JPH01179687A - Ｈｉｖ融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、後天性免疫不全症候群（エイズ）の原因ウィ
ルスであるエイズウィルスのｇａｇ抗原とｅｎｖ抗原の
融合蛋白質、すなわち、遺伝子細換え技術を用いて発現
されたエイズウィルスのｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質に関
する。

えユニ１１ 後天性免疫不全症候群（エイズ）は、１９８１年頃に初
めてヒトへの感染が報告された比較的新しい免疫疾患で
あり、これまでにその有効な予防ワクチンや、治療法が
確立されていない疾患である。

エイズ患者が示す特徴的な臨床症状としては、カリニ肺
炎や、カボジ肉腫等であり、これらはエイズウィルス感
染によりヒトの免疫機能が急速に低下することが原因と
考えられている。このような症状を示すエイズは、アフ
リカ・アメリカを中心として感染が広がっており、いっ
たん発症すれば２年以内の致死率が７０％以上ともいわ
れ、今日ではヨーロッパそして日本においても深刻な致
死性ウィルス感染症として恐れられている。

このようなエイズの治療方法については、多くの国の様
々な研究機関において研究・探索が進められているが、
今日までに有効な治療方法は見つかっていない。一方、
感染を予防できるワクチンに大きな期待が寄せられてい
るが、エイズウィルスの場合には通常のウィルスと異な
りウィルス表面の抗原変異が激しい等の理由からワクチ
ン開発にも問題が多く、現状においては有効なワクチン
は開発されていない。

このような状況においては、エイズウィルス感染源とな
る血液や感染者等をチエツクし、これらから新たに感染
が生じないよう防止することが最も大切な対応策として
考えられる。すなわちサンプル中にエイズウィルスが存
在しているかどうかを検出できる臨床検査試薬が大きな
役割を果たすことになり、このような臨床検査試薬開発
もワクチンや治療法の開発と並んで精力的に研究されて
いる。エイズウィルスまたはその構成成分を直接検出で
きる検査試薬はまだ市販されていないが、エイズウィル
スに対する抗体を検出し間接的にウィルス汚染（感染）
を検出できる臨床検査試薬についてはすでに数種が開発
され広く市販されている。今日ではこれらの検査試薬は
、血液等を取り扱う機関等において必須となっており、
効瀝的に活用されている。

エイズ感染の原因となるウィルスは、モンタニエらによ
る報告によるＬ　Ａ　Ｖ　［５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏ　ｌ
　、２２０ｐ８６８−８７１　（＋９８３）、及び特開
昭６０−６７８５９号コや、ガロらによるＨ　Ｔ　Ｌ　
Ｖ−ｍ　［５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２２４ｐ５０ｆ１
５０３　（＋９８４）、及び特表昭６１−５００９８７
号コと呼ばれていたが、今日ではこれらのウィルスやそ
の他のエイズ関連ウィルス［例えばＡＲＶ：Ｌｅｖｙら
、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２２５　　ｐ８４０　（＋
０８４）コを総称してＨＩＶ　（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕ
ｎｏｄｅｆｉｃｉａｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ）という名称で
統一されつつある。本明細書中では、このような様々な
名称のエイズ関連ウィルスを総称してＨＩＶと呼ぶこと
にする。

エイズ病原ウィルスであるＨＩＶはレトロウィルスに属
し、そのウィルス粒子の直径は約１０００オングストロ
ーム、粒子の外側は、宿主のＴ４リンパ球細胞の細胞膜
に由来する脂質二重層からなる膜に覆われている。その
膜にはｅｎｖと呼ばれる糖蛋白質が存在する。ｅｎｖは
、ｇｐ４１とｇｐ１２０の糖蛋白質からなり、ｇｐ４１
は膜を貫通するように、モしてｇｐ１２０は膜の外側に
突出して存在する。ウィルス内部にはｇａｇと呼ばれる
コア抗原が存在し、ｐ１４、ｐ２４とｐ＋７と呼ばれる
３つの蛋白質が存在する。さらに逆転写酵素、エンドヌ
クレアーゼ、プロテアーゼが存在し、これらはｐｏｌ遺
伝子内にコードされている。

遺伝子ゲノムの構造としては、プロウィルスの両端に末
端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれるＤＮＡ配列が存在し、
その間にｇａｇ、　ｐｏｔそしてｅｎｖをコードする遺
伝子が存在する構造を持ち、ゲノムの長さが約０゜７Ｋ
ｂｐの遺伝子である。このＨＩＶゲノムは、既に全塩基
配列がクローニングされている［　Ｓｈａνら、５ｃｉ
ｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２２６　ｐＨ６５１１７１（１９８
４）］。

