DE3687377T2

DE3687377T2 - Vitamin-d-abkoemmlinge und deren herstellungsverfahren.

Info

Publication number: DE3687377T2
Application number: DE8686900954T
Authority: DE
Inventors: F Deluca; Nobuo Ikekawa; Voula Ostrem; K Schnoes; Yoko Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1985-01-17
Filing date: 1986-01-15
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2006-01-16
Also published as: EP0211863A1; DK56490D0; DK162394B; DK157007B; DK443186A; DK443186D0; JPH06128160A; DK35889A; EP0211863A4; DK157007C; AU5359786A; DK35889D0; EP0211863B1; KR910004337B1; AU594662B2; JPH0737391B2; KR870700071A; DK56490A; DK159273C; DK159273B

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Vitamin D Derivate. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf 26-Homo- Vitamine.
Im ganz besonderen bezieht sich die Erfindung auf hydroxylierte 26-Homo-Vitamine.
Vitamin D ist dafür bekannt, den Calcium- und Phosphormetabolismus bei Tieren und Menschen zu regulieren und es steht nun fest, daß die biologische Wirksamkeit von Vitamin D von seiner metabolischen Umwandlung in vivo zu hydroylierten Derivaten abhängt. So wird Vitamin D&sub3; in vivo zu 25-Hydroxyvitamin D&sub3; in der Leber hydroxyliert, das seinerseits in den Nieren zu 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; umgewandelt wird. Es ist die zuletzt genannte Verbindung, die nunmehr als die zirkulierende hormonale Form von Vitamin D anerkannt wird.
Wegen ihrer biologischen Aktivität hinsichtlich der Förderung des Calcium- und Phosphortransports im Darm und der Mobilisierung und Mineralisierung des Knochens stellen diese Formen von Vitamin D wichtige pharmazeutische Produkte dar, die hervorragend geeignet sind zur Behandlung verschiedener Störungen des Knochens.

Stand der Technik

Vitamin D Derivate und ihre Herstellung und Anwendung werden in vielen Schriften aus der Patent- und anderen Literatur erörtert. Zum Beispiel bezieht sich US-Patent No. 3,565,924 auf 25-Hydroxycholecalciferol; US-Patent No. 3,697,559 auf 1,25-Dihydroxycholecalciferol; US-Patent No. 3,741,996 auf 1α-Hydroxycholecalciferol; US-Patent No. 3,796,072 auf 22-Dehydro-25-Hydroxycholecalciferol; US- Patent No. 3,880,894 auf 1,25-Dihydroxyergocalciferol; US- Patent No. 4,201,881 auf 24,24-Difluoro-1α,25- dihydroxycholecalciferol; US-Patent No. 4,196,133 auf 24, 24-Difluoro-1α,25-dihydroxycholecalciferol.

Beschreibung der Erfindung

Es wurden nun neue Derivate von Vitamin D&sub3; gefunden, welche eine ausgezeichnete Vitamin D-ähnliche Aktivität zeigen und die, aus diesem Grunde, ohne weiteres als Ersatz für Vitamin D&sub3; wie auch verschiedener seiner Derivate dienen könnten. Bei bekannten Anwendungen wie beispielsweise die Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen, die auf einer Calcium- und Phosphorunausgewogenheit beruhen wie Hypoparathyroidismus, Osteodystrophie, Osteomalazie und Osteoporose.
Bei diesen Derivaten handelt es sich um 26-Homo-Vitamine und insbesondere um 1α,25-Dihydroxy-22E-dehydro-26-homo- Vitamin D&sub3; und 1α,25-Dihydroxy-26-homo-Vitamin D&sub3;.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung der Formel
zur Verfügung, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl und R&sub4; und R&sub5; jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten oder miteinander eine Kohlenstoff- Kohlenstoffbindung bilden.

