole der drei obigen DNA-Fragmente wurden vereint und unter Verwendung von 200 Einheiten T4 DNA-Ligase während 18 Stunden bei 15°C miteinander verbunden. Die DNA des Reaktionsgemisches wurde dann zur Transformation von E.coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten gebracht, die Ampicillin enthielten. Es wurden 12 verschieden Ampicil­ lin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNA isoliert und das Vorhandensein der erwarteten Fragmentgrößen durch Restriktionsenzymanalyse mit PvuII getestet. Es wurde fest­ gestellt, daß 11 davon die erwarteten 3505 und 2882 Basen­ paare-enthaltenden PvuII-Fragmente besaßen. Zwei der posi­ tiven Transformanten wurden dann auf ihre Fähigkeit gag/env-Fusionsprotein zu exprimieren getestet. Diese Trans­ formanten wurden aufgezogen und zur Expression bei 42°C induziert. Die Expressionsprodukte wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse, wie oben beschrieben, analysiert.
Die erste Doppelspur in Fig. 3 zeigt die Gesamt­ protein-Analyse von E.coli MC 1061 Zellen enthaltend das rekombinante Plasmid, welches das gag/env-Fusionsgen kodiert (g/e) und von E.coli Kontrollzellen (c). Die Doppelspuren 2 und 3 zeigen die Western-Blot-Analyse der Gesamtproteine der gleichen Zellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, die gegen die Aminosäurereste 500-511 des env-Proteins gerichtet sind (Doppelspur 2) oder von polyklonalen Schafs-Antikörpern, die gegen das p24 gag-Protein gerichtet sind (Doppelspur 3). Die letztge­ nannten Antikörper sind im Handel erhältlich. Das p24 gag-Protein wurde von Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] detailliert beschrieben. Die Immunkomplexe in den Doppelspuren 2 und 3 wurden mittels eines zweiten Antikörpers, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt war, sichtbar gemacht. Die Banden der gag/env- Fusionsproteine sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
Viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung liegen für den Fachmann im Bereich des Möglichen ohne von ihrem Inhalt abzuweichen. Beispielsweise, kann das Gen, welches das gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, durch Nukleotid-Substitution verändert werden (durch Gebrauch der Sequenzinformation des HTLV-III Genoms) so daß ein etwas anderes, aber funktionell gleiches, Fusionsprotein exprimiert werden kann. Ein solches veränder­ tes Protein würde immer noch im Bereich der vorliegenden Er­ findung liegen, vorausgesetzt es besitzt mindestens eine determinante Gruppe, die mit gag- und env-Proteinsequenzen eines HTLV-III Virus überstimmt. Die zuvor beschriebenen speziellen Ausführungsformen werden nur als Beispiele ange­ boten und die vorliegende Erfindung ist nur durch den Wort­ laut der beiliegenden Ansprüche begrenzt.

Claims (8)

1. Ein rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz ent­ hält, welche ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des HTLV-III gag-Pro­ teins und des HTLV-III env-Proteins übereinstimmt, kodiert und der die Expression dieser DNA-Sequenz in einem einzel­ ligen Wirtsorganismus bewirken kann.
2. Ein rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 1, der eine DNA-Sequenz enthält, welche die Nukleotidsequenz oder Teilsequenzen davon, einschließt.
3. Ein rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 1 oder 2, der das Plasmid pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 ist.
4. Ein einzelliger Organsimus, der einen rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 1-3 enthält.
5. Ein einzelliger Organismus gemäß Anspruch 4, der ein prokaryoter Organismus ist.
6. Ein einzelliger Organismus gemäß Anspruch 5, der eine Escherichia coli Zelle ist.
7. Ein einzelliger Organismus gemäß Anspruch 6, der eine Escherichia coli MC 1061 Zelle ist.
8. Ein einzelliger Organismus gemäß Anspruch 4, der ein eukaryoter Organismus ist.
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