遺伝子組換えを用いたエイズウィルス関連ポリペプチド
の発現を試みた例は、いくつかこれまでに報告されてい
る。

例えば、Ｎ、Ｔ、Ｃｈａｎｇらは、ＨＴＶのＤＮＡを約
５００ｂｐ　（塩基対）程度のＤＮＡ断片に切断し、こ
れを大腸菌用発現ベクターに組み込み、入ファージのβ
ガラクトシダーゼとの融合蛋白として発現させた。その
結果としてエイズ、巴者血清と反応する蛋白を発現して
いる形質転換大腸菌を得ている゛［５ｃｉｅｎｃｅ　　
２２８．９３−９６　（１９８６）］。しかしながらこ
こで発現されたエイズ関連抗原物質はβガラクトシダー
ゼとの融合蛋白質であり、エイズ関連抗原測定検査試薬
等に用いる場合には、純粋なエイズ関連抗原であること
が望ましい。

Ｒ，Ａ、Ｋｒａｍｅｒらは、ＨＩＶ遺伝子のうちｇａｇ
とｐｏｔ遺伝子をコードする遺伝子断片を酵母用の発ｒ
Ｈベクターに組み込み、ｇａｇ蛋白である　ｐ２４．ｐ
＋？およびｐ１４の蛋白を発現させている［５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２３１．１５８０−１５８４　　（１９８６）コ
　。

ざらにＰｈ１ｌｉｐ　Ｊ、　Ｂａｎらは、エイズウィル
スのｅｎｖ抗原ｇｐ１２０及びｇｐ４１をＧＡＰ　（グ
ルタルアルデハイド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）と
ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）のプロモーター
を利用し酵母で発現さすることを試みたが、発現された
ｇｐ４１が酵母菌体内で酵母に対して毒性を示したため
効率よく発現されなかったと報告している。

一方、ＳＯＤ　（ヒトスーパーオキシドデスムターゼ）
との融合蛋白として発現させた実験では効率よく発現に
成功し、これらの発現産物はエイズ患者血清とも反応し
た［Ｖａｃｃｉｎｅ　５．　９０−１０１　（１９８７
）コ。しかしながら、この場合におけるｇｐ４１の発現
はエイズウィルスとは同等関係ないＳＯＤとの融合蛋白
質であるため、ワクチンや検査試薬として利用を考えた
場合には純粋なｇｐ４１の発現が望まれる。

現在市販されているエイズ関連抗体の測定試薬は、培養
したウィルスを壊して得られた抗原を用いて作られてい
るため、これらの試薬を作る作業においては、感染性の
あるＨＩＶウィルスを直接取り扱う必要があり、ウィル
ス感染事故の危険性が心配される。このような作業当事
者の万が−の事故を考慮しても、感染能を有するウィル
スを取り扱う必要のない安全な作業に変換されることが
好ましい。すなわち、遺伝子組換え等の技術により調製
された感染性のない抗原を用いた安全かつ有効な測定試
薬またはワクチンの開発が望まれている。

ざらに、エイズ患者や、エイズウィルス感染者は、ｅｎ
ｖ抗原とｇａｇＪ＊原の両方に対する抗体あるいはどち
らか一方の抗体しか存在しない場合があるため、抗体測
定試薬としてはこれら両方の抗体を検出できなければな
らない。

一方、エイズに対するワクチンとしてはこれまて主にｅ
ｎｖ抗原にそのターゲットがおかれてきている。最近で
はｅｎｖ抗原の中で、コンサーブ領域であるｇρ４１に
もワクチンとして重要なペプチド領域があることが明ら
かになりつつある。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙらは、ｅｎ
ｖ抗原構成アミノ酸配列で７３５−７５２の領域（ｇｐ
４１のＣ末端に近い領域）のペプチドを合成ペプチドと
して調製し、これをウサギに免疫した結果、ｅｎｖ抗原
と反応する有効な抗体を誘導することに成功している［
５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２３＋　１５５６−１５５９
（１９８６）］。また、Ｄ、Ｄ、　Ｎｏらは、ｅｎｖ抗
原のアミノ酸配列から重要な領域と考えられる２２種の
異なるペプチドを調製しこれを免疫した結果、その中の
いくつかにおいて中和抗体を誘導できたことを報告して
いる。その中で、ｇｐ４１のコードするアミノ酸配列で
８１６−６３２および７２８−７５１　（番号はすべて
ｅｎＶ抗原全アミノ酸配列のＮ末端からの順番に相当す
る）の領域に中和抗体を誘発する能力があることを報告
している。　［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｒ
ｙ　Ｖｏｌ、６１Ｎｏ、６　ｐ２０２４−２０２８　　
（１９８７）］。