Beste Art zur Ausführung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entsprechend dem Verfahren hergestellt werden, das in der nachfolgenden schematischen Darstellung und Verfahrensbeschreibung dargestellt ist. Hierin geben gleiche Zahlen dieselben Verbindungen an. Schematisch
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung:
1α,3β-Dimethoxymethoxy-23,24-dinorchol-5-en-22-al wurde mit Vinylmagnesiumbromid umgesetzt um den Allylalkohol (1) zu ergeben. Dieser Alkohol wurde der Claisen Umlagerung unterworfen indem er mit Trimethyl-ortho-n-butylat und einer katalytischen Menge an Propionsäure umgesetzt wurde, um den Ester (2) in guter Ausbeute (97%) zu erhalten. Die Verbindung (2) wurde überführt in ihre Enolatform durch Behandlung mit n-Butyllithium und THF, die dann mit Sauerstoff behandelt und nachfolgend mit Triethylphosphit reduziert wurde, um an der C-25 Stelle im Molekül eine Hydroxylgruppe einzuführen. Hiernach wurde der 27-Ester (3) in den Alkohol (4) überführt durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Lithiumaluminiumhydrid, um das korrespondierende Diol zu erhalten, gefolgt von einer Behandlung mit Methansulfonylchlorid und Pyridin, um das Mesylat zur Verfügung zu stellen, das seinerseits mit Lithiumaluminiumhydrid behandelt wurde.
Die Entfernung der MOM-Gruppe durch Behandlung mit Säure ergab (22E, 25ξ)-1α,3β,25-Trihydroxy-26-homocholesta-5,22- dien (5), das acetyliert wurde, um das Diacetat (6) zu ergeben. Die allylische Bromierung von (6) mit N- Bromosuccinimid und dann mit Tetra-n-Butylammoniumfluorid ergab das 5,7,22-Trien (7), das bestrahlt und isomerisiert wurde durch Erhitzen, um das (22E)-Dehydroxy-26-homo- Vitamin D&sub3; (8) zu ergeben.
(25ξ)-1α,25-Dihydroxy-26-homo-Vitamin D&sub3; (11) wurde erhalten durch selektive Hydrierung des 5,22-Diens (6), um das 5-En (9) zu erhalten, das in das 5,7-Dien (10) und dann in das 26-Homo-Vitamin (11) überführt wurde, so wie es oben beschrieben worden ist.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens

Bei der nachfolgenden detaillierten Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die Schmelzpunkte mit einem Heiztisch-Mikroskop bestimmt und blieben unkorrigiert. ¹H-NMR Spektren wurden mit einem Hitachi R- 24A (60 MHz) in CDCl&sub3; mit Me&sub4;Si als Bezugselement aufgenommen, soweit nichts anderes gesagt ist. Die Massenspektren wurden mit einem Shimadzu QP-1000 Massenspektrometer bei 70 eV erhalten. Die UV Spektren wurden in einer Ethanollösung mit einem Shimadzu UV-200 Doppelstrahlspektrophotometer erhalten. Die Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von Silikagel (E. Merck, Kieselgel 60, 70-230 Mesh) durchgeführt. Die präparative Dünnschichtchromatographie wurde auf Precoatplatten aus Silikagel (E. Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;, 0.25 mm Dicke) ausgeführt. Die übliche Aufarbeitung bezieht sich auf die Verdünnung mit Wasser, Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, in Klammern angegeben, Waschen des Extrakts bis zur Neutralität, Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat, Filtration und Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck. Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet; THP - Tetrahydrophyranyl; THF - Tetrahydrofuran; Äther - Diethylether, MeOH - Methanol, MOM - Methoxymethyl, LDA - Lithiumdiisopropylamid. Temperaturen sind º Celsius angegeben.

(22E, 25ξ)1-α,3β-Dimethoxymethyloxy-26-homocholesta-5,22- dien-27-carboxylsäuremethylester (2)

Eine Lösung des Allylalkohols (1) (390 mg, 0.844 mmol), Trimethyl-ortho-n-butylat (0.7 ml) und Propionsäure (3 Tropfen) in Toluol (6 ml) wurde während 2 Stunden unter Argon am Rückflußkühler erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab ein Rohprodukt, welches auf eine Säule von Silikagel (20 g) gegeben wurde. Die Eluierung mit Hexan-Ethylacetat (5:1) ergab den Ester (2) (446 mg, 97%) als ein Öl.
&supmin;¹H-NMR δ:0.68 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.88 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 0.98 (3H, d, J = 6 Hz, 21-H&sub3;) β.03 (3H, s, 19-H&sub3;), 3.38 (3H, s, -OCH&sub3;), 3.43 (3H, s, -OCH&sub3;), 3.68 (3H, s, -CO&sub2;CH&sub3;), 3.76 (1H, m, 1β-H), 4.68 (2H, s, 3β-O-CH&sub2;-O-), 4.69 (2H, ABq, J = 7 Hz, ΔAB = 11 Hz, 1α-O-CH&sub2;-O), 5.27 (2H, m, 22-H and 23-H), und 5.56 (1H, m, 6-H).

(22E, 25ξ)-1α,3β-Dimethoxymethyloxy-25-hydroxy-26- homocholesta-5,22-dien-27-carboxylsäuremethylester (3)

