DE3686981T2 - Produktion eines proteins. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protein.
• Das Vorhandensein einer Vielfalt physiologisch wirksamer Proteine wie etwa von Cytokinen und Peptidhormonen wurde festgestellt, und neuere gentechnologische Fortschritte eröffnen Wege zur Produktion dieser physiologisch wirksamen Proteine in großem Maßstab sowie zu ihrer klinischen Anwendung.
• Interleukin-2 [im folgenden als IL-2 bezeichnet; auch T-Zellenwachstumsfaktor (TCGF) genannt] ist ein Lymphokin, das produziert wird von T-Zellen nach Stimulierung durch u. a. ein Lektin oder Alloantigen [Science 193, 1007 (1976)].
• Durch den Einsatz von IL-2 wurde bislang eine große Zahl an Klonen von T-Killerzellen oder T-Helferzellen und auch natürlichen Killerzellen erhalten [z. B. Nature, 268, 154 (1977)]. Neben dieser direkten Anwendung beim Klonieren von T-Zellen oder natürlichen Killerzellen kann die Verwendung von IL-2 zur selektiven in vitro-Proliferation von antigenspezifischen T-Killerzellen führen, die ein bestimmtes spezielles Antigen, zum Beispiel ein Tumorantigen, erkennen und zerstören können. Durch Einbringen von auf diese Weise vermehrten tumorspezifischen T-Killerzellen in Tiere, ist es möglich, das Tumorwachstum zu kontrollieren oder zu hemmen [The Journal of Immunology 125. 1904 (1980)].
• Diese experimentellen Befunde legen die mögliche Nutzung von IL-2 als Antitumormittel nahe. Ferner ist bekannt, daß IL-2 die Funktion der T-Helferzellen bei nackten Mäusen mit fehlenden Thymusfunktionen wiederherstellt [European Journal of Immunology 10, 719 (1980)], und die Induktion von T-Killerzellen gegen allogene Zellen wiederherstellt [Nature 284, 278 (1980)], und deswegen kann erwartet werden, daß IL-2 bei der Behandlung von immunbedingten Krankheiten brauchbar ist.
• Interferon-α (im folgenden als IFN-α bezeichnet) und Interferon-γ (im folgenden als IFN-γ bezeichnet) sind Lymphokine, die durch virus- oder Nucleinsäure-aktivierte Lymphocyten produziert werden, sind biologisch insofern wirksam als sie auf Zellen wirken und diese in einen antiviralen Zustand bringen, und somit eine bedeutende Rolle im phylaktischen System oder Onkoimmunsystem spielen.
• Derartige Proteine wie diese Cytokine können als natürlich vorkommende Substanzen nur in sehr begrenzten Mengen erhalten werden. Neuere Fortschritte in der DNA-Rekombinationstechnik eröffneten jedoch den Weg zur Gewinnung biologisch wirksamer Proteine aus Kulturen derjenigen Stämme von Escherichia coli usw., die jeweils Expressionsvektoren mit Genen für die darin eingesetzten Proteine tragen [zu IL-2: Nature 302, 305 (1983), und Nucleic Acids Research 11, 4307 (1983); zu IFN-α: Journal of Interferon Research 1, 381 (1981); zu IFN-γ: Nature 295, 503 (1982)].
• Da die Protein-Biosynthese, ob sie nun in einem Eukaryonten oder in einem Prokaryonten stattfindet, mit dem Codon der messenger-RNA AUG beginnt, das Methionin entspricht, ist es möglich, daß das Produktprotein möglicherweise entweder eine molekulare Spezies mit einem Methionin-Rest am N-terminalen Ende sein kann oder eine molekulare Spezies ohne einen solchen Rest oder eine Mischung aus diesen beiden. Tatsächlich ist zum Beispiel bekannt, daß in Escherichia coli der Terminus vieler Zellproteine Methionin ist [Conn und Stumpf, Outlines of Biochemistry, 4. Aufl., John Wiley & Sons (1976)], und daß der Initiationsfaktor IF-3 von Escherichia coli sowohl die molekulare Spezies mit einem Methionin-Rest am N-terminalen Ende als auch diejenige ohne diesen Rest umfaßt [Hoppe-Seylers Zeitschrift für Physiologische Chemie 354, 1415 (1973)]. Was die Proteine betrifft, die in Escherichia coli unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik produziert werden, so ist bekannt, daß der Prozentanteil Addition des Methionin-Rests an den N-Terminus bei IFN-α etwa 50% beträgt [Journal of Interferon Research 1, 381 (1981) und sogar 100% beim humanen Wachstumshormon [Nature 293, 408 (1981)]. Allerdings wurden bislang keine Fälle der Kontrolle des Prozentanteils der Addition des Methionin-Rests bei solchen Proteinen bekannt.
• Im Zuge ihrer Untersuchungen, betreffend das Verfahren zur Herstellung des IL-2-Proteins unter Verwendung von Escherichia coli-Stämmen, in die das IL-2-Gen eingebracht worden war, fanden die Erfinder, daß das in Escherichia coli produzierte IL-2-Protein zwei molekulare Spezies umfaßt, nämlich ein IL-2 ohne einen N-terminalen Methionin-Rest, d. h., eine molekulare Spezies, die mit einem Alanin-Rest als N-terminale Aminosäure beginnt [Ala-IL-2], sowie eine molekulare Spezies, bei der ein Methionin-Rest am N-terminalen Ende angefügt ist, und die daher mit einem Methionyl-Alanin-Rest beginnt [Met-Ala-IL-2], wobei der Gehalt an letzterer viel höher ist als der der ersteren.
• In gleicher Weise wurde für in Escherichia coli produziertem IFN-α und IFN-γ gefunden, daß jedes eine Mischung aus einer molekularen Spezies ist, deren N-Terminus mit einem Cystein- Rest beginnt [Cys-IFN-α bzw. Cys-IFN-γ], sowie einer molekularen Spezies, bei der ein Methionin-Rest am N-terminalen Ende angefügt ist, und die daher mit einem Methionyl-Cystein-Rest beginnt [Met-Cys-IFN-α bzw. Met-Cys-IFN-γ], wobei letztere 5-50% ausmacht.
• Diejenigen Proteine, die einen Methionin-Rest am N-terminalen Ende aufweisen, sollten in ihrer biologischen Wirkung den entsprechenden Proteinen vom natürlich vorkommenden Typ gleichen, sind aber in jedem Falle von letzteren verschiedene Substanzen. Daher sind die bekannten Methoden zur Herstellung von Proteinen, die die jeweiligen Aminosäure- Sequenzen des natürlich vorkommenden Typs aufweisen, nicht völlig zufriedenstellend.
• Die vorliegende Erfindung liefert eine Verbesserung bei einem Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivieren von Escherichia coli mit einem Expressionsvektor, der ein Strukturgen für das stromabwärts vom Translationsstartcodon gelegene Protein enthält, umfassend das Kultivieren dieser Escherichia coli in einem Medium, das (1) eine Quelle für Eisen-Ionen, eine Quelle für Mangan-Ionen oder eine Mischung derselben, und (2) eine Stickstoff-Quelle natürlichen Ursprungs enthält, um die Ausbeute an Methionin-freiem Protein, entsprechend dem Startcodon der Translation ATG am N-terminalen Ende zu erhöhen.
• Erwähnt als das vorstehend erwähnte Protein sei eine Auswahl physiologisch wirksamer Proteine, zum Beispiel Cytokine wie etwa Interferone (z. B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ), Interleukine (z. B. Interleukin-1, IL-2), B-Zellenwachstumsfaktor (BGF), B-Zellendifferenzierungsfaktor (BDF) Makrophagenaktivierungsfaktor (MAF), Lymphotoxin (LT), Tumornekrosefaktor (TNF); Transformationswachstumsfaktor (TGF-α); Peptidproteinhormone wie etwa Erythropoetin, Epidermiswachstumsfaktor, Insulin und humanes Wachstumshormon; pathogene mikrobielle Antigenproteine wie etwa Hepatitis B-Virus-Antigen, Influenzavirus-Antigen, Maul- und Klauenseuchevirus-Antigen und Malariaparasiten-Antigen; Enzyme wie etwa Peptidasen (z. B. Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase, Serratiopeptidase) und Lysozym; und Serumproteine wie etwa Humanserumalbumin (HSA).