さらにエイズ患者においてはその症状が悪化するに伴い
、８３と抗原に対する抗体のうちｐ２４に対する抗体が
減少するという報告があり［ＪｏｎａｔｈａｎＮ、　　
Ｗｅｂｅｒら；　　Ｌａｎｃｅｔ、　　Ｊａｎｕａｒｙ
　１７．　　ｐＨ９−１２１（１９８７）］、ｇａｇ　
ｐ２４抗体の存在がエイズ症状の進行を抑える可能性が
ある。

これらの状況から判断しても、エイズワクチンとしては
ｅｎｖとｇａｇの両方の抗原を原料とすることがより効
果的と考えられ、同様に、これらの抗原に対する抗体を
特異的に検出する臨床検査試薬等の開発も非常に重要で
あると考えられる。

しかしながら、前にも述べたように現状の遺伝子組換え
技術においては８ａｇ抗原であるｐ２４の発現には成功
しているものの、ｅｎｖ抗原であるｇｐ４１を純粋な形
、すなわちエイズウィルスに関連のない他のペプチドと
の融合蛋白ではない純粋な形で効率よく発現させること
は成功しておらず、遺伝子組換えによりｅｎｖ抗原を効
率よく製造できる方法の開発が待ち望まれている。また
更に、ワクチンの成分としてｅｎｖ抗原とｇａｇ抗原の
両方が必須と考えられている今日においては、これらを
それぞれ別々に形質転換体から製造・精製することはそ
の作業量の点で問題も残り、願わくば、これら両抗原を
効率よく調製することが可能な遺伝子組換え技術や培養
技術の開発も望まれる。

ｌ豆ユ且力 このような状況において、本発明者らは、ＨＩＶの１１
２４をコードする領域を含むｇａｇ抗原遺伝子断片とｇ
ｐ４１をコードする領域を含むｅｎｖ抗原遺伝子断片を
単一の読み取りフレームになるよう融合させ、これの酵
母における発現を試みたところ、ｇａｇ−ｐ２４とｅｎ
ｖ−ｇｐ４１の両抗原性を持ったｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋
白質を得ることに成功した。さらにこれまてｅｎｖ抗原
を純粋な形で組換え体で発現させることは非常に困難で
あったが、本発明によるｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質は、
発現された産物のｅｎｖ抗原の宿主細胞に対する毒性は
認められずｇａｇ抗原同様目的産物を効率よく産生ずる
ことができることを見いだし本発明を完成するに至った
。さらに本発明によれば、抗体測定試薬に必要なＨＩＶ
のｇａｇ抗原とｅｎｖ抗原双方の抗原性を持ったｇａｇ
−ｅｎｖ融合蛋白質を一度に得ることができ、工業的利
用においても大きな効果を得ることが出来る。また、こ
のようなｅｎｖ−ｇａｇ融合蛋白質は、ワクチン開発に
おいても多価サブユニットワクチンとしてその利用が期
待される。

すなわち、本発明は、エイズの診断試薬、ワクチンに有
用なエイズウィルスの新規なｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質
を提供するものである。さらに詳しくは、遺伝子組換え
技術を利用して効率よく発現されたエイズウィルスのｇ
ａｇ蛋白とｅｎｖ蛋白の融合蛋白質、並びにその製法を
提供するものである。

・Ｈの　】− 本発明に用いるＨ　Ｉ　Ｖ遺伝子は、これまでに分離さ
れているエイズウィルスから通常の遺伝子クローニング
方法、例えば［ＮＡＴＵＲＥ　　Ｖｏｌ、３１２．　ｐ
１６６−１６９（１９８４）］等を用いることにより調
製できる。

例えば）１９／）ＩＴＬＶ−ｍ　Ｂで示されるウィルス
感染細胞株（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ８５４３）　　ヤ、
Ｍｏ１ｔ３／ＨＴＬＶ−ｍＢ　（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ
８６０２）が人手可能なウィルスの一例として挙げられ
る。これらのウィルス感染細胞よりＤＮＡを抽出し、す
でに報告されているＨＩＶ−ＤＮＡの塩基配列［Ｎａｔ
ｕｒｅ　Ｖｏｌ、３１３　ｐ２７７−２８４　（１９８
５）等コを参照して合成したＤＮＡプローブや市販され
ているＨＴＶ−ＤＮＡプローブ（Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｒｅ
ｓ、　Ｌａｂ。