Zu einer Lösung von LDA (hergestellt mit Diisopropylamin (0.13 ml, 0.929 mmol), 1.56 M n-Butyllithium (0.59 ml) und THF (2 ml), wurde der Ester (2) (437 mg, 0.800 mmol) in THF (5 ml) zugegeben und die Mischung wurde unter Argon bei -78ºC während 30 Minuten gerührt. In die Lösung wurde Sauerstoff in Form von Bläschen eingeleitet und dann Triethylphosphit (0.14 ml, 0.817 mmol) zugesetzt. Die übliche Aufarbeitung (Äther für die Extraktion) ergab ein Rohprodukt, das auf eine Silikagelsäule (25 g) gegeben wurde. Die Elution mit Hexan-Ethylacetat (5 : 1) erbrachte den Hydroxyester (3) (303 mg, 67%) als ein Öl.
¹H-NMR δ: 0.68 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.85 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 0.98 (3H, d, J = 6 Hz, 21-H&sub3;), 1.02 (3H, s, 19-H&sub3;), 3.08 (1H, bs, W1/2 = 3 Hz, -OH), 3.38 (3H, s, -OCH&sub3;), 3.42 (3H, s, -OCH&sub3;) , 3.76 (3H, s, -CO&sub2;CH&sub3; 4.68 (2H, s, 3β-O-CH&sub2;-O-), 4.68 (2H, ABq, J = 7Hz, ΔAB = 11 Hz, 1α-O-CH&sub2;-O-), 5.32 (2H, m, 22-H and 23-H), 5.55 (1H, m, 6-H).

(22E, 25ξ)-1α,3β-Dimethoxymethyloxy-25-hydroxy-26- homocholesta-5,22-dien (4)

Zu einer Lösung des Hydroxyesters (3) (294 mg, 0.539 mmol) in THF (5 ml) wurde Lithiumaluminiumhydrid (20 mg, 0.526 mmol) zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Äther für die Extraktion) ergab ein rohes Diol. Dieses wurde mit Methansulfonylchlorid (0.04 ml, 0.517 mmol) und Pyridin (1.5 ml) bei Raumtemperatur während 30 Minuten behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Äther für die Extraktion) ergab ein rohes Mesylat. Zu einer Lösung des rohen Mesylats in THF (5 ml) wurde Lithiumaluminiumhydrid (20 mg, 0.526 mmol) zugesetzt und die Mischung wurde während 30 Minuten unter dem Rückflußkühler erhitzt. Die übliche Aufarbeitung (Äther zur Extraktion) ergab ein rohes Produkt, welches auf eine Silikagelsäule (20 g) aufgegeben wurde. Die Elution mit Hexan-Ethylacetat (5 : 1) ergab den Alkohol (4) (190 mg, 70%) als ein Öl.
¹H-NMR δ: 0.71 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.90 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 1.03 (3H, d, J = 6 Hz, 21-H&sub3;), 1.03 (3H, s, 19-H&sub3;), 1.12 (3H, s, 27-H&sub3;), 3.36 (3H, s, -OCH&sub3;) 3.40 (3H, s, -OCH&sub3;), 3.74 (1H, m, 1β-H), 4.66 (2H, s, 3β-O-CH&sub2;-O-), 4.67 (2H, ABq, J = 7 Hz, ΔAB = 11 Hz, 1α-O-CH&sub2;-O-), 5.35 (2H, m, 22-H and 23-H) and 5.54 (1H, m, 6-H).

(22E, 25ξ)-1α,3β,25-Trihydroxy-26-homocholesta-5,22-dien (5)

Eine Lösung des Dimethoxymethylesters (1) (181 mg, 0.349 mmol) in THF (5 ml) wurde mit 6N HCl (1 ml) bei 50ºC während 1.5 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes Produkt, das auf eine Silikagelsäule (15g) aufgegeben wurde. Die Elution mit Hexan-Ethylacetat (1 : 2) ergab das Triol (5) (147 mg, 98%), m.p. 85-87ºC (Hexan-Dichloromethan).
¹H-NMR δ: 0.69 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.89 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 1.02 (3H, s, 19-H&sub3;), 1.13 (3H, s, 27-H&sub3;), 3.85 (1H, m, 1β-H), 3.98 (1H, m, 3α-H), 5.40 (2H, m, 22-H und 23-H), and 5.60 (1H, m, 6-H).

(22E, 25ξ)-1α,3β-Diacetoxy-25-hydroxy-26-homocholesta-5,22- dien (6)

Eine Lösung des Triols (5) (100 mg, 0.233 mmol) in Pyridin (1 ml) wurde mit Essigsäureanhydrid (1 ml) bei Raumtemperatur während 15 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes Produkt, welches auf eine Silikagelsäule (10 g) gegeben wurde. Die Elution mit Hexan-Ethylacetat (5 : 1) ergab das Diacetat (6) (101 mg, 85%) als amorpher Feststoff.
¹H-NMR δ: 0.68 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.88 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 0.98 (3H, d, J = 6Hz, 21-H&sub3;), 1.08 (3H, s, 19-H&sub3;), 1.12 (3H, s, 27-H&sub3;), 2.03 (3H, s, acetyl), 2.06 (3H, s, acetyl), 4.98 (1H, m, 3α-H), 5.06 (1H, m, 1β-H), 5.37 (2H, m, 22-H and 23-H), and 5.53 (1H, m, 6-H).