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Vorteil in den Fällen angewandt werden, in denen IL-2, IFN-α und IFN-γ u. a. durch Kultivieren bestimmter Escherichia coli-Stämme produziert werden.
• Die Bezeichnung "IL-2", wie hierin verwendet, bezieht sich auf irgendeine Spezies, die die gleichen biologischen oder immunologischen Wirkungen wie natürliches Human-IL-2 besitzt, zum Beispiel IL-2-rezeptorbindende oder Anti-IL-2- antikörperbindende Fähigkeit. Bei diesen Spezies kann es sich zum Beispiel um ein Polypeptid handeln, das die in Fig. 1 [Polypeptid (I)] gezeigte Aminosäure-Sequenz aufweist, oder ein Fragment desselben, umfassend den einen oder anderen Teil der Aminosäure-Sequenz, wie sie für die biologische oder immunologische Wirkung von Polypeptid (I) erforderlich ist, wie z. B. ein Fragment von Polypeptid (I), dem eine Aminosäure am N-terminalen Ende fehlt [EPC (Offenlegung) Nr. 91539] oder 4 Aminosäuren (japanische Patentanmeldung Nr. 58-235638, eingereicht am 13. Dezember 1983 und offengelegt unter der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 126088/1985), oder ein Fragment von Polypeptid (I), dem mehrere Aminosäuren am C-terminalen Teil fehlen. Weiterhin kann es sich bei diesen Spezies um ein Polypeptid handeln, das ansonsten das gleiche wie das obige Polypeptid (I) ist, dem aber zum Teil die konstituierenden Aminosäuren des Polypeptids (I) fehlen, oder das eine oder mehrere Aminosäuren enthält, die sich von der ursprünglich im Polypeptid (I) auftretenden Aminosäure oder den Aminosäuren unterscheiden, wie etwa ein Analogon des Polypeptids (I), das einen Serin-Rest anstelle des Cystein-Rests Nr. 125 enthält [japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 93093/1984]. Die vorstehend erwähnten Polypeptide liegen vorzugsweise in nicht-glycosylierter Form vor.
• Die Bezeichnung "IFN-α", wie hierin verwendet, bezieht sich auf irgendeine Spezies, die die gleichen biologischen oder immunologischen Wirkungen wie natürliches Human-IFN-α besitzt, zum Beispiel IFN-α-rezeptorbindende oder Anti-IFN-αantikörperbindende Fähigkeit. Ein Beispiel ist ein Polypeptid, das die bin Fig. 3 [Polypeptid (II)] gezeigte Aminosäure-Sequenz besitzt. Weiterhin kann es sich bei dieser Spezies um ein Fragment handeln, das eine teilweise Aminosäure-Sequenz aufweist, wie sie für die biologische oder immunologische Wirkung von IFN-α erforderlich ist, wie z. B. ein Fragment von Polypeptid (II), dem mehrere Aminosäuren am N-terminalen Teil oder mehrere Aminosäuren am C-terminalen Teil fehlen. Des weiteren kann es sich um ein Polypeptid handeln, das ansonsten das gleiche wie das obige Polypeptide (II) ist, dem aber zum Teil die konstituierenden Aminosäuren des Polypeptids (II) fehlen, oder das eine oder mehrere Aminosäuren enthält, die sich von der ursprünglich im Polypeptid (II) auftretenden Aminosäure oder den Aminosäuren unterscheiden. Besonders bevorzugt darunter ist IFN-αA.
• Die Bezeichnung "IFN-γ", wie hierin verwendet, bezieht sich auf irgendeine Spezies, die die gleichen biologischen oder immunologischen Wirkungen wie natürliches Human-IFN-γ besitzt, zum Beispiel IFN-γ-rezeptorbindende oder Anti-IFN-γantikörperbindende Fähigkeit. Beispiele sind das in Fig. 4 gezeigte Polypeptid (III), das 146 Aminosäuren umfaßt, sowie verschiedene Fragmente des Polypeptids (III). Spezielle Beispiele für derartige Fragmente sind eine molekulare Spezies mit Defizit am N-Terminus, der bis zu 4 Aminosäuren am N-terminalen Teil von Polypeptid (III) fehlen, sowie eine molekulare Spezies mit Defizit am C-Terminus, die entsteht durch Spaltung des Polypeptids (III) oder einer entsprechenden molekularen Spezies mit Defizit am N-Terminus an einer Stelle, die sich nicht vor dem 131. Aminosäure-Rest befindet. Außerdem kann das oben erwähnte IFN-γ ein Analogon davon sein, das einen Serin- oder Threonin-Rest anstelle eines Cystein-Rests im obigen Polypeptid enthält. Unter anderen ist das Polypeptid (III) bevorzugt.
• Das für das Protein codierende Strukturgen kann irgendeine DNA sein, entweder natürlichen Ursprungs oder synthetisch, die für die Aminosäure-Sequenz des obigen Proteins codiert.
• So sei zum Beispiel für IL-2 eine DNA erwähnt, die die in Fig. 2 gezeigte Basensequenz besitzt [DNA (IV), die für die in Fig. 1 gezeigte Aminosäure-Sequenz codiert]; für IFN-α eine DNA [DNA (V); z. B. japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 79897/1982], die für die in Fig. 3 gezeigte Aminosäure-Sequenz (IFN-QA) codiert; und für IFN-γ eine DNA [DNA (VI); z. B. japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 189197], die für die in Fig. 4 gezeigte Aminosäure-Sequenz codiert.
• Das oben erwähnte Strukturgen (DNA) befindet sich stromabwärts vom Translationsstartcodon ATG. Dieses Gen kann stromabwärts von ATG entweder in direkter Verbindung damit vorliegen oder über einen Spacer, der nicht exprimiert werden kann, oder irgendein anderes Strukturgen, das zwischen ATG und diesem Gen auftritt. Besonders bevorzugt ist, wenn ATG und das Strukturgen direkt miteinander verbunden sind.
• Vorzugsweise weist das oben erwähnte Gen (DNA) stromaufwärts einen Promotor auf. Dieser Promotor kann irgendeiner der Promotoren λPL oder λPR sein, die an der Vermehrung der λ-Phage beteiligt sind, unter anderen der Tryptophan(trp)- Promotor, der Lactose(lac)-Promotor, der Protein-Kettenverlängerungsfaktor-Tu(tuf B)-Promotor und der recA-Promotor. Insbesondere der λPL- und der trp-Promotor können in der Praxis der vorliegenden Erfindung mit Vorteil verwendet werden.
• Obiges Gen und obiger Promotor werden im allgemeinen in einen Vektor insertiert, um einen Expressionsvektor zu ergeben. Als Plasmid für die Gewinnung des Vektors zum Beispiel wird am häufigsten von ColE1 abgeleitetes pBR322 verwendet [Gene 2, 95 (1977)], doch kann auch irgendein anderes Plasmid verwendet werden, das bei der Replikation in Escherichia coli aufrechterhalten werden kann. Beispiele sind pBR313 [Gene 2 75 (1977)], pBR324 und pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pBR327 und pBR328 [Gene 9, 287 (1980)], pKY2289 [Gene 3, 1 (1978)], pKY2700 [Seikagaku (Biochemistry), 52, 770 (1980)], pACYC177 und pACYC184 [Journal of Bacteriology 134, 1141 (1978)] und pRK248, pRK646 und pDF41 [Methods in Enzymology 68, 268 (1979)].