、　Ｍｄ、、ＬＩＳＡ）を利用してＨＩ　Ｖ−ＤＮＡを
クローニングすることも可能である。

エイズウィルス遺伝子ゲノム中のとの位置に目的のｅｎ
ｖ遺伝子およびｇａｇ遺伝子が存在するかについては、
ガロらの報告（ＮＡＴＬＩＲＥ　Ｖｏｌ、３＋３　ｐ２
７７−２８４（１９８５））から既に知られており、こ
れを参照し、目的の遺伝子分離に適した制限酵素にて遺
伝子を切断し、また必要に応じてエンドヌクレアーゼ（
Ｂａｌ−３１）で遺伝子を削ることにより調製すること
が可能である。また、必要であれば適当なリンカ−を目
的の遺伝子末端に結合させ、後の遺伝子操作が行いやす
いように工夫することも必要である。

このようにして目的のそれぞれのｅｎｖ遺伝子およびｇ
ａｇ遺伝子を分離する。

または、上記のように既に報告されているＨｒＶ−ＤＮ
Ａの遺伝子配列を参照し、ＤＮＡ合成装置を用いて必要
な抗原の好ましい領域のポリペプチドをコードする遺伝
子のみを合成し以下に述べる発現プラスミド、形質転換
体の調製に用いることができる。

つぎに、このようにして分離・調製された２つの遺伝子
を下記のようにして同一の読み取りフレームになるよう
に融合させる。エイズウィルスのｅｎｖｖｃ原（表面抗
原）としてはｇｐ４１とｇｐ１２０の存在が知られてい
るが、本発明の融合ペプチドをコードする遺伝子には、
少なくともｇｐ４１をコードする領域をすべて含むＨＩ
Ｖ由来のｅｎｖ遺伝子断片が用いられる。一方、ｇａｇ
抗原としてはρ２４、ｐ＋７およびｐ＋４等が知られて
いるが、本発明においては少なくともｐ２４をコードす
る領域をすべて含むｆ（Ｉ　Ｖ由来のｇａｇ遺伝子断片
が泪いられる。これらの遺伝子を結合させる場合は、ｇ
ａｇをコードする遺伝子を５　Ｊ向になるように結合さ
せることで目的産物を効果的に発現させることができる
。また、ｇａｇ−ｐ２４をコードする遺伝子の部分には
翻訳開始コドンが存在しないため、ｇａｇ　ｐ１７の遺
伝子の５′部位の一部を除去した場合には、合成りＮＡ
やＡＴＧを持つ適当なリンカ−を用いて、翻訳開始コド
ン（ＡＴＧ）を予め５′端にフレームが合うように結合
させることが必要である。または、別の方法として、発
現ベクターの外来遺伝子用発現プロモーター下流に翻訳
開始コドン（ＡＴＧ）を持つような改良されたプラスミ
ドを使用することもできる。ｇａｇ遺伝子の３′端には
ｅｎｖ抗原ｇｐ４１をコードする領域を含むｅｎｖ遺伝
子断片をフレームが合うように結合させる。翻訳を止め
る終止コドンはｇｐ４１本来の終止コドンが用いられる
。

この様にして得られた目的の融合蛋白質をコードする遺
伝子は、酵母ならびに動物細胞等の真核細胞を宿主とし
て発現させることができる。真核細胞の中でも酵母を宿
主として用いれば、得られる形質転換体の取り扱いが非
常に容易となり、目的の融合蛋白を比較的容易に調製す
ることができる。また、ワクチンとして用いる場合には
、安全性の面から、発癌因子を持つ動物細胞を宿主とす
るより、ヒトに対してほとんど危険性のない酵舟を用い
ることが好ましい。

このような宿主での発現に必要な発現ベクターは、用い
る宿主細胞の機能に応じて構築することが必要である。

たとえば、酵母を宿主として利用する場合には、大腸菌
と酵母の双方でのクローニングが可能なシャトルベクタ
ーを用いることが望ましい。このような大腸菌・酵母シ
ャトルベクターの構造としては、大腸菌プラスミドの由
来のプラスミド複製開始領域および薬剤耐性遺伝子（ア
ンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン遺伝子等）を
大腸菌側の遺伝子として持ち、酵母側の遺伝子として、
酵母由来の複製開始領域（２μｏｒｉ、ａｒｓ　１なと
）、酵母用選択マーカー遺伝子（ｌｅｕ２など）を持つ
。さらに目的遺伝子を酵母内で発現させるために、酵母
由来のプロモーターを上記シャトルベクターに組込むこ
とが必要であり、そのようなプロモーターとしては、酵
母の酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）プロモーターや
、グルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ−３−リンｍ　
（ＧＡＰ−ＤＨ）プロモーターなどが最も好ましいもの
として挙げられる。このようなシャトルベクターの外来
遺伝子発現用プロモーター遺伝子下流にＨｒＶ　３ａ呂
−ｅｎｖ融合遺伝子を鞘込むことにより、本発明のＨＩ
　Ｖ　ｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質発現用プラスミドが得
られる。このプラスミドを酵母に導入し、１１ＩＶ融合
蛋白質発現形質転換酵母を得る。