(22E, 25ξ)-1α,3β,25-Trihydroxy-26-homocholesta-5,7,22-trien (7)

Eine Lösung von 5,22-Dien (6) (38 mg, 0.0739 mmol) und N- Bromosuccinimid (19 mg, 0.107 mmol) in Tetrachlorkohlenstoff (3 ml) wurde unter Argon während 20 Minuten unter dem Rückflußkühler erhitzt. Nach Abkühlung auf 0ºC wurde das erhaltene Präcipitat abfiltriert. Das Filtrat wurde bei unterhalb 40ºC konzentriert, wobei ein Rückstand zurückblieb. Die THF (5 ml) Lösung dieses Rückstands wurde mit einer katalytischen Menge Tetra-nbutylammoniumbromid bei Raumtemperatur während 50 Minuten behandelt. Hiernach wurde die Mischung mit einer Lösung von Tetra-n-Butylammoniumfluorid in THF (0.3 ml, 0.3 mmol) bei Raumtemperatur während 30 Minuten behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes Trien. Dieses Trien in THF (5 ml) wurde mit 5% KOH-MeOH (4 ml) bei Raumtemperatur während 14 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes Produkt, welches einer präparativen Dünnschichtchromatographie (Benzol-Ethylacetat, 1 : 1, sechsmalige Entwicklung) unterworfen wurde. Das Band mit dem Rf Wert 0.45 wurde abgeschabt und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels erbrachte das 5,7,22-Trien (7) (8.7 mg, 40%). UV λ EtOH/max : 293, 282, 271nm.

(22E, 25ξ)-1α,25-Dihydroxy-22-dehydro-26-homovitamin D3 (8)

Eine Lösung des Triens (2) (4.4 mg, 0.0103 mmol) in Benzol (90 ml) und Ethanol (40 ml) wurde mit einer Mitteldruck- Quecksilberlampe durch einen Vyco® Filter bei 0ºC unter Argon während 2.5 Minuten bestrahlt. Die Reaktionsmischung wurde unter Argon während 1 Stunde unter dem Rückflußkühler erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab ein rohes Produkt, welches einer präparativen Dünnschichtchromatographie (Benzol-Ethylacetat 1 : 1, sechsmaliges Entwickeln) unterworfen wurde. Das Band mit dem Rf Wert 0.49 wurde abgeschabt und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels erbrachte das Vitamin D&sub3; Analogum (8) (0.91 mg, 21%).
UV λ EtOH/max 265 nm, λ EtOH/min : 282 nm. Ms m/z: 428 (M&spplus;), 410, 392, 374, 338, 320, 287, 269, 251, 141, 134, 123, 73. ¹H-NMR (400 MHz) δ: 0.56 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.91 (3H, t, J = 7.6 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 1.04 (3H, d, J = 6.8 Hz, 21-H&sub3;), 1.13 (3H, s, 27-H&sub3;), 4.23 (1H, m, W1/2 = 18.4 Hz, 3α-H), 4.43 (1H, m, W1/2 = 16.9 Hz, 1β-H), 5.00 (1H, bs, W1/2 = 3.2 Hz, 19-H), 5.32 (1H, bs, W1/2 = 3.2 Hz, 19-H), 5.37 (2H, m, 22-H und 23-H), 6.02 (1H, d, J - 11.5 Hz, 7-H), and 6.38 (1H, d, J = 11.5 Hz, 6-H).

(25ξ)-1α,3β-Diacetoxy-25-hydroxy-26-homocholest-5-en (9)

Eine Mischung des 5,22-Diens (6) (35 mg, 0.0681 mmol) und 10% Pd-C (4 mg) in Ethylacetat (4 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Wasserstoff während 3 Stunden gerührt. Der Pd Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat unter Hinterlassung eines Rückstandes konzentriert, der einer präparativen Dünnschichtchromatographie (Hexan-Ethylacetat, 2 : 1, einmal entwickelt) unterworfen wurde. Das Band mit Rf Wert 0.46 wurde abgeschabt. Die Elution mit Ethylacetat ergab das 5-En (9) (30 mg, 85%) als amorphen Feststoff.
¹H-NMR δ: 0.66 (3H, s, 18-H&sub3;), 0.88 (3H, t, J = 7 Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 1.08 (3H, s, 19-H&sub3;), 1.12 (3H, s, 27-H&sub3;), 2.02 (3H, s, acetyl), 2.04 (3H, s, acetyl), 4.97 (1H, m, 3α-H), 5.04 (1H, m, 1β-H), and 5.51 (1H, m, 6-H).

(25ξ)-1α,3β,25-Trihydroxy-26-homocholesta-5,7-dien (10)

Das 5-en (22 mg, 0.0426 mmol) wurde umgewandelt, wie es für (7) beschrieben wurde, in 5,7-Dien (10) (6.7 mg, 37%). UVλ EtOH/max : 293, 282, 271 nm.