• Von Bakteriophagen abgeleitete Vektoren, zum Beispiel von X-Phagen abgeleitete Vektoren der Reihe λgt wie etwa λgt·λC [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 71, 4579 (1974)], λgt·λB [ebenda 72, 3416 (1975)] und λDam [Gene 1, 255 (1977)], Charon-Vektoren [Science 196, 161 (1977); Journal of Virology 29, 555 (1979)], sowie filamentartige, von Phagen abgeleitete Vektoren können ebenfalls als Expressionsvektoren verwendet werden.
• Der oben erwähnte Expressionsvektor läßt sich mit Hilfe einer geeigneten bekannten Methode aufbauen [z. B. Nature 302, 305 (1983); Nucleic Acids Research 11, 4307 (1983); japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 79897/1982; japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 18197/1983;].
• Als Wirt, in den das Expressionsplasmid mit einem insertierten Strukturgen für ein Protein eingeführt werden soll, wird ein Stamm von Escherichia coli verwendet, und ein von Escherichia coli K-12 abgeleiteter Stamm wird vom Gesichtspunkt der Handhabung und der Sicherheit besonders bevorzugt. Beispiele für die von Escherichia coli K-12 abgeleiteten Stämme, die mit Vorteil verwendet werden, sind die Stämme 294, RR-1, DH-1, N4830 und C-4.
• Der Stamm 294 ist ein bekannter Stamm [Proceedings of the National Academy of Sciences USA 73 4174 (1976)] und wurde hinterlegt beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Hinterlegungsnummer IFO-14171.
• Der Stamm RR-1 wird beschrieben in Gene 2, 75 (1977), der Stamm DH-1 in Nature 217, 1110 (1968), und der Stamm N4830 in Cell 25 713 (1981). Mit dem temperaturempfindlichen cI-Repressor im Wirt ist der Stamm N4830 besonders brauchbar, wenn XPL als Expressionspromotor verwendet wird, und er ist zu beziehen durch Pharmacia P-L Biochemicals.
• Der Stamm C-4 ist beim IFO unter IFO-14421 hinterlegt und beim FRI unter FERM BP-966.
• Der für die Praxis der vorliegenden Erfindung zu verwendende Escherichia coli-Stamm kann erzeugt werden durch Transformation eines Escherichia coli-Wirtsstammes mit einem Expressionsvektor, der das Strukturgen für ein Protein enthält, und die Transformation kann durchgeführt werden mit Hilfe der beschriebenen Methoden, zum Beispiel in Journal of Molecular Biology 53, 159 (1970), Methods in Enzymology 68, 253 (1979), Gene 3, 279 (1978), und Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 69, 2110 (1972).
• Gemäß vorliegender Erfindung wird obiger Escherichia coli- Stamm in einem Medium kultiviert, das mit einer Quelle für Eisen-Ionen und/oder Mangan-Ionen ergänzt ist.
• Bezüglich der Quelle für Eisen-Ionen und der Quelle für Mangan-Ionen, die dem Medium zuzusetzen sind, bedeutet Quelle für Eisen-Ionen eine Substanz, die in der Lage ist, beim Auflösen Eisen-Ionen zu liefern, oder eine Substanz, die in Form von Eisen-Ionen eingesetzt werden kann. Beispiele sind Eisen-Salze. Bevorzugt sind anorganische Salze von zweiwertigem oder dreiwertigem Eisen [z. B. Eisen(II)chlorid, Eisen(III)-chlorid, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)sulfat, Eisen(III)-phosphat, Eisen(III) -nitrat], worunter die Mineralsäuresalze von dreiwertigem Eisen (z. B. Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat) meistbevorzugt sind.
• Quelle für Mangan-Ionen bedeutet eine Substanz, die in der Lage ist, beim Auflösen Mangan-Ionen zu ergeben, oder eine Substanz, die in Form von Mangan-Ionen eingesetzt werden kann. Beispiele für derartige Substanzen sind Mangan-Salze, vorzugsweise anorganische Mangan-Salze (z . B. Mangansulfat, Manganchlorid, Mangancarbonat, Manganphosphat), meistbevorzugt sind Mineralsäuresalze von Mangan (z. B. Mangansulfat, Manganchlorid).
• Eisen-Ionenquelle und Mangan-Ionenquelle werden entweder alleine oder in Kombination verwendet. Vorzugsweise werden sie in Form von wäßrigen Lösungen zugesetzt.
• Eisen-Ionenquelle und Mangan-Ionenquelle werden jeweils in Konzentrationen von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ mol/l, vorzugsweise 2·10&supmin;&sup5; bis 5·10&supmin;&sup4; mol/l zugesetzt. Bei Verwendung in Kombination werden sie jeweils in einer Konzentration innerhalb des obigen Bereichs zugegeben.
• Das Medium, ergänzt mit Stickstoff-Quellen natürlichen Ursprungs, das zur Kultivierung des obigen Escherichia coli-Stammes verwendet werden soll, ist ein Medium, das hergestellt wird durch Ergänzen eines bekannten Basismediums mit einer Stickstoff-Quelle, erhalten aus einer natürlich vorkommenden Substanz wie etwa Casaminosäuren, Pepton, Hefeextrakt oder Malzextrakt. Die Stickstoff-Quelle wird gewöhnlich in einer Konzentration von 1 g/l bis 50 g/l zugesetzt. Einige für die Praxis der vorliegenden Erfindung geeignete Beispiele für ein solches Medium sind in Tabelle 1 gegeben. Tabelle 1 Beispiele für Medien, die zur Verwendung geeignet sind Bestandteil Modifiziertes M-9-Medium Glucose Casaminosäuren
• Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, besonders wenn Escherichia coli ein Expressionsplasmid beherbergt und einen Trp-Promotor aufweist, in einer Weise, daß Escherichia coli in ein Medium von pH 4,8 bis 6,0 eingeimpft und unter Aufrechterhaltung dieses Bereichs kultiviert wird. Mehr zu empfehlen ist ein pH-Bereich von 5,0 bis 5,8; ein pH-Wert von 5,5 ist der Kultivierung besonders förderlich.
• Nach ausreichendem Wachstum jedoch können die Kultivierungsbedingungen aus diesem pH-Bereich herausbewegt werden, z. B. hin zu saureren Bedingungen.
• Der pH wird mit Hilfe einer anorganischen Base oder einer Mineralsäure eingestellt bevor oder nachdem das Medium vorbereitet und sterilisiert ist. Bei der Kultivierung von E. coli kann die pH-Einstellung erforderlich sein, um den pH innerhalb des angegebenen Bereichs zu halten. Da der pH während der Kultivierung gewöhnlich fällt, wird der pH eingestellt durch Zugabe einer anorganischen Base, z. B. Ammoniak, Natriumhydroxid und Natriumcarbonat; falls gewünscht, können jedoch auch Mineralsäuren wie etwa Schwefelsäure zugesetzt werden. Von diesen Substanzen ist Ammoniakwasser besonders vorzuziehen, da es eine Stickstoff-Quelle für die Medien darstellt.
• Zum Beispiel wird für Transformanten, die ein Expressionsplasmid beherbergen und einen Trp-Promotor aufweisen, ein Reagens eingesetzt, das effiziente Funktion des Promotors bewirkt; zum Beispiel kann 3-β-Indolylacrylsäure zugesetzt werden.
• Ist der Wirt ein auxotropher Organismus, werden benötigte Aminosäure oder Aminosäuren (z. B. L-Lysin, L-Arginin, L-Methionin, L-Leucin, L-Prolin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Tryptophan) vorzugsweise auf eine Konzentration von etwa 10 bis 1000 mg/l zugesetzt. Je nach Notwendigkeit können während der Kultivierung zusätzlich Glucose, Casaminosäuren und weitere Bestandteile zugegeben werden. Zur selektiven Vermehrung des rekombinanten Escherichia coli-Stamms kann weiterhin ein Reagens, demgegenüber der Stamm resistent ist, zum Beispiel Tetracyclin, zugesetzt werden - je nach im Plasmid verbleibendem Gen für die Arzneimittelresistenz oder dergleichen.