また、動物由来細胞等の培養細胞を宿主として利用する
場合には以下の方法が考えられる。例えば、ＳＶ４０な
どのウィルス遺伝子の一部を本発明のＨＩＶ融合遺伝子
と置換し、ヘルパーウィルスとともに宿主細胞（サル由
来の細胞等）に導入すれば、本発明の融合蛋白質を発現
することが可能な組換えウィルスが得られる。あるいは
、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウィルス遺
伝子の一部（パピローマウィルスなと）とＨＩ　Ｖ融合
遺伝子を結合させ宿主細胞に導入すれば、プラスミド状
態で目的遺伝子を発現する細胞を得ることができる。あ
るいは、酵母を宿主細胞とした場合のシャトルベクター
と同様に、大腸菌・培養細胞シャトルベクターを利用す
ることもできる。

そのような大腸菌・培養細胞シャトルベクターの構成と
しては、酵母用シャトルベクターに組み込んだ大腸菌由
来の遺伝子のほかに、培養細胞中で機能することが可能
なプロモーターを有するプラスミドである。このシャト
ルベクターのプロモーター下流にＨＩＶ融合遺伝子を組
込むことにより本発明のＨＩＶ融合蛋白質を発現するこ
とが可能な培養細胞用プラスミドを得ることが出来、こ
れを培養細胞に導入すれば、宿主染色体に絹み込まれた
）ｆ　Ｉ　Ｖ融合遺伝子を培養細胞で発現することがで
きる。このようなプラスミドとしては、ｐＳＶＬ（ファ
ルマシア株式会社）なとのように市販のものを利用する
こともてきる。

上記のようにして得られたｌ（Ｉ　Ｖｇａｇ−ｅｎｖ融
合蛋白質発現形質転換体を、用いたプロモーターが効率
よく機能できる培養条件において培養することによって
目的のｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質を効率よく得ることが
できる。

このようにして得られたＨＩＶのｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋
白質は、エイズウィルス本来のｇａｇ蛋白質とｅｎｖｙ
白質の抗原性を持ち、エイズ関連抗体測定試薬やワクチ
ンとしての利用に適した新規な蛋白質である。すなわち
、本発明の３ａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質は、ワクチンとし
ての抗原として特に重要であると考えられるｇａｇ−ｐ
２４およびｅｎｖ−ｇｐ４１のペプチド領域をすべて含
んでいるために、ＨＩＶに対する抗体誘導において非常
に優れていると考えられる。また、特にエイズ関連抗体
測定試薬に用いる抗原としての使用においては、現状の
市販品に代わる優れた抗体測定試薬となりうる。すなわ
ち、本発明の融合蛋白質を用いればエイズの検診に必要
と考えられるｇａｇ蛋白質とｅｎｖ蛋白質の抗体のみを
特異的に、しかも同時に検出することができる。また、
従来の遺伝子組換え技術では、ｅｎｖ蛋白質ｇｐ４１を
純粋な形で発現させることが出来なかった為に有効な抗
体検査試薬やワクチンを遺伝子組換えて作ることには問
題があったが、本発明の融合蛋白質を用いればこの問題
も解決することが可能となる。

以上のような品質の面での技術的進歩に加えて、本発明
はこのような臨床検査試薬を生産するメーカーや消費者
にとっても大きな経済的効果を及ぼすものである。すな
わち、従来の遺伝子組換え技術ではこの様な２種の異な
る蛋白質を得る場合には、各々の蛋白質を別々に発現・
培養・精製させる必要があったため二度手間であり、時
間並びにコストの面での問題が残されていた。しかしな
がら、本発明によれば、目的の両抗原、すなわちｇａｇ
蛋白質とｅｎｖ蛋白質を一度の培養・精製により短期間
で、しかも低コストで調製することが可能となる。エイ
ズの問題が深刻になってきている今日においては本発明
が社会的にもたらす効果は経済的な面においても非常に
大きく、またその意義も大きい。

以下、発現させる宿主として酵母を用いた場合の実施例
に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下
記の実施例のみに限定されるものではない。