(25ξ)-1α,25-Dihydroxy-26-homovitamin D&sub3; (11)

Das Dien (10) (4.8 mg, 0.0112 mmol) wurde, wie für (8) beschrieben, in das Vitamin D&sub3; Analoge (11) (1.3 mg, 27%) überführt. UV λ EtOH/max : 265 nm, λ EtOH/min : 228 nm. MS m/z:430(M&spplus;), 412, 394, 379, 376, 287, 269, 251, 152, 134, 116, 73, 55.
Falls gewünscht können die erfindungsgemäßen Verbindungen ohne weiteres in kristalliner Form durch Kristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, z. B. Hexan, Äthern, Alkoholen oder Mischungen hiervon erhalten werden, wie für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich ist.

Biologische Aktivität

Kochencalcium-Mobilisierungsaktivität von 1α,25-(OH)&sub2;-26- homo-D&sub3; Verbindungen

Männliche, entwöhnte Ratten wurden von Holtzman Co., Madison, Wis. gekauft und während 3 Wochen nach Belieben mit einer wenig Calcium enthaltenden und an Vitamin D unzureichenden Diät, wie von Suda et al (J. Nutrition 100 : 1049, 1970) beschrieben, und Wasser gefüttert. Die Ratten wurden dann in 4 Gruppen von jeweils 6 Tieren eingeteilt und 7 Stunden vor deren Tötung wurden ihnen jeweils 650 pmole von entweder 1α,25-(OH)&sub2;-26-homo-D&sub3;, 1α,25-(OH)&sub2;-(22E) ²²-26-homo oder 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, aufgelöst in 0.05 ml von 95%igem Ethanol in die Halsader einverleibt. Den Ratten aus der Kontrollgruppe wurden 0.05 ml an 95%igem Ethanol 7 Stunden vor der Tötung verabreicht. Den Ratten aus der Kontrollgruppe wurden in derselben Weise 0.05 ml eines Ethanolträgers verabreicht. Sie wurden durch Enthauptung getötet, das Blut wurde gesammelt und zentrifugiert, um das Serum zu erhalten. Die Serumcalciumkonzentration wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer (Perkin-Elmer Model 214) in Gegenwart von 0.1% Lanthanchlorid bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben: Tabelle 1 Verabreichte Verbindung Serumcalciumkonzentration Ethanol *) Standardabweichung vom Mittel b) ist deutlich verschieden von a)
Aus den vorstehenden Daten kann geschlossen werden, daß in den Vitamin D-Responsivsystemen von Vitamin D-Mangeltieren die erfindungsgemäßen Verbindungen dieselbe Aktivität wie 1α,25-Hydroxyvitamin D&sub3;, die zirkulierende hormonale Form des Vitamins, zeigen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ohne weiteres wegen ihrer kalzemischen Aktivität in sterilen parenteralen Lösungen durch Injektion oder intravenös oder durch den Verdauungskanal in Form von oralen Dosen oder durch Suppositorien oder sogar transkutan verabreicht werden. Dosen von 0.1 ug bis 2.5 ug pro Tag sind im allgemeinen wirksam für die Erzielung der physiologischen Calciumgleichgewichtsreaktionen, die charakteristisch für eine Vitamin D-ähnliche Aktivität sind, wobei Aufrechterhaltungsdosen von 0.1 ug bis 0,5 ug geeignet sind.
Es wurde kürzlich festgestellt, daß 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3;(1α,25-(OH)&sub2; D&sub3;) und sein strukturelles Analogum 1α- Hydroxyvitamin D&sub3;(1α-OH-D&sub3;), zusätzlich zu ihrer vorerwähnten nunmehr feststehenden calcemischen Wirkung auch eine sehr bemerkenswerte Antikrebsaktivität zeigen. Es konnte speziell gezeigt werden, daß die vorerwähnten Verbindungen hinsichtlich einer Differenzierung von bösartigen menschlichen Zellen, wie Leukämiezellen in der Kultur, zu nicht-bösartigen Makrophagen wirksam sind und die Antikrebsaktivität auf Zellen in vitro könnte in Beziehung gebracht werden mit günstigen Wirkungen in vivo indem die Verabreichung dieser Verbindungen die Lebensspanne von leukämischen Mäusen (verglichen mit Kontrollen) verlängert wird und das Befinden von menschlichen Leukämiepatienten bemerkenswert verbessert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde vorgeschlagen 1αhydroxylierte Vitamin D Verbindungen als therapeutische Mittel zur Behandlung von leukämoiden Krankheiten einzusetzen (Suda et al., U.S. Patent No. 4,391,802).
Wenngleich diese bekannten 1α-Hydroxyvitamin D Verbindungen wie sie von Suda et al. (open) getestet wurden, nämlich 1α- Hydroxyvitamin D&sub3; (1α-OH-D&sub3;) und 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; (1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;), in der Tat sehr wirksam für eine Differenzierung leukämischer Zellen sind, weisen sie für ihren Einsatz als antileukämische Mittel dadurch einen ernsten Nachteil auf, daß sie eine inhärente und folglich unvermeidbare hohe calcemische Aktivität besitzen. So stellt 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, das bislang wirksamste vitaminabgeleitete antileukämische Mittel auch das wirksamste calcemische Mittel dar und die antileukämische Wirksamkeit von 1α-OH-D&sub3; korreliert gleichermaßen mit einer hohen calcemischen Aktivität. Die Verabreichung dieser Verbindungen bei einem Dosisniveau, bei dem sie als antileukämische Arzneimittel wirksam sind (z. B. 1 ug/Tag wie in den Beispielen des Suda et al. Patents im einzelnen angegeben) würde notwendigerweise erhöhte, potentiell übermäßige Calciumspiegel verbunden mit ernsten medizinischen Komplikationen zur Folge haben, insbesondere bei Patienten, die an einer sie schwächenden Krankheit leiden. Wegen der den bekannten 1α-Hydroxyvitamin D Verbindungen eigenen Wirkungsstärke hinsichtlich der Erhöhung der Calciumspiegel ist ihr Einsatz als antileukämische Mittel ausgeschlossen.
Eine bevorzugte Methode zur Behandlung von malignen Krankheitszuständen würde ersichtlich die Verabreichung von Verbindungen darstellen, die durch ein hohes Verhältnis der antileukämischen zur calcemischen Aktivität charakterisiert sind, d. h. von Verbindungen, die eine verbesserte Wirksamkeit hinsichtlich der Differenzierung von leukämischen Zellen verglichen mit ihrer die Serumcalciumspiegel erhöhenden Wirkung zeigen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch bevorzugt aktiv hinsichtlich der Herbeiführung der Differenzierung von malignen Zellen zu nicht-malignen Zellen, i.e. hinsichtlich einer antineoplastischen Aktivität wie sie durch Leukämiezellendifferenzierung gemessen wird, während sie keine größere Aktivität als 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; in ihrer Beeinflussung des Calciummetabolismus aufweisen. Wegen dieser einzigartigen und unerwarteten Kombination von Eigenschaften stellen die neuen Seitenketten-Homovitamin D Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung überlegene und bevorzugte Mittel für die Behandlung von Leukämien und anderen neoplastischen Krankheiten dar.
Bei Anwendung an menschlichen promyelocytischen, in der Kultur gewachsenen Leukämiezellen (HL-60 Zellen) induzieren die Seitenketten Homovitamin D Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung die Differenzierung dieser Zellen zu Macrophagen (Monocyten). Bei verschiedenen Standarduntersuchungen zur Messung der Differenzierungsaktivität zeigten diese Verbindungen eine höhere Wirksamkeit als 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, des bislang am stärksten aktiven Vitamin D Derivats. Diese Untersuchungen wurden wie folgt ausgeführt:

Untersuchung von Homo-Vitamin D Verbindungen auf ihre Differenzierungsaktivität.

Die menschliche promyelocytische Leukämiezellinie (HL-60) wurde in Suspensionskultur im RPMl 1640 Medium (Gibco, Grand Islands, NY) ergänzt mit 10% (v/v) hitzeinaktiviertem fötalen Kalbsserum, 100 ug/ml Penizillin, 100 ug/ml Streptomycin und 0.25 u/ml Fungizon aufrechterhalten. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gezüchtet. Die Zellebensfähigkeit wurde aufgrund von Standardassays, z. B. Trypanblau-Exclusion, beurteilt. Die morphologischen Auswertungen wurden mit einem Wright- Farbstoff eingefärbten Präparationen auf einem Objektträger ausgeführt.
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1.5-2·10&sup5; Zellen/ml in 10 ml Medium auf Gewebekulturschalen angesetzt. Nach 20 Stunden wurden dann doppelte Schalen mit jeder der Testverbindungen in verschiedenen Konzentrationen behandelt wie in der nachstehenden Tabelle angegeben. Die Testverbindungen wurden als Lösungen in 100% Ethanol zugesetzt, so daß die Gesamtkonzentration an Ethanol in jeder Kulturschale nicht 0.2% überstieg. Die Kontrollkulturen wurden mit derselben Konzentration an Ethanol behandelt. Nach einer viertägigen (96 h) Inkubation mit den Testverbindungen wurden die Zellen von den Kulturschalen gesammelt und die Anzahl der Zellen und ihre Lebens- bzw. Wachstumsfähigkeit bestimmt. Das Ausmaß der von den getesteten Vitam D Derivaten induzierten Differenzierung wurde als Prozentsatz der Zellen ausgedrückt, die funktionelle und enzymatische Marker zeigen wie sie für Monocyten charakteristisch sind. Die zwei untersuchten Marker waren a) die Fähigkeit der Zellen Hefe zu phagocytisieren, und b) die Fähigkeit der Zellen Superoxid zu erzeugen (Nitroblautetrazol zu reduzieren) wenn sie mit Phorbolester stimuliert wurden.