• Zur Kultivierung im großen Maßstab werden vorstehend erwähnte Eisen-Ionenquelle oder Mangan-Ionenquelle im allgemeinen vorher in angemessener Konzentration zugesetzt. Eine solche Ionenquelle kann auch dem Keimkulturmedium zugesetzt werden.
• Die Kultivierung wird im allgemeinen bei 15-45ºC durchgeführt. Bei Stämmen zum Beispiel, die den λPR- oder λPL-Promotor und den temperaturempfindlichen Repressor tragen, ist die Proliferation bei 25-35ºC, gefolgt von Hochfahren auf 42ºC für die Genexpression vorteilhaft. Bei Stämmen, die andere Promotoren tragen, kann hohe Produktivität erreicht werden, indem die Temperatur vom Beginn der Vermehrung bis etwa zu deren Mittelstadium bei etwa 37ºC gehalten und dann die Temperatur mit der Proliferation abgesenkt wird, wonach bei 20-30ºC gehalten wird.
• Die Kultivierung wird im allgemeinen unter Belüften und Rühren durchgeführt. Vorteilhaft ist die Kultivierung unter Beibehaltung einer Sauerstoff-Konzentration im Medium von nicht weniger als 5% (Vol./Vol) der Sauerstoff-Konzentration bei Sättigung, da in diesem Falle eine höhere Ausbeute an gewünschtem Protein erzielt werden kann.
• Das so erzeugte Protein kann mit Hilfe einer bekannten Methode analysiert werden.
• Zum Beispiel kann zur Analyse von IL-2 eine IL-2-abhängige Zellinie verwendet werden. Da bekannt ist, daß Human-IL-2 die Vermehrung von Ratten-, Maus- und einigen anderen IL-2-abhängigen Zellinien wie auch menschlichen Zellinien fördert [Immunological Reviews 51, 257 (1980)], können nicht nur menschliche IL-2-abhängige Zellinien sondern auch IL-2-abhängige Zellinien von Ratten oder Mäusen verwendet werden [Journal of Immunology 130, 981 und 988 (1983)].
• Insbesondere IL-2-abhängige Maus-Zellinien können durch Passage über lange Zeiträume stabil gehalten werden und liefern Analysenergebnisse hoher Reproduzierbarkeit.
• Die in dieser Patentschrift gegebenen Daten zur Gesamtausbeute an IL-2 sind Daten, die mit Hilfe des Verfahrens gemessen wurden, bei dem IL-2-abhängige Zellen eingesetzt werden und die Aufnahme an radioaktivem Thymidin als Index genommen wird [Biochemical and Biophysical Research Communications 109, 363 (1982)].
• Die Ausbeute an Ala-IL-2 wurde bestimmt durch Extrahieren von IL-2 aus Zellen mittels 7 M Guanidin-hydrochlorid, Dialysieren des Extrakts, Unterwerfen des Dialysats einer später hierin noch zu erwähnenden FPLC (fast protein liquid chromatography) zur Abtrennung einer Ala-IL-2-Fraktion und einer Met-Ala-IL-2-Fraktion, Bestimmen der IL-2-Aktivität beider Fraktionen mit Hilfe der vorstehend erwähnten Methode, Berechnen des Anteils an Ala-IL-2 und Multiplizieren der Gesamtausbeute an IL-2 mit diesem Anteil.
• Gereinigte Proben wurden quantitativ bestimmt auf der Grundlage des Verhältnisses zwischen Absorptionswerten, die bei 280 nm für die mittels FPLC isolierten Proteine gemessen wurden.
• Die IFN werden entweder mit Hilfe der Antiviralassay-Methode [Journal of Virology 37, 755 (1981)] oder der Enzym-Immunoassay-Methode [Journal of Immunology 80 55 (1985)] analysiert. Der Anteil an IFN-Spezies mit N-terminalem Methionin relativ zum gesamten gebildeten IFN wird dadurch bestimmt, daß das IFN-Protein, das aus Zellen extrahiert und mittels geeigneter Methoden gereinigt wurde, zum Beispiel eine gereinigte Probe IFN-αA, einer FPLC unterworfen wird, um so die molekularen Spezies mit N-terminalem Methionin und die molekularen Spezies ohne N-terminales Methionin zu trennen, gefolgt von einer Berechnung auf der Grundlage des Verhältnisses der Absorption bei 280 nm zwischen diesen. Im Falle des IFN-γ werden beide Spezies quantitativ erfaßt durch Bestimmung des Gehalts an N-terminalem Methionin mit Hilfe der Dansylierungsmethode oder durch Verwendung eines Peptid- Sequencers.
• Bei der Extraktion des gemäß vorliegender Erfindung erzeugten Proteins aus kultivierten Zellen werden die Zellen nach dem Kultivieren geerntet und in einem Puffer suspendiert, der ein Protein-Denaturierungsreagens wie etwa Guanidinhydrochlorid enthält, und nach Rühren an einem kühlen Ort wird durch Zentrifugieren ein Überstand gewonnen, der das Protein enthält. Nach einem anderen Verfahren werden die Zellen in einem Puffer suspendiert und durch Beschallung, Lysozym-Behandlung und/oder Tiefgefrieren und Tauen aufgebrochen, wonach durch Zentrifugieren ein Überstand gewonnen wird, der das Protein enthält. Es kann auch irgendeine andere Methode angewandt werden.
• Das Protein kann mit Hilfe einer geeigneten Kombination an sich bekannter Trennungs- und Reinigungsmethoden aus dem oben erwähnten Überstand isoliert und gereinigt werden. Beispiele für derartige bekannte Trennungs- und Reinigungsmethoden sind Methoden, bei denen Löslichkeitsunterschiede ausgenutzt werden wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung; Methoden, bei denen hauptsächlich Molekulargewichtsunterschiede ausgenutzt werden wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; Methoden, bei denen Unterschiede in der elektrischen Ladung genutzt werden wie etwa Ionenaustauschchromatographie; Methoden, die auf spezifischer Affinität beruhen, wie z. B. die Affinitätschromatographie; Methoden, die auf unterschiedlicher Hydrophobie beruhen, wie etwa die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; sowie Methoden, bei denen Unterschiede im isoelektrischen Punkt genutzt werden wie etwa isoelektrisches Fokussieren. Speziell das Human-IL-2-Protein, das hohe Hydrophobie aufweist, kann sehr wirksam durch hydrophobe Säulenchromatographie gereinigt werden, insbesondere durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule vom Umkehrphasentyp. Bei IFN-α und IFN-γ ist diejenige Reinigungsmethode sehr effektiv, bei der monoklonale Antikörper eingesetzt werden, die spezifisch an die jeweilige IFN-Spezies binden können.
• Ist das obige IL-2-Protein eine Mischung aus Ala-IL-2 und Met-Ala-IL-2, so kann Ala-IL-2 gewünschtenfalls mit Hilfe der Trennungsmethode isoliert werden, die auf unterschieden im isoelektrischen Punkt beruht, wie sie zum Beispiel von der gleichen Anmelderin der vorliegenden Anmeldung offenbart wurde in PCT/JP84/00460 (Datum der internationalen Anmeldung: 26. September, 1984).