大」１例 （１）プラスミドの構築 ＨＩＶのＤＮＡがクローニングされた組換えプラスミド
λ８１１１０　［Ｎａｔｕｒｅ　３１３　ｐ２４　（＋
９８５）、米国国立保９！衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ：ＮｔＨ
）ガロ博士より入手］２０μｇを制限酵素Ｓａｃ　Ｉと
８８ＩＩＩで切断しアガロース電気泳動にてｇａｇ蛋白
であるρ２４をコードしている約１．４Ｋｂρ遺伝子遺
伝子弟１図参照）を分離した。また、前述のプラスミド
λＢ＋＋１０２ｏＨを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏ　Ｉ
で切断し同様にアガロース電気泳動によりｅｎｖ蛋白の
ｇｐ４１遺伝子を含む１．２Ｋｂｐ遺伝子遺伝子弟１図
参！Ｉイ）を分離した。一方、プラスミドρＦＢ＋２（
ファルマシア社製）を制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＳａｃ
　Ｉて切断し、アガロース電気泳動にて３．２Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を分離した。

このようにして得られた上記の３つの遺伝子断片各＋０
０ｎｇをＴリガーゼ反応液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１
ｃＩｐＨ７，６，６，６ａ＋Ｍ　ＭｇＣｌ２．ｌ０ｍＭ
　　Ｄ　Ｄ　Ｔ、ＩｍＭ　　ＡＴＰ）にてＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ２単位を用い４℃、４時間反応させた。高木康敬
偏著「遺伝子操作実験法」第１６１頁に記載の方法に従
い、この反応液で大腸菌χ１７７６を形質転換し、アン
ピシリン５０μ３／ｍｌを含む寒天培地で生育してくる
コロニーから「代謝」第１７巻、第４「リパーゼＪ　１
１８１−８９　（１９８０）に記載されている方法に従
ってプラスミドを調製した。その結果ｐＦＢＩ２のＸｈ
ｏ　Ｉ　−５ａｃ　Ｉ間にＨＩＶのｇＢ　ｐ２４をコー
ドする領域を含む遺伝子とｅｎｖ　ｇｐ４１をコードす
る領域を含む遺伝子の融合遺伝子が挿入されたブラスミ
Ｆ　Ｉ）　Ｆ　Ｇ　Ｅ　１を選択した（第２図参照）。

このようにして得たｐ　Ｆ　ＧＥ　１　５μ８を制限酵
素Ｐｖｕ　ＩＩおよびＸｈｏ　１で切断しアガロース電
気泳動にてＨＩＶのｐ２４−ｐ４１融合遺伝子を含む２
．ＩＫｂｒ＋Ｄ　Ｎ　Ａ断片を分離した。

このようにして得られた約２．１ｋｂｐの、ｇａｇ−ｅ
ｎｖ融合遺伝子断片の全塩基配列は、第３図に示した遺
伝子の５′端の７塩基対（ＡＴＧＧＡＴＣ）を除く全塩
基配列に相当する。

一方、酵母の抑制性酸性フォスファターゼ（ＰＩ（０５
）形質発現調節領域を持つプラスミドｐＡＭ８２（特開
昭５９−３６６９９、微工研条寄第３１３号）のプロモ
ーター下流のＸｈｏＩ部位に、翻訳開始コドンＡＴＧ及
びＢａａ＋Ｈ１部位を持つ合成り　Ｎ　Ａ　（ＣＣＡＴ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧ　；　ＤＮＡ合成機により合成）
を結合させ、さらにその下流のＰｖｕ　Ｕ部位にＸｈｏ
　［リンカ−を挿入したく第４図参照）。このようにし
て得られたプラスミドｐ　ＡＭＢ　（Ｘｈｏｌ　）を制
限酵素Ｂａｌｌ１ｌ　Ｉで切断し、Ｔ４ポリメラーゼ反
応液［６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ８，０，６，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　ｌｏｍＭ　２
−メルカプトエタノール、各３３０μＭ　ｄＡＴＰ、　
ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、　６．７μ門硫酸
アンモニウム；　（ＮＨａ）３ｓＯｚ、　６．７μＭ　
ＥＤＴＡＩにて３７℃、１時間反応さ＋ｔＸｈｏＩリン
カーの付着末端を平滑末端に変換した。さらに制限酵素
Ｘｈｏ　Ｉにてこの反応液を切断し、アガロース電気泳
動で１０ＫｂρのＤＮＡ断片を得た。

これら上記の２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合反応させる。その結果ｐＡＭＢ１（Ｘｈｏｌ）にＨ
ＩＶのｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子が挿入されたプラスミ
ドｐＧＥ１（第５図参照）を得た。このようにして得ら
れたプラスミドにおいて発現されるｇａｇ−ｅｎｖ融合
蛋白質の構造遺伝子の全塩基配列を第３図に示した。こ
のｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質発現プラスミドｐＧＥ１を
組込んだ大腸菌は、微工研菌寄第９７７６号（ＦＥＲＭ
　Ｐ−９７７６）として寄託されている。