a) Phagocytose-Assay zur Differenzierungsaktivität:

Die gesammelten Zellen wurden resuspendiert in RPMl Medium, das 20% AB Serum und 20% fötales Kalbsserum enthielt, um eine Präparation mit 2·10&sup6; Zellen/ml zu erhalten. Zu 0.5 ml (10&sup6; Zellen) der vorgenannten Zellsuspension wurde 0.5 ml einer Suspension (in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung) von in der Hitze abgetöteten Saccharomyces cerevisiae Zellen (1·10&sup8; Zellen) zugegeben, die mit Trypanblau angefärbt waren. Nach Inkubation dieser Mischung während 1 h bei 37ºC wurde die Anzahl der Phagozytenzellen gezählt (bestimmt aufgrund der mit Trypanblau angefärbten und intrazellular auftretenden Hefe) und als Prozentzahl der gesamten anwesenden lebens- bzw. wachstumsfähigen Zellen bestimmt. Dieser "% phagozytische Zellen" gibt den Prozentsatz der durch die Testverbindungen induzierten Differenzierung an. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Prozentsatz phagocytischer (differenzierter) Zellen erzeugt in HL-60 Zellkulturen, behandelt mit Vitamin D Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen Verabreichte Verbindung Konzentration (Mol/Liter) a Kontrollevel; die Zellkulturen wurden mit Ethanol als einzigem Lösungsmittel behandelt. b Die in diesen Reihen angegebenen Ergebnisse stellen das Mittel±SEM von drei verschiedenen Experimenten, jedes doppelt ausgeführt, dar.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß die Homo- Verbindungen eine wesentlich stärkere Wirksamkeit besitzen als 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;. Bei allen Konzentrationen erreichen die Homo-Verbindungen einen größeren Grad an Differenzierung der Leukämiezellen als 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, der bisher als am aktivsten bekannten Verbindung. Zum Beispiel bei einer 10&supmin;&sup8; molaren Konzentration erreichen die Homo-Verbindungen eine Differenzierung von 70%, wohingegen 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; bei derselben Konzentration lediglich etwa 47% differenzierte Zellen ergibt. Um eine 50% Differenzierung zu erreichen, ist eine Konzentration von 1·10&supmin;&sup9; M an den Homoverbindungen erforderlich, jedoch etwa 1·10&supmin;&sup8; M an 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, d. h. ein Wirksamkeitsunterschied von etwa dem 10-fachen.

b) NBT-Reduktionsassay zur Differenzierung:

Diese Untersuchung ist abhängig von der Fähigkeit der monocytenähnlichen Leukämiezellen Nitroblautetrazol (NBT) Reagenz zu einem schwarzblauen Präcipitat (Formazan) nach Stimulierung mit Phorbolestern zu reduzieren. Die Untersuchung wurde entsprechend der allgemeinen Verfahrensweise wie sie von Yen et al (J. Cellular Physiol. 118, 277 (1984)) vorgeschlagen wurde, durchgeführt. Die Zellen wurden wie oben angegeben gesammelt und dann in RPMI Medium suspendiert; zu 0.2 ml dieser Suspension (enthaltend etwa 1.4·10&sup6; Zellen/ml) wurde 0.2 ml an Nitroblautetrazol (NBT)-Reagenz zugegeben. (Das NBT Reagenz wurde durch Mischen einer 50 mg Nitroblautetrazol in 50 ml Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung enthaltenden Lösung mit 10 Mikroliter einer Azeton/Wasser (1 : 1) Lösung, die 0.5 mg/ml von 4β-Phorbol-12-myristat-13- acetat enthielt, hergestellt). Nach Stehenlassen in einem Wasserbad während 30 Minuten wurden die differenzierten Zellen (d. h. diejenigen Zellen, welche die für die NBT Reduktion sprechende Formazanblau Ablagerung zeigten) mit einem Hämocytometer gezählt und als Prozentsatz der gesamten anwesenden lebens- bzw. wachstumsfähigen Zellen angegeben. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Prozentsatz der Zellen in HL-60 Zellkulturen, die eine Notroblautetrazol (NBT) Reduktionsaktivität nach Behandlung mit Vitamin D-Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen aufweisen Verabreichte Verbindung Konzentration (Mol/Liter) a Kontrollevel; die Zellkulturen wurden mit Ethanol als einzigem Lösungsmittel handelt. b Die Daten stellen das Mittel±SEM von drei verschiedenen Experimenten dar, jedes doppelt ausgeführt.
Die in Tabelle 3 wiedergegebenen Resultate verdeutlichen erneut, daß die getesteten Homo-Verbindungen in vitro aktiver sind als 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3; hinsichtlich der Induzierung der Differenzierung von menschlichen myeloiden Leukämiezellen zu normalen Zellen. Um eine 60%ige Differenzierung der Leukämiezellen zu erreichen wie sie durch diesen NBT Reduktionsassay gemessen wurde, wird eine Konzentration von 2·10&supmin;&sup9; M der Homoverbindungen benötigt; um denselben Differenzierungsgrad mit 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3; zu erreichen ist eine Konzentration von 3.5·10&supmin;&sup8; M erforderlich, ein 17-facher Unterschied im Wirkungsgrad.
So bestätigen beide der obigen Assays die hohe Wirksamkeit von Homo-Vitamin D Verbindungen hinsichtlich der Induzierung der Differenzierung von Leukämiezellen. Hinzukommt, daß die vorerwähnten Ergebnisse zeigen, daß bei dieser Differenzierungsaktivität diese Homo-Vitamin D Verbindungen bedeutend wirksamer sind als 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;.
Da sich diese Differenzierungsaktivität bei menschlichen Leukämiezellen (HL-60) ausdrückt, ist klar, daß diese neuen Homo-Vitamin D Verbindungen wirksam gegen Leukämien bei Menschen eingesetzt werden können. Gleichzeitig zeigen diese Verbindungen keine erhöhte calcemische Aktivität, sind jedoch etwa so aktiv wie 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;. Somit sind diese Homo-Vitamin D Verbindungen durch ein hohes Verhältnis von antineoplastischer zu calcemischer Aktivität charakterisiert. Aufgrund dieser neuen und erstrebenswerten biologischen Eigenschaft würden diese Seitenketten-Homo- Verbindungen als überlegenere therapeutische Mittel zur Behandlung von malignen Krankheiten fungieren.
Zur Behandlung der menschlichen Leukämie werden die erfindungsgemäßen Homo-Vitamin D Verbindungen den Betreffenden in Dosen verabreicht, die ausreichen, um die Differenzierung von leukämischen Zellen zu Makrophagen zu induzieren. Geeignete Dosismengen sind von 0.2 ug bis 5 ug pro Tag, wobei es sich versteht, daß diese Dosen auf die Schwere der Krankheit oder die Reaktion oder den Zustand des Betreffenden abgestimmt werden können, so wie es sich nach dem Stand der Technik versteht.
Für Behandlungszwecke können die Dosisformen der Verbindungen durch ihre Kombination mit einem nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden, so wie es im Stand der Technik hinlänglich bekannt ist. Solche Träger können entweder fest oder flüssig sein wie beispielsweise Maisstärke, Laktose, Saccharose, Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl und Wasser. Wenn ein fester Träger verwendet wird, kann es sich bei den Verabreichungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen um Tabletten; Kapseln, Pulver oder Pastillen handeln. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, können die Verabreichungsformen Weich-Gelatinekapseln oder Sirup oder flüssige Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen sein. Die Verabreichungsform kann auch Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Benetzungs- oder Emulgierungsmittel und Lösungspromoter enthalten. Sie können auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten.
Es versteht sich, daß, wenngleich Dosisbereiche angegeben werden, die spezielle an einen Wirt zu verabreichende Dosis abhängt vom speziellen, zu behandelnden Krankheitszustand, den in einem besonderen Fall angestrebten Ergebnissen, der Physis des Wirts wie auch von anderen den Fachleuten von der therapeutischen Verwendung solcher medizinischer Mittel geläufigen Faktoren.
Die Verbindungen können vorteilhafterweise durch Injektion, oder durch intravenöse Infusion von geeigneten sterilen Lösungen oder in Form von oralen Dosen über den Verdauungskanal verabreicht werden.

Claims

1. Verbindung der Formel

worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl bedeuten und R&sub4; und R&sub5; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen oder gemeinsam eine Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bilden.

2. Verbindung nach Anspruch 1 worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff und R&sub4; und R&sub5; Wasserstoffatome bedeuten.

3. Verbindung nach Anspruch 2 in kristalliner Form.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff bedeuten und R&sub4; und R&sub5; zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung darstellen.

5. Verbindung nach Anspruch 4 in kristalliner Form.

6. Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, worin die ²² Bindung sich in der E-Konfiguration befindet.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine Verbindung wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.

8. Verbindung der Formel

worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl bedeuten und R&sub4; und R&sub5; Wasserstoffatome oder gemeinsam eine Kohlenstoff- Kohlenstoffbindung darstellen.

9. Verbindung der Formel

worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Benzoyl oder Methoxymethyl bedeuten.

10. Verbindung der Formel

worin R&sub1; und R&sub2; beide Acetyl bedeuten.

11. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung bei der Induzierung und Steigerung der Zelldifferenzierung in malignen Zellen.