• Als Trennungsmethode, die auf Unterschieden im isoelektrischen Punkt beruht, kann irgendeine Methode zur Trennung von Proteinen angewandt werden, die sich im isoelektrischen Punkt um etwa 0,01-0,2 voneinander unterscheiden, zum Beispiel Dichtegradientenelektrofokussierung mit Hilfe von Ampholinen, Gelelektrofokussierung, Elektrophorese bei konstanter Geschwindigkeit oder eine ähnliche Methode zur Protein-Elektrophorese in einem elektrischen Feld, Chromatofokussierung, FPLC (fast protein liquid chromatography), pH-Gradienten-DEAE (Diethylaminoethyl) - und CM(Carboxymethyl)-Ionenaustauschsäulenchromatographie oder eine ähnliche Methode, um Proteine nacheinander von einer Säule zu eluieren, in der ein pH-Gradient erzeugt wird, oder irgendeine andere an sich bekannte Methode oder eine Kombination aus diesen. Die bei diesen Trennungsverfahren verwendeten Reagenzien und Geräte sind alle im Handel erhältlich und können ohne weiteres erstanden werden.
• Gewünschtenfalls kann auch eine Mischung aus Cys-IFN-α und Met-Cys-IFN-α zur Trennung der Komponenten voneinander behandelt werden.
• Die so gereinigten Proteine, die frei sind von N-terminalen Methionin-Resten, entsprechend dem Translationsstartcodon ATG, weisen die gleiche physiologische Wirkung auf wie die entsprechenden bekannten Proteine - wie z. B. die entsprechenden natürlich vorkommenden Proteine - und können als Pharmazeutika verwendet werden.
• Das Protein Ala-IL-2 kann - wie bekannte IL-2-Spezies - selektive in vitro-Vermehrung antigenspezifischer Killer- T-Zellen hervorrufen, die zum Beispiel Tumorantigene erkennen und zerstören können, oder natürlicher Killerzellen, die unabhängig von einer bereits erfahrenen Antigensensibilisierung Tumore abtöten können. Da gleichzeitiges Impfen mit dem IL-2 und Einbringen obiger Killerzellen in einen lebenden Organismus zu erhöhter Antitumoraktivität der Killerzellen führt, kann das Protein zur Prävention und Behandlung von Tumoren oder zur Behandlung immunbezogener Krankheiten bei Warmblütern (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Katze, Schwein, Pferd, Schaf, Rind und Mensch) verwendet werden.
• Zur Verwendung des obigen Ala-IL-2-Proteins als Prophylaktikum oder Therapeutikum gegen Tumore kann das Protein entweder parenteral oder oral zum Beispiel in Form von Injektionen oder Kapseln verabreicht werden, wie sie durch Verdünnung mit einem an sich bekannten Träger hergestellt werden. Außerdem kann es entweder alleine oder in Kombination mit Killer-T-Zellen oder natürlichen Killerzellen verwendet werden, die wie vorstehend beschrieben in vitro vermehrt wurden.
• Das oben erwähnte Ala-IL-2-Protein besitzt im wesentlichen die gleichen biologischen Wirkungen wie das bekannte, aus der Natur isolierte Human-IL-2 und kann daher in gleicher Weise wie letzteres verwendet werden. Da die Konstante für seine Dissoziation aus zellulären IL-2-Rezeptoren sehr klein ist, ist die Verabreichung des Proteins in sehr geringen Dosen ausreichend.
• IFN, das antivirale, Antitumor-, zellproliferationshemmende, immunpotenzierende und andere Wirkungen besitzt, kann unter anderem verwendet werden zur Behandlung viraler Infektionen und Tumoren bei Säugern (z. B. Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Maus, Ratte). Zur Verwendung des IFN als antivirales, Antitumor-, zellproliferationshemmendes oder immunpotenzierendes Mittel zum Beispiel wird das IFN mit einem an sich bekannten, pharmakologisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel gemischt und wird verabreicht in Form parenteraler Injektionen, beispielsweise durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion. Beim normalen Menschen liegt die tägliche Dosis im Bereich von etwa 100 000 bis 100 000 000 Einheiten, vorzugsweise etwa 1 000 000 bis 50 000 000 Einheiten. Bei nichtmenschlichen Säugern liegt die Dosis im Bereich von 2000 bis 2 000 000 Einheiten/kg/Tag, vorzugsweise etwa 20 000 bis 1 000 000 Einheiten/kg/Tag.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Human-IL-2.
• Fig. 2 zeigt ein Beispiel einer für Human-IL-2 codierenden DNA-Basensequenz.
• Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz von Human-IFN-αA.
• Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenz von Human-IFN-γ.
• Fig. 5 und Fig. 6 zeigen die Schemata zum Aufbau der Plasmide pTF1 bzw. pTB285, die im Bezugsbeispiel beschrieben sind.
BEISPIELE
• Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ausführlicher.
• Die in diesen Beispielen offenbarten Transformanten wurden unter den in Tabelle 2 angegebenen Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry und dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO) hinterlegt. Tabelle 2 Transformat Hinterlegt bei FRI IFO (Hinterlegungsdatum) Escherichia coli
Beispiel 1
• Ein 50 ml-Teil eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 50 mg/l Natrium-ampicillin und 15 mg/l Tetracyclin-hydrochlorid zu L-Medium (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bacto-yeast- Extrakt, 5 g/l Natriumchlorid), wurde geimpft mit Escherichia coli N4830/pTB285, erhalten in Bezugsbeispiel 1 (ii), gefolgt von Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Drehen und Schütteln. Die Kulturbrühe wurde in einen 5 l-Gefäßfermenter überführt, der 2,5 l modifiziertes M-9-Medium, ergänzt durch ein oder mehrere im einzelnen in Tabelle 3 angegebene Metallsalze enthielt, und die Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2,5 l/min, einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min und einer Temperatur von 30ºC begonnen. Im mittleren Stadium der Kultivierung, wenn die Vermehrung 1000 Klett-Einheiten erreicht hatte, wurde die Temperatur auf 42ºC hochgefahren, und nach 4 h fortgesetzter Inkubation wurden die Zellen geerntet und tiefgefroren. Bei jeder Kulturbrühe wurden die gefrorenen Zellen auf Ala-IL-2- Produktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse waren die in Tabelle 3 gezeigten. Tabelle 3 Auswirkung der Zugabe verschiedener Metall-Ionen Zugesetztes Metall-Ion 1) (mol) Ala-IL-2-Produktivität 2) 1) Die Metall-Ionen wurden jeweils in Form folgender Verbindungen zugesetzt: MnSO&sub4; · 4-6H&sub2;O, FeCl&sub3; · 6H&sub2;O, CuSO&sub4; · 5H&sub2;O, ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O, CaCl&sub2; · 2H&sub2;O und CoCl&sub2; · 6H&sub2;O. 2) Gegeben als Relativwert, wobei die Produktivität für den Fall ohne Zugabe von Metall-Ionen als 100 genommen wurde.
• Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, führte die Zugabe von Mn²&spplus; und/oder Fe³&spplus; zu einer deutlich erhöhten Ala-IL-2-Produktivität, wogegen die Zugabe anderer Ionenquellen (Cu²&spplus; Zn²&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus;) die Produktivität nicht weiter erhöhte.
Beispiel 2
• Der Stamm Escherichia coli N4830/pTB285 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in M-33-Medium, ergänzt durch Mn-Ionen in verschiedenen Konzentrationen vermehrt, und es wurden die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse erhalten. Tabelle 4 Auswirkung der Zugabe von Mangan-Ionen Ala-IL-2-Produktivität* *Die Produktivität für das Medium ohne Zugabe von Metallsalz wurde als 100 genommen.
Beispiel 3
• Der Stamm Escherichia coli N4830/pTB285 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in M-33-Medium, ergänzt durch Fe-Ionen in verschiedenen Konzentrationen vermehrt, und es wurden die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse erhalten. Tabelle 5 Auswirkung der Zugabe von Eisen-Ionen Ala-IL-2-Produktivität* *Die Produktivität für das Medium ohne Zugabe von Metallsalz wurde als 100 genommen.