（２）酵母による融合ペプチドｐ２４−ｐ４１の発現宿
主酵母としてサッカロミセス・セレビシエＡｌ１２２　
（ａ　１ｅｕ２　ｈｉｓ４　ｃａｎｌ（Ｃｉｒ”））　
　（微工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地
（２χポリペプトン、Ｉ！イーストエキス、２ｚグ／Ｌ
コース）　ｌｏｏｍｌに接種し、３０℃で一映培養した
のち、遠心して集菌した。滅菌水にて菌体を洗浄し、つ
いて１．２Ｍソルビトールおよび１００μｇ／ｍｌチモ
リアーゼ６０，０００　（生化学工業〕の溶液５ｍｌに
懸濁させ３０℃、３０分保ち、スフェロプラスト化した
。ついでスフェロプラストを１．２Ｍソルビトール溶液
で３回洗浄したのち、１．２Ｍソルビトール、ｌ０ｍＭ
　ＣａＣｌ２およびＩＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
，５）の溶液に懸濁させた。これに前述（１）で調製し
たプラスミドｐＧＥ１を加え十分混合し、さらに０．１
Ｍ　ＣａＣｌ２を加えて最ｉｖａ度１０ｍＭ　１：ａＣ
Ｉ２とし室温で５〜１０分間放置した。ついでこれに、
２０％ポリエチレングリコール４０００、ｌ０ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２および１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，
５）溶液を加えて室温で２０分間放置した。この混合液
０．２１ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソ
ルビトール、２％グルコース、０．７％イーストニトロ
ゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、　　２０μ８／ｍｌ
ヒスチジン、３％寒天）　ｌ０ｍ１に加え、軽く混合さ
せ、予め準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地
（０，７％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グ
ルコース、２０μ８／１ヒスチジン、２％寒天）プレー
トに重層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシ
ン非要求性酵母のコロニーを得た。このコロニーを２０
μｇ／ｍｌヒスチジンを含むバルクホルダー最小培地（
東洋ら、Ｊ、　Ｂａｃｈｔｅｒｏｆ、、　１１３．　ｐ
７２７−７３８）　１０＋ｎｌ、３７℃にて培養した。

Ｓ５２４時間後、対数増殖期にある菌体を分離し、これ
をリン酸を含まない最小培地（バルクホルダーミニマル
メディウムに含まれるにＨ２ＰＯ４をにＣ１て置換し、
さらに２０μｇｅｍ　Ｉのヒスチジンを加えたもの）　
１０ｍ１菌体約４ｘｌＯ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう
に懸濁し３０℃にて約２４時間培養を続けた後、４００
０回転１０分間の遠心により菌体を集めた。この菌体を
１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸緩衝？ａ　（ｐ
Ｈ７，２）、１１１μＭ　２−メルカプトエタノール、
１００μｇ／ｍ　ｌサイモリエース６０゜０００の溶液
３ｍｌに懸濁させ、３０℃にて３０分閏ゆるやかに振盪
してスフェロプラスト化し、遠心分離によりこれを集め
た。このフェロブラストを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）　１ｍｌに懸濁し、グラスビーズを加えて攪拌
して菌体を破壊した。この破砕液を５０００回転で１０
分間遠心し、その上清について下記のウェスタンプロッ
ト法で抗原産生の有無を調べた。