Beispiel 4
• Ein 50 ml-Teil eines Flüssigmediums (pH 7,0), hergestellt durch Zugabe von 7 mg/l Tetracyclin-hydrochlorid zu L-Medium, wurde geimpft mit Escherichia coli DH1/pTF4 (japanische Patentanmeldung Nr. 225079/1983, eingereicht am 28. November 1983 und offengelegt unter der japanischen Patentveröffentlichungsnummer 115528/1985; Beispiel 3), gefolgt von Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Drehen und Schütteln. Die Kulturbrühe wurde in einen 5 l-Gefäßfermenter geimpft, der 2,5 l modifiziertes M-9-Medium oder das gleiche Medium, ergänzt durch 4·10&supmin;&sup4; mol FeCl&sub3;·6H&sub2;O und 4·10&supmin;&sup5; mol MnSO&sub4;·4-6H&sub2;O enthielt, und die Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2,5 l/min, einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min und einer Temperatur von 37ºC begonnen. Im Laufe der Kultivierung, wenn die Vermehrung 500 Klett-Einheiten erreicht hatte, wurde die Temperatur zu 30ºC geändert, und wenn die Vermehrung etwa 1000 Klett-Einheiten erreicht hatte, zu 25ºC. Nach 24stündiger Kultivierung wurden die Zellen geerntet und tiefgefroren und durch IL-2-Extraktion aus den Zellen auf Ala-IL-2-Produktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse waren die in Tabelle 6 gezeigten. Tabelle 6 Metall-Ion (mol) Ala-IL-2-Produktivität* *Die Produktivität für das Medium ohne Zugabe von Metallsalz wurde als 100 genommen.
Beispiel 5
• Sechs jeweils in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindliche 50 ml-Teile eines Flüssigmediums (pH 6,0), bei dem es sich um L-Medium enthaltend 50 mg/l Natrium-ampicillin handelte, wurde geimpft mit Escherichia coli N4830/pTB285, gefolgt von Inkubieren über Nacht bei 30ºC unter Drehen und schütteln. Die Kulturbrühe wurde zu 125 ml-Teilen in einen 2,5 l-Teil eines M-33-Mediums, enthaltend 50 mg/l Natrium-ampicillin [Medium (A)] und einen 2,5 l-Teil eines M-33-Mediums, enthaltend 50 mg/l Natrium-ampicillin, 8·10&supmin;&sup5; mol MnSO&sub4;·4-6H&sub2;O und 4·10&supmin;&sup4; mol FeCl&sub3;·6H&sub2;O [Medium (B)] geimpft, und die Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2,5 l/min, einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min und einer Temperatur von 30ºC begonnen, wobei der pH während der gesamten Kultivierung mit wäßrigem Ammoniak bei 6,5 gehalten wurde. Immer wenn die Glucose-Konzentration auf 0,5% oder darunter abnahm, wurden Glucose und Casaminosäuren jeweils in einer Menge entsprechend 1% zugesetzt. Wenn des weiteren die Vermehrung 1000 Klett-Einheiten erreicht hatte, wurde die Temperatur auf 42ºC angehoben. 4 h nach der Temperaturänderung war die Kultivierung beendet, jede Kulturbrühe wurde zentrifugiert, und die geernteten Zellen wurden auf -80ºC tiefgefroren und gelagert.
• Ein 12 g-Teil der gefrorenen Zellen von jeder Brühe wurde homogen in 100 ml eines Extraktionsmittels (pH 7,0) suspendiert, das 7 M Guanidin-hydrochlorid und 0,1 M Tris-HCl- Puffer enthielt. Nach einstündigem Rühren bei 4ºC wurde die Suspension 20 min lang mit 28 000 · g zentrifugiert, um einen Überstand zu ergeben.
• Jeder erhaltene Überstand wurde gegen 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) dialysiert und 10 min lang mit 19 000 · g zentrifugiert. Der erhaltene überstand wurde über eine DE52-Säule (DEAE-Cellulose, Whatman, Großbritannien; 50 ml Volumen) gegeben, die mit 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) äquilibriert war, um Protein-Adsorption zu bewirken. Durch Aufbauen eines linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0 bis 0,15 M NaCl, 1 l) wurde IL-2 unter Bildung aktiver Fraktionen eluiert.
• Eine jede oben erhaltene aktive Fraktion wurde unter Verwendung einer YM-5-Membran (Amicon, USA) auf 5 ml eingeengt, und das Konzentrat wurde einer Gelfiltration unterworfen unter Verwendung einer Sephacryl S-200-Säule (Pharmacia, Schweden; 500 ml Volumen), die mit 0,1 M Tris-HCl- (pH 8,5)/1 M NaCl-Puffer äquilibriert war. Die aktiven Fraktionen, jeweils etwa 30 ml, wurden mit Hilfe einer YM-5-Membran auf etwa 2,5 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde zur Adsorption auf eine Ultrapore RPSC-Säule (Altex, USA) gegeben, gefolgt von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wobei ein Trifluoressigsäure/Acetonitril-System als Elutionsmittel verwendet wurde. Ultrapore RPSC-Säule (4,6 · 75 mm); Säulentemperatur 30ºC; Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure/99,9% Wasser; Elutionsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure/99,9% Acetonitril; Elutionsprogramm: O Minuten (68% A + 32% B)/25 Minuten (55% A + 45% B)/35 Minuten (45% A + 55% B)/45 Minuten (30% A + 70% B)/48 Minuten (100% B); Elutionsgeschwindigkeit 0,8 ml/min; Erfassungswellenlänge 230 nm.
• Nach etwa 39 min Retentionszeit unter den obigen Bedingungen wurden bei jeder Kultur etwa 10 ml einer aktiven Fraktion aufgefangen.
• Eine jede der so erhaltenen Flüssigkeiten, enthaltend eine Mischung aus Ala-IL-2 und Met-Ala-IL-2, wurde lyophilisiert, und das Lyophilisat wurde in 5 ml 0,005 M Ammoniumacetat- Puffer (pH 5,0) gelöst und über eine Mono P-Säule für die FPLC (0,5 · 20 cm; Pharmacia) gegeben, die äquilibriert war mit 0,025 M Diethanolamin-hydrochlorid-Puffer (pH 9,4), wonach das auf der Mono P-Säule adsorbierte Protein mit 1% (Vol./Vol.) Pharmalite (8-10,5)/5,2% (Vol./Vol.) Polybuffer 96-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) eluiert wurde. Die FPLC wurde bei Raumtemperatur und einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h durchgeführt. Bei jeder Kultur wurde eine aktive Eluatfraktion mit 17 ml bis 19 ml aufgefangen und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterworfen, wobei ein Trifluoressigsäure/Acetonitril-System als Elutionsmittel zur Abtrennung des Polybuffers verwendet wurde. Ultrapore RPSC-Säule (1,0 · 25 cm, Altex); Säulentemperatur, Elutionsmittel A und Elutionsmittel B wie oben; Elutionsprogramm: 0 Minuten (55% A + 45% B)/4 Minuten (55% A + 45% B)/28 Minuten (42% A + 58% B)/38 Minuten (34% A + 66% B)/43 Minuten (20% A + 80% B)/44 Minuten (55% A + 45% B); Elutionsgeschwindigkeit 3,0 ml/min.
• Eine jede so erhaltene Ala-IL-2-Fraktion wurde lyophilisiert, um ein weißes Pulver zu ergeben.
• Das oben erwähnte Pulver, erhalten aus Medium (A) ohne Zusatz irgendeines Metallsalzes wog 1,53 mg, wogegen Medium (B) mit Zusatz von Metallsalz 6,31 mg Pulver ergab.
• Bei diesen beiden Proben wurde die N-terminale Aminosäure mit Hilfe des automatischen Edman-Abbauverfahrens unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequencers (Applied Biosystems Modell 470A) identifiziert, und es bestätigte sich, daß Ala 98% oder mehr ausmachte. Gleichzeitig bestätigte sich, daß andere Charakteristika der Proteinchemie (C-terminale Aminosäure, Analysen der Aminosäure-Zusammensetzung, Peptid-Kartierung) genau die gleichen waren.
Beispiel 6
• Der Stamm Escherichia coli 294 (ATCC 31446)/pLeIF-A-Trp2s [vgl. Beispiel 1 der EPC (Offenlegung) Nr. 43980], der ein insertiertes Expressionsplasmid mit einem für die in Fig. 3 gezeigte Aminosäure-Sequenz codierenden Human-IFN-αA-Gen trug, wurde in 50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 5 mg/l Tetracyclin-hydrochlorid zu L-Medium, geimpft, gefolgt von Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Drehen und Schütteln. Die Kulturbrühe wurde in einen 5 l-Gefäßfermenter überführt, der 2,5 l modifiziertes M-9-Medium, ergänzt mit einem oder zwei der in Tabelle 7 angegebenen Metalle enthielt. Die Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2,5 l/min, einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min und einer Temperatur von 37ºC begonnen. Bei einem Vermehrungsgrad von 500 Klett-Einheiten wurde die Temperatur auf 30ºC abgesenkt und weiter auf 25ºC bei 1000 Klett- Einheiten. Die Kultivierung wurde 24 h lang in dieser Weise durchgeführt. Immer wenn während der Kultivierung die Glucose-Konzentration auf 0,2% oder darunter abnahm, wurde Glucose jeweils in einer Menge von 1% zugesetzt. Nach der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, wodurch die Zellen geerntet wurden, die in 100 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 10% Sucrose, 0,2 M NaCl, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM Spermidin, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,2 mg/ml Lysozym, suspendiert wurden. Nach 1 h Rühren bei 4ºC wurde die Suspension 5 min lang auf 37ºC erwärmt und dann 40 s lang bei 0ºC in einem Beschallungsgerät (Altex, USA) weiterbehandelt. Das gebildete Lysat wurde 1 h lang mit 11 300 · g zentrifugiert, um 95 ml eines Überstands zu ergeben.
• Dieser Überstand (95 ml) wurde verdünnt mit 300 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), enthaltend 1 mM EDTA und 0,15 M NaCl (TEN), und die Verdünnung wurde auf eine Anti-IFN-αA-Säule (20 ml) gegeben.
• Nach ausreichendem Waschen der Säule mit TEN wurde IFN-αA eluiert mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1% Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries), wobei die aufgefangene aktive Fraktion auf pH 4,5 eingestellt und zur Adsorption auf eine CM Cellulose-Säule gegeben wurde. Nach ausreichendem Waschen der Säule wurde die Elution durchgeführt mit 0,025 M Ammoniumacetat-Puffer (pH 5,0) enthaltend 0,15 M NaCl. Die so aufgefangene aktive Fraktion wurde wiederum lyophilisiert, um ein Human-Leukocyten-IFN-αA-Pulver in der in nachstehender Tabelle angegebenen Menge zu ergeben.
• Eine jede so erhaltene Probe lieferte bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzige Bande und hatte ein Molekulargewicht von 19 000 ± 1000 und eine antivirale Aktivität von 2 bis 3·10&sup8; E/mg. Die erhaltene Probe wurde einer FPLC unterworfen unter Verwendung einer Mono P-Säule zur Chromatofokussierung mit Polybuffer pH 6,7 bis pH 5,5, wodurch-die Anteile der molekularen Spezies mit N-terminalem Methionin und der molekularen Spezies ohne dieses Methionin bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Somit ergab die Zugabe von Mangan- und/oder Eisen-Ionen eine Erzeugung von IFN-αA, das im wesentlichen frei war von molekularen Spezies, die N-terminales Methionin enthielten. Tabelle 7 Zugesetztes Metall-Ion (mol) Ausbeute an IFN-αA-Pulv. Anteil N-terminales Methionin enthaltender Spezies weniger als 0,5%
Beispiel 7
• Escherichia coli RR-1 (pRK248cIts, pRC231/TFN-900), die ein Expressionsplasmid mit einem für die in Fig. 4 gezeigte Aminosäure-Sequenz codierenden Human-IFN-γ-Gen trugen, das insertiert wurde wie beschrieben in Beispiel 8 der japanischen Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 189197/1983, wurde geimpft in 50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 50 mg/l Natrium-ampicillin und 10 mg/l Tetracyclin-hydrochlorid, gefolgt von Inkubieren über Nacht bei 30ºC unter Drehen. Die Kulturbrühe wurde in einen 5 l-Gefäßfermenter überführt, der 2,5 l M-33-Medium, ergänzt mit einem oder zwei der in Tabelle 8 angegebenen Metallsalze enthielt. Die Kultivierung wurde mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2,5 l/min, einer Rührgeschwindigkeit von 1000 U/min und einer Temperatur von 30ºC begonnen. Im logarithmischen Stadium, wenn sich die Vermehrung auf etwa 700 Klett-Einheiten belief, wurden Glucose und Casaminosäuren jeweils in einer Menge entsprechend einer Konzentration von 1% zugesetzt und gleichzeitig wurde die Inkubationstemperatur von 30ºC auf 42ºC angehoben, gefolgt von 4 h fortgesetzter Kultivierung. Immer wenn die Glucose-Konzentration bei 0,2% oder darunter lag, wurden Glucose und Casaminosäuren jeweils in einer Menge entsprechend einer Konzentration von 1% zugesetzt.
• Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, wodurch die Zellen geerntet wurden, die dann tiefgefroren und gelagert wurden.
• Nach Extraktion eines 100 g-Teils gefrorener Zellen aus jeder Kultur mit 300 ml 100 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,0), enthaltend 7 M Guanidin-hydrochlorid, folgte eine Zentrifugation, die einen Überstand ergab. Dieser Überstand wurde auf das 70fache verdünnt mit einem Puffer (im weiteren als P.B.S. bezeichnet), umfassend 137 mM Natriumchlorid, 27 mM Kaliumchlorid, 8 mM Dinatriumphosphat und 147 mM Mononatriumphosphat, und die Verdünnung wurde noch einmal zentrifugiert, um einen klaren, durchsichtigen Überstand zu ergeben. Dieser Überstand wurde auf eine Säule (50 ml) mit monoklonalem Antikörper [γ2-11.1 MoAb; japanische Patentveröffentlichung (Offenlegung) Nr. 80646/1984] gegeben, und nach ausreichendem Waschen wurde die Elution durchgeführt mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 2 M Guanidinhydrochlorid. Es wurde eine aktive Fraktion aufgefangen und des weiteren auf eine Säule mit Sephacryl S-200 (Pharmacia) gegeben und dann auf eine Sephadex G-25-Säule, und die aktive Fraktion wurde jeweils aufgefangen, wodurch eine gereinigte IFN-γ-Probe erhalten wurde. Die Ausbeuten aus den jeweiligen Medien sind in Tabelle 8 gezeigt.
• Jede erhaltene Probe zeigte eine IFN-γ-Reinheit von nicht weniger als 95% und eine antivirale Aktivität von 3 bis 4·10&sup6; IE/mg. Die Probe wurde dansyliert, und das Dansylmethionin wurde mittels HPLC isoliert und quantitativ bestimmt. Der Anteil N-terminales Methionin enthaltender molekularer Spezies relativ zu den gesamten molekuaren Spezies wurde so bestimmt, und die erhaltenen Daten sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Zugesetztes Metall-Ion (mol) Ausbeute an IFN Anteil N-terminales Methionin enthaltender molekularer Spezies weniger als 1%
• Somit ergab der Zusatz von Eisen- und Mangan-Ionen erfolgreiche Erzeugung von IFN-γ, das im wesentlichen frei war von N-terminales Methionin enthaltenden molekularen Spezies.