サンプルを１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動したのち、電気的にニトロセルロースフィルター
に移行した。フィルターを５％スキムミルクで１時間、
室温で反応させ、）ｆ［Ｖ−ｇａｇｐ２４に対するモノ
クロナール抗体［Ｊａｐａｎ　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ、　　Ｖｏｌ、７８．　ｐ２３５−２４１　（＋９
８７）、熊本大学医学部より供与］と２時間反応させた
。フィルターをトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　
１５抛Ｍ　ＮａＣＩ）で洗浄後、抗マウスＩｇＧパーオ
キシダーゼ結合抗体（バイオラド社製）と室温で１時間
反応させた。ＴＢＳで洗浄後、過酸化水素とジアミノベ
ンジジンで発色させた。その結果ｐＧＥ１を持つ酵母抽
出液サンプルでは、分子ｍ６Ｂ、２にダルトンと９２．
５にダルトンの間に約８０〜８５にダルトンのブロード
なバンドが観察された。これは本発明のｇａｇ−ｅｎｖ
融合遺伝子から推定される分子量とほぼ一致した。一方
陰性対照である、ｇａｇ−ｅｎｖの融合遺伝子を含まな
いｐＡＭＢｌを持つ酵母抽出液サンプルにはそのような
バンドは見られなかった（第６図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＴ、　Ｌ　Ｖ　−ｍの遺伝子の制限酵素地
図とｇａｇ％ｐｏｌおよびｅｎｖをコードする領域を示
したものである。 第２図は、プラスミドｐＦＧＥ　１を示す。 第３図は、プラスミドｐＧＥ１において、外来遺伝子発
現プロモーター下流にコードされるｇａｇ−ｅｎｖ融合
蛋白質構造遺伝子の全塩基配列を示す。 第４図は、プラスミドｐＡＭＢ　１　（Ｘｈｏｌ　）を
示す。 第５図は、プラスミドｐＧＥ１を示す。 第６図は、本発明のｇａｇ−ｅｎｖ融合蛋白質のウェス
タンプロットの結果を示した図である。 ネ１２０１ ＡＴＡ、ＧＴＧ、ＣＡＧ、ＣＡＧ、ＣＡＧ、ＡＡＣ，Ａ
ＡＴ、ＴＴＧ、ＣＴＧ、ＡＧＧ、ＧＣＴ。 １１　ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ａ　ｌ　ａ−ネ１２６１ ＣＴＣ，ＡＣＡ、ＧＴＣ，ＴＧＧ、ＧＧＣ，ＡＴＣ，Ａ
ＡＧ、ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＧＣＡ。 Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｒｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−１
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ａ　ｌ　
ａ−ネ１３２１ ＡＡＧ、ＧＡＴ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＴＧ、Ｇ
ＧＧ、ＡＴＴ、ＴＧＧ、ＧＧＴ、ＴＧＣ。 Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙ
ｓ−＊　　１３８１ ＧＴＧ、ＣＣＴ、ＴＧＧ、ＡＡＴ、ＧＣＴ、ＡＧＴ、Ｔ
ＧＧ、ＡＧＴ、ＡＡＴ、ＡＡＡ、ＴＣＴ。 Ｖａ　ｌ　−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　ａ−５
ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−５ｅ　ｒ−ネ
１４４１ ＴＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、ＴＧＧ、ＧＡＣ，ＡＧＡ、Ｇ
ＡＡ、ＡＴＴ、ＡＡＣ，ＡＡＴ、ＴＡＣ。 Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇ　ｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｇ　ｌ　ｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−＊　
　１５０１ ＧＡＡ、ＴＣＧ、ＣＡＡ、ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＡＡ、Ｇ
ＡＡ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＧＡＡ、ＣＡＡ。 Ｇ　１ｕ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｌ
　ｎ−１２６０ネ ＡＴＴ、ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、Ｃ
ＴＧ、ＴＴＧ、ＣＡＡ−Ｉ−１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌ　ｎ−Ｇｌｎ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ１３
２０ネ ＡＧＡ、ＡＴＣ，ＣＴＧ、ＧＣＴ、ＧＴＧ、ＧＡＡ、Ａ
ＧＡ、ＴＡＣ，ＣＴＡ・Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ１３８０
　＊ ＴＣＴ、ＧＧＡ、ＡＡＡ、ＣＴＣ，ＡＴＴ、ＴＧＣ，Ａ
ＣＣ，ＡＣＴ、ＧＣＴ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ１４４
０　＊ 、ＣＴＧ、ＧＡＡ、ＣＡＧ、ＡＴＴ、ＴＧＧ、ＡＡＴ、
ＡＡＣ，ＡＴＧ、ＡＣＣ・Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−１
１ｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ１５０
０　＊ ＡＣＡ、ＡＧＣ，ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＣＡＣ，ＴＣＣ，Ｔ
ＴＡ、ＡＴＴ、ＧＡＡ＝Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ｌ　１ｅ−Ｇｌｕ１５６
０　＊ 、ＧＡＡ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＧＡＡ、ＴＴＡ、ＧＡＴ、
ＡＡＡ、ＴＧＧ、ＧＣＡ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｌ、ｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ第
５図 ｇａｇ遺伝子 Ｍ６図 ｐＡＭＢｌ　　ｐＧＥ１

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子のうち、少なくともｐ２４
   をコードする領域をすべて含む遺伝子断片と、ｅｎｖ遺
   伝子のうち、少なくともｇｐ４１をコードする領域をす
   べて含むｅｎｖ遺伝子断片とからなる融合遺伝子を真核
   細胞内で発現させることにより得られるＨＩＶのｇａｇ
   −ｅｎｖ融合蛋白質。
2. （２）該融合遺伝子が、ＨＴＬＶ−IIIｇａｇ遺伝子の
   ＰｖｕII部位からＢｇｌII部位までの約０．９ｋｂｐの
   遺伝子とＨＴＬＶ−IIIｅｎｖ遺伝子のＢｇｌII部位か
   らＸｈｏ I 部位までの約１．２ｋｂｐの遺伝子との融
   合遺伝子である前記第（１）項記載の融合蛋白質。
3. （３）該真核細胞が酵母サッカロミセス・セレビシエで
   ある前記第（１）項または第（２）項記載の融合蛋白質
   。