Beispiel 8
• Ein Medium, hergestellt durch Zugabe von 5 mg/l Tetracyclinhydrochlorid zu L-Medium, wurde geimpft mit Escherichia coli C-4/pTF4, die in Bezugsbeispiel 2 erhalten wurden, gefolgt von Kultivieren bei 37ºC unter Drehen und Schütteln (200 U/min) für 16,5 h. 125 ml-Teile der Kulturbrühe wurden jeweils in einen 2,5 l-Teil der Medien (1) M-03-Medium, eingestellt auf pH 5,5, und (2) M-03-Medium, ergänzt durch 20 mg/l FeCl&sub3;·6H&sub2;O und 10 mg/l MnSO&sub4;·4-6H&sub2;O, in einem 5 l-Gefäßfermenter geimpft und dann bei 34,5ºC kultiviert mit einer Belüftung von 2,5 l/min unter Rühren und Halten des pH bei 5,5 mit Hilfe von 14% wäßrigem Ammoniak und 5 N Schwefelsäure. Wenn während der Kultivierung die Vermehrung etwa 500 Klett-Einheiten erreichte, wurde die Temperatur zu 27,5ºC geändert, hatte die Vermehrung etwa 1000 Klett-Einheiten erreicht, zu 22,5ºC. Jeweils nach 6 h wurden 2 g/l Glucose und 2 g/l Casaminosäure zugesetzt. Nach 24 h Kultivierung wurde die Ala-IL-2-Produktivität der Kulturbrühen untersucht, wobei die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden.
• Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe geerntet, und aus jeweils 12 g gefrorener Zellen wurde IL-2 extrahiert und in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben zu Ala-IL-2 gereinigt. Aus den Zellen, die in Medium (1) und Medium (2) wuchsen, wurden 2,1 mg bzw. 10,0 mg Ala-IL-2 erhalten. Tabelle 9 Metallsalze Ala-IL-2-Produktivität
Bezugsbeispiel 1 Herstellung von Transformant (I), der Human-IL-2 produziert
• (i) Das Plasmid pILOT135-8, das Human-IL-2-Gen enthält [japanische Patentanmeldung Nr. 225079/1983, eingereicht am 28. November 1983 und offengelegt unter japanischer Patentveröffentlichung Nr. 115528/1985; siehe dort Beispiel 1 (vii)] wurde mit dem Restriktionsenzym HgiAI gespalten. Das erhaltene 1294 bp-DNA-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem EcoRI-Linker dTGCCATGAATTCATGGCA ligasiert. Die erhaltene DNA wurde mit EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment zu ergeben, das das Translationsstartcodon ATG und das Human-IL-2-Gen aufwies.
• Dieses DNA-Fragment wurde in das PLasmid ptrp781 [Nucleic Acids Research 11, 3077 (1983)] insertiert, das vorher unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an den EcoRI-PstI-Stellen gespalten wurde. Das so erhaltene Expressionsplasmid pTF1 besitzt stromabwärts vom Trp-Promotor das Translationsstartcodon ATG und das Human-IL-2-Gen (Fig. 5).
• Das Plasmid pTF1 wurde mit dem Restriktionsenzym StuI gespalten, gefolgt von Ligasieren mit dem Linker BamHI. Die gebildete Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI behandelt, und das EcoRI-BamHI-Fragment wurde in das den λPL-Promotor enthaltende Plasmid pTB281 insertiert. Das so erhaltene Expressionsplasmid wurde als pTB285 benannt (Fig. 6).
• (ii) Escherichia coli N4830 wurde mit Hilfe der Methode von Cohen et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69, 2110 (1972)] mit dem oben erhaltenen Plasmid pTB285 transformiert, wodurch ein Transformant, Escherichia coli N4830/pTB28s, erhalten wurde.
Bezugsbeispiel 2 Herstellung von Transformant (II), der Human-IL-2 produziert
• Das Expressonsplasmid pTF4, das ein Human-IL-2-Strukturgen enthält, wurde aus E. coli DH1/pTF4 [europäische Patentanmeldung (Offenlegung) Nr. 145390] isoliert nach der Methode von Birnboim H.C. et al. [Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)]. Unter Verwendung dieses Plasmids wurde E. coli PR 13 [J.Bacteriology 97, 1522 (1969)] nach der Methode von Cohen S.N. et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69, 2110 (1972)] transformiert. Die gebildeten Transformantenzellen wurden in Medien geimpft (50 ml; pH 7,0), enthaltend 1% Bacto-trypton (Difco Laboratories, USA), 0,5% Bacto-yeast-Extrakt (wie oben), 0,5% Natriumchlorid und 5 mg/l Tetracyclin-hydrochlorid in einem Erlenmeyer-Kolben von 200 ml Fassungsvermögen, und dann über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die gebildeten Kulturflüssigkeiten wurden dann jeweils in einen 200 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Vertiefung geimpft, enthaltend ein Medium, das hergestellt wurde durch Zugabe von 1 mg/l Vitamin B&sub1;-hydrochlorid zu einem modifizierten M-9-Medium, wonach 4 h lang kontinuierlich bei 37ºC kultiviert wurde, 4 h lang bei 30ºC und 10 h lang bei 25ºC; ein Stamm mit eminent hoher IL-2-Produktivität, d. h., E. coli C-4/pTF4, wurde ausgewählt.

Claims (21)

1. Verfahren zur Erhöhung der Menge an heterologem Methionin-freien Protein, entsprechend dem Startcodon der Translation ATG am N-terminalen Ende, relativ zur Menge des Proteins, das ein Methionin am N-terminalen Ende enthält, erzeugt in E. coli, dadurch gekennzeichnet, daß dieses E. coli in einem Medium kultiviert wird, das (1) eine Quelle für zweiwertige oder dreiwertige Eisen- Ionen, eine Quelle für zweiwertige Mangan-Ionen oder eine Mischung derselben, und (2) eine Stickstoff-Quelle natürlichen Ursprungs enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein physiologisch wirksames Protein eines Vertreters ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytokin, transformierendem Wachstumsfaktor, Peptidproteinhormon, pathogenem mikrobiellen Antigenprotein, Enzym- und Serumprotein.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Cytokin Interferon oder Interleukin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Interferon Interferon-α oder Interferon-β ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Interleukin Interleukin-2 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Expressionsvektor einen Promotor enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Promotor λPL-Promotor ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Promotor Tryptophan-Promotor ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Quelle für Eisen- Ionen ein Eisen-Salz ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Eisen-Salz ein Mineralsäure-Salz von dreiwertigem Eisen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Quelle für Mangan- Ionen ein Mangan-Salz ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Mangan-Salz ein Mineralsäure-Salz ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium eine Quelle für Eisen-Ionen in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ Mol enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium eine Quelle für Mangan-Ionen in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ Mol enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium eine Mischung einer Quelle für Eisen-Ionen und einer Quelle für Mangan-Ionen in einer Gesamtkonzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ Mol enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stickstoff-Quelle natürlichen Ursprungs ein Vertreter ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Casaminosäure, Pepton' Hefeextrakt und Malzextrakt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Stickstoff-Quelle Casaminosäure ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium die Stickstoff-Quelle in einer Konzentration von 1 g/l bis 50 g/l enthält.

19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultivierung unter sauren Bedingungen durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultivierung durchgeführt wird bei einer Temperatur von 25 bis 35ºC während der Proliferation und dann auf eine höhere Temperatur um 42ºC gegangen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Vermehrung durchgeführt wird unter Aufrechterhalten der Temperatur um 37ºC bis zum mittleren Stadium der Vermehrung, und die Temperatur dann im Verhältnis zur Fortpflanzung auf 20 bis 30ºC gesenkt wird.